JPH05252965A - ＨＳＶ ｇＤ２バキユロウイルスの発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＨＳＶ ｇＤ２をエンコードする遺伝子を組
み込んだバキュロウイルスのＤＮＡで昆虫細胞をトラン
スフェクションし、そして前記遺伝子の発現を可能とす
る条件下に前記細胞を培養することからなるＨＳＶ ｇ
Ｄ２の組み換え産生法および該方法により産生される組
み換え糖タンパク質。 【効果】 産生される糖タンパク質は高度に免疫原性で
あり、ＨＳＶの感染の予防および処置のためのワクチン
の調製において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、組み換え的に産生されたウイル
スのタンパク質に関する。さらに詳しくは、本発明は、
昆虫宿主細胞中でバキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ）により単純ヘルペスウイルス２型（Ｈｅｒｐｅ
ｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２）（Ｈ
ＳＶ２）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）を組み換え産生する
ことに関する。これにより産生されたｇＤ２は免疫原性
および保護的であり、そしてそれ自体ＨＳＶの感染に対
して保護するためのワクチン組成物において有用であ
る。

【０００２】単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および
２型による感染は流行しており、そして、とくに新生児
および免疫無防備の個体において、潜在的に重大な健康
の問題である。粘膜表面に加えて、ウイルスの感染は
眼、脳または他の器官を包含し、そして頸癌の潜在的病
原性因子として関係づけらた（２、２４）。さらに、Ｈ
ＳＶは付随する物理的および生理学的不快を伴う、病気
の再発のエピソード（３０）の可能性をもつ潜伏性感染
を確立する。ＨＳＶワクチンの開発は、ウイルスの遺伝
子と腫瘍形成との関連により妨害され（３）、そしてワ
クチンの努力の集中を免疫予防および免疫治療へのサブ
ユニットのアプローチに向けた。

【０００３】単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄ
（ｇＤ）は、ヒトにおける使用のための主なワクチンの
候補である。両者をウイルスのエンベロープおよび感染
した細胞表面に関連させると、ｇＤはウイルスの初期の
事象において絶対必要な役割を演じ（１１、９）そして
交差反応性の中和性抗体（４）および細胞免疫応答
（１、２２、４０、４７、１１、３５、３１）の重要な
標的として働くことが示された。従来示されたように、
ＨＳＶ１感染したＶｅｒｏ細胞から誘導された、ｇＤの
自然の調製は、マウスおよびモルモットにおいてＨＳＶ
２対抗に対する保護を与え、霊長類において長期間の体
液および細胞の応答を引き出し（２５）そして健康な血
清陽性の大人（９）に投与するとき安全である。糖タン
パク質の収量を最適化しかつワクチン接種物中のゲノム
のウイルスまたは報告された形質転換領域の潜在的導入
を除去するために、ある数の組み換え系がｇＤの産生に
おいて使用されてきている。これらはバクテリア（４
４）、酵母菌（３７、４１）、ワクシニア（２８）、哺
乳動物（３６）およびバキュロウイルス（１４）の発現
系を包含する。これらの系の産生物は、動物のモデルに
おいて変化する程度の免疫原性を示した。バキュロウイ
ルス系は、翻訳後の修飾の安全性、許容されうる信頼
性、（１３、１５）、免疫原性（３３、４２、１４、３
４、８）ならびに、バキュロウイルスのホリヘドリン
（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーターのコントロール
下に配置されたとき、外来タンパク質の実質的な収量の
可能性（４５、６）の利点を提供する。

【０００４】本発明は、感染の基質としてスポドプテラ
・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐ
ｅｒｄａ）の細胞を使用して、バキュロウイルスが発現
した単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質Ｄ（ｂｇＤ
２）を、最初に、提供する。生ずる糖タンパク質を精製
し、そしてＨＳＶ誘導ｇＤの生化学的および免疫化学的
特性に合致することが示された。さらに、このワクチン
候補で免疫化したマウスは、全ウイルスおよび精製した
糖タンパク質の体液および細胞の応答を例示し、そして
致死的ＨＳＶ２の対抗に対して保護される。

【０００５】本発明は、ｇＤ２の遺伝子を組み込んだバ
キュロウイルスのＤＮＡで昆虫宿主細胞をトランスフェ
クションし、そして前記遺伝子の発現を可能とする条件
下に前記細胞を培養することからなる、組み換えｇＤ２
を産生する方法に関する。好ましい実施態様において、
ｇＤ２をバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーター
のコントロール下に配置する。これにより産生された糖
タンパク質は、高度に免疫原性であり、そして致死的投
与量のＨＳＶを使用する対抗に対して保護的である。こ
うして、本発明は、また、有効量の実質的に純粋なバキ
ュロウイルス産生したｇＤ２、および製剤学的に許容さ
れうる担体からなる、ワクチン組成物を提供する。この
ような組成物は、有効量のワクチン組成物を宿主に投与
することからなる、ＨＳＶの感染の処置および予防にお
いて使用することができる。

【０００６】また、本発明は、昆虫細胞中のｇＤ２遺伝
子の発現において有用なバキュロウイルスのベクター、
ならびにこれにより感染された昆虫細胞を提供する。

【０００７】本発明は、自然ｇＤ２糖タンパク質（ｎｇ
Ｄ２）の構造に密接に近似するｇＤ２の高い収量の産生
のためにバキュロウイルスの発現系を使用する。ある数
のバキュロウイルス、とくに核ポリヘドロリシスウイル
ス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉ
ｒｕｓｅｓ）（ＮＰＶ）は昆虫細胞の培養において増殖
可能であり、そして糖タンパク質の産生に潜在的に有用
なベヒクルを提供する。有用なＮＰＶは、ボンビクス・
モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）ＮＰＶ（ＢｍＮＰＶ；
１９）およびオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ（Ａｃ
ＮＰＶ；３９）を包含する。本発明の方法における使用
に好ましいバキュロウイルスはＡｃＮＰＶである。この
手順を開始するために、ｇＤ２配列を含有するＤＮＡ断
片を分離し、そしてバキュロウイルス転移ベクターの中
にスクリーニングする。次いで、選択した昆虫細胞を転
移ベクターおよびＡｃＮＰＶのＤＮＡと同時トランスフ
ェクションし、こうしてポリヘドリンプロモーターのコ
ントロールおよび調節下に、バキュロウイルスのゲノム
の中に挿入して、ウイルスのポリヘドリン遺伝子を置換
する。この目的に利用可能な、ある数の転移ベクターが
存在（例えば、１８、２３）。好ましいベクターはｇＤ
２で高いレベルの発現を与えるが、ポリヘドリンと融合
タンパク質を産生しないものである。本発明の実施例に
おいて、ｐＶＬ９４１（１８）のようなベクターを使用
する。一般に、ポリヘドリンの開始コドンに対して直ぐ
５’および可能ならばそれから下流に延長する配列は転
写のために重要である。ｐＶＬ９４１において、ｇＤ２
遺伝子をポリヘドリン遺伝子のＡＴＧ開始部位の下流に
挿入し、そしてリーダー配列は完全である。融合タンパ
ク質を排除するために、ポリヘドリン遺伝子のＡＴＧ開
始部位を部位特異的突然変異によりＡＴＴに変更する。

【０００８】ある数の昆虫細胞系を本発明の方法におい
て宿主細胞として使用することができる。例えば、マメ
ストラ・ブラッシカエ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓ
ｉｃａｅ）種（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ８００３）ま
たはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）［例えば、ＳＦ−２１、イ
ンビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニ
ア州サンディエゴ、またはＳｆ−９、ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１７１１）は本発明の方法において有用である。好まし
い宿主細胞系はスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄ
ｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）である。組み換え
バキュロウイルスのプラークを同定し、そしてポリヘド
リンの閉鎖体の不存在により取り上げる。これらのプラ
ークは昆虫細胞上で増幅され、そして生ずるプラークを
バキュロウイルスｇＤ２（ｂｇＤ２）の発現についてス
クリーニングする。選択したプラークを精製し、そして
それ以上のｇＤ２の発現のために使用することができ
る。

【０００９】発現のために使用した遺伝子は、免疫原性
および保護のために要求されるエピトープを有するＨＳ
Ｖ遺伝子であることができる。ＨＳＶ菌株ＧからのｇＤ
２の配列は、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）（４３）および
ラスキー（Ｌａｓｋｙ）ら（１６）により発表された。
次の実施例において、ＨＳＶ２菌株１２をｇＤ２ＤＮＡ
源として使用される。これらの２つの遺伝子のＤＮＡ配
列は小さい程度に異なり、究極的に、生ずるタンパク質
の中に１つのアミノ酸の差を生成する（参照、実施例
３）。基本のｇＤ２配列中の小さい修飾はこの分子の免
疫原性に影響を与えないで許容されうることが理解され
るであろう。したがって、この方法において使用する遺
伝子は、また、ヌクレオチドレベルで既知の配列と異な
るものであることができるが、遺伝暗号の同義性のため
に、同一のアミノ酸配列を産生するか、あるいは、１つ
の化学的に同等のアミノ酸が、生ずる糖タンパク質の免
疫原性活性に影響を与えないで、他のアミノ酸と置換さ
れている、「サイレントの変化」を生成する遺伝子であ
ることができる。

【００１０】本発明の方法は、ｎｇＤ２とほぼ同一であ
る、５７，５００ダルトンの見掛けの分子量をもつ糖タ
ンパク質を生ずる。糖タンパク質を崩壊した細胞から回
収し、そして免疫親和クロマトグラフィーにより精製
し、このクロマトグラフィーは少なくとも約９０％の精
製を提供する。タンパク質の同一性はウェスタンブロッ
トによりｇＤ２特異的モノクローナル抗体およびポリク
ローナル抗体を使用して確証する。アミノ酸配列から予
測されるタンパク質の非グリコシル化分子量は約４０，
０００であり、炭水化物の広範な翻訳後の付加を示唆す
る。バキュロウイルス感染の昆虫細胞の中で発現される
タンパク質のグリコシル化パターンは、ツニカマイシン
感受性（１３、１４）およびエンド−Ｈ感受性（４５、
１５）であり、Ｎ連鎖した高いマンノースのグリコシル
化パターンの存在を示唆する。下の実施例に示すよう
に、ｂｇＤ２のＥＬＩＳＡおよびイムノブロッティング
反応性は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体の結合において自然の調製物の反応性を抑制するよう
に思われる。これらの観察が示唆するように、バキュロ
ウイルス発現の糖タンパク質中のエピトープの潜在的に
増強されたアクセス可能性を示唆する。バキュロウイル
ス発現のｇＤ２に対する増大された血清学的応答性は、
抗体応答性に関して、自然物質に関係する組み換え産生
物の増強した効能を示すことができる。

