KR0166585B1 - 앵커-결여 vzv 당단백질, 이를 제조하는 방법 및 이의 면역보호적 용도 - Google Patents
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Abstract
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Description
제1도는 gpI 단백질의 총 아미노산 서열과 DNA 서열.
제2도는 gpII 단백질의 총 아미노산 서열과 DNA 서열.
제3도는 gpIII 단백질의 총 아미노산 서열과 DNA 서열.
본 발명은 바리셀라-조스터(Varicella-Zoster) 바이러스 당단백질의 발현과 이런 단백질을 면역 보호적 양으로 포함하는 백신에 관한 것이다.
바리셀라-조스터 바이러스(VZV)는 수두(바리셀라) 및 대상포진(조스터) 병인제인 인간 헤르페스 바이러스이다. 바리셀라는, 비교적 양성인 어린시절동안에 보통 걸리는 초기 또는 제1감염으로부터 초래된다. 그러나, 어린시절동안 바리셀라에 노출되지 않았던 성인에 있어서 VZV는 생명을 위협할 수 있으며, 때로는, 면역된 개인에 있어서도 생명을 위협할 수 있다. 유사하게 VZV 감염은 방이러스가 태반을 가로지를 수 있기 때문에 신생아에 대해 생명을 위협할 수 있다. 직접적인 접촉으로, 바리셀라는 고도의 전염성인 감염성 질병으로 알려져 있다.
대부분의 헤르페스-바이러스와 같이, VZV는 성장이 정지된 일부 세포를 감염시키는 경향이 있다. 다양한 잠복 기간 후에, 바리셀라-조스터(VZ) 바이러스는 다른 세포에서 감염을 개시하기 위해 방출될 수 있다. VZ 바이러스의 이런 재활성화(reactivation)는 해마다 대략 5백만의 조스터 환자를 야기한다(플로트킨 일동(Plotkin et., al.), Postgrad Med I 61 : 155-63(1985)). 조스터는 뇌 신경절 및 말초 신경의 염증을 특징으로 하며, 심한 고통과도 관련된다. 현재, 바이러스를 재활성화시키는 인자는 잘 규명되지 않았다.
VZV의 약해진 균주로 백신화된 인간이 VZV 감염으로부터 보호적 면역을 받는다고 알려졌다. (알베터 일동(Arbeter et al.), J. Pediatr 100 996-93(1982) 및 부르넬 일동(Brunell et al.), Lancetii : 1069-72(1982)) 이 방법은 효과적이기는 하나, 바리셀라-조스터 바이러스를 번식시키는데 어려움이 따르기 때문에 제한을 받는다. VZ 바이러스의 항원 성분들을 확인하기 위해 상당한 노력이 있어왔다. 개선된 VZ 백신, 특히 서브유닛(subunit) 백신을 개발하기 위해서, VZV 엔벨로프 (envelope) 단백질을 단리(isolation)시키는 것이 중요하다. 포르가니 일동(Forghani et al., J Virol, 52 : 55-62(1984), 오쿠노 일동(Okuno et al., Virol, 129 P 357-68(1983)) 및 켈러일동(Keller et al., J Virol, 52 : 293-7(1984))은 VZV-감염 세포 및 VZ 비리온으로부터 많은 바이러스-특히 당단백질을 확인했다.
별도이기는 하나, 관련된 연구에서, VZV 게놈은 제한 엔도뉴클레아제 분석에 의해 설명된다. 11개의 제한 엔도뉴클레아제에 대한 VZV DNA의 실제 지도 및 클로닝된 DNA 단편이 결정되었다..(엑커 일동(Ecker et al.), Proc Natl Acad Sci USA 79 : 156-160(1982)), 스트라우스 일동(Straus et al.), Proc Natl Acad Sci USA 79 : 993-7(1982)), 스트라우스 일동 J Gen Virol 64 : 1031-41(1983) 및 데이비슨 일동(Davison et al.) J Gen Virol 64 : 1811-1814(1983) 참조).
이런 연구의 결과로서, VZV에 대한 과학적인 지식이 확산되었다. 게다가, 명명법도 동반하여 확산되었다. 데이비슨 일동(J Virol 57 : 1195-7(1986))은 VZV 당 단백질 유전자 및 그 유전자 생성물의 명명법을 표준화하기 위해 워크샵을 열었다. 세 개의 가장 풍부한 엔벨로프 유전자 생성물을 그 양이 줄어드는 순서로 기록하여, gpI, gpII, gpIII로 표시한다. 이런 세가지 모든 당단백질, gpI 내지 gpIII는 시험관내에서 중화 항체를 유도하는 것으로 입증되었다.
VZV의 전체 뉴클레오타이드 서열은 얼마 안 있어 데이비슨 일동(J Gen Virol, 67 : 1579-1816, (1986))에 의해 공개되었다. 이는 다양한 당단백질 유전자의 확인을 가능케하여 다양한 바이러스 당 단백질의 전구체-생성물관계를 명확히 밝히는 것을 도와주었다. 다른 헤르페스바이러스와 같이, VZV 게놈도 꽤 복잡하다. 이것은 70개의 오픈 리딩 프레임(open reading frames : ORFs)을 함유하는데, 이는 gpI, gpII, gpIII, gpIV 및 gpV으로 표시되는 5개의 가능한 당백질 유전자를 코팅한다. 추론되는 아미노산 서열에 기초하여, 이것들은 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV-1)당 단백질 gE, gB, gH, gI 및 gC 각각에 대해 다양한 정도의 상동성을 갖는다. (데이비슨 일동, Id, 및 롱넥커 일동(Longnecker et al.)의 Proc Netl Acad Sci USA 84 : 4303-4307(1987)). VZV와 HSV-1 당단백질간의 아미노산 상동성이 기능적관계를 보이는지 여부는 알려져있지 않다. 상당한 자료가 HSV-1 당단백질 기능에 유용한 반면, VZV 당단백질 기능에 대해서는 제한된 연구만이 존재한다. 이런 연구들은 바이러스 중화에 관련된 당단백질에 일차적으로 집중된다.(데이비슨 일동, supra 켈러 일동, supra 및 바파이 일동(Vafai et al.), J Virol 52 : 953-9(1984))
엘리스 일동(Ellis et al., 미합중국 특허 제 4,769,239호)은 VZV mRNA로부터 두 개의 gpI 코딩 서열을 단리하는 것을 공개하고 있다. 엘리스 일동은 아미노 말단부 끝에서 발견된 부가적인 38개 코돈과 gpI를 함유하는 폴리펩티드의 서열을 공개하고 있다. 엘리스 일동은 또한 gpI의 300개 아미노산 단편을 코딩하는 분자를 공개하는 반면, 천연 gpI은 623개 아미노산을 갖는다.
