JPH0698764A - 単純ヘルペスウイルス型1グリコプロテインiの発現方法及び使用方法 - Google Patents
単純ヘルペスウイルス型1グリコプロテインiの発現方法及び使用方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 組換えバキュロウイルスで感染又は形質転換
した細胞から単純ヘルペスウイルス型1(HSV−1)グ
リコプロテインI(gI)を得る。 【構成】 組換えバキュロウイルスは遺伝構成が下記を
含む。 a) HSV−1gIをコードする遺伝子配列又は生物学
的に活性なその誘導体。 b) 該gI遺伝子配列がポリヘドリンプロモーターの調
整要素に官能的に結合するポリヘドリン遺伝子プロモー
ター配列。
した細胞から単純ヘルペスウイルス型1(HSV−1)グ
リコプロテインI(gI)を得る。 【構成】 組換えバキュロウイルスは遺伝構成が下記を
含む。 a) HSV−1gIをコードする遺伝子配列又は生物学
的に活性なその誘導体。 b) 該gI遺伝子配列がポリヘドリンプロモーターの調
整要素に官能的に結合するポリヘドリン遺伝子プロモー
ター配列。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は感染病及び分子生物学の
分野に関する。
分野に関する。
【0002】
A.単純ヘルペスウイルス型1(HSV−1)グリコプロ
テインI グリコプロテインI(gI)は10の報告された単純ヘル
ペスウイルス型1(HSV−1)グリコプロテインの1つ
である。HSV−1感染細胞において、gIは41KDa
の分子量を有する非グリコシル化ペプチドとして存在す
る。非グリコシル化ポリペプチドは、部分的にグリコシ
ル化されて約55kDaの前駆体gIを生成し、次いでこ
れは65kDaの明白な分子量を有する熟成gIまでさら
にグリコシル化される。
テインI グリコプロテインI(gI)は10の報告された単純ヘル
ペスウイルス型1(HSV−1)グリコプロテインの1つ
である。HSV−1感染細胞において、gIは41KDa
の分子量を有する非グリコシル化ペプチドとして存在す
る。非グリコシル化ポリペプチドは、部分的にグリコシ
ル化されて約55kDaの前駆体gIを生成し、次いでこ
れは65kDaの明白な分子量を有する熟成gIまでさら
にグリコシル化される。
【0003】10のHSVグリコプロテインはウイルス
の表面に位置し、その幾らかは、HSV−1感染への液
性(抗体)及び細胞性免疫応答の1次インヂューサー及び
標的であると報告されている。HSV−1グリコプロテ
インE及びIはイムノグロブリンGのFc部分に結合で
きる複合体を形成する。gEのみではFc受容体として作
用するが、gIはこの活性を増強するように見える。今
までFc受容体活性はgIだけでは検出されていない。さ
らに、ブラックロウズ等は、gIを発現したワクチニア
が免疫マウスで防御反応を生じないことを見出した。ブ
ラックロウズ、ビー.エイ.、クリシュナ.エス.、ミ
ンソン、エイ.シー.及びナシュ.エイ.エイ.ワクチ
ニアウイルス組換え体において発現された単純ヘルペス
ウイルス型1グリコプロテインの免疫原性、バイロロジ
ィ(Virology)、177、727−736(1990)。
の表面に位置し、その幾らかは、HSV−1感染への液
性(抗体)及び細胞性免疫応答の1次インヂューサー及び
標的であると報告されている。HSV−1グリコプロテ
インE及びIはイムノグロブリンGのFc部分に結合で
きる複合体を形成する。gEのみではFc受容体として作
用するが、gIはこの活性を増強するように見える。今
までFc受容体活性はgIだけでは検出されていない。さ
らに、ブラックロウズ等は、gIを発現したワクチニア
が免疫マウスで防御反応を生じないことを見出した。ブ
ラックロウズ、ビー.エイ.、クリシュナ.エス.、ミ
ンソン、エイ.シー.及びナシュ.エイ.エイ.ワクチ
ニアウイルス組換え体において発現された単純ヘルペス
ウイルス型1グリコプロテインの免疫原性、バイロロジ
ィ(Virology)、177、727−736(1990)。
【0004】グリコプロテインIは、ワクチニア発現系
において唯一の他の群、スリバン及びスミスにより発現
され、そして、gI中和抗体は完全に補体依存性である
と報告された。スリバン.ブイ.及びスミス.ジー.エ
ル.単純ヘルペスウイルス型IUS7遺伝子生成物は6
6Kグリコプロテインであり、補体依存性ウイルス中和
のための標的である。ジャーナル・オブ・ジェネラル・
バイロロジィ(J.Gen.Virol.)、69、859−8
67(1988)。しかしながら、それらの報告された中
和力価は異常に低く、非慣用検定方法を用いて測定され
た。さらにブラックロウズ等は、スリバン及びスミスに
より構築された同じワクチニア組換えgIを用い、標準
検定を用いて、補体の存在で1:2以下の中和力価を得
た。
において唯一の他の群、スリバン及びスミスにより発現
され、そして、gI中和抗体は完全に補体依存性である
と報告された。スリバン.ブイ.及びスミス.ジー.エ
ル.単純ヘルペスウイルス型IUS7遺伝子生成物は6
6Kグリコプロテインであり、補体依存性ウイルス中和
のための標的である。ジャーナル・オブ・ジェネラル・
バイロロジィ(J.Gen.Virol.)、69、859−8
67(1988)。しかしながら、それらの報告された中
和力価は異常に低く、非慣用検定方法を用いて測定され
た。さらにブラックロウズ等は、スリバン及びスミスに
より構築された同じワクチニア組換えgIを用い、標準
検定を用いて、補体の存在で1:2以下の中和力価を得
た。
【0005】これらの報告と対照的に、我々はバキュロ
ウイルス系において、HSV−1感染に対し強い保護免
疫応答を惹起しうる多量のgIを発現した。我々の組換
えgIをワクチン接種したマウスは、強い中和抗体応答
を誘導した。gI中和力価は補体の存在で1:167、補
体の不存在で1:91であり、従って、部分的に補体依
存性であるようであった。我々は、又、バキュロウイル
ス組換えgIをワクチン接種したマウスが致死HSV−
1感染に対し完全防御を示すことを見出した。我々の認
識では、これはgIが動物においてHSV−1攻撃に対
し、防御免疫を誘導できることを証明する最初の報告で
ある。大量の高品質生物活性gIを生成するこの能力は
HSVに対する有効ワクチンの開発に重要である。
ウイルス系において、HSV−1感染に対し強い保護免
疫応答を惹起しうる多量のgIを発現した。我々の組換
えgIをワクチン接種したマウスは、強い中和抗体応答
を誘導した。gI中和力価は補体の存在で1:167、補
体の不存在で1:91であり、従って、部分的に補体依
存性であるようであった。我々は、又、バキュロウイル
ス組換えgIをワクチン接種したマウスが致死HSV−
1感染に対し完全防御を示すことを見出した。我々の認
識では、これはgIが動物においてHSV−1攻撃に対
し、防御免疫を誘導できることを証明する最初の報告で
ある。大量の高品質生物活性gIを生成するこの能力は
HSVに対する有効ワクチンの開発に重要である。
【0006】B.DNA技術 組換えDNA及び関連技術は、治療又は予防HSVワク
チンに必要とされる大量の高品質生物活性HSVグリコ
プロテインIを有効に供給するのに適用できる。
チンに必要とされる大量の高品質生物活性HSVグリコ
プロテインIを有効に供給するのに適用できる。
【0007】DNA技術は、部分的に、複製の起源、1
又はそれ以上の表現型選択特質、発現プロモーター、異
種遺伝子挿入及び残留ベクターのDNA組換えによる複
製可能発現伝播体又は置換(transplacement)ベクターを
生成することを含む。得られる発現伝播体は形質転換に
より細胞内に導入され組換えバキュロウイルス置換ベク
ターから受容体バキュロウイルスへ遺伝構造を置換させ
る。次いで、大量の組換え伝播体が被転換体を生育する
ことにより得られる。遺伝子がコード化されたDNAメ