【００１１】精製した糖タンパク質は、ウェスタンブロ
ットまたはドットブロットにおいて、モノクローナル抗
体ＤＬ６、ＤＬ１１および１Ｄ３と反応した。ＤＬ１１
はウイルス誘導ｇＤの順次でない中和性エピトープ（２
９）と結合する。こうして、組み換えワクチン調製物は
この部位における自然コンフォメーションを保持するこ
とが結論された。事実、自然コンフォメーションの維持
はＤＬ１１の反応性およびその相補性の独立の中和能力
と結合された（２７、４６）。１Ｄ３ ＭＡｂとの反応
性は、糖タンパク質がアミノ末端において切頭されてい
ないことを示唆する。

【００１２】バキュロウイルス誘導分子の自然形態との
類似性は、血清学的研究により確証された。免疫化した
マウスからの血清のＥＬＩＳＡ分析は、ｎｇＤ１免疫血
清がｂｇＤ２と強く反応することを示した。逆に、ｂｇ
Ｄ２免疫血清は、０．１μｇ程度に低いワクチン投与量
後でさえ、ｎｇＤ１およびｂｇＤ２の両者と結合する。
ＥＬＩＳＡの力価はｂｇＤ２の投与量とともに増加する
ことが観察される。ＨＳＶ１およびＨＳＶ２に対するｂ
ｇＤ２免疫化マウスの中和抗体の力価は、一般に投与量
に関係する方法で増加し、そしてホモタイプのウイルス
に対する優先的に高くなった力価を実証したが、ヘテロ
タイプに対する幾何平均の力価は０．１μｇのｂｇＤ２
より大きい投与量で実質的であった。ＨＳＶ２に対する
より高い力価の同様なパターンはｎｇＤ２免疫化したマ
ウスからの血清について認められ、この現象が組み換え
糖タンパク質を使用する免疫化に対して独特でないこと
を示唆する。バキュロウイルス発現のｇＤ２は、ｎｇＤ
１およびｎｇＤ２の両者と比較したとき、ＨＳＶ２に対
して中和性抗体のレベルの増大を引き出す。ｎｇＤ１免
疫化マウスからの血清は、また、ＨＳＶ１についての力
価と比較したとき、ＨＳＶ２に対する力価の増加を実証
する。しかしながら、ｎｇＤ１について観測された差は
適度である。

【００１３】全ウイルスまたはサブユニットの抗原に対
する試験管内のリンパ増殖の応答に関して、ｂｇＤ２免
疫化をｎｇＤ１およびｎｇＤ２ワクチンと比較すると
き、ｂｇＤ２の試験管内の細胞の応答を、全ウイルス抗
原に対する本質的に型特異的応答性およびｂｇＤ２の投
与量とリンパ増殖の活性との間の逆相関関係により、特
性決定する。ワクチン濃度、抗体応答の増加、およびリ
ンパ増殖活性の間の観測される関連は、Ｔヘルパー細胞
のサブセットの可能なｇＤ投与量に関係する選択を示唆
する（２６）。

【００１４】生体内において、ｂｇＤ２による免疫化は
致死的ＨＳＶ２の足の対抗に対する有意な保護を生ず
る。高いレベルの保護は、投与した糖タンパク質のすべ
ての投与量において起こる。ＨＳＶ２に対する保護は、
麻酔および死を包含する症状のひどさの減少および感染
のすべての観察可能な症状のすべてをもたないマウスの
頻度の有意な増加により特性づけられる。生き残りのマ
ウスにおける潜伏性のＨＳＶ２感染の頻度は現在の研究
において検出されなかったが、マウスにおけるｎｇＤ１
を使用する免疫化は潜伏性ならびに一次のＨＳＶ２感染
に対して保護することをわれわれは示した（２５）。

【００１５】糖タンパク質、またはその免疫原性部分
は、実質的に純粋な（すなわち、少なくとも９０％の純
粋な）形態で、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２の感染の予防お
よび処置の両者において使用することができる。

【００１６】組み換え的に産生された糖タンパク質は、
宿主細胞から、標準の分離技術により分離する。次い
で、精製された糖タンパク質を普通に使用されている製
剤学的に許容されうる担体、例えば、水、生理的塩類溶
液、エタノール、ポリオール、例えば、グリセロールま
たはプロピレングリコール、または植物油の任意のもの
と、ならびに任意の適当なワクチンのアジュバント、例
えば、ＡｌＰＯ₄、および／または３ジオキシ−モノホ
スホニル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ；ＲＩＢＩ）と組み合わ
せる。ここで使用するとき、「製剤学的に許容されうる
担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒質、コー
ティング、抗菌剤、等張および吸収遅延剤などを包含す
る。普通の媒質が活性成分と不混和性である場合を除外
して、ワクチン組成物におけるその使用は考えられる。

【００１７】ワクチンにおける唯一の免疫原性因子とし
てのその使用に加えて、ｂｇＤ２はまた他の活性因子と
組み合わせることができる。例えば、ＨＳＶワクチン
は、さらに、他のＨＳＶ糖タンパク質、例えば、ｇＢ１
および／またはｇＢ２からなるか、あるいは他の伝染
病、例えば、肝炎またはインフルエンザに対する免疫原
性因子を含むことができる。

【００１８】ワクチン組成物は、ＨＳＶの感染への引き
続く暴露に対する保護を与える。ワクチン組成物の配合
方法は、ヅフィ（Ｄｕｆｆｙ）（６）またはウィリアム
ス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら（４７）に示されているよう
に、この分野において知られている。糖タンパク質の使
用量は、アジュバントを使用するかどうかに依存して変
化するであろう。一般に、ワクチンの単位投与量は１〜
１００μｇの糖タンパク質を含有するであろう。投与は
好ましくは非経口的、すなわち、皮下、静脈内、筋肉内
または腹腔内であるが、経口的に投与することができ
る。

【００１９】初期のワクチン接種後、好ましくは１また
は２以上の促進を行う。

【００２０】ここにおいて言及する微生物は、アメリカ
ン・サイアナミド・カンパニー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃ
ｔｎａｍｉｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、パール
リバー）の菌株保存所に保持されている。また、プラス
ミドｐ９４１ｇＤ２Ｃは、ブダベスト条約の規定に従
い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州ロック
ビレ１２３０１）に１９９１年８月９日に、受け入れ番
号６８６６４に受託された。

【００２１】次の実施例によって、本発明をさらに説明
する。これらの実施例は本発明を限定しない。

【００２２】

【実施例】

Ｉ、ｇＤ２のバキュロウイルスの発現 Ａ、細胞およびウイルス。野生型オートグラファ・カリ
フォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎ
ｉｃａ）核のポリヘドリンウイルス（ＡｃＮＰＶ；Ｅ２
菌株ＡＴＣＣ ＶＲ １３４４）およびバキュロウイル
ス転移ベクターｐＶＬ９４１を、マックス・サマース
（Ｍａｘ Ｓｕｍｍｅｒｓ）博士（Ｔｅｘａｓ Ａ＆
Ｍ、カレッジステーション、テキサス州）からを受け取
った。スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅ
ｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（以後、Ｓ．ｆｒｕｇｉ
ｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞は、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１；マリイランド州ロック
ビレ）から購入した。野生型および組み換えバキュロウ
イルスを、２％の鉄補充子ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、
ユタ州、ローガン）、０．１％のプルロニック（Ｐｌｕ
ｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８、および他の液体添加物を含有す
るＩＰＬ４１培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、
カンサス州レネクサ）の中でＳｆ９の単層または懸濁培
養物の中で成長させる（１７）。単純ヘルペスウイルス
２型（菌株１２；ＨＳＶ２−１２）およびＨＳＶ１−Ｎ
Ｓをフリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）博士（Ｃｈｉｌ
ｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ペンシルベニア州フ
ィラデルフィア）から受け取り、そして３回プラーク精
製し、そしてＶｅｒｏ細胞培養において増殖させる。Ｈ
ＳＶ２−１８６を同様なプラーク精製し、そしてＶｅｒ
ｏ細胞増殖手順にかけ、動物の研究において使用する。

