JPH0698764A - 単純ヘルペスウイルス型１グリコプロテインｉの発現方法及び使用方法 - Google Patents
単純ヘルペスウイルス型１グリコプロテインｉの発現方法及び使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 組換えバキュロウイルスで感染又は形質転換
した細胞から単純ヘルペスウイルス型１(ＨＳＶ−１)グ
リコプロテインＩ(gＩ)を得る。 【構成】 組換えバキュロウイルスは遺伝構成が下記を
含む。 a) ＨＳＶ−１gＩをコードする遺伝子配列又は生物学
的に活性なその誘導体。 b) 該gＩ遺伝子配列がポリヘドリンプロモーターの調
整要素に官能的に結合するポリヘドリン遺伝子プロモー
ター配列。
した細胞から単純ヘルペスウイルス型１(ＨＳＶ−１)グ
リコプロテインＩ(gＩ)を得る。 【構成】 組換えバキュロウイルスは遺伝構成が下記を
含む。 a) ＨＳＶ−１gＩをコードする遺伝子配列又は生物学
的に活性なその誘導体。 b) 該gＩ遺伝子配列がポリヘドリンプロモーターの調
整要素に官能的に結合するポリヘドリン遺伝子プロモー
ター配列。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は感染病及び分子生物学の
分野に関する。
分野に関する。
【０００２】
Ａ．単純ヘルペスウイルス型１(ＨＳＶ−１)グリコプロ
テインＩ グリコプロテインＩ(gＩ)は１０の報告された単純ヘル
ペスウイルス型１(ＨＳＶ−１)グリコプロテインの１つ
である。ＨＳＶ−１感染細胞において、gＩは４１ＫＤa
の分子量を有する非グリコシル化ペプチドとして存在す
る。非グリコシル化ポリペプチドは、部分的にグリコシ
ル化されて約５５kＤaの前駆体gＩを生成し、次いでこ
れは６５kＤaの明白な分子量を有する熟成gＩまでさら
にグリコシル化される。
テインＩ グリコプロテインＩ(gＩ)は１０の報告された単純ヘル
ペスウイルス型１(ＨＳＶ−１)グリコプロテインの１つ
である。ＨＳＶ−１感染細胞において、gＩは４１ＫＤa
の分子量を有する非グリコシル化ペプチドとして存在す
る。非グリコシル化ポリペプチドは、部分的にグリコシ
ル化されて約５５kＤaの前駆体gＩを生成し、次いでこ
れは６５kＤaの明白な分子量を有する熟成gＩまでさら
にグリコシル化される。
【０００３】１０のＨＳＶグリコプロテインはウイルス
の表面に位置し、その幾らかは、ＨＳＶ−１感染への液
性(抗体)及び細胞性免疫応答の１次インヂューサー及び
標的であると報告されている。ＨＳＶ−１グリコプロテ
インＥ及びＩはイムノグロブリンＧのＦc部分に結合で
きる複合体を形成する。gＥのみではＦc受容体として作
用するが、gＩはこの活性を増強するように見える。今
までＦc受容体活性はgＩだけでは検出されていない。さ
らに、ブラックロウズ等は、gＩを発現したワクチニア
が免疫マウスで防御反応を生じないことを見出した。ブ
ラックロウズ、ビー．エイ．、クリシュナ．エス．、ミ
ンソン、エイ．シー．及びナシュ．エイ．エイ．ワクチ
ニアウイルス組換え体において発現された単純ヘルペス
ウイルス型１グリコプロテインの免疫原性、バイロロジ
ィ(Ｖirology)、１７７、７２７−７３６(１９９０)。
の表面に位置し、その幾らかは、ＨＳＶ−１感染への液
性(抗体)及び細胞性免疫応答の１次インヂューサー及び
標的であると報告されている。ＨＳＶ−１グリコプロテ
インＥ及びＩはイムノグロブリンＧのＦc部分に結合で
きる複合体を形成する。gＥのみではＦc受容体として作
用するが、gＩはこの活性を増強するように見える。今
までＦc受容体活性はgＩだけでは検出されていない。さ
らに、ブラックロウズ等は、gＩを発現したワクチニア
が免疫マウスで防御反応を生じないことを見出した。ブ
ラックロウズ、ビー．エイ．、クリシュナ．エス．、ミ
ンソン、エイ．シー．及びナシュ．エイ．エイ．ワクチ
ニアウイルス組換え体において発現された単純ヘルペス
ウイルス型１グリコプロテインの免疫原性、バイロロジ
ィ(Ｖirology)、１７７、７２７−７３６(１９９０)。
【０００４】グリコプロテインＩは、ワクチニア発現系
において唯一の他の群、スリバン及びスミスにより発現
され、そして、gＩ中和抗体は完全に補体依存性である
と報告された。スリバン．ブイ．及びスミス．ジー．エ
ル．単純ヘルペスウイルス型ＩＵＳ７遺伝子生成物は６
６Ｋグリコプロテインであり、補体依存性ウイルス中和
のための標的である。ジャーナル・オブ・ジェネラル・
バイロロジィ(Ｊ．Ｇen．Ｖirol．)、６９、８５９−８
６７(１９８８)。しかしながら、それらの報告された中
和力価は異常に低く、非慣用検定方法を用いて測定され
た。さらにブラックロウズ等は、スリバン及びスミスに
より構築された同じワクチニア組換えgＩを用い、標準
検定を用いて、補体の存在で１:２以下の中和力価を得
た。
において唯一の他の群、スリバン及びスミスにより発現
され、そして、gＩ中和抗体は完全に補体依存性である
と報告された。スリバン．ブイ．及びスミス．ジー．エ
ル．単純ヘルペスウイルス型ＩＵＳ７遺伝子生成物は６
６Ｋグリコプロテインであり、補体依存性ウイルス中和
のための標的である。ジャーナル・オブ・ジェネラル・
バイロロジィ(Ｊ．Ｇen．Ｖirol．)、６９、８５９−８
６７(１９８８)。しかしながら、それらの報告された中
和力価は異常に低く、非慣用検定方法を用いて測定され
た。さらにブラックロウズ等は、スリバン及びスミスに
より構築された同じワクチニア組換えgＩを用い、標準
検定を用いて、補体の存在で１:２以下の中和力価を得
た。
【０００５】これらの報告と対照的に、我々はバキュロ
ウイルス系において、ＨＳＶ−１感染に対し強い保護免
疫応答を惹起しうる多量のgＩを発現した。我々の組換
えgＩをワクチン接種したマウスは、強い中和抗体応答
を誘導した。gＩ中和力価は補体の存在で１:１６７、補
体の不存在で１:９１であり、従って、部分的に補体依
存性であるようであった。我々は、又、バキュロウイル
ス組換えgＩをワクチン接種したマウスが致死ＨＳＶ−
１感染に対し完全防御を示すことを見出した。我々の認
識では、これはgＩが動物においてＨＳＶ−１攻撃に対
し、防御免疫を誘導できることを証明する最初の報告で
ある。大量の高品質生物活性gＩを生成するこの能力は
ＨＳＶに対する有効ワクチンの開発に重要である。
ウイルス系において、ＨＳＶ−１感染に対し強い保護免
疫応答を惹起しうる多量のgＩを発現した。我々の組換
えgＩをワクチン接種したマウスは、強い中和抗体応答
を誘導した。gＩ中和力価は補体の存在で１:１６７、補
体の不存在で１:９１であり、従って、部分的に補体依
存性であるようであった。我々は、又、バキュロウイル
ス組換えgＩをワクチン接種したマウスが致死ＨＳＶ−
１感染に対し完全防御を示すことを見出した。我々の認
識では、これはgＩが動物においてＨＳＶ−１攻撃に対
し、防御免疫を誘導できることを証明する最初の報告で
ある。大量の高品質生物活性gＩを生成するこの能力は
ＨＳＶに対する有効ワクチンの開発に重要である。
【０００６】Ｂ．ＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ及び関連技術は、治療又は予防ＨＳＶワク
チンに必要とされる大量の高品質生物活性ＨＳＶグリコ
プロテインＩを有効に供給するのに適用できる。
チンに必要とされる大量の高品質生物活性ＨＳＶグリコ
プロテインＩを有効に供給するのに適用できる。
【０００７】ＤＮＡ技術は、部分的に、複製の起源、１
又はそれ以上の表現型選択特質、発現プロモーター、異
種遺伝子挿入及び残留ベクターのＤＮＡ組換えによる複
製可能発現伝播体又は置換(transplacement)ベクターを
