ES2199960T3

ES2199960T3 - Productos farmaceuticos basados en el papillomavirus.

Info

Publication number: ES2199960T3
Application number: ES94911252T
Authority: ES
Inventors: Maria Severia Campo; William Fleming Hoggan Jarrett
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd
Priority date: 1993-03-31
Filing date: 1994-03-31
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2014-03-31
Also published as: DK0692028T3; JPH08508728A; DE69432790D1; GB9306731D0; AU6381794A; US6020309A; EP0692028B1; WO1994023037A1; ATE242265T1; DE69432790T2; CA2158554A1; PT692028E; EP0692028A1

Abstract

EN LA INVENCION SE PRESENTAN FORMULACIONES FARMACEUTICAS PARA LA PROFILAXIS DE TUMORES O LESIONES PROVOCADAS POR EL VIRUS DEL PAPILOMA. LAS FORMULACIONES SE PUEDEN SELECCIONAR DEL GRUPO QUE CONSISTE EN (I) UNA FORMULACION QUE CONTIENE UNA PROTEINA L2 DEL VIRUS DEL PAPILOMA (PV) O UN FRAGMENTO PROFILACTICAMENTE EFECTIVO DE LA MISMA Y UN COMPUESTO DE ALUMINIO; (II) UNA FORMULACION QUE CONTIENE UNA PROTEINA L2 DEL VIRUS DEL PAPILOMA BOVINO (BPV) O UN FRAGMENTO PROFILACTICAMENTE EFECTIVO DE LA MISMA Y UN COMPUESTO DE ALUMINIO; (III) UNA FORMULACION QUE CONTIENE UNA PROTEINA L2 DE UN BPV-4 O UN FRAGMENTO PROFILACTICAMENTE EFECTIVO DE LA MISMA Y UN COMPUESTO DE ALUMINIO; (IV) UNA FORMULACION QUE CONTIENE UNA PROTEINA DE UN BPV-4 O UN FRAGMENTO PROFILACTICAMENTE EFECTIVO DE LA MISMA Y UN AUXILIAR; (V) UNA FORMULACION QUE CONTIENE UNA PROTEINA L2 DE UN BPV-4 O UN FRAGMENTO PROFILACTICAMENTE EFECTIVO DE LA MISMA Y UN AUXILIAR; Y (VI) UNA FORMULACION QUE CONTIENE UNA PROTEINA DE UN BPV-4 O UN FRAGMENTO PROFILACTICAMENTE EFECTIVO DE LA MISMA Y UN COMPUESTO DE ALUMINIO.

Description

Productos farmacéuticos basados en el papillomavirus.

La presente invención está relacionada con productos farmacéuticos basados en papilomavirus.

Los papilomavirus inducen una diversidad de lesiones, tanto en humanos como en animales. Algunos papilomavirus, si bien benignos, constituyen por si mismos un problema clínico, tales como los papilomas de laringe de los niños o los papilomas penianos de los toros y se sabe que otros constituyen un factor de riesgo en la patogénesis del cáncer, tal como ocurre en el caso de las lesiones planas del cuello uterino o de los condilomas penianos, en humanos. Por consiguiente, tanto en la medicina humana como en veterinaria, representaría una ventaja importante el disponer de productos farmacéuticos antivíricos frente a papilomavirus, por ejemplo para su utilización profiláctica como protección frente al establecimiento de una infección grave.

Los estudios de vacunación en humanos presentan una serie de problemas. En primer lugar, la experimentación resulta éticamente inaceptable. En segundo lugar, se dispone de una cantidad de virus muy limitada, dado que algunas lesiones, en particular las del cuello uterino, no producen descendencia vírica y no se dispone todavía de ningún modelo in vitro que permita una replicación vegetativa del virus.

La producción de proteínas víricas en bacterias y la utilización de péptidos sintéticos ha permitido salvar este problema y posibilitado el análisis en curso de la respuesta inmune a la infección por papilomavirus (ver, por ejemplo, Jenison et al, 1988, J. Virol. 62 p. 2115 y Tindle et al., 1990, J. Gen. Virol., 71, p. 1347).

Se han obtenido ya vacunas eficaces profilácticas, tanto de modo natural(Jarret et al., 1990 The Vet. Record, 126 p.449) como mediante ingeniería genética (Pilachinsky et al, 1986 Ciba Foundation Symposium Vol. 120 p. 136), frente a papilomavirus bovinos y se ha logrado el retroceso de papilomas de Shope mediante la vacunación de conejos con extractos de tejido tumoral (Evans et al, 1962, J. Nat. Cancer Inst. 29, p.277). El sistema bovino constituye un modelo excelente para las enfermedades inducidas por papilomavirus en humanos y para los medicamentos frente a tales enfermedades en humanos, dadas las diversas similitudes existentes entre la enfermedad bovina y la humana. A saber, existen tipos de virus múltiples con elevada especificidad de lesión (Jarret et al., 1984 Virol. 136 p. 255), homología de estructura genética y avance de algunas lesiones hacia la malignidad. El sistema bovino presenta también algunas ventajas, en el sentido de que se conocen cofactores en la oncogénesis (Campo and Jarret, 1986 en Papillomaviruses, Ciba Foundation Symposium 120, John Wiley and Sons p. 117) y, por encima de todo, resulta posible la experimentación directa (Jarret, 1985 In Advances in Viral Oncology (Ed. G. Klein) 5 p. 83).

