JPH0349694A - 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、水痘帯状庖疹ウイルス（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ
Ｚｏｓｔｅｒ　Ｖｉｒｕｓ）　Ｗ蛋白の発現、および免
疫防御量のｍＩ記蛋白を含むワクチンに関する。

［従来の技術１ 水痘帯状庖疹ウイルス（Ｖ　Ｚ　Ｖ）は水痘および帯状
庖疹の原因となるヒトヘルペスウイルスである。水痘は
初感染または一次感染から発症し、通常幼午期にかかる
比較的軽度の感染症である。しかしながら、幼午期の間
に水痘にさらされなかった戊人や免疫抵抗力が低下した
個人の場合、ＶｚＶは命にかかわる恐れがある。同様に
、このウイルスは胎盤を通過できるので、ＶＺＶ感染は
新生児にとって生命の危険を伴う。水痘は直接接触によ
って伝染する伝染性疾患であることが知られている。

大部分のヘルペスウイルスと同様に、ｖｚＶは一部の細
胞に感染し、細胞内でその発生を中断する傾向がある。

いろいろな潜伏期間後、水痘帯状庖疹（ＶＺ）ウイルス
は放出されて他の細胞への感染を開始する。ＶＺウイル
スのこの再活性化は毎年約５００万件の帯状庖疹を引き
起こしている［Ｐｌｏｔｋｉｎ　ｅｔ　ａｔ．，　Ｐｏ
ｓｔｇｒａｄ　Ｍｅｄ　Ｊ　６１：　１５５−６３（１
９８５）］　．帯状庖疹は大脳の神経ｗｉ１；よび末梢
神経の炎症によって特徴づけられ、激しい浦みを伴う。

現在のところ、このウイルスを再活性化する要因は不明
である。

弱毒化ＶＺＶ株をワクチン接種したヒトはＶＺＶ感染に
対して防御免疫を賦与されることが分かっている［Ａｒ
ｂｅｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ　１
００　８８６−９３（１９８２）およびＢｒｕｎｅｌｌ
　ｅｔ　ａｌ．，　ＬａｎｃｅＬ　ｉｉ：　１０６９−
７２　（１９８２）］。この方法は有効であるが、水痘
帯状庖疹ウイルスを増殖させることが困難であるために
限界がある。Ｖｚウイルスの抗原性部分を同定するため
に、相当な努力が払われている。改良されたＶＺワクチ
ン（特に、サブユニットワクチン）の開発を可能にする
ためには、ｖＺｖエンベロープ蛋白を単離することが重
要である。

Ｆｏｒｇｈａｎｉ　ｅｔ　ａｌ．　［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，
　５２：５５−６２　（１９８４）］、Ｏｋｕｎｏ　ａ
ｔ　ａｌ．　［Ｖｉｒｏｌ．　１２９：３５７−６８　
（１９８３）］　およびＫｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ．　
［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．　５２：２９３−７　（１９８４）
］はｖＺｖ感染細胞およびＶＺヴイリオンから多数のウ
イルス特異的ａｉｉ白を同定した。

別の関連研究において、ｖｚｖゲノムが制限エンドヌク
レアーゼ解析により解明された。１１種の制１訣工冫ド
ヌクレアーゼについてのＶＺＶ　ＤＮＡの物理地図およ
びクローン化ＤＮＡ断片が決定された［Ｅｃｋｅｒ　ｅ
Ｌ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　ＮａＬＩ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ
　ＵＳＡ　７９：　１５６−１６０　（１９８２）、Ｓ
ｔｒａｕｓ　ｅＬ　ａｔ．，　ＰｒｏｃＮａｔｌ　Ａｃ
ａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７９：９９３−７　（１９８２
）、Ｓｔｒａｕｓ　ｅＬａｌ．，　Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒ
ｏ１　６４：ｌ０３１−４１　（１９８３）、およびＤ
ａｖｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．．　Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏ
１　６４：ｌ８１１−１８１４　（１９８３）を参照さ
れたい］． これらの研究の結果、ＶＺＶの科学的知識は急増した。

さらに、これらに付随して命名も増えた。

Ｄａｖｉｓｏｎ　ｅｔ　ａ＋．　［Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　５
７：ｌｌ９５−７　（１９８６）］はｖＺｖ糖蛋白遺伝
子およびそれらの遺伝子産物の命名を標準化するために
研究会を催した。最も豊富に存在する３稍類のエンベロ
ーグ遺伝子産物は、豊富に存在する量の順に、ｇｐｒ、
ｇｐＩＩおよびｇｐＩＩＩと命名された。これらの３種
類の糖蛋白ｇｐＩ−ｇｐＩＩＩはすべてｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏで中和抗体を誘起することが見いだされた。

その後まもなく、Ｄａｖｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．　［Ｊ
　ＧｅｎＶｉｒｏｌ．　６７：ｌ７５９−１８１６　（
１９８６）］　ニよってｖＺｖの全ヌクレオチド配列が
開示された。これは種々の糖蛋白遺伝子の同定へ導き、
各種のウイルス糖蛋白の前駆物質一産物の関係を明らか
にするのに役立った。他のヘルペスウイルスと同様に、
ｖＺｖゲノムは非常に複雑である。それは７０のオープ
ン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含み、ｇｐｒ
、ｇｐｕ、ｇ　ｐＩＩＩ　ｓ　ｇ　ｐＩＶおよびｇｌ）
Ｖと命名された５ａ類の糖蛋白遺伝子をコードしている
。それらの推定アミノ酸配列によれば、それらはそれぞ
れ単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）糖蛋白　ｇＥ，
ｇＢ，ｇＨ，ｇｌおよびｇＣといろいろな程度の相同性
を有する［Ｄａｖｉｓｏｎ　ｅＬ　ａｌ．．同書および
Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎ
ａｉｌＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４：４３０３−４
３０７　（１９８７）］　．　Ｖ　Ｚ　Ｖ糖蛋白とＨＳ
Ｖ−１糖蛋白とのアミノ酸相同が機能的な関係を意味す
るのかどうかは知られていない。

ＨＳＶ−１糖蛋白機能に関してかなりの数のデータが利
用しうるが、ＶＺＶ糖蛋白機能については限られた数の
研究が存在するにすぎない。これらの研究は主としてウ
イルス中和に関与する糖蛋白に集中している［Ｄａｖｉ
ｓｏｎ　ｅＬ　ａｔ．，同書、Ｋｅｌｌｅｒｅｔ　ａｌ
．，同書およびＶａｆａｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｖｉ
ｒｏｌ　５２：９５３−９　（１９８４）］。

Ｅｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｈ　（米国特許第４７６９２３９
号）はＶＺＶ　ｍＲＮＡからの２種類のｇｐｒコード配
列の単離を開示している。Ｅｌｌｉｓ　ｅＬ　ａｌ．は
ｇｐ■とアミノ末端に存在する追加の３８コドンを含む
ポリペグチドの配列を開示している。また、Ｅｌｌｉｓ
　ｅＬ　ａＪ．はｇｐｒの３００アミノ酸断片をコード
する分子を開示しているが、天然ｇｌ）Ｉは６２３１１
１のアミノ酸を有する。

Ｅｌｌｉｓ　ｅＬ　ａｌ．，　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．　５３
：８１−８８　（１９８５）はｇｐＩ遺伝子マッピング
の２つの方法を開示している。ランダムに消化したＶＺ
ＶＤＮ．Ａの小さい断片を細菌発現ベクターに挿入し、
このベクターライブラリーで形質転換した細菌コロニー
を、ｇｐｌ／ｌａｃＺ融合蛋白としてのｇｐＩの抗原発
現についてスクリーニングした。このハイブリッド蛋白
はｇｐＩに対して誘導されたモノクローナル抗体（ｍＡ
ｂ）によって認識された。さらに、ＶＺＶ感染細胞由来
のｍＲＮＡが一組のＶＺＶ組換えグラスミドによってハ
イブリッド選択され、ｉｎ　ｖｉＬｒｏで翻訳された。