ッセージの転写及び翻訳を制御する調整要素に関して適
当に挿入され又は官能的に関連する所では、発現伝播体
は、挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列を生成し
うる。ポリペプチドを生成するこの方法は、“発現"と
呼ばれる。得られる生成物は宿主細胞を溶解し、適当な
精製方法により生成物を回収することにより得られる。
又はそれ以上の表現型選択特質、発現プロモーター、異
種遺伝子挿入及び残留ベクターのDNA組換えによる複
製可能発現伝播体又は置換(transplacement)ベクターを
生成することを含む。得られる発現伝播体は形質転換に
より細胞内に導入され組換えバキュロウイルス置換ベク
ターから受容体バキュロウイルスへ遺伝構造を置換させ
る。次いで、大量の組換え伝播体が被転換体を生育する
ことにより得られる。遺伝子がコード化されたDNAメ
ッセージの転写及び翻訳を制御する調整要素に関して適
当に挿入され又は官能的に関連する所では、発現伝播体
は、挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列を生成し
うる。ポリペプチドを生成するこの方法は、“発現"と
呼ばれる。得られる生成物は宿主細胞を溶解し、適当な
精製方法により生成物を回収することにより得られる。
【0008】原核及び真核生物を含む広範囲の宿主細胞
を用いることができる。微生物に加えて、脊椎動物であ
れ、非脊椎動物であれ、多細胞生物から導かれる細胞の
培養物も宿主として用いうる。我々の系は、バキュロウ
イルス、ポリヘドリンプロモーター系及び宿主細胞とし
ての昆虫細胞の使用を含み、大量の生物活性gIを生成
した。我々の認識によれば、我々はgIワクチンを用い
る致死HSV−1攻撃に対する高レベルの防御を証明す
る最初である。本明細書で記載される文献は全て引例と
して明細書記載の一部とする。
を用いることができる。微生物に加えて、脊椎動物であ
れ、非脊椎動物であれ、多細胞生物から導かれる細胞の
培養物も宿主として用いうる。我々の系は、バキュロウ
イルス、ポリヘドリンプロモーター系及び宿主細胞とし
ての昆虫細胞の使用を含み、大量の生物活性gIを生成
した。我々の認識によれば、我々はgIワクチンを用い
る致死HSV−1攻撃に対する高レベルの防御を証明す
る最初である。本明細書で記載される文献は全て引例と
して明細書記載の一部とする。
【0009】
発明の要約 本発明は、組換えDNA技術によるHSV−1gIの生
成及びHSV−1及び/又はHSV−2感染を防御する
ワクチンにおける免疫原としてのその用途に関する。遺
伝的に設計された免疫原から造られたワクチンは、弱毒
化ウイルスから造られた慣用のワクチンよりも安全であ
るべきである。というのは、レシピエントへの感染の危
険がなく、特にヘルペスウイルスについてそうであり、
頸部癌の危険がないからである。別法として遺伝的に設
計されたグリコプロテイン又は蛋白生成物が受身免疫治
療での使用のための抗体を生成するのに用いうる。本発
明は又、目的の置換ベクターを含む形質転換細胞系及び
HSV−1gIを生成するその培養物にも関する。
成及びHSV−1及び/又はHSV−2感染を防御する
ワクチンにおける免疫原としてのその用途に関する。遺
伝的に設計された免疫原から造られたワクチンは、弱毒
化ウイルスから造られた慣用のワクチンよりも安全であ
るべきである。というのは、レシピエントへの感染の危
険がなく、特にヘルペスウイルスについてそうであり、
頸部癌の危険がないからである。別法として遺伝的に設
計されたグリコプロテイン又は蛋白生成物が受身免疫治
療での使用のための抗体を生成するのに用いうる。本発
明は又、目的の置換ベクターを含む形質転換細胞系及び
HSV−1gIを生成するその培養物にも関する。
【0010】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】この目的
のために、我々はSf9細胞において高レベルのHSV
−1gIを発現する組換えバキュロウイルスを構築し
た。しかしながら、我々は予期に反して我々の発現gI
によるマウスのワクチン接種が致死HSV−1攻撃に対
する高レベルの防御を起こすことを発見した。従って、
方法及び組成物は単一細胞宿主生物におけるHSVgI
遺伝子のクローニング及び発現に提供される。又、これ
らの新規単一細胞生物を培養してHSVgI遺伝子生成
物を生成する方法及び遺伝子生成物の精製方法をも記載
する。
のために、我々はSf9細胞において高レベルのHSV
−1gIを発現する組換えバキュロウイルスを構築し
た。しかしながら、我々は予期に反して我々の発現gI
によるマウスのワクチン接種が致死HSV−1攻撃に対
する高レベルの防御を起こすことを発見した。従って、
方法及び組成物は単一細胞宿主生物におけるHSVgI
遺伝子のクローニング及び発現に提供される。又、これ
らの新規単一細胞生物を培養してHSVgI遺伝子生成
物を生成する方法及び遺伝子生成物の精製方法をも記載
する。
【0011】次いでヒト宿主に、好ましくは免疫誘導量
のgIのみを含むワクチンをあるいは1又はそれ以上の
HSVグリコプロテイン又は蛋白と共に、全身性経路、
腸内経路又は、眼経路により接種する。ワクチンも、
又、ワクチンのグリコプロテイン成分と共に、前又は後
に、投与される1又はそれ以上のアジュバンドを含みう
る。
のgIのみを含むワクチンをあるいは1又はそれ以上の
HSVグリコプロテイン又は蛋白と共に、全身性経路、
腸内経路又は、眼経路により接種する。ワクチンも、
又、ワクチンのグリコプロテイン成分と共に、前又は後
に、投与される1又はそれ以上のアジュバンドを含みう
る。
【0012】本発明のワクチンは、溶液形、凍結乾燥、
噴霧乾燥、又は凍結乾燥形で、処理の間にグリコプロテ
イン又は蛋白を保護するために1又はそれ以上の適当な
保存剤及び保護剤と組合せて有利に用いうる。
噴霧乾燥、又は凍結乾燥形で、処理の間にグリコプロテ
イン又は蛋白を保護するために1又はそれ以上の適当な
保存剤及び保護剤と組合せて有利に用いうる。
【0013】A.抗原 バキュロウイルス発現gIは52及び56kDaの分子量
を有し、ゲル上を移動した。組換えgIはツニカマイシ
ン及びエンドグリコシダーゼHに対するその感受性によ
り証明されるようにグリコシル化されたようである。間
接免疫蛍光もそれがSf9細胞の膜に輸送されることを
証明した。我々の発現gIをワクチン接種したマウスは
致死HSV−1攻撃からマウスを防御する高血清力価の
補体依存性及び非補体依存性HSV−1中和抗体を示し
た。
を有し、ゲル上を移動した。組換えgIはツニカマイシ
ン及びエンドグリコシダーゼHに対するその感受性によ
り証明されるようにグリコシル化されたようである。間
接免疫蛍光もそれがSf9細胞の膜に輸送されることを
証明した。我々の発現gIをワクチン接種したマウスは
致死HSV−1攻撃からマウスを防御する高血清力価の
補体依存性及び非補体依存性HSV−1中和抗体を示し
た。
【0014】B.アジュバンド ワクチンは種々のアジュバンドとエマルジョンでしばし
ば投与される。アジュバンドは、免疫原のみが投与され
るよりも少ない用量でより少量の抗原を用いて、より永
続性でより高レベルの免疫を獲得するのを助ける。本発
明において用いるアジュバンドはアラム、フロインド、
MTP−PE及びISCOMs(QuilA)を含むがこれに
限らない。加えて、ワクチンは、細胞伝達免疫応答を誘
導するため1又はそれ以上のアジュバンドと共に又は存
在させることなく投与される1又はそれ以上のHSV−
1グリコプロテインを含むリポソーム又は他の膜結合小
胞を含みうる。
ば投与される。アジュバンドは、免疫原のみが投与され
るよりも少ない用量でより少量の抗原を用いて、より永
続性でより高レベルの免疫を獲得するのを助ける。本発
明において用いるアジュバンドはアラム、フロインド、
MTP−PE及びISCOMs(QuilA)を含むがこれに