엘리스 일동(J Virol, 53 : 81-88(1985))은 gpI유전자의 지도를 만드는 두가지 방법을 공개하고 있다. 랜덤하게 소화(digestion)된 VZV DNA의 작은 단편들을 세균 벡터에 삽입한다. 이렇게 벡터 라이브러리(library)에 의해 형질전환된 세균 콜로니를 gpI/lacZ 융합물로서 gpI의 항원 발현 여부를 스크리닝한다. 이런 교잡 단백질은 gpI에 대한 모노클로날 항체(mAb)에 의해 인식된다. 또한, VZV-감염 세포로부터의 mRNA는 한 세트의 VZV 재조합체 플라스미드에 의해 선택된 교잡이므로 시험관내에서 해독된다. 결과 형성된 생성물은 gpI에 대한 회복기 환자의 조스터 혈청에 의해 면역 침전된다.
엘리스 일동(미합중국 특허 제 4,686,101호 및 미합중국 특허 제 4,812,559호)은 gpII VZV 서열을 공개한다. 엘리스 일동은 또한 VZ 바이러스로 감염된 MRC-5 인간의 이배체 섬유아세포로부터 gpII의 정제를 공개하고 있다. 또한, 정제된 VZV gpII는 시험관내에서 시험되는 경우 중화하는 기니아 피그내 항체를 유도해냈다.
켈러 일동(Virology, 152 : 181-191(1986))은 숙성 gpII가 숙주 세포에서 생체내 단백질 분해에 의해 생겨나는 이황화물-연결된 이중이량체(heterodimer)라고 제안한다.
켈러 일동(EP-A-244,155)은 gpIII를 코딩하는 DNA 단편, 및 VZ 바이러스로 감염된 인간 이배체 섬유 아세포로부터의 gpIII의 정제를 공개하고 있다. gpIII에 대한 항혈청은 시험관내 VZV를 중화시키는 것으로 보여졌다.
그러나, 상기 언급된 참고물 중 어떤것도 임상적으로 유용한 양으로 VZV 당단백질을 생산하는 방법을 기술하거나 제안하고 있지 않다. 이리하여, 대안적인 발현 시스템을 개발시키기 위하여 노력해왔다. 카브리액 일동(Cabriac et al., Virus Res 10 : 205-14(1988))은 재조합체 바이러스-감염 세포의 막 위에 국재된 재조합체 백시니아 바이러스 발현 gpI를 공개하고 있다. 그러나, 카브리액 일동은 쉽게 정제될 수 있는 gpI를 생산하는 방법을 공개하지 않고 있다.
디노세라 일동(DiNocera et al., Proc Natl Acad Sci USA, 80 : 70958(1983))은 배양된 드로조필라(Drosophila) 세포내 외래 유전자의 일시적 발현을 공개하고 있다. 공개된 재조합체 프라스미드는 드로조필라 열 충격 단백질 70 (hsp 70) 또는 코피아 (CoPia) 프로모터의 통제 하에 있다.
보러이스 일동(Bourouis et al., Embo J, 2 : 1099-1104(1983))은 외래 유전자를 배양된 드로조필라 세포에 삽입하는 것을 공개하고 있다.
배큘로바이러스(baculovirus)발현 시스템에서, 강력하고 일시적으로 조절된 프로모터는 일부 이종 유전자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 스미드 일동(Smith et al., 미합중국 특허 제 4,745,051 호) 및 메트슈라 일동(Matsuura et al., J Gen Virol, 68 : 1233-50(1987))은 특정한 원핵 및 진핵 생물 유전자를 발현시키기 위해 폴리헤드린 유전자 프로모터를 함유하는 배큘로 바이러스 벡터를 공개하고 있다.
프라저 일동(Frazer et al., PCT/WO88/07282)은 교합체(occlusion body)를 형성하는 폴리헤드린 융합 단백질을 기술하고 있다. 폴리헤드린-인플루엔자융합 단백질은 인플루엔자 비리온에 대한 항체에 의해 인식되는 헤마글루티닌(hemagglutinin) 단백질의 에피토프를 발현하는 것으로 보여졌다.
밀러 일동(Miller et al., PCT/WO88/02030)은 적어도 두 개의 유전적으로 뚜렷한 배큘로바이러스들의 혼합물을 사용함으로써 이종 유전자를 생산하는 방법을 기술하고 있다.
또한, 재조합체 배큘로바이러스 감염 곤충 세포로부터 유도된 특정 바이러스 항원은 그 천연 대응물과 항원적 및 면역원적으로 유사한 것으로 보여졌다. 코크란 일동(Cochrane et al., EP-A-265,785) 및 루쉐 일동(Rusche et al., EP-A-272,858)은 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 엔벨로프 당단백질, gp120 및 gp 160의 클로닝 및 발현을 공개하고 있다.
코크란 일동(EP-A-228.036)은 재조합체 배큘로 바이러스 내에서의 백신 성장 인자(VGF)의 발현을 공개하고 있다. 또한, 코크란 일동은 헤파티티스 B 표면 항원 및 플라스 모듐(Plasmodium) 폴리펩티드를 포함하는 재조합체 배큘로바이러스안에서 발현될 수 있는 단백질 가설 목록을 제안한다. 비숍 일동(Bishop et al., EP-A-260,090) 및 타케하라 일동(Takehara et al., J Gen Virol, 69 : 2763-77(1988))은 배큘로바이러스 내에서 헤파티티스 B 표면 항원의 발현을 공개하고 있다.
에스테스 일동(Estes et al. EP-A-273,366)은 배큘로바이러스 시스템 내에서의 로타바이러스(rotavirus)유전자의 발현을 공개한다. 자콥스 일동(Jacobs et al., 미합중국 특허 출원 일련 번호 : 제 07/287934 및 PCT/US 89/0550)은 배큘로바이러스 시스템 내에서의 플라스모듐 설쿰 스포로조이트(Plasmodium Circumsporozoite) 단백질의 발현을 공개하고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 곤충 세포에서 발현된 항원 당단백질로 구성된, 개선된 바리셀라-조스터 백신을 제공한다.
또 다른면에서 본 발명은 곤충 숙주 세포안에서 기능하는 조절 지역에 조작가능하게 연결된, 바리셀라-조스터 바이러스 당단백질을 코딩하는, DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자 또는 벡터이다.
