JPH10509582A - 乳頭腫ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 子牛乳頭腫ウイルスのＮ末端領域(BPV-4)L2 タンパク質は、免疫原性として活性なエピトープを有する。これらのエピトープの２種は、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)タイプと実質的に相同性の配列を有する。該BPV 及びHPV を用いて、牛及びヒトについて用いるワクチン配合物を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】 乳頭腫ウイルスワクチン 発明の分野 本発明は、医薬における乳頭腫ウイルスL2タンパク質フラグメントの使用に関 するものである。特に、本発明は、哺乳動物、特にヒト及び牛の疾患に関連する 乳頭腫ウイルスに対する免疫を行うためのワクチン配合物に関するものである。発明の背景 乳頭腫ウイルス(Papillomaviruses)はヒトと動物の双方に様々な病変を引き起 こす。例え、良性であっても、幾つかの乳頭腫はそれ自身臨床的に問題である。 例えば、子供の咽頭部乳頭腫（Steinberg 及びAbramson，1985年）又は雄牛の陰 茎乳頭腫(Jarrett，1985年)であり、かつ他に、ヒトにおける子宮頸部又は陰茎 コンジロームのフラットな病変の場合などのように、癌の病因において危険な因 子になるものが知られている(zur Hausen，1978年)。したがって、ヒト及び獣医 用の医薬において、抗ウイルスワクチンの導入は重要事項であろう。 国際特許出願第 PCT/GB 92/01092号は、乳頭腫ウイルスL2タンパク質を乳頭腫 ウイルス腫瘍又は病変の治療における医薬として有用な成分として使用すること に関するものである。この例において、BPV-4 のL2オープンリーディングフレー ム（ＯＲＦ）が、全L2ＯＲＦ（アミノ酸８〜525 をコードする。）及びアミノ酸 11〜201、203 〜329 及び330 〜525 をコードする３種のフラグメントとしてク ローンされることが述べられている。続く予防接種の実験において、前記アミノ 酸配列フラグメントの混合物が、予防接種組成物に使用された。しかし、乳頭腫 ウイルスに対する免疫を付与することができる活性画分の同定、及び疾患に関連 する乳頭腫ウイルスに対する拡大は試みられていなかった。他の研究者により、 ワタオウサギの乳頭腫ウイルス（CRPV）のL2タンパク質が、ウサギについて予防 的なワクチンであるということが(Christensenらの論文、Virology(181，572 〜 579 頁(1991 年)；Linらの論文、Virology(187，612 〜619 頁(1992年))、BPV- ４のL2タンパク質が雌牛に対し予防的なワクチンであるということが報告されて いる(Campoらの論文、J.gen.virol.74，945 〜953 頁(1993 年)。Christensenら は、CRPVのL2タンパク質の末端カルボキシル側半分（アミノ酸259 〜492）を使 用し、Lin らはアミノ酸番号67〜489 からのCRPVのL2タンパク質を使用した。い ずれのグループもBPV-4 L2の活性Ｎ末端（アミノ酸11〜200）に対応する部分を 含むポリペプチドを用いることを示俊していなかった。さらに研究者達は、E.co liで完全なBPV-1 L1及びL2タンパク質を発現した。該L1タンパク質を子牛を免疫 するのに使用し、BPV-1 の抗原投与から保護できる程度の免疫を得た(Pilacinsk i らの論文、乳頭腫ウイルス：Molecular and Clinical Aspects,UCLA シンポ ジウム２，(1985 年)257〜271 頁）。また、L1及びL2に対するウサギ抗血清は、 C127マウス細胞の形質転換アッセイにおいてBPV-1 を中和することができ、これ はL1及びL2が中和性エピトープを含んでいること意味すると報告している。これ は雌牛では試験されていない。さらに、試験された５種のウサギL2免疫血清のう ち唯一種のみが該ウイルスを中和した。 