生成することを含む。得られる発現伝播体は形質転換に
より細胞内に導入され組換えバキュロウイルス置換ベク
ターから受容体バキュロウイルスへ遺伝構造を置換させ
る。次いで、大量の組換え伝播体が被転換体を生育する
ことにより得られる。遺伝子がコード化されたＤＮＡメ
ッセージの転写及び翻訳を制御する調整要素に関して適
当に挿入され又は官能的に関連する所では、発現伝播体
は、挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列を生成し
うる。ポリペプチドを生成するこの方法は、“発現"と
呼ばれる。得られる生成物は宿主細胞を溶解し、適当な
精製方法により生成物を回収することにより得られる。
又はそれ以上の表現型選択特質、発現プロモーター、異
種遺伝子挿入及び残留ベクターのＤＮＡ組換えによる複
製可能発現伝播体又は置換(transplacement)ベクターを
生成することを含む。得られる発現伝播体は形質転換に
より細胞内に導入され組換えバキュロウイルス置換ベク
ターから受容体バキュロウイルスへ遺伝構造を置換させ
る。次いで、大量の組換え伝播体が被転換体を生育する
ことにより得られる。遺伝子がコード化されたＤＮＡメ
ッセージの転写及び翻訳を制御する調整要素に関して適
当に挿入され又は官能的に関連する所では、発現伝播体
は、挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列を生成し
うる。ポリペプチドを生成するこの方法は、“発現"と
呼ばれる。得られる生成物は宿主細胞を溶解し、適当な
精製方法により生成物を回収することにより得られる。
【０００８】原核及び真核生物を含む広範囲の宿主細胞
を用いることができる。微生物に加えて、脊椎動物であ
れ、非脊椎動物であれ、多細胞生物から導かれる細胞の
培養物も宿主として用いうる。我々の系は、バキュロウ
イルス、ポリヘドリンプロモーター系及び宿主細胞とし
ての昆虫細胞の使用を含み、大量の生物活性gＩを生成
した。我々の認識によれば、我々はgＩワクチンを用い
る致死ＨＳＶ−１攻撃に対する高レベルの防御を証明す
る最初である。本明細書で記載される文献は全て引例と
して明細書記載の一部とする。
を用いることができる。微生物に加えて、脊椎動物であ
れ、非脊椎動物であれ、多細胞生物から導かれる細胞の
培養物も宿主として用いうる。我々の系は、バキュロウ
イルス、ポリヘドリンプロモーター系及び宿主細胞とし
ての昆虫細胞の使用を含み、大量の生物活性gＩを生成
した。我々の認識によれば、我々はgＩワクチンを用い
る致死ＨＳＶ−１攻撃に対する高レベルの防御を証明す
る最初である。本明細書で記載される文献は全て引例と
して明細書記載の一部とする。
【０００９】
発明の要約 本発明は、組換えＤＮＡ技術によるＨＳＶ−１gＩの生
成及びＨＳＶ−１及び／又はＨＳＶ−２感染を防御する
ワクチンにおける免疫原としてのその用途に関する。遺
伝的に設計された免疫原から造られたワクチンは、弱毒
化ウイルスから造られた慣用のワクチンよりも安全であ
るべきである。というのは、レシピエントへの感染の危
険がなく、特にヘルペスウイルスについてそうであり、
頸部癌の危険がないからである。別法として遺伝的に設
計されたグリコプロテイン又は蛋白生成物が受身免疫治
療での使用のための抗体を生成するのに用いうる。本発
明は又、目的の置換ベクターを含む形質転換細胞系及び
ＨＳＶ−１gＩを生成するその培養物にも関する。
成及びＨＳＶ−１及び／又はＨＳＶ−２感染を防御する
ワクチンにおける免疫原としてのその用途に関する。遺
伝的に設計された免疫原から造られたワクチンは、弱毒
化ウイルスから造られた慣用のワクチンよりも安全であ
るべきである。というのは、レシピエントへの感染の危
険がなく、特にヘルペスウイルスについてそうであり、
頸部癌の危険がないからである。別法として遺伝的に設
計されたグリコプロテイン又は蛋白生成物が受身免疫治
療での使用のための抗体を生成するのに用いうる。本発
明は又、目的の置換ベクターを含む形質転換細胞系及び
ＨＳＶ−１gＩを生成するその培養物にも関する。
【００１０】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】この目的
のために、我々はＳf９細胞において高レベルのＨＳＶ
−１gＩを発現する組換えバキュロウイルスを構築し
た。しかしながら、我々は予期に反して我々の発現gＩ
によるマウスのワクチン接種が致死ＨＳＶ−１攻撃に対
する高レベルの防御を起こすことを発見した。従って、
方法及び組成物は単一細胞宿主生物におけるＨＳＶgＩ
遺伝子のクローニング及び発現に提供される。又、これ
らの新規単一細胞生物を培養してＨＳＶgＩ遺伝子生成
物を生成する方法及び遺伝子生成物の精製方法をも記載
する。
のために、我々はＳf９細胞において高レベルのＨＳＶ
−１gＩを発現する組換えバキュロウイルスを構築し
た。しかしながら、我々は予期に反して我々の発現gＩ
によるマウスのワクチン接種が致死ＨＳＶ−１攻撃に対
する高レベルの防御を起こすことを発見した。従って、
方法及び組成物は単一細胞宿主生物におけるＨＳＶgＩ
遺伝子のクローニング及び発現に提供される。又、これ
らの新規単一細胞生物を培養してＨＳＶgＩ遺伝子生成
物を生成する方法及び遺伝子生成物の精製方法をも記載
する。
【００１１】次いでヒト宿主に、好ましくは免疫誘導量
のgＩのみを含むワクチンをあるいは１又はそれ以上の
ＨＳＶグリコプロテイン又は蛋白と共に、全身性経路、
腸内経路又は、眼経路により接種する。ワクチンも、
又、ワクチンのグリコプロテイン成分と共に、前又は後
に、投与される１又はそれ以上のアジュバンドを含みう
る。
のgＩのみを含むワクチンをあるいは１又はそれ以上の
ＨＳＶグリコプロテイン又は蛋白と共に、全身性経路、
腸内経路又は、眼経路により接種する。ワクチンも、
又、ワクチンのグリコプロテイン成分と共に、前又は後
に、投与される１又はそれ以上のアジュバンドを含みう
る。
【００１２】本発明のワクチンは、溶液形、凍結乾燥、
噴霧乾燥、又は凍結乾燥形で、処理の間にグリコプロテ
イン又は蛋白を保護するために１又はそれ以上の適当な
保存剤及び保護剤と組合せて有利に用いうる。
噴霧乾燥、又は凍結乾燥形で、処理の間にグリコプロテ
イン又は蛋白を保護するために１又はそれ以上の適当な
保存剤及び保護剤と組合せて有利に用いうる。
【００１３】Ａ．抗原 バキュロウイルス発現gＩは５２及び５６kＤaの分子量
を有し、ゲル上を移動した。組換えgＩはツニカマイシ
ン及びエンドグリコシダーゼＨに対するその感受性によ
り証明されるようにグリコシル化されたようである。間
接免疫蛍光もそれがＳf９細胞の膜に輸送されることを
証明した。我々の発現gＩをワクチン接種したマウスは
致死ＨＳＶ−１攻撃からマウスを防御する高血清力価の
補体依存性及び非補体依存性ＨＳＶ−１中和抗体を示し
た。
を有し、ゲル上を移動した。組換えgＩはツニカマイシ
ン及びエンドグリコシダーゼＨに対するその感受性によ
り証明されるようにグリコシル化されたようである。間
接免疫蛍光もそれがＳf９細胞の膜に輸送されることを
証明した。我々の発現gＩをワクチン接種したマウスは
致死ＨＳＶ−１攻撃からマウスを防御する高血清力価の
補体依存性及び非補体依存性ＨＳＶ−１中和抗体を示し
た。
【００１４】Ｂ．アジュバンド ワクチンは種々のアジュバンドとエマルジョンでしばし
ば投与される。アジュバンドは、免疫原のみが投与され
るよりも少ない用量でより少量の抗原を用いて、より永
続性でより高レベルの免疫を獲得するのを助ける。本発
明において用いるアジュバンドはアラム、フロインド、
ＭＴＰ−ＰＥ及びＩＳＣＯＭs(ＱuilＡ)を含むがこれに