또 다른 면에서, 본 발명은 곤충세포 안에서 상기 DNA 서열을 발현시켜 단백질 산물을 회수하는 것을 포함하는, 바리셀라-조스터 바이러스 당단백질을 제조하는 방법이다.
관련된 측면에서, 본 발명은 재조합체 DNA 분자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스, 및 재조합 배큘로바이러스로 감염된 곤충 숙주 세포이다.
또 다른 관련된 측면에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산된 바리셀라-조스터 바이러스 당단백질 ; 면역보호 양의 상기 당단백질을 포함하는 백신; 백신에서 사용하기 위한 상기 당단백질 ; 및 백신의 제조를 위한 상기 당단백질의 사용이다.
본 발명은 또한 안전한 유효량의 백신을 투여하는 것으로 이루어지는, 바리셀라-조스터 바이러스 감염에 대해 인간을 보호하기 위한 방법에 관련된다.
본 발명은 또한 앵커(anchor)-결여 gpI 앵커-결여 gpII 또는 앵커-결여 gpIII로 구성된 바리셀라-조스터 당단백질로부터 단백질을 제공한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 상기 앵커-결여 당단백질을 코딩하는 DNA 서열; 숙주 세포 안에서 상기 DNA 서열을 발현할 수 있는 복제가능한 발현 벡터; 상기 복제가능한 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포; 면역 보호 양의 상기 앵커-결여 당단백질을 포함하는 백신; 안전한 유효량의 상기 백신을 투여하는 것으로 이루어지는, 바리셀라-조스터 바이러스 감염에 대해 인간을 보호하는 방법; 백신의 제조를 위한 상기 앵커-결여 당단백질의 사용 및 백신에서 사용하기 위한 상기 앵커-결여 당단백질을 제공한다.
완전한 바리셀라-조스터 바이러스(VZV) 뉴클레오티드 서열은 데이비슨 일동, J Gen Virol, 67-1759-1816(1986)에 의해 공개된다. VZV 당단백질(gp) I, II 및 III의 DNA 서열 및 추론되는 아미노산 서열은 도면에 기술되어 있다.
첫 번재 ATG는 N-말단 메티오닌을 코딩하고 마지막 코돈, TGA 또는 TAA는 해독 종결(즉, 중지)신호이다.
본원에서 사용되는 용어 'gpI', 'gpII', 'gpIII'는 도면에 예시한 바와 같은 바리셀라-조스터 바이러스의 완전한 길이 막 당단백질 및 앵커-결여 변종을 포함하는 이들의 모든 면역원성 유도체 둘다를 포함한다. 용어 '면역원성 유도체'는 인간에 내부 투여시 VZV에 대한 면역 반응을 유도하는 능력을 보유하는, 끝이 잘린 VZV 당단백질같은 임의 분자 또는 기타 유도체를 망라한다. 상기 다른 유도체는 아미노산의 첨가, 삭제, 치환 또는 재배열 또는, 이의 화학적 변이에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 VZV 당단백질은 완전한 길이 VZV 당단백질, 또는 이후 더 자세히 논의되는, 카르복시 종결 말단에서 총 아미노산 잔기의 4-20%를 결실한 앵커-결여 당단백질 유도체를 포함하는 이의 유도체를 포함한다.
예로써, 본 발명에서 사용되는 gpI는 도면에 예시된 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질과 실질적으로 동일(즉, 기껏해야 10개 이하의 아미노산이 다름)하거나, 카르복시 말단 앵커 영역이 부족(대략 아미노산 547-623)한 단백질이다. 유사하게, 본 발명의 gpII 및 gpIII도 도면에 예시된 것과 실질적으로 동일하거나, 아미노산 699-868(gpII) 및 803-841(gpIII)이 각각 부족한 것들이다. 바람직한 당단백질은 gpII 1-698이다.
본 발명의 면역원성 유도체는 교잡(hybrid)일 수 있다. 즉, 다른 VZV당단백질 예컨대, gpI-gpII, gpI-gpIII, gpII-gpIII 또는 gpI-gpII-gpIII, 다른 VZV 항원 또는 다른 비-VZV 항원으로부터 하나이상의 에피토프를 운반할 수 있는 부가적인 서열을 함유하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 면역원성 유도체는 보조제의 경우에서와 같이 면역자극 성질을 갖거나, 그렇지 않으면 VZV 당단백질에 대한 면역반응을 증가시키거나, VZV 당단백질을 발현, 정제 또는 배합시키는데 유용한 캐리어 폴리펩티드로 융합될 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 상기 당단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현시키고, 당단백질 생성물을 회수시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따르는 앵커-결여 VZV 당단백질 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 마니아티스 일동(Maniatis et al.)의 분자 클로닝-실험실 매뉴얼(Molecular Cloning-Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 및 DNA Cloning vols I, II 및 III(D.M. Glover ed., IRL Press Ltd))에 기술된 것과 같은 통상적인 재조합 기술에 의해 수행될 수 있다.
상기 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자는 공지 기술(예컨대, mRNA 주형으로부터의 상보성 또는 cDNAs를 제조)을 사용하여 VZV mRNA로부터 유도되거나 VZV 게놈 DNA로부터 단리될 수 있다. 엑커 일동(Ecker et al.)의 Proc Natl Acad Sci USA 79 : 156-160(1982), 스트라우스 일동의 Proc Natl Acad Sci USA 79 : 993-7(1982), 스트라우스 일동의 J Gen Virol 64 : 1031-41(1983) 및 데이비슨 일동의 J Gen Virol 64 : 1811-1814(1983) 참고하라. 대안적으로, gpI, gpII 및 gpIII를 코딩하는 DNA 분자는 표준 DNA 합성기술로 합성될 수 있다.
이리하여, 본 발명은 적절한 모노, 디- 또는 올리고머 뉴클레오티드 단위의 축합에 의한 DNA 서열 제조방법을 제공한다.
제조는 화학적으로, 효소적으로 또는 두가지 방법을 조합하여 시험관내 또는 생체내에서 적절하게 수행될 수 있다. 즉, DNA 서열은 Biochemistry 1985, 24, 5090-5098 내 디.엠. 로버트 일동(D.M.roberts et al.)에 의해 기술된 것과 같은 통상적인 방법에 의해, 적절한 DNA 단편의 효소적 연결로 제조될 수 있다. DNA 단편은 적절한 제한 효소로 원하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA를 소화시킴으로써 화학 합성으로써, 효소중합으로써, 또는 이들 방법을 조합함으로써 얻을 수 있다.
제한 효소로의 소화는 20℃ - 70℃에서 적절한 완충액, 대개 0.1-10μg DNA를 가진 50μl이하의 부피 내에서 수행될 수 있다.