【００２３】Ｂ、転移ベクターの構成。ＨＳＶ２（菌株
１２）の糖タンパク質Ｄを、組み換えバキュロウイルス
Ｄ２ＡＣ−１１により、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞
の中で発現させる。Ｄ２ＡＣ−１１は、オートグラファ
・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉｃａ）の核ポリヘドリンウイルスのポリヘドリ
ン遺伝子を、ポリヘドリンプロモーターのコントロール
および調節下に置換することによって発生させる。ＨＳ
Ｖ２ ＤＮＡは、２リットルのＨＳＶ２感染Ｖｅｒｏ細
胞のリゼイトから、ＤＥＡＥセファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）カラムに通過させることによって分離する。
このＤＮＡをカラムから０．５モルのＮａＣｌで溶離
し、抗体４０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼ、１００μｇ／ｍ
ｌのプロテイナーゼＫおよび０．４％のＳＤＳで溶離
し、次いでフェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コールの混合物（２５：２４：１）で数回抽出する。次
いで、ＤＮＡをＣｓＣｌの勾配で１．３ｇ／ｍｌの密度
において精製する。精製したＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化
し、そしてＨＳＶ１からの糖タンパク質（ｇＤ１）のＲ
ＮＡ転写体を使用して、ＨＳＶ２糖タンパク質（ｇＤ
２）についてプロービングする。プラスミドｐＲＥ２６
［Ｇ．Ｈ．コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）博士およびＲ．Ｊ．
アイゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎｇｅｒｇ）、ペンシルベニ
ア大学、ペンシルベニア州フィラデルフィア、から受け
取った］を使用し、これはＨＳＶ１ ｇＤ（ｇＤ１）遺
伝子をＳＰ６プロモーターコントロール下に含有する。
³²Ｐ−ＣＴＰ（４１０Ｃｉ／ミリモル、Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）標識したＲＮＡ転
写体を、ＳＰ６ポリメラーゼを使用して調製する。ｇＤ
２遺伝子は、サザンブロットハイブリダイゼーションに
より実証されるように、ＥｃｏＲＩ断片上に位置する。
５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（図１Ａ）をアガロースゲルで
精製し、そしてマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（２
１）に従うクローニング手順を使用して、ｐＢＲ３２２
の独特ＥｃｏＲＩの中に挿入する。この構成体をＳｐｅ
ＩおよびＸｈｏＩで二重消化して、インサートをｇＤ２
ＡＴＧ開始部位からほぼ３０塩基上流にまで下にトリ
ミングする。生ずる２ｋｂのｇＤ２を含有する断片をア
ガロースゲルで精製し、そして転移ベクターｐＶＬ９４
１（１７）の独特ＢａｍＨＩ部位の中に平滑末端の結合
によりサブクローニングする。生ずるプラスミドｐ９４
１ｇＤ２Ｃ（図１Ｂ）の向きを制限マッピング、サザン
ブロットハイブリダイゼーション、およびセクエナーゼ
（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）を使用するジデオキシ法により
ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ、オハイオ州クレブランド）により確証
する。

【００２４】Ｃ、バキュロウイルス組み換え体の発生。
Ｓｆ９細胞を２．０μｇのＡｃＮＰＶ ＤＮＡおよび
４．０μｇのｐ９４１ｇＤ２Ｃ ＤＮＡと、サンマース
（Ｓｕｍｍｅｒｓ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）（３
８）の手順に従い同時トランスフェクションすう。組み
換えバキュロウイルスのプラークを、ポリヘドリンの閉
鎖物体の不存在により、顕微鏡検査的に同定する。閉鎖
物体陰性のプラークを取り上げ、そして２４ウェルのプ
レートの中に接種したＳｆ９細胞上で増幅する。次い
で、生ずるプラークを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび細胞リ
ゼイトのウェスタンブロッティングまたはドットブロッ
ティングによりｇＤ特異的モノクローナル抗体を使用し
て、バキュロウイルスｇＤ２（ｂｇＤ２）の発現につい
てスクリーニングする。親のプラーク（プラーク＃１
１）を選択し、そして３回プラーク精製する。この組み
換えバキュロウイルス、Ｄ２ＡＣ−１１と表示する、
を、それ以上の糖タンパク質の発現に使用する。

【００２５】Ｄ、Ｓｆ９リゼイトの調製および収穫。Ｓ
ｆ９細胞をバイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉ
ｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージイ州エジ
ソン）内で灌流した懸濁培養物中で成長させ、そして組
み換えバキュロウイルスで０．１の感染の多重度で、２
×１０⁶〜８×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度において感染
させる。培養物を、感染後（ｐｉ）４４時間に、バキュ
ロウイルス感染した細胞懸濁液を０．１Ｎ ＮａＯＨま
たは１．０モルのＥＤＴＡでポリヘドリン７．４に調節
し、次いでＣＨＡＰＳ洗浄剤を６０ミリモルの最終濃度
に添加して溶菌することによって、収穫する。

【００２６】Ｅ、自然およびバキュロウイルス発現の糖
タンパク質の精製。自然ｇＤ１およびｇＤ２を、従来記
載されたように（２５）、ＨＳＶ感染Ｖｅｒｏ細胞の洗
浄剤の抽出物から精製する。類似の方法において、バキ
ュロウイルス発現ｇＤ２糖タンパク質を、組み換え感染
Ｓｆ９昆虫細胞から回収する。簡単に述べると、感染し
たＳｆ９培養物のｐＨを０．１Ｎ ＮａＯＨまたは１．
０ＥＤＴＡで中性に調節し、そしてＣＨＡＰＳ（細胞密
度に依存して１５〜６０ミリモルの最終濃度）および／
または他の可溶化剤の添加により溶菌する。洗浄剤可溶
化した糖タンパク質を、０．１ミリモルのフィルター
（Ｓａｒｔｉｃｏｎ Ｉｎｃ．、コネチカット州イース
トグランビイ）を通す接線方向の流れの限外濾過または
同様な方法を使用し、次いでＤＥＡＥファースト・フロ
ー（Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、
ニュージャージイ州ピッツバーグ）を使用してイオン交
換クロマトグラフィーにより、清浄にする。イオン交換
の貫流分画を、２０，０００分子量のカットオフフィル
ター（Ｓａｒｔｉｃｏｎ）を使用する接線方向の流れの
限外濾過により濃縮し、次いで活性化ＣＨ−セファロー
ズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にカ
ップリングした固相ＤＬ６モノクローナル抗体（１２、
７；Ｇ．Ｈ．コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）博士およびＲ．
Ｊ．アイゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）博士から入
手した］を使用する免疫親和クロマトグラフィーによ
り、製造業者により提供されたプロトコルに従い、分割
する。精製した糖タンパク質を免疫親和マトリックスか
ら緩衝化ＮａＳＣＮ（５０ミリモルのトリスｐＨ７．
４、０．５モルのＮａＣｌ、１．５モルのＮａＳＣＮ、
０．１％のＮＰ４０）を使用して溶離し、ＰＢＳに対し
て透析し、次いでワクチンに配合する。自然ｇＤ１のみ
はホルマリン（１：４０００、３７℃において４０時
間）で処理する。リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ₄）を
５００ｍｇ／投与でアジュバントとして使用する。糖タ
ンパク質の投与濃度を、ピロケミルミネセント窒素分析
（Ａｎｔｅｋ Ｉｎｃ．、テキサス州ハウストン）によ
り直接およびドットブロット分析により間接的に確証す
る。

【００２７】Ｆ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブ
ロット分析。自然ｇＤ１、ｇＤ２およびバキュロウイル
ス発現ｇＤ２をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そしてシミン
グトン（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ）（３９）に本質的に記載
されているように、電気転移する。ニトロセルロースの
ブロットを適当な抗体とインキュベーションし、そして
抗原／抗体複合体をペルオキシダーゼ標識したプロテイ
ンＡおよび４−クローンナフトール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、ミゾリー州セントルイス）で可
視化する。使用した抗体は、次のものを包含する：型共
通ウサギポリクローナル抗ｇＤ、アミノ酸残基２７２−
２７９を含有するｇＤの順次のエピトープを認識するＤ
Ｌ６モノクローナル抗体（ＭｃＡｂ）（１２、７）およ
びｇＤのアミノ末端付近のアミノ酸１−２３の領域にお
ける直線のエピトープを認識するモノクローナル抗体１
Ｄ３（２８）。あるいは、ニトロセルロースのエレクト
ロブロットをアウロダイ（Ａｕｒｏｄｙｅ）（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）で処理して、全体のタンパク質を可視化す
る。

【００２８】Ｇ、ｂｇＤ２の同一性および純度。精製し
た組み換えタンパク質の同一性を、ウェスタンブロット
分析により、ｇＤ特異的モノクローナル抗体ＤＬ６およ
び１Ｄ３（Ｎ末端特異的）、ならびに抗ｇＤポリクロー
ナル血清を使用して確証する。この研究において使用す
る３つの糖タンパク質の比較ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタ
ンイムノブロットを図２Ａに表す。自然ｇＤ１は精製後
２量体を形成し、これは自然または組み換えｇＤ２のい
ずれにおいても観察されない。組み換えｇＤ２は自然ｇ
Ｄ２とほぼ同一の分子量を有する。

【００２９】ｂｇＤ２の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
をエレクトロブロッティングし、次いで銀染色により確
証する（図２）。組み換えｇＤ２は５７，５００の見掛
けの分子量をもつ単一のタンパク質成分として移動す
る。抗体のプローブにより可視化された成分とタンパク
質の染色のとき観察される成分との間の直接の対応は、
９０％を越える糖タンパク質純度と一致する。

【００３０】ＩＩ、ワクチンの投与およびｂｇＤ２免疫
反応性 Ａ、マウス。雌のＢＡＬＢ／ｃ ＶＡＦ Ｐｌｕｓ（ウ
イルスの抗体不含）マウスを、免疫原性および保護の研
究のために、チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒ
ｉｖｅｒ）（マサチュセッツ州ウィルミントン）から入
手し、そして滅菌したミクロアイソレーターの中に収容
する。