限らない。加えて、ワクチンは、細胞伝達免疫応答を誘
導するため1又はそれ以上のアジュバンドと共に又は存
在させることなく投与される1又はそれ以上のHSV−
1グリコプロテインを含むリポソーム又は他の膜結合小
胞を含みうる。
【0015】C.免疫経路 ワクチンは全身経路、全身予防接種と組合せ又は組合せ
ることになく眼球経路、又は腸内経路により投与でき
る。全身経路は1又は多用量で、皮下、筋肉、又は静脈
内注射を含むがこれに限らない。眼球経路は、1又は多
用量での眼の結膜下注射、表面滴下、徐放装置、例えば
コラーゲン保護、ヒドロゲルコンタクトレンズ又はAL
ZA“Ocusert"を含むがこれに限らない。
ることになく眼球経路、又は腸内経路により投与でき
る。全身経路は1又は多用量で、皮下、筋肉、又は静脈
内注射を含むがこれに限らない。眼球経路は、1又は多
用量での眼の結膜下注射、表面滴下、徐放装置、例えば
コラーゲン保護、ヒドロゲルコンタクトレンズ又はAL
ZA“Ocusert"を含むがこれに限らない。
【0016】投与される用量は、変更可能で一般に予防
接種を含む1ないし3用量で所望の効果及び選択した投
与経路に依存する。しかしながら、注射によるヒトへの
接種用量は約1μgから1000μgまで変化する。眼球
予防接種については、ヒト供与量は約1μgから500
μgまで変わり、一方、腸内予防接種についてはヒト供
与量は約1μgから2000μgまで変わる。
接種を含む1ないし3用量で所望の効果及び選択した投
与経路に依存する。しかしながら、注射によるヒトへの
接種用量は約1μgから1000μgまで変化する。眼球
予防接種については、ヒト供与量は約1μgから500
μgまで変わり、一方、腸内予防接種についてはヒト供
与量は約1μgから2000μgまで変わる。
【0017】従って、本発明の主たる目的は、高レベル
のHSV−1gIを発現することである。
のHSV−1gIを発現することである。
【0018】本発明の目的は単一ベクター系において1
ウイルス株から高レベルのHSV−1gIを発現するこ
とである。
ウイルス株から高レベルのHSV−1gIを発現するこ
とである。
【0019】本発明の目的は、又、組換えバキュロウイ
ルスに感染し、又は形質転換した細胞から高レベルの生
物活性HSV−1gIを発現することである。
ルスに感染し、又は形質転換した細胞から高レベルの生
物活性HSV−1gIを発現することである。
【0020】本発明の他の目的は、HSV−1gIを生
成する形質転換された細胞系を得ることである。
成する形質転換された細胞系を得ることである。
【0021】本発明の次の目的は、宿主におけるHSV
の処置又は予防のための有効なワクチンを開発すること
である。
の処置又は予防のための有効なワクチンを開発すること
である。
【0022】これらの及び他の目的は、以下の記載及び
添付された請求の範囲からこの分野の当業者が容易に明
らかとなろう。
添付された請求の範囲からこの分野の当業者が容易に明
らかとなろう。
【0023】図面の説明 本発明を添付の図面の援助によって説明する。
【0024】図1は、HSV−1gI遺伝子を含むpAc
−gI1組換えバキュロウイルス転換ベクターの構築の
概要図表である。バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子
プロモーター(斜線部分)のコントロールの下にHSV−
1gI(黒ぬり部分)の完全コード部分を含むバキュロウ
イルス転移ベクター(pAc−gII)の構築方法は、ここ
に概要を述べ、テキストに記載される。図の底部はバキ
ュロウイルス転移ベクターにおけるクローン化されたg
Iの5'末端の近くの部分の配列である。バキュロウイ
ルスポリヘドロン遺伝子プロモーターの3'末端、Bam
HIリンカー、及びgIのコード配列(gI遺伝子の5非
コードヌクレオチドにより先に起きた)を示す。
−gI1組換えバキュロウイルス転換ベクターの構築の
概要図表である。バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子
プロモーター(斜線部分)のコントロールの下にHSV−
1gI(黒ぬり部分)の完全コード部分を含むバキュロウ
イルス転移ベクター(pAc−gII)の構築方法は、ここ
に概要を述べ、テキストに記載される。図の底部はバキ
ュロウイルス転移ベクターにおけるクローン化されたg
Iの5'末端の近くの部分の配列である。バキュロウイ
ルスポリヘドロン遺伝子プロモーターの3'末端、Bam
HIリンカー、及びgIのコード配列(gI遺伝子の5非
コードヌクレオチドにより先に起きた)を示す。
【0025】図2は感染昆虫細胞における発現gIのウ
エスタンブロット分析である。昆虫細胞はバキュロウイ
ルス−gI組換え体(vAc−gII)で、10の多重性の感
染で感染し、幾つかの単層はツニカマイシンで処理(感
染後0ないし48時間)するか、又は細胞抽出物を製造
業者(ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ)に
より推奨されるように、エンドグリコシダーゼHで処理
した。大略述べると、105細胞をゲル試料緩衝液、酢
酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解した。次いで、
エンドグリコシダーゼHを加えて試料を一夜インキュベ
ートした。レーン:M、分子寸法標識:1、野性型−バキ
ュロウイルス−感染昆虫細胞:2、バキュロウイルス−g
I−感染細胞感染後48時間:3、バキュロウイルス−g
I−感染細胞感染後72時間:4、ツニカマイシン−処
理、バキュロウイルス−gI−感染細胞(48時間):5、
エンドグリコシダーゼH−処理、バキュロウイルス−g
I−感染細胞感染後72時間。
エスタンブロット分析である。昆虫細胞はバキュロウイ
ルス−gI組換え体(vAc−gII)で、10の多重性の感
染で感染し、幾つかの単層はツニカマイシンで処理(感
染後0ないし48時間)するか、又は細胞抽出物を製造
業者(ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ)に
より推奨されるように、エンドグリコシダーゼHで処理
した。大略述べると、105細胞をゲル試料緩衝液、酢
酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)に溶解した。次いで、
エンドグリコシダーゼHを加えて試料を一夜インキュベ
ートした。レーン:M、分子寸法標識:1、野性型−バキ
ュロウイルス−感染昆虫細胞:2、バキュロウイルス−g
I−感染細胞感染後48時間:3、バキュロウイルス−g
I−感染細胞感染後72時間:4、ツニカマイシン−処
理、バキュロウイルス−gI−感染細胞(48時間):5、
エンドグリコシダーゼH−処理、バキュロウイルス−g
I−感染細胞感染後72時間。
【0026】図3は組換えバキュロウイルス−感染細胞
の免疫蛍光を示す。アセトン固定又は未固定感染Sf9
細胞を抗gIモノクローナル抗体と、次いでフルオレセ
イン抱合ヤギ抗マウス免疫グロブリンG抗体とインキュ
ベートし、既に記載され且つこの分野で知られているよ
うに蛍光顕微鏡により試験した。(A)組換えバキュロウ
イルス−gI−感染細胞、全(細胞内)蛍光:(B)バキュロ
ウイルス−gI−感染細胞、表面蛍光:(C)野性型−バキ
ュロウイルス−感染細胞、全蛍光。
の免疫蛍光を示す。アセトン固定又は未固定感染Sf9
細胞を抗gIモノクローナル抗体と、次いでフルオレセ
イン抱合ヤギ抗マウス免疫グロブリンG抗体とインキュ
ベートし、既に記載され且つこの分野で知られているよ
うに蛍光顕微鏡により試験した。(A)組換えバキュロウ
イルス−gI−感染細胞、全(細胞内)蛍光:(B)バキュロ
ウイルス−gI−感染細胞、表面蛍光:(C)野性型−バキ
ュロウイルス−感染細胞、全蛍光。
【0027】詳細な説明 本発明は組換えDNA技術を利用してHSV−1gIを