この産物はｇｐＩに対する回復期帯状庖疹血清により免
疫沈降された。

Ｅｌｌｉｓ　ａｔ　ａ！．　（米国特許第４６８６１０
１号および同第４８１２５５９号）はｇｐＦｉ　ｖＺｖ
配列を開示している。また、Ｅｌｌｉｓ　ｅＬ　ａｌ．
はＶＺウイルスに感染したＭ１１Ｃ−５ヒト二倍体線維
芽細胞からのｇｐＩＩの精製を開示している。さらに、
精製ｖｚｖ　　ｇｐｌｒを用いてモルモットにおいて抗
体を誘導し、この抗体はｉｎ　ｖｉＬｒｏで試験したと
き中和能をもっていた。

Ｋｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．　
　１５２：１８１−１９１　（１９８６）は、戊熟ｇｐ
ＩＩが宿主細胞内でｉｎ　ｖｊｖｏ蛋白加水分解により
生戊したジスルフィド結合ヘテロダイマーであると示唆
している。

Ｋｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　（欧州特許公開第２４４
１５５号）はｇｐＩＩＩをコードするＤＮＡ断片、およ
びＶＺウイルスに感染したヒト二倍体線維芽細胞からの
ｇｐＩＩＩの精製を開示している。ｇｐＩＩ［に対ずる
抗血清はｉｎ　ｖｉＬｒｏでＶＺＶを中和することが判
明した。

しかしながら、上記文献はどれも、臨床的に使用できる
食のＶＺＶ糖蛋白をいかにして生産するかについて教示
も示唆もしていない。努力は既知の発現系に代わる他の
発現系の開発に向けられているａ　Ｃａｂｒｉａｃ　ｅ
ｔ　ａｌ．，　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ．　ｌｏ：２０５−
１４　（１９８８）は、組換えウイルス感染細胞の膜上
に局花化されたｇｐｒを発現する組換えワクシニアウイ
ルスを開示している。しかし、Ｃａｂｒｉａｃ　ｅｔ　
ａｌ．は容易に精製できるｇｐＩの生産方法を開示して
いない。

ＤｉＮｏｃｅｒａ　ｅＬ　ａｔ．．　　Ｐｒｏｃ　Ｎａ
ｉｌ　　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　　ＵＳＡ．　　８０：７０
９５−８　（１９８３）は、ショウジョウバエ属の培養
細胞による外来遺伝子の一時的発現を開示している。開
示された組換えグラスミドはショウジョウバエの熱シａ
ツク蛋白７　０　（ｈ　ｓ　ｐ　７　０）またはコピア
プロモーターの制御下にある。

Ｂｏｕｒｏｕｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｅｍｂｏ　Ｊ．　
２：ｌ０９９−１１０４　（１９８３）ハシａ　’＞　
シａウバエ属の培養細胞のゲノムへの外来遺伝子の組込
みを開示している。

バキュロウィルス発現系では、ある種の異種遺伝子を発
現させるために、強力な一時調節グロモーターが使用さ
れる。Ｓｍｉｔｈ　ｅＬ　ａｌ．　（米国特許第４７４
５０５１号）８よびＭａＬｓｕｕｒａ　ｅｔ　ａｌ．　
［ＪＧｅｎ　Ｖｉｒｏｌ．　６８：１２３３−５０　（
１９８７）］は、いくっがの原核および真核細胞遺伝子
を発現させるための、ポリヒドリン遺伝子プロモーター
を含むバキュロウイルスベクターを開示している。

Ｆｒａｚａｒ　ｅｔａｌ．　（ＰＴＣ／１０８８／０７
０８２）は多角体を構成するポリヒドリン融合蛋白を教
示している。

ポリヒドリンーインフルエンザ融合蛋白は赤血球凝巣素
蛋白のエビトープを発現することが明らかとなり、この
蛋白はインフルエンザヴイリオンに対する抗体によって
認識された。

Ｍｉ目ｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　（Ｐ丁Ｃ／Ｗ０８８／０２
０３０）は、少なくとも２種類の遺伝学的に異なるバキ
ュロウイルスの混合物を使用することによる異種遺伝子
の作製方法を教示している。

さらに、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞か
ら誘導されたある種のウィルス抗原は、それらの天然同
等物に抗原的にも免疫学的にも類似することが立証され
た。Ｃｏｃｈｒａｎｅ　ｅＬ　ａｌ．　（欧州特許公開
第２６５７８５号）およびＲｕｓｃｈｅ　ａｔａ１．（
欧州特許公開第２７２８５８号）は、ヒト免疫不全症ウ
イルス（Ｈ　Ｉ　Ｖ）エンベローグ糖蛋白　ｇｐ１２０
およびｇｐｌ６０のクローニング並びに発現を開示して
いる。

Ｃｏｃｈｒａｎ　ｅＬ　ａｌ．　（欧州特許公開第２２
８０３６号）は組換えバキュロウイルスによるワクシニ
ア成長因子（ＶＧＦ）の発現を開示している。さらに、
Ｃｏｃｈｒａｎ　ｅｔ　ａｌ．は組換えバキュロウイル
スにより発現されうる蛋白（Ｂ型肝炎表面抗原およびマ
ラリア原虫ポリペグチドを含む）の仮説的一覧表を提示
している。

Ｂｉｓｈｏｐ　ｅＬ　ａｌ．　（欧州特許公開第２６０
０９０サ）およびＴａｋｅｈａｒａ　ａＬ　ａ１．　（
Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ，　６９：２７６３−７７　（
１９８８）は、バキュロウィルスによるＢ型肝炎表面抗
原の発現を開示している。

Ｅｓｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ．　（欧州特許公開第２７３３
６６号）はバキュロウィルス系によるロタウィルス遺伝
子の発現を開示している。

Ｊａｃｏｂｓ　ｅＬ　ａｌ．　（米国特許出願第０　７
／２　８　７９３４号オヨびＰＣＴ／ＵＳ８９／０５５
５０）はバキュロウィルス系によるグラス舌ディウム・
サーカムスボロゾイト・プロテイン（Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍＣｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉＬｅ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）の発現を開示している。

【発明の構戊］ 本発明は、一つの面において、昆虫細胞により発現され
た抗原性糖蛋白を含む改良された水痘帯状庖疹ワクチン
を提供する。

本発明は、他の面において、昆虫宿主細胞内で機能する
調節領域に機能しうる状態で連結された、水痘帯状庖疹
ウイルス糖蛋白をコードするＤＮＡ配列を含む、組換え
ＤＮＡ分子またはベクターを提供する。

本発明は、別の面におい５て、昆虫細胞内で前記ＤＮＡ
配列を発現させ、その蛋白生産物を回収することから成
る、水痘帯状庖疹ウィルス糖蛋白の生産方法を提供する
。

関連した面において、本発明は組換えＤＮＡ分子を含む
組換えバキュロウィルス、および組換えバキュロウイル
スに感染した昆虫宿主細胞を提供する。

さらに関連した面において、本発明は、本発明の宿主細
胞により生産された水痘帯状庖疹ウィルス糖蛋白；免疫
防御量の前記糖蛋白を含むワクチン；ワクチンとして使
用するための前記糖蛋白；およびワクチンを製造するた
めの前記糖蛋白の使用；を提供する。

また、本発明は、安全かつ有効量のワクチンを投与する
ことから戊る水痘帯状庖疹ウイルス感染からヒトを防御
する方法に関する。

本発明はさらにアンカーレス（ａｎｃｈｏｒ−ｌｅｓｓ
）ｇｐ　Ｉ，７７カ−レスｇｐＭｔたはアンカーレスｇ
ｐＩＩＩから戊る水痘帯状庖疹ウイルス糖蛋白からの蛋
白を提供する。

