JPH08504592A

JPH08504592A - 水痘−帯状疱疹ウイルス（ｖｚｖ）に対するワクチン

Info

Publication number: JPH08504592A
Application number: JP6514805A
Authority: JP
Inventors: ジャコブ，ポール; マッサール，マール; オモン，ミッシェル; ボラン，アレックス
Original assignee: スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム）
Priority date: 1992-12-23
Filing date: 1993-12-17
Publication date: 1996-05-21
Also published as: GB9226768D0; ZA939564B; AU672870B2; NZ259362A; CA2152256A1; MX9307998A; CN1095106A; KR950704494A; EP0675957A1; WO1994014962A1; AU5814494A

Abstract

(57)【要約】本発明は、水痘−帯状庖疹ウイルス即時型蛋白１７５（ＩＥＰ１７５）およびその誘導体の組み換え法による製造方法を開示する−ＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＩＥＰ１７５、構造的または機能的相同物ならびに融合蛋白および真核宿主細胞に適合したベクター用に提供される。該蛋白およびその誘導体はＶＺＶに対するワクチンとして使用される。

Description

【発明の詳細な説明】水痘−帯状庖疹ウイルス（ＶＺＶ）に対するワクチン本発明は、水痘−帯状庖疹ウイルス（ＶＺＶ）の即時型蛋白１７５ならびにその誘導体、およびＶＺＶ感染の予防ならびに治療に使用するかかる蛋白からなるワクチンに関する。水痘−帯状庖疹ウイルス（ＶＺＶ）は、水痘（varicella）および帯状庖疹（z oster）の病因学的要因であるヒト・ヘルペスウイルスである。水痘は、初期感染または初感染から生じ、通常は、子供である間に獲得される比較的良性のものである。しかしながら、子供のころに水痘にかからなかった成人、および時折、免疫を有している個体に対して、ＶＺＶは生命を脅かすことがありうる。同様に、ＶＺＶ感染は、ウイルスが胎盤を通過しうるために、新生児に対してもＶＺＶは生命を脅かすことがありうる。直接接触することにより、水痘は、非常に伝染性の高いことが知られている。大部分のへルペスウイルスと同様に、ＶＺＶは、増殖が停止しているいくつかの細胞に感染する傾向がある。種々の潜伏期の後、水痘−帯状庖疹（ＶＺ）ウイルスは遊離されて他の細胞に感染しうる。このＶＺウイルスの再活性化は、年間推定５００万件の帯状庖疹を引き起こす（プロトキン（Plotkin）ら，ポストグラジュエイティッド・メディシン・ジャーナル（Postgrad Med J）第６１巻：１５５〜１６３頁（１９８５年））。帯状庖疹は、大脳神経節および末梢神経の炎症により特徴づけられ、急性の痛みを伴う。現在、該ウイルスを再活性化する因子は病的であると定義されている。ＶＺＶの弱毒化株て予防接種されたヒトは、ＶＺＶ感染に対して防御的な免疫性を獲得していることが示されている（アーベータ（Arbeter）ら，ジャーナル・オブ・ぺディアトリクス（J.Pedlatr.）第１００巻．８８６〜８９３頁（１９８２年）およびブルネル（Brunell）ら，ランセット（Lancet）第ii巻：１０６９〜１０７２頁（１９８２年））。この方法は、有効ではあるが、増殖している水痘 −帯状庖疹ウイルスに対する困難性による限界がある。ＶＺウイルスに対する抗原性化合物を同定するためにかなりの努力がなされてきた。改良されたＶＺワクチン、特に、サブユニットワクチンを開発するためには、ＶＺＶ外套蛋白を単離することが必要である。フォーガニ（Forghani）ら（ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J Virol.）第５２巻：５５〜６２頁（１９８４年））、オークボ（Okub o）ら（ウイロロジー（Virol.）第１２９巻：３５７〜３６５８頁（１９８３年））およびケラー（Keller）ら（ジャーナル・オブ・ウイロロジー第５２巻：２９３〜２９７頁（１９８４年））は、ＶＺＶ感染細胞およびＶＺウイルス粒子から、多くのウイルス特異的糖蛋白を同定した。現在に至るまで、有効な糖蛋白としての外部外套糖蛋白に関して、ＶＺＶに対する組み換え型サブユニットワクチンを製造する努力が集中している。本発明は、このアプローチとは有意に異なり、引き続いて起こるＶＺＶの攻撃に対する防御を提供するための、ＶＺＶの即時型非構造蛋白の使用に関する。細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による抗原認識の機構は、ネイティブな抗原のペプチドへの分解、ＭＨＣへの蛋白分解フラグメントの結合およびその複合体の細胞表面への輸送を必要とするので、糖蛋白のような必須の膜蛋白だけでなく、ウイルスによりコードされたポリペプチドはいずれも、Ｔ細胞により媒介される応答の有効な標的でありうる。しかしながら、ＶＺＶゲノムはいくつかの非構造蛋白および内部ウイルス粒子蛋白、さらに外部糖蛋白をコードしているので、このことにより、多くの有効なＣＴＬ標的を生じることとなり、どの蛋白が最も重要であるかがわからなくなる。