CZ283283B6 - Deleční mutanty bovinního herpesvirusu typu 1, vakcíny založené na těchto delečních mutantách a diagnostické soupravy pro detekci bovinního herpe sviru typu 1 - Google Patents

Abstract

Deleční mutanta bovinního herpesviru typu 1, která má deleci v genu pro glykoprotein gE. Mutanta může dále mít deleci v genu pro thymidinkinázu a/nebo v genu pro glykoprotein gI, nebo může být vložen heterologní gen. Rekombinantní nukleová kyselina, která obsahuje gen gE nebo jeho část. Glykoprotein gE, peptidy na něm založené a komplexy glykoproteinů gE a gI a protilátky proti nim. Vakcíny a diagnostické soupravy obsahující jakýkoliv z těchto materiálů.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká mutantu bovinního herpesového viru typu 1, BHV-1, způsobu jeho přípravy a způsobu přípravy vakcíny, očkovacího prostředku pro zvířata, dále pak diagnostické soupravy pro detekci nukleové kyseliny BHV-1 ve vzorku, jakož i způsobu určení infekce BHV-1 zvířete.

Jedná se zde o vakcinaci a diagnostiku nemocí, způsobovaných patogeny, při čemž se používá jak klasických metod podání živé oslabené vakcíny nebo inaktivované vakcíny, tak i moderních metod, založených na DNA rekombinantní technologii.

Vynález se týká zvláště živé oslabené vakcíny a inaktivované vakcíny na ochranu zvířat, zejména skotu, proti bovinnímu herpesovému viru typu 1. Tyto vakcíny jsou navrženy tak, že nejsou pouze bezpečné a účinné, ale také vytvářejí možnost rozlišení infikovaných zvířat od neinfikovaných v očkované populaci.

Diagnostická souprava se používá při testech k rozlišení infikovaných a neinfikovaných zvířat v očkované populaci.

Dosavadní stav techniky

BHV-1, včetně infekčního bovinního viru rhinotracheitidy (IBRV) a infekčního viru pustulámí vulvovaginitidy (IPVV), hraje důležitou roli v patogenezi nemocí dýchacího ústrojí a poruch plodnosti u skotu. Po akutní infekci BHV-1 často zůstává přítomný v hostiteli v latentní formě. Latentní virus může být reaktivován vlivem inter alia stresu, který může, ale nemusí být doprovázen klinickými příznaky, a následně vylučován. Následkem toho musí být infikovaný dobytek považován za celoživotního potenciálního přenašeče BHV-1. BHV-1 se objevuje endemicky v 75 % dánských dobytčích farem. Zejména starší dobytek je sérologicky pozitivní.

Existuje mnoho inaktivovaných (mrtvých) vakcín a mnoho atenuovaných (živých) vakcín, dostupných pro očkování proti infekci BHV-1. Inaktivované vakcíny jsou připraveny umrtvením viru BHV-1, např. teplem, zářením, ethanolem nebo formalinem. To ovšem poskytuje nedostatečnou ochranu. Atenuované vakcíny jsou připravovány četným pasážováním v homologních (bovinních) nebo heterologních buňkách, např. prasečích nebo psích, a někdy je navíc virus ještě fyzikálně nebo chemicky upraven. Tímto způsobem se ve virovém genomu vyvinou neznámé mutace/delece, které často redukují patogenní vlastnosti viru. Atenuované živé vakcíny poskytují lepší ochranu než inaktivované vakcíny mimo jiné proto, že prezentují více virových antigenů imunitnímu systému hostitele. Další důležitou výhodou živých vakcín je to, že mohou být podávány intranazálně, to jest v místě, kde se poprvé pomnoží divoký virus po infekci. Živé vakcíny zatím nechávají dostatek prostoru pro zlepšení. Zdá se, že některé živé vakcíny mají stále schopnost způsobovat aborty, což je výrazné zejména po intramuskulámí aplikaci. Nadto pravděpodobně všechny živé vakcíny zůstávají latentně přítomny v očkované krávě. Navíc jestliže se vakcína odlišuje jen velmi málo od divokého typu viru, může se objevit reverze virulence. Ale hlavní problém je to, že vakcíny BHV-1 nemohou zabránit infekci divokým typem viru. Výsledkem je to, že očkovaný dobytek může také šířit divoký typ viru BHV-1.

Pro vhodný program ke zvládnutí BHV-1 je nezbytné mít k dispozici účinnou a bezpečnou vakcínu, která může být odlišena od divokého typu viru, neboť aplikace účinné vakcíny může značně redukovat cirkulující BHV-1, a tudíž test, který může rozlišit mezi vakcínou a divokým typem viru, umožní detekovat (a pak odstranit) infikované jedince v očkované populaci.

- 1 CZ 283283 B6

Dosud byly vyvinuty BHV-1 vakcíny, které se zdají být bezpečnější než konvenční vakcíny a jsou odlišitelné od divokého typu viru. Byl izolován deleční mutant s defektem v genu pro thymidinkinázu, který způsobuje aborty v menším stupni, stává se méně často latentní a nemůže být reaktivován. Dále byla, užitím technik rekombinantní DNA, vytvořena BHV-1 vakcína, která má deleci v genu pro glykoprotein glll, což umožní tuto vakcínu odlišit od divokého typu BHV-1 sérologickými technikami. Přesto existují určité námitky proti těmto vakcínám. Na jedné straně, gen pro thymidinkinázu je potřebný pro virovou replikaci a menší replikace snižuje ochrannou funkci vakcíny. Na druhé straně glykoprotein glll je důležitý pro vznik ochranných protilátek, a proto vakcína s deleci glll je méně účinná. Praktický problém je, že intranazální podání, které všeobecně poskytuje nejlepší ochranu, není v někteiých zemích pro rekombinantní vakcíny povoleno. Proto je vyžadována taková vakcína, která je bezpečná a také účinná a ještě může být odlišena od divokého typu BHV-1 aje dále žádoucí, aby přinejmenším jedna z takovýchto vakcín byla založena na viru, atenuovaném spíše konvenční cestou, než na viru, vytvořeném technikami rekombinantní DNA.

Pasážemi v tkáňových kulturách byl nyní získán kmen BHV-1, který postrádá gen pro glykoprotein gE. První výsledky našeho výzkumu naznačují, že tento gen je užitečný pro sérologické rozlišení s ohledem na divoký typ BHV-1 a že je zapojen v expresi virulence. Proto jeho delece přispívá k bezpečnosti a může tak učinit deleci v genu pro thymidinkinázu přebytečnou. Glykoprotein gE se zdá být méně důležitý pro indukci ochrany než glykoprotein glll. Konvenčně atenuovaný kmen BHV-1, který může být sérologicky odlišen od divokého typu viru, je unikátní. Umístění a sekvence DNA genu gE, ani z ní odvozené oligonukleotidy, polypeptidy a oligopeptidy, nebyly dříve známy a jsou zde popsány poprvé. Test pro sérologické rozlišení na podkladě genu pro gE je také unikátní.

Důležitá výhoda tohoto konvenčního gE delečního mutantu (konvenční se vztahuje na užití konvenční metody pro izolaci atenuovaného viru) je to, že bude možné podávat jej intranazálně i v zemích, kde je toto pro rekombinantní vakcíny zakázáno.

Vzhledem k odlišným názorům na bezpečnost byly navíc k těmto konvenčním delečním vakcínám zkonstruovány také dobře definované rekombinantní vakcíny. Tyto rekombinantní vakcíny mají také gE deleci a mohou nebo nemusejí mít také deleci v thymidinkinázovém genu a také mohou být užity jako vektory pro expresi heterologních genů. Všechny tyto rekombinantní vakcíny je možné rozlišit od divokého typu viru stejným testem, specifickým pro gE. Užití standardního testu pro soubor různých vakcín může být velká výhoda v mezinárodním boji proti BHV-1. Takovýto přístup, týkající se oboru BHV-1 vakcín, nebyl dosud popsán.

Sérologické analýzy odpovědi proti BHV-1 u dobytka ukázaly, že důležitý podíl protilátek anti-gE je namířen proti komplexu, tvořenému glykoproteinem gE a dalším BHV-1 glykoproteinem, a sice gl. Sérologické testy, které také dokazují přítomnost protilátek, specifických pro takový komplex, mohou být více citlivé než testy, které detekují pouze protilátky anti-gE. Dobytek, očkovaný jednoduchými gE delečními mutanty, může produkovat protilátky anti-gl, které mohou interferovat s detekcí protilátek anti-gl/gE. Proto tento vynález obsahuje také vakcínu s dvojitou gl/gE deleci.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je mutant bovinního herpesového viru, uložený v Pasterově institutu ve Francii pod číslem 1-1213.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy mutantu bovinního herpesového viru typu 1, BHV-1, jehož podstata je v tom, že se deletuje alespoň část glykoproteinového gE-genu, přičemž

-2CZ 283283 B6 gE je protein, který, zejména v BHV-1 kmenu, má aminokyselinovou sekvenci podle obrázku 3A.

Podle jednoho provedení způsobu se deletuje gE-gen.

Podle jiného provedení způsobu se deletuje gE-gen podle obrázku 3A z pozice asi 168 do asi 1895.

Podle dalšího provedení způsobu se deletuje gE-gen podle obrázku 3 A z pozice asi 168 do asi 1427.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy vakcíny, jehož podstata je v tom, že se smísí farmaceuticky přijatelný nosič s mutantem bovinního herpesového viru typu 1, BHV-1, získaným shora uvedeným způsobem.

Při dalším provedení způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy.

Při jiném provedení způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 se zkonstruuje mutant, který má deleci v gl-genu glykoproteinu.

Jinou možností způsohu přípravy mutantu kmenu BHV-1 je, že se BHV-1 kmen podrobí postupu, kterým se vytvoří kromě delece v jeho gE-genu glykoproteinu také delece v genu thymidinkinázy a delece v gl-genu.

Ještě při jiném provedení způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 se zkonstruuje mutant, který obsahuje heterogenní gen a má deleci v gE-genu glykoproteinu, který umožňuje sérologické odlišení mutantu od divokého typu BHV-1.

Další možností způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle vynálezu je, že se zkonstruuje mutant, který má heterologní gen vložen do místa gE-genu a který je pod kontrolou regulačních sekvencí, například gE-genu nebo heterologního genu, a popřípadě je připojen k té části gE-genu, která kóduje signální peptid.

Podle ještě jiného provedení způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy, deleci v gl-genu nebo obě, přičemž heterologní gen je vložen do místa alespoň jedné z těchto deleci.

Jinou možností způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 je, že se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy, deleci v gl-genu nebo obě, heterologní gen je vložen do alespoň jedné z těchto deleci, přičemž v případě, že mutant má dvojí deleci, kterou je delece v gE-genu a delece v genu thymidinkinázy, heterologní gen není vložen do genu thymidinkinázy.

Další postup při způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 je, že se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy, deleci v gl-genu nebo obě, heterologní gen vložený do alespoň jedné z těchto deleci má dvojitou deleci, kterou je delece v gE-genu a delece v genu thymidinkinázy, a heterologní gen neznamená gen bovinního respiračního syncyciálního viru F nebo N.

Ještě jiným provedením způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 je, že se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy, deleci v gl-genu nebo obě, heterologní gen je vložen do alespoň jedné z těchto deleci, přičemž v případě, že mutant má

-3CZ 283283 B6 dvojitou deleci, kterou je delece v gE-genu a delece v genu thymidinkinázy, jsou vloženy alespoň dva heterologní geny.

Konečně posledním možným provedením způsobu přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle tohoto vynálezu je, že se zkonstruuje mutant, v němž heterologní gen kóduje imunogenní protein nebo peptid jiného patogenu, nebo kóduje cytokin.

Jiným předmětem tohoto vynálezu je očkovací prostředek k očkování zvířat, zejména savců, zvláště hovězího dobytka, k jejich ochraně proti BHV-1, jehož podstata je vtom, že obsahuje živou, nebo inaktivovanou vakcínu obsahující mutant BHV-1, uložený v Pasterově institutu ve Francii pod číslem 1-1213, získaný shora uvedeným způsobem, a vhodný nosič nebo pomocné činidlo.

Očkovací prostředek podle vynálezu k očkování zvířat, zejména savců, zvláště hovězího dobytka, k jejich ochraně proti patogenu, může obsahovat živou nebo inaktivovanou vakcínu obsahující mutant BHV-1, získatelný shora uvedeným způsobem, a vhodný nosič nebo pomocné činidlo, přičemž heterologní gen tohoto mutantu kóduje imunogenní protein nebo peptid patogenu.

Předmětem vynálezu je rovněž diagnostická souprava pro detekci nukleové kyseliny BHV-1 ve vzorku, zejména v biologickém vzorku, jako jsou krev nebo krevní sérum, krevní buňky, mléko, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, sperma, obzvláště semenná kapalina, sliny, sputum nebo tkáň, zejména nervová tkáň, pocházející ze zvířete, zvláště savce, zejména hovězího dobytka, jejíž podstata je v tom, že obsahuje sondu nukleové kyseliny nebo primer s nukleotidovou sekvencí, odvozenou od gE-genu viru BHV-1, přičemž tento gE-gen je umístěn v genomu BHV-1 podle obrázku 6, a detekční prostředky, vhodné pro detekční zkoušky nukleové kyseliny.

Diagnostická souprava podle vynálezu pro detekci protilátek, které jsou specifické pro BHV-1, ve vzorku, zejména biologickém vzorku, jako jsou krev nebo krevní sérum, sliny, sputum, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, mléko nebo tkáň, pocházející ze zvířete, zvláště savce, zejména hovězího dobytka, je charakteristická tím, že obsahuje gE viru BHV-1, část gE, peptid, odvozený od gE, nebo komplex glykoproteinu gE a gl viru BHV-1, a detekční prostředky, vhodné pro detekční zkoušku protilátky.

Diagnostická souprava podle vynálezu může dále obsahovat jednu nebo více protilátek, které jsou specifické pro gE viru BHV-1 nebo komplex glykoproteinů gE a gl viru BHV-1.

Tato diagnostická souprava pro detekci protilátek, které jsou specifické pro BHV-1, ve vzorku, zejména biologickém vzorku, jako jsou krev nebo krevní sérum, sliny, sputum, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, mléko nebo tkáň, zejména nervová tkáň, pocházející ze zvířat, zvláště savců, zejména hovězího dobytka, je vytvořena tak, že obsahuje protilátku, která je specifická pro gE viru BHV-1 nebo komplex glykoproteinů gE a gl viru BHV-1, a detekční prostředky, vhodné pro detekční zkoušku protilátky.

Diagnostická souprava podle vynálezu pro detekci proteinu viru BHV-1 ve vzorku, zejména v biologickém vzorku, jako jsou krev nebo krevní sérum, krevní buňky, mléko, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, sperma, zvláště semenná kapalina, sliny, sputum nebo tkáň, zejména nervová tkáň, pocházející ze zvířete, zvláště savce, zejména hovězího dobytka, může s výhodou obsahovat protilátku, která je specifická pro gE viru BHV-1, nebo komplex glykoproteinů gE agl viru BHV-1, a detekční prostředky, vhodné pro detekční zkoušku proteinu.