関連した面において、本発明は、前記アンカーレス糖蛋
白をコードするＤＮＡ配列；宿主細胞内で前記ＤＮＡ配
列を発現しうる複製可能な発現ベクター；前記複製可能
な発現ベクターで形質転換された宿主細胞；免疫防御量
の前記アンカーレス糖蛋白を含むワクチン：安全かつ有
効量の前記ワクチンを投与することがら戒る、水痘帯状
庖疹ウイルス感染からヒトを防御する方法；ワクチンを
製造するための前記アンカーレス糖蛋白の使用二および
ワクチンとして使用するための前記アンカーレス糖蛋白
；を提供する。　水痘帯状庖疹ウイルス（Ｖ　Ｚ　Ｖ）
の完全なヌクレオチド配列はＤａｖｉｓｏｎ　ｅＬ　ａ
ｌ．．　Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ．　６７：ｌ７５９−
１８１６　（１９８６）に開示されている。ＶＺＶ糖蛋
白（ｇｐ）ｒ．■および■のＤＮＡ配列、 並びにそれらの推定ア ミノ酸配列を以下に示す： ｇｌ）Ｉ ＤＮＡおよびアミノ酸配列 ミ！　非　５旦　ニ至　＝テ　ミ＝　ミ：　ミニ　＝＝
＝ニ　弓最初のＡＴＧはＮ末端メチオニンをコードし、
そして最後のコドンＴＧＡまたはＴＡＡは翻訳終結（す
なわち、停止）シグナルである。

本明細書中で用いる“ｇｐＩ”　　　ｇｐｌｌ”または
’ｇｐｌｌｒ”なる用語は、実質的に先に示した水痘帯
状庖疹ウイルスの全長膜糖蛋白と、アンカーレス変異型
を含むそれらの免疫原性誘導体との両方を含むものであ
る。“免疫原性誘導体″なる用語は、末端切断ｖｚｖｇ
蛋白、またはヒトへ内部投与後ＶＺＶに対する免疫反応
を誘起する能力を保持する他の誘導体のような分子を包
含する。

この種の他の誘導体はアミノ酸の付加、欠失、置換また
は転位により、あるいは化学的修飾により製造される。

本発明のＶＺＶ糖蛋白は、全長ｖｚｖ糖蛋白、またはカ
ルボキシ末端で全アミノ酸残基の４〜２０％を欠失して
いるアンカーレス糖蛋白誘導体を含むその誘導体（以下
でより詳しく説明する）から或る。

一例として、本発明で用いるｇｐＩは、上記ＤＮＡ配列
によりコードされる蛋白と実質的に同じ（すむわち，異
なるアミノ酸が１０個以下）であるか、またはカルボキ
シ末端アンカー領域（約アミノ酸５４７−６２３）を欠
失している。同様に、本発明のｇｐＭおよびｇｐＩＩＩ
は上記配列と実質的に同じであるか、またはアミノ酸６
９９−８６８（ｇｐｌｌ）および８０３−８４　１　（
ｇｐｌｌｌ）をそれぞれ欠失している。好適な糖蛋白は
ｇｐｌｌｌ６９８である。

本発明の免疫原性誘導体はハイブリッド、すなわち、他
のｖｚｖｇ蛋白、他のＶＺＶ抗原、または他の非ｖｚｖ
抗原からの１以上のエピトーブを保有しうる追加の配列
を含む融合蛋白（例．ｇｐｔ−ｇｐＩＩ、ｇｐＩ−ｇＰ
ｍ、ｇｐＩＩ−ｇｐＩＩＩ、ｇｐＩ−ｇｐ［Ｉ−ｇｐｌ
ｌｌ）でありうる。また、本発明の免疫原性誘導体は、
アジュバントの場合のように免疫刺激特性を有するか、
ＶＺＶ糖蛋白に対する免疫反応を増強するか、あるいは
ＶＺＶ［！蛋白の発現、精製または製剤化に適している
キャリアーポリペブチドに融合される。

別の面において、本発明は、アンカーレスＶＺＶ糖蛋白
をコードするＤＮＡ配列を組換え宿主細胞により発現さ
せ、その糖蛋白生産物を回収することから戒る、本発明
によるアンカーレスＶｚＶ糖蛋白の生産方法を提供する
。

本発明方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　−　Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
１１ａｒｂｏｒ　＋　１　９８２およびＤＮＡ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　ｖｏｌ．ｌ，ｌおよび厘（Ｄ．Ｍ．ＧＩｏｖ
ｅｒ　ｅｄ．，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ＬＬｄ）に記載
されるような、通常の組換え技術により実施することが
できる。

前記コード配列を含むＤＮＡ分子は、既知技術を使って
ＶＺＶ　ｍＲＮＡから誘導される（例えば、ｍＲＮＡ鋳
型から相補ＤＮＡすなわちｃＤＮＡを作製する）か、ま
たはＶＺＶゲノムＤＮＡから単離できる。Ｅｃｋｅｒ　
ｅＬ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　ＮａＬＩ　ＡｃａｄＳｃｉ
　ＵＳＡ　７９：　１５６−１６０　（１９８２）、Ｓ
Ｌｒａｕｓ　ｅＬ　ａｌ．，８１４　（１９８３）を参
照されたい。これとは別に、ｇｐＬｇｐＩＩおよびｇｐ
ＩＩＩをコードするＤＮＡ分子は標準ＤＮＡ合成法によ
り合成することができる。

従って、本発明はまた、適当な七ノー、ジーまたはオリ
ゴマーヌクレオチド単位を縮合することによるＤＮＡ配
列の作製方法を提供する。

ＤＮＡ配列の作製は化学的に、酵素的に、またはこれら
の２つの方法の併用により、適宜にｉｎｖｉｖｏまたは
ｉｎ　ｖｉＬｒｏで行われる。こうして、ＤＮＡ配列は
適当なＤＮＡ断片の酵素による連結、またはＤ．Ｍ．Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ　ｅｃ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　１９８５＋２４．　５０９０−５０９８に記載さ
れるようｋ慣用方法により作製される。

ＤＮＡ断片は、必要なヌクレオチド配列を含むＤＮＡを
適当な制限酵素で消化するか、化学的に合成するか、酵
素により重合するか、またはこれらの方法を組み合わせ
ることにより得られる。

制限酵素による消化は、適当な緩衝液中２０〜７０℃の
温度で、一般にはｏ．ｔ−ｉｏμｇのＤＮＡを含む５０
μＩまたはそれ以下の容量にて実施する。

ＤＮＡの酵素による重合は、ヌクレオチド三リン酸ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む適当な
緩衝液中ｌＯ〜３７℃の温度で、一般には５０μｌまた
はそれ以下の容量にて、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌ
ｅｎｏｗ断片）のようなＤＮＡポリメラーゼを使ってｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏで実施する。

ＤＮＡ断片の酵素による連結は、適当な緩衝液中４゜Ｃ
ないし周囲温度で、一般には５０μ！またはそれ以下の
容量にて、Ｔ４　　ＤＮＡリガ・−ゼのようなＤＮＡリ
ガーゼを用いて行う。