ＶＺＶ感染は、遊離ウイルスの最小限の存在により特徴づけられる。潜伏期および再活性化の間、ウイルスは主に細胞内にある。したがって、再発性疾患は、高レベルの中和抗体によってさえも防止されず、ウイルスに対するコントロールは細胞により媒介される免疫性に依存する。それゆえ、予防接種により防御を行うためには、抗体応答のみならずＣＴＬ応答を誘導することが望ましい。有効なワクチンは、潜伏しているウイルスの再活性化の兆候が現れたらできるだけすみやかに行動することのできる感作ＣＴＬを活性化すべきである。ワクチン目的の予防または治療用の最も重要なＣＴＬ標的抗原を同定するために、本発明は、ＶＺＶの複製可能な生活環を考慮した。ウイルスゲノムを有する細胞内部でのウイルス蛋白合成の開始は、細胞表面でＭＨＣ分子により表されるウイルス蛋白フラグメントを発生させ、これを適切な特異性を有するＣＴＬの標的とする。ＶＺＶの複製生活環は約２４時間継続し、αまたは即時型（ＩＥ）β もしくは初期（Ｅ）およびγまたは後期（Ｌ）遺伝子産物の定序的発現を含む。それゆえ、後期の構造遺伝子の発現に先立つ感染細胞に対する初期のＣＴＬ攻撃およびその結果起こる溶解は、新たなウイルス粒子の生成を防止し、それゆえ、近隣細胞へのウイルス拡散を防止しうる。最も有用であるためには、ＣＴＬは、感染および再活性後に細胞内部に出現するきわめて初期のウイルス蛋白を検出すべきである。ＩＥ蛋白であるＩＥＰ１７５は、ＯＲＦ６２と命名されたオープンリーティングフレームによりコードされており、その蛋白自体、時々ＩＥ６２と呼ばれる。該蛋白は、相対分子量１７５ｋＤａのリン蛋白であるように思われるが（キンチントン（Kinchlnton）ら，ジャーナル・オブ・ウイロロジー第６６巻（１）：３５９〜３６６頁（１９９２年）、予想分子量は１４０ｋＤａである。該蛋白は、ヒト・Ｔ細胞により認識され（バージェン（Bergen）ら，ウイラル・イミュノロジー（Viral Immunol.）第４巻（３）：１５１頁（１９９１年））、重要な免疫標的であることが示唆された（バージェンら，ジャーナル・オブ・インフェクシャス・デイジージズ（J.Infectious Diseases）第１６２巻：１０４９頁（１９９０年））。当業者に利用可能な、組み換えＤＮＡ法を用いて蛋白を製造するための多くの系があるが、これらの大部分は、ＩＥＰ１７５全長の製造においては成功しないことが証明されている。例えば、昆虫細胞において該蛋白は分解される。しかしながら、本発明者らは、ネイティブなＩＥＰ１７５に対する機能的等価物および構造的等価物（すなわち、ちょうど同じ大きさのもの）が、ＣＨＯ細胞における発現により産生されることを見いだした。本発明の具体例によれば、ネイティブな蛋白に対する機能的等価物であるＶＺＶ汚染のないＩＥＰ１７５が提供される。さらに本発明は、生理学的に機能的なＩＥＰ１７５の誘導体を包含する。本発明の１の態様において、本明細書に添付した図１に示す配列と実質的に相同なアミノ酸配列を有するＶＺＶ汚染のないＩＥＰ１７５蛋白が提供される。実質的に相同とは、図１に示すアミノ酸配列と、少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するＩＥ１７５と機能的に等価な蛋白を、本発明が提供することを意味する。ＩＥＰ１７５の好ましい誘導体は、イー・コリ（E.coli）またはＣＨＯ細胞中での発現において分泌されるものである。詳細には、アミノ酸２２６ないし２５７、およびアミノ酸６４８ないし７３３が欠失している分泌性誘導体が提供される。他の免疫原性誘導体の典型的なものは、例えばｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIVまたはｇｐV（時々、ｇｃＩ、ｇｃII、ｇｃIII等としても知られる）のごときＶＺＶ糖蛋白、他のＶＺＶ抗原、あるいはＢ型肝炎表面抗原のような他の非ＶＺＶ抗原由来の１種またはそれ以上のエピトープを有するさらなる配列を含む融合ポリペプチドであろう。これとは別に、本発明の免疫原性誘導体を、アジュバントの場合と同様に免疫剌激特性を有する、あるいはＶＺＶ蛋白に対する免疫応答を高める、またはＶＺＶ蛋白の発現、精製もしくは処方に有用なキャリアポリペプチドに融合させることができる。好ましい融合蛋白は、上記のごとく、ＩＥＰ１７５の分泌可能形態に融合したアンカーレスｇｐIIからなる。さらなる態様において、本発明は、異種宿主中で機能しうる調節配列の支配下にあるＩＥＰ１７５をコードしている発現可能なＤＮＡ分子またはその誘導体を提供する。詳細には、本明細書に添付した図１に示すＤＮＡ配列と実質的に相同なＤＮＡ分子が提供される。実質的に相同とは、図１に示すＤＮＡ配列と、少なくとも７５％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有するＤＮＡ配列を意味する。ＩＥＰ１７５またはその誘導体をコードしているＤＮＡ配列を、当該分野で知られている塩基の付加、欠失、置換または転移により製造することができる。図１において、最初のＡＴＧはＮ−末端メチオニンをコードし、最後のＴＧＡは翻訳終止（すなわちストップ）シグナルである。本発明のさらなる態様において、水痘−帯状庖疹ウイルスのＩＥＰ１７５もしくはその誘導体をコードしており、真核宿主細胞、最も好ましくはＣＨＯ細胞中で機能する調節領域に作動するように連結したＤＮＡ配列からなる、組み換え型ＤＮＡ分子またはべクターが提供される。