限らない。加えて、ワクチンは、細胞伝達免疫応答を誘
導するため１又はそれ以上のアジュバンドと共に又は存
在させることなく投与される１又はそれ以上のＨＳＶ−
１グリコプロテインを含むリポソーム又は他の膜結合小
胞を含みうる。
ば投与される。アジュバンドは、免疫原のみが投与され
るよりも少ない用量でより少量の抗原を用いて、より永
続性でより高レベルの免疫を獲得するのを助ける。本発
明において用いるアジュバンドはアラム、フロインド、
ＭＴＰ−ＰＥ及びＩＳＣＯＭs(ＱuilＡ)を含むがこれに
限らない。加えて、ワクチンは、細胞伝達免疫応答を誘
導するため１又はそれ以上のアジュバンドと共に又は存
在させることなく投与される１又はそれ以上のＨＳＶ−
１グリコプロテインを含むリポソーム又は他の膜結合小
胞を含みうる。
【００１５】Ｃ．免疫経路 ワクチンは全身経路、全身予防接種と組合せ又は組合せ
ることになく眼球経路、又は腸内経路により投与でき
る。全身経路は１又は多用量で、皮下、筋肉、又は静脈
内注射を含むがこれに限らない。眼球経路は、１又は多
用量での眼の結膜下注射、表面滴下、徐放装置、例えば
コラーゲン保護、ヒドロゲルコンタクトレンズ又はＡＬ
ＺＡ“Ｏcusert"を含むがこれに限らない。
ることになく眼球経路、又は腸内経路により投与でき
る。全身経路は１又は多用量で、皮下、筋肉、又は静脈
内注射を含むがこれに限らない。眼球経路は、１又は多
用量での眼の結膜下注射、表面滴下、徐放装置、例えば
コラーゲン保護、ヒドロゲルコンタクトレンズ又はＡＬ
ＺＡ“Ｏcusert"を含むがこれに限らない。
【００１６】投与される用量は、変更可能で一般に予防
接種を含む１ないし３用量で所望の効果及び選択した投
与経路に依存する。しかしながら、注射によるヒトへの
接種用量は約１μgから１０００μgまで変化する。眼球
予防接種については、ヒト供与量は約１μgから５００
μgまで変わり、一方、腸内予防接種についてはヒト供
与量は約１μgから２０００μgまで変わる。
接種を含む１ないし３用量で所望の効果及び選択した投
与経路に依存する。しかしながら、注射によるヒトへの
接種用量は約１μgから１０００μgまで変化する。眼球
予防接種については、ヒト供与量は約１μgから５００
μgまで変わり、一方、腸内予防接種についてはヒト供
与量は約１μgから２０００μgまで変わる。
【００１７】従って、本発明の主たる目的は、高レベル
のＨＳＶ−１gＩを発現することである。
のＨＳＶ−１gＩを発現することである。
【００１８】本発明の目的は単一ベクター系において１
ウイルス株から高レベルのＨＳＶ−１gＩを発現するこ
とである。
ウイルス株から高レベルのＨＳＶ−１gＩを発現するこ
とである。
【００１９】本発明の目的は、又、組換えバキュロウイ
ルスに感染し、又は形質転換した細胞から高レベルの生
物活性ＨＳＶ−１gＩを発現することである。
ルスに感染し、又は形質転換した細胞から高レベルの生
物活性ＨＳＶ−１gＩを発現することである。
【００２０】本発明の他の目的は、ＨＳＶ−１gＩを生
成する形質転換された細胞系を得ることである。
成する形質転換された細胞系を得ることである。
【００２１】本発明の次の目的は、宿主におけるＨＳＶ
の処置又は予防のための有効なワクチンを開発すること
である。
の処置又は予防のための有効なワクチンを開発すること
である。
【００２２】これらの及び他の目的は、以下の記載及び
添付された請求の範囲からこの分野の当業者が容易に明
らかとなろう。
添付された請求の範囲からこの分野の当業者が容易に明
らかとなろう。
【００２３】図面の説明 本発明を添付の図面の援助によって説明する。
【００２４】図１は、ＨＳＶ−１gＩ遺伝子を含むpＡc
−gＩ１組換えバキュロウイルス転換ベクターの構築の
概要図表である。バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子
プロモーター(斜線部分)のコントロールの下にＨＳＶ−
１gＩ(黒ぬり部分)の完全コード部分を含むバキュロウ
イルス転移ベクター(pＡc−gＩＩ)の構築方法は、ここ
に概要を述べ、テキストに記載される。図の底部はバキ
ュロウイルス転移ベクターにおけるクローン化されたg
Ｉの５'末端の近くの部分の配列である。バキュロウイ
ルスポリヘドロン遺伝子プロモーターの３'末端、Ｂam
ＨＩリンカー、及びgＩのコード配列(gＩ遺伝子の５非
コードヌクレオチドにより先に起きた)を示す。
−gＩ１組換えバキュロウイルス転換ベクターの構築の
概要図表である。バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子
プロモーター(斜線部分)のコントロールの下にＨＳＶ−
１gＩ(黒ぬり部分)の完全コード部分を含むバキュロウ
イルス転移ベクター(pＡc−gＩＩ)の構築方法は、ここ
に概要を述べ、テキストに記載される。図の底部はバキ
ュロウイルス転移ベクターにおけるクローン化されたg
Ｉの５'末端の近くの部分の配列である。バキュロウイ
ルスポリヘドロン遺伝子プロモーターの３'末端、Ｂam
ＨＩリンカー、及びgＩのコード配列(gＩ遺伝子の５非
コードヌクレオチドにより先に起きた)を示す。
【００２５】図２は感染昆虫細胞における発現gＩのウ
エスタンブロット分析である。昆虫細胞はバキュロウイ
ルス−gＩ組換え体(vＡc−gＩＩ)で、１０の多重性の感
染で感染し、幾つかの単層はツニカマイシンで処理(感
染後０ないし４８時間)するか、又は細胞抽出物を製造
業者(ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ)に
より推奨されるように、エンドグリコシダーゼＨで処理
した。大略述べると、１０5細胞をゲル試料緩衝液、酢
酸ナトリウム緩衝液(pＨ５．０)に溶解した。次いで、
エンドグリコシダーゼＨを加えて試料を一夜インキュベ
ートした。レーン:Ｍ、分子寸法標識:１、野性型−バキ
ュロウイルス−感染昆虫細胞:２、バキュロウイルス−g
Ｉ−感染細胞感染後４８時間:３、バキュロウイルス−g
Ｉ−感染細胞感染後７２時間:４、ツニカマイシン−処
理、バキュロウイルス−gＩ−感染細胞(４８時間):５、
エンドグリコシダーゼＨ−処理、バキュロウイルス−g
Ｉ−感染細胞感染後７２時間。
エスタンブロット分析である。昆虫細胞はバキュロウイ
ルス−gＩ組換え体(vＡc−gＩＩ)で、１０の多重性の感
染で感染し、幾つかの単層はツニカマイシンで処理(感
染後０ないし４８時間)するか、又は細胞抽出物を製造
業者(ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ)に
より推奨されるように、エンドグリコシダーゼＨで処理
した。大略述べると、１０5細胞をゲル試料緩衝液、酢
酸ナトリウム緩衝液(pＨ５．０)に溶解した。次いで、
エンドグリコシダーゼＨを加えて試料を一夜インキュベ
ートした。レーン:Ｍ、分子寸法標識:１、野性型−バキ
ュロウイルス−感染昆虫細胞:２、バキュロウイルス−g
Ｉ−感染細胞感染後４８時間:３、バキュロウイルス−g
Ｉ−感染細胞感染後７２時間:４、ツニカマイシン−処
理、バキュロウイルス−gＩ−感染細胞(４８時間):５、
エンドグリコシダーゼＨ−処理、バキュロウイルス−g
Ｉ−感染細胞感染後７２時間。
【００２６】図３は組換えバキュロウイルス−感染細胞
の免疫蛍光を示す。アセトン固定又は未固定感染Ｓf９
細胞を抗gＩモノクローナル抗体と、次いでフルオレセ
イン抱合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体とインキュ
ベートし、既に記載され且つこの分野で知られているよ
うに蛍光顕微鏡により試験した。(Ａ)組換えバキュロウ
イルス−gＩ−感染細胞、全(細胞内)蛍光:(Ｂ)バキュロ