DNA의 효소 중합은 요구되는 10℃-37℃에서 뉴클레오시드 트리포스 페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 함유하는 적절한 완충액, 대개 50ml이하의 부피 내에서 DNA 폴리머라제 I(클레나우 단편) 같은 DNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다.
DNA 단편의 효소적 연결은 4℃내지 주변온도에서 적절한 완충액, 대개 50μl 이하의 부피 내에서 T4 DNA 리가아제 같은 DNA 리가아제를 사용하여 수행할 수 있다.
DNA 서열 또는 단편의 화학적 합성은 '유전자 단편의 화학 및 효소 합성-실험실 매뉴얼(Chemical 뭉 Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual' (ed. H. G. gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim(1982)에 또는 다른 과학 발행물 [예컨대, M. J. Gait, H.W.D Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, 및 R.C.Titmas Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B. S. Sproat 및 W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 21, 719; M.D. Matteucci 및 M.H Caruthers Tetrahedron Letters, 1980, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci 및 M. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S. P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus 및 H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4639; 및 H.W.D Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801]에 기술된 것과 같은 고체상 기술을 사용하여 통상적인 포스포트리에스터, 포스파이트 또는 포스포아미다이트 화학에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 자동화 DNA 합성기가 사용된다.
DNA 서열은 당단백질을 코딩하는 DNA 서열로 함께 포함하는, 두 개이상의 DNA 분자를 연결시켜서 바람직하게 제조된다.
DNA 분자는 요구되는 코딩 서열을 나르는 벡터를 적절한 제한 효소로 소화시켜 얻을 수 있다.
DNA 분자의 정확한 구조와 이들을 얻는 방식은 원하는 당단백질 생성물의 구조에 의존한다. 당단백질을 코딩하는 DNA 분자 구성을 위한 적절한 전략의 고안은 당분야의 기술자들에게는 일상적인 문제이다. 재조합 숙주 세포에서 앵커-결여 당단백질을 코딩하는 DNA 서열의 발현은 숙주세포에서, DNA 서열을 발현시킬 수 있는 복제가능한 발현 벡터에 의해 수행될 수 있다.
복제가능한 발현 벡터는 본 발명에 따라, 숙주 세포에 적합한 벡터를 절단하여 완전한 레프리콘을 갖는 선형 DNA 부분을 제공하고, 상기 선형 부분과 함께 연결 조건 하에서 앵커-결여 당단백질을 코딩하는 하나이상의 DNA 분자와 상기 선형 부분을 결합시켜 제조할 수 있다.
선형 부분 및 하나이상의 DNA 분자의 연결은 원하는 바에 따라, 동시에 또는 순차적으로 수행할 수 있다.
즉, DNA 서열은 원하는 바에 따라, 벡터의 작제 동안 예비형성 또는 형성될 수 있다.
벡터의 선택은 부분적으로는 숙주의 종류에 따라 결정될 것이다. 숙주는 이 콜라이 또는 스트렙토마이세스와 같은 원핵 세포(단, 이들예에 제한되지는 않는다.)이거나 또는 생쥐 C127, 생쥐 골수종, 헬라, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO), BHK, HaK, COS, 효모(예컨데, 피치아 파스토리스, S. 세레비시에 및 한세눌라 sp) 및 곤충세포와 같은 진핵 세포(단, 이들예에 제한되지는 않는다.)일수 있다. 바람직하게, 숙주세포는 포유동물 또는 곤충원이다 보다 구체적으로, 본 발명의 바람직한 숙주세포는 CHO, 레피도프테라 또는 드로조필라 세포이다. 본 발명의 숙주 세포로 적당한 벡터는, 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 및 재조합 바이러스로서, 이 중 재조합 바이러스는 예컨대, 백시니아 같은 배큘로바이러스 및 폭스바이러스로부터 유도된다.
복제가능한 발현 벡터의 제조는 예컨대, 앞서 인용된 마니아티스 일동에 기술된 방법에 의해, 제한, 중합 및 DNA의 연결을 위한 적절한 효소에 의해 통상적으로 수행될 수 있다. 제한 효소로의 소화는 20℃-70℃에서 적절한 완충액, 0.1-10μg DNA를 가진 대개 50μl 이하의 부피 내에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따라, 형질전환 조건 하에 본 발명의 복제가능한 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환하여 재조합 숙주 세포를 제조한다. 적절한 형질전환 조건은 통상적인 것이고, 예컨대, 앞서 인용된 마니아티스 일동에 또는, DNA Cloning Vol. II. D. M, Glover ed., IRL Press Ltd, 1985에 기술된다. 형질전환 조건의 선택은 숙주세포에 의해 결정된다. 그래서, 이 콜라이 같은 세균성 숙주는 CaCl2용액(코헨 일동(Cohen et al., Proc. Nat. Acad.Sci., 1973, 69, 2110) 또는 RbCl,MnCl2, 아세트산칼륨 및 글리세롤의 혼합물을 포함하는 용액으로 처리되고 나서, 3-[N-모르폴리노]-프로판-설폰산, RbCl 및 글리세롤로 처리될 수 있다. 배양물 내 포유동물 세포는 세포상으로의 벡터 DNA의 칼슘 공침에 의해 형질전환될 수 있다.
DNA 서열의 발현을 허용하는 조건 하에 형질전환된 숙주 세포의 배양은 예컨대, 앞서 인용된 마니아티스 일동 및 DNA Ccloning에 기술된 바와 같이 통상적으로 수행된다. 즉, 바람직하게 세포에 영양원을 공급하고, 45℃ 이하에서 배양한다.
앵커-결여 당단백질 발현 생성물은 숙주 세포에 따라 통상적인 방법에 의해 회수된다. 즉, 숙주 세포가 이 콜라이 같은 세균성일 때는, 이는 물리적, 화학적 또는 효소적으로 용균될 수 있고, 단백질 생성물은 결과 용균물로부터 단리된다. 숙주세포가 포유동물성일 경우, 생성물은 대개 영양원 매질로부터 단리될 수 있다.
DNA 서열은 앵커-결여 당단백질을 발현시키는, 안정한 형질전환된 포유동물 세포주의 단리를 위해 고안된 벡터 ; 예컨대, 소 파필로마바이러스 벡터 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포내 증폭된 벡터로 어셈블링될 수 있다.(DNA cloning Vol, II D. M. Glover ed. IRL Press 1985; Kaufman. R. J. et al., Molecular and Cellular biology 5, 1750-1759, 1985; Pavlakis G.N. and Hamer, D.H., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 80, 397-401, 1983; Goeddel, D, V, et al., European Patent Application No. 0093619, 1983).