本発明の別の態様において、水痘− 帯状庖疹誘導体のＩＥＰ１７５蛋白またはその誘導体の製造方法であって、該ＤＮＡ配列を宿主細胞中で発現させ、次いで、その蛋白産物を回収することからなる方法が提供される。関連した態様において、本発明は、組み換え型ＤＮＡ分子で形質転換された組み換え型ＣＨＯ細胞系を提供する。さらなる態様において、本発明は、本発明ＶＺＶＩＥ１７５蛋白またはその誘導体の製造方法であって、該蛋白またはその誘導体をコードしているＤＮＡ配列を組み換え型宿主細胞中で発現させ、次いで、得られた蛋白産物を回収することからなる方法を提供する。マニアティス（Maniatis）ら，モレキュラー・クローニングーア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）；コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor），１９８２年およびＤＮＡクローニング（DNA Cloning）第Ｉ、IIおよびIII巻（ディー・エム・グローバー（D.M.Glov er）ら編，ＩＲＬプレス・リミテッド（IRL press Limited）に記載のごとき、慣用的な組み換え法により本発明方法を実施することができる。かかる暗号配列からなるＤＮＡ分子を、既知方法（例えば、ｍＲＮＡ鋳型から相補的もしくはｃＤＮＡを調製）を用いてＶＺＶｍＲＮＡから誘導することができ、あるいはＶＺＶゲノムＤＮＡから単離することができる。エッカー（Ecke r）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７９巻：１５６〜１６０頁（１９８２年）、ストラウス（Straus）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第７９巻：９９３〜９９７頁（１９８２年）、ストラウスら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.Gen.Virol.）第６４巻：１０３１〜１０４１頁（１９８３年）およびダビソン（Davison）ら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー第６４巻：１８１１〜１８１４頁（１８９３年）参照。別法として、ｇｐＩ、ｇｐIIおよびｇｐIIIコードしているＤＮＡ分子を、標準的なＤＮＡ合成法により合成することもできる。よって、さらに本発明は、適当なモノー、ジーまたはオリゴマーヌクレオチド単位の縮合によりＤＮＡ配列を製造する方法を提供する。上記製造を、化学的、酵素的、あるいはこれら２方法を組み合わせることにより、適宜、インビトロまたはインビボで行うことができる。よって、バイオケミストリー（Biochemistry）第２４巻：５０９０〜５０９８頁（１９８５年）においてディー・エム・ロバーツ（D.M.Roberts）ら，により記載されたような慣用的方法によって適当なＤＮＡフラグメントの酵素的ライゲーションを行うことにより、ＤＮＡ配列を合成することができる。適当な制限酵素で所望ヌクレオチド配列を含むＤＮＡを消化することにより、化学合成により、あるいはこれらの方法の組み合わせにより、ＤＮＡフラグメントを得ることができる。制限酵素での消化を、適当なバッファー中、２０〜７０℃の温度において、通常は、０．１〜１０μｇのＤＮＡとともに５０μｌまたはそれ以下の体積中で行うことができる。ＤＮＡの酵素的ポリマー化を、所望のヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有するバッファー中、１０〜３７℃の温度において、通常は、５０μｌまたはそれ以下の体積中で、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）のごときＤＮＡポリメラーゼを用いて行うことができる。ＤＮＡフラグメントの酵素的ライゲーションを、適当なバッファー中、４℃ないし室温において、通常は、５０μｌまたはそれ以下の体積中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのごときＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。「ケミカル・アンド・エンザイマティック・シンセシス・オブ・ジーン・フラグメンツーア・ラボラトリー・マニュアル（Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual）」（エイチ・ジー・ガッセン（H.G. Gassen）およびエイ・ラング（A.Lang）編），ワインハイム（Weinheim）のフェァラーク・ヘミー（Verlag Chemie）、または他の科学出版物、例えば、エム・ジェイ・ゲイト（M.J.Gait）、エイチ・ダブリュ・ディー・マテス（H.W.D.Matt es）、エム・サイン（M.Singh）、ビー・エス・スプロウト（B.S.Sproat）およびアール・シー・チトマス（R.C.Titmas），ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）第１０巻：６２４３頁（１９８２年）；ビー・エス・スプロウトおよびダブリュ・バンワース（W.Bannwarth），テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）第２４巻：５７７１頁（１９８３年）；エム・ディー・マテウチ（M.D.Matteucci）およびエム・エイチ・カルサーズ（M.H.C