Christensen ら及びLin らの仕事は、当業者に、該ペプチドのカルボキシ末端 部分内に位置する免疫原性エピトープを予期させるものであるが、しかしながら 、該先行技術は乳頭腫ウイルスL2タンパク質のどの要素が有効な予防的治療に寄 与できる免疫原性要素であるか示していない。一般に、現在までに生産されたワ クチンは、様々な融合タンパク質の混合物から製造されるか（組換えＤＮＡ技術 を介して製造される場合）、又は乳頭腫ウイルス要素の粗製抽出物、又は或る動 物種に免疫原性活性を示し得るが、その活性は容易に再生でき、又はできない生 きているウイルス株から製造されている。ワクチンとして使用されるこのような 抽出物は、一般に、他の種に投与された場合、十分な働きを示さず、かつ具体的 な有効性を示さない。 本発明の目的は、哺乳動物における乳頭腫ウイルスの感染に対しさらに有効な 予防的ワクチンを提供することである。 本発明の目的は、さらに乳頭腫ウイルス感染の予防的な治療に使用するより有 効な免疫原性活性成分を提供することである。 これらの、及び他の目的は、次の記載及び実施例から明らかになるであろう。発明の要約 今日、驚くべきことに、L2タンパク質の免疫原性エピトープ（類）が、本明細 書に記載した従前の研究、本願発明者らの予想、及び先行技術の教示から導かれ る推論に反し、Ｎ末端領域にあるということが見出された。したがって、乳頭腫 ウイルスL2のＮ末端フラグメント（例えば、アミノ酸11〜200）又はその一部が 、乳頭腫ウイルス感染に影響される哺乳動物において疾患状態の発生を阻止する のを助けることができる。 さらに、Ｎ末端領域に見られるエピトープの少なくとも幾つかは、ヒト乳頭腫 ウイルスタイプの対応フラグメントに対し明瞭な配列類似性を示す。したがって 、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における乳頭腫ウイルス感染に対する予防剤と して使用するのに適した薬剤の製造における、乳頭腫ウイルスL2タンパク質のＮ 末端部分、又はその予防的に有用なペプチドフラグメント（又はその予防的に有 用なペプチド誘導体配列）の使用を提供するものである。 前記ペプチドフラグメントは、約200 までのアミノ酸長さ、好ましくは約10〜 200 アミノ酸長さ、さらに好ましくは約10〜30アミノ酸長さ、かつ最も好ましく は約10〜20アミノ酸長さとすることができる。本発明の実施態様において、免疫 原性として有効なペプチドフラグメントは、次のアミノ酸配列（配列(I)、配列( II)及び配列(III)という。）の一つを、その一部として含んでいる。該アミノ酸 配列はＮ末端からＣ末端に読むものであり、特に特に下線を引いたアミノ酸フラ グメントであり、またそのペプチドの誘導体が予防的活性を有する限り、該誘導 体を含むものである。 理論により結び付ける意図はないが、前記アミノ酸配列（及び特に下線を付し たフラグメント）は、それ自体で免疫応答を導き出すものではないが、もし満足 すべき免疫応答を得なければならないならば、一般に大きなタンパク質の一部と して含まれることが必要であると考えられる。したがって、該アミノ酸配列は本 来の乳頭腫ウイルスL2配列の一部、またこれに対する合成で得られる誘導類似配 列であってもよく、又はキーホールリンペットハモシアニン（ＫＬＨ）（ウサギ 用）又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のような他のタンパ ク質又はペプチドを結合し、又は融合することができる。 したがって、また本発明は、予防的な機能を発揮でき、したがって、適当な免 疫原性能力を有する分離された、又は合成により製造されたペプチドを含むもの である。 本発明の目的を達成するために、本発明の配列の誘導体は哺乳動物に予防的効 果を発揮することができるものである。好ましくはこのような誘導体は、 これ まで示したL2配列の一つとの関連で認識できる程度の類似性を維持する。したが って、得られた配列が適当なタンパク質、ポリペプチド又はペプチド形態におい て予防的な効果を発揮できる限り、その置換、付加、欠失又は組み合わせをアミ ノ酸残基の配列において行うことができる。Ca 20aアミノ酸残基長BPV −L2配列 (I)及び(III)自身に注目すると、比較におけるアミノ酸残基配列の類似性の程度 は、アミノ酸の同一性、最適な配列を行った場合に類似位置におけるアミノ酸残 基の保存的配列に基づいて、約20％〜約35%、好ましくは30% 〜35% とすること ができる。例えば、少なくとも配列(I)において下線を引いたアミノ酸であり、 又はこれらが配列されている場合に10又は14アミノ酸残基配列に関する実質的な 類似性を示す配列(III)の下線を引いたアミノ酸である。すなわち、また物理化 学的類似性に基づく、アミノ酸置換の可能性がある場合は、類似性は約55% 以上 に、好ましくは約40% 〜約50% になってもよい。 このようなペプチドは、例えば、HPV-18，HPV-16，HPV-II，HPV-6 などのヒト 乳頭腫ウイルスのような他の乳頭腫ウイルスタイプと配列類似性を示す。 したがって、例えば、先に示した配列(I)のＣ末端の下線を引いたアミノ酸に 関し、これに対応する10アミノ酸残基長ペプチド部分の類似性の程度は、アミノ 酸の同一性、及びアミノ酸残基の保存的配列に基づいて、40% 〜約70% 、好まし くは約60% 〜約70% とすることができる。また、物理化学的類似性に基づく置換 可能性がある場合は、約80% 〜約100%になることができる。 当然、異なるアミノ酸配列間の整合を取ることができる、該技術分野で入手可 能なコンピュータプログラムがあると、当業者は考えるであろう。このようなプ ログラムの例にBESTFIT of TRANSLATE（Genetic Computer Group package(Unive rsity of Wisconsin)）がある。 本発明の目的を達成するために、保存性置換を次のグループに含まれるアミノ 酸間で調製することができる： (i)アラニン、セリン及びスレオニン (ii)グルタミン酸及びアスパラギン酸 (iii)イソロイシン、ロイシン、バリン及びメチオニン したがって、アミノ酸残基置換、付加及び／又は欠失が起こった場合、得られ たどのペプチドでも、これまで記載した天然のエピトープの潜在的能力と類似の 免疫原性能力を実質的に維持できるであろう。アミノ酸残基の保存性置換又は同 一性をもたらさない、アミノ酸残基におけるこのような許容し得る改質の例には 、例えば、セリンに代えてプロリン、及びグルタミン酸に代えてセリンがある。 前記の適切なコンピュータプログラム（Bestfit of Translate）を用いて最適に 配列することができ、かつ免疫原性を潜在的に発揮し得るペプチド、ポリペプチ ド及びペプチド形態に含まれ得るものである、少なくとも10アミノ酸残基長ペプ チド配列及び14アミノ酸残基長ペプチド配列の例には、下記のHPV-18、HPV-16、 HPV-11及びHPV-6がある： 実際、BPV の配列(II)は、いずれの前記ヒト乳頭腫ウイルスに対しても、十分 な相同関係を有していない。 したがって、本発明のさらなる範囲において、先に列挙した、10種のHPV 配列 (I)及び(III)の何れとも対応する配列を含む、ヒトにおける免疫原性応答を誘導 することができる免疫原性ペプチドを提供する。 保存性アミノ酸残基置換を考慮に入れた場合、前記L2フラグメントは、配列(I )、(II)及び(III)に関し35% の類似性を有するのが好ましい。したがって、乳頭 腫ウイルスL2ペプチドフラグメントが、子牛乳頭腫ウイルスL2フラグメント又は ヒト乳頭腫ウイルスL2フラグメント、又はその誘導体であってもよい。 したがって、本発明のさらなる実施態様において、配列(I)のBPV-4 L2ペプチ ドフラグメントの下線を引いた部分と少なくとも60% の同一性を有し、かつ配列 (III)の下線を引いた部分と43% の同一性を有し、哺乳動物に免疫応答を誘導す ることができるペプチド配列を提供する。 また、本発明は、乳頭腫ウイルスL2タンパク質のＮ末端部分を含む、予防的に 有効な単離ペプチドフラグメントを提供する。該予防的に有効な単離ペプチドフ ラグメントはこれまでに記載されたものとほぼ同じフラグメントのサイズを有す る。 当然、本発明はさらに、前記単離ペプチドフラグメント、又は本発明の免疫原 性ペプチドを生じさせるのに用いることができる如何なるペプチドフラグメント にも対応するヌクレオチド配列を提供する。 また、本発明は、乳頭腫ウイルス感染を予防的に治療するのに用いる、医薬と して許容し得る担体と混合されている、長さが少なくとも約10アミノ酸のＮ末端 L2タンパク質を含む、医薬配合物を提供する。該ペプチドは長さが約20アミノ酸 程度で、Ｎ末端BPVL2 及び／又はHPVL2 ペプチドと少なくとも30% の同一性を有 するのが好ましい。 一般的に言うと、該Ｎ末端L2ペプチドフラグメントの予防的効果は、例えば、 ヒトにおいて、HPV-18、HPV-16、HPV-11及びHPV-6 といった、それぞれの乳頭腫 ウイルスタイプに限定することができる。したがって、ヒト及び／又は雌牛のよ うな哺乳動物に一般的な予防的適用を行うためには、予防接種すべき具体的な乳 頭腫ウイルスが特定できない場合、これまで記載された異なるＮ末端L2ペプチド フラグメントの混合物、カクテルを用いるのが好ましいであろう。 この予防的治療はヒト及び雌牛のような哺乳動物の乳頭腫ウイルスに適用する ことができる。ヒトの場合、本発明は乳頭腫ウイルス感染自体に予防的治療に適 用できるだけでなく、乳頭腫ウイルス感染の結果として直接又は間接的に起きる 二次疾患にも適用することができる。このような疾患のタイプには、咽頭腫瘍、 皮膚の腫瘍及び性器の腫瘍があり、軽度の疾患であるか否かを問わない。雌牛の 場合、当該治療は、乳腺又は乳頭のイボのような軽度の疾患に対する予防的な治 療、又は消化管における乳頭腫ウイルス感染の防止に特に有用である。 一般に、前記L2Ｎ末端フラグメントは組換えＤＮＡ技術によって調製する。特 に、これまで記載してきた、乳頭腫ウイルスL2オープンリーディングフレーム（ ＯＲＦ）又はその誘導体は、分子的にクローン化して、E.coliのような適当な細 菌宿主にトランスフェクトし、かつ培養することができる、細菌性発現ベクター に入れることができる。これまで記載してきたように、L2タンパク質のＮ末端の 異なるペプチドフラグメントを、このようなフラグメントの治療的予防効果が実 質的に損なわれない限り、製造することができる。Ｎ末端L2フラグメントは、医 薬として許容し得るワクチン配合物に入った、適当な融合タンパク質の形態（E. coli が産生するようなタンパク質、例えば、グルタチオン-S- トランスフ ェラーゼ-L2）で投与することができる。それに代わり、該L2フラグメントをそ の融合パートナーのタンパク質から切り出し、適当な医薬として許容し得る配合 物において、それ自身混合することができる。全ての投与を行う場合において、 該L2フラグメントは、免疫を誘導する程度の免疫原性効果を引き起こすことがで きるであろう。 したがって、Ｎ末端L2ペプチドフラグメントは天然の形態であっても、治療的 予防効果に実質的に影響を与えない、付加、欠失又は置換を伴うものであっても よい。それに代わり、Ｎ末端L2ペプチドフラグメントは、合成された形態（直接 的ペプチド合成による製造）で、治療的予防効果に実質的に影響を与えない、付 加、欠失又は置換を伴うものであってもよい。 該Ｎ末端L2タンパク質フラグメント（又は免疫原性ヌクレオチド配列）が通常 、医薬配合物の形態で投与されることになる。該配合物は医薬として許容し得る 担体を含んでいる。該担体は、該配合物の他の成分と親和性であり、かつその投 与を受ける者に有害でないという意味で許容できるものでなければならない。 該Ｎ末端L2タンパク質フラグメントが胃の中で壊されるという理由で、経口投 与は好ましくない。医薬配合物は、皮下、筋肉及び静脈注射、または座薬及び膣 座薬を含む非経口的投与ができるように配合するのが好ましい。非経口的投与を 行うため、該配合物は適当な液体賦形剤中で無菌溶液又は懸濁液として提供する のが好ましい。また、この配合物は、防腐剤及び該配合物を等浸透圧にするため の物質を含んでいてもよい。該配合物は単位投与量又は複数回投与量の容器に入 れて提供してもよい。該担体は一般に発熱性であろう。各投与単位は一般に該L2 タンパク質フラグメントの100 〜10,000μg/を含んでいる。該タンパク質フラグ メントの予防的効果を強化するために、水中油型エマルジョンとして、又は当該 技術分野で公知の他のアジュバンド系を使用して、フロンズ(Freund's)不完全ア ジュバンドのようなアジュバンドを一緒に投与することができる。前記他のアジ ュバンド系とは、Pilacinskiらの論文(1986 年)で用いられたL101及びDDA のよ うなものである（Immunisation against bovine papillomavirus infection.Cib a Foundation Symposium 120; Papillomaviruses 136 〜148 頁）。好ましい実施態様の記載 本発明の実施態様を次の実験的なプロトコルのみに関連する例を介して、ここ に記載する。ペプチドL2a は本発明を詳細に示すものである。L2b 及びL2c タン パク質は比較の目的でのみ示すものである。図１： は、ワクチンタンパク質の免疫学的活性部分を調べるために投与４週間後 の時点で、ワクチンタンパク質のＮ末端タンパク質フラグメントL2a 、中間部分 L2b 及びＣ末端L2c に対する、L2タンパク質フラグメントで予防接種された動物 から得た免疫血清における抗体応答を示すものである。図２： は、比較を目的としてウシ乳頭腫ウイルス−4L2c ワクチンの結果を示す ものである。図３： は、ウイルス接種後、14日までの時間経過におけるL2a 、L2b 及びL2c に 対する抗体の分析結果を示すものである。図４： は、全てのL2a （本発明）で予防接種した動物がBPV-4 感染に抵抗性であ ることを示す。図５Ａ及び５Ｂ は、L2タンパク質のＮ末端によりコードされた３種の免疫優性Ｂ −細胞エピトープの存在を示している。図６： は、L2a 、L2b 及びL2c を含むpGEX細菌性発現ベクターを示す。図７： は、図５Ｂの３種のBPV-4L2aエピトープのアミノ酸配列を示す。実施例１：組換えL2タンパク質の発現と生成 グルタチオン-S- トランスフェラーゼ(GST)遺伝子を含むプラスミドpGEXが、S mith and Johnson K.S．の論文に記載されている(Gene 67，31 〜40頁(1988年)) 。後半部(L)BPV-4L2 ＯＲＦを３種のフラグメントに分子的にクローンし、pGEX に導入することにより、図６に示した細菌性発現ベクターを形成した。前記３種 のフラグメント、L2a 、L2b 及びL2c を下記の３種Dde １フラグメントとしてク ローン化した。 (i)pGEX2Tにおける、アミノ酸11〜アミノ酸200 のBPV-4L2 タンパク質のＮ末端 をコードする5’末端フラグメント（nt 4042 〜4610） (ii)pGEX3X における、アミノ酸201 〜アミノ酸326 を コードする中間フラグメ ント（nt 4610 〜4989） (iii)pGEX3Xにおける、アミノ酸327 〜アミノ酸524 のＣ末端をコードする3'末 端フラグメント（nt 4989 〜5629） 組換えプラスミドpGEX2T L2a，pGEX3X L2b及びpGEX L2cをE.coli JM109にトラ ンスフェクトし、次いで該細菌をアンピシリン100 μg/mlを加えたL-ブロス(Gib co BRL)中で中間対数増殖期まで生育させた。イソプロピル-b-D- チオガラクト ピロノシド(IPTG，BioFine，Ipswich)100 μg/mlを加えることにより、これらを グルタチオン-S- トランスフェラーゼ融合タンパク質を発現するように１〜４時 間誘導した。グルタチオン-S- トランスフェラーゼL2a 、L2b 及びL2c を、DNア ーゼ1 300 μg/ml及びデオキシコレイト１mg/mlを含むライソザイム緩衝液（蔗 糖25% 、10mM-MgCl₂，50 mMTris-HCl pH 8.0，ライソザイム１mg/ml）に懸濁し た細菌から封入体をペレット化することにより多量に調製し、次いで、0.5% Tri ton X 100/10 mM-EDTA（pH 8.0）で洗浄した。収量は湿った細菌重量１ｇ当たり ２〜３mgであり、純度50〜70% を達成した。全ての場合において、予防接種を行 う前に、煮沸し、かつ音波処理して、5%SDS，5mM-2- メルカプトエタノール、50 mM-Tris-HCl pH 8.0 に懸濁した。実施例２：予防接種 1．L2a 、L2b 及びL2c の混合物の接種に続く血清抗体 子牛に、L2a（BPV-4-GST 融合タンパク質のＮ末端部分）、L2b（BPV-4-GST融 合タンパク質の中間部分）及びL2c（BPV-4-GST融合タンパク質のＣ末端部分）の カクテルを接種した。これらの動物から得た免疫血清を、予防接種後、及び抗原 投与後の異なる時間に、該ワクチンタンパク質の該Ｎ末端部分（L2a）、該中間 部分（L2b）及び該Ｃ末端部分（L2c）（すなわち、カクテル）に対する抗体を分 析し、該タンパク質の免疫学的活性部位を決定した。最初に、ウイルスの投与４ 週間後に回収した血清を、分析した。全ての血清は、L2c に対する抗体を有して いたが、L2a 又はL2b に対するものは無かった（図１参照）。この理由から、L2 c タンパク質における免疫原性エピトープ、及びこのタンパク質がさらに予防接 種の研究のために選択されることになった。 ii）L2c フラグメントの接種 次いで、12頭の子牛にL2c 融合タンパク質（Ｃ末端）を接種し、他の12頭の子 牛をコントロールとして用いた。接種を受ける各動物に、４週間あけて２回に渡 り、アジュバンドとしてアルミニウム塩（ゲルに含まれる、水酸化アルミニウム ３% とリン酸アルミニウム２% の等容量（Intervet、UKから入手））を伴うタン パク質330 μgを接種した。第２回目の接種（追加抗原刺激）から２週間経過後 、全ての動物に、口唇10箇所にBPV-4 の粒子10¹¹個を投与した（各箇所毎に粒子 10¹⁰個）。抗原投与後、該動物を12週間にわたり４週間間隔で検査した。L2c は 細胞性及び体液性応答を引き出すことはできたが、動物をBPV-4 の攻撃から守る ことはできなかった（図２）。 (iii)さらなる血清抗体研究 第２回目の接種（追加抗原刺激）から２日、７日及び14日後、及びウイルス投 与２日後に、免疫血清の試料をL2a 、L2b 及びL2c に対する抗体に関して分析し た。L2b に対する抗体はどの時点においてもほとんど検出されず、L2a に対する 抗体は接種後、かつ該投与前に高い力価で存在したが、この高い力価は該投与後 直ぐに劇的に低下した（図３；表１）。 (iv)L2a を用い成功した処置 次いで８頭の子牛にL2a タンパク質（Ｎ末端）を接種し、10頭の子牛をコント ロールとして用いた。L2c 融合タンパク質に関し先に記載したように、各動物に 接種を行い、投与を行った。すべてのL2a で接種を行った動物はBPV-4 感染に対 し抵抗性であった（図４）。したがって、驚くべきことに、L2免疫原性エピトー プはＮ末端L2a 部分にあることが見出された。実施例３：エピトープ地図作成（ELISA） さらに研究を行って、実施例２に記載されている一般的接種の戦略に従ってL2 a フラグメント内のエピトープ地図の作成を行った。合成ペプチドをAlta Bio-s cience(University of Birmingham)から入手した。該ペプチドは一般に20アミノ 酸残基長で、BPV −L2Ｎ末端タンパク質に及ぶ、10アミノ酸残基と重複している 。10 mM 炭酸ナトリウム緩衝液(pH 9.6)中に溶かしたペプチドを、２μg/ウェル でマイクロタイタープレート上にコートした。該プレートを４℃で一晩放置した 。プレートを山羊血清10％、無脂肪乾燥ミルク５％、Tween0.5％を含むリン酸緩 衝生理食塩水(PBS)で、37℃で１時間ブロックした。自動プレート洗浄器を用 い、プレートをTween0.5％を含むPBS で６回洗浄した。１：２又は１：10で希釈 した免疫子牛血清を各ウェルに加え37℃で一晩放置した。プレートを先と同じよ うに６回洗浄した。アルカリホスファターゼ(DynaTech)と組合わせた山羊抗子牛 IgG を加え、１：500 に希釈し、37℃で１時間反応させた。該プレートを先と同 じように６回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質キット(Biorad)を用いて現像 した。該キットは、基質として3-ヒドロキシル-2- ナフトニックアシド 2,4ジメ チルアニリド／4-クロロ-0- トルイジン-1,5 ジアゾニウムナフタレンジスルホ ネートを使用し、バイオラド(Biorad)プレートリーダを用いて読み取る。結果を 図５に示した。 L2a で予防接種した動物から得た血清をL2Ｎ末端に渡るペプチドに対し応答す るその抗体について分析した。 その結果を図5A（追加抗原接種後１週間の免疫血清）、及び図5B（追加抗原接 種後２週間で、ウイルス投与直前）に示した。 ８頭の雌牛のグループを処置し（図5Aにおいて257 から287 の範囲で番号を付 した。）、図5Bにおいて各種のシンボルで表した。図5Aに示された20アミノ酸ペ プチド（アミノ酸１〜15から193〜197、実際アミノ酸20未満のいくつかのペプチ ド）は図5Bにおいて１〜20の番号を付した20ペプチドに対応する。 図5Aは追加抗原接種後１週間におけるペプチド11（アミノ酸101〜120）のエピ トープの存在を示す。図5Bに示されているように、追加抗原接種後２週間で、３ 種のエピトープに対する応答が現れた。これらはペプチド11(aa 101〜120)、ペ プチド14(aa 132〜151)、及びペプチド16(aa 151〜171)である。これら３種のペ プチドエピトープの配列を図７に記載した（HPV との相同性を示す部分に下線を 引いた。）。これら３種のペプチドが、免疫血清及び該タンパク質のＮ末端にお ける免疫優性B細胞エピトープの存在によって認識された。ペプチド11及び16は 主要なエピトープをコードし、かつエピトープ14は主要でないエピトープをコー ドする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 ジャーレット ウィリアム フレミング ホーガン イギリス ブレインフィールド ジー63 ９エイエックス オーチネーデン ハウス （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．乳頭腫ウイルスL2タンパク質のＮ末端領域に含まれている免疫原性アミノ酸 配列を有する、乳頭腫ウイルス感染の予防に用いる免疫原ペプチド。 ２．前記Ｎ末端が、乳頭腫ウイルスL2のアミノ酸11〜200 の間の領域として規定 される、請求項１記載のペプチド。 ３．前記免疫原性配列がアミノ酸10〜20個の長さである、請求項１又２記載のペ プチド。 ４．BPV 配列(I)、BPV 配列(II)、BPV 配列(III)、図７記載のように下線を引い たこれらの配列の一部、又は予防的効果を有するこれらの誘導体に対応する配列 を有する、請求項１記載のペプチド。 ５．本明細書に記載された、５種のHPV 配列(I)配列、又は５種のHPV 配列(III) 配列、又は予防的効果を有するこれらの誘導体のいずれにか対応する配列を有す る、請求項１記載のペプチド。 ６．前記免疫原性アミノ酸配列が他のタンパク質又はペプチドと結合、又は融合 している請求項１〜５のいずれか１項記載のペプチド。 ７．組換えＤＮＡ技術により調製されたものである請求項１〜６のいずれか１項 記載のペプチド。 ８．合成により調製されたものである請求項１〜６のいずれか１項記載のペプチ ド。 ９．請求項１〜８のいずれか１項記載の免疫原性ペプチド又は免疫原性配列をコ ードする核酸配列。 10．請求項１〜８のいずれか１項記載の免疫原性ペプチド、又は該ペプチドをコ ードする免疫原性ヌクレオチド配列を含む、医療用ワクチン配合物。 11．請求項１〜８のいずれか１項記載の免疫原性ペプチド、又は該ペプチドをコ ードする免疫原性ヌクレオチド配列を投与することを含む、乳頭腫ウイルス感染 に対し哺乳動物を免疫する方法。 12．前記哺乳動物がヒトである請求項11記載の方法。 13．前記哺乳動物がウシである請求項11記載の方法。 14．乳頭腫ウイルス感染に対し免疫するワクチン配合物を生産することを目的と する、請求項１〜８のいずれか１項記載の免疫原性ペプチド、又は該ペプチドを コードする免疫原性ヌクレオチド配列の使用。