コードするDNA配列又はその蛋白をDNA置換ベクタ
ーに挿入し、ベクターは外来宿主においてgI遺伝子の
発現を増殖し指図することが可能となる。得られる組換
えDNA分子を昆虫細胞に導入して、宿主細胞によりg
I又はその部分又はその分子変異体を大量に生成しう
る。生成したgIは、次いで、HSV型1及び/又は型
2に対する免疫療法に用いるために分離、精製する。
コードするDNA配列又はその蛋白をDNA置換ベクタ
ーに挿入し、ベクターは外来宿主においてgI遺伝子の
発現を増殖し指図することが可能となる。得られる組換
えDNA分子を昆虫細胞に導入して、宿主細胞によりg
I又はその部分又はその分子変異体を大量に生成しう
る。生成したgIは、次いで、HSV型1及び/又は型
2に対する免疫療法に用いるために分離、精製する。
【0028】以下に示す実施例はバキュロウイルス、ポ
リヘドロンプロモーター系及び宿主細胞としての昆虫細
胞の利用を記載する。しかしながら、別の宿主細胞培養
において望ましいgI及びgI生成物の発現のための発現
ベクターを構築するため類似の技術を用いることはこの
分野の当業者にとって容易である。従って、以下の詳細
な記載は限定する意味にとるべきでなく、本発明の範囲
は添付の特許請求の範囲により最もよく定義される。
リヘドロンプロモーター系及び宿主細胞としての昆虫細
胞の利用を記載する。しかしながら、別の宿主細胞培養
において望ましいgI及びgI生成物の発現のための発現
ベクターを構築するため類似の技術を用いることはこの
分野の当業者にとって容易である。従って、以下の詳細
な記載は限定する意味にとるべきでなく、本発明の範囲
は添付の特許請求の範囲により最もよく定義される。
【0029】A.ウイルス及び細胞 オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa califo
rnica)核多角体病ウイルス(AcNPV)のE2株及びスポ
ドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)ク
ローン(Sf9)細胞をこの分野で知られた方法により生
育した。プラク精製HSV−(McKrae及びKOS株)及
びVero細胞を標準的技術を用いて生育した。
rnica)核多角体病ウイルス(AcNPV)のE2株及びスポ
ドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)ク
ローン(Sf9)細胞をこの分野で知られた方法により生
育した。プラク精製HSV−(McKrae及びKOS株)及
びVero細胞を標準的技術を用いて生育した。
【0030】AcNPV組換え転移ベクターの構築 プラスミドpSS17をFspI/SphIで2回消化し、g
Iの完全コード部分を含む1.3Kb断片を分離した。
得られた断片をpGem−3のSmaI部位に連結した。プ
ラスミドpGem−gIをHindIIIで線状にし、Bal3
1エキソヌクレアーゼで大まかに消化し、ベクターpAc
YM1のユニークBamHI部位に連結した。部分配列分
析は、クローン化gIが5'末端に5ヌクレオチドの短い
非コード部分及び3'末端にgI終止コドン後48HSV
−1非コードヌクレオチドを有することを示した。
Iの完全コード部分を含む1.3Kb断片を分離した。
得られた断片をpGem−3のSmaI部位に連結した。プ
ラスミドpGem−gIをHindIIIで線状にし、Bal3
1エキソヌクレアーゼで大まかに消化し、ベクターpAc
YM1のユニークBamHI部位に連結した。部分配列分
析は、クローン化gIが5'末端に5ヌクレオチドの短い
非コード部分及び3'末端にgI終止コドン後48HSV
−1非コードヌクレオチドを有することを示した。
【0031】C.組換えウイルスのトランスフェクショ
ン及び選択 Sf9細胞はこの分野で知られた方法で精製感染がバキ
ュロウイルス(AcNPV)DNA及びpAc−gI1プラス
ミドDNAを同時移入した。3反復のポリヘドリン陰性
プラク精製ののち、2つの組換えウイルスを得た。両組
換え体は、抗−gIモノクローナル抗体を用いるウエス
タンブロットにより測定されるように同様の性質を有す
るgIを発現した。組換えバキュロウイルスの1つをさ
らに研究するために選び、vAc−・gI1と名付けた。
ン及び選択 Sf9細胞はこの分野で知られた方法で精製感染がバキ
ュロウイルス(AcNPV)DNA及びpAc−gI1プラス
ミドDNAを同時移入した。3反復のポリヘドリン陰性
プラク精製ののち、2つの組換えウイルスを得た。両組
換え体は、抗−gIモノクローナル抗体を用いるウエス
タンブロットにより測定されるように同様の性質を有す
るgIを発現した。組換えバキュロウイルスの1つをさ
らに研究するために選び、vAc−・gI1と名付けた。
【0032】D.ウイルスDNAの調製 Sf9細胞を10PFU/細胞のMOIにおいて、組換
えウイルスで感染し、28℃で72時間インキュベート
した。感染細胞を凍結融解し、1000xgで10分遠心
して細胞残骸を除いた。続く、ウイルス分離、DNA抽
出及びブロッティングはこの分野で既知であり、従っ
て、ここでは繰り返さない。
えウイルスで感染し、28℃で72時間インキュベート
した。感染細胞を凍結融解し、1000xgで10分遠心
して細胞残骸を除いた。続く、ウイルス分離、DNA抽
出及びブロッティングはこの分野で既知であり、従っ
て、ここでは繰り返さない。
【0033】E.ウエスタンブロット ウエスタンイムノブロットを変性条件下に実施した。S
DS−PAGE用試料を2%SDS及び10%2−メル
カプトエタノールを含む電気泳動試料緩衝液中に崩壊
し、100℃で3分間加熱した。蛋白をSDS−PAG
Eにより分離し、電気泳動によりニトロセルロース紙に
移した。ニトロセルロースブロットをBLOTTO(P
BS中5%脱脂乾燥牛乳)中遮断し、Fd69抗gIモノ
クローナル抗体(エス.チャタージー博士からの贈物)と
4℃で1時間反応させた。結合抗体では、ブロットを
125I−プロテインAと25℃で1時間反応させ、次い
で、オートラジオグラフィーにより測定した。
DS−PAGE用試料を2%SDS及び10%2−メル
カプトエタノールを含む電気泳動試料緩衝液中に崩壊
し、100℃で3分間加熱した。蛋白をSDS−PAG
Eにより分離し、電気泳動によりニトロセルロース紙に
移した。ニトロセルロースブロットをBLOTTO(P
BS中5%脱脂乾燥牛乳)中遮断し、Fd69抗gIモノ
クローナル抗体(エス.チャタージー博士からの贈物)と
4℃で1時間反応させた。結合抗体では、ブロットを
125I−プロテインAと25℃で1時間反応させ、次い
で、オートラジオグラフィーにより測定した。
【0034】F.エンドグリコシダーゼH(Endo−H)
処理 Endo−H処理を、製造者(ベーリンガー・マンハイム・
バイオケミカルズ)により記載されるようにSf9感染細
胞(10PFU/細胞:感染後72時間)からの溶解質上
で行なった。簡単にいうと、105細胞をゲル試料緩衝
液、酢酸Na(pH5.0)緩衝液に溶解した。次いで、E
ndo−Hを加えて試料を一晩インキュベートした。
処理 Endo−H処理を、製造者(ベーリンガー・マンハイム・
バイオケミカルズ)により記載されるようにSf9感染細
胞(10PFU/細胞:感染後72時間)からの溶解質上
で行なった。簡単にいうと、105細胞をゲル試料緩衝
液、酢酸Na(pH5.0)緩衝液に溶解した。次いで、E
ndo−Hを加えて試料を一晩インキュベートした。
【0035】G.ツニカマイシン処理 感染細胞(10PFU/細胞)をTNN−FH培地中4μ
g/mlツニカマイシンに感染後、0−48時間インキュ
ベートし、SDS−PAGEを収集した。
g/mlツニカマイシンに感染後、0−48時間インキュ
ベートし、SDS−PAGEを収集した。
【0036】H.免疫蛍光 Sf9細胞を野性型AcNPV又はgIを発現する組換え