Posledním předmětem tohoto vynálezu je způsob určení infekce BHV-1 zvířete, zvláště savce, zejména hovězího dobytka, jehož podstata je vtom, že se vyšetřuje vzorek, pocházející ze

-4CZ 283283 B6 zvířete, zejména biologický vzorek, jako je krev nebo krevní sérum, krevní buňky, sperma, zvláště semenná kapalina, sliny, sputum, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, mléko nebo tkáň, zejména nervová tkáň, na přítomnost nukleových kyselin, obsahujících gE-gen viru BHV-1, tento gE-gen je umístěn v genomu BHV-1 podle obrázku 6, na přítomnost viru BHV-1 nebo komplexu glykoproteinů gE a gl viru BHV-1 nebo na přítomnost protilátek, které jsou specifické pro gE viru BHV-1 nebo komplex glykoproteinů gE a gl viru BHV-1.

Výhodný způsob určení infekce podle vynálezu spočívá v tom, že se zkoumá vzorek, pocházející ze zvířete, které je očkováno očkovacím prostředkem podle vynálezu.

Podstatou tohoto vynálezu je především deleční mutant BHV-1, který má deleci v genu pro glykoprotein gE. Výraz delece v znamená deleci genu jako celku.

Výhodným provedením vynálezu je deleční mutant BHV-1, který má deleci v genu pro glykoprotein gE a který byl získán atenuačním postupem, stejně jako deleční mutant Difivac-1, který bude popsána dále.

Dalším výhodným provedením vynálezu je deleční mutant BHV-1, obsahující deleci v genu pro glykoprotein gE, který se zkonstruuje technikou rekombinantní DNA, jako deleční mutanty 1B7 nebo 1B8, popsané dále.

Další výhodné provedení vynálezu spočívá v dvojitém delečním mutantu BHV-1, obsahujícím deleci v genu pro glykoprotein gE a deleci v genu pro glykoprotein gl, což je dále popsáno jako gl/gE dvojitý deleční mutant Difivac-IE.

Dále se podle vynálezu dává přednost, s ohledem na maximální bezpečnost, delečnímu mutantu BHV-1, který má deleci v genu pro glykoprotein gE a deleci v genu pro thymidinkinázu. Vynález také zahrnuje deleční mutant BHV-1, který má deleci v genu pro glykoprotein gE, genu pro glykoprotein gl a genu pro thymidinkinázu.

Vynález poskytuje též prostředek pro očkování zvířat, zvláště savců, speciálně hovězího dobytka, k ochraně proti BHV-1, přičemž vakcína obsahuje deleční mutant BHV-1, jak je definováno výše a vhodný nosič nebo adjuvans. Řečená směs může být živá nebo inaktivovaná očkovací směs.

Vynález je dále ztělesněn v mutantu BHV-1, který má deleci v genu pro glykoprotein gE a obsahuje heterologní gen, zavedený technikou rekombinantní DNA. Týká se to hlavně mutantu BHV-1, který obsahuje heterologní gen, zavedený technikou rekombinantní DNA v místě genu pro glykoprotein gE, přičemž heterologní gen je pod kontrolou regulačních sekvencí genu gE a je volitelně připojen k části genu gE, která kóduje signální peptid. Zmíněný heterologní gen může být také pod kontrolou jiného promotoru BHV-1, nebo pod kontrolou heterologního promotoru. Když mutant BHV-1 má další deleci navíc k deleci v genu pro glykoprotein gE, jako deleci v genu pro thymidinkinázu a/nebo deleci v genu pro glykoprotein gl, zmíněný heterologní gen může být také vložen do místa této dodatečné delece nebo deleci. Vícečetné inzerce jsou další možností, buďto společně v místě jedné delece, nebo odděleně v místě několika deleci.

Je vhodné, aby zavedený heterologní gen kódoval imunogenní protein nebo peptid jiného patogenu nebo cytokin, který vyvolává imunitní odpověď. Příklady vhodných cytokinů jsou interleukin-2, interferon-alfa a interferon-gama.

Tento vynález také poskytuje očkovací směs (živou nebo inaktivovanou) pro očkování zvířat, zejména savců a zvláště hovězího dobytka, kjeho ochraně proti (různým) patogenům, přičemž směs obsahuje mutant BHV-1 s heterologním genem, kódujícím imunogenní protein nebo peptid

-5CZ 283283 B6 jiného patogenu, a vhodný nosič nebo adjuvans. Ochrana se samozřejmě může týkat více než jednoho patogenu, tj. multivalentní vakcíny, kde mutant obsahuje několik heterologních genů.

Vynález se dále týká směsi, obsahující rekombinantní nukleovou kyselinu genu pro glykoprotein gE viru BHV-1, část genu pro glykoprotein gE, nebo nukleotidovou sekvenci, odvozenou z genu pro glykoprotein gE. Tato směs může obsahovat klonovací nebo expresní vektor, který má v sobě vloženu rekombinantní nukleovou kyselinu genu pro glykoprotein gE z viru BHV-1, část genu pro tento glykoprotein gE, nebo nukleotidovou sekvenci, odvozenou z genu pro glykoprotein gE.

Vynález dále obsahuje směs, složenou z glykoproteinu gE z BHV-1, části tohoto glykoproteinu gE, peptidu, odvozeného z glykoproteinu gE, nebo komplexu glykoproteinů gE agl, a směs, obsahující protilátku, specifickou pro glykoproteiny gE z viru BHV-1, část tohoto glykoproteinu gE, peptid, odvozený z tohoto glykoproteinu gE, nebo komplex glykoproteinů gE agl. Protilátkou se rozumí jak polyklonální, tak monoklonální protilátka, které se dává ve většině aplikací přednost. Termíny část glykoproteinu gE a peptid odvozený z glykoproteinu gE se rozumí sekvence aminokyselin, specifická pro gE, která bude dlouhá obecně přinejmenším asi 8 aminokyselin.

Vynález se dále týká diagnostické soupravy pro detekci nukleové kyseliny BHV-1 ve vzorku, zejména v biologickém vzorku, jako je krev nebo krevní sérum, krevní buňky, mléko, tělesné tekutiny, jako slzy, tekutina získaná výplachem plic, nosní sekrety, sperma, obzvláště semenná tekutina, sliny, sputum nebo tkáň, zejména nervová tkáň, pocházející ze zvířat, zvláště savců, zejména pak hovězího dobytka, obsahující sondu nukleové kyseliny nebo primer, jehož nukleotidová sekvence je odvozena z genu pro glykoprotein gE viru BHV-1, a detekčních prostředků, vhodných pro detekční zkoušku na nukleové kyseliny.

Dále se vynález týká diagnostické soupravy pro detekci protilátek, které jsou specifické pro BHV-1 ve vzorku, zejména biologickém vzorku, jako je krev nebo krevní sérum, sliny, sputum, tělesné tekutiny, jako slzy, tekutina získaná výplachem plic, nosní sekrety, mléko, nebo tkáň, pocházející ze zvířete, zejména savce a zvláště hovězího dobytka, obsahující glykoprotein gE viru BHV-1, část tohoto glykoproteinu gE, peptid, odvozený z tohoto glykoproteinu gE, nebo komplex glykoproetinů gE a gl, a detekčních prostředků, vhodných pro detekční zkoušku na protilátky. Taková diagnostické souprava může dále obsahovat jednu nebo více protilátek, které jsou specifické pro glykoprotein gE viru BHV-1, nebo komplex glykoproteinů gE agl viru BHV-1.

Vynález se dále týká diagnostické soupravy pro detekci virového proteinu BHV-1 ve vzorku, zejména v biologickém vzorku, jako je krev nebo krevní sérum, krevní buňky, mléko, tělesné tekutiny, jako slzy, tekutina získaná výplachem plic, nosní sekrety, sperma, obzvláště semenná tekutina, sliny, sputum nebo tkáň, zejména nervová tkáň, pocházející ze zvířat, zvláště savců, zejména pak hovězího dobytka, obsahující jednu nebo více protilátek, které jsou specifické pro glykoprotein gE viru BHV-1, nebo komplex glykoproteinů gE agl, a detekčních prostředků, vhodných pro detekční zkoušku na protein.

Vynález dále poskytuje metodu pro určení infekce BHV-1 u zvířete, zejména savce a zvláště hovězího dobytka, která spočívá v prozkoumání vzorku, pocházejícího ze zvířete, zvláště biologického vzorku, jako je krev nebo krevní sérum, krevní buňky, sperma, obzvláště semenná tekutina, sliny, sputum, tělesné tekutiny, jako slzy, tekutina získaná výplachem plic, nosní sekrety, mléko, nebo tkáň, zejména nervová tkáň, na přítomnost nukleové kyseliny, obsahující sekvence genu pro glykoprotein gE viru BHV-1, nebo na přítomnost glykoproteinu gE viru BHV-1, nebo komplexu glykoproteinů gE a GI viru BHV-1, nebo na přítomnost protilátek, které jsou specifické pro glykoprotein gE viru BHV-1, nebo specifické pro komplex glykoproteinů gE a gl viru BHV-1. Vzorek pro zkoumání může pocházet ze zvířete, které nebylo dosud očkováno

-6CZ 283283 B6 očkovací směsí podle tohoto vynálezu, nebo ze zvířete, které bylo očkováno očkovacím přípravkem podle vynálezu.

Syntéza oligopeptidů, polypeptidů a glykoproteinů, odvozených z kódující sekvence genu pro glykoprotein gE a gl viru BHV-1.

Výsledky sekvenční analýzy DNA genu pro glykoprotein gE (obrázek 3A) a izolované fragmenty DNA, které kódují tento gen, popsané v příkladech, umožňují užitím standardních molekulárně biologických postupů jak syntetizovat peptidy proteinu gE (oligo- nebo polypeptidy), tak exprimovat protein gE vcelku nebo ve velkých částech prostřednictvím prokaryot (v baktériích) nebo eukaryot (např. v myších buňkách). Těmito způsoby může být získán specifický antigen, který může například sloužit pro vytvoření monoklonálních protilátek (Mabs), specifických pro gE. Antigen, specifický pro gE a monoklonální protilátky (Mabs), specifické pro gE, mohou být užity v sérologických testech k tomu, aby stanovily rozdíly mezi zvířaty, očkovanými vakcínou s delečním gE mutantem BHV-1, a zvířaty, infikovanými divokým typem BHV-1.

Výsledky částečné sekvenční analýzy DNA genu pro glykoprotein gl, popsané v příkladech, a izolované fragmenty DNA, které kódují tento gen, společně s eukaryotickými buňkami, exprimujícími glykoprotein gE, dovolují expresi komplexu gl/gE v eukaryotických buňkách (obrázky 13 a 14). Tento glykoproteinový komplex může být užit k vytvoření monoklonálních protilátek, specifických pro gl/gE. Komplex gl/gE může být také užit jako antigen v sérologických testech k rozlišení mezi dobytkem, očkovaným jednoduchým gE delečním mutantem BHV-1, nebo dvojitým gl/gE delečním mutantem BHV-1, a dobytkem, infikovaným divokým typem BHV-1.

gE specifické peptidy

Na základě znalosti sekvence, kódující protein, mohou být užitím automatického syntetizátoru vytvořeny polypeptidy, dlouhé nejméně 40 až 50 aminokyselin. Nyní, když proteinová sekvence glykoproteinů gE viru BHV-1 kmene Lam byla objasněna (obr. 3A), polypeptidy tohoto gE viru BHV-1 mohou být syntetizovány. S takovými polypeptidy podle standardních metod mohou být imunizována experimentální zvířata, jako jsou myši nebo králíci, pro vytvoření gE-specifických protilátek. Dále, užitím těchto gE-specifických peptidů mohou být dále specifikována místa, kde anti-gE protilátky reagují s gE proteinem (epitopy), např. metodou PEPSCAN (Geysen et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 81, 3998-4002). gE-specifické oligopeptidy mohou být také užity v sérologických testech, které demonstrují anti-gE protilátky.

Prokaryotická exprese gE

Pro syntézu proteinu gE v baktériích (tj. prokaryotická exprese gE) musí být DNA fragmenty, kódující glykoprotein gE, nebo jeho části klonovány v prokaryotických expresních vektorech. Prokaryotické expresní vektory jsou cirkulámí DNA molekuly, které mohou udržovat samy sebe v bakterii jako separátně se replikující molekuly (plazmidy). Tyto expresní vektory obsahují jeden nebo více genových markérů, které kódují rezistenci na antibiotika atak umožňují selekci bakterií s expresním vektorem. Dále expresní vektory obsahují (často regulovatelný) úsek promotoru, za který mohou být připojeny DNA fragmenty, které jsou pak exprimovány pod vlivem promotoru. V mnoha obvyklých prokaryotických expresních vektorech je požadovaný protein exprimován ve spojení (fúzován) s takzvaným bílkovinným nosičem. Pro tento účel je ve vektoru za promotorem lokalizována kódující sekvence pro bílkovinný nosič, přímo přilehlá k místu, kam může být připojen (ligován) požadovaný DNA fragment. Fúzované proteiny jsou často mnohem stabilnější a snáze se rozeznávají a/nebo izolují. Ustálený stav, kterého může dosáhnout konkrétní fúzovaný protein v určitém bakteriálním kmeni, se liší od fúze k fúzi a od kmene ke kmeni. Je obvyklé zkoušet různé kombinace.

-7CZ 283283 B6

Eukaryotická exprese glykoproteinu gE-genu

Ačkoliv prokaryotická exprese proteinů skýtá některé výhody, proteiny postrádají modifikace, jako např. glykosylace a pod., ke kterým dochází v eukaryotických buňkách. Výsledkem je, že protein, exprimovaný v eukaryotech, je často mnohem vhodnější antigen. Pro heterologní expresi proteinů v eukaryotických buňkách, jako např. myších, se používají eukaryotické expresní vektory. Tyto vektory jsou plazmidy, které nejsou množitelné jen v E. coli, ale udrží se naživu také v eukaryotických buňkách. Kromě prokaryotického selekčního markéru obsahují také eukaryotický selekční markér. Analogicky k prokaryotickým expresním vektorům eukaryotické expresní vektory obsahují úsek promotoru, za který mohou být vkládány (ligovány) požadované geny. Avšak sekvence promotoru v eukaryotických vektorech jsou specifické pro eukaryota. V eukaryotických vektorech se fůze s bílkovinnými nosiči používá jen zřídka. Tyto vektory jsou zavedeny do eukaryotických buněk pomocí standardní transfekční metody (F. L. Graham, A. J. van der Eb, 1973, Virology 52,456-467). Kromě eukaryotických plazmidových vektorů jsou také virové vektory, kde heterologní gen je zaveden do genomu viru (např. retroviry, herpesviry a virus vakcinie). Eukaryotické buňky mohou potom být infikovány rekombinantními viry.

Obecně nemůžeme předpovědět, který vektor a buněčný typ jsou nejvhodnější pro konkrétní genový produkt. Většinou se zkouší několik kombinací.