La vacunación ha sido tradicionalmente contemplada como una medida profiláctica. Los huéspedes son inmunizados frente a un patógeno y tras la subsiguiente exposición del organismo al mismo, la infección es abortada en un estadio preclínico. Esto es habitualmente logrado en el caso de infecciones víricas a través de un acontecimiento neutralizante dirigido a un epítopo superficial sobre una proteína estructural. Los tumores inducidos por virus, tales como los papilomavirus, persisten habitualmente durante largos períodos de tiempo y, posteriormente, en una determinada proporción de casos, son rechazados. El huésped puede resultar entonces inmune a la re-infección (Jarret, 1985 supra). La naturaleza del mecanismo de rechazo y de sus mediadores, no son conocidas pero resulta ventajoso inducir el mecanismo de rechazo en la fase inicial del ciclo de vida del tumor. En la práctica veterinaria, se sabe desde hace tiempo que los extractos crudos de papilomas podían, algunas veces pero nunca siempre, provocar el rechazo de papilomas homólogos (Olson et al., 1959 Am. J. Vet. Res. 21, p. 233, Evans et al., 1962 supra). Estos experimentos fueron llevados a cabo antes de que se conociera la existencia de diferentes tipos de papilomavirus en una especie (Jarret et al., 1984 supra; de Villier, 1989 J. Virol. 63 p. 4898) y de que estos eran probablemente todos ellos específicamente de tipo inmunológico (Jarret et al., 1990, The Vet. Record 126 p. 473; Jenison et al., 1988 supra).

Los papilomavirus pueden infectar y provocar tumores tanto en el epitelio mucoso como en el epitelio cutáneo. En el hombre y en los animales, los papilomas de mucosa constituyen a menudo lesiones graves, las cuales tienden a seguir un proceso prolongado, tal como es el caso de los papilomas de laringe, genitales y cervicales humanos (Steinberg, 1987 In the Papovaviride Vol 2 (ed. N.P. Saizman and P.M. Howley), p. 265; zur Hausen, 1991 Virol. 184 p.9). Estos pueden ser factores desencadenantes en el desarrollo subsiguiente de malignidades, tal como ocurre en el caso del carcinoma cervical asociado al papilomavirus humano (HPV) de tipo 16, en mujeres (zur Hausen, 1991 supra) y en el cáncer alimentario asociado al papilomavirus bovino (BPV) de tipo 4, en ganado (Campo and Jarret, 1986 supra). Claramente, existe la urgente necesidad de disponer de productos farmacéuticos contra las enfermedades provocadas por papilomavirus. A pesar del reciente éxito limitado (Kreider et al., 1986 J. Virol. 59 p.369; Sterling et al., 1990 J. Virol. 64 p. 6305; Meyers et al., 1992 Science 257 p. 971; Dollard et al., 1992 Genes and Development 6p. 1131); los papilomavirus son notoriamente reticentes al crecimiento en células cultivadas (Teichaman and LaPorta, 1987 In the Papovaviradae, Vol. 2, (ed. N.P. Saizman and P.M. Howley) p. 109) y la consiguiente falta de reactivos víricos ha retrasado el análisis de la respuesta inmune a la infección. La reciente disponibilidad de tecnología recombinante ha permitido la producción de tanto proteína vírica temprana como tardía en grandes cantidades y en forma purificada (Tindle et al., 1990 supra; Jarret et al., 1991 Virol. 184 p. 33; Ghim et al., 1992 Virology 190 p. 548; Stacey et al, 1992 J. Gen. Virol. 73 p. 2337) y, por consiguiente, ha hecho posible, por primera vez, estudiar sus potenciales de inmunización. Se ha demostrado ya que resulta posible utilizar virus y extractos tumorales en el ganado para inducir, a la vez, protección frente a lesiones cutáneas provocadas por papilomavirus (Jarret et al., The Vet Record 1990 126 p. 473; The Vet Record 1990 126 p. 449) y utilizar proteínas recombinantes para inducir, a la vez, protección y rechazo frente a las lesiones cutáneas inducidas por PV (Virology, 1991, 184 p. 33).

La producción de determinadas proteínas cápside de papilomavirus y su potencial uso en formulaciones de vacuna ha sido mencionada en las siguientes publicaciones:

WO 93/02184 (University of Queensland, Frazer et al.) menciona partículas de tipo virus (VLPs) las cuales comprenden proteína L1 de papilomavirus o una combinación de proteína L1 y proteína L2. Se describe también una vacuna que contiene estas VLPs en combinación con adyuvante completo de Freunds.

La WO 93/00436 (Cancer Research Campaign Technology Limited, Jarret et al.) describe una formulación farmacéutica para la profilaxis o la terapia de tumores provocados por papilomavirus, utilizando proteína L2 de papilomavirus y menciona también la utilización de un adyuvante, tal como el adyuvante incompleto de Freunds o L1D1 o DDA.

El documento EP 0133123 (Molecular Genetics Inc, Pilacinski) describe la producción de BPV-1 L1 y proteínas cápsides L2 y su potencial para ser utilizadas en formulaciones de vacuna.

Los solicitantes de la presente demuestran ahora que se puede vacunar, de una forma prácticamente significativa, frente al papilomavirus, por ejemplo, el virus BPV-4 de la mucosa, el cual sobre el terreno es el factor desencadenante del carcinoma escamoso del tracto alimentario superior (Campo and Jarret, 1986 supra).

Por consiguiente, la presente invención proporciona nuevas formulaciones de productos farmacéuticos para la terapia de papilomavirus, las cuales comprenden proteína L2 en combinación con alumbre.

La presente invención proporciona una formulación farmacéutica seleccionada de entre el grupo que comprende: (i) una formulación que comprende una proteína de papilomavirus (PV) L2 o uno de sus fragmentos terapéuticamente eficaces y un compuesto de aluminio, (ii) una formulación que comprende una proteína de papilomavirus bovino (BPV) L2 o uno de sus fragmentos terapéuticamente eficaces y un compuesto de aluminio; (iii) una formulación que comprende una proteína BPV-4 L2 o uno de sus fragmentos terapéuticamente eficaces y un compuesto de aluminio.

La formulación farmacéutica puede comprender una proteína PV L2 o uno de sus fragmentos terapéuticamente eficaces y un compuesto de aluminio. El PV puede ser BPV. El BPV puede ser BPV-4.

La proteína papilomavirus o el fragmento terapéuticamente eficaz de la misma puede encontrarse en forma de proteína de fusión con una co-proteína diferente. La co-proteína puede ser glutationa-S-transferasa.

La proteína papilomavirus o el fragmento de la misma terapéuticamente eficaz puede obtenerse por medio de técnicas de DNA recombinante.