【００３１】Ｂ、ｇＤの配合および生体内の研究のため
のマウスの免疫化。自然ｇＤ１、ｇＤ２およびｂｇＤ２
の分画を２０〜１４０μｇ／ｍｌの濃度でＡｌＰＯ
₄（２ｍｇ／ｍｌ）と４℃において一夜混合する。次い
で、糖タンパク質の濃度を、合計の窒素含量を測定する
か、あるいはドットブロット分析により決定する。スロ
ット−ブロット分析のための試料は、リン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）希釈物中の２倍希釈物として９６ウェルのプ
レートの中で調製する。精製した、可溶性糖タンパク質
を標準として日常的に使用する。試料の希釈物をドット
ブロットのマニホールド（ＢＢＬ、マリイランド州ガイ
サーバーグ）に移し、そしてニトロセルロース膜上に真
空吸収させる。各試料を３×２００μｇのＰＢＳで洗浄
し、そしてフィルターを空気乾燥した後、３％のウシ血
清アルブミン／トリス−緩衝化生理的塩類溶液（ＢＳＡ
／ＴＢＳ）の中で４５分間ブロッキングする。次いで、
ブロットを１％のＢＳＡ／ＴＢＳ／０．０５％のＴｗｅ
ｅｎ２０（ＴＴＢＳ）中で希釈した選択した抗体と１時
間インキュベーションする。ウェスタンブロット分析に
使用した抗体に加えて、ＤＬ１１［Ｇ．Ｈ．コーヘン
（Ｃｏｈｅｎ）博士およびＲ．Ｊ．アイゼンバーグ（Ｅ
ｉｓｅｎｂｅｒｇ）博士から入手した］、不連続の中和
性ＭｃＡｂを使用する（２７、２９）。引き続いて、抗
体を洗浄により除去し、そしてフィルターをペルオキシ
ダーゼ標識プロテインＡと１％のＢＳＡ／ＴＴＢＳ中で
１時間インキュベーションする。次いで、フィルターを
よく洗浄し、そしてメタノール中で４−クロロナフトー
ル／Ｈ₂Ｏ₂とインキュベーションする。配合した糖タン
パク質試料を同一方法において分析するが、ただしＡｌ
ＰＯ₄をまず１Ｎ ＨＣｌで３７℃において５分間可溶
化することによってフィルターから除去する。次いで、
糖タンパク質／ＡｌＰＯ₄／ＰＢＳのストックを選択し
た投与濃度に希釈する。処理群（Ｎ＝１６）は次の通り
である：ＡｌＰＯ₄、０．１μｇのｂｇＤ２、１．０μ
ｇのｂｇＤ２、５．０μｇのｂｇＤ２、１０．０μｇの
ｂｇＤ２、５．０μｇのｎｇＤ２、５．０μｇののｎｇ
Ｄ１；非接種Ｎ＝６。免疫化の前に、配合した糖タンパ
ク質を、また、ドットブロットにより中和性エピトープ
ＤＬ１１の存在についてプロービングする。すべての３
つの糖タンパク質はこのエピトープを含有する。

【００３２】６週齢のマウスを５００μｇのＡｌＰＯ₄
に前以て吸収させたバキュロウイルス発現ｇＤ２で免疫
化する。使用した投与量は０．１μｇ、１．０μｇ、
５．０μｇおよび１０．０μｇである。対照は５．０μ
ｇのｎｇＤ１またはｎｇＤ２で免疫化した動物またはＡ
ｌＰＯ₄単独でモック免疫化した動物から成る。すべて
の動物に肩甲骨領域に３週の間隔で２回の皮下免疫化を
与える。

【００３３】Ｃ、試験管内アッセイ。第２免疫化の２週
後、各投与群の５匹のマウスを麻酔下に放血し、そして
体液およびワクチンに対して免疫応答性の細胞分析のた
めに脾摘出する。

【００３４】（ｉ）ＥＬＩＳＡの応答を評価して、ウイ
ルス誘導およびバキュロウイルス発現のｇＤ２の生体内
同等性を確証する。９６ウェルのプレート（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ、ニューヨーク州コーニング）を１００ｍｌの０．
０１モルのＰＢＳ中の２０ｎｇ／ウェルの濃度のｎｇＤ
１またはｂｇＤ２で一夜コーティングする。プレートを
洗浄し、そして３％のＢＳＡと室温において３時間イン
キュベーションする。ＢＳＡ処理後、実験の血清をＴＢ
Ｓ＋０．１％のＴｗｅｅｎ２０の中でプレートを横切っ
て２倍希釈し、そして３７℃において１時間ブロッキン
グする。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いでＴＢＳ
中のセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ｆ（ａｂ’）
₂ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ、Ｏｒｇａｎｏｎ
Ｔｅｋｎｉｋａ、ノースカロライナ州ダーハム）の
１：５００希釈物の１００μｌとインキュベーションす
る。プレートをＡＢＴＳ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ
＆Ｐｅｒｒｙ、マリイランド州ガイサーバーグ）を使用
して現像し、そして４０５ｎｍにおいてバイオテク（Ｂ
ｉｏｔｅｋ）ＥＬＩＳＡプレートリーダー（バーモント
州ウィノスキ）を使用して定量する。

【００３５】抗体の応答は、ＥＬＩＳＡにより、試験管
内の抗原としてｂｇＤ２を使用して測定すると、すべて
の免疫化したマウスはワクチンに対して有意に応答性で
ある（９５％の信頼区間）こと、およびすべてのワクチ
ンの処理はＡｌＰＯ₄対照動物に関して有意に高い（Ｐ
＜０．００１、ＡＮＯＶＡによる）ことを示す。ｂｇＤ
２免疫化マウスは、それぞれ、０．１μｇ〜１０．０μ
ｇの糖タンパク質において記録した活性の最小および最
大をもつ投与量応答性ＥＬＩＳＡ力価を一般に実証す
る。１：１６０より大きい血清希釈において、ｎｇＤ１
抗原についての０．１μｇのｂｇＤ２試験血清の応答
は、すべての他の免疫化群より有意に（Ｐ＜０．０５、
ＡＮＯＶＡによる）低い。

【００３６】ｎｇＤ１抗原に対するＥＬＩＳＡの応答
は、ｂｇＤ２について観察される応答より低い。これ
は、抗体の応答の有意の差よりむしろ自然糖タンパク質
に関する組み換え体の結合のより大きい結合をの率を反
映する可能性が最も強い。しかしながら、ＥＬＩＳＡの
応答はＤＬ６ドットブロットの応答を反映し（データは
示さない）ここでバキュロウイルス発現の糖タンパク質
に対するＭｃＡｂ反応性は自然ｇＤ１に対する反応性よ
り大きい。ｂｇＤ２免疫化マウスに対する抗ｎｇＤ１Ｅ
ＬＩＳＡ活性は投与量依存性的に増加した。ｎｇＤ１抗
原に対するピーク活性はｎｇＤ１免疫化に関連する。自
然糖タンパク質の応答をバキュロウイルス発現のｇＤ２
マウスの応答と直接比較することは困難である。なぜな
ら、自然糖タンパク質は微量の他のＨＳＶタンパク質、
例えば、ｇＢを含有することがあり、これらのタンパク
質は測定されたＥＬＩＳＡの応答に寄与しうるからであ
る。しかしながら、これに関して、５．０μｇのｎｇＤ
２は、また、微量の汚染物質を潜在的に収容し、０．１
μｇ〜１．０μｇのｂｇＤ２匹敵する、ｎｇＤ１に対す
る比較的低いＥＬＩＳＡ応答を引き出す。

【００３７】（ｉｉ）中和性抗体のアッセイ。中和アッ
セイを従来記載されたように（２１）実施する。簡単に
述べると、血清をアッセイ前に３０分間５６において加
熱不活性化する。二重反復実験の２倍の系統的希釈物
を、５％のＦＣＳおよび１０％のモルモットの補体（Ｇ
ｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）を含有
するＭＥＭの中で１００ｐｆｕのＨＳＶ１−ＮＳまたは
ＨＳＶ２−１８６と混合する。ウイルス−血清混合物を
３７℃において１時間インキュベーションし、次いで９
６ウェルのプレート中で成長させたＶｅｒｏ細胞の単層
上に接種する。ウイルスは１時間（３７℃）吸収し、次
いで１％のメチルセルロースでオーバーレイする。ウイ
ルス、培地および補体の対照を各アッセイにおいてイン
キュベーションする。＞５０プラークがウイルス対照の
ウェルの中で観察させるまで、プレートをインキュベー
ションする。次いで、プレートを１０％のホルマリン中
で固定し、そしてプラークを数える。力価は、ウイルス
対照において観察されるものの５０％より小さい平均プ
ラーク数を実証する、血清希釈の逆数として定義する。

【００３８】結果を表１に示す。０．１μｇのｂｇＤ２
で免疫化した単一の動物を除外して、すべての免疫化し
たマウスはＨＳＶ１に対して２０またはそれより大きい
中和性抗体の力価を実証した。ｂｇＤ２マウスについて
のＨＳＶ１に対する平均の幾何平均力価（ＧＭＴ１）
は、一般に、それぞれ、０．１μｇおよび１０．０μｇ
における最小および最大をもつ投与量に関係する方法で
増加する。５．０μｇのｂｇＤ２で処理したマウスは、
投与応答により予測されるより多少低いＧＭＴ１（すな
わち、１８３．９）を実証する。ｎｇＤ２を与えた動物
と比較したとき、ｂｇＤ２マウスのＧＭＴ１の増大は重
要である。事実、ＧＭＴ１の２．５〜６．０倍の増加
は、ｎｇＤ２の免疫化に関して、１．０〜１０．０μｇ
のｂｇＤ２の投与量において起こる。同等のＧＭＴ１は
１０．０μｇのｂｇＤ２または５．０μｇのｎｇＤ１を
与えた動物について記録され、組み換え調製物に対する
交差反応性中和性抗体の活性のすぐれた程度を実証す
る。

【００３９】ＧＭＴ２をすべてのワクチン処理群におい
てＨＳＶ１中和力価に関して増加する。これは０．１μ
ｇのｂｇＤ２群についてとくに明らかであり、これは２
４倍増加する。ｎｇＤ１力価はＧＭＴ２／ＧＭＴ１が
１．５のＨＳＶ１およびＨＳＶ２について本質的に同等
である。ピークのＧＭＴ２は５．０μｇのｂｇＤ２に関
連し、一部分、１０，２４０の力価を示す単一の動物に
起因する。ＧＭＴ２／ＧＭＴ１により示される、比例す
る交差反応の応答のパターンは、５．０μｇのｂｇＤ２
および５．０μｇのｎｇＤ２について認められ、ここ
で、組み換え候補について記録される力価がより高いに
もかかわらず、１３．９の比は両者の群について計算さ
れる。

【００４０】

【表１】

【００４１】注： ａ ＨＳＶ１（ＧＭＴ１）およびＨＳＶ２（ＧＭＴ２）
に対する中和性抗体の応答の幾何平均の力価は、前述し
たようにプラーク減少ミクロ中和アッセイ法を使用し
て、個々のマウスから得た。