Eukarytotickká exprese obou glykoproteinů gE a gl

Konečná struktura, kterou získá Protein, závisí na jeho primární sekvenci aminokyselin, jeho svinutí či rozložení (folding), potranslačních modifikacích atd. Důležitý faktor, který přispívá ke struktuře proteinu, je jeho interakce s jedním nebo více jinými proteiny. Zjistili jsme, že také glykoprotein gE viru BHV-1 vytváří komplex s přinejmenším jedním jiným glykoproteinem, glykoproteinem gl viru BHV-1. První známka takového komplexu se objevila v našich výsledcích s testovanými anti-gE monoklonálními protilátkami (Mabs) 1, 51, 67, 75 a 78 (viz tabulka 2). Tyto Mabs nereagovaly s Difivacem-1 ani s Lam gE', ale také selhaly při rozeznání 3T3 buněk, exprimujících glykoprotein gE. Avšak tyto Mabs reagovaly s gE-exprimujícími 3T3 buňkami po infekci Difivacem-1, prokazující, že pro tyto Mabs jsou potřebné doplňující faktory, dodávající glykoproteinu gE vlastní antigenní konformaci. V některých našich radioimunoprecipitačních pokusech s Mab 81 jsme nalezli koprecipitaci proteinu s molekulovou váhou 63 kD. Vzhledem k faktu, že glykoprotein gE viru herpes simplex tvoří komplex s proteinem se srovnatelnou molekulovou váhou (HSV1 glykoprotein gl), jsme usuzovali, že glykoprotein gE viru BHV-1 tvoří komplex shomologem glykoproteinu gl viru BHV-1. Pro studium tohoto komplexu gE/gl viru BHV-1 a pro produkci antigenu gE s vhodnou antigenní strukturou jsme exprimovali oba glykoproteiny v jedné eukaryotické buňce. Použili jsme stejné procedury, jaké byly popsány pro eukaryotickou expresi glykoproteinu gE samotného. Jediný předpoklad navíc je užití expresních vektorů s odlišnými eukaryotickými selekčními markéry.

Sérologické testy

Sérologické metody, vhodné pro rozlišování mezi dobytkem, očkovaným Difivacem-1, a dobytkem, infikovaným divokým typem viru BHV-1, na bázi protilátek proti gE jsou založeny na užití monoklonálních protilátek, namířených proti gE. Tyto mohou být užity následujícími způsoby:

a) podle principu, který publikovali Van Oirschot et al. (Joumal of Virological methods 22, 191-206, 1988). V této metodě ELISA pro detekci gl protilátek proti viru Aujeszkyho nemoci jsou protilátky demonstrovány blokujícím účinkem na reakci dvou monoklonálních protilátek (Mabs), které mají dva odlišné epitopy na gl. Test se provádí následovně. Mikrotitrační destičky jsou potaženy (coated) Mab 1, přes noc při 37 °C, a potom jsou uskladněny, např. při 4 °C nebo při -20 °C. Vyšetřované sérum je preinkubováno s antigenem v oddělených nepotažených

-8CZ 283283 B6 mikrotitračních destičkách, např. 2 hodiny při 37 °C. Destičky, potažené Mab 1 jsou promyty, např. 5krát, a poté je na tyto destičky přidána Mab 2, spojená s křenovou peroxidázou (HRPO). Pak je na destičky přenesena preinkubovaná směs sérum-protilátka, ve které jsou lokalizovány dvě Mabs, vše následováno inkubací, např. 1 hodinu při 37 °C. Destičky jsou pak odmyty a do každé jamky je přidán substrát. Po např. 2 hodinách při pokojové teplotě jsou destičky hodnoceny spektrofotometricky. 4 negativní kontrolní séra a 4 sériová ředění pozitivního séra jsou zahrnuta na každé destičce. Sérum, které má hodnotu optické denzity (OD) méně než 50 % průměrné hodnoty OD 4 negativních kontrolních sér, která byla vyšetřena na stejné destičce, se považuje za pozitivní.

b) Podle principu IDAS (Nepřímý sendvič dvojité protilátky. Indirect Double Antibody Sendwich). Zde jsou mikrotitrační destičky potaženy Mab nebo polyklonálním sérem, namířeným proti proteinu gE. Inkubace s gE-antigenem má za následek navázání gE na potažené jamky. Protilátky, specificky namířené proti gE, ve vyšetřovaném bovinním séru se potom vážou na gE. Tyto navázané protilátky jsou rozpoznány konjugátem anti-bovinního imunoglobulinu. Protilátky v tomto konjugátu jsou kovalentně vázány na enzym peroxidázu.

Nakonec je navázaný konjugát zviditelněn přidáním chromogenního substrátu. Specificita reakce je kontrolována prováděním stejné proceduiy s gE-negativní kontrolou místo přípravku s gE-antigenem. Na každé mikrotitrační destičce jsou také pozitivní a negativní kontrolní séra. Test je platný, jestli pozitivní sérum je pozitivní v určitém ředění. Sérum je pozitivní, jestliže zaznamenáme OD, která je o 0,2 vyšší, než standardní negativní kontrolní sérum.

c) Podle principu IDAS, který je popsán v b), ale po inkubaci vyšetřovaného séra, je použito anti-gE Mab/HRPO místo konjugátu anti-bovinního imunoglobulinu. Anti-gE peptidové sérum nebo anti-gE polyklonální sérum může být použito místo anti-gE Mab. Destičky jsou promyty a do každé jamky je přidán chromogenní substrát. Po např. 2 hodinách při pokojové teplotě jsou destičky odečteny spektrofotometricky. Každá destička obsahuje čtyři negativní kontrolní séra a čtyři řadová ředění pozitivního séra. Sérum, které má hodnotu OD menší než 50 % průměrné hodnoty OD 4 negativních kontrolních sér, vyšetřených na stejné destičce, je považováno za pozitivní.

d) Podle principu blokující ELISA, kdy je virovým antigenem, který může nebo nemusí být purifikován, přes noc potažena mikrotitrační destička. Na těchto destičkách je vyšetřované sérum inkubováno po např. 2 hodiny nebo déle při teplotě 37 °C. Po promývací proceduře je na destičky přidána anti-gE Mab a následuje inkubace např. 1 hodinu při 37 °C. Místo anti-gE Mab může být použito anti-gE peptidové sérum nebo anti-gE polyklonální sérum. Destičky jsou promyty a do každé jamky je přidán chromogenní substrát. Po např. 2 hodinách při pokojové teplotě jsou destičky spektrofotometricky hodnoceny. Každá destička obsahuje čtyři negativní kontrolní séra a čtyři řadová ředění pozitivního séra. Sérum, které má hodnotu OD menší než 50 % průměru hodnot OD čtyřech negativních kontrolních sér, vyšetřených na stejné destičce, je považováno za pozitivní.

Ve všech výše popsaných úpravách může být použit konvenčně vypěstovaný virový antigen, který obsahuje gE, ale stejně tak gE-antigen, který je exprimován prokaryoty nebo eukaryoty. Nebo by mohly být použity místo konvenčního antigenů ve výše popsaných diagnostických testech oligopeptidy, založené na sekvenci gE viru BHV-1. Navíc by takové polypeptidy mohly být použity pro vývoj takzvaných cow-side testů podle principu, který popsali Kemp et al., Science 241, 1352-1354, 1988. Takový test by pak byl založen na vazbě antigenní sekvence oligopeptidu s protilátkami, namířenými proti gE, přítomnými v infikovaných zvířatech. Pro takový test by měl být oligopeptid spojen s Mab, namířenou proti bovinním erytrocytům.

-9CZ 283283 B6

Analýza nukleových kyselin užitím polymerázové řetězové reakce

Oligonukleotidy (sondy a primery) mohou být použity například v polymerázové řetězové reakci, abychom rozlišili očkovaná a infikovaná zvířata. Polymerázová řetězová reakce (PCR) je 5 technika, pomocí níž nukleové kyseliny patogenu mohou být v krátkém čase miliónkrát namnoženy (De polymerase kettingreactie, P. F. Hilderink, J. A. Wagenaar, J. W. B. van der Giessen and Β. A.M. van der Zeijst, 1990, Tijdschrift voor Diergeneeskunde deel 115, 1111-1117). Oligonukleotidy gE mohou být vybrány tak, že v genomu pozitivním v gE se tvoří odlišný produkt než v genomu negativním v gE. Výhoda toho je, že také zvíře, které bylo ío očkováno gE deleční vakcínou, dává pozitivní signál v PCR testu. Avšak tento přístup závisí na přítomnosti virových nukleových kyselin ve vzorku, např. krvi, pocházející z testovaného zvířete.

Po akutní BHV-1 infekci je velká šance, že nukleové kyseliny, specifické pro BHV-1, mohou být prokázány v krvi, ale zatím ještě nebylo zjištěno, zda nukleové kyseliny BHV-1 mohou být 15 prokázány v krvi také během latence.

Užití BHV-1 jako vektoru

Pro expresi heterologních genů v genomu BHV-1 je nezbytné mít k dispozici přesné informace 20 o oblasti, kam má být vložen heterologní gen. Nemělo by dojít k žádnému porušení nezbytných sekvencí a také regulační sekvence musí být dostupné pro expresi heterologního genu. V zásadě je gen pro glykoprotein gE vhodný místem pro expresi heterologních genů, gE-gen není nezbytný, proto není námitek k jeho nahražení heterologním genem. Tudíž heterologní gen může být umístěn tak, že bude pod vlivem regulačních sekvencí genu gE. Avšak není nezbytné použít 25 regulační sekvence gE genu. Exprese heterologních genů může být řízena eventuálně jinými, např. silnějšími regulačními sekvencemi odlišných genů. Je také možné připojit heterologní gen k exportnímu signálnímu peptidů genu gE, takže může být ovlivněna sekrece produktu heterologního genu. Je tedy jasné, že detailní znalost genu a proteinu gE poskytuje možnost využít BHV-1 jako vektoru. Vyvinuté vektory mohou navíc být sérologicky odlišeny od 30 divokého typu. Konstrukce mutantů BHV-1, které exprimují heterologní geny, může být provedena stejným způsobem, jako konstrukce gE delečních mutantů, ukázaná v příkladech. Avšak deleční fragmenty by pak měly být nahrazeny fragmentem, na kterém je lokalizován heterologní gen v místě delece.

Příklady provedení vynálezu

1) Izolace a identifikace přírodního gE delečního mutantu

a) Izolace přírodního mutantu

Genomická DNA byla izolována z řady konvenčně atenuovaných vakcín podle standardních metod a analyzována užitím restrikčních enzymů. Konkrétně jsme pátrali po genomických odchylkách, které by byly vhodné pro rozlišení od divokého typu BHV-1.

Konkrétně byla pozornost namířena na oblast U_s genomu viru BHV-1, protože v této oblasti analogicky s virem herpes simplex - je pravděpodobně lokalizována řada genů, kódujících neesenciální glykoproteiny (Identification of a herpes simplex virus 1 gylcoprotein gene within a gene cluster dispensable for growth in cell culture, R. Longnecker, S. Chatterjee, R. J. Whitley 50 a B. Roizman (1987), Proč. Nati. Acad. Sci. 84, 4303-4307).

Po velkém počtu pasáží na buňkách bovinní embryonální ledviny a buňkách bovinní embryonální trachey (Ebtr) bylo prokázáno, že soubor vakcín BHV-1, pocházející z Univerzity Záhřeb, Jugoslávie (Lugovic et al., Veterinarski Arhiv 55, 241-245, 1985), má kromě normální U_s oblasti

- 10CZ 283283 B6 také odlišnou U_s oblast. Tato vakcína nadto vytvářela jak velké, tak i malé plaky na Ebtr buňkách. Z této smíšené populace byl třemi konečnými ředicími kroky izolován virus s odchylnou U_s oblastí, když byly pokaždé vybrány malé plaky. Virus, izolovaný touto cestou, byl dále zkoumán a nazván Difivac-l. Byl uložen v Institut Pasteur, Paříž, Francie, 27. května

1992, pod číslem 1-1213.

b) Identifikace delece v genu gE viru Difivac-l

K další analýze této odchylky v oblasti U_s byla izolována genomická DNA viru Difívac-1 podle standardních metod a podrobena analýze přenosem (blotem) dle Southema (Obr. 1A). Hybridizace tohoto blotu s ³²P značeným HindlII K fragmentem divokého typu potvrdila, že tento fragment, lokalizovaný centrálně v U_s oblasti, je asi o 1.0 kilobáze (kb) kratší v Difivac-l. Navíc byla touto analýzou přibližně zjištěna pozice chybějící části (Obr. 18). K další analýze této delece byla izolována U_s oblast divokého typu BHV-1 kmene Lam a klonována v prokaryotických vektorech. Nakonec byla izolována podle standardních metod genomická DNA kmene Lam (Obr. 2A) a klonována ve vektorech pUC18, pACYC apBR322 (Obr. 2B). Byla vytvořena fyzikální mapa oblasti okolo předpokládaného místa delece (Obr. 2C). Na základě této fyzikální mapy byly konstruovány ve vektorech pKUN19 apUC18 subklony, vhodné pro určení nukleotidové sekvence této oblasti (Obr. 2D). Použitím těchto subklonů byla určena Sangerovou metodou nukleotidová sekvence obou řetězců celé oblasti (ukázáno na obr. 2C). Tato nukleotidová sekvence (SEQ ID NO:1) byla analyzována užitím programu PC/Gene. Na základě počítačové translace se ukázalo, že nukleotidy (nt) 168 až 1893 kódují otevřený čtecí rámec 575 aminokyselin (Obr. 3A). Další analýza ukázala, že tato sekvence aminokyselin má charakteristiku transmembránového glykoproteinu, jak je ukázáno na obr. 38. Faktem je, že oblast prvních 26 aminokyselin (aa) je rozpoznávána jako typický eukaryotický exportní signál a oblast mezi aa 423 a aa 450 je rozpoznávána jako transmembránová oblast. Navíc se v této sekvenci objevila tři potenciální N- glykosylační místa. Takto předpovězená sekvence aminokyselin vykazuje jasnou podobnost s genem pro glykoprotein gE viru herpes simlex (HSV); viz obr. 4A a 48. Tyto a jiné podobnosti opravňují závěr, že nalezený gen je gE homolog viru BHV-1. Z tohoto důvodu je gen nazýván gE. K. určení toho, do jaké míry chybí tento gE-gen viru BHV-1 ve viru Difivac-l, byl izolován fragment p318. Fragment p318 začíná v Alul místě 55 nt před otevřeným čtecím rámcem předpokládaného gE a končí 133 nt za ním. S tímto p318 fragmentem byla analyzována užitím Southemovy hybridizace genomická DNA viru Difivac-l. Tak se zjistilo, že Difivac-l neobsahuje žádnou p318 detekovatelnou sekvenci (Obr. 5). Tento experiment potvrdil, že Difivac-l obsahuje deleci ajasně demonstruje, že tato delece zaujímá celý gen gE.