El compuesto aluminio puede comprender una mezcla de hidróxido de aluminio y de fosfato de aluminio. Puede consistir en 3% de hidróxido de aluminio y 2% de fosfato de aluminio. El compuesto de aluminio puede ser un gel de aluminio.

Se proporciona también una formulación farmacéutica, tal como la indicada anteriormente, para su utilización en medicina para la terapia de tumores o lesiones causados por papilomavirus.

Se proporciona también la utilización de (i) una proteína PV L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio; o (ii) una proteína BPV L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio, o (iii) una proteína BPV-4 L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio, en la producción de una vacuna para la terapia de tumores o lesiones provocadas por papilomavirus.

Se proporciona también una formulación farmacéutica, según lo indicado anteriormente, en una dosificación terapéuticamente efectiva para inmunizar a un mamífero frente a tumores o lesiones causados por papilomavirus.

Siguiendo procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica, pueden prepararse vacunas basadas en las formulaciones farmacéuticas descritas anteriormente. De manera similar, las frecuencias de administración pueden determinarse según procedimientos conocidos. Se llama especialmente la atención en relación con New Trends and Developments in Vaccines, Editors A. Voller and H. Friedman, University Park Press, Baltimore, 1978 y el respecto de Remington's Pharmaceutical Science, de E.W. Martín.

Con vistas a que la invención pueda ser entendida con mayor claridad, la misma será adicionalmente descrita por vía de ejemplo únicamente, y sin que ello represente ninguna limitación, con relación a las siguientes figuras.

Los ejemplos relativos a la proteína (B) PV E7 se utilizan únicamente a efectos comparativos:

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La Figura 1 muestra los resultados de la vacunación con proteínas de fusión \beta-gal-tempranas (E1, E2, E4 y E7). A, animal Nº. 132 procedente del grupo 3 (control). B, animal Nº. 146 procedente del grupo 1 (vacunación anterior a la provocación). C, animal Nº. 139 procedente del grupo 2 (vacunación post provocación). La leyenda de barras se encuentra en la Figura. D, pURE7. Los plásmidos recombinantes que contienen ORFs E1, E2 y E4 no se muestran.

La Figura 2 muestra los resultados de la vacunación con \beta-gal-E7. A, número promedio de todos los tumores en animales control y vacunados. B, número promedio de tumores en estadio 1. C, número promedio de tumores en estadio 2. D, número promedio de tumores en estadio 3. Cuadrados, animales vacunados; diamantes, animales control. En un análisis de medición repetida, P=0,02 en C y 0,04 en D.

La Figura 3 muestra la vacunación con E7+L2 y L2. A, plásmidos recombinantes pGEX. B-D, número de tumores en terneras once semanas después de la provocación; B, grupo 1 (vacuna E7+L2); C, grupo 2 (vacuna L2); D, grupo 3 (control).

Materiales y procedimientos

La totalidad de procedimientos de manipulación genética son llevados a cabo según procedimientos estándar descritos en "Molecular Cloning". A Laboratory Manual eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Se describe a continuación la manera según la cual los solicitantes obtuvieron péptidos BPV-4 recombinantes en Escherichia coli utilizando pAT153 como fuente de E7 y de L2. De manera alternativa, la invención puede ser puesta en práctica utilizando la secuencia de información L2 y E7 disponible a partir de la base de datos de secuencias EMBL (nº de acceso X59063).

Terneras

Procedentes de suministros exentos de papiloma se obtuvieron terneras de razas mezcladas, de aproximadamente 12 semanas de edad. Las mismos fueron asignadas al azar en grupos y retenidas en corrales separados, limpios, bien ventilados, en una unidad de aislamiento. Los animales fueron objeto de cuidados completos, de acuerdo con lo establecido en las directivas del Home Office de la Gran Bretaña.

Producción de péptidos BPV-4 recombinantes en Escherichia coli (i) Proteínas de fusión \beta-galactosidasa E7

Los marcos de lectura abierta (ORFs) E1, E2, E4 y E7 de BPV-4 fueron clonados en la serie plásmido pUR (Ruther and Muller-Hill, 1983 EMBO J. 2p 1791). No se describe el clonaje de los ORFs de E1, E2 y E4.

El ORF que codifica para el péptido E7 fue aislado por medio de digestión del genoma BPV-4 clonado en pAT153 (Campo M.S. et al., 1982 J. Gen. Virol. 63, p255) con BAMHI. El ORF que codifica para el péptido E7 fue aislado como fragmento Bsrl que abarca los nucleótidos (nts) 652-1249 y clonado en pUR 278 (Ruther and Mullter-Hill 1983 supra), a través de la adición de ligandos BamHI. El plásmido recombinante fue transfectado en Escherichia coli JM 109 (Promega Ltd, Southampton, UK). Las bacterias fueron cultivadas hasta la fase semi-log en caldo-L suplementado con 100 \mug/ml de ampicilina e inducidas a expresar la proteína de fusión \beta-gal por medio de la adición de 100\mug/ml de IPTG, por espacio de entre 1 y 4 horas. La \beta-gal-E7 fue preparada suspendiendo bacterias en tampón lisozima (sucrosa 25%, MgCl_{2} 10mM, Tris Hcl 50 mM pH 8,0; 1 mg/ml de lisozima) conteniendo 300 \mug/ml de Dnasa I, El péptido de fusión fue peletizado después de la lisis celular en NP40 0,25%, desoxicolato 0,125%, NaCl 0,25M, Tris HCl pH 7,2 y subsiguientes lavados en Guanidina HCl 1,75M, NaCl 1M, Triton X100 1%.