다양한 곤충 세포 및 발현 시스템도 또한 이종 단백질의 발현에 대해 유용하다. 곤충 숙주는 전형적으로 드로조필라(Drosophila) 및 레피도프테라 세포를 포함한다. 대개, 이들 시스템은 조절 요소 (regulatory element)의 통제하에, 관심있는 유전자 및 선택가능한 마아커에 대한 코딩 서열을 포함하는 재조함 DNA 분자를 사용한다. 조절 요소는 전사 또는 해독을 위해 필요하거나 바람직한 기능을 포함하는 DNA 영역(들)이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 곤충 세포는 드로조필라 S1, S2, S3, KC-0 및 디이. 하이데이(D. hydei)세포를 포함한다. 예컨대, 스네이더(Schneider)일행의 J Embryol Exp Morph, 27 : 353(1972); 술츠(Schultz) 일행의 Proc Natl Acad Sci USA, 183 : 9428(1986); 신클라이르(Sinclair) 일행의 Mol Cell Biol, 5 : 3208(1985)을 보라. 드로조필라 세포는 인산 칼슘 침전, 일렉트로포레이션(electropration) 및 바이러스성 트랜스펙션(transfection)을 포함하는 표준 기술에 의해 트랜스펙션된다. 세포는 예컨대 균형적인 염 및 필수 아미노산으로 구성되는 M3 매질을 포함하는 다양한 영양 매질 내에서 표준 세포 배양 과정에 따라 배양된다. 린드퀴스트(Lindquist) 일행의 DIS(Drosophila Information Services), 58 : 163(1982)를 보라.
드로조필라에서 유용한 것으로 알려진 프로모터는 포유동물 세포 프로모터 및 드로조필라 프로모터를 포함하고, 드로조필라 프로모터가 바람직한다. 유용한 드로조필라 프로모터의 예는 드로조필라 메탈로티오네인 프로모터, 70 킬로달톤 열충격 단백질 프로모터(HSP70) 및 COPIA LTR을 포함한다. 예컨대, 디노세라(DiNocera)일행의 Proc Natl Acad Sci USA, 80 : 7095(1983); 맥가리(McGarry) 일행의 Cell, 42 : 903(1985); 조한센(Johansen) 일행의 유럽 특허 출원 제 88 30493.3호(EP-A-290261)를 보라.
본 발명의 실시양태에서, VZV 당단백질은 면역원성 단백질을 제조하기 위해 레피도프테라(Lepidoptera)세포에서 발현된다. 레피도프테라 세포내의 VZV 당단백질을 발현하기 위해, 배큘로바이러스 발현계의 사용이 바람직하다. 그러한 계에서, 배큘로마이러스 프로모터로 조작가능하게 연결된(즉, 조절하에서 VZV 단백질 코딩 서열을 포함하는 발현 카셋트는 전형적으로 셔틀 벡터 내로 놓여진다. 그러한 벡터는 이 콜라이(E. Coli) 또는 몇몇 다른 적절한 원핵 숙주 내에서 셔틀 벡터를 증폭시키기에 충분한 양의 세균 DNA를 포함한다. 그러한 셔틀 벡터는 또는 야생형 배큘로바이러스 및 이종성 유전자간의 재조합을 허용하도록 VZV 당단백질 코딩 서열을 플랭킹하는 충분한 양의 배큘로바이러스 DNA를 포함한다. 그리고 나서 재조합 벡터는 야생형 배큘로바이러스로부터 DNA를 가지는 래피도프레라 세포로 코트랜스펙팅(contransfect)된다. 그리고나서 동종 재조합으로부터 생긴 재조합 배큘로바이러스가 선택되고 플라크는 표준 기술에 의해 정제된다. 스미스(Smith) 일행의 TAES Bull(Texas Agricultural Experimental Station Bulletion) NR 1555, 5, 1987 참조.
레피도프테라(Lepidoptera)세포에 사용하기 위한 프로모터는 배큘로바이러스 게놈으로부터 얻은 프로모터를 포함한다. 폴리헤드린 유전자의 프로모토는, 폴리헤드린 단백질이 다른 배큘로바이러스 단백질에 비해 자연적으로 과발현되기 때문에 바람직하다. 바람직한 폴리헤드린 유전자 프로모터는 AcMNPV 배큘로바이러스이다. 스미스 일행의 미합중국 특허 제 4,4745,051호; 스미스 일행의 Proc Natl Acad Sci USA, 82 : 8404(1985); 및 코크란의 EP-A-228,036을 보라.
유용한 레피도프테라 세포는 트리코폴루시아 니(Trichoplusia ni), 스포 도프테레 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 헬리오티스 제아(Heliothis Zea), 오우토그래피아 칼리포리니카(Autographica californica), 라치플루시아오르(Rachiplusia or) 갈레리아 멜로넬라(Galleria melonella), 만두카 섹스타(Manduca Sexta)로부터의 세포 또는 배큘로바이러스로 감염될 수 있는 다른 세포를 포함한다. 이들은 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(NPV), 싱글 뉴클레오캡시드 바이러스(SNPV) 및 멀티플 뉴클레오캡시드 바이러스(MNPN)를 포함한다. 배큘로바이러스는 감염된 세포내에서 고도로 발현되는 폴리헤드린 유전자 프로모터를 함유하기 때문에 바람직한 배큘로바이러스는 NPV 또는 MNPV 배큘로바이러스이다. 오우토그래피카 칼리포르니아(AcMNPV)로부터의 MNPV 바이러스는 하기에서 특별하게 예증화된다. 그러나, 다른 MNPV 및 NPV 바이러스도 또한 누에 바이러스, 봄비스 모리(Bombyx mori) 같이 사용될 수 있다. 레피도프테라 세포는 표준 트랜스펙션 기술에 따라서 본 발명의 재조합 배큘로바이러스로 트랜스펙션된다. 이들은 인산 칼슘 침전, 일렉트로포레이션 및 리포좀-중재 트랜스퍼를 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 세포는, 예컨대 10% 태아 송아지 혈청(FCS)으로 보족되고 27℃-28℃에서 18-24시간 동안 생장시킨 TC100(Gibco Europe : 가르디너(Gardiner) 일행의 J. Invert path, 25 : 363(1975)를 포함하는 다양한 영양 매질에서 표준 세포 배양 기술에 따라 배양된다. 대안적으로, 곤충 세포 성장을 보조하는 혈청-유리 매질은 마이오렐라(Maiorella)일행(Bio/Technology, 6 : 1406-1401(1988) 또는 PCT/wo89-01028)에 의해 기술된다. 재조합 바이러스-코딩 생성물의 탁월한 수율은 1내지 1.2×106세포/ml 밀도에서 활발히 성장하는 배양의 감염으로 얻어진다. 밀러 일행의 in Setlow 및 Holander(eds.), Genetic Engineering : Principle of Methods, Vol 8, p 277-98, Plenum publishing Co., New York, 1986을 보라, 무르하머(Murhammer)일행의 (Bio/Technology) 6 : 1411-1418(1988) (또는 PCT/WO89/-1029).