【００４２】（ｉｉｉ）リンパ増殖アッセイ。免疫化ま
たはＡｌＰＯ₄感染したマウスからの脾細胞を、２×１
０⁵細胞／ウェルにおいて、９６ウェルの平らな底のプ
レートの中で、培地、Ｖｅｒｏ（２．５×１０⁶ＰＦＵ
同等体／ウェル）、ｎｇＤ１（１０ｎｇ／ウェル）、ｂ
ｇＤ２（２０ｎｇ／ウェル）またはアミノ酸残基２４１
−２６０を含有するｇＤ１ペプチド（２つの残基におい
てＧＭＴ２と異なる；３９、４０）の存在下にプレイテ
ィングする。リンパ増殖アッセイにおいて使用する培地
は、１０％の胎児仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州
ロウガン）、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ＮＥＡＡ、ピル
ベート、β−メルカプトエタノールおよびペニシリン／
ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ（Ｃｅｌｌｇｒ
ｏ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ワシントＤＣ）から成る。５
日間インキュベーションした後、細胞を１μＣｉの［³
Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリン
トンハイツ）で６時間パルシングし、次いでシンチレー
ションカウンティングのために収穫する。刺激指数を実
験のＣＰＭを培地対照のＣＰＭで割って計算する。結果
を表２に示す。全ウイルス抗原に対する試験管内増殖応
答は、最大のＴ細胞の活性化により本質的に型特異的で
ある。事実、ｎｇＤ１免疫化したマウスは、ＨＳＶ１刺
激に対する応答が、すべての他の群より、有意に高い
（Ｐ＜０．０１）。ＨＳＶ２および他の刺激に対するｂ
ｇＤ２免疫化マウスの応答を、０．１μｇのワクチンに
おいて見られるピーク活性をもつ逆投与量応答により特
性決定する。ｎｇＤ１免疫動物は、ｎｇＤ１の試験管内
の刺激に対して応答して、すべての他の群に関して³Ｈ
−チミジンの吸収を有意に増大する。ＥＬＩＳＡの応答
について認められるように、ｎｇＤ１免疫脾細胞の活性
の増大は、Ｔ細胞の胚発生を引き出すことができる他の
ＨＳＶ１タンパク質の微量の存在を反映する。しかしな
がら、体液の応答におけるように、ｎｇＤ２免疫化は応
答の見掛けの増大を伴わない。ｂｇＤ２とｎｇＤ１との
間の高い程度の交差反応性の応答は、Ｄ１のペプチドの
アミノ酸２４１−２６１で刺激した培養において見られ
る。このｇＤ１ペプチドは発表されたｇＤ２配列と２残
基において異なり（＃２４６、Ａ≫Ｐ、＃２５７、Ｅ≫
Ｄ）そして免疫優性Ｔ_hエピトープを含有する（１
０）。

【００４３】

【表２】

【００４４】注： ａ リンパ増殖アッセイを前述したように実施した。５
匹の動物／群についての刺激指数（ＳＩ）の平均および
標準偏差を表す。ＳＩ＝ＣＰＭ（実験）／ＣＰＭ（培地
対照）。

【００４５】ｂ 投与量はμｇ単位である。

【００４６】Ｄ、ＨＳＶ対抗に対する保護。第２免疫化
後２週に、マウスを１×１０⁶ｐｆｕ／０．０３ｍｌの
ＨＳＶ２（１８６）で右後足において皮下接種する。マ
ウスをＨＳＶ２に関係する病気について３０日間ｐｉモ
ニターする。症状を毎日の基準で評価し、そして次のよ
うにスコアを付ける：０＝症状なし；１＝隆起または剥
離；２＝薄弱；３＝右後足の部分的麻痺；４＝右後足の
完全な麻痺；５＝両側の麻痺；６＝死。

【００４７】表３に示すように、マウスのすべての免疫
化群は、次で証明されるように、致死的ＨＳＶ２対抗に
対して有意に保護される：罹病率の減少、麻痺的感染の
頻度の減少、致死率の減少（１１匹のうちの６匹は感染
に屈するが、いずれかの群の単一の免疫化マウスのみが
死亡する；この動物に５．０μｇのｎｇＤ２を与え、そ
してその死前に麻痺していた）、および局所的または前
身の感染のすべての観察しうる兆候をもたない動物の頻
度の増加。この保護的免疫性は低い０．１μｇのバキュ
ロウイルス発現ｇＤ２においてさえ明らかであり、ホモ
タイプの対抗に対する高い程度のワクチン仲介抵抗性を
示す。

【００４８】

【表３】

【００４９】注： ａ 症状のスコアは次のように定義する：０＝症状な
し；１＝局所的隆起／紅班／剥離；２＝薄弱；３＝右後
足の部分的麻痺；４＝右後足の完全な麻痺；５＝両側の
麻痺；６＝死。

【００５０】ｂ 麻痺の頻度は部分的および完全な障害
の両者を実証する動物を包含する。

【００５１】＊＊ Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡによる。

【００５２】§ Ｐ＜０．０１、フィッシャー（Ｆｉｓ
ｈｅｒ）の抽出試験。

【００５３】¶ Ｐ＜０．０４、フィッシャーの抽出試
験。

【００５４】ＩＩＩ、ｂｇＤ２の糖タンパク質の配列決
定 糖タンパク質Ｄ２遺伝子のヌクレオチド配列を、ＨＳＶ
２（菌株１２）およびＤ２Ａｃ−１１（バキュロウイル
スの組み換え体）のウイルスのＤＮＡを直接配列決定す
ることによって決定する。ｇＤ２遺伝子のオーバーラッ
ピングする断片（下を参照）を、ポリメラーゼ連鎖反応
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ
Ｋｉｔ）により非対称的に増幅して、一本鎖を発生
し、次いでセクエナーゼキット（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏ
ｎ ２．０）を使用するジデオキシ法により配列決定す
る。

【００５５】バキュロウイルスの組み換え体Ｄ２Ａｃ−
１１の中のｇＤ２遺伝子のヌクレオチド配列は、ＨＳＶ
２からの親の遺伝子の配列（１２）と合致する。この配
列を、また、発表された菌株、ＨＳＶ２菌株Ｇ（Ｗａｔ
ｓｏｎ、Ｒ．、Ｇｅｎｅ、１９８３、２６：３０７−３
１２）と比較する。

【００５６】菌株ＧおよびＤ２Ａｃ−１１のｇＤ２遺伝
子との間の塩基の差は次の通りである。塩基番号２６８
はＡＴＧ開始部位のＡである。塩基番号１４４９はＡＴ
Ｇ停止部位のＧである。

【００５７】

【表４】

【００５８】引用文献 １、ブラックロウズ（Ｂｌａｃｋｌａｗｓ）、Ｂ．
Ａ．、ナッシュ（Ｎａｓｈ）、Ａ．Ａ．およびＧ．ダー
ビイ（Ｄａｒｂｙ）。１９８７。Ｌ細胞系上で構成的に
発現された単純ヘルペスウイルスのＧタンパク質Ｂおよ
びＤに対してマウスの免疫応答の特異性。ジャーナル・
オブ・ゼネラル・ビロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏ
ｌ．）、６８：１１０３−１１１４。

【００５９】２、カブラル（Ｃａｂｒａｌ）、Ｇ．
Ａ．、フライ（Ｆｒｙ）、Ｄ．、マルシアノ−カブラル
（Ｍａｒｃｉａｎｏ−Ｃａｂｒａｌ）、Ｆ．、ルンプキ
ン（Ｌｕｍｐｋｉｎ）、Ｃ．、マーセル（Ｍｅｒｃｅ
ｒ）、Ｌ．、およびＤ．ゴペルド（Ｇｏｐｅｒｕｄ）。
１９８３。悪性前および悪性のバイオプシーおよび移植
片におけるヘルペスウイルスの抗原。アメリカン・ジャ
ーナル・オブ・オブステトリクス・アンド・ジネロロジ
ー（Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．）、１
４５：７９−８６。

【００６０】３、カッペル（Ｃａｐｐｅｌ）、Ｒ．、ス
プレチャー（Ｓｐｒｅｃｈｅｒ）、Ｓ．、デクイペル
（ＤｅＣｕｙｐｅｒ）、Ｆ．、およびＪ．デブレケリー
ア（ＤｅＢｒａｅｋｅｌｅｅｒ）。１９８５。単純ヘル
ペスウイルスのサブユニットのワクチンの臨床的効能。
ジャーナウ・オブ・メディカル・ビロロジイ（Ｊ．Ｍｅ
ｄ．Ｖｉｒｏｌ．）、１６：１３７−１４５。

【００６１】４、コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｇ．Ｈ．、
カトゼ（Ｋａｔｚｅ）、Ｍ．、ハイドリーン（Ｈｙｄｒ
ｅａｎ−スターン（Ｓｔｅｒｎ）、Ｃ．、およびＲ．
Ｊ．エイセンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）。１９７
８。単純ヘルペスウイルスの普通のＣＰ−１型を５９０
００の分子量のエンベロープ糖タンパク質に関連する。
ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、２７：１７２
−１８１。

【００６２】５、コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｊ．、チャ
ーピリエンネ（Ｃｈａｒｐｉｌｉｅｎｎｅ）、Ａ．、チ
ルモンクジク（Ｃｈｉｌｍｏｎｃｚｙｋ）、Ｓ．、およ
びＭ．Ｋ．エステス（Ｅｓｔｅｓ）。１９８９。ウスロ
タウイルス遺伝子１のヌクレオチド配列およびバキュロ
ウイルスにおいてその遺伝子産生物の発現。ウイルス学
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１７１：１３１−１４０。

【００６３】６、ヅフィー（編）、１９８０。ワクチン
の調製技術（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｔｉｏ
ｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、Ｎｏｙｅｓ Ｄａｔａ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージイ州パークリ
ッジ。