K určení velikosti a pozice deletované oblasti byly v prokaryotických vektorech klonovány genomické sekvence, pokrývající oblast U_s viru Difivac-l, viz obr. 11C. EcoRI fragment o velikosti 14,5 kb byl klonován ve vektoru pACYC a pojmenován p775. HindlII fragment o velikosti 7,4 byl nazávisle klonován ve vektoru pUC18 a nazván p728. Z klonu p728 byly izolovány dva subklony: Pstl fragment velikosti 1,4 kb v klonu p737 aAluI-Pstl fragment velikosti 350bp v klonu p754. Analýza těchto klonů restrikčními enzymy a bloty dle Southema (data nejsou ukázána) dokázala, že delece gE v Difivac-l je 2,7 kb dlouhá, začíná právě od 5'konce genu gE a končí na hranici U_s oblasti. Těchto 2, 7 kb je nahrazeno duplikací 1 kb segmentu, lokalizovaného v oblasti U_s opačně k genu gE, jako aberantní extenze opakované (repeat) oblasti, viz obr. 118. K potvrzení výsledků této analýzy a k určení přesného místa rekombinace byla určena nukleotidová sekvence větší části inzertu klonu p754 a srovnána se sekvencemi divokého typu, viz obr. 12. Tato analýza ukázala, že místo rekombinace je lokalizováno 77 bp protisměrně (upstream) od počátečního kodonu genu gE.

-11 CZ 283283 B6

c) Hodnocení bezpečnosti a účinnosti viru Difivac-1

Difívac-1 byl testován v BHV-1 séronegativních telatech, starých 7 týdnů, neobsahujících specifický patogen. 8 telat bylo intranazálně očkováno 10⁵ TCID50 po 2 ml, každému byl rozprášen 1 ml do každé nozdry. 8 BHV-1 séronegativním telatům, starým 7 týdnů, bez průkazu specifického patogenu, která byla umístěna v oddělené izolační jednotce, byly intranazálně podány 2 ml média s kulturou a sloužila jako neočkované kontroly. 5 týdnů po vakcinaci vakcinovaná a kontrolní telata byla intranazálně testována 10⁷ TCID50 vysoce virulentního kmene BHV-1 Iowa. 6 týdnů po testu všechna telata byla ošetřena intramuskulámě Dexamethasonem po 5 dní za účelem reaktivovat předpokládaný latentní virus. Byly monitorovány klinické příznaky, rektální teploty a tělesný růst. Z nazálních výtěrů byly prováděny izolace viru, v séru byly určovány titry neutralizačních protilátek.

Chování, chuť k jídlu, rektální teploty a tempo růstu telat zůstalo po vakcinaci normální, ale vakcinovaná telata měla trochu serózní výtok z nosu a mírně zvýšené slinění. Nebyla pozorována poškození nazální sliznice. Po vakcinaci byl Difivac-1 vylučován z nazálních výtěrů (obr. 17). Všechna očkovaná telata produkovala neutralizační protilátky k BHV-1.

Po testu všechna neočkovaná kontrolní telata vykazovala apatii, ztrátu chutě k jídlu, oční a nosní výtok, zarudnutí dásně dolní čelisti, vážná poškození nosní sliznice až do 14 dnů po testu a zástavu růstu o 4 dny. Očkovaná telata měla malá, rychle se hojící poškození nosní sliznice a neměla zpomalený růst. Denní klinické výsledky, rektální teplota a růstový vývoj po testu jsou udány na obrázcích 18, 19 a 20. Po testu vylučovala virus nosem všechna telata, ale množství a doba exkrece viru byla u očkovaných telat znatelně snížena (obr. 21). U očkovaných telat se vyvinula sekundární protilátková odpověď a všechna neočkovaná telata produkovala protilátky po testu.

Po reaktivaci byl testující virus izolován z jednoho očkovaného telete az5 neočkovaných. Difívac-1 nemohl být reaktivován.

Výše uvedené výsledky demonstrují, že Difívac-1 stěží vyvolal jakýkoliv příznak nemoci u mladých telat a nebyl schopný reaktivace. Difívac-1 značně snížil vážnost onemocnění a intenzitu exkrece viru po testu.

Lze uzavřít, že Difivac-1 je bezpečná a účinná vakcína, která může být užita u dobytka proti infekcím BHV-1.

2) Konstrukce rekombinantních gE delečních mutantů viru BHV-1

Aby byly k dispozici odlišitelné vakcíny BHV-1, které jsou molekulárně lépe definovány než Difívac-1 a které, pokud by byl takový požadavek, obsahují deleci např. v genu pro thymidinkinázu kromě delece v gE genu, byly kromě Difívac-1 vytvořeny rekombinantní gE deleční mutanty, gE deleční fragmenty mohly být vytvořeny za předpokladu určení polohy genu pro glykoprotein gE a použitím klonovaných fragmentů DNA, které ohraničují (flank) gE gen. Užitím standardní techniky (F. L. Graham a A. J. van der Eb, 1973, Virology 52, 456-467) mohl být tento deleční fragment vložen do genomu divokého typu viru BHV-1, což vedlo k vytvořeni gE delečního mutantu.

a) Konstrukce gE delečního fragmentu

Ke konstrukci gE delečního fragmentu byl vybrán fragment, který na jedné straně postrádá celou sekvenci gE a na druhé straně obsahuje dostatečnou ohraničující (flanking) sekvenci, aby dovolila rekombinaci s genomem divokého typu. Na 5' (upstream) konci byl vybrán fragment Pstl-AsuII, veliký 1,2 kb, který končí 18 nukleotidů před počátečním kodonem gE genu. Na 3'

- 12CZ 283283 B6 (downstream) konci byl vybrán 1,2 kb EcoNI-Dral fragment, který začíná 2 nt před koncovým kodónem gE genu (obr. 6).

K vytvoření gE delečního fragmentu byl v Smál a Pstl místě plazmidu pUC18 subklonován 1,4 kb Pstl-Smal fragment, pocházející z 8,4 kb HindlII K fragmentu BHV-1 kmene Lam, lokalizovaný v 5' místě genu gE. Tento klon byl nazván p515. EcoNI-Smal fragment, lokalizovaný ve 3' místě gE, pocházející ze 4,1 kb HindlII-EcoRI klonu, byl klonován v unikátním AsuII místě p515. Takto byla dovršena konstrukce delečního fragmentu gE a klon takto vytvořený byl nazván p519. Ačkoliv by v principu celý Pstl-Smal inzert p519 mohl být užit jako gE deleční fragment, nelze to doporučit. Fakt je, že Pstl-Smal zasahuje přibližně 100-150 bp do opakované sekvence, která ohraničuje oblast U_s. Tento úsek 100-150 bp by mohl rekombinovat s opakovanou sekvencí na jedné straně U_s oblasti, kde není lokalizován gen gE, a mohl by tak poskytovat nežádoucí rekombinační produkty. Z tohoto důvodu byl pro rekombinační pokus vybrán Pstl-Dral fragment, takže 100 bp opakované sekvence bylo odstraněno.

b) rekombinace gE delečního fragmentu s genomem divokého typu viru BHV-1

Aby se uskutečnila rekombinace mezi vytvořeným gE delečním fragmentem a genomem divokého typu BHV-1, kotransfekce buněk embryonální bovinní trachey (Ebtr) mikrogramovým množstvím obou DNA molekul se provádí podle standardní metody, kterou popsali F. L. Graham a A. J. van der Eb (1973, Virology 52, 456-467). Buněčné mechanismy rekombinace vedou k rekombinaci malého procenta DNA molekul (2-4 %), které byly přijaty buňkami. K selekci rekombinovaných gE delečních mutantů je virová směs, která vznikne po transfekci, vyseta na tkáňovou kulturu Ebtr. Ve většině případů takto vzniknou oddělené virové populace (plaky), které pocházejí zjednoho viru. K izolaci gE delečních mutantů BHV-1 kmene Lam bylo 230 těchto plaků izolováno a vyšetřeno podle standardních imunologických metod s BHV-1 specifickými monoklonálními protilátkami (Mabs), které nereagují s buňkami infikovanými Difivac-1. Tyto Mabs jsou namířeny přímo proti glykoproteinu gE. 5 z 230 plaků nereagovalo s těmito Mabs. Dále byla vyšetřována také DNA těchto plaků.

c) DNA analýza vytvořených gE delečních mutantů viru BHV-1 kmene Lam

DNA, izolované ze 3 (1B7, 1B8 a 2H10) výše zmíněných 5 možných gE delečních mutantů, byly dále vyšetřovány použitím standardní techniky blotu dle Southema (Sambrook et al., 1989). Dvojité štěpení těchto DNA sPstl a Dral, následované gelovou elektroforézou ahybridizací Southemova blotu s 2,3 kb Pstl-Dral delečním fragmentem jako sondou ukazuje, že gen gE genomu virové populace 1B7 a 1B8 byl požadovaným způsobem přesně odstraněn, viz obr. 7A a 7B. Populace 2H10 má odlišný Pstl-Dral fragment. Hybridizace Southemových blotů s gE-specifickou sondou ukazují, že žádné gE sekvence nejsou lokalizovány v jakémkoliv ze tří DNA izolátů (výsledky nejsou ukázány). BHV-1 virové populace 1B7 a 1B8 jsou zamýšlené rekombinantní gE deleční mutanty. Populace 1B7 viru BHV-1 byla testována na vlastnosti vakcíny.

d) Vytvoření dvojitých delečních mutantů thymidinkináza/gE

Protože rekombinantní deleční mutanty BHV-1 s delecí pouze v jednom genu by nemusely mít dostatečně redukovanou virulenci, byly také zvažovány delece v thymidinkinázovém (TK) genu BHV-1 kmene Lam a Harberink. Tyto mutanty byly vytvořeny analogním způsobem kvýše zmíněnému způsobu, použitému pro gE deleční mutanty (výsledky nejsou ukázány). Tyto TK deleční mutanty byly použity k vytvoření TK/gE dvojitých delečních mutantů.

- 13 CZ 283283 B6

e) Vytvoření dvojitých glykoprotein gl/glykoprotein gE delečních mutantů

Protože dobytek, očkovaný jednoduchým gE delečním mutantem, může produkovat anti-gl protilátky, které mohou interferovat s detekcí protilátek anti gl/gE (diskutováno níže), vynalezli jsme také vakcínu s gl/gE dvojitou delecí. Takový gl/gE dvojitý deleční mutant může být vytvořen použitím stejných procedur, použitých ke konstrukci gE jednoduchého delečního mutantu. Částečná nukleotidová sekvenční analýza protisměrného (upstream) konce 1,8 kb Pstl fragmentu - který pokrývá 5' konec gE genu - odkryla otevřený čtecí rámec s významnou homologii ke gl homologům, nalezeným u jiných herpesvirů, viz obrázky 13 a 14. Užitím 350 bp Smal-Pstl fragmentu, který zahrnuje předpokládaný konec gl genu, a EcoNI-Smal fragmentu, lokalizovaného po směru (downstream) od genu gE, může být vytvořen gl/gE deleční fragment. Tento fragment může rekombinovat s genomem divokého typu za vzniku gl/gE delečního mutantu BHV-1, viz obrázek 16. 80-90 aminokyselin, které - teoreticky - mohou ještě vznikat, nebude schopno vytvořit protilátky, které mohou interferovat s detekcí anti-gl/gE protilátek. Další sekvenční analýza genu gl umožní vytvoření gl delece, která pokryje kompletní kódující oblast gl. Tento gl/gE dvojitý deleční mutant byl pojmenován Difivac-IE.

f) Hodnocení bezpečnosti a účinnosti mutantů Lam gE' a Lam gE‘ ,TK’

Vlastnosti vakcíny Lam gE’ a Lam gE‘ ,TK' mutantních kmenů BHV-1 byly testovány na telatech, starých 7 týdnů. BHV-1 séronegativních, neobsahujících specifický patogen. Každý mutantní kmen byl intranazálně rozprášen 6 telatům. Každému teleti byla dána celková dávka 10⁵ TCID50 ve 2 ml média s kulturou, do každé nozdry byl rozprášen 1 ml. Jiným 6 telatům bylo intranazálně vstříknuto tkáňové médium bez viru a sloužila jako neočkované kontroly. 5 týdnů po vakcinaci všechna telata, vakcinovaná a kontrolní, byla intranazálně testována s 10⁷ TCID₅₀ vysoce virulentního kmene BHV-1 Iowa. Po očkování a po testu byly monitorovány klinické příznaky, rektální teploty a tělesná váha.

Chování, chuť k jídlu, rektální teploty a tempo růstu u telat po vakcinaci zůstaly normální. Sérózní nazální výtok a malá poškození nazální sliznice byly pozorovány u všech očkovaných telat. Virus mohl být izolován z nosů očkovaných telat po přibližně 7 dnů (tabulka 1).

Po testu všechna neočkovaná kontrolní telata vykazovala apatii, ztrátu chutě k jídlu, oční a nosní výtok, zarudnutí dásně dolní čelisti, vážná poškození nosní sliznice a byl zpomalen růst. Všechna telata očkovaná Lam gE’ ,TK‘měla nějaký nosní výtok a menší poškození nosní sliznice. Ne všechna telata očkovaná Lam gE’ měla nosní výtok nebo poškození nosní sliznice. Apatie, ztráta chuti k jídlu nebo jiné klinické příznaky onemocnění u očkovaných telat nebyly pozorovány. Rektální teplota, růst a klinické výsledky po testu jsou ukázány na obr. 22, 23 a 24. Neočkovaná telata vylučovala virus nosem dvakrát déle než očkovaná telata (tabulka 1).

Výše uvedené výsledky prokazují, že mutantní kmeny Lam gE’ a Lam gE’ ,TK’ viru BHV-1 sotva vyvolaly jakýkoliv příznak nemoci u mladých telat. Oba mutantní kmeny zamezily nemoci po testu a snížily období nazálního vylučování viru o 50 %.

Mutantní kmeny Lam gE’ a Lam gE’ ,TK’ viru BHV-1 jsou bezpečné a účinné pro užití jako vakcína u dobytka proti BHV-1 infekcím.

3) Prokaryotická exprese gE

K prokaryotické expresi genu pro glykoprotein gE viru BHV-1 byly vytvořeny vektory, založené na dosud užívaných expresních vektorech pGEX (D. B. Smith a K. S. Johnson, Gene 67 (1988) 31-40). Vektory pGEX kódují bílkovinný nosič glutathion S-transferázu (GST) ze Schistosoma japonicum, který je pod vlivem promotoru tac, který může být indukován k expresi isopropylthiogalaktosidem (IPTG). Příklad GST-gE fúzovaného proteinu je produkt konstruktu

- 14CZ 283283 B6 pGEX-2T600s3 (obr. 8A). V tomto konstruktu byl použitím standardních molekuláměbiologických technik (Sambrook et al. 1989) 600 bp velký Smál fragment, který kóduje N-terminální oblast 200 aminokyselin gE proteinu, připojen za gen GST. Tento konstrukt byl navržen ve třech variantách, pokaždé s odlišným čtecím rámcem 600 bp fragmentu, který byl připojen kGST. Všechny 3 konstrukty byly zavedeny do Escherichia coli, kmene DH5a, indukovány s IPTG a vytvořené proteiny byly přeneseny na nitrocelulózu po elektroforéze na polyakrylamidovém gelu pomocí Western blottingu. Imunologická detekce s anti-GST protilátkami prokázala, že pouze vlastní čtecí rámec (č. 3), který kóduje proteinovou oblast gE, vede k expresi fúzovaného proteinu předpokládané velikosti 27k (GST) + 20k (gE) = 47 k. Tři zMabs námi izolovaných, které nereagují sDifivac-1, rozeznávají 47 kD GST-gE fúzovaný protein ve Western blotu; viz obrázek 8B.