세포 배양물로부터 VZV 당단백질의 정제는 통상적인 단백질 단리 기술, 예컨대 선택적 침전, 흡수 크로마토그래피, 및 하기된 모노클로날 항체 친화력(affinity) 칼럼을 포함하는 친화력 크로마토그래피에 의해 수행된다.
곤충 세포에서 제조는 곤충 유충을 감염시킴에 의해서도 수행될 수 있다. 예컨대, VZV 당단백질은, 미량의 야생형 배큘로바이러스와 함게 본 발명의 재조함 배큘로바이러스를 공급시키고 나서, 약 2일 후에 헤모림프로부터 단백질을 추출시킴에 의해 헬리오티스 비레스센스(Heliothis virescens) 카테르 필라에서 제조될 수 있다.
덧붙여서, 교합체를 형성할 수 있는 융합 폴리헤드린 단백질의 제조는 프라저(Frazer) 일행의 PCT/WO88/07082에 의해 공개된다.
본 발명의 또한 본 발명에 따르는 VZV 당단백질(들)의 면역 보호양을 함유하는 백신에 관한 것이다. 용어 면역보호는 사람에게 투여될 때, 질병을 피하거나 완화시키기에 충분한 후속 VZV 감염에 대한 보호 항체 또는 면역 반응을 유발시키는 VZV 당단백질(들)의 충분한 양을 말한다.
본 발명의 백신에서, VZV 당단백질(들)의 수용액이 직접 사용될 수 있다. 대안적으로 선행의 동결건조가 있거나 없는 VZV 당단백질(들)은 함께 혼합되거나 공지된 다양한 보조제와 함께 혼합될 수 있다. 그러한 보조제는 수산화 알루미늄, 무라밀 디펩타이드 및 사포닌, 예컨대 Quil A를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또 다른 예증적인 대안으로, 단백질은 리포좀 같은 미소입자 내에서 캡슐화될 수 있다. 또 다른 예증적인 대안에서, VZV 당단백질(들)은 죽은 보르데텔라(Bordetella) 또는 파상풍 유독소 같은 면역자극 거대분자에 접합될 수 있다.
백신 제조는 불러(Voller) 일행의 New Trends and Development in Vaccines(eds.), 미합중국 메릴랜드주 발티모아시 파아크 프레스 유니버시티 1978에서 일반적으로 기술된다. 리포좀 내의 캡슐화는 풀레르톤(Fullerton)의 미합중국 특허 제 4,235,877호에 의해 기술된다. 거대 분자에의 단백질 접합은 예컨대 리크하이트(Likhite)의 미합중국 특허 제 4,372,954 호 및 아르모르(Armor) 일행의 미합중국 특허 제 4,474,757호에서 기술된다. Quil A의 사용은 달스가아드(Dalsgard) 일행의 Acta Vet Scand., 18 : 349(1977)에 의해 공개된다.
하기 실시예는 본 발명을 예증하나 본 발명을 제한하지는 않는다. 제한 효소 및 다른 시약은 대체로 벤더의 지시에 따라 사용되었다.
[실시예]
[벡터 구성]
A) 앵커-결여 gpI : 플라스미드 pNIV2011
VZV 게놈 DNA를 바리셀라(Professor Rentier, Institut de Pathologie, Universite de Liege, Sart Tilman, Liege Belgium)로부터 고통받는 환자로부터 단리시켰다. 바이러스 DNA를 BamHI로 소화시키고 염기 114,042-118,004에 상응하는 4킬로염기쌍 단편(다비손(Davison) 일행의 J Gen Virol, 67 : 1759-1816(1986) 참조)을 단리시켰다. 플라스미드 pNIV2005를 만들기 위해 표준 이 콜라이 클로닝 벡터를 플라스미드 pUC9의 BamHI 부위로 클로닝시켰다. 플라스미드 pNIV2005은 잠정적인 시그날 서열을 포함하는 623 아미노산의 전체 VZV gpI 단백질에 덧붙여서 5' 및 3' 해독되지 않은 DNA를 코딩 한다.
플라스미드 pNIV2001를 만들기 위해 pNIV2005로부터의 1965 염기쌍 BglI-BclI 단편을 DNA 폴리머라제 I(즉, 클레나우)로 블런트-말단으로 되게 하고, 본원에서 TigND로 언급되는 전형적인 셔틀 벡터의 블런트-말단 HindIII-BclI 부위로 클로닝시켰다.
플라스미드 TigND는 플라스미드 TND의 유도체이다.(콘노르(Connors)일행의 DNA, 7 : 651-666 (1988)). 플라스미드 TigND는 라우스 LTR이 생쥐 감마 2b 헤비 사슬 면역글로빈 인핸서 서열에 의해 대체된다는 점에서 플라스미드 TND와 다르다.
5' 해독되지 않은 DNA를 제거하기 위해, pNIV2001을 NspIII, BgIII 및 PpumI로 소화시켰다. 두개의 단편, 532 염기쌍(bp) NspIII(블런트-말단)-BgIII, 및 7,187 bp BglIII-PpumI 단편을 단리시켰다. 이들 단편을 플라스미드 pNIV2002를 만들기 위해 플라스미드 TigND로부터의 741 bp PpumI-HindIII(블런트-말단)로 연결시켰다. pNIV2002에서, HindIII 부위는 ATG의 다시만들어진 56 염기쌍 업스트림이다.
플라스미드 pNIV2002로부터, VZV gpI 코딩 영역을 함유하는 플라스미드는 카르복시 말단 앵커 서열은 부족하지만 시그날 서열은 보유하도록 작제되었다. 이 벡터는 pNIV2002로부터 모두 단리된 861 bp HindIII-HgiAI 단편(아미노산 1-268을 코딩)을 817 bp HgiA I-AvaII 단편(아미노산 269-541을 코딩)에 연결시키고, 아미노산 542-546 및 종결 코돈을 코딩하는 AvaII-BclI 합성 링커에 연결시킴으로써 만들어졌다:
벡터 pNIV2004를 만들기 위해 이것을 플라스미드 TndHBB의 HindIII-BclI 부위로 연결시켰다. (플라스미드 TndHBB는 NotI 부위가 pUC19서열의 플랭킹 도입된 플라스미드 pTND(상기인용된)의 변형이다). 이 벡터는 아미노산 1-546을 코딩하여 5' 말단의 HindIII와 3' 말단의 BclI의 제한 부위에 의해 플랭킹된다.