ＤＮＡ配列または断片の化学的合成は、例えば″Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙ＋ｎａｔｉｃ　ＳｙｎＬ
ｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ＧｅｎｅＦｒａｇｍｅｎｔｓ　−　
Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＩＪａｎｕａｌ″”　（ｅ
ｄ．■．Ｇ，Ｇａｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ａ．Ｌａｎｇ），
　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ，　Ｗｅｉｎｈａｉｍ（
１９８２）、または他の科学出版物、例えばＭ．Ｊ．Ｇ
ａｉｔ．　ｌＩ．Ｗ．Ｄ．ＭａＬｔｈｅｓ，　Ｍ．Ｓｉ
ｎｇｈ，　Ｂ．Ｓ．ＳｐｒｏａＬ，ａｎｄ　Ｒ．Ｃ．Ｔ
ｉＬｍａｓ，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ，　１９８２，１０．　６２４３；　Ｂ．Ｓ．
ＳｐｒｏａＬ　ａｎｄ　Ｗ．ＩｌａｎｎｗａｒＬｈ，Ｔ
ａｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ．　　１９８３
．　２４．　５７７１；　Ｍ．Ｄ．ＭａＬＬｅｕｃｃｉ
　　ａｎｄ　Ｍ．Ｉｌ．ＣａｒｕＬｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎＬｅＬｔｅｒｓ，　　１９８０ｓ　２Ｌ
　７１９；　Ｍ．Ｄ．Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ａｎｄ　Ｍ
．１１．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ
　　Ｌｈｅ　ＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｒｎｉｃａｌ　　
Ｓｏｃｉｅｔｙ．１９８１．１０３．３１８５；　　Ｓ
．Ｐ．Ａｄａｍｓｅｔ　　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　　
ｏｆ　　Ｌｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｓｏｃｉｅｔｙ．　　１９８３．　　１０５．　６６１
；　Ｎ．Ｄ．Ｓｉｎｈａ，　Ｊ．ＢｉｅｒｎａＬ，Ｊ．
ＭｃＭａｎｎｕｓ，ａｎｄ　ＩＩ．Ｋｏｅｓｔｅｒ，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　１９８
４．　１２＋　４５３９；およびｌｌＷ．Ｄ．ＭａＬＬ
ｈｅｓ　ｅＬ　ａｌ．，　ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ，
　１９８４＋　３．　８０１に記載されるような固相法
を使って、慣用のホスホトリエステル、ホスファイトま
たはホスホルアミダイト化学により実施できる。好まし
くは、自動ＤＮＡ合戊機が使用される。

ＤＮＡ配列は、好ましくは、２以上のＤＮＡ分子（一緒
になって糖蛋白をコードするＤＮＡ配列を構成する）を
連結することにより作製される。

ＤＮＡ分子は必要なコード配列を含むベクターを羅華な
制限酵素で消化することにより得られる。

ＤＮＡ分子の正確な構造およびそれらを得る方法は、目
的の糖蛋白生産物の構造に依存している。

糖蛋白をコードするＤＮＡ分子の構築のための適当な戦
略方法の設計は、当分野で習熟した者にとって日常的な
仕事である。

アンカーレス糖蛋白をコードするＤＮＡ配列のｌ換え宿
主細胞による発現は、宿主細胞内でそのＤＮＡ配列を発
現しうる複製可能な発現ベクターを用いて行われる。

複製可能な発現ベクターは、本発明によれば、宿主細胞
と適合しうるベクターを切断して完全なレプリコンをも
つ線状ＤＮＡセグメントを形成し、その線状セグメント
をｌ以上のＤＮＡ分子（前記線状セグメントと一緒にな
ってアンカーレス糖蛋白をコードする）と連結条件下で
一緒にすることにより作製される。

線状セグメントと１より多いＤＮＡ分子の連結は、所望
により、同時にまたは逐次行うことができる。従って、
ＤＮＡ配列は、所望により、前以て作製しても、ベクタ
ーの構築中に作製してもよい。

ベクターの選択は原核細胞、例えば、制限するものでは
ないが、大腸菌またはストレグトマイセス属；真核細胞
、例えば、制限するものではないが、マウスＣ１２７、
マウスミエローマ、｝Ｉ　ｅ　Ｌａ１チャイニーズハム
スター卵巣（ＣＨＯ）、ＢＨＫ，ＨａＫ％ＣＯＳ，酵母
（例．ピキア・パストリス、Ｓ．セレビシエ、ハンセヌ
ラ種）；および昆虫細胞：でありうる宿主によって一部
決定されるであろう。宿主はトランスジェニック動物で
あってもよい。好ましくは、宿主細胞は呻乳動物または
昆虫に由来するものである。より詳却１には、本発明の
好適な宿主細胞はＣ　Ｈ　Ｏ　，鱗翅目またはショウジ
ョウバエ属の昆虫細胞である。本発明の宿主細胞に適す
るベクターにはプラスミド、バクテリオファージ、コス
ミド、およびバキュロウイルスやボックスウィルス（例
．ワクシニア）などから誘導された組換えウイルスが含
まれる。

複製可能な発現ベクターの作製は、例えば先に引用した
Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．の文献に記載される方
法により、ＤＮＡの制限、重合および連結のための適当
な酵素を用いて慣例的に行われる。重合および連結はＤ
ＮＡボリマーの作製について上述したように実施する。

制限酵素での消化は適当な緩衝液中２０〜７０℃の温度
で、一般にＯ．ｌ−１０μｇ　　ＤＮＡを含む５０μ「
またはそれ以下の容量にて行う。

組換え宿主細胞は、本発明によれば、形質転換条件下に
宿主細胞を本発明の複製可能な発現ベクターで形質転換
することにより作られる。適当な形質転換条件は慣例的
であり、例えば先に引用したＭａｎｉａＬｉｓ　ｅＬ　
ａｌ．の文献または“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　Ｖｏ
ｌ．Ｉ，　Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｄ．，　ＩＲＬ　
Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ，　１９８５に記載されている。

形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。こう
して、大腸菌のような細菌宿主はＣａＣ！，の溶液で処
理する（Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．　Ｐｒｏｃ．ＮａＬ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，　１９７３．　６９．　２１１
０）か、またはＲｈＣＩ　、Ｍ　ｎ　Ｃ　１　１ｓ酢酸
カリウムおよびグリセロールの混合物から成る溶液で処
理し、次に３−［Ｎ−モノレホリノ１プロパンースノレ
ホン酸、ＲｂＣｌおよびグリセロールで処理ずる。補乳
動物の培狩細胞は細胞上へのベクターＤＮＡのカルシウ
ム共沈により形質転換される。

ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下での形質転換宿主
細胞の培養は、例えば先に引用したＭａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　ａｌ．の文献および“ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ’
″に記載されるように、慣例的に実施される。こうして
、好ましくは細胞に栄養分を供給して、４５℃以下の温
度で培養する。

アンカーレス糖蛋白発現産物は宿主細胞に応じて慣用方
法で回収される。宿主細胞が大腸菌のような細菌である
場合は、その細菌を物理的、化学的または酵素的に溶菌
し、得られた溶菌液から蛋白産物を単離する。宿主細胞
が啼乳動物細胞である場合は、一般に栄養培地から蛋白
を単離する。

ＤＮＡ配列はアンカーレス糖蛋白を発現する安定した形
質転換呻乳動物細胞系列の単離のために設計されたベク
ター、例えばウシバビローマウィルスベクターまたはチ
ャイニーズハムスター卵巣細胞中の増幅ベクターに構築
される（　ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ”　　Ｖｏｌ．ｆ，Ｄ
．Ｍ．ＧＩｏｖｅｒ　ｅｄ．，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　　
，１９８５　；　Ｋａｃ＋４ｍａｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ　ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　５．１７５０−１７５９．１９８５：
Ｐａｖｌａｋｉｓ　Ｇ．Ｎ．ａｎｄ　　Ｉｌａｒｏｅｒ
，Ｄ．Ｈ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆＬｈｅ　　
Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅｍｙ　　ｏｆ　　Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ　　（ロＳ＾）　　８０．　　３９７−４
０１．１９８３；　Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ　ａ
ｌ．，欧州特許公開第００９３６１９号，　１９８３）
。