バキュロウイルスで感染し(10PFU/細胞の多重性
の感染)、72時間インキュベートした。全蛍光を見る
ため、細胞をPBSで洗浄し、アセトンで固定し、gI
モノクローナル抗体と37℃で1時間インキュベートし
た。細胞表面免疫蛍光を試験するため、未固定、未透過
細胞を抗gIモノクローナル抗体と4℃で1時間インキ
ュベートし、次いで、アセトンで固定した。次いで、全
及び表面蛍光用スライドをフルオレセイン結合ヤギ抗マ
ウスIgGで37℃、1時間染色し、蛍光を試験した。
バキュロウイルスで感染し(10PFU/細胞の多重性
の感染)、72時間インキュベートした。全蛍光を見る
ため、細胞をPBSで洗浄し、アセトンで固定し、gI
モノクローナル抗体と37℃で1時間インキュベートし
た。細胞表面免疫蛍光を試験するため、未固定、未透過
細胞を抗gIモノクローナル抗体と4℃で1時間インキ
ュベートし、次いで、アセトンで固定した。次いで、全
及び表面蛍光用スライドをフルオレセイン結合ヤギ抗マ
ウスIgGで37℃、1時間染色し、蛍光を試験した。
【0037】I.予防接種 10PFU/細胞の野性型(AcNPV)又はvAc−gII
で72時間感染したSf9細胞を集め、PBS中洗浄
し、懸濁した。マウス(Balb/C.6−8週令)をgIを
発現する凍結融解した全昆虫細胞で3回皮下及び腹腔内
に(付随的に)ワクチン接種した。皮下注射は0日にフロ
インド完全アジュバントと混合した、21及び24日に
フロインド不完全アジュバントと混合した、1×106
細胞で行なった。腹腔内注射は同じ日にPBS中1×1
06細胞を用いて行った。同様に模擬ワクチン接種マウ
スを野性型バキュロウイルスを感染させたSf9細胞を
接種した。陽性コントロール群を2×105PFUのK
OSで3回腹腔内に免疫した。最終予防接種3週間後S
eraを集め、各群ごとにプールした。
で72時間感染したSf9細胞を集め、PBS中洗浄
し、懸濁した。マウス(Balb/C.6−8週令)をgIを
発現する凍結融解した全昆虫細胞で3回皮下及び腹腔内
に(付随的に)ワクチン接種した。皮下注射は0日にフロ
インド完全アジュバントと混合した、21及び24日に
フロインド不完全アジュバントと混合した、1×106
細胞で行なった。腹腔内注射は同じ日にPBS中1×1
06細胞を用いて行った。同様に模擬ワクチン接種マウ
スを野性型バキュロウイルスを感染させたSf9細胞を
接種した。陽性コントロール群を2×105PFUのK
OSで3回腹腔内に免疫した。最終予防接種3週間後S
eraを集め、各群ごとにプールした。
【0038】J.血清中和検定 インビトロ血清中和検定のため、熱不活性プール血清を
MENに希釈し、500PFUのHSV−1株KOSと
混合し、37℃で30分間インキュベートした。2.5
%の熱不活性又は新鮮なモルモット成分を加えて混合物
をさらに30分間インキュベートした。重複試料を24
ウエルミクロタイタープレート内のCV−1細胞に加え
て残留HSV−1感染性を検定した。プレートを37
℃、72時間インキュベートし、1%クリスタルバイオ
レットで染色し、プラクを数えた。
MENに希釈し、500PFUのHSV−1株KOSと
混合し、37℃で30分間インキュベートした。2.5
%の熱不活性又は新鮮なモルモット成分を加えて混合物
をさらに30分間インキュベートした。重複試料を24
ウエルミクロタイタープレート内のCV−1細胞に加え
て残留HSV−1感染性を検定した。プレートを37
℃、72時間インキュベートし、1%クリスタルバイオ
レットで染色し、プラクを数えた。
【0039】K.HSV−1攻撃 最終予防接種3週間後、マウスは2×106PFUのH
SV−1(Mckrae株)で腹腔内に攻撃した。攻撃したマ
ウスは2週間モニターした。
SV−1(Mckrae株)で腹腔内に攻撃した。攻撃したマ
ウスは2週間モニターした。
【0040】結果 A.gIを発現する組換えウイルスの構築 完全gIオープンリーディングフレームを含むバキュロ
ウイルス転移ベクターの構築の方法は図1に示される。
gI遺伝子の完全DNA複写をFspI/SphIによる制
限酵素消化により分離した。HSV−IgI(黒)の完全
コーディング部分を含む得られる断片をpGem−3のSm
aI部位に鈍端化した。プラスミドpGem−gIをHindI
IIで線状化し、Bal31で大体消化し、BamHIリン
カーを加えた。得られるDNAを次いでpAcYM1ベク
ターのBamHI部位に挿入した(図1及び上記詳細な記
載参照)。制限酵素分析及び部分配列決定は、この構成
物はgI遺伝子の全配列を含むことを立証した。それは
第1ATGの前の5ヌクレオチドの非コード化部分を有
する。これは1170ヌクレオチドの完全コード化部分
に続く。gI遺伝子をバキュロウイルスAcNPV DN
Aに転移するため、Sf9細胞はpAc−gII DNA及
び感染AcNPV DNAを同時移入した。2つの推定
組換えウイルスを3循環のポリヘドロン陰性プラク精製
により選択した。両組換えバキュロウイルスはウエスタ
ンブロッティングにより測定されたように同様の性質を
有するgIを発現した。一つを続く研究のために独断的
に選びvAc−gIIと名付けた。
ウイルス転移ベクターの構築の方法は図1に示される。
gI遺伝子の完全DNA複写をFspI/SphIによる制
限酵素消化により分離した。HSV−IgI(黒)の完全
コーディング部分を含む得られる断片をpGem−3のSm
aI部位に鈍端化した。プラスミドpGem−gIをHindI
IIで線状化し、Bal31で大体消化し、BamHIリン
カーを加えた。得られるDNAを次いでpAcYM1ベク
ターのBamHI部位に挿入した(図1及び上記詳細な記
載参照)。制限酵素分析及び部分配列決定は、この構成
物はgI遺伝子の全配列を含むことを立証した。それは
第1ATGの前の5ヌクレオチドの非コード化部分を有
する。これは1170ヌクレオチドの完全コード化部分
に続く。gI遺伝子をバキュロウイルスAcNPV DN
Aに転移するため、Sf9細胞はpAc−gII DNA及
び感染AcNPV DNAを同時移入した。2つの推定
組換えウイルスを3循環のポリヘドロン陰性プラク精製
により選択した。両組換えバキュロウイルスはウエスタ
ンブロッティングにより測定されたように同様の性質を
有するgIを発現した。一つを続く研究のために独断的
に選びvAc−gIIと名付けた。
【0041】B.Sf9細胞におけるgIの発現 gIを発現したバキュロウイルスの大きさを分析するた
め、Sf9細胞の融合単層をバキュロウイルス組換えvA
c−gIIにより多重性の10PFU/細胞で感染した。
全蛋白抽出物を10% SDS−PAGE上で行ない、
gIに対するFd69モノクローナル抗体を用いるウエス
タンブロッティングにより分析した。52及び56kDa
の2つのバンドはgI特異的抗体を強く反応した(図3、
レーン2及び3)。加えて、これらのバンドは、感染4
8時間後(レーン2)よりも感染72時間後(レーン3)で
より顕著であった。これらのバンドは野性型バキュロウ
イルス感染細胞(レーン1)又は膜凝感染Sf9細胞に見
られなかった。
め、Sf9細胞の融合単層をバキュロウイルス組換えvA
c−gIIにより多重性の10PFU/細胞で感染した。
全蛋白抽出物を10% SDS−PAGE上で行ない、
gIに対するFd69モノクローナル抗体を用いるウエス
タンブロッティングにより分析した。52及び56kDa
の2つのバンドはgI特異的抗体を強く反応した(図3、
レーン2及び3)。加えて、これらのバンドは、感染4
8時間後(レーン2)よりも感染72時間後(レーン3)で
より顕著であった。これらのバンドは野性型バキュロウ
イルス感染細胞(レーン1)又は膜凝感染Sf9細胞に見
られなかった。
【0042】C.gIのグリコシル化 発現されたgIがグリコシル化されたことを証明するた
め、ツニカマイシン処理を行ない、感染Sf9細胞にお
けるN−グリコシル化を防御した。感染細胞を4μgツ
ニカマイシンの培地で感染後0−48時間処理し、全細