플라스미드 pAcYMl은 폴리헤드린 유전자 프로모터는 포함하나 폴리헤드린 유전자는 포함하지 않는 AcMNPV 게놈으로부터의 서열과 높은 카피수의 세균 플라스미드, pUC8로부터의 서열을 함유하는 배큘로바이러스 셔틀벡터이다. 마트수우라(Matsuura) 일행의 J Gen Virol, 68:1233-50(1987) 참조.
앵커-결여 gpI 서열을 함유한 1695 bp HingIII-BclI 단편을 pNIV2004로부터 단리시켜서 DNA 폴리머라제 I으로 블런트 말단으로 만들어 주었다. 이어서 이 단편을 폴리헤드린 프로모터에 대해 바로 3'인 플라스미드 pAcYM1의 블런트-말단의 BamHI 부위내로 연결시켰다. 본원에서 이 신규 플라스미드는 pNIV2011로 언급한다.
B) 앵커-결여 gplI : 플라스미드 PNIV2014
VZV 게놈 DNA(A 파트 참조)을 제한효소 EcoRI로 소화시켰다. 염기 49,362-64,735(다비손 일동의 상기 참조)에 상응하는 15킬로 염기쌍 단편을 단리시키고, 블런트 말단으로 만들어 주고 다른 표준 클로닝 벡터, 플라스미드 pUC19의 HindII 부위로 클로닝 시켰다. pNIV2008로 언급되는 이 신규 플라스미드는 잠정적인 시그널 서열(아미노산 1-9)을 포함하는 완전한 868 아미노산의 VZV gpII 단백질에 덧붙여서 5' 및 3' 해독되지 않은 DNA를 코딩한다.
카르복시 말단 앵커 서열이 부족하고 해독되지 않은 DNA가 없는 클론을 얻기 위해, 두 개 이상의 플라스미드 작제가 필요하다. 첫 번째는 HindIII-MaeIII 합성 링커(처음 두 개의 아미노산을 코딩함):
를 pNIV2008(아미노산 3-283을 코딩)로부터의 840 bp MaeIII-PstI 단편에 연결시킨 다음, 이 단편을 pUC19 벡터의 HindIII-PstI 부위내로 연결시킴으로써 5' 해독되지 않은 DNA를 제거하는 것이다. gpII의 아미노 부분을 함유한 이 벡터는 클론 A로 언급된다. 클론 A로부터의 854 HindIII-PstI 단편을 단리시키고 이를 pNIV2008(아미노산 284-694를 코딩)로부터의 1235 bp PstI-SacII 단편과 아미노산 695-698 및 멈춤 또는 종결 코돈을 코딩하는 합성 링커:
에 연결시킨다.
이어서 이들 단편을 pUC19의 HindIII-EcoRI 부위로 연결시켜 클론 C(pNIV 2039)를 만든다. 이 벡터는 gpII의 아미노산 1-698(즉 시그널 서열을 포함하고 앵커 서열을 결여을 코딩하고 이는 5' 말단에 있는 HindIII 및 3' 말단에 있는 HindII 제한 부위에 의해 플링킹된다.
클론 C로부터 앵커-결여 gpII 서열을 함유한 2108 bp Hind III-HindII 단편을 단리시키고, DNA 플리머라제 I(즉, 클레나우)로 블런트-말단으로 만들었다. 이어서 이 단편을 폴리헤들니 프로모터에 대해 바로 3'인, 플라스미드 pAcYMl의 블런트-말단의 BanmHI 부위로 연결시켰다. pNIV2014로 언급된, 이 플라스미드에 있어, ATG의 A는 연결 접면부로부터 다운스트림으로 9염기가 지나서 위치된다.
C) 앵커-결여 gpIII : 플라스미드 pNIV2012
염기 64,735-77,656(다비손 일동, 상기 참조)에 상응하는 12.9 kbp EcoRI 단편(B 파트 참조)을 단리시키고 pUC9의 EcoRI 부위로 연결시켰다. 이 결과로 생성된 플라스미드, pNIV 2007은 시그널서열(시그널서열은 이의 소수성 특징에 의해 추론됨)을 포함하는 841 아미노산의 완전한 VZV gpIII 단백질)에 덧붙여서 해독되지 않은 VZV DNA를 코딩한다.
추가 작제를 용이하게 하기 위해, 4400 bp MluI 단편을 블런트-말단으로 만들고, 플라스미드 pUC19의 브런트-말단 HindII 제한 부위로 연결시킨다. 여기서 이 플라스미드는 pNIV2003으로 언급된다.
pNIV2003으로부터, VZV gpIII의 코딩 영역을 함유한 플라스미드는 카르복시 말단 앵커 서열은 부족하나 시그널서열은 함유하도록 작제되었다. 네 개의 단편을 플라스미드 TndHBB(상기 참조)의 HindIII-BclI 부위로 연결시켰다. 그들은 아미노산 1-13을 코딩하는 합성 HindIII-AvaII DNA 단편 :
pNIV2003으로부터의 231 bp AvaII-AatII 단편(아미노산 14-91을 코딩), pNIV2003으로부터의 2103 bp AatII-AsuII 단편, 및 아미노산 793-802에 덧붙여 종결코돈을 코딩하는 합성 AsuII-BclI 단편 :
을 포함하여 구성된다.
이 결과로 생성된 벡터는 아미노산 1-802를 코딩하고 5' 말단에 있는 HindIII 및 3' 말단에 있는 XbaI제한 부위에 의해 플랭킹 된다.
앵커-결여 gpIII 서열을 함유한 2422 bp HindIII-Xbal 단편을 DNA 폴리머라제 I(즉, 클레나우)로 블런트-말단으로 만들어주고 단리시켰다. 이어서 이 단편을 폴리헤드린 프로모터의 바로 3'위치인 플라스미드 pAcYMI의 블런트-말단의 BamHI 부위로 연결시켜 플라스미드 pNIV2012를 만든다.