【００６４】７、アイゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒ
ｇ）、Ｒ．Ｊ．、ロング（Ｌｏｎｇ）、Ｄ．、ポンス・
デレオン（Ｐｏｎｃｅ ＤｅＬｅｏｎ）、Ｍ．、マシュ
ーズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）、Ｊ．Ｔ．、スピーア（Ｓｐ
ｅａｒ）、Ｐ．Ｇ．、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）、Ｍ．
Ｇ．、ラスキー（Ｌａｓｋｙ）、Ｌ．Ａ．、バーマン
（Ｂｅｒｍａｎ）、Ｐ．、ゴルム（Ｇｏｌｕｍ）、
Ｅ．、およびＧ．Ｈ．コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）。１９８
５。単純ヘルペスウイルス１型の糖タンパク質Ｄのエピ
トープの局在化。ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）、５３：６３４−６４４。

【００６５】８、エステス（Ｅｓｔｅｓ）、Ｍ．Ｋ．、
クラウフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）、Ｓ．Ｅ．、ペナ
ランダ（Ｐｅｎａｒａｎｄａ）、Ｍ．Ｅ．、ペトリエ
（Ｐｅｔｒｉｅ）、Ｂ．Ｌ．、バーンス（Ｂｕｒｎ
ｓ）、Ｊ．Ｗ．、チャン（Ｃｈａｎ）、Ｗ．、エリクソ
ン（Ｅｒｉｃｓｏｎ）、Ｂ．、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、
Ｇ．Ｅ．、およびＭ．Ｄ．サンマース（Ｓｕｍｍｅｒ
ｓ）。１９８７。バキュロウイルスの発現系を使用する
ロタウイルスの主要なキャプシド抗原の合成および免疫
原性。ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６１：
１４８８−１４９４。

【００６６】９、フレンケル（Ｆｒｅｎｋｅｌ）、Ｌ．
Ｍ．、ディロン（Ｄｉｌｌｏｎ）、Ｍ．、ガラッティ
（Ｇａｒｒａｔｔｙ）、Ｅ．、ブリソン（ｂｒｙｓｏ
ｎ）、Ｙ．、ハッケル（Ｈａｃｋｅｌｌ）、Ｊ．、カウ
ェイン（Ｃａｗｅｉｎ）、Ａ．、アブラモビズ（Ａｂｒ
ａｍｏｖｉｔｚ）、Ａ．、およびミシュキン（Ｍｉｓｈ
ｋｉｎ）、Ｅ．。１９９０。アブスツラクト。単純ヘル
ペスウイルスの精製した糖タンパク質（ｇＤ１）ワクチ
ンのランダム化二重ブラインド、プラシーボコントロー
ルした相Ｉの試験。第３０回ＩＣＡＡＣ会合、１９９
０。

【００６７】１０、フラー（Ｆｕｌｌｅｒ）、Ａ．Ｏ．
およびＰ．Ｇ．スピーア（Ｓｐｅａｒ）。１９８７。単
純ヘルペスウイルス１による吸収を許すが、感染をブロ
ッキングする抗糖タンパク質Ｄ抗体は、細胞表面におけ
るヴィリオンの融合を防止する。プロシーディングス・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、８４：
５４５４−５４５８。

【００６８】１１、ヘバー−カツズ（Ｈｅｂｅｒ−Ｋａ
ｔｚ）、Ｅ．、ホロシ（Ｈｏｌｌｏｓｉ）、Ｍ．、ジエ
ズショルド（Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ）、Ｂ．、フデク
ズ（Ｈｄｅｃｚ）、Ｆ．、およびＧ．Ｄ．ファスマン
（Ｆａｓｍａｎ）。１９８５。Ｔ細胞は単純ヘルペスウ
イルスの糖タンパク質Ｄに対して応答する：抗原のコン
フォメーションの意義。ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１３５：１３８５−１３９
０。

【００６９】１２、ハイランダー（Ｈｉｇｈｌａｎｄｅ
ｒ）、Ｓ．Ｌ．、サザーランド（Ｓｕｇｈｅｒｌａｎ
ｄ）、Ｓ．Ｌ．、ゲイプ（Ｇａｐｅ）、Ｐ．Ｊ．、ジョ
ンソン（Ｊｈｏｎｓｏｎ）、Ｄ．Ｃ．、レビン（Ｌｅｖ
ｉｎｅ）、Ｍ．およびＪ．Ｃ．グロリオソ（Ｇｌｏｒｉ
ｏｓｏ）。１９８７。単純ヘルペスウイルスの糖タンパ
ク質Ｄに対して特異的なモノクローナル抗体の中和は浸
透を防止する。ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）、６１：３３５６−３３６４。

【００７０】１３、組み換えバキュロウイルス感染昆虫
細胞におけるヒト組織プラスミノゲンアクチベーターの
グリコシル化および分泌。モレキュラー・アンド・セル
ラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、９：２１４−２２
３。

【００７１】１４、クリシュナ（Ｋｒｉｓｈｎａ）、
Ｓ．、ブラックロウズ（Ｂｌａｘｋｌａｗｓ）、Ｂ．
Ａ．、オバートン（Ｏｖｅｒｔｏｎ）、Ｈ．Ａ．、ビシ
ョップ（Ｂｉｓｈｏｐ）、Ｄ．Ｈ．Ｌ．、およびＡ．
Ａ．ナッシュ（Ｎａｓｈ）。１９８９。組み換えバキュ
ロウイルスにおける単純ヘルペスウイルス１型の糖タン
パク質Ｄの発現：組み換え感染細胞の保護的応答および
Ｔ細胞の認識。ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジ
ー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、７０：１８０５−１
８１４。

【００７２】１５、ランフォード（Ｌａｎｆｏｒｄ）、
Ｒ．Ｅ．、ルッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）、ｖ．、ケネディ
（ｋｅｎｎｅｄｙ）、Ｒ．Ｃ．、ドリースマン（Ｄｒｅ
ｅｓｍａｎ）、Ｇ．Ｒ．、ノットヴァル（Ｎｏｔｖａｌ
ｌ）、Ｌ．、およびＭ．Ｄ．サンマーズ（Ｓｕｍｍｅｒ
ｓ）。１９８９。バキュロウイルスの発現系を使用する
昆虫細胞中のＢ型ウイルスｎｏ表面抗原のポリペプチド
の発現および特性決定。ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ）、６３：１５４９−１５５７。

【００７３】１６、ラスキー（Ｌａｓｋｙ）、Ｌ．Ａ．
およびＤ．Ｊ．ドウベンクス（Ｄｏｗｂｅｎｋｓ）。１
９８４。単純ヘルペスウイルス１型および２型の型共通
の糖タンパク質Ｄ遺伝子のＤＮＡ配列の分析。ＤＮＡ
３：２３−２９。

【００７４】１７、ルッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）、Ｖ．
Ａ．およびＭ．Ｄ．サンマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）。１
９８８。バキュロウイルスの発現ベクターの開発におけ
る傾向。バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）、６：４７−５５。 １８、ルッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）、Ｖ．Ａ．およびＭ．
Ｄ．サンマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）。１９８９。Ａｕｔ
ｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核のポリヘ
ドロシスウイルスの発現ベクターを使用する非融合外来
遺伝子の高いレベルの発現。ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ）、１７０：３１−３９。

【００７５】１９、マエダ、Ｓ．、クワイ、Ｔ．、オビ
ナタ、Ｍ．、フジワラ、Ｈ．、ホリウチ、Ｔ．、サエ
キ、Ｙ．、サトー、Ｙ．、フルサワ、Ｍ．。１９８５。
バキュロウイルスのベクターを使用するカイコにおける
ヒトα−インターフェロンの産生。ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、３１５：５９２−５９４。

【００７６】２０、マイオレラ（Ｍａｉｏｒｅｌｌ
ａ）、Ｂ．、インロウ（Ｉｎｌｏｗ）、Ｄ．、シャウガ
ー（Ｓｈａｕｇｅｒ）、Ａ．およびＤ．ハラノ（Ｈａｒ
ａｎｏ）。１９８８。組み換えタンパク質の産生のため
の大規模の昆虫細胞の培養。バイオ／テクノロジー（Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６：１４０６−１４１
０。

【００７７】２１、マニアチス（Ｍａｎｉｔｉｓ）、
Ｔ．、フリトシ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、Ｅ．Ｆ．、および
Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。１９８２。分
子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ
ー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニュー
ヨーク。

【００７８】２２、マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、Ｓ．、
モス（Ｍｏｓｓ）、Ｂ．、バーマン（Ｂｅｒｍａｎ）、
Ｐ．Ｗ．、ラスキイ（Ｌａｓｋｙ）、Ｌ．Ａ．、および
Ｂ．Ｔ．ラウス（Ｒｏｕｓｅ）。１９８７。単純ヘルペ
スウイルス１型糖タンパク質Ｄ：細胞障害性Ｔ細胞を発
現するワクシニアウイルスの組み換え体により誘発され
た抗ウイルスの免疫性のメカニズム。ウイルス学誌
（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、６１：７２６−７３４。

【００７９】２３、マツラ（Ｍａｔｓｕｒａ）、Ｙ．、
ポッシー（Ｐｏｓｓｅｅ）、Ｒ．Ｄ．。オーバートン
（Ｏｖｅｒｔｏｎ）、Ｈ．Ａ．およびビショップ（Ｂｉ
ｓｈｏｐ），Ｄ．Ｈ．Ｌ．。１９８７。バキュロウイル
スの発現ベクター：タンパク質の高いレベルについての
要件、糖タンパク質を包含する。ジャーナル・オブ・ゼ
ネラル・ビロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）、６
８：１２３３−１２５０。

【００８０】２４、メルニック（Ｍｅｌｎｉｃｋ）、
Ｊ．Ｌ．、アダム（Ａｄａｍ）、Ｅ．、およびＷ．ラウ
ルス（Ｒａｗｌｓ）。１９７４。頸癌におけるヘルペス
ウイルス２型の原因となる役割。キャンサー（Ｃａｎｃ
ｅｒ）、３８：１３５５−１３８５。