胞抽出物を抗gIモノクローナル抗体を用いるウエスタ
ンブロットにより分析した。ツニカマイシン処理(図
3、レーン4)はコントロール(レーン2及び3)に比べg
Iの可動性を増加し、52及び56kDaポリペプチドが
共にN−連鎖糖を含むことを示した。この結果は自生(n
ative)gIのように未処理の組換えgIがグリコシル化さ
れたことを示す。
め、ツニカマイシン処理を行ない、感染Sf9細胞にお
けるN−グリコシル化を防御した。感染細胞を4μgツ
ニカマイシンの培地で感染後0−48時間処理し、全細
胞抽出物を抗gIモノクローナル抗体を用いるウエスタ
ンブロットにより分析した。ツニカマイシン処理(図
3、レーン4)はコントロール(レーン2及び3)に比べg
Iの可動性を増加し、52及び56kDaポリペプチドが
共にN−連鎖糖を含むことを示した。この結果は自生(n
ative)gIのように未処理の組換えgIがグリコシル化さ
れたことを示す。
【0043】Endo−H処理に続いて、52及び56kD
aバンドは50kDaの明白な分子量を有するポリペプチ
ドで置換された(図3、レーン5)。これらの結果は、組
換えgIがN−グリコシル化され、高マンノース糖を含
むことを示す。
aバンドは50kDaの明白な分子量を有するポリペプチ
ドで置換された(図3、レーン5)。これらの結果は、組
換えgIがN−グリコシル化され、高マンノース糖を含
むことを示す。
【0044】D.昆虫細胞における組換えgIの局在 発現されたgIが細胞表面に輸送されたかどうかを測定
するため、vAc−gII感染Sf9細胞をgIに対するモ
ノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光抗体染色により
試験した(図3)。全細胞免疫蛍光が組換え感染細胞中に
容易に観察された(パネルA)。細胞表面上のgIを特に
見るために、間接免疫蛍光抗体染色を固定前に細胞上で
行なった(パネルB)。vAc−gII感染細胞上の表面蛍
光は、強く且つ透過した固定細胞に観察されたものと類
似した。背景レベル免疫蛍光のみが野性型バキュロウイ
ルス AcNPVで感染した細胞又は模擬感染細胞に見
られた。これは、発現したgIが細胞表面に輸送したこ
とを示す。
するため、vAc−gII感染Sf9細胞をgIに対するモ
ノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光抗体染色により
試験した(図3)。全細胞免疫蛍光が組換え感染細胞中に
容易に観察された(パネルA)。細胞表面上のgIを特に
見るために、間接免疫蛍光抗体染色を固定前に細胞上で
行なった(パネルB)。vAc−gII感染細胞上の表面蛍
光は、強く且つ透過した固定細胞に観察されたものと類
似した。背景レベル免疫蛍光のみが野性型バキュロウイ
ルス AcNPVで感染した細胞又は模擬感染細胞に見
られた。これは、発現したgIが細胞表面に輸送したこ
とを示す。
【0045】E.中和抗体応答 Balb/Cマウスを全昆虫細胞発現gIで皮下及び腹腔内
に3回免疫した。最終予防接種3週間後、マウスは採血
した。組換えgIを接種した20匹のマウスからのプー
ルした血清を熱不活性化し、新鮮な又は熱不活性化成分
の存在下、HSV−1と反応させた。組換えgIワクチ
ン接種マウスからの抗体はHSV−1感染性を中和し
た。しかしながら、新鮮な成分の存在での中和のレベル
は熱不活性化成分の存在よりも高かった。中和抗体は模
擬(AcNPV)ワクチン接種動物では生成しなかった。
に3回免疫した。最終予防接種3週間後、マウスは採血
した。組換えgIを接種した20匹のマウスからのプー
ルした血清を熱不活性化し、新鮮な又は熱不活性化成分
の存在下、HSV−1と反応させた。組換えgIワクチ
ン接種マウスからの抗体はHSV−1感染性を中和し
た。しかしながら、新鮮な成分の存在での中和のレベル
は熱不活性化成分の存在よりも高かった。中和抗体は模
擬(AcNPV)ワクチン接種動物では生成しなかった。
【0046】F.ウイルス攻撃 ワクチン接種マウスを、最終接種3週間後、HSV−1
株McKraeの腹腔内注射(2×106PFU)により攻撃
した。以下の表Iに示すように、模擬ワクチン接種した
マウスの60%は14日以内に死亡したが、一方、発現
gIワクチン接種マウスの90%は延命した。陽性コン
トロール群ではKOSで免疫したマウスの100%が防
御した(表1)。我々の結果は、バキュロウイルス発現g
Iによる純正動物の接種はHSV−1による致死腹腔内
攻撃からマウスを防御したことを示唆する。
株McKraeの腹腔内注射(2×106PFU)により攻撃
した。以下の表Iに示すように、模擬ワクチン接種した
マウスの60%は14日以内に死亡したが、一方、発現
gIワクチン接種マウスの90%は延命した。陽性コン
トロール群ではKOSで免疫したマウスの100%が防
御した(表1)。我々の結果は、バキュロウイルス発現g
Iによる純正動物の接種はHSV−1による致死腹腔内
攻撃からマウスを防御したことを示唆する。
【0047】
【表1】 HSV−1gIを発現する組換えバキュロウイルスによるマウスの免疫 中和力価 b 免疫 生存数/合計数a 生存数% +補体 −補体 バキュロウイルス−GI 18/20 90 167 91 KOS 11/11 100 >320 >320 模擬 7/18 39 < 10 < 10 a.バキュロウイルスgI組換え−及びKOS−ワクチン
接種マウスの生存率(防御)は模擬予防接種生存率と有意
に異なる(フィッシャーの正確な試験:P=0.01)。 b.中和力価はプラク数で50%減少を生ずる希釈の逆
相乗平均として表わす。
接種マウスの生存率(防御)は模擬予防接種生存率と有意
に異なる(フィッシャーの正確な試験:P=0.01)。 b.中和力価はプラク数で50%減少を生ずる希釈の逆
相乗平均として表わす。
【0048】要するに、本発明は、バキュロウイルス発
現系におけるgIの高レベル発現を含む。この系におけ
るgIは、グリコシル化された細胞表面に輸送された。
純真なマウスに組換えgIを予防接種することによりH
SV−1に対する補体依存性及び補体非依存性中和抗体
を生成した。加えてgIをワクチン接種したマウスは致
死HSV−1攻撃を防御し、HSV−1に対する全ての
サブユニットワクチンにおいてgIを有用且つ重要な成
分とした。
現系におけるgIの高レベル発現を含む。この系におけ
るgIは、グリコシル化された細胞表面に輸送された。
純真なマウスに組換えgIを予防接種することによりH
SV−1に対する補体依存性及び補体非依存性中和抗体
を生成した。加えてgIをワクチン接種したマウスは致
死HSV−1攻撃を防御し、HSV−1に対する全ての
サブユニットワクチンにおいてgIを有用且つ重要な成
分とした。
【0049】G.gIの精製 本発明のバキュロウイルス発現gIは、細胞培養物の上
清媒体からの分泌され、先を切り取ったgIの免疫親和
性クロマトグラフィー及び収集を含むがこれらに限らな
い標準的技術によってヒトの使用のために精製しうる。
これらの方法により精製されたgIは他の生成物又は蛋
白による汚染がない。
清媒体からの分泌され、先を切り取ったgIの免疫親和
性クロマトグラフィー及び収集を含むがこれらに限らな
い標準的技術によってヒトの使用のために精製しうる。
これらの方法により精製されたgIは他の生成物又は蛋
白による汚染がない。
【0050】1.免疫親和性クロマトグラフィ gI蛋白は回転瓶中、レンズ豆レクチンクロマトグラフ
ィ、免疫親和性クロマトグラフィ及び限外濾過による濃
縮の連続的段階により精製できる。第1段階に関し、2
lの調整培地は1mM PMSF及び0.5%アプロチ
ニンを補充し、次いで、レンズ豆レクチン−セファロー
ス−4B(シグマ・ケミカル・カンパニー・セントルイ
ス・M0)の30mlカラム上に50ml/hの流速でのせる
ことができる。カラムは100mlのPBS及び0.5M
Nalを含有する100mlのPBSで続けて洗浄でき