4) Eukaryotická exprese genu pro glykoprotein gE

Pro eukaryotickou expresi genu pro glykoprotein gE byl již dříve inter alia vybrán vektor pEVHis. Vektor pEVHis má jako eukaryotický markér gen HisD, kódující histidinol dehydrogenázu [EC 1.1.1.23] (C. Hartmann aR. Mulligan, 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 8047-8051), který umožňuje buňkám přežít toxickou koncentraci 2,5 mM histidinolu. Vektor navíc obsahuje promotorovou oblast bezprostředního časného genu lidského cytomegaloviru (HCMV) s unikátními restrikčními místy, lokalizovanými za ním. K vytvoření pEVHis/gE expresního vektoru byl použit fragment, zahrnující celou kódující oblast genu pro glykoprotein gE. Začíná v Alul místě 55 bp před předpokládaným otevřeným čtecím rámcem gE a končí 133 bp za ním. Tato oblast byla klonována za HCMV promotor vektoru pEVHis, pomocí něhož byl vytvořen konstrukt pEVHis/gE (obr. 9). pEVHis/gE byl pomnožen v buňkách DH5a E. coli a přečištěn pomocí cesiumchloridového gradientu (Sambrook et al., 1989). Tato puntíkovaná DNA byla transfekována do Balb/C-3T3 buněk podle metody Grahama a van der Eba. Transformované buňky byly selektovány histidinolem, po jehož aplikaci bylo izolováno 20 histidinolrezistentních kolonií. Tyto kolonie byly vyšetřeny s Mab 81 pomocí imunologického testu s peroxidázou na monovrstvě (Immuno Peroxidase Monolayer Assay - IPMA). Ve čtyřech koloniích byla prokázána exprese proteinu gE. Z těchto čtyř kolonií byly použity buňky 3T3 gE klon 9 k izolaci subklonu, který měl vysokou expresi gE. Klon, izolovaný touto metodou (nazvaný 3T3gE 9, 5), byl použit k bližšímu určení možných anti-gE monoklonálních protilátek.

5) Eukaryotická exprese obou glykoproteinů gE a gl viru BHV-1 ve stejné buňce

K expresi glykoproteinů gl viru BHV-1 ve stejné buňce společně s glykoproteinem gE viru BHV-1 jsme nejdříve určili předpokládanou pozici genu gl ve viru BHV-1. Protože gen pro glykoprotein gl viru herpes simplex je lokalizován právě protisměrně od genu pro glykoprotein gE, dalo se předpokládat, že gen gl BHV-1 by mohl být lokalizován v odpovídající pozici. Aby se toto prokázalo, byla určena sekvence oblasti 283 nukleotidů, lokalizovaná přibližně 1 kb protisměrně od začátku genu gE viru BHV-1. Teoretická translace této oblasti ukázala, že druhý čtecí rámec kóduje 94 aminokyselin a jejich sekvence je homologní s glykoproteinem gl viru herpes simplex (obrázky 13 a 14). Protože homologní segment je asi 80 aminokyselin od počátečního kodónu, předpokládaný začátek otevřeného čtecího rámce genu gl viru BHV-1 může být asi 250 nt protisměrně od sekvenované oblasti. Z tohoto bylo odvozeno, že 1,7 kb Smál fragment, který začíná 400 nt protisměrně od sekvenované oblasti a končí v genu gE, by mohl obsahovat kompletní kódující oblast genu gl viru BHV-1. Tento 1,7 kb Smál fragment byl klonován v eukaryotickém vektoru MSV-neo (viz obr. 15). Tento vektor obsahuje silný promotor viru myšího sarkomu a selekční gen neo, který kóduje rezistenci proti antibiotiku G-418 sulfátu Geneticin. Výsledný konstrukt MSVneoGI byl množen v buňkách E. coli DH5a a byl transfekován do 3T3gE 9, 5 buněk použitím metod Grahama a van der Eba. Transfekované buňky byly selektovány v tkáňovém médiu s 400 pg Geneticinu/ml a rezistentní kolonie byly izolovány a testovány s možnými anti-gE Mabs, které selhaly v reakci s 3T3gE 9,5 buňkami.

- 15CZ 283283 B6

Z toho jsme vybrali 3T3gE/gI R20 klon, který reagoval např. s Mab 66 a také s divokým typem

BHV-1.

6) Charakterizace možných anti-gE monoklonálních protilátek (Mabs)

Mabs byly produkovány proti divokému typu viru BHV-1 a selektovány pro jejich neschopnost reagovat s buňkami embryonální bovinní trachey (Ebtr), infikovanými virem Difivac-1. Tyto Mabs byly vyšetřeny na reaktivitu s

a) Lam gE' delečním mutantem;

b) s výše popsaným prokaryotickým expresním produktem ve Western blotu;

c) s výše popsanými gE-expresními buňkami Balb/c-3T3;

d) buňkami, zmíněnými za c) a infikovanými Difivac-1, a

e) Balb/c-3T3 buňkami, exprimujícími gE/gl komplex.

Pro reaktivitu, testovanou v a), c), d) a e), byl použit test imunoperoxidázové monovrstvy (IPMA). Výsledky v tabulce 2 ukazují, že se vytvářely Mabs, které byly namířené proti gE (čísla 2, 3, 4, 52, 66, 68, 72 a 81) a Mabs (čísla 1, 51, 53, 67, 75 a 78), které mohou být mířeny proti strukturálním antigenním doménám na gE/gl komplexu. Antigenní domény, rozeznávané různými Mabs při kompetitivní IPMA, indikovaly, že přinejmenším 4 antigenní domény jsou přítomny na glykoproteínu gE a že jedna doména je pravděpodobně tvořena komplexem gE/gl (tabulka 2).

Detekce protilátek anti-gE u dobytka, infikovaného BHV-1 K vyšetření toho, zda jsou v séru infikovaného dobytka přítomny protilátky proti gE, byl použit nepřímý blokující test IPMA se 16 možnými gE-Mabs a následujícími 8 vybranými séry:

- 2 séra hovězího dobytka, očkovaného Difivac-1 atestovaného virulentním kmenem Iowa, která byla sbírána 14 dnů po testu;

- 2 séra hovězího dobytka, experimentálně infikovaného virem BHV-1 subtypem 1, která byla sbírána 20 měsíců po infekci.

Jedno zvíře bylo infikováno kontaktní expozicí;

- 2 séra hovězího dobytka, experimentálně infikovaného virem BHV-1 subtypem 2b, která byla sbírána 20 měsíců po infekci. Jedno zvíře bylo infikováno kontaktní expozicí;

- sérum telete bez specifického patogenu, očkovaného ts mutantní vakcínou atestovaného 3 týdny později virem BHV-1 subtypem 2b, které bylo sbíráno 7 týdnů po testu;

- sérum gnotobiotického telete, očkovaného ts mutantní vakcínou atestovaného 3 týdny později virem BHV-1 subtypem 2b, které bylo sbíráno 7 týdnů po testu.

Tabulka 2 ukazuje, že všechna tato séra obsahovala protilátky proti antigenním doménám III a IV na gE a proti antigenní doméně 1, která je pravděpodobně lokalizována na komplexu gE/gl. Můžeme uzavřít, že gE se jeví být vhodným sérologickým markérem pro rozlišení mezi dobytkem, infikovaným BHV-1, a dobytkem očkovaným.

- 16CZ 283283 B6

7) Detekce BHV-1 nukleových kyselin pomocí procedury PCR a primerů, specifických pro gE viru BHV-1

Na základě určené nukleotidové sekvence genu gE viru BHV-1 byl vybrán pár primerů, vhodný pro PCR užitím programu na výběr primerů od Loweho et al. (T. Lowe. J. Sharefkin, S. Oi Yang aC. W. Dieffenbach, 1990, Nucleic Acids Res. 18, 1757-1761). Tyto primery byly nazvány P₃ aP₄ a jsou ukázány na obr. 10. Primery jsou lokalizovány 159 nt od sebe a vedou k amplifikací fragmentu 200 nt. Použitím primerů P₃ a P₄ a izolované DNA viru BHV-1 byly optimalizovány podmínky pro metodu PCR. To znamená obzvláště variace v koncentraci MgCl₂, koncentraci glycerolu a v podmínkách pro cyklování. Byl nalezen optimální pufr pro užití P₃ a P₄ k amplifikací DNA BHV-1, jeho složení je 10 mM Tris pH 8,0, 50 mM KCI, 0,01% želatina, 2,6 mM MgCl₂ a 20% glycerol. Optimální podmínky pro cyklování (Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler) jsou pro cykly 1-5:1 min. 98 °C, 30 sec. 55 °C a 45 sec. 72 °C a pro cykly 635:30 sec. 96 °C, 30 sec. 55 °C a 45 sec. 72 °C. Po amplifikací PCR byl získaný DNA fragment, dlouhý 200 nt, podroben elektroforéze ve 2% agarózovém gelu, přenesen blotováním na nitrocelulózu a následně podroben analýze Southemovou hybridizaci. Značená sonda ³²P dCTP, použitá k Southemově analýze, je 137 bp Taql fragment, který je lokalizován mezi místy, kam se vážou primery (obr. 10). Po autoradiografii hybridizovaného filtru může být pozorován proužek, odpovídající délce 200 bp. Tato amplifikace pouhých 10 BHV-1 genomů (přibl. 1,5 x 10'¹⁵ pg DNA) vede k dostatečně detekovatelnému signálu (výsledek není ukázán). Srovnatelným způsobem byla vyvinuta metoda PCR, používající primery, které jsou založeny na kódující sekvenci glykoproteinu glll viru BHV-1 (D. R. Fitzpatrick, L. A. Babiuk aT. Zamb, 1989, Virology 173, 46-57). Aby bylo možné rozlišit mezi DNA divokého typu BHV-1 agE deleční mutantní vakcínou, oba DNA vzorky byly podrobeny oběma PCR analýzám - specifické pro gE a specifické pro glll. V takovém testu byl nalezen izolát DNA Difívac-1 glll pozitivní agE negativní.

Protože detekce DNA viru BHV-1 v býčím semenu bude důležitým využitím BHV-1 specifické PCR procedury, byla pokusně provedena PCR, specifická pro gE, na býčím semenu, infikovaném BHV-1. Avšak neznámé komponenty v semenu mají silný inhibiční účinek na polymerázovou řetězovou reakci. Proto byl vyvinut protokol k izolaci DNA BHV-1 z býčího semene. K izolaci DNA z býčího semene je 30 μΐ semene inkubováno s 1 mg/ml proteinázy K (pK.) v celkovém objemu 300 μΐ 0,15M NaCl, 0,5% Na-Sarkosylu a 40 mM DTT při 60 °C. Po 1 hodině je vzorek ochlazen na pokojovou teplotu a je přidáno 300 μΐ 6M Nal a inkubuje se 5 min. Z této směsi je DNA izolována standardní chloroform/isoamylalkoholovou extrakcí a precipitována jedním objemem isopropanolu. Precipitát je omyt 2,5 M NHiAc/70% ethanolem a resuspendován v 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 80 a 0,1 mg/ml pK pro druhou inkubaci jednu hodinu při 60 °C. Tento izolát DNA může být přímo podroben polymerázové řetězové reakci.

Průmyslová využitelnost

Vynález se týká souboru vakcín BHV-1, buď živých nebo inaktivovaných, kterým je společné to, že postrádají buď celý nebo část genu pro glykoprotein gE. Tento soubor obsahuje jak přirozerý gE deleční mutant, tak vytvořené gE deleční mutanty, které mohou ale nemusejí obsahovat deleci v genu pro thymidinkinázu a/nebo genu pro glykoprotein gl, a vytvořené gE deleční mutanty, které jsou užity jako vektory pro heterologní geny. Vynález se dále týká nukleotidových sekvencí, kódujících gen pro glykoprotein gE viru BHV-1, oligonukleotidů, odvozených z těchto sekvencí, samotného glykoproteinu gE, peptidů, které jsou z něho odvozeny a (monoklonálních nebo polyklonálních) protilátek, které jsou namířeny proti glykoproteinu gE a z něho odvozeným peptidům. Vynález se dále týká komplexů glykoproteinů gE agl viru BHV-1 a protilátek, namířených proti takovým komplexům.

- 17CZ 283283 B6

Tyto materiály mohou být podle vynálezu použity pro:

1) očkování dobytka proti nemocem, způsobeným BHV-1, a to tak, že mohou být odlišena zvířata; infikovaná BHV-1 od očkovaných zvířat, konvenční a zkonstruovaná vakcína mohou být užity vedle sebe;

2) očkování dobytka jak proti nemocem, způsobeným BHV-1, tak nemocem, způsobeným jinými patogeny, jejichž sekvence, kódující ochranné antigeny, mohou být vloženy do delečních mutantů BHV-1;

3) testování krve, séra, mléka, nebo jiných tělesných tekutin z dobytka sérologicky nebo technikami detekce nukleových kyselin (např. PCR), zda jsou infikovány divokým typem BHV-1, nebojsou očkovány gE delečním mutantem.

Popis výkresů

Obrázek 1

Analýza dle Southema (Southem blot) virových BHV-1 kmenů Difivac-1 a Iowa

A. Kresba autoradiogramu Southemova blotu genomické DNA viru Difivac-1 a Iowa. V řadách 1 a 3 byla použita DNA Difívac-1 po štěpení restrikčním enzymem HindlII a Pstl. V řadách 2 a 4 byla použita DNA Iowa po štěpení restrikčním enzymem HindlII a Pstl. Velikost fragmentů je udána v kilobázích (kb).

Virová DNA byla izolována centrifugací tkáňového média (70 ml/kultivační láhev přibl. 450 cm²) s virem infikovanými Ebtr buňkami po 2 hodiny na 25% (w/w) sacharózovém gradientu, v lOmM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl a lmM EDTA v 20 krpm v rotoru Beckman SW27 ultracentrifugy L5-65. Z takto získané virové pelety byla izolována DNA dle standardních metod (J. Sambrook, E. F. Fritsch aT. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Tato DNA byla štěpena restrikčními enzymy od Boehringera Mannheim v SuRE/cut pufrech, dodanými výrobcem.