(ii) Proteínas de fusión Glutationa-S-transferasa (GST)

Los ORFs E7 y L2 fueron clonados en pGEX (Smith and Jonson, 1988 Gene, 67 p.31)

El ORF que codifica para el péptido E7 fue aislado tal como se describe anteriormente y clonado en pGEX 3X (Pharmacia Ltd, Milton Keynes MK9 3HP, UK), por medio de ligadura con extremos redondeados (ver Fig. 3)

El ORF que codifica para el péptido L2 aislado por medio de digestión del genoma BPV-4 clonado en pAT 153 (Campo et al., 1982, supra) fue obtenido como fragmento BamHI-EcoRI que abarca nt 3987-5585 y clonado en su totalidad en pGEX2T (Pharmacia Ltd, Milton Keynes MK9 3HP, UK) y también como tres fragmentos Dde I: (i) un fragmento 5' terminal (nt 4042-4610) en pGEX 2T; (ii) un fragmento central (nt 4610-4989) en pGEX 3X; y (iii) un fragmento 3' terminal (nt 4989-5629) en pGEX 3X (ver Fig. 3). Los péptidos de fusión GST representan la proteína E7 a partir de los aminoácidos -21 a 98 (GST-E7); la proteína L2 a partir de los aminoácidos -8 a 542 (GST-L2w), aminoácido 11-200 (GST-L2a); aminoácidos 201-326 (GST-L2b); y aminoácidos 327-542 (GST-L2c). La transformación y el cultivo de bacterias y la producción de péptidos de fusión GST fue llevada a cabo según lo indicado en el caso de \beta-gal E7. Los péptidos fueron preparados en masa mediante la peletización de cuerpos de inclusión procedentes de bacterias suspendidas en tampón lisozima que contenía Dnasa I a 300 \mug/ml y desoxicolato a 1 mg/ml, seguido de lavado en Triton X100 0,05%/EDTA 10 mM, pH 8,0. En la totalidad de casos, los péptidos de fusión fueron suspendidos por ebullición y aplicación de ultrasonidos en SDS 5%, B-mercaptoetanol 5 mM, Tris HCl 50 mM, pH 8,0, con anterioridad a la vacunación. Los rendimientos fueron de entre 2-3 mg por gramo de peso húmedo de bacteria y se logró habitualmente un grado de pureza de entre el 50 y el 70%.

Caracterización de proteínas de fusión

Los péptidos \beta-gal-E7, GST-E7 y GST-L2 fueron caracterizados por medio de electroforesis SDS-PAGE. Los pesos moleculares de los péptidos de fusión estaban todos ellos de acuerdo con la predicción. El \beta-gal-E7 y el GST-E7 fueron caracterizados inmunológicamente utilizando antisuero de conejo, bovino o murino, realzados frente a \beta-gal-E7 o GST-E7, en ELISA o análisis de manchas Western, seguido de absorción con la proteína bacteriana adecuada. Los sueros inmunes reaccionaron positivamente con tanto con el antígeno homólogo como con el heterólogo, demostrando que las proteínas de fusión eran inmunológicamente activas y que los sueros eran específicos para E7 (ver Tabla 1). Los antígenos GST-L2 resultaban reactivos en las pruebas ELISA con sueros bovinos homólogos, de la misma forma que lo eran la proteína de fusión \beta-gal-E7, demostrando que la GST-L2 era inmunológicamente activa y que los sueros eran específicos para L2 (ver Tabla 1).

TABLA 1 Las proteínas de fusión son inmunológicamente activas

	Vacío	No Ag	No Ab	\beta-gal	\beta-gal:E7	GST	GST-E7
Animal 5 Pre-inmune	0,064	0,104	0,105	0,153	0,206	0,132	0,134
(\beta-gal-E7) Inmune	0,058	0,192	0,174	0,718	2,892	0,112	0,886
					\beta-gal-L2		GST-L2
Animal 16 Pre-Inmune	0,064	0,149	0,124	0,15	0,231	0,284	0,317
(GST-L2) Inmune	0,087	0,157	0,105	0,12	1,512	0,724	2,694

Los pocillos de microvaloración fueron revestidos con 500 \mug/pocillo de proteína de fusión o con 100 \mug/pocillo de proteína de fusión L2. \beta-gal y GST se utilizaron en cantidades equivalentes. Los pocillos se incubaron durante el transcurso de toda una noche con los sueros bovinos adecuados y por espacio de una hora se añadió IgG anti-bovina conjugada con fosfatasa alcalina. El Animal 5 procede del experimento 3, grupo 1; el animal 16 del experimento 4, grupo 2.

Diseño experimental (i) Vacunación con proteínas de fusión tempranas E1, E2, E4 y E7

Dieciocho animales fueron divididos en tres grupos con seis animales en cada grupo. A cada uno de los animales en el grupo 1 se le inaculó, en el flanco posterior izquierdo, 1 ml de PBS conteniendo 1 mg de una mezcla de proteínas de fusión \beta-gal-tempranas (E1, E2, E4 y E7), emulsionadas en 1 ml de adyuvante incompleto de Freund (FIA); se repitió la vacunación (refuerzo) al cabo de quince días, en el flanco posterior derecho. A las dos semanas de haberse aplicado el refuerzo, la totalidad de animales en cada uno de los grupos fue objeto de provocación en el paladar (Jarret et al., 1990 The Vet Record, 126 p.473) con 10^{12} partículas de BPV-4. Los animales del grupo 2 fueron vacunados, tal cono se ha indicado anteriormente, a las dos semanas de la provocación y revacunados transcurridas otras dos semanas. El BPV-4 se purificó a partir de papilomas esofágicos y se catalogó según lo descrito previamente (Campo et al., 1980 Nature 286, p.180), estimándose la concentración de partículas víricas por medio de ensayo con microscopía electrónica (Jarret et al., 1990 The Vet Record, 126 p.449). Cada uno de los animales fue examinado cada tres a cuatro semanas, se contabilizaron los papilomas y se midió su tamaño, según lo indicado anteriormente (Jarret et al., 1985 supra).

(ii) Vacunación con \beta-gal-E7

Diecinueve animales fueron divididos en dos grupos de once y ocho animales cada uno de ellos. Las once terneras en el grupo 1 recibieron cada uno de ellas una suspensión de 1 mg/ml de la proteína de fusión \beta-gal-E7 emulsionada en 1 ml de FIA, en el músculo cuadriceps derecho. Se repitió la vacunación cuatro semanas más tarde en el músculo cuadriceps izquierdo (revacunación). Catorce días después de la revacunación, la totalidad de animales en los grupos 1 y 2 fueron objeto de provocación en el paladar con 10^{11} partículas de BPV-4 en diez puntos (10^{10} partículas por punto). Los animales fueron examinados y los papilomas monitorizados, según lo indicado anteriormente.