aruthers），テトラヘドロン・レターズ第２１巻：７１９頁（１９８０年）；エム・ディー・マテウチおよびエム・エイチ・カルサーズ，ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Journal of the American Chemical S ociety）第１０３巻：３１８５頁（１９８１年）；エス・ピー・アダムス（S.P. Adams）ら，ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー第１０５巻：６６１頁（１９８３年）；エヌ・ディー・シンハ（N.D.Sinha）、ジェイ・ビエルナト（J.Biernat）、ジェイ・マクマナス（J.MacMannus）およびエイチ・ケスター（H.Koester），ヌクレイック・アシッズ・リサーチ第１２巻：４３５９頁（１９８４年）；ならびにエイチ・ダブリュ・ディー・マテスら，ＥＭＢＯジャーナル第３巻、８０１頁（１９８４年）に記載のごとき固相法を用いて、慣用的なホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホラミダイト化学により、ＤＮＡ配列またはフラグメントの化学合成を行うことができる。好ましくは、自動ＤＮＡ合成装置を用いる。好ましくは、ＤＮＡ配列を、一緒になって蛋白をコードしているＤＮＡ配列からなる、２個またはそれ以上のＤＮＡ分子をライゲーションすることにより調製する。所望配列を有するベクターを適当な制限酵素で消化することにより、ＤＮＡ分子を得ることができる。正確なＤＮＡの構造およびそれが得られる方法は、所望蛋白産物の構造に依存する。上記蛋白をコードしているＤＮＡ分子を構築するのに適した方法の設計は、当業者が常に行うことである。宿主細胞と両立可能なベクターを開裂して線形ＤＮＡセグメントを得、ライゲーション条件下でＩＥ１７５蛋白または誘導体をコードしている１つまたはそれ以上のＤＮＡ分子と該線形セグメントとを結合することにより、本発明に従い、発現べクターを調製することができる。線形セグメントと１つ以上のＤＮＡ分子とのライゲーションを、所望により、同時にまたは引き続いて行ってもよい。かくして、ベクター構築を行っている間に、ＤＮＡ配列を前以て形成あるいは形成することができる。ベクターの選択は、一部には、宿主により決定されるであろう。より詳細には、本発明の好ましい宿主細胞はＣＨＯ細胞である。本発明宿主細胞に適したベクターとしては、プラスミドおよびコスミドが挙げられる。ＤＮＡの制限的切断、ポリマー化およびライゲーション用の適当な酵素を用い、例えば、マニアティスら（上で引用）記載の方法により、慣用的にＩＥ１７５発現ベクターの調製を行うことができる。ポリマー化およびライゲーションを、ＤＮＡポリマーの調製に関して上に記載したようにして行うことができる。制限酵素での消化を、適当なバッファー中、２０〜７０℃の温度において、通常は、０．１〜１０μｇのＤＮＡとともに５０μｌまたはそれ以下の体積中で行うことができる。形質転換条件下で、本発明発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、組み換え宿主細胞を調製することができる。適当な形質転換条件は慣用的であり、例えば、マニアティスら（上で引用）または「ＤＮＡクローニング」第II巻，ディー・エム・グローバー編、ＩＲＬプレス・リミテッド（１９８５年）に記載されている。ベクターＤＮＡの細胞上へのカルシウム共沈またはエレクトロポレーションにより、培養中の哺乳動物細胞を形質転換することができる。ＤＮＡ配列を発現できる条件下での形質転換宿主細胞の培養を、例えば、上記マニアティスおよび「ＤＮＡクローニング」記載のごとく、慣用的に行う。よって、好ましくは、細胞に栄養を供給し、４５℃未満の温度で培養する。ＶＺＶＩＥ１７５蛋白発現産物を、宿主細胞に応じた慣用的方法により回収し、化学的または酵素的に産物を分泌もしくは放出させ、得られる溶解物から蛋白産物を単離する。産物が分泌可能である場合には、通常、産物を栄養培地から単離する。ＩＥＰ１７５蛋白を発現する安定な形質転換哺乳動物細胞系からの単離用に設計されたベクター、例えば、ウシ・乳頭腫ウイルスベクターまたはチャイニーズハムスター卵巣細胞中で増幅されたベクター中にＤＮＡ配列を組み入れる（「ＤＮＡクローニング」第II巻，ディー・エム・グローバー編、ＩＲＬプレス・リミテッド（１９８５年）；カウフマン，アール・ジェイ（Kaufman,R.J.）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biolo gy）第５巻：１７５０〜１７５９頁（１９８５年）；パブラキス，ジー・エヌ（ Pavlakis,G.N.）およびハマー，ディー・エイチ（Hamar,D.H.）プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ第８０巻：３９７〜４０１頁（１９８３年）；ゲデル，ディー・ブイ（Goeddel，D.V .）ら，欧州特許出願第００９３６１９号（１９８３年））。本発明の１の具体例において、ＶＺＶＩＥＰ１７５蛋白がＣＨＯ細胞において発現される。ＩＥＰ１７５蛋白の発現のためには、Ｔｄｎ発現が好ましい。かかる系において、ＶＺＶ蛋白暗号領域からなる発現カセットは、ラウス・肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。