Po separaci v 0,7% agarózovém gelu při horizontální elektroforéze a přenesení na nitrocelulózový filtr (Schleicher & Schuell, lne.) byl filtr prehybridizován 6 hodin při 42 °C v 50% formamidu, 3x SSC (lx SSC = 0,15 M NaCl a 0,015 M Na citrát, pH 7,4) , 50 μΐ denaturované salmon sperm DNA (Sigma)/ml a 0,02% bovinní sérový albumin, 0,02% polyvinyl pyrrolidon a 0,02% ficoll a 0,1% Na dodecylsulfát (SDS). Potom byla provedena hybridizace přidáním ³²P dCTP (Amersham) značeným HindlII K fragmentem do téhož roztoku. (Výběr HindlII K fragmentu je založen na: Cloning and cleavage site mapping of DNA from bovine herpesvirus 1 (Cooper strain), John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. Vanort, Alphonso R. Campbell and David A Reed, Joumal of Virology (1983) 259-264). Po 12-14 hodinách hybridizace byl filtr promyt po 2 hodiny v 0,1% SDS a 0,1 x SSC při 60 °C. HindlII K fragment byl klonován ve vektoru pUC18 podle standardních klonovacích procedur (J. Sambrook, E. F. Fritsch aT. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Po HindlII štěpení pUC/8, 4 HindlIIK klonu byl separován vektor pUCIB od 8,4 kb HindlII K fragmentu znovu elektroforeticky v 0,7% agarózovém gelu s nízkým (low melting) bodem tání (BRL, Life Technologies. Inc.) a izolován z agarózy standardní fenolovou extrakcí a ethanolovou precipitací. Izolovaný HindlII K fragment byl naznačen pomocí kitu Random Primed DNA Labelling Kit 1004.760 od Boehringer Mannheim. Autoradiografie

- 18CZ 283283 B6 hybridizovaných filtrů byla prováděna během 36-hodinové expozice Kodak XAR filmu v -70 °C, s použitím odrážející clony.

B. Fyzikální mapa 8,4 kb velkého HindlII K fragmentu z Iowa a 7,4 kb Hind III fragmentu z Difivac-1. Vzhledem ke komigraci 6 kb Pstl fragmentů a nepřítomnosti 1,8 kb Pstl fragmentu v Difivac-1 lze předpokládat deleci ve šrafované oblasti.

Obrázek 2

Subklonování fragmentů BHV-1 divokého v oblasti chybějící v Difivac-1

V A jsou ukázány části genomu BHV-1: unikátní dlouhá (U_L) oblast; unikátní krátká (U_s) oblast a dvě opakované oblasti (repeaty Ir a Tr). Tato mapa je založena na publikované analýze kmene Cooper (John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. Vanoort, Alphonso R. Campbell a David A. Reed, Joumal of Virology (1983) 259-264).

V B jsou ukázány fragmenty z U_s oblasti, které byly klonovány v prokaryotických vektorech: A 15,2 kb EcoRI fragment v pACYC, 8,4 kb Hind ΙΠ fragment v pUC18 a 2,7 kb a 4,1 kb EcoRIHindlII fragment v pBR322. Izolace fragmentů virové DNA byla provedena postupy, které jsou zmiňovány v legendách obrázku 1 A. Klonování těchto fragmentů v různých vektorech bylo provedeno podle standardních procedur (J. Sambrook, E. F. Fritsch aT. Maniatis, 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York).

V C je ukázána fyzikální mapa oblasti, kde je lokalizována předpokládaná delece v Difivac-1.

V D jsou vyznačeny některé subklony této oblasti, které byly použity pro další analýzy. Dva Pstl fragmenty byly klonovány v pKUN19 a zbývající fragmenty v pUC18.

Obrázek 3

A: Nukleotidová sekvence 2027 nukleotidů zU_s oblasti BHV-1 kmene Lam v okolí předpokládaného místa, které bylo deletováno v Difivac-1, jak je vyznačeno na obr. 2C (z Alul místa extrémně nalevo k HincII místu extrémně napravo). Nukleotidová sekvence inzertů subklonů, zobrazená na obr. 2D, byla určena analýzou obou vláken dideoxy-sekvenační metodou Sangera et al. (F. Sanger, S. Nicklen a A. R. Coulson, 1977, proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). K tomu byl použit sekvenační kit T7 od Pharmacia a postup podle výrobce. K radioaktivnímu značení byl použit [³⁵S] dATP (Amersham). Sekvenční analýza oblastí bohatých na GC s kompresními artefakty byla opakována s 7-deaza-dGTP variantou sekvenačního kitu Pharmacia. Pod nukleotidovou sekvencí je vyznačena v třípísmenném kódu sekvence aminokyselin (aa) otevřeného čtecího rámce 575 aa reziduí, která byla nalezena po teoretické translaci nukleotidové sekvence. Tato translace je založena na univerzálním kódu a byla provedena počítačovým programem PC/gene (PC/gene verze 1.03, listopad 1987). Tento otevřený čtecí rámec 575 aa začíná methioninem v nt 168 a končí stopkodónem v nukleotidu 1983.

Strukturální analýza otevřeného čtecího rámce 575 aa reziduí byla také provedena počítačovým programem PC/gene. Prvních 26 aa tvoří eukaryotický exportní signál, označený na obrázku jako signální peptid. Se skórem 6,2 lze předpovědět štěpění této signální sekvence mezi aa 26 a aa27. Sekvence 575 aa má 3 možná N-glykosylační místa (NXT/S), vyznačená linií pod aminokyselinovými reziduy. Podle metody dle Raa a Argose je mezi aa 423 a aa 450 transmembránova oblast, označená na obrázku transmembránová šroubovice . Rozpoznávací sekvence pro

- 19CZ 283283 B6 restrikční enzymy AsuII, Sma 1, HindlII aEcoNI jsou podtrženy. Vypočtená molekulární hmotnost tohoto polypeptidů je 61212.

B: Schématické znázornění strukturálních charakteristik výše zmíněného otevřeného čtecího rámce dlouhého, 575 aa.

Obrázek 4

Srovnání sekvence aminokyselin genu gE viru BHV-1 se sekvencí aminokyselin genu gE viru herpes simplex (HSV) a s ostatními homologními geny gE [gl viru pseudorabies (PRV) a gpl viru varicella-zoster (VZV) ]

Sekvence, použité k tomuto srovnání, pocházejí z následujících publikací: HSV: Sequence determination and genetic content of the short unique region in the genome of herpes simplexvirus type 1. D. J. McGeoch, A. Dolan, S. Donald a F. J. Rixon (1985) Joumal Mol. Biol. 181, 1-13. VZV: DNA sequence of the Us component of the varicella-zoster virus genome. A. J. Davidson (1983), EMBO Joumal 2, 2203-2209. PRV: Use of lambda-gtll to isolate genes for two pseudorabies virus glycoproteins with homology to herpes simplex virus and varicella-zoster virus glycoproteins. E. A. Petrovskis. J. G. Timmins a L. E. Post (1986) Joumal of Virology 60, 185-193. Tyto sekvence byly srovnány použitím programu Multalin pro sekvenční analýzu (F. Corpet, 1988, Nucl. Acids Res. 16, 10881-10890).

V diagramu A jsou schematicky znázorněny všechny čtyři sekvence aminokyselin. Zde jsou pod každou sekvencí vyznačeny předpokládané transmembránové části (TM). Kromě předpověděných exportních signálních sekvencí (SP) s možnými N-glykosylačními místy (I) jsou ukázány dvě konzervativní oblasti, ve kterých je často stabilní relativní pozice cysteinových reziduí (C C C).

V B jsou ukázány výsledky srovnání oblastí, bohatých na centrálně lokalizovaný cystein, čtyř verzí gE, získané programem Multalin. Hvězdičky označují identické aminokyseliny a dvojtečky analogní aminokyseliny.

Obrázek 5

Kresba fotografií, získaných analýzou kmenů Difivac-1 a Iowa dle Southema

Panel A: Genomická DNA z viru Difivac-1 a Iowa, štěpená restrikčními enzymy Bstl (1, 2), EcoRI (3, 4) a HindlII (5, 6) separovaná na 0,7% agarózovém gelu, přenesená na nitrocelulózu a hybridizovaná s ³²P značeným HindlII

K fragmentem BHV-1 kmene Lam podle postupů, specifikovaných v legendách obrázku 1A.

Panel B: Nitrocelulózový blot téhož gelu jako v A, hybridizovaný s BHV-1 gE-specifickou sondou p318. Tato sonda obsahuje celou AluI-HincII oblast, vyznačenou na obr. 2C.

Obrázek 6

Konstrukce gE delečního fragmentu BHV-1

V A jsou ukázány pozice genu gE a použitých klonů. Součásti genomu BHV-1 jsou: unikátní dlouhá (Ul) oblast; unikátní krátká (U_s) oblast a dva repeaty (IR a TR). Aby se získala oblast,

-20CZ 283283 B6 lokalizovaná na 5' straně genu gE, byl v místech Smál aPstl plazmidu pUC18 subklonován 1,4 kb Pstl-Smal fragment z 8,4 kb HindlII K fragmentu z BHV-1 kmene Lam. Tento klon byl nazván p515 a je ukázán v B. V unikátním AsuII místě p515 byl klonován EcoNI-Smal fragment, lokalizovaný na 3' straně gE, pocházející z 4,1 kb HindlII-EcoRI klonu. Aby bylo možné připojit zbytek EcoNI ke zbytku AsuII, byl klon p515 štěpen s AsuII, ošetřen Klenow enzymem (Boehringer Mannheim) a dCTP za účelem získání jednoho cytosinového rezidua v AsuII zbytku podle standardních metod (Sambrook et al., 1989). Tento přídatný cytosin je označen hvězdičkou v D. Pak byl také štěpen p515 enzymem Smál, aby mohl být vnesen EcoNI fragment do tohoto vektoru. Takto vytvořený klon byl nazván p519.

Obrázek 7

A. Kresba fotografie, získané analýzou Southemova blotu izolátů DNA z 1B7, 1B8 a2H10. DNA izolace, štěpení restrikčními enzymy, blotování ahybridizace byly provedeny podle procedur, popsaných v legendách obr. IA. Po Pstl-Dral dvojitém štěpění izolátů DNA 1B7, 1B8 a2H10 byly fragmenty separovány na 0,7% agarózovém gelu a následně přeneseny na nitrocelulózový filtr. Tento filtr byl hybridizován s ³²P dCTP značeným 2,3 kb Pstl-Dral delečním fragmentem jako sondou. V liniích 1 až 3 byly separovány vzorky 1B7, 1B8 a 2H10. V linii 4 byla použita DNA divokého typu BHV-1 kmene Lam a v linii 5 deleční fragment 2,3 kb.

B. Fyzická mapa 15,2 kb EcoRI fragmentu BHV-1 kmene Lam. Mapa ukazuje pozici Pstl, Dral a HindlII rozpoznávacích míst a pozici hybridizační sondy, zmíněné v 7A.

Obrázek 8

Prokaryotická exprese gE viru BHV-1

K prokaryotické expresi gE viru BHV-1 byl fúzován 600 bp Smál fragment genu gE ve třech čtecích rámcích ke kódující oblasti genu pro glutathion-S-transferázu ze Schistosoma japonicum ve vektoru pGEX-2T (D. B. Smith aK. S. Johnson, Gene 67 (1988) 31-40). Rekombinantní molekuly s vhodnou (syn) orientací Smál fragmentu byly identifikovány pomocí restrikční analýzy užitím standardních metod. E. coli DH5a klony s tímto fúzovaným konstruktem byly nazvány pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 a pGEX-2T600s3.

A. Diagram jednoho z pGEX-2T600s konstruktů. Na NH₂ straně oblasti, která kóduje GST-gE fúzovaný produkt, je lokalizovaná oblast pro tac promotor, indukovatelný isopropylthiogalaktosidem (IPTG).

B. Kresba fotografií, získaných analýzou Western blotu celkových proteinových izolátů buněk DH5a transformovaných pGEX-2T600s. Celonoční kultury buněk DH5a transfekovaných pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 a pGEX-2T600s3 pokračovaly v 1/10 Luria-Bertani (LB) médiu s 50 pg/ml ampicilinem a po 1 hodině byl růst indukován IPTG po 5 hodin. Tyto indukované kultury byly centrifugovány 5 min, v 6 OOOxg a sloučeny s lx vrstvící směsí (2% SDS, 10% glycerol, 5% mercaptoethanol a 0,01% bromophenol blue) [1,5 ml kultury se sloučí s 500 μΐ směsi] a zahřátý při 95 °C 5 minut. Pak bylo separováno 50 μΐ na jednu dráhu na vertikálním 12,5% polyakrylamidovém gelu podle standardních procedur a následně přeneseno (Semi-dry blotted) na nitrocelulózový filtr za použití systému LKB-multiphor II Nova Blot dle podmínek, stanovených výrobcem.

V dráhách M byl použit předem nabarvený markerový protein (BRL Life Technologies, lne. 236k, 112k, 71 km 44k, 28k, 18k a 15k) a v dráhách 1, 2 a 3 celkové proteinové izoláty z buněk

-21 CZ 283283 B6

DH5a transfekovaných konstrukty se třemi odpovídajícími rámci: pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 a pGEX-2T600s3.

Na panelu A je vidět výsledek analýzy Western blotu s anti-GST sérem. K tomu byl filtr inkubován podle standardních procedur (E. Harlow aD. Lané, 1988, Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory. New York) v blokujícím pufru (PBS + 2% sušené mléko a 0,05% Tween 20) a následně s polyklonálním anti-GST králičím sérem. Pak byl filtr promyt a inkubován se sérem obsahujícím kozí protikráličí imunoglobulin, konjugovaný s křenovou peroxidázou (HRPO). Potom byly chromogenem (diaminobenzidin, chloronaphtol a H2O2) imunochemicky detekovány navázané kozí protilátky. GST fúzovaný produkt, který je označen šipkou, má předpokládanou velikost přibližně 47 k pouze v rámci 3.

Na panelu B je vidět výsledek anylýzy Western blotování s monoklonální protilátkou Mab 4, která rozeznává gE protein. K tomu byl blokován dvojitý filtr jako v panelu A, inkubován s Mab, promyt a inkubován s HRPO konjugovaným králičím protimyším sérem. Pak byly navázané králičí protilátky imunochemicky detekovány chromogenem. Pruh, který je viditelný v řadě 3 (rámec 3), je 47k veliký aje označen šipkou.

Obrázek 9

Konstrukce plazmidu pEVHisgE pro eukaryotickou expresi genu gE viru BHV-1

Pro eukaryotickou expresi genu gE byla klonována celá gE kódující oblast ve správné orientaci za HCMV promotorovou oblast expresního vektoru pEVHis použitím standardních procedur (Sambrook et al. 1989). K tomu byl klonován 394 bp Alul fragment, začínající 55 bp před otevřeným čtecím rámcem gE v pUC18, a nazván p201. Pak po naštěpení p201 enzymem HincII byl do p201 klonován 1740 bp HincII fragment, který zahrnuje větší část genu gE. To vedlo k plazmidu p318, který v polylinkeru pUC18 obsahuje celou gE kódující oblast od Alul místa 55 bp před počátečním kodónem gE do HincII místa 133 bp za stop-kodónem gE. Užitím restrikčních míst v polylinkeru vektoru byl tento fragment vyštípnut zp318 enzymy BamHI a SphI. Nejdříve byl p318 štěpen Sphl a pak bylo Sphl místo vyplněno za použití Klenowovy polymerázy adNTP. Po štěpení BamHI byl 1,9 kb inzert separován z vektoru pUC18 v agaróze s nízkým bodem tání a ligován do vektoru pEVHis, který byl k tomu naštěpen BamHI a EcoRV. Takto vytvořený plazmid byl nazván pEVHis/gE.