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(iii) Vacunación con GST-E7 y GST L2

Cuarenta y siete animales fueron divididos en dos grupos de quince animales cada uno de ellos (grupos 1 y 2) y un grupo de diecisiete animales (grupo 3). Las terneras del grupo 1 recibieron cada una de ellas 2 ml de una suspensión conteniendo 1 mg de proteína de fusión GST-E7 y 1 mg en total de los péptidos de fusión GST-L2 (la relación de GST-péptidos de fusión L2w:L2a:L2b:L2c era de aproximadamente 1:5:5:5) además de 2 ml de FIA, en el músculo cuadriceps derecho. La vacunación se repitió cuatro semanas mas tarde en el músculo cuadriceps izquierdo. Las terneras del grupo 2 recibieron cada una de ellas 1 mg de proteínas de fusión GST-L2, tal como se ha indicado anteriormente. Dos semanas después de la revacunación, todos los animales, en los tres grupos, fueron inoculados en el paladar, en diez diferentes puntos, con un total de 10^{11} partículas de BPV-4 (10^{10} partículas por punto). Los animales fueron examinados y los papilomas monitorizados, tal como se ha indicado anteriormente.

(iv) Vacunación con GST-L2 en gel de aluminio

Treinta y seis animales fueron divididos en tres grupos de 12 animales en cada uno de ellos. Cada una de las terneras del grupo 1 recibió 3 ml de una suspensión que contenía 1 ml de péptidos de fusión GST-L2, a 1 mg/ml, en la misma proporción que la indicada anteriormente, 1 ml de TRIS-HCL 40 mM, NaCl 0,33% y 1 ml de gel de aluminio, compuesta por volúmenes iguales de hidróxido de aluminio al 3% y de fosfato de aluminio al 2% (Intervet UK Ltd, Cambridge Science Park, Cambridge CB4, UK). Se repitió la vacunación cuatro semanas más tarde. Las terneras del grupo 2 fueron vacunadas según lo indicado anteriormente, pero únicamente con 100 \mug de péptidos de fusión por animal. Los terneros del grupo 3 se utilizaron como control. La provocación era la misma que en los casos anteriores.

Resultados

La inmunización con la proteína E7 inhibe el desarrollo del papiloma y provoca el rechazo del mismo.

La E7 constituye la proteína transformante más importante de BPV-4 in vitro (Jagger et al., J. Ger. Virol. 71, p. 3041) y se expresa a través de diferentes estadios de desarrollo de los papilomas del canal alimentario, apuntando su importancia para el mantenimiento del estado proliferativo in vivo. Es homóloga a la oncoproteína E7 del papilomavirus de tipo 16 humano (HPV-16) (Jagger at al., 1990 supra; Jackson et al., 1991 Molecular Carcinogenesis 4, pg. 382), el virus más comúnmente asociado con el carcinoma escamoso del cuello uterino en mujeres (zur Hausen, 1991 supra). Debido a su papel pivotal en la transformación celular, E7 puede constituir un objetivo para las respuestas inmunes mediadas por las células que conducen al rechazo del tumor, tanto en el caso del BPV-4 como en el de

\hbox{HPV-16.}

Los solicitantes llevaron a cabo dos experimentos piloto, los cuales serán descritos brevemente, y un tercer experimento con un número más grande de animales, el cual será descrito con mayor profundidad.

En el primer experimento, los solicitantes vacunaron terneras con una mezcla de proteínas tempranas BPV-4 E1, E2, E4 y E7, sintetizadas en bacterias como productos de fusión \beta-galactosidasa (Ruther and Muller-Hill 1983 supra; Jarret et al., 1991 Virol., 184 pag. 33). Seis terneras del grupo 1 fueron vacunadas antes de la provocación en la boca con BPV-4 y seis terneras en el grupo 2 fueron vacunadas después de la provocación. Seis terneras control en el grupo 3 no fueron vacunadas y fueron provocadas con BPV-4 (ver Tabla 2). Entre cuatro y seis semanas después de la provocación la totalidad de animales desarrolló lesiones de tipo placa, las cuales constituían el estadio 1a del desarrollo del papiloma en el canal alimentario (Jarret, 1985 supra). Las lesiones estaban confinadas a los puntos de inyección. Durante las siguientes veinte semanas, las lesiones de los animales control crecieron en número y en tamaño, con extensión secundaria en el paladar; y continuaron con los bien conocidos estadios de crecimiento de los papilomas: originaron placas (estadio 1b), papilomas de hasta 2 mm de longitud (estadio 2) y papilomas de tamaño superior a los 2 mm (estadio 3). Los papilomas de los estadios 2 y 3 son los tumores productores de virus maduros.

TABLA 2

Estrategia de vacunación
Grupo	Exp. 1	Exp. 2	Exp. 3	Exp. 4	Exp. 5
1	(PR)E1-2-4-7(6)	E7(6)	E7(11)	E7+L2(15)	L2*(12)
2	(PS)E1-2-4-7(6)	E2(6)	nv(8)	L2(15)	L2**(12)
3	nv(6)	nv		Nv(17)	Nv(12)

El número de animales en cada uno de los grupos se indica entre paréntesis. Los animales fueron inoculados dos veces con 1 mg de proteína, con la excepción del exp. 5, grupo 2, donde los mismos recibieron dos inoculaciones de 100 \mug cada una de ellas (L2**). El adyuvante era FIA en la totalidad de los casos, con la excepción del exp. 5 (L2* y L2**) en el cual era gel de aluminio (Intervet UK, Ltd). En el Exp. 1, PR indica vacuna proporcionada con anterioridad a la provocación y PS vacuna suministrada con posterioridad a la provocación. En los exp. 2-5, la vacuna fue siempre suministrada con anterioridad a la provocación. N.v. número de vacunas.