かかるベクターは、イー・コリ（E.coli）または他のある種の適当な原核細胞において増殖する十分量の細菌ＤＮＡを含んでいる。かかるシャトルベクターはさらにＶＺＶ暗号領域に隣接した十分量の真核細胞ＤＮＡを含んでおり、真核宿主のゲノム中での組み換えおよび選択薬剤としてメトトレキサートを用いる組み込みＤＮＡの増幅を可能にする。他のプロモーターと比較すると転写プロモーション効率が高いため、ＲＳＶのプロモーターが好ましい。メトトレキサートに対する感受性のため、ＣＨＯＤＨＦＲ細胞が好ましい。慣用的な蛋白単離法、例えば、選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、およびモノクローナル抗体カラムをはじめとする親和性クロマトグラフィーにより、細胞培養物からのＶＺＶＩＰＥ１７５蛋白または誘導体の精製を行う。本発明はさらに、免疫防御量の本発明ＶＺＶＩＥＰ１７５蛋白を含有するワクチンに関する。「免疫防御」なる語は、ヒトに投与した場合に、引き続いて起こるＶＺＶ感染に対する、疾患を防止または緩和するに十分な量の防御抗体または免疫応答を誘導する十分量のＶＺＶＩＥＰ１７５蛋白をいう。したがって、本発明は、医薬担体、賦形剤または希釈剤と混合されたＶＺＶＩＥＰ１７５もしくはその誘導体からなるワクチン処方を提供する。本発明ワクチンが、さらに、ＶＺＶｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIVまたはｇｐVもしくはそれらの切形された誘導体のごとき他の抗原性成分を含有していてもよい。特に、欧州特許出願公開第０４０５８６７に開示されたような切形されたｇｐＩ、ｇｐIIまたはｇｐIIIが好ましい。本発明の好ましい具体例において、ＩＥＰ１７５またはＩＥＰ１７５誘導体と混合されたアンカーレスｇｐIIからなるワクチン組成物が提供される。アンカーレス（anchorless）は、哺乳動物細胞中で発現された場合、分泌を可能にするＣ−末端のアンカー領域のすべてを実質的に欠いているＶＺＶ糖蛋白誘導体を意味する。かかる蛋白は、ＥＰ−Ａ−０４０５８６７に記載されている。もう１つの具体例において、ＩＥＰ１７５または誘導体を表すアミノ酸配列およびｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIII、ｇｐIVまたはｇｐVもしくはそれらの誘導体のうちの１つを表すアミノ酸配列からなる融合蛋白よりなるワクチン組成物が提供される。さらなる具体例において、ＶＺＶ感染の治療または予防のためのワクチンの製造のためのＶＺＶＩＥＰ１７５またはその誘導体の使用がある。本発明はさらに、医薬に使用するためのＶＺＶＩＥＰ１７５またはその誘導体を提供する。本発明のさらなる態様において、ＶＺＶ感染に感受性のある、あるいはＶＺＶ感染に苦しんでいるヒトの治療方法であって、安全かつ有効量の本発明ワクチンを投与することからなる方法を提供する。各ワクチン投与量中の蛋白量は、典型的なワクチンにおける有意で不利な副作用なしに免疫応答を誘導する量として選択される。かかる量は、特異的免疫原が使用され、どの程度それが存在するかによって変更されるであろう。一般的には、各投与量は１〜１０００μｇ、好ましくは２〜１００μｇ、最も好ましくは４〜４０μｇの蛋白からなる。個々のワクチンの最適量は、対象における適当な免疫応答の観察をはじめとする標準的研究により確認されうる。最初のワクチン接種の後、十分に間隔をあけて、対象に１回または数回の追加免疫を与える。ＶＺＶ感染に感受性のあるヒトへのワクチン接種のほかに、帯状庖疹の再発、頻度、重さまたは期間を防止あるいは有意に軽減するために、本発明医薬組成物を用いて、ＶＺＶ感染に苦しんでいる患者を免疫療法的に治療することができる。本発明ワクチンにおいて、ＶＺＶＩＥＰ１７５蛋白の水溶液を直接使用することができる。別法として、前以て凍結乾燥された、またはされていないＶＺＶＩＥＰ１７５蛋白を、種々のいかなる既知アジュバントとも混合することができる。かかるアジュバントには、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチドおよびキルＡ（Quil A）、特にＱＳ２１または３デアシレーティッドリピドＡ（3D -MPL）のごときサポニン類が包含されるがこれらに限定されない。さらなる典型的別法としては、蛋白をリポソームのごとき微粒子中に封入することもできる。さらに別の典型的別法としては、ＶＺＶＩＥＰ１７５蛋白を、死ボルデテラ（Bordetella）または破傷風トキソイドのごとき免疫刺激性高分子に抱合させることもできる。ワクチン標品は、一般的には、ニュー・トレンズ・アンド・ディベロップメンツ・イン・ワクチンズ（New Trends and Developments in Vaccines），ボラー（Voller）ら編，メリーランド州ボルチモア（Baltimore）のユニバーシティー・パーク・プレス（University Park Press），１９７８年に記載されている。リポソーム中への封入は、フラートン（Fullerton），米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子への蛋白の抱合は、例えば、リクハイト（Likhit e），米国特許第４，３７２，９５４号およびアーマー（Armor）ら，米国特許第４，４７４，７５７号により開示されている。