異種蛋白の発現のために、いろいろな昆虫細胞および発
現系が利用できる。昆虫細胞にはショウジョウバエ属（
　Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）と鱗翅目（　Ｌｅｐｉｄ
ｏｐｉｅｒａ）の細胞が含まれる。一般に、これらの系
は調節要素の制御下にある対象遺伝子のコード配列およ
び選択マーカーを含む組換えＤＮＡ分子を使用する。調
節要素は転写または翻訳に必要なまたは望ましい機能を
有するＤＮＡ領域である。

本発明で使用しうる昆虫細胞にはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ
Ｓｔ，Ｓ２、Ｓ３、ＫＣ−０およびＤ．ｈｙｄｅｉ　Ｊ
［［Ｉ胞が含まれる。

ｅｉ　ａｌ．，　Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ，　５：
３２０８　（１９８５）を参照されたい。ショウジョウ
バエ属の細胞はリン酸カルシウム沈降、エレクトロボレ
ーションおよびウイルストランスフェクションを含む標
準技法によりトランスフヱクトされる。細胞は標準細胞
培養法により種々の栄養培地（例えば、平衡塩類および
必須アミノ酸を含むＭ３培地）を用いて培養する。Ｌｉ
ｎｄｑｕｉｓＬ　ｅＬ　ａｌ．．　０１Ｓ（Ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ
）　．５８：１６３　（１９８２）を参照されたい。

ショウジョウバエ属の細胞に有用であることが知られて
いるグロモーターには補乳動物細胞プロモーターとショ
ウジョウバエプロモーターが含まれるが、後者が好適で
ある。有用なショウジョウバエグロモーターの例にはシ
ョウジョウバエ・メタロチオネインプロモーター　７０
キロダルトンの熱ショック蛋白グロモーター（ＨＳＰ７
０）およびＣＯＰＩＡ　ＬＴＲが含まれる。例えば、Ｄ
ｉＮｏｃｅｒａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　Ｎａｉｌ
　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．　８０：７０９５　（１
９８３）；　ＭｃＧａｒｒｙ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌ
ｌ．　４２：９０３　（１！Ｊ８５）；　Ｊｏｈａｎｓ
ｅｎ　ｅｔ　ａｔ．，欧州特許出願第８８　３０４０９
３．３号（欧州特許公開第２９０２６１号）を参照され
！こ　い。

本発明の一つの実施態様において、ＶＺＶ糖蛋白は免疫
原性のある蛋白を得るために鱗翅目の昆虫細胞内で発現
される。ＶＺＶ糖蛋白を鱗翅目細胞内で発現させるため
には、バキュロウィルス発現系を使用することが好適で
ある。この種の発現系では、バキュロウイルスプロモー
ターに機能しうる状態で連結された（すなわち、制御下
にある）■ＺＶ蛋白コード配列を含む発現カセットが、
通常シャトルベクター内に配置される。前記ベクターは
大腸菌または他の適当な原核細胞宿主内でシャトルベク
ターを増殖させるのに十分な量の細菌ＤＮＡを含んでい
る。このようなシャトルベクターはさらに、野生型バキ
ュロウィルスと異種遺伝子との間で組換えを可能とする
ように、ｖｚｖ糖蛋白コード配列に隣接して十分な量の
バキュロウィルスＤＮＡを含んでいる。相同組換えによ
り生じた組換えバキュロウィルスはその後標準技法にょ
り選別され、グラークＭ製される。ＳｍｉＬｈ　ｅＬ　
ａｌ．，ＴＡＥＳ　Ｂｕｌｌ　（Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉ
ｃｕｌＬｕｒａｌ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｉａｔ
ｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）　ＮＲ　１５５５．　Ｍａ
ｙ．　１９８７を参照されたい。

鱗翅目細胞用のプロモーターにはバキュロウイルスゲノ
ムからのグロモーターが含まれる。ポリヒドリン遺伝子
のプロモーターは、ボリヒドリン蛋白が他のバキュロウ
イルス蛋白と比較して自然界で過剰発現されるので、好
適である。好適なポリヒドリン遺伝子プロモーターはＡ
　ｃ　Ｍ　Ｎ　Ｐ　Ｖバキュロウイルスから得られる。

ＳｍｉＬｈ　ｅＬ　ａｌ．，米国特許第４７４５０５１
号；　Ｓｍｉｔｈ　ｅＬ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ　ＮａＬ
ＩＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　８２：８４０４　（１
９８５）；　およびＣｏｃｈｒａｎ，欧州特許公開第２
２８０３６号を参照されたい。

有用な鱗翅目の細胞にはトリコプルシア・二（Ｔｒｉｃ
ｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）　、スポドグテラ・７ルギベ
ルダ（ＳｐｏｄｏｐＬｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）
　、ヘリオシス●ゼア（Ｉｌｅ口ｏｔｈｉｓ　ｚｅａ）
　、アウトグラ７イ力　カリンｔルニカ（Ａｕｔｏｇｒ
ａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）　、ラキプル
シア（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ）または、ガレリア−メ
ロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ　ｍｅｌｏｎｅｌｌａ）　、
マンドゥ力・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ　ｓｅｘｔａ）
からの細胞、もしくはバキュロウイルスが感染する他の
細胞が含まれる。

これらは核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）、単一ヌクレオ
カプシドウイルス（ＳＮＰＶ）および多重ヌクレオカプ
シドウィルス（ＭＮ　Ｐ　Ｖ）を含む。

好適なバキュロウイルスはＮＰＶまたはＭＮＰＶバキュ
ロウイルスである。その理由はこれらが感染細胞内で高
度に発現されるボリヒドリン遺伝子グロモーターを含む
からである。特に、アウトグラフィカ・カリフ才ノレニ
カ（ＡｕＬｏｇｒａｐｈｉｃａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ
）からのＭＮＰＶウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）が以下に例
示される。しかしながら、カイコウイルス、ボンビック
ス・モリ（　Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒ　ｉ　）のような他の
ＭＮＰＶおよびＮＰＶウイルスも使用できる。鱗翅目細
胞は標準トランスフエクシａン技法により本発明の組換
えパキュロウイルスでトランスフエクトされる。これら
にはリン酸カルシウム共沈、エレクトロボレーシ日冫、
およびリポソーム媒介転移が含まれるが、これらに限定
されない。細胞は標単細胞培養法に従って種々の栄養培
地、例えばｌＯ％ウシ胎児血？ｆｆ（ＦＣＳ）を補給し
たＴ　Ｃ　Ｉ　Ｏ　Ｏ　（Ｇｉｂｃｏ　Ｅｕｒｏｐｅ；
Ｇａｒｄｉｎｅｒ　ｅｔ　ａｔ．．　Ｊ　Ｉｎｖｅｒｔ
　Ｐａｔｈ．　２５：３６３　（１９７５）を参照）を
用いて培養し、２７〜２８゜Ｃで１８〜２４時間増殖さ
せた。これとは別に、昆虫細胞の増殖を促す無血清培地
はＭａｉｏｒｅｌｌａ　ｅＬ　ａｔ．　（Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ．　６：１４０６−１４１０　（１９
８８）またはＰＣＴ／ＷＯ８９／０１０２８）により開
示されている。組換えウィルスコード化産物の高収量は
、１〜ｌ．２ＸＩＯ“細胞／ｍｌの密度で、活発に増殖
する培養物を感染させることにより達戊される。ｌＪｉ
ｌｌｅｒ　ｅＬ　ａｌ．，Ｓｅｔｌｏｗ　ａｎｄ　ｆｌ
ｏｌｌａｎｄｅｒ　（ｅｄｓ．），　ＧｅｎｅｔｉｃＥ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｖｏｌ　８，ｐ．２７７−９８
，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，　
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．　１９８６を参照されたい。Ｍｕｒ
ｈａｍｍｅｒ　ｅＬ　ａｌ．．　（Ｂｊｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｆｏｇｙ．　６：１４１１−１４１８　（１９８８）
またはＰＯＴ／ＷＯ８９／０１０２９）。