ウイルス−gＩ−感染細胞、表面蛍光:(Ｃ)野性型−バキ
ュロウイルス−感染細胞、全蛍光。
の免疫蛍光を示す。アセトン固定又は未固定感染Ｓf９
細胞を抗gＩモノクローナル抗体と、次いでフルオレセ
イン抱合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体とインキュ
ベートし、既に記載され且つこの分野で知られているよ
うに蛍光顕微鏡により試験した。(Ａ)組換えバキュロウ
イルス−gＩ−感染細胞、全(細胞内)蛍光:(Ｂ)バキュロ
ウイルス−gＩ−感染細胞、表面蛍光:(Ｃ)野性型−バキ
ュロウイルス−感染細胞、全蛍光。
【００２７】詳細な説明 本発明は組換えＤＮＡ技術を利用してＨＳＶ−１gＩを
コードするＤＮＡ配列又はその蛋白をＤＮＡ置換ベクタ
ーに挿入し、ベクターは外来宿主においてgＩ遺伝子の
発現を増殖し指図することが可能となる。得られる組換
えＤＮＡ分子を昆虫細胞に導入して、宿主細胞によりg
Ｉ又はその部分又はその分子変異体を大量に生成しう
る。生成したgＩは、次いで、ＨＳＶ型１及び／又は型
２に対する免疫療法に用いるために分離、精製する。
コードするＤＮＡ配列又はその蛋白をＤＮＡ置換ベクタ
ーに挿入し、ベクターは外来宿主においてgＩ遺伝子の
発現を増殖し指図することが可能となる。得られる組換
えＤＮＡ分子を昆虫細胞に導入して、宿主細胞によりg
Ｉ又はその部分又はその分子変異体を大量に生成しう
る。生成したgＩは、次いで、ＨＳＶ型１及び／又は型
２に対する免疫療法に用いるために分離、精製する。
【００２８】以下に示す実施例はバキュロウイルス、ポ
リヘドロンプロモーター系及び宿主細胞としての昆虫細
胞の利用を記載する。しかしながら、別の宿主細胞培養
において望ましいgＩ及びgＩ生成物の発現のための発現
ベクターを構築するため類似の技術を用いることはこの
分野の当業者にとって容易である。従って、以下の詳細
な記載は限定する意味にとるべきでなく、本発明の範囲
は添付の特許請求の範囲により最もよく定義される。
リヘドロンプロモーター系及び宿主細胞としての昆虫細
胞の利用を記載する。しかしながら、別の宿主細胞培養
において望ましいgＩ及びgＩ生成物の発現のための発現
ベクターを構築するため類似の技術を用いることはこの
分野の当業者にとって容易である。従って、以下の詳細
な記載は限定する意味にとるべきでなく、本発明の範囲
は添付の特許請求の範囲により最もよく定義される。
【００２９】Ａ．ウイルス及び細胞 オートグラファ・カリフォルニカ(Ａutographa califo
rnica)核多角体病ウイルス(ＡcＮＰＶ)のＥ2株及びスポ
ドプテラ・フルギペルダ(Ｓpodoptera frugiperda)ク
ローン(Ｓf９)細胞をこの分野で知られた方法により生
育した。プラク精製ＨＳＶ−(ＭcＫrae及びＫＯＳ株)及
びＶero細胞を標準的技術を用いて生育した。
rnica)核多角体病ウイルス(ＡcＮＰＶ)のＥ2株及びスポ
ドプテラ・フルギペルダ(Ｓpodoptera frugiperda)ク
ローン(Ｓf９)細胞をこの分野で知られた方法により生
育した。プラク精製ＨＳＶ−(ＭcＫrae及びＫＯＳ株)及
びＶero細胞を標準的技術を用いて生育した。
【００３０】ＡcＮＰＶ組換え転移ベクターの構築 プラスミドpＳＳ１７をＦspＩ／ＳphＩで２回消化し、g
Ｉの完全コード部分を含む１．３Ｋb断片を分離した。
得られた断片をpＧem−３のＳmaＩ部位に連結した。プ
ラスミドpＧem−gＩをＨindＩＩＩで線状にし、Ｂal３
１エキソヌクレアーゼで大まかに消化し、ベクターpＡc
ＹＭ１のユニークＢamＨＩ部位に連結した。部分配列分
析は、クローン化gＩが５'末端に５ヌクレオチドの短い
非コード部分及び３'末端にgＩ終止コドン後４８ＨＳＶ
−１非コードヌクレオチドを有することを示した。
Ｉの完全コード部分を含む１．３Ｋb断片を分離した。
得られた断片をpＧem−３のＳmaＩ部位に連結した。プ
ラスミドpＧem−gＩをＨindＩＩＩで線状にし、Ｂal３
１エキソヌクレアーゼで大まかに消化し、ベクターpＡc
ＹＭ１のユニークＢamＨＩ部位に連結した。部分配列分
析は、クローン化gＩが５'末端に５ヌクレオチドの短い
非コード部分及び３'末端にgＩ終止コドン後４８ＨＳＶ
−１非コードヌクレオチドを有することを示した。
【００３１】Ｃ．組換えウイルスのトランスフェクショ
ン及び選択 Ｓf９細胞はこの分野で知られた方法で精製感染がバキ
ュロウイルス(ＡcＮＰＶ)ＤＮＡ及びpＡc−gＩ１プラス
ミドＤＮＡを同時移入した。３反復のポリヘドリン陰性
プラク精製ののち、２つの組換えウイルスを得た。両組
換え体は、抗−gＩモノクローナル抗体を用いるウエス
タンブロットにより測定されるように同様の性質を有す
るgＩを発現した。組換えバキュロウイルスの１つをさ
らに研究するために選び、vＡc−・gＩ１と名付けた。
ン及び選択 Ｓf９細胞はこの分野で知られた方法で精製感染がバキ
ュロウイルス(ＡcＮＰＶ)ＤＮＡ及びpＡc−gＩ１プラス
ミドＤＮＡを同時移入した。３反復のポリヘドリン陰性
プラク精製ののち、２つの組換えウイルスを得た。両組
換え体は、抗−gＩモノクローナル抗体を用いるウエス
タンブロットにより測定されるように同様の性質を有す
るgＩを発現した。組換えバキュロウイルスの１つをさ
らに研究するために選び、vＡc−・gＩ１と名付けた。
【００３２】Ｄ．ウイルスＤＮＡの調製 Ｓf９細胞を１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩにおいて、組換
えウイルスで感染し、２８℃で７２時間インキュベート
した。感染細胞を凍結融解し、１０００xgで１０分遠心
して細胞残骸を除いた。続く、ウイルス分離、ＤＮＡ抽
出及びブロッティングはこの分野で既知であり、従っ
て、ここでは繰り返さない。
えウイルスで感染し、２８℃で７２時間インキュベート
した。感染細胞を凍結融解し、１０００xgで１０分遠心
して細胞残骸を除いた。続く、ウイルス分離、ＤＮＡ抽
出及びブロッティングはこの分野で既知であり、従っ
て、ここでは繰り返さない。
【００３３】Ｅ．ウエスタンブロット ウエスタンイムノブロットを変性条件下に実施した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ用試料を２％ＳＤＳ及び１０％２−メル
カプトエタノールを含む電気泳動試料緩衝液中に崩壊
し、１００℃で３分間加熱した。蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分離し、電気泳動によりニトロセルロース紙に
移した。ニトロセルロースブロットをＢＬＯＴＴＯ(Ｐ
ＢＳ中５％脱脂乾燥牛乳)中遮断し、Ｆd６９抗gＩモノ
クローナル抗体(エス．チャタージー博士からの贈物)と
４℃で１時間反応させた。結合抗体では、ブロットを
125Ｉ−プロテインＡと２５℃で１時間反応させ、次い
で、オートラジオグラフィーにより測定した。
ＤＳ−ＰＡＧＥ用試料を２％ＳＤＳ及び１０％２−メル
カプトエタノールを含む電気泳動試料緩衝液中に崩壊
し、１００℃で３分間加熱した。蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分離し、電気泳動によりニトロセルロース紙に
移した。ニトロセルロースブロットをＢＬＯＴＴＯ(Ｐ
ＢＳ中５％脱脂乾燥牛乳)中遮断し、Ｆd６９抗gＩモノ
クローナル抗体(エス．チャタージー博士からの贈物)と
４℃で１時間反応させた。結合抗体では、ブロットを
125Ｉ−プロテインＡと２５℃で１時間反応させ、次い
で、オートラジオグラフィーにより測定した。
【００３４】Ｆ．エンドグリコシダーゼＨ(Ｅndo−Ｈ)