Obrázek 10

Poloha gE-specifických primerů a sondy pro metodu PCR pro detekci DNA viru BHV-1

Na obrázku je ukázána sekvence nukleové kyseliny glykoproteinů gE viru BHV-1 od nukleotidu 1272 do 2027 (sekvence byla převzata z Obr. 3). Použité primery pro gE-specifíckou techniku PCR byly nazvány P₃ aP₄. Místa, vázající primery P₃ aP₄, jsou podtržena. Nukleotidová sekvence P₃ je 5-ACG-TGG-TGG-TGC-CAG-TTA-GC-3' (SEQ ID NO:2). Nukleotidová sekvence P₄ je (komplementární k sekvenci vázající primer určené výše) 5'-ACC-AAA-CTTTGA-ACC-CAG-AGC-G-3' (SEQ ID NO:3). Sonda, která byla použita k hybridizaci Southemova blotu pro detekci DNA amplifíkované v PCR, je 137 bp Taql fragment, lokalizovaný mezi místy, vázajícími primery, konce tohoto fragmentu jsou označeny. Ke srovnání s obr. 3 jsou také označena místa HindlII a EcoNI.

-22CZ 283283 B6

Obrázek 11

Mapování gE delece ve viru Difivac-l

A ukazuje fyzikální mapu 15,5 kb EcoRI fragmentu divokého typu BHV-1 kmene Lam. B ukazuje fyzikální mapu 14,5 kb EcoRI fragmentu Difivac-l. Oba EcoRI fragmenty pokrývají kompletně unikátní krátké oblasti genomů příslušných virů. Pozice genu gE a předpokládaná pozice genu gl byly označeny otevřenými rámečky. Mapy A a B jsou umístěny tak, že 6 kb Pstl fragmenty v každé mapě se překrývají. V obou mapách vnitřní (intemal repeat) a koncové opakované sekvence (terminál repeat) byly označeny šrafovanými rámečky. Šipky pod opakovanými sekvencemi označují orientaci těchto sekvencí.

V A je označena část U_s oblasti, která chybí v kmeni Difivac-l.

C ukazuje pozici klonovaných fragmentů Difivac-l, použitých k mapování delece gE a k získání fyzikální mapy, ukázané v B. Šipky pod inzerty klonů p728, p737 a p754 označují oblasti, které byly sekvenovány k určení rekombinačního místa.

Zkratky:

A = Alul, E = EcoRI, P = Pstl, H = HindlII, r = místo rekombinace, IR = vnitřní opakované sekvence, TR = koncové opakované sekvence.

Obrázek 12

Určení přesného místa rekombinace v oblasti U_s viru Difivac-l

K. určení přesných hranic gE delece, nalezené v kmeni Difivac-l, byly sekvenovány klon p754 a konce klonů p728 ap737. Inzerty těchto klonů byly označeny na obrázku 11. Použité sekvenační procedury byly popsány v legendách obrázku 3.

V A je ukázána sekvence většiny Alul-Pstl fragmentu. Tato sekvence začíná v oblasti promotoru genu gE. Předpokládaný TATA rámeček je podtržen. V bodu r (=misto rekombinace) je tato promotorová oblast fúzovaná se sekvencí také nalezenou na protějším místě oblasti U_s, nazvanou invertovaná opakovaná sekvence (repetice). Přesné místo rekombinace bylo určeno srovnáním opakované sekvence, nalezené v gE promotorové oblasti, s kopií opakované sekvence, nalezené na protějším místě oblasti U_s. Bod, kde se tyto sekvence rozcházejí, je označen v B (pod 1) ’r* . Podobné srovnání bylo provedeno sgE promotorovou sekvencí, nalezenou v Difivac-l, agE promotorem, nalezeným v divokém typu kmene Lam. Bod, kde se tyto sekvence rozcházejí, je ukázán v B (pod II) a také označen 'r'. Nalezená rekombinační místa jsou totožná.

Obrázek 13

Částečná sekvenční analýza genu gl BHV-1

Použitím 1,8 kb Pstl klonu BHV-1 kmene Lam, který zasahuje do obou genů gE a gl viru BHV-1 (viz obr. 11), byla určena sekvence 284 nukleotidů v kódující oblasti BHV-1 gl. Použité sekvenační procedury byly popsány v legendách obrázku 3. Sekvence byla přeložena univerzálním kódem počítačovým programem PC/gene, verze 1.03 (listopad 1987). Sekvence aminokyselin, zakódovaná druhým čtecím rámcem, je uvedena v jednopísmenném kódu pod nukleotidovou sekvencí. Tato aminokyselinová sekvence je homologní ke kódující oblasti jiných

-23 CZ 283283 B6 homologů gl virů herpes (viz obr. 14).

Obrázek 14

Srovnání částečné aminokyselinové sekvence předpokládaného genu gl viru BHV-1 s odpovídajícími částmi kódujících oblastí genu gl viru herpes simplex (HSV1), genu gp63 viru pseudorabie (PRV) a genu gpIV viru varicella-zoster (VZV).

Sekvence PRV začíná v aminokyselině 82, HSV1 sekvence začíná vaa 80 a sekvence N7N začíná v aa 76 příslušných kódujících oblastí. Užité sekvence byly publikovány v článcích, zmíněných v legendách obrázku 4. Srovnání bylo provedeno použitím počítačového programu Multalin. Hvězdičky označují identické aminokyseliny a dvojtečky označují analogické aminokyseliny.

Obrázek 15

Konstrukce plazmidů MSVneoGI pro eukaryotickou expresi genu gl viru BHV-1

Na základě srovnání aminokyselin částečné sekvence genu gl BHV-1, byla určena předpokládaná poloha genu gl. Z tohoto určení lze usuzovat, že 1,7 kb Smál fragment by mohl obsahovat kompletní kódující oblast genu gE BHV-1. Pozice tohoto 1,7 kb Smál fragmentu je označena v A. K tupým koncům tohoto 1,7 kb Smál fragmentu byly užitím standardních procedur ligovány BamHI linkery. Výsledný produkt byl štěpen BamHI a ligován do eukaiyotického expresního vektoru MSV-neo. MSV-neo vektor má unikátní BamHI místo za MSV-LTR, které má silnou promotorovou aktivitu. Tento vektor byl popsán v práci Rijsewijk et al., 1987 EMBO J. 6, 127-131.

Obrázek 16

Konstrukce gl/gE dvojitého delečního fragmentu BHV-1

Poloha glykoproteinového genu gE a předpokládaná poloha glykoproteinového genu gl v U_s oblasti BHV-1 jsou zobrazeny v diagramu A. Srafované bloky označují opakované sekvence, které ohraničují U_s oblast. B ukazuje fyzikální mapu míst některých hlavních restrikčních enzymů se zřetelem na pozici obou genů. Ke konstrukci gl/gE delečního fragmentu je klon pl,7Smal/o, obsahující 1,7 kb Smál fragment, který zahrnuje gen gl, štěpen Pstl. Pstl místo zbývajícího 350 bp Smal-Pstl inzertu bude vytvořeno s tupými konci užitím standardních molekulárně biologických procedur. EcoNI-Smal fragment (viz obr. 6B), izolovaný z 4,1 kb HindlII-EcoRI fragmentu, popsaného, na obrázku 6A, je také vytvořen s tupými konci a ligován k modifikovanému Pstl místu. Toto je znázorněno v C a D. Z výsledného klonu p-delta-IE může být izolován 1,4 kb Smal-Dral fragment k rekombinaci s DNA divokého typu BHV-1.

Zkratky:

E = EcoRI, H = HindlII, S = Smál, P = Pstl, ENI= EcoNI, D = Dral, kb = kilobáze, U_s - unikátní krátká sekvence.

-24CZ 283283 B6

Obrázek 17

Průměrné nazální vylučování viru telaty po očkování: · = očkovaná Difivac-1, 0 = neočkovaná kontrola.

Obrázek 18

Průměrný denní klinický stav telat po testu (challenge) virulentním kmenem BHV-1, klíč jako na obr. 17.

Obrázek 19

Průměrná rektální teplota telat, testovaných virulentním kmenem BHV-1, klíč jako na obr. 17.

Obrázek 20

Průměrný růst telat po testu virulentním kmenem BHV-1, klíč jako na obr. 17.

Obrázek 21

Průměrné nazální vylučování viru telaty po testu virulentním kmenem BHV-1, klíč jako na obr. 17.

Obrázek 22

Průměrná rektální teplota telat po testu virulentním kmenem BHV-1, • ~ očkovaný Lam gE', o = očkovaný Lam gE‘ /TK‘, x = neočkovaná kontrola.

Obrázek 23

Průměrný růst telat po testu virulentním kmenem BHV-1, klíč jako na obr. 22.

Obrázek 24

Průměrný denní klinický stav telat po testu virulentním kmenem BHV- 1, klíč jako na obr. 22.

Tabulka 1

Nazální vylučování viru telaty po očkování Lam gE' nebo Lam gE /TK/a po testu virulentním BHV-1 kmenem těchto očkovaných a kontrolních telat

-25CZ 283283 B6

Průměrný počet dní nazálního vylučování viru

Skupina Po očkování Po testu

Kontrola	0	10,33 ± 1,51
Lam gE'	7,00 ± 0,89	4,83 ± 1,17
Lam gEVTK’	7,17 ±1,33	5,17 ±0,98

Tabulka 2 Charakteristika gE-Mabs
Mab	REAKTIVITA MOŽNÉ gE-Mab S:
	Difivac-1 3T3/ EBTR	Lam gE’	Prok.	3T3 gE	3T3 gE Difivac-1	3T3 gE/gl	Ag skupina	Ab dobytek
1			nd	-	+	?	I	+
2			-	+	+	+	II	-
3			+	+	+	+	9	-
4			+	+	+	+	?	-
42			nd	-	-	?	V?	±
51			nd	-	+	+	III	+
52			+	+	+	+	?
53			nd	-	+	+	III	+
59			nd	-	-	+	III	+
66			nd	+	+	+	III	+
67			nd	-	+	+	III	+
68			-	+	+	+	IV	+
72			-	+	+	+	v	+
75			nd	-	+	?	I	+
78			nd	-	+	?	nd	-
81				+	+	+	II?	-

+: Všech 8 testovaných sér dosahuje v nepřímé blokující IPMA víc jak 50 % účinku. ±: Séra dosahují blokující procento ± 50 %.

-: Séra dosahují blokující procento < 50 %.

Výpis sekvence

Číslo sekvence (SEQ ID NO:1)

DÉLKA:

2027 nukleotidů, 575 aminokyselin

TYP: nukleotidy a aminokyseliny

TYP VLÁKNA: jednoduché

AGGGCGGAGC GTTGAGCGGC CCGACCGCCG CCGGGTTGTT AAATGGGTCT CGCGCGGCTC 60 I —> deletováno v Difivac-1

GTGGTTCCAC ACCGCCGGAG AACCAGCGCG AGCTTCGCTG CGTGTGTCCC GCGAGCTGCG 120

-26CZ 283283 B6

167

AsuII

TTCCGGGGAA CGGCGCACGC GAGAGGGTTC GAAAAGGGCA TTTGGCA

ATG CAA CCC ACC GCG CCG CCC CGG CGG CGG TTG CTG CCG CTG CTG CTG 215 Met Gin Pro Thr Ala Pro Pro Arg Arg Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu 15 10 15

----------------------------------------------------------SIGNÁLNÍ PEPTID-----------------------------------------

CCG CAG TTA TTG

CTT Leu

TTC Phe

GGG CTG ATG GCC

GAG GCC AAG CCC GCG ACC

263

Pro

Gin

Leu

Leu 20

Gly

Leu

Met 25

Ala

Glu

Ala

Lys

Pro 30

Ala

Thr

Smál

GAA ACC CCG GGC TCG

GCT

TCG GTC GAC ACG GTC

TTC

ACG GCG CGC

GCT

311

Glu

Thr

Pro

Gly

Ser

Ala

Ser

Val

Asp

Thr

Val

Phe

Thr

Ala

Arg

Ala

35

40

45

GGC GCG CCC

GTC

TTT

CTC

CCA GGG CCC GCG GCG CGC CCG GAC GTG CGC

359

Gly

Ala

Pro

Val

Phe

Leu

Pro

Gly

Pro

Ala

Ala

Arg

Pro

Asp

Val

Arg

50

55

60

GCC

GTT

CGC GGC TGG AGC GTC

CTC

GCG GGC GCC TGC TCG CCG CCC GTG

407

Ala

Val

Arg

Gly

Trp

Ser

Val

Leu

Ala

Gly

Ala

Cys

Ser

Pro

Pro

Val

65

70

75

80

CCG GAG CCC

GTC

TGC

CTC

GAC GAC CGC GAG TGC

TTC

ACC GAC GTG GCC

455

Pro

Glu

Pro

Val

Cys

Leu

Asp

Asp

Arg

Glu

Cys

Phe

Thr

Asp

Val

Ala

85

90

95

CTG GAC GCG GCC

TGC

CTG CGA ACC GCC CGC GTG GCC CCG CTG GCC

ATC

503

Leu

Asp

Ala

Ala

Cys

Leu

Arg

Thr

Ala

Arg

Val

Ala

Pro

Leu

Ala

Ile

100

105

110

GCG GAG CTC GCC GAG CGG CCC GAC TCA ACG GGC GAC AAA GAG

TTT

GTT

551

Ala

Glu

Leu

Ala

Glu

Arg

Pro

Asp

Ser

Thr

Gly

Asp

Lys

Glu

Phe

Val

115

120

125

PvuII

CTC

GCC GAC CCG CAC

GTC

TCG GCG CAG CTG GGT CGC AAC GCG ACC GGG

599

Leu

Ala

Asp

Pro

His

Val

Ser

Ala

Gin

Leu

Gly

Arg

Asn

Ala

Thr

Gly

130

135

140

GTG

CTG

ATC GCG GCC GCA GCC GAG GAG GAC GGC GGC GTG TAC

TTC

CTG

647

Val

Leu

Ile

Ala

Ala

Ala

Ala

Glu

Glu

Asp

Gly

Gly

Val

Tyr

Phe

Leu

145

150

155

160

TAC GAC CGG CTC

ATC GGC GAC GCC GGC GAC GAG GAG ACG CAG TTG

GCG

695

Tyr

Asp

Arg

Leu

Ile

Gly

Asp

Ala

Gly

Asp

Glu

Glu

Thr

Gin

Leu

Ala

165 170 175

CTG ACG CTG CAG GTC GCG ACG GCC GGC GCG CAG GGC GCC GCG CGG GAC 743 Leu Thr Leu Gin Val Ala Thr Ala Gly Ala Gin Gly Ala Ala Arg Asp