Se han descrito detalles de los estadios de desarrollo de los papilomas y su significado en el ciclo de vida del tumor (Jarret, 1985 supra). Aproximadamente treinta semanas después de la provocación, la degeneración natural de los papilomas empezó a tener lugar, con una disminución en el tamaño y en el número de lesiones y los animales estuvieron esencialmente libres de papilomatosis alrededor de la semana cincuenta y cuatro. En la Figura 1A se muestra el desarrollo de papilomas en un animal representativo procedente de este grupo. La totalidad de animales vacunados, tanto los vacunados antes como los vacunados con posterioridad a la provocación, presentaban aproximadamente el mismo número de placas que los animales control, indicando que el virus era igualmente infeccioso y que las terneras eran igualmente susceptibles de padecer la infección en los tres grupos. No obstante, la mayor parte de las lesiones en los animales vacunados no se desarrollaron en su tamaño total, particularmente en el grupo 1, y la mayoría fueron rechazadas entre las semanas 40-47 posteriores a la provocación, mucho antes que en los animales control. El desarrollo de lesiones en animales representativos procedentes de los grupos vacunados se muestra en las Figuras 1B y C. Dos conclusiones podrían ser extraídas a partir de estos resultados: que la vacunación terapéutica resultaba posible y que, dentro de los intervalos de tiempo utilizados en el estudio, el momento de aplicarse la vacunación con respecto a la provocación no resultaba crítico.

Para averiguar cual de las cuatro proteínas tempranas era la responsable del retroceso tumoral, los solicitantes procedieron a vacunar seis terneras con \beta-gal-E7 y seis con \beta-gal-E2 antes de la provocación; seis animales constituían el grupo control (ver Tabla 2). Los animales vacunados con E2 no se comportaban de manera distinta a los animales control, mientras que en las terneras vacunadas con E7 la mayor parte de las lesiones no crecieron más allá del estadio 1a y fueron rechazadas antes que o bien en los animales control o en los animales vacunados con E2 (datos no mostrados).

En el tercer experimento más grande, once terneras fueron vacunadas con \beta-gal-E7 antes de la provocación y ocho terneras fueron mantenidas como control (ver Tabla 2). En este experimento, las placas y las placas realzadas serán consideradas conjuntamente como lesiones en estadio 1. Al igual que en casos anteriores, la totalidad de animales desarrolló el mismo número de placas cuatro semanas después de la provocación, confirmando que todos ellos eran igualmente susceptibles de ser infectados (ver Figura 2A). Transcurridas diez semanas, el número de lesiones en el estadio 1 se redujo de manera drástica en ambos grupos, en concomitancia con el incremento en el número de lesiones en estadio 2 (ver Figuras 2B y C). En el grupo control, las lesiones en estadio 2 avanzaron hasta el estadio 3 en las siguientes diez semanas (ver Fig. 2D), mientras que el número de lesiones en el estadio 1 permanecía constante (ver Fig. 2B). No hubo extensión secundaria (ver Materiales y Procedimientos). Transcurridas cinco semanas más (veinticinco semanas después de la provocación), los papilomas de estadio 2 y de estadio 3 empezaron a reducirse (ver Figs. 2C y D). En el grupo vacunado con E7, hacia la semana décima después de la infección, el número de lesiones en el estadio 2 era más elevado y el número de lesiones en el estadio 3 más bajo que en el grupo control (ver Figs. 2C y D). Trece semanas después de la infección, el número de papilomas en estadio 2 se redujo de manera considerable, sin originarse ningún incremento concomitante en los papilomas de estadio 3 (ver Figs. 2C y D). Por consiguiente, en los animales vacunados con E7, el avance de las lesiones desde el estadio 2 hasta el estadio 3 se vio reducido drásticamente y los papilomas en estadio 2 estaban reduciéndose antes de llegar a la plena madurez. La diferencia entre el grupo vacunado y el grupo control fue observada no solo cuando se consideró el número de papilomas en estadio 2 y estadio 3 por grupo, tal como en la Fig 2, sino también cuando se consideró el porcentaje de papilomas en estadio 3 o el porcentaje de animales con papilomas en estadio 3 (ver Tabla 3).

En los tres diferentes experimentos, se vacunaron un total de veintinueve animales con E7. Veintidós de ellos (76%) o bien no desarrollaron papilomas maduros o rechazaron los mismos antes que los animales control. Puede concluirse, por tanto, que la vacunación con E7 reduce el crecimiento del tumor e induce el retroceso del tumor prematuro, proporcionando de este modo un tratamiento eficaz frente a los papilomas.

La vacuna E7 es presentada efectivamente al sistema inmune

La vacunación con E7 va acompañada, a la vez, de una respuesta humoral y de una respuesta inmune a la vacuna. Ambas respuestas aparecen mucho antes y presentan una mayor amplitud en los animales vacunados que en las terneras de control. Si bien la totalidad de animales vacunados tenían anticuerpos de suero a E7, los anticuerpos de suero a E7 no se encontraban en la totalidad de animales control y algunos permanecían negativos a lo largo del transcurso del experimento. Por consiguiente, la vacuna E7 es presentada a ambos brazos efectores del sistema inmune, mientras que la E7 vírica se encuentra escasamente presente. Esto puede explicar la eficacia de la vacuna terapéutica. La respuesta humoral y la respuesta inmune mediada por células a E7 y la distribución de los epítopos de banda de células T será presentada con más detalle más adelante.

La inmunización con la proteína L2 evita la formación de papiloma

L2 es la proteína cápside menor de los papilomavirus. Si bien no se conoce todavía la estructura molecular detallada del virión, existe constancia circunstancial de que un dominio(s) de la proteína está(n) expuesto(s) sobre la superficie del virus (en conejos inmunizados con proteína L2 recombinante se han encontrado virus neutralizantes de anticuerpos L2 de baja titulación (Christensen et al, 1991 Virology 181 p. 572; Lin et al., 1992 Virology 187 p. 612)). Los solicitantes han demostrado que la vacunación con proteína L2 del papilomavirus BPV-2 cutáneo inducía rechazo temprano de fibropapilomas en la piel, acompañado de infiltrados de células inmunes en las verrugas en retroceso (Jarret et al., 1991 Virology 184, p. 33).