処理 Ｅndo−Ｈ処理を、製造者(ベーリンガー・マンハイム・
バイオケミカルズ)により記載されるようにＳf９感染細
胞(１０ＰＦＵ／細胞:感染後７２時間)からの溶解質上
で行なった。簡単にいうと、１０５細胞をゲル試料緩衝
液、酢酸Ｎa(pＨ５．０)緩衝液に溶解した。次いで、Ｅ
ndo−Ｈを加えて試料を一晩インキュベートした。
処理 Ｅndo−Ｈ処理を、製造者(ベーリンガー・マンハイム・
バイオケミカルズ)により記載されるようにＳf９感染細
胞(１０ＰＦＵ／細胞:感染後７２時間)からの溶解質上
で行なった。簡単にいうと、１０５細胞をゲル試料緩衝
液、酢酸Ｎa(pＨ５．０)緩衝液に溶解した。次いで、Ｅ
ndo−Ｈを加えて試料を一晩インキュベートした。
【００３５】Ｇ．ツニカマイシン処理 感染細胞(１０ＰＦＵ／細胞)をＴＮＮ−ＦＨ培地中４μ
g／mlツニカマイシンに感染後、０−４８時間インキュ
ベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを収集した。
g／mlツニカマイシンに感染後、０−４８時間インキュ
ベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを収集した。
【００３６】Ｈ．免疫蛍光 Ｓf９細胞を野性型ＡcＮＰＶ又はgＩを発現する組換え
バキュロウイルスで感染し(１０ＰＦＵ／細胞の多重性
の感染)、７２時間インキュベートした。全蛍光を見る
ため、細胞をＰＢＳで洗浄し、アセトンで固定し、gＩ
モノクローナル抗体と３７℃で１時間インキュベートし
た。細胞表面免疫蛍光を試験するため、未固定、未透過
細胞を抗gＩモノクローナル抗体と４℃で１時間インキ
ュベートし、次いで、アセトンで固定した。次いで、全
及び表面蛍光用スライドをフルオレセイン結合ヤギ抗マ
ウスＩgＧで３７℃、１時間染色し、蛍光を試験した。
バキュロウイルスで感染し(１０ＰＦＵ／細胞の多重性
の感染)、７２時間インキュベートした。全蛍光を見る
ため、細胞をＰＢＳで洗浄し、アセトンで固定し、gＩ
モノクローナル抗体と３７℃で１時間インキュベートし
た。細胞表面免疫蛍光を試験するため、未固定、未透過
細胞を抗gＩモノクローナル抗体と４℃で１時間インキ
ュベートし、次いで、アセトンで固定した。次いで、全
及び表面蛍光用スライドをフルオレセイン結合ヤギ抗マ
ウスＩgＧで３７℃、１時間染色し、蛍光を試験した。
【００３７】Ｉ．予防接種 １０ＰＦＵ／細胞の野性型(ＡcＮＰＶ)又はvＡc−gＩＩ
で７２時間感染したＳf９細胞を集め、ＰＢＳ中洗浄
し、懸濁した。マウス(Ｂalb／Ｃ．６−８週令)をgＩを
発現する凍結融解した全昆虫細胞で３回皮下及び腹腔内
に(付随的に)ワクチン接種した。皮下注射は０日にフロ
インド完全アジュバントと混合した、２１及び２４日に
フロインド不完全アジュバントと混合した、１×１０6
細胞で行なった。腹腔内注射は同じ日にＰＢＳ中１×１
０6細胞を用いて行った。同様に模擬ワクチン接種マウ
スを野性型バキュロウイルスを感染させたＳf９細胞を
接種した。陽性コントロール群を２×１０5ＰＦＵのＫ
ＯＳで３回腹腔内に免疫した。最終予防接種３週間後Ｓ
eraを集め、各群ごとにプールした。
で７２時間感染したＳf９細胞を集め、ＰＢＳ中洗浄
し、懸濁した。マウス(Ｂalb／Ｃ．６−８週令)をgＩを
発現する凍結融解した全昆虫細胞で３回皮下及び腹腔内
に(付随的に)ワクチン接種した。皮下注射は０日にフロ
インド完全アジュバントと混合した、２１及び２４日に
フロインド不完全アジュバントと混合した、１×１０6
細胞で行なった。腹腔内注射は同じ日にＰＢＳ中１×１
０6細胞を用いて行った。同様に模擬ワクチン接種マウ
スを野性型バキュロウイルスを感染させたＳf９細胞を
接種した。陽性コントロール群を２×１０5ＰＦＵのＫ
ＯＳで３回腹腔内に免疫した。最終予防接種３週間後Ｓ
eraを集め、各群ごとにプールした。
【００３８】Ｊ．血清中和検定 インビトロ血清中和検定のため、熱不活性プール血清を
ＭＥＮに希釈し、５００ＰＦＵのＨＳＶ−１株ＫＯＳと
混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。２．５
％の熱不活性又は新鮮なモルモット成分を加えて混合物
をさらに３０分間インキュベートした。重複試料を２４
ウエルミクロタイタープレート内のＣＶ−１細胞に加え
て残留ＨＳＶ−１感染性を検定した。プレートを３７
℃、７２時間インキュベートし、１％クリスタルバイオ
レットで染色し、プラクを数えた。
ＭＥＮに希釈し、５００ＰＦＵのＨＳＶ−１株ＫＯＳと
混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。２．５
％の熱不活性又は新鮮なモルモット成分を加えて混合物
をさらに３０分間インキュベートした。重複試料を２４
ウエルミクロタイタープレート内のＣＶ−１細胞に加え
て残留ＨＳＶ−１感染性を検定した。プレートを３７
℃、７２時間インキュベートし、１％クリスタルバイオ
レットで染色し、プラクを数えた。
【００３９】Ｋ．ＨＳＶ−１攻撃 最終予防接種３週間後、マウスは２×１０6ＰＦＵのＨ
ＳＶ−１(Ｍckrae株)で腹腔内に攻撃した。攻撃したマ
ウスは２週間モニターした。
ＳＶ−１(Ｍckrae株)で腹腔内に攻撃した。攻撃したマ
ウスは２週間モニターした。
【００４０】結果 Ａ．gＩを発現する組換えウイルスの構築 完全gＩオープンリーディングフレームを含むバキュロ
ウイルス転移ベクターの構築の方法は図１に示される。
gＩ遺伝子の完全ＤＮＡ複写をＦspＩ／ＳphＩによる制
限酵素消化により分離した。ＨＳＶ−ＩgＩ(黒)の完全
コーディング部分を含む得られる断片をpＧem−３のＳm
aＩ部位に鈍端化した。プラスミドpＧem−gＩをＨindＩ
ＩＩで線状化し、Ｂal３１で大体消化し、ＢamＨＩリン
カーを加えた。得られるＤＮＡを次いでpＡcＹＭ１ベク
ターのＢamＨＩ部位に挿入した(図１及び上記詳細な記
載参照)。制限酵素分析及び部分配列決定は、この構成
物はgＩ遺伝子の全配列を含むことを立証した。それは
第１ＡＴＧの前の５ヌクレオチドの非コード化部分を有
する。これは１１７０ヌクレオチドの完全コード化部分
に続く。gＩ遺伝子をバキュロウイルスＡcＮＰＶ ＤＮ
Ａに転移するため、Ｓf９細胞はpＡc−gＩＩ ＤＮＡ及
び感染ＡcＮＰＶ ＤＮＡを同時移入した。２つの推定
組換えウイルスを３循環のポリヘドロン陰性プラク精製
により選択した。両組換えバキュロウイルスはウエスタ
ンブロッティングにより測定されたように同様の性質を
有するgＩを発現した。一つを続く研究のために独断的
に選びvＡc−gＩＩと名付けた。
ウイルス転移ベクターの構築の方法は図１に示される。
gＩ遺伝子の完全ＤＮＡ複写をＦspＩ／ＳphＩによる制
限酵素消化により分離した。ＨＳＶ−ＩgＩ(黒)の完全
コーディング部分を含む得られる断片をpＧem−３のＳm
aＩ部位に鈍端化した。プラスミドpＧem−gＩをＨindＩ
ＩＩで線状化し、Ｂal３１で大体消化し、ＢamＨＩリン
カーを加えた。得られるＤＮＡを次いでpＡcＹＭ１ベク
ターのＢamＨＩ部位に挿入した(図１及び上記詳細な記
載参照)。制限酵素分析及び部分配列決定は、この構成
物はgＩ遺伝子の全配列を含むことを立証した。それは
第１ＡＴＧの前の５ヌクレオチドの非コード化部分を有
する。これは１１７０ヌクレオチドの完全コード化部分
に続く。gＩ遺伝子をバキュロウイルスＡcＮＰＶ ＤＮ
Ａに転移するため、Ｓf９細胞はpＡc−gＩＩ ＤＮＡ及
び感染ＡcＮＰＶ ＤＮＡを同時移入した。２つの推定
組換えウイルスを３循環のポリヘドロン陰性プラク精製
により選択した。両組換えバキュロウイルスはウエスタ
ンブロッティングにより測定されたように同様の性質を