キルＡの使用は、ダルスガード（ Dalsgaard）ら，アクタ・ベテリナリア・スカンジナビカ（Acta Vet Scand）第１８巻：３４９ページ（１９７７年）に記載されている。３Ｄ−ＭＰＬは、米国リビ・イミュノケム（Ribi immunochem）から市販されており、英国特許出願第２，２２０２１１号および米国特許第４９１２０９４号に開示されている。ＱＳ２１は、米国特許第５０５７５４０号に開示されている。以下の実施例は説明的であるが、本発明を限定するものではない。制限酵素および他の試薬を、実質的には販売者の説明書にしたがって使用した。実施例１組み換え型種痘ウイルスに感染した細胞におけるＩＥＰ１７５の発現ＶＺＶゲノムＤＮＡを水痘に苦しむ患者から回収したウイルスから抽出した（材料は、べルギー国リエージュ（Liege）のサルーティルマアン（Sart-Tilman）のアンスティトゥ・ド・パトロジ・ウニベルシテ・ド・リエージュ（Institute de Pathologie,Universite de Liege）のランティエ博士（Dr.Rentier）から提供された）。ウイルスＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、塩基１００４４１から１１７０３４（デイビソン（Davison）ら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J.G en.Vlrol.）第６７巻，１７５９〜１８１６頁（１９８６年））に対応する〜１６．６ｋ塩基対のフラグメントを単離し、次いで、プラスミドｐＵｃ９のＥｃｏＲＩ部位中にクローン化した。このプラスミドから〜７キロベースのＳｓｐＩフラクメント（１０２２４１から１０９２９３）を単離し、ｐＵＣ１９のincil部位中にクローン化してプラスミドｐＮＩＶ２０１７を作成した。このプラスミドは、ＩＥＰ１７５蛋白に加えて５’および３’非翻訳ＤＮＡをコードしている。次いで、プラスミドｐＮＩＶ２０１７を、制限酵素のセットで消化して３つのフラグメント：蛋白のＮ末端部分をコードする２１９９塩基対のＢｓｔXI−ＢａｍＨＩフラグメント；蛋白のＣ末端部分をコードする１００２塩基対のＢａｍＨＩ−Ｐｐｕｍエフラグメントおよび７２８塩基対のＰｐｕｍＩ−ＭａｅIIIフラグメントを得た。合成オリゴヌクレオチドをこれらのフラクションに添加して単一制限部位に隣接した暗号カセットを得た。暗号カセットを保存のためにｐＵＣ１９中に導入した（プラスミドｐＮＩＶ２０２０）。オリゴヌクレオチド配列およびそのジャンクション（junction）を確認した。ＩＥＰ１７５暗号カセットをｐＮＩＶ２０２０から回収し、次いで、チャクラバルティ（Chakrabarti）ら，モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cellular B iology）第５巻，３４０３〜３４０９頁（１９８５年）記載のプラスミドｐＳＣ１１の誘導体である転移ベクターｐＵＬＢ５２１３中に挿入した。最終構築物ｐＮＩＶ２０２６を図２に示す。組み換え型転移プラスミドｐＮＩＶ２０２６を種痘に感染したＣＶ−１細胞中に転移させ、ブロモウリジン選択およびＸ−ｇａｌ存在下でのその青色によるプラーク精製後、組み換え型ウイルスを単離した。それをＶＶ２０２６と呼ぶ。プラークアッセイ用に、好ましくはＲＡＴ２細胞に対してヒト・Ｈ１４３線維芽細胞ＴＫ−株を用いた。細胞に感染させるのに用いた種痘ウイルスは、ＷＲ型（ボリシエビッツ・エル・ケイ（Borysiewicz L.K.）が出所）のものであった。方法は、組み換え型種痘ウイルスの獲得についてすでに記載されている方法に従った（マケット，エム（Mackett,M）およびスミス，ジー・エル（Smith,G.L.），ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J Gen Virol）第６７巻，２０６７〜２０８２頁（１９８６年），マケット，エム、スミス，ジー・エルおよびモス，ビー（Moss,B.），ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virology）第４９巻，８５７〜８６４頁（１９８４年））。感染の多重度１（ｍｏｉ１）の培養において組み換え型種痘ウイルスＶＶ２０２６を用いてＣＶ−１細胞を感染させた。感染１６ないし１７時間後に感染細胞（アッセイあたり約３ｘ１０⁵個）および培養後の培地（約２ｍｌ）を集めた。ＩＥＰ１７５蛋白の存在をウェスタンブロッティング実験により確認した。蛋白を１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロースフィルター上に移し、ＩＥＰ１７５蛋白のアミノ酸配列（アミノ酸１２９９から１３１０）由来の合成ぺプチドに対して生じたマウス・血清でプローブした。標準的方法により、アルカリ性ホスファターゼに抱合したヤギ・抗マウスＩｇＧおよび適当な発色基質を用いて複合体を検出した。結果は、ＶＶ２０２６に感染した細胞は、有効にＩＥＰ１７５蛋白を細胞質内に蓄積したが、培地中に放出することはできなかったことを示す。該組み換え型蛋白のサイズは約１５０Ｋであった。ａ）ｐＮＩＶ２０２６のＤＮＡ挿入物の構造を図２に示す。実施例２組み換え型バキュロウイルスに感染した昆虫細胞におけるＩＥＰ１７５の発現大量の組み換え型ＩＥＰ１７５蛋白を製造する観点において、我々は、バキュロウイルスおよび培養昆虫細胞に基づく発現系を用いた。