L2 y E7 fueron producidas en bacterias como proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) (Smith and Johnson, 1988, supra). Quince animales fueron vacunados con GST-L2, quince con GST-L2+GST-E7 y diecisiete fueron conservados como control (ver Tabla 2). La totalidad de los animales fueron provocados con iguales cantidades de virus procedente del mismo stock. Los animales fueron examinados a las cuatro, siete y once semanas siguientes a la provocación. En el grupo 3, el cual no había recibido vacuna, 13 de las 17 terneras desarrollaron lesiones aproximadamente cuatro semanas después de la infección del virus. Estas lesiones evolucionaron a través de los estadios habituales (ver Tabla 4). Once semanas después de la provocación, cuando el experimento había finalizado, uno de los cuatro animales que no presentaba lesiones a las cuatro semanas tenía tan solo una lesión en el estadio 1 y tres no presentaban lesiones en absoluto (ver Tabla 4 y la Fig. 3). De los quince animales en el grupo 1 (L2+E7), dos desarrollaron lesiones en estadio 1, las cuales desaparecieron con posterioridad, uno desarrolló lesiones en estadio 2, las cuales todavía permanecían al final del experimento y doce no desarrollaron ningún tipo de tumor (ver Tabla 4 y Fig. 3). En el grupo 2 (L2), al final del experimento una ternera presentaba cinco lesiones en estadio 1 y una lesión en estadio 2, y los restantes catorce animales estaban completamente exentos de tumores (ver Tablas 4 y Fig. 3). Los 28 animales vacunados sin tumores permanecían todavía exentos de papilomas una vez transcurridas 44 semanas desde la aplicación de la provocación, mientras que los animales control todavía presentaban papilomas. Por consiguiente, las vacunas L2 y L2+E7 conferían un alto grado de protección, un efecto casi ciertamente atribuible a la proteína L2, ya que la vacuna E7 no presentaba efecto protector por si misma (ver lo indicado anteriormente). Esto fue confirmado a través de un segundo experimento de vacunación con L2, en el cual únicamente se utilizaron péptidos L2, rebajando la cantidad de antígeno a 100 \mug por inoculación por animal y se modificó el adyuvante a gel de aluminio (ver Tabla 2). La mayor parte de los animales del grupo 1 (once de doce) y todos los animales del grupo 2 (doce de doce) quedaron completamente protegidos a partir de la provocación y exentos de tumor, mientras que 11 de los 12 animales de control desarrollaron papilomas cuatro semanas después de la provocación (datos no mostrados). Por consiguiente, los péptidos L2 proporcionan una poderosa vacuna profiláctica. Los resultados demuestran que resulta posible reducir la dosis de L2 cuando se administra con sales de aluminio, al tiempo que se conserva un potente efecto profiláctico.

Por consiguiente, los solicitantes han logrado con éxito una inmunización profiláctica y terapéutica frente a papilomavirus bovino de la mucosa.

Esto se ha conseguido en un animal huésped frente a su propio patógeno natural. El ganado y sus papilomavirus han co-evolucionado y la respuesta inmunológica observada en condiciones experimentales imita la observada en la naturaleza y resulta, por tanto, biológicamente significativa (Jarret et al, 1991 Virology 184, p.33; Campo, 1991 Cancer Cells, 3p.421).

El éxito obtenido frente al virus BPV-4 de la mucosa, en el caso de una provocación fuerte, resulta particularmente remarcable y de especial relevancia frente al posible uso de vacunas contra papilomavirus genital en sujetos humanos. Existen diversas similitudes entre los sistemas BPV-4 y HPV-16. Ambos virus infectan al epitelio de la mucosa dando lugar a lesiones que pueden transformarse en neoplasias. En ambos virus, las principales funciones de transformación, tal como se han definido en sistemas in vitro, son codificadas por el gen E7. Además, las dos proteínas E7 muestran homología de aminoácidos.

Mediante la inmunización con la proteína L2 se logró protección virtualmente completa frente a la infección por BPV-4. Se ha demostrado también que la vacunación con la proteína L2 del papilomavirus de conejo de cola de algodón (CRPV) presenta efectos protectores en el conejo (Christensen et al., 1991 supra:Lin et al., 1992 supra), si bien en una extensión mucho más limitada que en el ganado. Tomados en conjunto, estos dos juegos de resultados sugieren que la L2 de HPV podría desarrollar unos efectos similares en humanos.

La inmunización con BPV-4 E7 induce rechazo de tumores establecidos, acompañado de una fuerte respuesta inmunocelular. La vacunación de ratas y ratones con el gen del HPV-16 E7 provocaba un retraso en el crecimiento y una regresión parcial de los tumores inducidos por células transformadas por HPV-16 (Meneguzzi et al., 1991 Virology 191 P 62-69; Chen et al, 1991 PNAS 88, p110) y, más recientemente, la vacunación de ratones con HPV-16 E7 daba lugar a una respuesta de hipersensibilidad de tipo retrasado, dirigida específicamente frente al antígeno E7. Por consiguiente, E7 de diferentes papilomavirus puede dar lugar a la respuesta inmune adecuada para originar rechazo a la inducción de tumor.