有するgＩを発現した。一つを続く研究のために独断的
に選びvＡc−gＩＩと名付けた。
【００４１】Ｂ．Ｓf９細胞におけるgＩの発現 gＩを発現したバキュロウイルスの大きさを分析するた
め、Ｓf９細胞の融合単層をバキュロウイルス組換えvＡ
c−gＩＩにより多重性の１０ＰＦＵ／細胞で感染した。
全蛋白抽出物を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で行ない、
gＩに対するＦd６９モノクローナル抗体を用いるウエス
タンブロッティングにより分析した。５２及び５６kＤa
の２つのバンドはgＩ特異的抗体を強く反応した(図３、
レーン２及び３)。加えて、これらのバンドは、感染４
８時間後(レーン２)よりも感染７２時間後(レーン３)で
より顕著であった。これらのバンドは野性型バキュロウ
イルス感染細胞(レーン１)又は膜凝感染Ｓf９細胞に見
られなかった。
め、Ｓf９細胞の融合単層をバキュロウイルス組換えvＡ
c−gＩＩにより多重性の１０ＰＦＵ／細胞で感染した。
全蛋白抽出物を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で行ない、
gＩに対するＦd６９モノクローナル抗体を用いるウエス
タンブロッティングにより分析した。５２及び５６kＤa
の２つのバンドはgＩ特異的抗体を強く反応した(図３、
レーン２及び３)。加えて、これらのバンドは、感染４
８時間後(レーン２)よりも感染７２時間後(レーン３)で
より顕著であった。これらのバンドは野性型バキュロウ
イルス感染細胞(レーン１)又は膜凝感染Ｓf９細胞に見
られなかった。
【００４２】Ｃ．gＩのグリコシル化 発現されたgＩがグリコシル化されたことを証明するた
め、ツニカマイシン処理を行ない、感染Ｓf９細胞にお
けるＮ−グリコシル化を防御した。感染細胞を４μgツ
ニカマイシンの培地で感染後０−４８時間処理し、全細
胞抽出物を抗gＩモノクローナル抗体を用いるウエスタ
ンブロットにより分析した。ツニカマイシン処理(図
３、レーン４)はコントロール(レーン２及び３)に比べg
Ｉの可動性を増加し、５２及び５６kＤaポリペプチドが
共にＮ−連鎖糖を含むことを示した。この結果は自生(n
ative)gＩのように未処理の組換えgＩがグリコシル化さ
れたことを示す。
め、ツニカマイシン処理を行ない、感染Ｓf９細胞にお
けるＮ−グリコシル化を防御した。感染細胞を４μgツ
ニカマイシンの培地で感染後０−４８時間処理し、全細
胞抽出物を抗gＩモノクローナル抗体を用いるウエスタ
ンブロットにより分析した。ツニカマイシン処理(図
３、レーン４)はコントロール(レーン２及び３)に比べg
Ｉの可動性を増加し、５２及び５６kＤaポリペプチドが
共にＮ−連鎖糖を含むことを示した。この結果は自生(n
ative)gＩのように未処理の組換えgＩがグリコシル化さ
れたことを示す。
【００４３】Ｅndo−Ｈ処理に続いて、５２及び５６kＤ
aバンドは５０kＤaの明白な分子量を有するポリペプチ
ドで置換された(図３、レーン５)。これらの結果は、組
換えgＩがＮ−グリコシル化され、高マンノース糖を含
むことを示す。
aバンドは５０kＤaの明白な分子量を有するポリペプチ
ドで置換された(図３、レーン５)。これらの結果は、組
換えgＩがＮ−グリコシル化され、高マンノース糖を含
むことを示す。
【００４４】Ｄ．昆虫細胞における組換えgＩの局在 発現されたgＩが細胞表面に輸送されたかどうかを測定
するため、vＡc−gＩＩ感染Ｓf９細胞をgＩに対するモ
ノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光抗体染色により
試験した(図３)。全細胞免疫蛍光が組換え感染細胞中に
容易に観察された(パネルＡ)。細胞表面上のgＩを特に
見るために、間接免疫蛍光抗体染色を固定前に細胞上で
行なった(パネルＢ)。vＡc−gＩＩ感染細胞上の表面蛍
光は、強く且つ透過した固定細胞に観察されたものと類
似した。背景レベル免疫蛍光のみが野性型バキュロウイ
ルス ＡcＮＰＶで感染した細胞又は模擬感染細胞に見
られた。これは、発現したgＩが細胞表面に輸送したこ
とを示す。
するため、vＡc−gＩＩ感染Ｓf９細胞をgＩに対するモ
ノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光抗体染色により
試験した(図３)。全細胞免疫蛍光が組換え感染細胞中に
容易に観察された(パネルＡ)。細胞表面上のgＩを特に
見るために、間接免疫蛍光抗体染色を固定前に細胞上で
行なった(パネルＢ)。vＡc−gＩＩ感染細胞上の表面蛍
光は、強く且つ透過した固定細胞に観察されたものと類
似した。背景レベル免疫蛍光のみが野性型バキュロウイ
ルス ＡcＮＰＶで感染した細胞又は模擬感染細胞に見
られた。これは、発現したgＩが細胞表面に輸送したこ
とを示す。
【００４５】Ｅ．中和抗体応答 Ｂalb／Ｃマウスを全昆虫細胞発現gＩで皮下及び腹腔内
に３回免疫した。最終予防接種３週間後、マウスは採血
した。組換えgＩを接種した２０匹のマウスからのプー
ルした血清を熱不活性化し、新鮮な又は熱不活性化成分
の存在下、ＨＳＶ−１と反応させた。組換えgＩワクチ
ン接種マウスからの抗体はＨＳＶ−１感染性を中和し
た。しかしながら、新鮮な成分の存在での中和のレベル
は熱不活性化成分の存在よりも高かった。中和抗体は模
擬(ＡcＮＰＶ)ワクチン接種動物では生成しなかった。
に３回免疫した。最終予防接種３週間後、マウスは採血
した。組換えgＩを接種した２０匹のマウスからのプー
ルした血清を熱不活性化し、新鮮な又は熱不活性化成分
の存在下、ＨＳＶ−１と反応させた。組換えgＩワクチ
ン接種マウスからの抗体はＨＳＶ−１感染性を中和し
た。しかしながら、新鮮な成分の存在での中和のレベル
は熱不活性化成分の存在よりも高かった。中和抗体は模
擬(ＡcＮＰＶ)ワクチン接種動物では生成しなかった。
【００４６】Ｆ．ウイルス攻撃 ワクチン接種マウスを、最終接種３週間後、ＨＳＶ−１
株ＭcＫraeの腹腔内注射(２×１０６ＰＦＵ)により攻撃
した。以下の表Ｉに示すように、模擬ワクチン接種した
マウスの６０％は１４日以内に死亡したが、一方、発現
gＩワクチン接種マウスの９０％は延命した。陽性コン
トロール群ではＫＯＳで免疫したマウスの１００％が防
御した(表１)。我々の結果は、バキュロウイルス発現g
Ｉによる純正動物の接種はＨＳＶ−１による致死腹腔内
攻撃からマウスを防御したことを示唆する。
株ＭcＫraeの腹腔内注射(２×１０６ＰＦＵ)により攻撃
した。以下の表Ｉに示すように、模擬ワクチン接種した
マウスの６０％は１４日以内に死亡したが、一方、発現
gＩワクチン接種マウスの９０％は延命した。陽性コン
トロール群ではＫＯＳで免疫したマウスの１００％が防
御した(表１)。我々の結果は、バキュロウイルス発現g
Ｉによる純正動物の接種はＨＳＶ−１による致死腹腔内
攻撃からマウスを防御したことを示唆する。
【００４７】
【表１】 ＨＳＶ−１gＩを発現する組換えバキュロウイルスによるマウスの免疫 中和力価 b 免疫 生存数/合計数a 生存数％ ＋補体 −補体 バキュロウイルス−ＧＩ １８／２０ ９０ １６７ ９１ ＫＯＳ １１／１１ １００ ＞３２０ ＞３２０ 模擬 ７／１８ ３９ ＜ １０ ＜ １０ a．バキュロウイルスgＩ組換え−及びＫＯＳ−ワクチン
接種マウスの生存率(防御)は模擬予防接種生存率と有意
に異なる(フィッシャーの正確な試験:Ｐ＝０.０１)。 b．中和力価はプラク数で５０％減少を生ずる希釈の逆
相乗平均として表わす。
接種マウスの生存率(防御)は模擬予防接種生存率と有意
に異なる(フィッシャーの正確な試験:Ｐ＝０.０１)。 b．中和力価はプラク数で５０％減少を生ずる希釈の逆
相乗平均として表わす。