【００８１】２５、ミシュキン（Ｍｉｓｈｋｉｎ）、
Ｅ．Ｍ．、ファヘイ（Ｆａｈｅｙ）、Ｊ．Ｒ．、キノ
（Ｋｉｎｏ）、Ｙ．、クレイン（Ｋｌｅｉｎ）、Ｒ．
Ｊ．、アブラモビズ（Ａｂｒａｍｏｖｉｔｚ）、Ａ．
Ｓ．、およびＳ．Ｊ．メント（Ｍｅｎｔｏ）。１９９
１。自然単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄのワク
チン：動物のモデルにおける免疫原性および保護。ワク
チン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、９：１４７−１５３。

【００８２】２６、モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ）、Ｔ．
Ｒ．およびＲ．Ｌ．コフマン（Ｃｏｆｆｍａｎｎ）。１
９８９。サイトカイニンの分泌のパターンの不均質性お
よびヘルパーＴ細胞の機能。アドバンスド・イムノロジ
ー（Ａｄｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、４６：１１１−１４
７。

【００８３】２７、ムッガーリッジ（Ｍｕｇｇｅｒｉｄ
ｇｅ）、Ｍ．Ｌ．、ウー（Ｗｕ）、Ｔ．Ｔ．、ジョンソ
ン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｄ．Ｃ．、グロリオソ（Ｇｌｏ
ｒｉｏｓｏ）、Ｊ．Ｃ．、アイゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎ
ｂｅｒｇ）、Ｒ．Ｊ．、およびＧ．Ｈ．コーヘン（Ｃｏ
ｈｅｎ）。１９９０。ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの中和
部位の抗原および機能的分析。ウイルス学（Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ）、１７４：３７５−３８７。

【００８４】２８、ムッガーリッジ（Ｍｕｇｇｅｒｉｄ
ｇｅ）、Ｍ．Ｌ．、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、Ｓ．
Ｒ．、イソラ（Ｉｓｏｌａ）、Ｖ．Ｊ．、コーヘン（Ｃ
ｏｈｅｎ）、Ｇ．Ｈ．およびＲ．Ｊ．アイゼンバーグ
（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）。１９９０。単純ヘルペスウイ
ルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）。
ｐｐ．４５９＝４８１。Ｍ．Ｈ．Ｖ．ファン・レゲンモ
ーテル（Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ）およびＡ．Ｒ．ネウ
ラス（Ｎｅｕｒａｔｈ）（編）。ウイルスの免疫化学。
ＩＩ。血清およびワクチン。ニューヨーク、エセビー
ア。

【００８５】２９、ムッガーリッジ（Ｍｕｇｇｅｒｉｄ
ｇｅ）、Ｍ．Ｉ．、イソラ（Ｉｓｏｌａ）、Ｖ．Ｊ．、
ビルン（Ｂｙｒｎ）、Ｒ．Ａ．、ツッカー（Ｔｕｃｋｅ
ｒ）、Ｔ．Ｊ．、ミンソン（Ｍｉｎｓｏｎ）、Ａ．
Ｃ．、グロリオソ（Ｇｌｏｒｉｏｓｏ）、Ｊ．Ｃ．、コ
ーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｇ．Ｈ．、およびＲ．Ｊ．アイ
ゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）。１９８８。単純ヘ
ルペスウイルスの糖タンパク質Ｄの主要な中和部位の抗
原の分析、欠失突然変異およびモノクローナル抗体抵抗
性突然変異。ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、
６２：３２７４−３２８０。

【００８６】３０、ナーミアス（Ｎａｈｍｉａｓ）、
Ａ．Ｊ．およびＲ．Ｍ．コールマン（Ｃｏｌｅｍａ
ｎ）。１９８４。ヒトにおいて単純ヘルペスウイルスの
感染の意義。ｐｐ．９２−１０２。Ｂ．Ｔ．ルーウス
（Ｒｏｏｕｓｅ）およびＣ．ロペズ（Ｌｏｐｅｚ）
（編）。単純ヘルペスウイルスの感染の免疫生物学：Ｉ
ｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉ
ｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、ＣＲ
Ｃ Ｐｒｅｓｓ、バコタレイトン。

【００８７】３１、ノリルド（Ｎｏｒｒｉｌｄ）、
Ｂ．、ショア（ｓｈｏｒｅ）、Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｊ．
ナーミアス（Ｎａｈｍｉａｓ）。１９７９。単純ヘルペ
スウイルスの糖タンパク質：免疫細胞溶解における個々
の単純ヘルペスウイルス１型の分割および従来同定され
たグリコペプチドとのそれらの相関関係。ウイルス学誌
（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３２：７４１−７４８。

【００８８】３２、パオレッチ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）、
Ｅ．、リプスンスカス（ｌｉｐｓｉｎｓｋａｓ）、Ｂ．
Ｒ．、サムソノッフ（Ｓａｍｓｏｎｏｆｆ）、Ｃ．、マ
ーセル（Ｍｅｒｃｅｒ）、Ｓ．およびＤ．パニカリ（Ｐ
ａｎｉｃａｌｉ）。１９８４。遺伝子操作したポックス
ウイルスを使用する生ワクチンの構成：肝炎ウイルスお
よび単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄを発現する
ワクシニアウイルスの組み換え体の生物学的活性。プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）、８１：１９３−１９７。

【００８９】３３、レイド−サンダデン（Ｒｅｉｄ−Ｓ
ａｎｄｅｎ）、Ｆ．Ｌ．、サムナー（Ｓｕｍｎｅｒ）、
Ｊ．Ｗ．、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｊ．Ｓ．、フェカヅ
（Ｆｅｋａｄｕ）、Ｍ．、シャッドック（Ｓｈａｄｄｏ
ｃｋ）、ｊ．Ｈ．およびＷ．Ｊ．ベリニ（Ｂｅｌｌｉｎ
ｉ）。１９９０。バキュロウイルスにおいて発現された
狂犬病のＮ遺伝子から調製した狂犬病の診断の試薬。ジ
ャーナル・オブ・クリカル・マイクロバイオロジー
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２８：８５
８−８６３。

【００９０】３４、シュマルジョン（Ｓｃｈｍａｌｊｏ
ｈｎ）、Ｃ．Ｓ．、パーカー（Ｐａｒｋｅｒ）、Ｍ．
Ｄ．、エンニス（Ｅｎｎｉｓ）、Ｗ．Ｈ．、ダーリンプ
ル（Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ）、Ｊ．Ｍ．、コレット（Ｃｏ
ｌｌｅｔｔ）、Ｍ．Ｓ．、スキチ（Ｓｕｘｉｃｈ）、
Ｊ．Ａ．、およびＡ．Ｌ．シュマルジョン（Ｓｃｈｍａ
ｌｊｏｈｎ）。１９８９。リフトバレー熱ウイルスのＭ
ゲノムのセグメントのバキュロウイルスの発現および発
現された抗原および免疫原の性質。ウイルス学（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）、１７０：１８４−１９２。

【００９１】３４、シュリーア（Ｓｃｈｒｉｅｒ）、
Ｒ．Ｄ．、ピゼル（Ｐｉｚｅｒ）、Ｌ．Ｉ．、および
Ｊ．Ｗ．ムーアヘッド（Ｍｏｏｒｈｅａｄ）。１９８
３。分離された単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質に
より誘発された型特異的遅延された型の過敏および保護
免疫性。ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ）、１３０：１４１３−１４１８。

【００９２】３５、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｇ．Ｅ．、
サンマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、Ｍ．Ｄ．、およびフレ
イザー（Ｆｒａｓｅｒ）、Ｍ．Ｊ．。１９８３。バキュ
ロウイルスの発現ベクターで感染させた昆虫細胞におけ
るヒトベータ−インターフェロンの産生。モレキュラー
・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）、３：２１５６−２１６５。

【００９３】３６、スタンベリイ（Ｓｔａｎｂｅｒｒ
ｙ）、Ｌ．Ｒ．、バーケ（Ｂｕｒｋｅ）、Ｌ．Ｒ．、お
よびＭ．Ｇ．マイアーズ（Ｍｙｅｒｓ）。１９８８。再
発性陰部ヘルペスの単純ヘルペスウイルスの糖タンパク
質の処理。ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディ
ジージス（Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．）、１５７：１５
６−１６３。

【００９４】３７、スタンベリイ（Ｓｔａｎｂｅｒｒ
ｙ）、Ｌ．Ｒ．、バーンステイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉ
ｎ）、Ｄ．Ｉ．、バーケ（Ｂｕｒｋｅ）、Ｒ．Ｌ．、パ
チル（Ｐａｃｈｌ）、Ｃ．、およびＭ．Ｇ．マイヤース
（Ｍｙｅｒｓ）。１９８７。組み換え単純ヘルペスウイ
ルスの糖タンパク質を使用するワクチン接種：初期およ
び再発性陰部ヘルペスに対する保護。ジャーナル・オブ
・インフェクシャス・ディジージス（Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．
Ｄｉｓ．）、１５５：９１４−９２０。

【００９５】３８、サンマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）、
Ｍ．Ｄ．、およびＧ．Ｅ．スミス（Ｓｍｉｔｈ）。１９
８７。テキサス・アグリカルチュラル・イクスペリメン
ト・ステーション・ブレチン（Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃ
ｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏ
ｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）Ｎｏ．１５５５。

【００９６】３９、シミングトン（Ｓｙｍｉｎｇｔｏ
ｎ）、Ｊ．。１９８４。２次元のゲルからシートへのタ
ンパク質の電気泳動の転移およびそれらの検出。ｐｐ．
１２７−１６８。Ｊ．Ｅ．セリス（Ｃｅｌｉｓ）および
Ｒ．ブラボ（Ｂｒａｖｏ）（編）、タンパク質の２次元
のゲルの電気泳動：方法および応用（Ｔｗｏ Ｄｉｍｅ
ｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏ
ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。アカデミック・プレス（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク。