プラスミドｐＶＩＶ２０２０から出発して、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩでの消化によりＩＥＰ１７５をコードしているカセットを回収し、次いで平滑末端化したものを、前以てＢａｍＨＩで切断され平滑末端化されているバキュロウイルス転移プラスミドｐＡｃＹＭ１中に挿入した。かくして得られた組み換え型プラスミドｐＮＩＶ２０３８は、ポリヘドリンプロモーターの支配下にあり、正しい方向のＩＥＰ１７５をコードしている配列を有している（図３）。プラスミドｐＡｃＹＭ１は、ポリヘドリン遺伝子プロモーター（ポリヘドリン遺伝子ではない）を含むＡｃＭＮＰＶゲノム由来の配列、および高コピー細菌プラスミドｐＵＣ８由来の配列を含むバキュロウイルスシャトルベクターである。マタウウラ（Matauura）ら，ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー（J. Gen.Virol.）第６８巻，１２２３〜１２５０頁（１９８７年）参照。公表されたプロトコール（サマーズ（Summers）ら，ＴＡＥＳ・ビュレチンＮＲ１５５５（TAES Bulletin NR1555），１９８７年５月；テキサス・アグリカルチュラル・イクスペリメンタル・ステイション（Texas Agricultural Experimenta l Station））に従い、組み換え型バキュロウイルス転移プラスミドｐＮＩＶ２０３８を、野生型ＤＮＡバキュロウイルスをスポドプテラ・フルギペドラ（Spod optera frugipedra）（Ｓｆ９）昆虫細胞中に、１μｇに対してそれぞれ５０の割合でトランスフェクションさせることにより導入した。スポドプテラ・フルギペドラ細胞（Ｓｆ９）は、ＡＴＣＣ（米国メリーランド州ロックビル（Rockvill e））から入手できる。上清を集めることにより、生じたウイルス粒子を得た。次いで、プラークアッセイにおいて、ウイルス含有培養基を用いてＳｆ９細胞に感染させた。数種の組み換え型バキュロウイルスが単離され精製された。次いで、それらを用いて培養Ｓｆ９細胞に感染させた。感染後、異なる時期において、感染細胞の全蛋白を回収し、ＩＥＰ１７５に特異的なマウス・抗ぺプチド血清を用いてウェスタン・ブロッティングによりＩＥＰ１７５の存在をアッセイした（上記参照）。この系においては、完全なＩＥＰ１７５の発現が示された場合はなかった。しかしながら、我々は、該蛋白の多数の切形された形態の発現を観察し、このことは、程度の進んだ蛋白分解が細胞内で起こったことを示すものであった。組み換え型バキュロウイルス転移プラスミドｐＮＩＶ２０３８を図３に示す。実施例３ＣＨＯ細胞におけるＩＥＰ１７５の発現さらなる発現系を試験して大量のＩＥＰ１７５を得るために、我々は、ＣＨＯ系に戻った。プラスミドｐＮＩＶ２０２０から出発して、ＰｓｔＩ（平滑末端）−ＰｖｕII の３９４６塩基対のフラグメントを単離し、プラスミドＴＤＮのＢｇ１II（平滑末端）とＥｃｏＲVとの間に挿入してｐＮＩＶ２０４２を得た。プラスミドＴＤＮは、コナーズ（Connors）ら，ＤＮＡ第７巻，６５１〜６６１頁（１９８８年）に記載されている。プラスミドＴＤＮは、ＲＳＶＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択マーカーおよび増幅のＤＨＦＲカセットを有している。ｐＮＩＶ２０４２は、性質上ＩＥＰ１７５の開始メチオニンに続く成熟プラスミノーゲンアクティベ一ター（ｔＰＡ）のＮ末端アミノ酸残基に対応する４個のアミノ酸残基に続く組織ｔＰＡのシグナルペプチドおよびＩＥＰ１７５の完全配列をコードしている（図１）。エレクトロポーレーションによりプラスミドｐＮＩＶ２０４２をＣＨＯｄｈｆｒ^-細胞中に導入した。ジェネティシン（Ｇ４１８）を用いて組み換え細胞系の選択を行い、メトトレキサートを用いて増幅を行った。用いたすべての方法は、モグイレフスキー（Moguilevsky）ら，ヨ一ロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）第１９７巻，６０５〜６１４頁（１９９１年）記載の方法に従った。Ｇ４１８^Rクローンを得、上記系を用いて全サイズのＩＥＰ１７５蛋白の産生をアッセイした。組み換え型蛋白を産生することが示されたクローンを、異なる濃度（５ないし５０ｎＭ）のメトトレキサートとともに増幅し、産生にっき再試験した。結果は、ＩＥＰ１７５が有効にＣＨＯ細胞において産生され、それが細胞質に蓄積すること、その見かけ上の分子量が約１７５ｋダルトンであることを示す。昆虫細胞系で観察されたのとは対照的に、ＣＨＯ発現系においては、蛋白分解が観察されなかった。最も良く産生するクローン１８．５．２２を５０ｎＭメトトレキサートでの増幅後に得た。ＩＥＰ１７５の産生を、当該蛋白（ペプチト１２９９ないし１３１０およびペプチド１７５〜４３６）に特異的な２種のマウス・抗ペプチド血清を用いてＥＬＩＳＡを用いてモニターした。上記のごとく行ったウェスタンブロット分析により、組み換え型ＩＥＰ１７５の構造上の完全性が確認された。意外なことに、組み換え型ＩＥＰ１７５は、ＩＥＰ１７５に関するＤＮＡ上にシグナルペプチドが存在するにもかかわらず、ＣＨＯ細胞の培地中に分泌されなかった。ＣＨＯ細胞のための発現プラスミドｐＮＩＶ２０４２を図４に示す。組み換え型ＩＥＰ蛋白が、構造的に適したものであることのみならず、それが天然蛋白の既知調節機能を示すことを証明するために、我々は、以下の実験を行った（参考文献：ジャッカーズ（Jackers）ら，１９９２年；リニー（Liny）ら，１９９２年）。ＩＥＰ１７５蛋白を発現するＣＨＯ細胞である１８−５−２２および対照ＣＨＯ細胞を、リポーター遺伝子であるクロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の暗号配列の上流に種々のＶＺＶプロモーターＤＮＡ配列を有するプラスミドのセットとともにエレクトロポーレーションした。これらのプラスミドを、べルギー国リエージュ（Liege）のサルーティルマア_ン（Sart-Tilman ）のアンスティトゥ・ド・パトロジ・ウニベルシテ・ド・リエージュ（Institut e de Pathologie,Universite de Liege）のランティエ博士（Dr.Rentier）から得た。次いで、得られたトランスフェクションされた細胞系を、酵素活性につきアッセイした（ＣＡＴアッセイ）。該アッセイは、ＶＺＶプロモーターに対する潜在的なＩＥＰ１７５の活性化効果を測定するものである。表１に、これらの実験結果をまとめてある。ＣＨＯ細胞中で産生されたＩＥＰ１７５蛋白は、いくつかの場合において、そのプロモーター活性を剌激しうることが理解できる。このことは、組み換え型ＩＥＰ１７５蛋白は、この点において、その天然等価物のように挙動することを示す。＋＋＋強力なＣＡＴ活性 − ＣＡＴ活性なしＭＤＢＰ主要ＤＮＡ結合蛋白ＰｏｌＲＮＡポリメラーゼ実施例４親核モチーフ（karyophilic motifs）を欠く分泌可能なＩＥＰ１７５蛋白をコードしているＤＮＡの構築４ａ．プラスミドＮＩＶ２０２０（実施例１参照）は、２種の親核モチーフを含む完全なＩＥＰ１７５蛋白をコードしている配列を有する。これらのモチーフは以下のアミノ酸配列を有する。モチーフ１は、アミノ酸残基２２６と２５４との間からなり、親核アミノ酸ストレッチＫＳＰＫＫＫＴＬＫＶＫを含み；モチーフ２は、アミノ酸残基６４８と７３３との間からなり、親核アミノ酸ストレッチＰＲＫＲＫＳを含む。ａ）ＡａｔIIおよびＳｐｈＩ；ｂ）ＰｐｕｍＩおよびＢｓｔＥIIでのｐＮＩＶ２０２０の消化物を、適当に平滑末端化し、ライゲーションして親核モチーフを含むＤＮＡ配列を欠くプラスミドを再構築する（図５）。４ｂ．生じた切形されたＩＥＰ１７５をコードするカセットを回収し、実施例３記載のやりかたで、プラスミド中、ｔＰＡシグナルを特徴づけている配列の下流に挿入する。生じたプラスミドでＣＨＯ細胞を形質転換して分泌型のＩＥＰ１７５を発現させる。実施例５ＩＥＰ１７５ｇｃＨ融合体の構築４ｂに記載したフラグメントを、ｇｃIIをコードしている配列（ＥＰ−Ａ−４０５８６７）の下流へ、融合体として挿入する。生じたプラスミドを用いてＣＨＯ細胞を形質転換し、ＩＥＰ１７５切形物ｇｃII切形物融合蛋白の発現を可能ならしめる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者マッサール，マールベルギー国ベー―1440ニーベル、リュ・デュ・ランディストリ24番、セルヴィス・デュ・ジェネティク・アプリケ、ファキュルテ・デ・スィヤンス、ユニベルシテ・リブレ・デュ・ブリュッセル (72)発明者オモン，ミッシェルベルギー国ベー―1440ニーベル、リュ・デュ・ランディストリ24番、セルヴィス・デュ・ジェネティク・アプリケ、ファキュルテ・デ・スィヤンス、ユニベルシテ・リブレ・デュ・ブリュッセル (72)発明者ボラン，アレックスベルギー国ベー―1440ニーベル、リュ・デュ・ランディストリ24番、セルヴィス・デュ・ジェネティク・アプリケ、ファキュルテ・デ・スィヤンス、ユニベルシテ・リブレ・デュ・ブリュッセル

Claims

【特許請求の範囲】１．ネィティブなＶＺＶＩＥＰ１７５およびその生理学的に機能的な誘導体に対して機能的に等価であるＶＺＶ汚染のないＶＺＶＩＥＰ１７５。２．図１に示す配列と実質的に相同的なアミノ酸配列を有する請求項１記載のＶＺＶＩＥＰ１７５。３．適当な宿主からの発現の際に分泌可能である請求項１記載のＶＺＶＩＥＰ１７５の生理学的に機能的な誘導体。４．アミノ酸２２６ないし２５７および６４８ないし７３３が欠失された請求項３記載の誘導体。５．その一部が請求項１ないし４記載のＶＺＶＩＥＰ１７５または生理学的に機能的な誘導体からなる融合蛋白。６．その一部がＶＺＶ由来のアンカーレスｇｐII蛋白誘導体からなる請求項５記載の融合蛋白。７．真核宿主細胞中で機能する調節領域に作動するように連結した、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の蛋白をコードしているＤＮＡ配列からなるべクター。８．請求項７記載のベクターで宿主細胞を形質転換し、次いで、得られた産生蛋白を回収することがらなる請求項１ないし６のいずれか１つに記載の蛋白の製造方法。９．医薬上許容される希釈剤、賦形剤または担体と混合された請求項１ないし６のいずれか１つに記載の蛋白からなるワクチン組成物。１０．請求項１ないし６のいずれか１つに記載の医薬用途のＶＺＶＩＥＰ１７５またはその生理学的に機能的な誘導体。１１．ＶＺＶ感染に感受性のある対象を予防的に処置するためのワクチンの製造のための請求項１ないし６のいずれか１つに記載のＶＺＶＩＥＰ１７５またはその生理学的に機能的な誘導体の使用。１２．無毒で有効な量の請求項１ないし６記載の蛋白を混合することからなるＶＺＶ感染に感受性の対象を予防的に処置する方法。