【００４８】要するに、本発明は、バキュロウイルス発
現系におけるgＩの高レベル発現を含む。この系におけ
るgＩは、グリコシル化された細胞表面に輸送された。
純真なマウスに組換えgＩを予防接種することによりＨ
ＳＶ−１に対する補体依存性及び補体非依存性中和抗体
を生成した。加えてgＩをワクチン接種したマウスは致
死ＨＳＶ−１攻撃を防御し、ＨＳＶ−１に対する全ての
サブユニットワクチンにおいてgＩを有用且つ重要な成
分とした。
現系におけるgＩの高レベル発現を含む。この系におけ
るgＩは、グリコシル化された細胞表面に輸送された。
純真なマウスに組換えgＩを予防接種することによりＨ
ＳＶ−１に対する補体依存性及び補体非依存性中和抗体
を生成した。加えてgＩをワクチン接種したマウスは致
死ＨＳＶ−１攻撃を防御し、ＨＳＶ−１に対する全ての
サブユニットワクチンにおいてgＩを有用且つ重要な成
分とした。
【００４９】Ｇ．gＩの精製 本発明のバキュロウイルス発現gＩは、細胞培養物の上
清媒体からの分泌され、先を切り取ったgＩの免疫親和
性クロマトグラフィー及び収集を含むがこれらに限らな
い標準的技術によってヒトの使用のために精製しうる。
これらの方法により精製されたgＩは他の生成物又は蛋
白による汚染がない。
清媒体からの分泌され、先を切り取ったgＩの免疫親和
性クロマトグラフィー及び収集を含むがこれらに限らな
い標準的技術によってヒトの使用のために精製しうる。
これらの方法により精製されたgＩは他の生成物又は蛋
白による汚染がない。
【００５０】１．免疫親和性クロマトグラフィ gＩ蛋白は回転瓶中、レンズ豆レクチンクロマトグラフ
ィ、免疫親和性クロマトグラフィ及び限外濾過による濃
縮の連続的段階により精製できる。第１段階に関し、２
ｌの調整培地は１mＭ ＰＭＳＦ及び０．５％アプロチ
ニンを補充し、次いで、レンズ豆レクチン−セファロー
ス−４Ｂ(シグマ・ケミカル・カンパニー・セントルイ
ス・Ｍ０)の３０mlカラム上に５０ml／hの流速でのせる
ことができる。カラムは１００mlのＰＢＳ及び０．５Ｍ
Ｎalを含有する１００mlのＰＢＳで続けて洗浄でき
る。結合フラクションは０．５Ｍ ＮaＣl、０．５Ｍα
−メチルマンノシド、０．１％トリトンＸ−１００及び
０．５％アプロチニンを含有するＰＢＳで溶出し、フラ
クションは固相酵素免疫測定法(エリザ)によりgＩを検
定できる。
ィ、免疫親和性クロマトグラフィ及び限外濾過による濃
縮の連続的段階により精製できる。第１段階に関し、２
ｌの調整培地は１mＭ ＰＭＳＦ及び０．５％アプロチ
ニンを補充し、次いで、レンズ豆レクチン−セファロー
ス−４Ｂ(シグマ・ケミカル・カンパニー・セントルイ
ス・Ｍ０)の３０mlカラム上に５０ml／hの流速でのせる
ことができる。カラムは１００mlのＰＢＳ及び０．５Ｍ
Ｎalを含有する１００mlのＰＢＳで続けて洗浄でき
る。結合フラクションは０．５Ｍ ＮaＣl、０．５Ｍα
−メチルマンノシド、０．１％トリトンＸ−１００及び
０．５％アプロチニンを含有するＰＢＳで溶出し、フラ
クションは固相酵素免疫測定法(エリザ)によりgＩを検
定できる。
【００５１】ピークカラムフラクションはプールし、７
０mgのウサギ抗gＩポリクローナル抗体を臭化シアン活
性化セファロース４Ｂに連結することにより調製した１
０ml免疫親和性カラムに適用できる。gＩ特異的ウサギ
抗血清をgＩ蛋白から作り、これはＨＳＶ−１感染Ｖero
細胞溶解質から調製ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製した。カップリングの前に、ＩgＧ強
化フラクションを３３％飽和硫酸アンモニウムによる沈
澱によりgＩ特異的ウサギ抗血清から調製した。レクチ
ンカラム溶出を免疫親和性カラムに適用したのち、カラ
ムは引き続いて２０mlの１０mＭトリス塩酸塩、pＨ７．
５並びにＳＤＳ及びＢＳＡの存在しない１０mlのＬＢ
で、次いで３０mlの１０mＭトリス塩酸塩、pＨ７．５−
０．５ＭＮaＣlで洗浄できる。結合フラクションは３Ｍ
チオシアン酸アンモニウム、pＨ７．５で溶出し、gＩ蛋
白ピークをエリザ及びウエスタン分析により検出でき
る。ピークフラクションは濃縮し、ＰＭ１０膜(アミコ
ン・コーポレーション、デンバー、Ｍass．)を用いる限
外濾過により貯蔵緩衝液(１００mＭ ＮaＣl、１０mＭ
トリス塩酸塩、pＨ７．５、１mＭ ＥＤＴＡ、７．５％
グリセロール)中で平衡化できる。膜表面に吸収された
蛋白を除くため、膜は０．１％トリトンＸ−１００を加
えた貯蔵緩衝液で洗浄した。次いで、この洗浄液を初め
の濃縮フラクションと混ぜることができる。
０mgのウサギ抗gＩポリクローナル抗体を臭化シアン活
性化セファロース４Ｂに連結することにより調製した１
０ml免疫親和性カラムに適用できる。gＩ特異的ウサギ
抗血清をgＩ蛋白から作り、これはＨＳＶ−１感染Ｖero
細胞溶解質から調製ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製した。カップリングの前に、ＩgＧ強
化フラクションを３３％飽和硫酸アンモニウムによる沈
澱によりgＩ特異的ウサギ抗血清から調製した。レクチ
ンカラム溶出を免疫親和性カラムに適用したのち、カラ
ムは引き続いて２０mlの１０mＭトリス塩酸塩、pＨ７．
５並びにＳＤＳ及びＢＳＡの存在しない１０mlのＬＢ
で、次いで３０mlの１０mＭトリス塩酸塩、pＨ７．５−
０．５ＭＮaＣlで洗浄できる。結合フラクションは３Ｍ
チオシアン酸アンモニウム、pＨ７．５で溶出し、gＩ蛋
白ピークをエリザ及びウエスタン分析により検出でき
る。ピークフラクションは濃縮し、ＰＭ１０膜(アミコ
ン・コーポレーション、デンバー、Ｍass．)を用いる限
外濾過により貯蔵緩衝液(１００mＭ ＮaＣl、１０mＭ
トリス塩酸塩、pＨ７．５、１mＭ ＥＤＴＡ、７．５％
グリセロール)中で平衡化できる。膜表面に吸収された
蛋白を除くため、膜は０．１％トリトンＸ−１００を加
えた貯蔵緩衝液で洗浄した。次いで、この洗浄液を初め
の濃縮フラクションと混ぜることができる。
【００５２】２．分泌された先を切り取ったgＩの収集 分泌形のgＩの収集方法はこの分野で知られており、従
って、本明細書では繰り返さない。しかしながら、本質
的に、膜内外錨配列をプログラムしている断片はgＩ遺
伝子から切断できる。次いで、削除されたgＩ遺伝子を
再結合により再構築し、膜外及びＣ末端細胞質内ドメイ
ンをコードしている枠配列に入れることができる。生成
物は、抗gＩモノクローナル抗体を伴う細胞培養の上清
媒体の免疫沈澱によるトランスフェクション後測定でき
る。
って、本明細書では繰り返さない。しかしながら、本質
的に、膜内外錨配列をプログラムしている断片はgＩ遺
伝子から切断できる。次いで、削除されたgＩ遺伝子を
再結合により再構築し、膜外及びＣ末端細胞質内ドメイ
ンをコードしている枠配列に入れることができる。生成
物は、抗gＩモノクローナル抗体を伴う細胞培養の上清
媒体の免疫沈澱によるトランスフェクション後測定でき
る。
【００５３】Ｈ．医薬組成物 本発明のgＩは、製薬上許容しうる担体賦形剤と混合し
て製薬上有用な組成物を調製する既知方法により処方で
きる。適当な賦形剤やそれらの処方は、例えばイー．ダ
ブリュ．マーチンによるレミントンズ・ファーマシュー
ティカル・サイエンスズに記載される。これらの組成物
は、有効量のgＩを、宿主に有効に投与するのに適した
製薬上許容しうる組成物を調製するために適当量の賦形
剤と共に含む。
て製薬上有用な組成物を調製する既知方法により処方で
きる。適当な賦形剤やそれらの処方は、例えばイー．ダ
ブリュ．マーチンによるレミントンズ・ファーマシュー
ティカル・サイエンスズに記載される。これらの組成物