[실시예 2]
곤충 세포 내에서의 발현
스포도프테라 프루기페르다 9(Sf9) 세포는 ATCC(미합중국 메릴랜드주 록크빌시)로부터 입수가능하다. Sf9 세포를 실질적으로 상기된 섬머(Summers) 일동의 TAES Bull, NR 1555 (1987. 5월)에 기재된 바와 같이 각각 50μg 및 1μg에서, 다음의 재조합 벡터, 플라스미드 pNIV2011, pNIV 2014 또는 pNIV2012 및 야생형 AcMNPV DNA 중 하나로 코트랜스펙팅시켰다.
상층물을 수집하여 결과 생성된 바이러스 입자를 얻었다. 이어서 바이러스-함유 매질을 플라크 검정에서 Sf9 세포를 감염시키는데 사용했다. 계속해서 플라크 정제된 재조합 배큘로바이러슬로 Sf9를 감염시켜 세포의 폴리헤드린 단백질 대신 VZV 당단백질 발현을 야기시켰다.
pNIV2011로부터 유도된 재조합 배큘로바이러스로 감염된 세포는 카르복시 말단 앵커 서열이 부족한 gpI 단백질을 분비하고 발현하는 것으로 나타났다. 대략 약 60 킬로달톤에서 하나의 밴드를 나타내는 전체 VZV입자에 대해 토끼 폴리클로날 항혈청으로 웨스턴 블러트(Western blot) 분석을 행했다.
pNIV2014로부터 유도된 재조합 배큘로바이러스로 감염된 세포는 카르복시 말단 앵커 서열이 부족한 gpII 단백질을 발현하는 것으로 나타났다. 약 63 및 85 킬로달톤의 두 개의 밴드를 나타내는 것에 대해 gpI에 행해졌던 것과 같이 웨스턴 블러트 분석을 행했다.
[실시예 3]
[CHO 세포내에서 gpII의 발현]
1) 플라스미드 pNIV 2034의 건조
pNIV2039로부터 '앵커-결여 gpII 서열을 함유한 2019 bp HindIII(블런트)-HindII 단편을 단리시켜 플라스미드 TDN(상기 참조)의 EcoRV 및 HindIII(블런트) 사이에 도입시켜 플라스미드 pNIV2034를 얻었다.
2 gpII s+a-를 발현시키는 CHO 클론의 선택
CHO DHFR 세포를 pNIV 2-34로 일렉트로포레이팅 시켰다. 항생물질 G418에 대한 그들의 내성을 기준으로 형질전환된 세포를 셀렉팅했다. 각 작제물당 약 100클론으로부터 세포 추출물 및 소비 배양물질을 gpII의 존재에 대해 시험했다. 가장 유망한 클론을 5nM 메토트렉세이트로의 증폭에 적용 시켰다. 각 작제물당 약 24클론을 다시 시험했다.
[실시예 4]
[VZV 당단백질을 함유한 백신]
본 발명의 대표적인 백신을 하기와 같이 제조한다. 곤충에서 유도된 당단백질과 같은 본 발명의 재조합 VZV 당단백질을 휘저어 섞으면서 ml 당 0.5mg Al3+(수산화 알루미늄 겔로서)를 함유한 완충 살린 용액(150mM NaCl, 10mM 인산나트륨 pH 6.8; 여과로 살균됨) 내에 최종농도 0.1-1000 μg/ml 폴리펩티드, 바람직하게 1-100 μg/ml로 첨가시켰다. pH를 pH 6.8에서 유지시키고 혼합물을 약 4℃에서 밤새 유지시켰다. 티메로살을 최종농도 0.0005%로 첨가시켰다. pH를 체크해주로 필요하다면 pH 6.8로 저절해 주었다.
각 백신 투여량내에 존재하는 곤충 유도된 VZV 당단백질의 양은 해로운 부작용을 수반하지 않고 면역보호 반응을 유도하는 양으로 선택된다. 그러한 양은 사용되는 특정의 폴리펩티드 및 백신이 보조되는가 여부에 따라 달라질 것이다. 특별한 백신의 최적량은 피검자에 있어 항체 적정 및 다른 반응의 측정을 포함한 표준 연구에 의해 확실해질 수 있다. 초기 백신 접종에 이어, 피검자는 보호면역 반응을 유지시키고 증대시키는데 필요한 간격으로 부스터(booster) 투여를 수용할 것이다.
비록 백신은 다른 투여 경로로 보호 반응을 이끌어내는 데 사용될 수 있지만, 비경구적으로, 예컨대 근육내로(im) 또는 피하로(sc) 투여되는 것이 바람직하다.
상기 상세한 설명 및 실시예는 본 발명 및 그들의 바람직한 실시양태를 충분히 공개한다. 본 발명은 구체적으로 공개된 실시양태에 한정되지 않으며, 첨부된 청구범위의 범위내에 있는 그들의 모든 변형 및 변화를 망라할 것이다.
Claims (17)
- 제1도, 제2도 및 제3도에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 바리셀라-조스터 바이러스의 당단백질로부터 유도되는 단백질로서, 카르복실 종결 말단부에서 완전한 길이 당단백질의 총아미노산 잔기의 4내지 20%가 결실된 앵커(anchor)-결여 gpI, 앵커-결여 gpII 또는 앵커-결여 gpIII 중의 하나인 단백질.
- 제1항에 있어서, gpI 1-546, gpII 1-698 및 gpIII 1-802로부터 선택되는 단백질.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 수득되는 단백질.
- 제1항에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
- 숙주 세포내에서 제4항의 DNA 서열을 발현시키는 복제 가능한 발현 벡터.
- 제5항의 복제가능한 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 재조합 곤충 세포에서 수득되는 단백질.
- 제7항에 있어서, 레피도프테라 세포 또는 드로조필라 세포에서 수득되는 단백질.
- 면역보호양의 제1항의 단백질 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 바리셀라 및 조스터에 대해 인간을 보호하기 위한 백신.
- 면역보호양의 제2항의 단백질 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 바리셀라 및 조스터에 대해 인간을 보호하기 위한 백신.
- 면역보호양의 제3항의 단백질 및 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 바리셀라 및 조스터에 대해 인간을 보호하기 위한 백신
- 재조합 숙주 세포내에서 제1항에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현시켜서 생성된 단백질을 회수하는 것으로 이루어지는, 제1항의 단백질을 제조하는 방법.
- 제12항에 있어서, 재조합 숙주 세포가 곤충세포임을 특징으로 하는 방법
- 제2항에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
- 제3항에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
- 재조합 숙주 세포내에서 제2항에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현시켜서 생성된 단백질을 회수하는 것으로 이루어지는, 제 2항의 단백질을 제조하는 방법.
- 재조합 숙주 세포내에서 제3항에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 발현시켜서 생성된 단백질을 회수하는 것으로 이루어지는, 제3항의 단백질을 제조하는 방법.
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