細胞培養物からのｖｚｖｍ蛋白の精製は、通常の蛋白分
離法、例えば選択的沈澱、吸着クロマトグラ７イー、お
よび以下で説明するような、モノクローナル抗体アフィ
ニティー力ラムを含むアフィニティーク口マトグラフィ
ーにより実施される。

昆虫細胞による生産は幼虫に感染させることによっても
達成される。例えば、ＶＺＶ糖蛋白は、本発明の組換え
バキュロウイルスをほんのわずかの野生型バキュロウイ
ルスと共にヘリオシス・ヴイレセンス（ＨｅｌｉｏＬｈ
ｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼虫に感染させ、約２日
後血リンパから蛋白を抽出することにより生産できる。

例えば、Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＣＴ／Ｗ０
８８／０２０３０を参照されたい。

さらに、多角体を形或しうる融合ポリヒドリン蛋白の生
産はＦｒａｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　ＰＣＴ／ＷＯ８８
／０７０８２により開示されている。

本発明はまた、免疫防御量の本発明ＶＺＶ糖蛋白を含む
ワクチンに関する。“免疫防御”なる用語は、ヒトに投
与したとき、その後のｖｚＶ感染を防ぐかまたは軽減す
るのに十分な防御抗体または免疫応答を誘起する十分量
のＶＺＶＷ蛋白を意味する。

本発明のワクチンにおいては、ＶＺＶ糖蛋白の水溶液を
直接使用することができる。また、前もって凍結乾燥を
行ったまたは行わないｖｚｖｒＪｑ蛋白を、いろいろな
既知のアジュバントと混合することもできる。この種の
アジュバントには水酸化アルミニウム、ムラミルジベグ
チド、およびＱｕｉｌＡのようｔｌサポニンが含まれる
が、これらに限定されない。別の例として、蛋白はリポ
ソームのような微粒子の内部に封入してもよい。さらに
他の例として、ＶＺＶ糖蛋白は死滅したボルデテラ属（
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）または破傷風トキソイドのよう
な免疫刺激性巨大分子に結合させることができる。

ワクチンの製造はＮｅｗ　ＴｒｅｎｄｓａｎｄＤｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎＬｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ，　Ｖｏｌ
ｌｅｒ　ｅＬ　ａｌ．（ｅｄｓ．），　Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ，　ＢａｌＬｉｍｏｒｅ
，　Ｍａｒｙｌａｎｄ，ｌ９７８に一般的に記載されて
いる。リポソーム内部への封入はＦｕｌｌｅｒｔｏｎ．
米国特許第４２３５８７７号に記載されている。巨大分
子への蛋白の結合は、例えばＬｉｋｈｉＬｅ，米国特許
第４３７２９５４号およびＡｒｍｏｒ　ｅＬ　ａｌ．，
米国特許第４４７４７５７号に開示されている。Ｑｕｉ
ｌＡの使用はＤａｌｓｇａａｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｃ
Ｌａ　ＶｅＬ　Ｓｃａｎｄ，　１８：３４９　（１９７
７）に記載されている。

以下の実施例は例示するものであって、本発明を限定す
るものではない。制限酵素および他の試薬類は実質的に
製造者の説明書に従って使用した。

ＩＶ２０１１ ｖＺｖゲノムＤＮＡは水痘にかかった患者から単離した
（ベルギー　リエージュ、サート・チルマン、リエージ
ュ大学、病理学研究所、Ｒｅｎｔｉｅｒ教授）。このウ
イルスＤＮＡはＢａｍＨＩで消化し、塩基１１４０４２
　　１１８００４　（Ｄａｖｉｓｏｎｅｔ　ａ＋．，　
Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ．　６７：ｌ７５９−１８１６
　（１９８６）を参照）に対応する４キロ塩基対の断片
を単離した。

この断片を標準大腸菌クローニングベクターのプラスミ
ドｐＵｃ９のＢ　ａ　ｍ　Ｈ　Ｉ部位にクローン化して
、グラスミドｐＮＩＶ２００５を作製した。

プラスミドｐＮＩＶ２００５は、推定上のシダナル配列
と５′および３′非翻訳ＤＮＡを含む、６２３個のアミ
ノ酸から或る全ＶＺＶｇｐＩｆｌＦ白をコードする。

ｐＮＩＶ２００５７５’らの１９６５塩基対ｃ７）Ｂｇ
Ｉ１−ＢｃｌＩ断片をＤＮＡポリメラーゼ（すむわち、
Ｋｌｅｎｏｗ）で平滑末端となし、代表的なシャトルベ
クター（ここではＴ　ｉ　ｇＮＤと呼ぶ）の平滑末端化
Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂｃｌ１部位にクローン化して、プラ
スミドｐＮｒＶ２００１を作った。

プラスミドＴ　ｉ　ｇＮＤはプラスミドＴＮＤ　（Ｃｏ
ｎｎｏｒｓ　ｅＬ　ａｔ．，　Ｄ　Ｎ　Ａ　．　７：６
５１−６６１　（１９８８）　）の誘導体である。ブラ
スミドＴ　ｉ　ｇＮＤは、ラウスＬＴＲがマウスガンマ
２ｂｆｆｉ鎖免疫グロプリンエンハンサー配列に置き換
えられている点で、グラスミドＴＮＤと相違する。

５′非翻訳ＤＮＡを除くために、ｐＮＩＶ２００ｌをＮ
ｓ　ｐＩ［ｒ、ＢｇｌｌｌおよびＰｐｕｍＩで消化した
。２つの断片、５３２塩基対（ｂ　ｐ）のＮｓｐＩＩ［
（平滑末端）−Ｂｇｌｌｌ断片と７１８７ｂｐのＢｇｌ
［Ｉ−ＰｐｕｍＩ断片を単離した。これらの断片はプラ
スミドＴｉｇＮＤからの７４１ｂｐのＰｐｕｍＩ−Ｈｉ
ｎｄｌｌｌ（平滑末端）断片と連結させて、プラスミド
ｐＮＩＶ２００２を作った。ｐＮＩＶ２００２では、Ａ
ＴＧの５６塩基対上流にＩ｛　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位が再
形成される。

プラスミドｐＮＩＶ２００２から、ｖｚｖ　　ｇｐＩコ
ード領域を含むグラスミド（ただし、カルボキシ末端ア
ンカー配列を欠くが、シグナル配列を保持する）を作製
した。このベクターは、８６ｌｂｐのＩＩ　ｉ　ｎｄｍ
−｝１ｇ　ｉＡＩ断片（アミノ酸１２６８をコードする
）を８１７ｂｐのＨｇｉＡｌ−Ａｖａ１１断片（アミノ
酸２６９−５４１をコードする）に連結し（両断片とも
ｐＮ　Ｉ　Ｖ２　００２から単離した）、アミノ＃５４
２−５４６および終結コドンをコードするＡｖａｕ−Ｂ
ｃｌＩ合戒リンカー： ５＞　ＧＡＣＣＧＧＡＧＧＧＣＴＴＧＣＡＴ　　　　＜
３３＞　　　　　ＧＣＣＴＣＣＣＧ入ＡＣＧＴＡＣＴＡ
Ｇ　　＜５に連結することによりｆ’ＦＩＩｌた。

これをグラスミドＴｎｄＨＢＢのＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ　
−Ｂｃ　Ｉ　１部位に連結して、プラスミドｐＮＩＶ２
００４を作った。（プラスミドＴ　ｎ　ｄ　Ｉ｛　Ｂ　
Ｂは上記グラスミド，ＴＮＤの修飾体であって、ｐＵＣ
ｌ９配列の両側にＮｏｔＩ部位が導入された。）このベ
クターはアミノ酸１−５／１６をコードし、その５′末
端に制限部位ＩＩ　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ［Ｉが、そしてその
３′末端にＢｃｌＩが存在する。