は、有効量のgＩを、宿主に有効に投与するのに適した
製薬上許容しうる組成物を調製するために適当量の賦形
剤と共に含む。
【００５４】全く説明のためであって限定を目的とする
ものでなく、本発明による調製された非経口投与のため
の医薬製品の例を記載する。
ものでなく、本発明による調製された非経口投与のため
の医薬製品の例を記載する。
【００５５】ワクチンは、単一用量バイアルの凍結バキ
ュロウイルス発現ＨＳＶ−１gＩとして単独、又は１又
はそれ以上のＨＳＶ−１グリコプロテイン、及びアラム
を伴う希釈剤のバイアルと組合せて与えうる。別法とし
て、ワクチンは多投与量バイアルで又はアラムを伴う希
釈剤のバイアルで与えうる。
ュロウイルス発現ＨＳＶ−１gＩとして単独、又は１又
はそれ以上のＨＳＶ−１グリコプロテイン、及びアラム
を伴う希釈剤のバイアルと組合せて与えうる。別法とし
て、ワクチンは多投与量バイアルで又はアラムを伴う希
釈剤のバイアルで与えうる。
【００５６】記載された本発明から、これらの方法が修
飾できることは明らかであり、修飾は、本発明の精神及
び目的から逸脱せず、この分野の当業者にとって明らか
である。従って本発明は、それらに限るものとして解釈
すべきでなく、添付の請求の範囲の法的範囲に限られる
と解釈すべきことが理解される。
飾できることは明らかであり、修飾は、本発明の精神及
び目的から逸脱せず、この分野の当業者にとって明らか
である。従って本発明は、それらに限るものとして解釈
すべきでなく、添付の請求の範囲の法的範囲に限られる
と解釈すべきことが理解される。
【図１】 ＨＳＶ−１gＩ遺伝子を含むpＡc−gＩＩ組換
えバキュロウイルス転換ベクターの構築を示す。
えバキュロウイルス転換ベクターの構築を示す。
【図２】 感染昆虫細胞における発現gＩのウエスタン
ブロットを示す薄膜の写真である。
ブロットを示す薄膜の写真である。
【図３】 図３a: 組換えバキュロウイルス−gＩ−感染
細胞、全(細胞内)蛍光を示す薄膜の写真である。
細胞、全(細胞内)蛍光を示す薄膜の写真である。
【図４】 図３b: バキュロウイルス−gＩ−感染細胞、
表面蛍光を示す薄膜の写真である。
表面蛍光を示す薄膜の写真である。
【図５】 図３c: 野性型−バキュロウイルス−感染細
胞、全蛍光を示す薄膜の写真である。
胞、全蛍光を示す薄膜の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/38 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） 8931−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 スティーブン・ルイス・ウェクスラー アメリカ合衆国91361カリフォルニア州ウ エストレイク・ビレッジ、セブンオーク ス・コート4401番 (72)発明者 ホマヨン・ギアシ アメリカ合衆国90034カリフォルニア州ロ サンジェルス、クレスト・ドライブ1904番
Claims (15)
- 【請求項１】 遺伝構成が下記を含む組換えバキュロウ
イルス a) ＨＳＶ−１gＩをコードする遺伝子配列又は生物学
的に活性な誘導体及び b) 該gＩ遺伝子配列がポリヘドリンプロモーターの調
整要素に官能的に結合するポリヘドリン遺伝子プロモー
ター配列。 - 【請求項２】 培養培地における細菌感染によりＨＳＶ
−１gＩを発現しうる請求項１の組換えバキュロウイル
ス。 - 【請求項３】 請求項１又は２において特徴とする遺伝
構成を含み、それをバキュロウイルスゲノムに導入しう
る組換えバキュロウイルス置換ベクター。 - 【請求項４】 pＡc−gＩＩである組換えバキュロウイ
ルス置換ベクター。 - 【請求項５】 請求項３又は４の組換えバキュロウイル
ス置換ベクター及び受容体バキュロウイルスを宿主細胞
に導入すること、該遺伝構成を該組換えバキュロウイル
ス置換ベクターから該受容体バキュロウイルスに置換す
ること、及び請求項１又は２のいずれか１つの組換えバ
キュロウイルスを分離することを含む請求項１又は２の
いずれか１つの組換えバキュロウイルスの製造方法。 - 【請求項６】 請求項１又は２のいずれか１つの組換え
バキュロウイルスを含み、該ＨＳＶ−１gＩを発現しう
る組換え昆虫細胞。 - 【請求項７】 スポドプテラ・フルギペルダから誘導さ
れる請求項５の組換え昆虫細胞。 - 【請求項８】 請求項６又は７の組換え細胞を培養する
こと及び培養物から該ＨＳＶ−１gＩを回収することを
含む生物学的に活性なＨＳＶ−１gＩを得る方法。 - 【請求項９】 該ＨＳＶ−１gＩを他の生成物又は蛋白
により汚染されることなく得る請求項８の方法。 - 【請求項１０】 請求項８又は９のいずれか１つの方法
で得られ、他の生成物又は蛋白のない生物学的に活性な
ＨＳＶ−１gＩ。 - 【請求項１１】 請求項１０の生物学的に活性なＨＳＶ
−１gＩを含むＨＳＶ感染の処置又は予防のための医薬
調製品。 - 【請求項１２】 ヒト又は動物に投与するための請求項
１１の医薬調製品。 - 【請求項１３】 非経口的経路で投与できる請求項１２
の医薬調製品。 - 【請求項１４】 経口経路により投与できる請求項１２
の医薬調製品。 - 【請求項１５】 眼球経路により投与できる請求項１２
の医薬調製品。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US85299992A | 1992-03-18 | 1992-03-18 | |
| US852999 | 1992-03-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698764A true JPH0698764A (ja) | 1994-04-12 |
| JP2759036B2 JP2759036B2 (ja) | 1998-05-28 |
Family
ID=25314765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5851393A Expired - Fee Related JP2759036B2 (ja) | 1992-03-18 | 1993-03-18 | 単純ヘルペスウイルス感染に対するワクチン |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0568178A1 (ja) |
| JP (1) | JP2759036B2 (ja) |
| AU (1) | AU664597B2 (ja) |
| CA (1) | CA2090303A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0561525A1 (en) * | 1992-03-04 | 1993-09-22 | Cedars-Sinai Medical Center | Process for the expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein E and methods of use |
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| Found | Equine herpes virus-4 thymidine-kinase-vaccine; expression in mammal host transformant; DNA sequence; potential mono-valent, multivalent live recombinant vaccine vector |
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