【００９７】４０、トルセス（Ｔｏｒｓｅｔｈ）、Ｊ．
Ｗ．、コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、Ｇ．Ｈ．、アイゼンバ
ーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ）、Ｒ．Ｊ．、バーマン（Ｂ
ｅｒｍａｎ）、Ｐ．Ｗ．、ラスキイ（Ｌａｓｋｙ）、
Ｌ．Ａ．、セリニ（Ｃｅｒｉｎｉ）、Ｃ．Ｐ．、ヘイル
マン（Ｈｅｉｌｍａｎ）、Ｃ．Ｊ．、カーワー（Ｋｅｒ
ｗａｒ）、Ｓ．、およびＴ．Ｃ．メリガン（Ｍｅｒｉｇ
ａｎ）。１９８７。自然および組み換え体の単純ヘルペ
スウイルス１型のエンベロープタンパク質は、ヒト免疫
Ｔリンパ球の応答を誘発する。ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）、６１：１５３２−１５３９。

【００９８】４１、バレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌ
ａ）、Ｐ．、コイト（Ｃｏｉｔ）、Ｄ．、メジナ−セル
バイ（Ｍｅｄｉｎａ−Ｓｅｌｂｙ）、Ｍ．Ａ．、クオ
（Ｋｕｏ）、Ｃ．Ｈ．、バン・ネスト（Ｖａｎ Ｎｅｓ
ｔ）、Ｇ．、バーケ（Ｂｕｒｋｅ）、Ｌ．Ｒ．、ブル
（Ｂｕｌｌ）、Ｐ．、アルデア（Ａｒｄｅａ）、Ｍ．
Ｓ．、およびＰ．Ｖ．グレイブス（Ｇｒａｖｅｓ）。１
９８３。酵母菌中の抗原の操作：ハイブリッドのＢ型肝
炎の表面抗原−単純ヘルペス１ｇＤ粒子。バイオテクノ
ロジー（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３：３２３−
３２６。

【００９９】４２、ウェイザー（Ｗａｔｈｅｒ）、Ｍ．
Ｗ．、ブリデアウ（Ｂｒｉｄｅａｕ）、Ｒ．Ｊ．、およ
びＤ．Ｒ．トムセン（Ｔｈｏｍｓｅｎ）。１９８９。バ
キュロウイルスのベクターを使用するヒトＲＳウイルス
Ｆ糖タンパク質を使用するワタラットの免疫化。ジャー
ナル・オブ・インフェクシャス・ディジージス（Ｊ．Ｉ
ｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．）、１５９：２５５−２６４。

【０１００】４３、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｒ．
Ｊ．。１９８３。単純ヘルペスウイルス２型の糖タンパ
ク質Ｄ遺伝子のＤＮＡ配列。遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２
６：３０７−３１２。

【０１０１】４４、ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｒ．
Ｊ．、ウェイス（Ｗｅｉｓ）、Ｊ．Ｈ．、サルストロム
（Ｓａｌｓｔｒｏｍ）、Ｊ．Ｓ．、およびＬ．Ｗ．エン
クイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）。１９８２。単純ヘルペス
ウイルス１型の糖タンパク質Ｄ遺伝子：ヌクレオチド配
列および大腸菌における発現。サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ）、２１８：３８１。

【０１０２】４５、ウェルス（Ｗｅｌｌｓ）、Ｄ．
Ｅ．、ブグラー（Ｖｕｇｌｅｒ）、Ｌ．Ｇ．、および
Ｗ．Ｊ．ブリット（Ｂｒｉｔｔ）。１９９０。昆虫細胞
中で発現されたヒトサイトメガロウイルスｇｐ５５−１
１６（ｇＢ）の構造および免疫学的特性決定。ジャーナ
ル・オブ・ゼネラル・ビロロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ
ｏｌ．）、７１：８７３−８８０。

【０１０３】４６、ウィルコックス（Ｗｉｌｃｏｘ）、
Ｗ．Ｃ．、ロンド（Ｌｏｎｄ）、Ｄ．、ソドラ（Ｓｏｄ
ｏｒａ）、Ｄ．Ｌ．、アイゼンバーグ（Ｅｉｓｅｎｂｅ
ｒｇ）、Ｒ．Ｊ．、およびＧ．Ｈ．コーヘン（Ｃｏｈｅ
ｎ）。１９８８。システイン残基の抗原性への寄与およ
び単純ヘルペスウイルス１型の糖タンパク質Ｄのプロセ
シングの程度。ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）、６２：１９４１−１９４７。

【０１０４】４７、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ）、Ｄ．Ａ．、チェイス（Ｃｈａｓｅ）、Ｍ．Ｗ．。
１９６７。免疫学および免疫化学についての方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）。Ｖｏｌ．１。アカデ
ミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニ
ューヨーク、ｐｐ．１９７−２３７。

【０１０５】４８、ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）、
Ｊ．Ｍ．、モウラン（Ｍｏｒａｎ）、Ｐ．Ａ．、ラスキ
イ（Ｌａｓｋｙ）、Ｌ．Ａ．、およびＢ．モス（Ｍｏｓ
ｓ）。１９８６。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の特
異的ヒトＴ細胞のクローンは、組み換えワクシニアウイ
ルスにより発現されたＨＳＶ糖タンパク質Ｄを認識す
る。ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、５９：５
０６−５０９。

【０１０６】本発明の主な特徴および態様は次の通りで
ある。

【０１０７】１、ＨＳＶ ｇＤ２をエンコードする遺伝
子を組み込んだバキュロウイルスのＤＮＡで昆虫細胞を
トランスフェクションし、そして前記遺伝子の発現を可
能とする条件下に前記細胞を培養することからなるＨＳ
Ｖ ｇＤ２の組み換え産生法。

【０１０８】２、ＨＳＶ ｇＤ２遺伝子をバキュロウイ
ルスのポリヒドリンプロモーターのコントロール下にあ
る上記第１項記載の方法。

【０１０９】３、バキュロウイルスはオートグラファ・
カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａ）である上記第２項記載の方法。

【０１１０】４、ＨＳＶ ｇＤ２を回収し、そして精製
する上記第１項記載の方法。

【０１１１】５、上記第４項記載の方法により得られた
実質的に純粋なＨＳＶ ｇＤ２。

【０１１２】６、有効量の上記第５項記載のｇＤ２およ
び製剤学的に許容されうる担体からなるＨＳＶの感染を
予防および処置するためのワクチン組成物。

【０１１３】７、ＨＳＶ ｇＤ２をエンコードする遺伝
子に操作的に連鎖したバキュロウイルスのポリヘドリン
プロモーターからなるＤＮＡ構成体。

【０１１４】８、上記第７項記載の構成体からなるベク
ター。

【０１１５】９、ｐ９４１ｇＤ２Ｃである上記第８項記
載のベクター。

【０１１６】１０、上記第８項記載のベクターを含有す
る昆虫細胞。

【０１１７】１１、ベクターはｐ９４１ｇＤ２Ｃである
上記第１０項記載の昆虫細胞。

【０１１８】１２、ＨＳＶｇＤ２をエンコードする遺伝
子を含有しかつそれを発現することができる組み換えバ
キュロウイルス。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＳＶ２ゲノム中のｇＤ２遺伝子の位置および
バキュロウイルス転移ベクター中のその配置を示す図で
ある。（Ａ）単純ヘルペスウイルス２型（菌株１２）ゲ
ノム（４３）をＥｃｏＲＩで消化して、５ｋｂの断片上
のｇＤ２遺伝子を分離する。（Ｂ）ｇＤ２を含有するＳ
ｐｅＩ／ＸｈｏＩ断片を、バキュロウイルス転移ベクタ
ーｐＶＬ９４１の独特ＢａｍＨＩ部位の中に、平滑末端
の結合により挿入する。それぞれ、インサートの５’お
よび３’末端におけるＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ部位は、
平滑末端の結合後に失われる。しかしながら、ＢａｍＨ
Ｉ部位は保持される。

【図２】ｎｇＤ１、ｎｇＤ２およびｂｇＤ２のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析の結果のチャートである。精製されたタン
パク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥの電気泳動にかけ、そしてニ
トロセルロース上にエレクトロブロッティングする。フ
レームＡ：レーン１、分子量標準；レーン２、精製した
自然ｇＤ１；レーン３、精製したｇＤ２；レーン４、精
製した組み換えｇＤ２。ブロットをウサギポリクローナ
ル抗ｇＤ血清で免疫プロービングし、そしてペルオキシ
ダーゼ標識したプロテインＡおよび４−クロロナフトー
ル／Ｈ₂Ｏ₂で可視化した。フレームＢ：レーン１、分子
量標準；レーン２、精製した組み換えｇＤ２。ブロット
上のタンパク質バンドを銀染色により可視化した。

【図３】バキュロウイルス発現されたおよび自然ｇＤに
対するＥＬＩＳＡの応答を示すグラフである。ｎｇＤ１
（図３Ａ）およびバキュロウイルス発現されたｇＤ２
（図３Ｂ）の抗原に対する５匹のマウス／群の平均のＥ
ＬＩＳＡの応答。活性のｂｇＤ投与量に関係する増加の
一般的パターンを両者の抗原について認められた。免疫
化は次の通りであった：ＡｌＰＯ₄

【数１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/14 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 7/01 15/38 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/38 Ｃ１２Ｒ 1:92） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＳＶ ｇＤ２をエンコードする遺伝子
   を組み込んだバキュロウイルスのＤＮＡで昆虫細胞をト
   ランスフェクションし、そして前記遺伝子の発現を可能
   とする条件下に前記細胞を培養することを特徴とするＨ
   ＳＶ ｇＤ２の組み換え産生法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法により得られる実質
   的に純粋なＨＳＶｇＤ２。
3. 【請求項３】 有効量の請求項２記載のｇＤ２および製
   剤学的に許容されうる担体からなるＨＳＶの感染を予防
   および処置するためのワクチン組成物。
4. 【請求項４】 ＨＳＶ ｇＤ２をエンコードする遺伝子
   に操作的に連鎖したバキュロウイルスのホリヘドリンプ
   ロモーターからなるＤＮＡ構成体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の構成体からなるベクタ
   ー。
6. 【請求項６】 請求項５記載のベクターを含有する昆虫
   細胞。
7. 【請求項７】 ＨＳＶｇＤ２をエンコードする遺伝子を
   含有しかつそれを発現することができる組み換えバキュ
   ロウイルス。