る。結合フラクションは0.5M NaCl、0.5Mα
−メチルマンノシド、0.1%トリトンX−100及び
0.5%アプロチニンを含有するPBSで溶出し、フラ
クションは固相酵素免疫測定法(エリザ)によりgIを検
定できる。
ィ、免疫親和性クロマトグラフィ及び限外濾過による濃
縮の連続的段階により精製できる。第1段階に関し、2
lの調整培地は1mM PMSF及び0.5%アプロチ
ニンを補充し、次いで、レンズ豆レクチン−セファロー
ス−4B(シグマ・ケミカル・カンパニー・セントルイ
ス・M0)の30mlカラム上に50ml/hの流速でのせる
ことができる。カラムは100mlのPBS及び0.5M
Nalを含有する100mlのPBSで続けて洗浄でき
る。結合フラクションは0.5M NaCl、0.5Mα
−メチルマンノシド、0.1%トリトンX−100及び
0.5%アプロチニンを含有するPBSで溶出し、フラ
クションは固相酵素免疫測定法(エリザ)によりgIを検
定できる。
【0051】ピークカラムフラクションはプールし、7
0mgのウサギ抗gIポリクローナル抗体を臭化シアン活
性化セファロース4Bに連結することにより調製した1
0ml免疫親和性カラムに適用できる。gI特異的ウサギ
抗血清をgI蛋白から作り、これはHSV−1感染Vero
細胞溶解質から調製SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製した。カップリングの前に、IgG強
化フラクションを33%飽和硫酸アンモニウムによる沈
澱によりgI特異的ウサギ抗血清から調製した。レクチ
ンカラム溶出を免疫親和性カラムに適用したのち、カラ
ムは引き続いて20mlの10mMトリス塩酸塩、pH7.
5並びにSDS及びBSAの存在しない10mlのLB
で、次いで30mlの10mMトリス塩酸塩、pH7.5−
0.5MNaClで洗浄できる。結合フラクションは3M
チオシアン酸アンモニウム、pH7.5で溶出し、gI蛋
白ピークをエリザ及びウエスタン分析により検出でき
る。ピークフラクションは濃縮し、PM10膜(アミコ
ン・コーポレーション、デンバー、Mass.)を用いる限
外濾過により貯蔵緩衝液(100mM NaCl、10mM
トリス塩酸塩、pH7.5、1mM EDTA、7.5%
グリセロール)中で平衡化できる。膜表面に吸収された
蛋白を除くため、膜は0.1%トリトンX−100を加
えた貯蔵緩衝液で洗浄した。次いで、この洗浄液を初め
の濃縮フラクションと混ぜることができる。
0mgのウサギ抗gIポリクローナル抗体を臭化シアン活
性化セファロース4Bに連結することにより調製した1
0ml免疫親和性カラムに適用できる。gI特異的ウサギ
抗血清をgI蛋白から作り、これはHSV−1感染Vero
細胞溶解質から調製SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製した。カップリングの前に、IgG強
化フラクションを33%飽和硫酸アンモニウムによる沈
澱によりgI特異的ウサギ抗血清から調製した。レクチ
ンカラム溶出を免疫親和性カラムに適用したのち、カラ
ムは引き続いて20mlの10mMトリス塩酸塩、pH7.
5並びにSDS及びBSAの存在しない10mlのLB
で、次いで30mlの10mMトリス塩酸塩、pH7.5−
0.5MNaClで洗浄できる。結合フラクションは3M
チオシアン酸アンモニウム、pH7.5で溶出し、gI蛋
白ピークをエリザ及びウエスタン分析により検出でき
る。ピークフラクションは濃縮し、PM10膜(アミコ
ン・コーポレーション、デンバー、Mass.)を用いる限
外濾過により貯蔵緩衝液(100mM NaCl、10mM
トリス塩酸塩、pH7.5、1mM EDTA、7.5%
グリセロール)中で平衡化できる。膜表面に吸収された
蛋白を除くため、膜は0.1%トリトンX−100を加
えた貯蔵緩衝液で洗浄した。次いで、この洗浄液を初め
の濃縮フラクションと混ぜることができる。
【0052】2.分泌された先を切り取ったgIの収集 分泌形のgIの収集方法はこの分野で知られており、従
って、本明細書では繰り返さない。しかしながら、本質
的に、膜内外錨配列をプログラムしている断片はgI遺
伝子から切断できる。次いで、削除されたgI遺伝子を
再結合により再構築し、膜外及びC末端細胞質内ドメイ
ンをコードしている枠配列に入れることができる。生成
物は、抗gIモノクローナル抗体を伴う細胞培養の上清
媒体の免疫沈澱によるトランスフェクション後測定でき
る。
って、本明細書では繰り返さない。しかしながら、本質
的に、膜内外錨配列をプログラムしている断片はgI遺
伝子から切断できる。次いで、削除されたgI遺伝子を
再結合により再構築し、膜外及びC末端細胞質内ドメイ
ンをコードしている枠配列に入れることができる。生成
物は、抗gIモノクローナル抗体を伴う細胞培養の上清
媒体の免疫沈澱によるトランスフェクション後測定でき
る。
【0053】H.医薬組成物 本発明のgIは、製薬上許容しうる担体賦形剤と混合し
て製薬上有用な組成物を調製する既知方法により処方で
きる。適当な賦形剤やそれらの処方は、例えばイー.ダ
ブリュ.マーチンによるレミントンズ・ファーマシュー
ティカル・サイエンスズに記載される。これらの組成物
は、有効量のgIを、宿主に有効に投与するのに適した
製薬上許容しうる組成物を調製するために適当量の賦形
剤と共に含む。
て製薬上有用な組成物を調製する既知方法により処方で
きる。適当な賦形剤やそれらの処方は、例えばイー.ダ
ブリュ.マーチンによるレミントンズ・ファーマシュー
ティカル・サイエンスズに記載される。これらの組成物
は、有効量のgIを、宿主に有効に投与するのに適した
製薬上許容しうる組成物を調製するために適当量の賦形
剤と共に含む。
【0054】全く説明のためであって限定を目的とする
ものでなく、本発明による調製された非経口投与のため
の医薬製品の例を記載する。
ものでなく、本発明による調製された非経口投与のため
の医薬製品の例を記載する。
【0055】ワクチンは、単一用量バイアルの凍結バキ
ュロウイルス発現HSV−1gIとして単独、又は1又
はそれ以上のHSV−1グリコプロテイン、及びアラム
を伴う希釈剤のバイアルと組合せて与えうる。別法とし
て、ワクチンは多投与量バイアルで又はアラムを伴う希
釈剤のバイアルで与えうる。
ュロウイルス発現HSV−1gIとして単独、又は1又
はそれ以上のHSV−1グリコプロテイン、及びアラム
を伴う希釈剤のバイアルと組合せて与えうる。別法とし
て、ワクチンは多投与量バイアルで又はアラムを伴う希
釈剤のバイアルで与えうる。
【0056】記載された本発明から、これらの方法が修
飾できることは明らかであり、修飾は、本発明の精神及
び目的から逸脱せず、この分野の当業者にとって明らか
である。従って本発明は、それらに限るものとして解釈
すべきでなく、添付の請求の範囲の法的範囲に限られる
と解釈すべきことが理解される。
飾できることは明らかであり、修飾は、本発明の精神及
び目的から逸脱せず、この分野の当業者にとって明らか
である。従って本発明は、それらに限るものとして解釈
すべきでなく、添付の請求の範囲の法的範囲に限られる
と解釈すべきことが理解される。
【図1】 HSV−1gI遺伝子を含むpAc−gII組換
えバキュロウイルス転換ベクターの構築を示す。
えバキュロウイルス転換ベクターの構築を示す。
【図2】 感染昆虫細胞における発現gIのウエスタン
ブロットを示す薄膜の写真である。
ブロットを示す薄膜の写真である。
【図3】 図3a: 組換えバキュロウイルス−gI−感染
細胞、全(細胞内)蛍光を示す薄膜の写真である。
細胞、全(細胞内)蛍光を示す薄膜の写真である。
【図4】 図3b: バキュロウイルス−gI−感染細胞、
表面蛍光を示す薄膜の写真である。
表面蛍光を示す薄膜の写真である。
【図5】 図3c: 野性型−バキュロウイルス−感染細
胞、全蛍光を示す薄膜の写真である。