TABLA 3 Vacuna E7 Semanas posteriores a la provocación

	4	7	10	13
Estadio de la lesión	1	2	3	1	2	3	1	2	3	1	2	3
Número promedio	6,3	0	0	5,8	3,9	0	0,3	8,7	0,3	1,7	8,1	0,1
de tumores en	[1,2]			[1,3]	[1,3]		[0,3]	[0,5]	[0,2]	[1,2]	[0,9]	[0,1]
grupo vacunado
Número promedio	3,9	1,8	0	8	0,1	1,1	2,1	5,4	2,5	1,8	4,4	3,1
de tumores en	[1,3]	[1,5]		[1,4]	[0,1]	[1,1]	[1,1]	[1,6]	[1,5]	[0,9]	[1,7]	[1,8]
grupo control
Animales vacunados	11	0	0	8	7	0	1	11	2	5	10	1
con lesiones	[100]			[72]	[64]		[9]	[100]	[18]	[45]	[91]	[9]
Animales control	5	3	0	7	1	2	4	6	3	3	5	3
con lesiones	[62]	[37]		[87]	[12]	[25]	[50]	[75]	[37]	[37]	[62]	[37]
Número de lesiones	69	0	0	63	43	0	3	96	3	19	89	1
en animales	[100]			[59]	[40]		[3]	[94]	[3]	[17]	[82]	[0,9]
vacunados
Número de lesiones	31	1	10	64	1	10	17	43	25	14	35	25
en animales control	[70]	[29]		[85]	[1]	[14]	[20]	[50]	[29]	[19]	[47]	[34]

TABLA 3 (continuación)

	17	21	25	29
Estadio de la lesión	1	2	3	1	2	3	1	2	3	1	2	3
Número promedio	2	5	1,2	2,5	2,6	1	0,3	3,8	0,2	1,1	2,6	0,3
de tumores en	[1,3]	[1,1]	[0,9]	[1,1]	[1,0]	[0,7]	[0,2]	[1,1]	[0,1]	[0,5]	[0,7]	[0,2]
grupo vacunado
Número promedio	1,8	3	3,8	2	2,3	3,5	0	3,5	2,6	0,8	1,3	0,5
de tumores en	[0,9]	[1,1]	[1,8]	[1,1]	[1,1]	[1,6]		[1,3]	[1,6]	[0,4]	[0,7]	[0,3]
grupo control
Animales vacunados	3	9	2	5	7	3	2	9	2	4	8	2
con lesiones	[27]	[82]	[18]	[45]	[64]	[27]	[18]	[82]	[18]	[36]	[72]	[18]
Animales control	4	5	3	4	4	4	0	5	4	3	3	3
con lesiones	[50]	[62]	[37]	[50]	[50]	[50]		[62]	[50]	[37]	[37]	[37]
Número de lesiones	22	55	13	27	29	11	3	42	2	12	29	3
en animales	[24]	[61]	[14]	[40]	[43]	[16]	[6]	[89]	[4]	[27]	[66]	[7]
vacunados
Número de lesiones	14	22	30	16	18	28	0	28	22	6	10	4
en animales control	[21]	[33]	[45]	[26]	[29]	[45]		[56]	[44]	[30]	[50]	[20]
a: estadio 1, placa; estadio 2, papilomas <2 mm; estadio 3, papilomas> 2 mm
b: número promedio de tumores en un grupo; SEM entre paréntesis
c: número de animales con lesiones en un grupo, porcentajes en paréntesis
d: número de lesiones en un grupo; porcentajes en paréntesis

TABLA 4 Vacunas con E7+L2 y L2 Semanas posteriores a la provocación

	4	7	11
Estadio lesión	1	2	3	1	2	3	1	2	3
Nº animal Grupo 1
(E7+L2)
1	2	-	-	-	-	-	-	-	-
2	1	-	-	-	-	-	-	-	-
3	-	-	-	4	3	–	1	6	-
4-15	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Grupo 2 (L2)
16-26	-	-	-	-	-	-	-	-	-
27	-	-	-	1	-	-	5	1	-
28-30	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Grupo 3 (control)
31	5	-	-	-	6	–	5	1	-
32	1	12	–	6	6	-	-	5	8
33	5	-	-	2	8	–	3	7	-
34	6	-	-	2	7	–	2	6	4
35	-	-	-	-	-	-	-	-	-
36	-	-	-	-	-	-	1	-	-
37	11	-	-	-	13	–	1	6	4
38	-	-	-	-	-	-	-	-	-
39	ne			3	2	-	-	9	-
40	7	-	-	4	8	–	2	9	1
41	7	-	-	2	9	-	-	6	-
42	ne			2	5	–	1	3	4
43	ne			3	-	-	-	3	-
44	ne			-	11	-	-	10	-
45	ne			-	1	–	3	-	-
46	-	-	-	-	-	-	-	-	-
47	ne			5	7	–	1	8	-
Ne= no examinado: los números representan lesiones en cada uno de los estadios; estadios de lesión como en la
Tabla 2. - significa ausencia de lesiones

Claims

1. Formulación farmacéutica para la inmunización de un mamífero frente a tumores o lesiones debidas a papilomavirus, con una dosis terapéuticamente eficaz de:

(i): una formulación que comprende una proteína papilomavirus (PV) L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio; o

(ii): una formulación que comprende una proteína papilomavirus bovina (BPV) L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio; o

(iii): una formulación que comprende una proteína BPV-4 L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio.

2. Formulación farmacéutica según la reivindicación 1, que comprende una proteína PVL2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio.

3. Formulación farmacéutica según la reivindicación 1, en donde el citado PV es BPV.

4. Formulación farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de papilomavirus o el fragmento terapéuticamente eficaz de la misma se encuentra en forma de proteína de fusión con una co-proteína diferente.

5. Formulación farmacéutica según la reivindicación 4, en donde la co-proteína es glutationa-S-transferasa (GST).

6. Formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína papilomavirus o el fragmento terapéuticamente eficaz de la misma se obtiene mediante técnicas de DNA recombinante.

7. Utilización de

(i): una proteína PV L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y de un compuesto de aluminio; o

(ii): una proteína BPV L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio; o

(iii): una proteína BPV-4 L2 o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y un compuesto de aluminio;

en la producción de una vacuna para la terapia de tumores o lesiones causados por papilomavirus.

8. Utilización de una proteína PV L2 o de un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma y de un compuesto de aluminio, según la reivindicación 7.

9. Utilización según la reivindicación 8, en donde el citado PV es BPV.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la proteína de papilomavirus o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma se encuentra en forma de proteína de fusión con una co-proteína diferente.

11. Utilización según la reivindicación 10, en donde la co-proteína es GST.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde la proteína de papilomavirus o un fragmento terapéuticamente eficaz de la misma se obtiene mediante técnicas de DNA recombinante.