180 185 190

-27CZ 283283 B6

GAG GAG AGG GAA CCA GCG ACC GGG CCC ACC CCC GGC CCG CCG CCC CAC 791

Glu

Glu

Arg 195

Glu

Pro

Ala

Thr

Gly 200

Pro

Thr

Pro

Gly

Pro 205

Pro

Pro

His

CGC ACG ACG ACA CGC GCG CCC CCG CGG CGG CAC GGC GCG CGC

TTC

CGC

839

Arg

Thr

Thr

Thr

Arg

Ala

Pro

Pro

Arg

Arg

His

Gly

Ala

Arg

Phe

Arg

210

215

220

Smál

GTG

CTG CCG TAC

CAC

TCC

CAC GTA TAC

ACC CCG GGC GAT TCC

TTT

CTG

887

Val

Leu

Pro

Tyr

His

Ser

His

Val

Tyr

Thr

Pro

Gly

Asp

Ser

Phe

Leu

225

230

235

240

CTA TCG GTG CGT

CTG CAG TCT GAG TTT

TTC

GAC GAG GCT CCC

TTC

TCG

935

Leu

Ser

Val

Arg

Leu

Gin

Ser

Glu

Phe

Phe

Asp

Glu

Ala

Pro

Phe

Ser

245

250

255

GCC AGC

ATC GAC TGG TAC

TTC

CTG CGG ACG GCC GGC GAC TGC GCG CTC

983

Ala

Ser

Ile

Asp

Trp

Tyr

Phe

Leu

Arg

Thr

Ala

Gly

Asp

Cys

Ala

Leu

260

265

270

ATC

CGC

ATA TAC GAG ACG TGC

ATC

TTC

CAC CCC GAG GCA CCG GCC TGC

1031

Ile

Arg

Ile

Tyr

Glu

Thr

Cys

Ile

Phe

His

Pro

Glu

Ala

Pro

Ala

Cys

275

280

285

CTG CAC

CCC

GCC GAC GCG CAG TGC AGC TTC GCG TCG CCG TAC CGC TCC

1079

Leu

His

Pro

Ala

Asp

Ala

Gin

Cys

Ser

Phe

Ala

Ser

Pro

Tyr

Arg

Ser

290

295

300

GAG ACC GTG TAC AGC CGG CTG TAC GAG CAG TGC

CGC CCG GAC

CCT GCC

1127

Glu

Thr

Val

Tyr

Ser

Arg

Leu

Tyr

Glu

Gin

Cys

Arg

Pro

Asp

Pro

Ala

305

310

315

320

GGT CGC TGG CCG CAC GAG TGC GAG GGC GCC GCG TAC GCG GCG CCC

GTT

1175

Gly

Arg

Trp

Pro

His

Glu

Cys

Glu

Gly

Ala

Ala

Tyr

Ala

Ala

Pro

Val

325

330

335

GCG CAC

CTG

CGT

CCC GCC AAT AAC AGC GTA GAC

CTG

GTC

TTT

GAC GAC

1223

Ala

His

Leu

Arg

Pro

Ala

Asn

Asn

Ser

Val

Asp

Leu

Val

Phe

Asp

Asp

340

345

350

GCG CCG GCT GCG GCC TCC GGG CTT

TAC

GTC

TTT

GTG CTG CAG TAC AAC

1271

Ala

Pro

Ala

Ala

Ala

Ser

Gly

Leu

Tyr

Val

Phe

Val

Leu

Gin

Tyr

Asn

355 360 365

HindlII

GGC Gly

CAC GTG GAA GCT TGG GAC TAC AGC

CTA GTC GTT ACT TCG GAC CGT

1319

His 370

Val

Glu

Ala

Trp

Asp 375

Tyr

Ser

Leu

Val

Val 380

Thr

Ser

Asp

Arg

TTG

GTG CGC GCG GTC ACC GAC CAC ACG CGC CCC GAG GCC GCA GCC GCC

1367

Leu

Val

Arg

Ala

Val

Thr

Asp

His

Thr

Arg

Pro

Glu

Ala

Ala

Ala

Ala

385

390

395

400

GAC GCT

CCC GAG CCA GGC CCA CCG

CTC

ACC AGC GAG CCG GCG GGC GCG

1415

Asp

Ala

Pro

Glu

Pro

Gly

Pro

Pro

Leu

Thr

Ser

Glu

Pro

Ala

Gly

Ala

405

410

415

-28CZ 283283 B6

CCC ACC GGG CCC GCG CCC TGG CTT GTG GTG CTG GTG GGC GCG CTT GGA 1463

Pro Thr Gly Pro Ala Pro Trp Leu Val Val Leu Val Gly Ala Leu Gly

420 425 430

------------------------------TRANSMEMBRÁNOVÝ HELIX--------------------CTC GCG GGA CTG GTG GGC ATC GCA GCC CTC GCC GTT CGG GTG TGC GCG 1511

Leu Ala Gly Leu Val Gly Ile Ala Ala Leu Ala Val Arg Val Cys Ala

435 440 445

CGC Arg

CGC GCA

AGC Ser

CAG Gin

AAG CGC

ACC TAC GAC ATC CTC AAC CCC TTC GGG

1559

Arg 450

Ala

Lys

Arg 455

Thr

Tyr

Asp

Ile

Leu 460

Asn

Pro

Phe

Gly

CCC

GTA

TAC

ACC AGC

TTG

CCG ACC AAC GAG CCG

CTC

GAC GTG GTG GTG

1607

Pro

Val

Tyr

Thr

Ser

Leu

Pro

Thr

Asn

Glu

Pro

Leu

Asp

Val

Val

Val

465

470

475

480

CCA

GTT

AGC GAC GAC GAA

TTT

TCC

CTC

GAC GAA GAC TCT

TTT

GCG GAT

1655

Pro

Val

Ser

Asp

Asp

Glu

Phe

Ser

Leu

Asp

Glu

Asp

Ser

Phe

Ala

Asp

485

490

495

GAC GAC AGC GAC GAT GAC GGG CCC

GCT AGC AAC

CCC

CCT GCG GAT GCC

1703

Asp

Asp

Ser

Asp

Asp

Asp

Gly

Pro

Ala

Ser

Asn

Pro

Pro

Ala

Asp

Ala

500

505

510

TAC GAC

CTC

GCC GGC GCC

CCA GAG CCA ACT AGC GGG TTT

GCG CGA GCC

1751

Tyr

Asp

Leu

Ala

Gly

Ala

Pro

Glu

Pro

Thr

Ser

Gly

Phe

Ala

Arg

Ala

515

520

525

CCC GCC AAC GGC ACG CGC

TCG AGT CGC

TCT GGG

TTC

AAA GTT

TGG

TTT

1799

Pro

Ala

Asn

Gly

Thr

Arg

Ser

Ser

Arg

Ser

Gly

Phe

Lys

Val

Trp

Phe

530

535

540

AGG GAC CCG CTT GAA GAC GAT GCC GCG CCA GCG CGG ACC CCG GCC GCA

1847

Arg

Asp

Pro

Leu

Glu

Asp

Asp

Ala

Ala

Pro

Ala

Arg

Thr

Pro

Ala

Ala

545

550

555

560

EcoNI

CCA GAT TAC ACC GTG GTA GCA GCG CGA CTC AAG TCC

ATC CTC CGC TAG

1895

Pro

Asp

Tyr

Thr

Val

Val

Ala

Ala

Arg

Leu

Lys

Ser

Ile

Leu

Arg

*

565

570

575

GCGCCCCCCC CCCCCCGCGC GCTGTGCCGT

CTGACGGAAA GCACCCGCGT GTAGGGCTGC

1955

ATATAAATGG AGCGCTCACA CAAAGCCTCG TGCGGCTGCT TCGAAGGCAT GGAGAGTCCA

2015

CGCAGCGTCG TC

2027

ČÍSLO SEKVENCE (SEQ ID NO: 2)

DÉLKA: 20 nukleotidů

TYP: nukleotid

TYP VLÁKNA: jednoduché

ACGTGGTGGT GCCAGTTAGC 20

-29CZ 283283 B6

ČÍSLO SEKVENCE (SEQ ID NO: 3)

DÉLKA: 22 nukleotidů

TYP: nukleotid

TYP VLÁKNA: jednoduché

ACCAAACTTT GAACCCAGAG CG 22

Claims (25)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mutant bovinního herpesového viru typu 1, BHV-1, uložený v Pasterově institutu ve Francii pod číslem 1-1213.
2. 2. Způsob přípravy mutantu bovinního herpesového viru typu 1, BHV-1, vyznačený tím, že se deletuje alespoň část glykoproteinového gE-genu, přičemž gE je protein, který, zejména v BHV-1 kmenu, má aminokyselinovou sekvenci podle obrázku
3. 3A.

   20 3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se deletuje gE-gen.
4. 4. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se deletuje gE-gen podle obrázku 3A z pozice asi 168 do asi 1895.

   25
5. 5. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že se deletuje gE-gen podle obrázku 3A z pozice asi 168 do asi 1427.
6. 6. Způsob přípravy vakcíny, vyznačený tím, že se smísí farmaceuticky přijatelný nosič s mutantem bovinníbo herpesového viru typu 1, BHV-1, získaným způsobem podle

   30 některého z nároků 2 až 4.
7. 7. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 2, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy.

   35
8. 8. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 5, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, který má deleci v gl-genu glykoproteinu.
9. 9. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 2, vyznačený tím, že se BHV-1 kmen podrobí postupu, kterým se vytvoří kromě delece v jeho gE-genu glykoproteinu

   40 také delece v genu thymidinkinázy a delece v gl-genu.
10. 10. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 5, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, který obsahuje heterogenní gen a má deleci v gE-genu glykoproteinu, která umožňuje sérologické odlišení mutantu od divokého typu BHV-1.
11. 11. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 10, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, který má heterologní gen vložen do místa gE-genu a který je pod kontrolou regulačních sekvencí, například gE-genu nebo heterologního genu, a popřípadě je připojen k té části gE-genu, která kóduje signální peptid.

    -30CZ 283283 B6
12. 12. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 11, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy, deleci v gl-genu nebo obě, přičemž heterologní gen je vložen do místa alespoň jedné z těchto deleci.
13. 13. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 9, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy, deleci v gl-genu nebo obě, heterologní gen je vložen do alespoň jedné z těchto deleci, přičemž v případě, že mutant má dvojí deleci, kterou je delece v gE-genu a delece v genu thymidinkinázy, heterologní gen není vložen do genu thymidinkinázy.
14. 14. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 9, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy, deleci v gl-genu nebo obě, heterologní gen je vložen do alespoň jedné z těchto deleci, má dvojitou deleci, kterou je delece v gE-genu a delece v genu thymidinkinázy, heterologní gen neznamená gen bovinního respiračního syncyciálního viru F nebo N.
15. 15. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle nároku 10, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, který má kromě delece v gE-genu také deleci v genu thymidinkinázy, deleci v gl-genu nebo obě, heterologní gen je vložen do alespoň jedné z těchto deleci, přičemž v případě, že mutant má dvojitou deleci, kterou je delece v gE-genu a delece v genu thymidinkinázy, jsou vloženy alespoň dva heterologní geny.
16. 16. Způsob přípravy mutantu kmenu BHV-1 podle kteréhokoliv z nároků 10 až 15, vyznačený tím, že se zkonstruuje mutant, v němž heterologní gen kóduje imunogenní protein nebo peptid jiného patogenu, nebo kóduje cytokin.
17. 17. Očkovací prostředek kočkování zvířat, zejména savců, zvláště hovězího dobytka, kjejich ochraně proti BHV-1, vyznačený tím, že je živou nebo inaktivovanou vakcínou, obsahující mutant BHV-1, uložený vPasterově institutu ve Francii pod číslem 1-1213, získaný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 2 až 16, a vhodný nosič nebo pomocné činidlo.
18. 18. Očkovací prostředek podle nároku 17 kočkování zvířat, zejména savců, zvláště hovězího dobytka, kjejich ochraně proti patogenu, vyznačený tím, že je živou nebo inaktivovanou vakcínou, obsahující mutant BHV-1, získatelný způsobem podle nároku 10, a vhodný nosič nebo pomocné činidlo, přičemž heterologní gen tohoto mutantu kóduje imunogenní protein nebo peptid patogenu.
19. 19. Diagnostická souprava pro detekci nukleové kyseliny BHV-1 ve vzorku, zejména v biologickém vzorku, jako jsou krev nebo krevní sérum, krevní buňky, mléko, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, sperma, obzvláště semenná kapalina, sliny, sputum nebo tkáň, zejména nervová tkáň, pocházející ze zvířete, zvláště savce, zejména hovězího dobytka, vyznačená tím, že obsahuje sondu nukleové kyseliny nebo primer s nukleotidovou sekvencí, odvozenou od gE-genu viru BHV-1, přičemž tento gE-gen je umístěn v genomu BHV-1 podle obrázku 6, a detekční prostředky, vhodné pro detekční zkoušky nukleové kyseliny.
20. 20. Diagnostická souprava podle nároku 19 pro detekci protilátek, které jsou specifické pro BHV-1, ve vzorku, zejména biologickém vzorku, jako jsou krev nebo krevní sérum, sliny, sputum, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, mléko nebo tkáň, pocházející ze zvířete, zvláště savce, zejména hovězího dobytka, vyznačená tím, že obsahuje gE viru BHV-1, část gE, peptid odvozený od gE nebo komplex glykoproteinu gE a gl viru BHV-1, a detekční prostředky, vhodné pro detekční zkoušku protilátky.

    -31 CZ 283283 B6
21. 21. Diagnostická souprava podle nároku 20, vyznačená tím, že dále obsahuje jednu nebo více protilátek, které jsou specifické pro gE viru BHV-1 nebo komplex glykoproteinů gE a gl viru BHV-1.
22. 22. Diagnostická souprava podle nároku 20 pro detekci protilátek, které jsou specifické pro BHV-1, ve vzorku, zejména biologickém vzorku, jako jsou krev nebo krevní sérum, sliny, sputum, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, mléko nebo tkáň, zejména nervová tkáň, pocházející ze zvířat, zvláště savců, zejména hovězího dobytka, vyznačená tím, že obsahuje protilátku, která je specifická pro gE viru BHV-1 nebo komplex glykoproteinů gE a gl viru BHV-1, a detekční prostředky, vhodné pro detekční zkoušku protilátky.
23. 23. Diagnostická souprava podle nároku 20 pro detekci proteinu viru BHV-1 ve vzorku, zejména v biologickém vzorku, jako jsou krev nebo krevní sérum, krevní buňky, mléko, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, sperma, zvláště semenná kapalina, sliny, sputum nebo tkáň, zejména nervová tkáň, pocházející ze zvířete, zvláště savce, zejména hovězího dobytka, vyznačená tím, že obsahuje protilátku, která je specifická pro gE viru BHV-1, nebo komplex glykoproteinů gE agl viru BHV-1, a detekční prostředky, vhodné pro detekční zkoušku proteinu.
24. 24. Způsob určení infekce BHV-1 zvířete, zvláště savce, zejména hovězího dobytka, vyznačený tím, že se vyšetřuje vzorek, pocházející ze zvířete, zejména biologický vzorek, jako je krev nebo krevní sérum, krevní buňky, sperma, zvláště semenná kapalina, sliny, sputum, tělní kapaliny, jako jsou slzy, kapalina získaná výplachem plic, nosní sekret, mléko nebo tkáň, zejména nervová tkáň, na přítomnost nukleových kyselin, obsahujících gE-gen viru BHV-1, tento gE-gen je umístěn v genomu BHV-1 podle obrázku 6, na přítomnost viru BHV-1 nebo komplexu glykoproteinů gE a gl viru BHV-1, nebo na přítomnost protilátek, které jsou specifické pro gE viru BHV-1, nebo komplex glykoproteinů gE a gl viru BHV-1.
25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačený tím, že se zkoumá vzorek, pocházející ze zvířete, které je očkováno očkovacím prostředkem podle nároku 17.