プラスミドｐ　Ａ　ｃ　Ｙ　Ｍ　ｌは、ポリヒドリン遺
伝子グロモーターを含むがポリヒドリン遺伝子を含まな
いＡ　ｃ　Ｍ　Ｎ　Ｐ　Ｖゲノムからの配列と、高コピ
ー数の細菌グラスミドｐＵＣ３からの配列を含むバキュ
ロウイルスシャトルベクターである。

ＭａＬｓｕｕｒａ　ｅＬ　ａｌ．，　Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉ
ｒｏｌ．　６８：１２３３−５０　（１９８７）を参照
されたい。

９Ｎ目Ｖ２００４から、“アンカーレス”ｇｐ■配列を
含むＬ６９５ｂｐのＨｉｎｄｌ［−Ｔ３ｃｌＩ断片を単
離し、ＤＮＡポリメラーゼＩで平滑末端とした。その後
、この断片はプラスミドｐＡｃＹＭＩの平滑末端化Ｂ　
ａ　ｍ　Ｈ　１部位（ポリヒドリングロモーターのちょ
うど３′側）に連結した。

この新規グラスミドをここではｐＮＩＶ２０１１と呼ぶ
ことにする。

Ｂ）“アンカーレス″’ｇｐｌ［：ブラスミドｐＮｘＶ
２０１４ ＶＺＶゲノムＤＮＡ　（バートＡ参照）を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで消化した。塩基４９３６２−６４７　３　５　
（Ｄａｖｉｓｏｎ　ｅＬａｌ．，回書参照）に対応する
１５キロ塩基対の断片を単離し、平滑末端となし、別の
標準クローニングベクター、グラスミドｐＵＣｌ９のＨ
　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１部位にクローン化した。ｐＮＩＶ２
００８と呼ばれるこの新しいブラスミドは、８６８個の
アミノ酸から戊る完全ｖｚｖ　　ｇｐＩＩ蛋白をコード
し、推定上のシグナル配列（アミノ酸１−９）と５′お
よび３′非翻訳ＤＮＡを含んでいる。

非翻訳ＤＮＡを含まずかつカルボキシ末端アンカー配列
を欠くクローンを得るために、２つ以上のプラスミドの
作製が必要であった。初めに、Ｈｉｎｄｌ［［　一Ｍａ
ｅｍ合成り冫カー（最初の２個のアミノ酸をコードする
）： ５＞　ＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＴＴ　　　　　＜３３
＞　　　　　　ＡＴＧＧＴＡＣＡＡＡＣＡＡＴＧ　　　
＜５をｐＮＩＶ２００８からの８４０ｂｐのＭ　ａ　ｅ
　Ｉ［ｒＰｓｔＩ断片（アミノ酸３−２８３をコードす
る）に連結し、その後この断片をｐＵＣ　１　９ベクタ
ーのＨｉｎｄｌｌｌ−ＰｓｔＩ部位に連結することによ
り、５′非翻訳ＤＮＡを除去した。ｇｐＩＩのアミノ部
分を含むこのベクターはクローン“Ａ”と命名した。ク
ローン″Ａ“から８５４ｂｐのＨｉｎｄＩ［［−Ｐｓｔ
Ｉ断片を単離し、この断片をｐＮＩＶ２００８からの１
２３５ｂｐのＰｓｔＴ−Ｓａｃ［［断片（アミノ酸２８
４−６９４をコードする）および合戊リンカー（アミノ
酸６９５−６９８および停止または終結コドンをコード
する）：に連結した。

これらの断片はその後ｐＵｃｌ９のＨｉｎｄＩＩＩＥｃ
ｏＲ１部位に連結してクローン“Ｃ”　　（ｐＮＩＶ２
０３９）を作った。このベクターはｇｐＵのアミノ酸１
−６９８　（すなわち、シグナル配列を含むが、アンカ
ー配列を含まない）をコードし、その５′末端にＨｉｎ
ｄｌｌが、そしてその３′末端にＦＩ　ｉ　ｎ　ｄ　ｎ
が存在する。

クローン“Ｃ″から“アンカーレス”ｇｐＴＪ配列を含
む２１０８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈｉｎｄｌｆ断片を
単離し、ＤＮＡポリメラーゼ■（すなわち、旧ｅｎｏｗ
）で平滑末端とした。その後、この断片はプラスミドｐ
　Ａ　ｃ　Ｙ　Ｍ　１の平滑末端化ＢａｍＨＩ部位（ポ
リヒドリンプロモーターのちょうど３′側）に連結した
。ｐＮＩＶ２０１４と呼ばれるこのグラスミドでは、Ａ
ＴＧのＡが連結接合点から９塩基下流に存在する。

Ｃ）″アンカーレス”ｇｐＩＩＩ：プラスミドｐＮＩＶ
２０１２ 塩基６　４　７　３　５　　７　７　６　５　６　（Ｄ
ａｖｉｓｏｎ　ｅＬ　ａｌ．，同書参照）に対応する１
２．９ＫｂｐのＥｃｏＲＩ断片（バートＢ参照）を単離
し、ｐＵＣ９のＥｃｏＲ１部位に連結した。このブラス
ミドｐＮＩＶ２００７は８４１個のアミノ酸から成る完
全ＶＺＶ　　ｇｐＩＩＩ蛋白、シグナル配列（シグナル
配列はその疎水性から推定した）、および非翻訳ＶＺＶ
　ＤＮＡをコードしている。

さらにベクターの構築を進めるために、４４００ｂｐの
Ｍ　ｌ　ｕ　Ｉ断片を平滑末端とｆｔ　Ｉ，、プラスミ
ドｐＵｃ１９の平滑末端化Ｈｉｎｄｌｌ制限部位に連結
しｌ；。このプラスミドをここではｐＮＩＶ２００３と
呼ぶことにする． ｐＮ夏Ｖ２００３から、ＶＺＶ　　ｇｐＩＩＩ（ｒ）コ
ード配列を含むプラスミド（ただし、カルボキシ末端ア
ンカー．配列を欠くが、シグナル配列を含む）を作製し
た。４つの断片は上記のプラスミドＴｎｄ　Ｈ　Ｂ　Ｂ
のＨｉｎｄｌ［［−ＢｃｌＩ部位に連結した。

それらはアミノｍｌ−１３をコードする合戒Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ−Ａｖａｎ　　ＤＮＡ断片：ｐＮＩＶ２００３から
の２３１ｂｐのＡｖａｆｆ−ＡａＬＩＩ断片（アミノ酸
１４−９１をコードする）ｐＮＴＶ２００３からの２１
０３ｂｐのＡａｔＨ−Ａｓｕｆｆ断片（アミノ酸９２−
７９２をコードする）、およびアミノ酸７９３−８０２
と終結コドンをコードする合成ＡｓｕＩＩ−Ｂｃ　ｌ　
Ｉ断片二から戊っている。得られたベクターはアミノ＃
ｌ−８０２をコードし、その５′末端に制限部位Ｈｉ　
ｎｄｌｌ［が、そしてその３′末端にＸｂａ　Ｉが存在
する。

“アンカーレス”ｇｐＩＩＩ配列を含む２４２２ｂｐの
ＨｉｎｄｎＩ−ＸｂａＩ断片はＤＮＡポリメラーゼ■（
すなわち、Ｋｌｅｎｏｖ）で平滑末端となし、単離した
。その後、この断片をグラスミドｐＡｃＹＭＩの平滑末
端化ＢａｍＨ１部位（ポリヒドリンプロモーターのちょ
うど３′側）に連結して、グラスミドｐＮＩＶ２０１２
を作製した。

実施例２ 昆虫細胞による発現 スポドグテラ・７ルギペルダ（　ＳｐｏｄｏｐＬｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）　９　（Ｓ　ｆ　９　）細胞は
Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，　ＭＤ，　Ｕ
ＳＡ）から入手できる。Ｓｆ９細胞は、実質的にＳｕｍ
ｍｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，　ＴＡＥＳ　Ｂｕｌｌ　　Ｎ
ＲＭａｙ　１９８７に記載されるように、次の組換えベ
クター　プラスミドｐＮＩＶ２０１１，ｐＮＩＶ２０１
４また（ｉｐＮＩＶ２０１２（７）うち（７）１種、お
よび野生型ＡｃＭＮＰＶ　ＤＮＡを用いて、それぞれ５
０μｇおよびｌμｇで、同時トランスフエクトした。

生成したウイルス粒子は上清を集めることにより回収し
た。その後、このウイルス含有培地を用いて、プラーク
検定によりＳｆ９細胞に感染させＩ二。グラーク精製し
ｔ二組換えバキュロウイノレスによるＳｆ９細胞のその
後の感染は、ポリヒドリン蛋白の代わりにＶＺＶ糖蛋白
を発現する細胞をもたらした。

ｐＮＩＶ２０１１から誘導された組換えバキュロウイル
ス感染細胞は、カルボキシ末端アンカー配列を欠＜ｇｐ
Ｉ蛋白を発現・分泌することが明らかとなった。完全■
ＺＶ蛋白に対して誘導されたウサギポリクローナル抗血
清を用いて行ったウェスタンプロット分析は、約６０キ
ロダルトンに本質的にｌ木のバンドを示した。

ｐＮＩＶ２０１４から誘導された組換えバキュロウイル
ス感染細胞は、カルボキシ末端アンカー配列を欠＜ｇｐ
■蛋白を発現することが明らかとなった。ｇｐＩと同様
に行ったウェスタンプロット分析は、約６３および８５
キロダルトンの本質的に２本のバンドを示した。

実施例３ ｐＮ■ｖ２０３９から“７７カ−レＸ”　ｇ　ｐＩＩ配
列を含む２１０８ｂｐのＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ　（平滑末
端）−｝｛ｉｎｄＵ断片を単離し、上記のグラスミドＴ
ＤＮのＨｉｎｄｌｌｌ（平滑末端）とＥｃｏＲＶの間に
挿入して、グラスミドｐＮＩＶ２０３４を得た６２）ｇ
ｐｕｓ”ａ−を発現するＣＨＯクローンの選別 ＣＨＯ　　ＤＨＦＲ−細胞４ｔｐＮＩＶ２０３４を用い
てエレクトロポレーションにより形質転換した。

抗生物質Ｇ４１８に対する耐性に基づいて形質転換細胞
を選別しｔ；。各構築物に対して約１００クローンから
の使用済み培地および細胞抽出物を、ｇｐＩＩの存在に
ついて試験した。最も有望なクローンを５ｎＭのメトト
レキセートの存在下で増幅させた。各構築物に対して約
２４クローンを再度試験した。

実施例４ ＶＺＶ糖蛋白を含むワクチン 本発明の例示的ワクチンは次のようにして調製した。木
発明の組換えＶＺＶＷ蛋白（例えば、昆虫誘導糖蛋白）
を、Ｏ．１〜１０００μｇ　／　ｍ　ｌ、好ましくはｌ
−１００μｇ／ｍＩのポリペプチドの最終濃度となるよ
うに、撹拌しながら、０．５ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのＡ　
Ｉ　”　（水酸化アルミニウムゲルとして）を含む緩衝
塩溶液（１　５０ｍＭ　ＮａＣ　ｌ、１０ｍＭ　　リン
酸ナトリウム　ｐＨ６．８；濾過滅菌済み）に加えた。

ｐＨ６．８に維持して、この混合物を約４℃で一晩放置
した。チメロサールを０．０００５％の最終濃度となる
まで加えた。必要に応じてｐＨを調べ、ｐＨ６．８に調
整した。

それぞれのワクチンに含まれる昆虫誘導ＶＺＶ糖蛋白の
量は、副作用を誘発せずに免疫防御応答を誘発する愈と
して選択される。このような量は、どの特定ポリペプチ
ドを使用するか、またワクチンがアジュバントを含むか
どうか、により変化するであろう。個々のワクチンの適
量は標準試験により、例えば被験者における抗体力価や
他の応答を観察することにより、確かめることができる
。

一次ワクチン接種後、被験者は防御免疫応答を増強し維
持するために、必要に応じて間隔をおいて追加の抗原量
を受け取るであろう。

ワクチンは好ましくは非経口的に、例えば筋肉内（ｉｍ
）または皮下（ｓｃ）に投与されるが、他の投与経路も
防御応答を誘起するために使用できる。

上記の説明および実施例は本発明並びにその好適な実施
態様を十分に開示している。本発明は詳述した実施態様
に限定されるものではなく、特許請求の範囲に含まれる
すべての変更および修飾を包含するものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）、アンカーレスｇｐ I 、アンカーレスｇｐII、
   またはアンカーレスｇｐIIIから成る水痘帯状庖疹ウィ
   ルス糖蛋白からの蛋白。 （２）、カルボキシ末端において全長糖蛋白の全アミノ
   酸残基の４〜２０％を欠失している、請求項１記載の蛋
   白。 （３）、ｇｐ I １−５４６、ｇｐII１−６９８および
   ｇｐIII１−８０２から選ばれる、請求項２記載の蛋白
   。 （４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞により生産さ
   れた、請求項１〜３のいずれか１項記載の蛋白。 （５）、請求項１〜４のいずれか１項記載の蛋白をコー
   ドするＤＮＡ配列。 （６）、請求項５記載のＤＮＡ配列を宿主細胞内で発現
   しうる複製可能な発現ベクター。（７）、請求項６記載
   の複製可能な発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 （８）、組換え昆虫細胞により生産されたＶＺＶ糖蛋白
   。 （９）、ｇｐ I 、ｇｐIIまたはｇｐIIIである、請求項
   ８記載のＶＺＶ糖蛋白。 （１０）、カルボキシ末端アンカー配列を欠く、請求項
   ９記載のＶＺＶ糖蛋白。 （１１）、ｇｐ I １−５４６、ｇｐII１−６９８およ
   びｇｐIII１−８０２から選ばれる、請求項１０記載の
   ＶＺＶ糖蛋白。 （１２）、鱗翅目の昆虫細胞またはショウジョウバエ属
   の昆虫細胞により生産された、請求項８〜１１のいずれ
   か１項記載の蛋白。 （１３）、昆虫細胞内で機能する調節要素に機能しうる
   状態で連結された、請求項８〜１１のいずれか１項記載
   のＶＺＶ糖蛋白をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤ
   ＮＡ分子。（１４）、請求項１３記載の組換えＤＮＡ分
   子を含む組換えバキュロウイルス。 （１５）、請求項１３または１４記載の組換えＤＮＡ分
   子またはバキュロウイルスを含む昆虫細胞。 （１６）、免疫防御量の請求項１〜４および８〜１２の
   いずれか１項記載の蛋白および製剤学的に許容しうる担
   体を含む、水痘および帯状庖疹に対してヒトを防御する
   ためのワクチン。 （１７）、ワクチンとして使用するための、請求項１〜
   ４および８〜１２のいずれか１項記載の蛋白。 （１８）、ワクチンを製造するための、請求項１〜４お
   よび８〜１２のいずれか１項記載の蛋白の使用。 （１９）、組換え宿主細胞内で下記蛋白をコードするＤ
   ＮＡ配列を発現させ、その蛋白生産物を回収することか
   ら成る、請求項１〜４のいずれか１項記載の蛋白の生産
   方法。 （２０）、昆虫細胞内で下記蛋白をコードするＤＮＡ配
   列を発現させ、その蛋白生産物を回収することから成る
   、請求項８〜１２のいずれか１項記載の蛋白の生産方法
   。