胞、全蛍光を示す薄膜の写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 5/10 15/38 ZNA C12P 21/00 C 8214−4B //(C12P 21/00 C12R 1:91) 8931−4B C12N 15/00 A (72)発明者 スティーブン・ルイス・ウェクスラー アメリカ合衆国91361カリフォルニア州ウ エストレイク・ビレッジ、セブンオーク ス・コート4401番 (72)発明者 ホマヨン・ギアシ アメリカ合衆国90034カリフォルニア州ロ サンジェルス、クレスト・ドライブ1904番
Claims (15)
- 【請求項1】 遺伝構成が下記を含む組換えバキュロウ
イルス a) HSV−1gIをコードする遺伝子配列又は生物学
的に活性な誘導体及び b) 該gI遺伝子配列がポリヘドリンプロモーターの調
整要素に官能的に結合するポリヘドリン遺伝子プロモー
ター配列。 - 【請求項2】 培養培地における細菌感染によりHSV
−1gIを発現しうる請求項1の組換えバキュロウイル
ス。 - 【請求項3】 請求項1又は2において特徴とする遺伝
構成を含み、それをバキュロウイルスゲノムに導入しう
る組換えバキュロウイルス置換ベクター。 - 【請求項4】 pAc−gIIである組換えバキュロウイ
ルス置換ベクター。 - 【請求項5】 請求項3又は4の組換えバキュロウイル
ス置換ベクター及び受容体バキュロウイルスを宿主細胞
に導入すること、該遺伝構成を該組換えバキュロウイル
ス置換ベクターから該受容体バキュロウイルスに置換す
ること、及び請求項1又は2のいずれか1つの組換えバ
キュロウイルスを分離することを含む請求項1又は2の
いずれか1つの組換えバキュロウイルスの製造方法。 - 【請求項6】 請求項1又は2のいずれか1つの組換え
バキュロウイルスを含み、該HSV−1gIを発現しう
る組換え昆虫細胞。 - 【請求項7】 スポドプテラ・フルギペルダから誘導さ
れる請求項5の組換え昆虫細胞。 - 【請求項8】 請求項6又は7の組換え細胞を培養する
こと及び培養物から該HSV−1gIを回収することを
含む生物学的に活性なHSV−1gIを得る方法。 - 【請求項9】 該HSV−1gIを他の生成物又は蛋白
により汚染されることなく得る請求項8の方法。 - 【請求項10】 請求項8又は9のいずれか1つの方法
で得られ、他の生成物又は蛋白のない生物学的に活性な
HSV−1gI。 - 【請求項11】 請求項10の生物学的に活性なHSV
−1gIを含むHSV感染の処置又は予防のための医薬
調製品。 - 【請求項12】 ヒト又は動物に投与するための請求項
11の医薬調製品。 - 【請求項13】 非経口的経路で投与できる請求項12
の医薬調製品。 - 【請求項14】 経口経路により投与できる請求項12
の医薬調製品。 - 【請求項15】 眼球経路により投与できる請求項12
の医薬調製品。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US85299992A | 1992-03-18 | 1992-03-18 | |
US852999 | 1992-03-18 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0698764A true JPH0698764A (ja) | 1994-04-12 |
JP2759036B2 JP2759036B2 (ja) | 1998-05-28 |
Family
ID=25314765
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5851393A Expired - Fee Related JP2759036B2 (ja) | 1992-03-18 | 1993-03-18 | 単純ヘルペスウイルス感染に対するワクチン |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0568178A1 (ja) |
JP (1) | JP2759036B2 (ja) |
AU (1) | AU664597B2 (ja) |
CA (1) | CA2090303A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0561525A1 (en) * | 1992-03-04 | 1993-09-22 | Cedars-Sinai Medical Center | Process for the expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein E and methods of use |
AU1377395A (en) * | 1993-12-23 | 1995-07-10 | University Technologies International Inc. | Methods of expressing proteins in insect cells and methods of killing insects |
US9919045B1 (en) * | 2015-07-24 | 2018-03-20 | Sigmovir Biosystems, Inc. | Herpes simplex virus vaccine compositions and methods of production and use thereof |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0561525A1 (en) * | 1992-03-04 | 1993-09-22 | Cedars-Sinai Medical Center | Process for the expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein E and methods of use |
-
1993
- 1993-02-24 CA CA 2090303 patent/CA2090303A1/en not_active Abandoned
- 1993-03-02 EP EP19930301570 patent/EP0568178A1/en not_active Withdrawn
- 1993-03-10 AU AU35127/93A patent/AU664597B2/en not_active Ceased
- 1993-03-18 JP JP5851393A patent/JP2759036B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J GEN VIROL=1988 * |
MOL CELL BIOL=1983 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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AU664597B2 (en) | 1995-11-23 |
EP0568178A1 (en) | 1993-11-03 |
AU3512793A (en) | 1993-09-23 |
CA2090303A1 (en) | 1993-09-19 |
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Found | Equine herpes virus-4 thymidine-kinase-vaccine; expression in mammal host transformant; DNA sequence; potential mono-valent, multivalent live recombinant vaccine vector |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |