HU219602B

HU219602B - 1-es tipusú szarvasmarha herpeszvírus deléciós mutánsa, ebből készült vakcina és az 1-es tipusú szarvasmarha herpeszvírus kimutatására szolgáló diagnosztikai készlet

Info

Publication number: HU219602B
Application number: HU9303470A
Authority: HU
Inventors: Roger Kamiel Maes; Johannes Theodorus Oirschot; Franciscus Antonius Maria Rijsewijk
Original assignee: Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-05
Publication date: 2001-05-28
Also published as: ES2097340T3; UA40571C2; KR100293761B1; SK137593A3; US5676951A; JP2010104367A; EP0587805A1; US5789177A; JP2006296426A; ATE143412T1; NO934431L; HU9303470D0; AU2275092A; NO934431D0; WO1992021751A1; FI935459A; CZ283283B6; CA2110519C; ES2097340T5; DE69214146T3

Abstract

A találmány tárgya 1-es típusú szarvasmarhaherpesz-vírus deléciósmutánsa, amely deléciót szenvedett a gE glikoproteingénben. Amutánsban lehet még deléció a timidin-kináz génben és/vagy a gIglikoproteingénben, illetve tartalmazhat egy heterológ géninszerciót.A találmány tárgyát képezik továbbá a gE gént vagy annak egy részéttartalmazó rekombináns nukleinsavak, a gE glikoprotein maga, annakalapján készített peptidek, valamint a gE/gI glikoproteinek komplexe,valamint az azokra specifikus antitestek, és vakcinák, valamintdiagnosztikai készletek, amelyek az említett anyagok valamelyikéttartalmazzák. ŕ

Description

A találmány a vakcinálás és diagnosztika területére vonatkozik, olyan betegségekkel kapcsolatban, amelyeket patogének okoznak, és magában foglalja mind a klasszikus módszereket, mind a rekombináns DNS-technológián alapuló modem módszereket egy élő attenuált vakcina vagy egy inaktivált vakcina előállítása céljából.

Pontosabban, a találmány tárgyát élő attenuált vakcinák és inaktivált vakcinák képezik állatok, különösen szarvasmarhák 1-es típusú szarvasmarhaherpesz-vírussal (BHV-1) szemben való megvédése céljára, és ezeket a vakcinákat úgy tervezzük, hogy nemcsak biztonságosak és hatékonyak, hanem megadják a lehetőségét annak is, hogy különbséget tegyünk a nem fertőzött állatok és a fertőzött állatok között egy vakcináit populációban.

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan diagnosztikai kitek, amelyeket arra lehet használni, hogy egy vakcináit populációban a fertőzött állatokat meg tudjuk különböztetni a nem fertőzött állatoktól.

A BHV-1, beleértve a fertőző szarvasmarharhinotracheitis-vírust (IBRV), valamint a fertőző gennyhólyagos vulvovaginitisz-vírust (IPVV), fontos szerepet játszik a szarvasmarhák légúti megbetegedéseinek és szaporodási rendellenességeinek kifejlődésében. Egy akut fertőzés után a BHV-1 gyakran latens formában megmarad a gazdaszervezetben. A latens vírusok reaktiválhatók, többek között stressz hatására - amelyet klinikai tünetek kísérhetnek vagy nem kísérnek -, majd szekretálódnak. Ennek következtében a fertőzött szarvasmarhákat úgy kell tekinteni, mint amelyek egy életen át hordozzák a BHV-1-et. A BHV-1 a holland szarvasmarhafarmok 75%-ában járványosán fordul elő. Különösen az idősebb szarvasmarhák szerológiailag pozitívak.

Számos inaktivált („elpusztított”) vakcina és számos attenuált („élő”) vakcina hozzáférhető a BHV-1 fertőzések elleni beoltás céljára. Az inaktivált vakcinákat a BHV-1 vírus elpusztításával állítják elő, például hőkezeléssel, besugárzással, etanolos vagy formalinos kezeléssel. Ezek azonban gyakran nem adnak kielégítő védelmet. Az attenuált vakcinákat nagyszámú, homológ (szarvasmarha-) vagy heterológ (például sertés- vagy kutyasejteken) való átoltással állítják elő, és a vírusokat néha még fizikailag vagy kémiailag is kezelik. Ily módon ismeretlen mutációk/deléciók keletkeznek a vírus genomjában, ami gyakran csökkenti a vírus betegségkeltő hatását. Az attenuált élő vakcinák jobb védelmet adnak, mint az inaktivált vakcinák, többek között azért, mert több virális antigént mutatnak be a gazdaszervezet immunrendszerének. Az élő vakcinák másik nagy előnye, hogy intranazálisan is beadhatók, azaz azon a ponton, ahol a vad típusú vírus első szaporodása lejátszódik a fertőzés után. Az élő vakcinákon azonban mégis van még mit fejleszteni. Néhány élő vakcináról úgy tűnik, hogy megtartja abortogén hatását, ami különösen az intramuszkuláris beadás után manifesztálódik. Emellett valószínűleg az összes élő vakcina latensen jelen marad a vakcináit szarvasmarhában. Megvan továbbá az esélye, hogy ha a vakcina csak kicsit tér el a vad típusú vírustól, akkor előfordulhat a virulenciára való reverzió. De a legnagyobb problémák egyike az, hogy a BHV-1 vakcinák nem tudják kivédeni a vad típusú vírusokkal való fertőzést. Ennek az az eredménye, hogy a vakcináit szarvasmarha is terjeszti a vad típusú BHV-l-et.

Egy megfelelő BHV-1 kontrollprogramhoz arra van szükség, hogy hatékony és biztonságos vakcinával rendelkezzünk, amely megkülönböztethető a vad típusú vírustól, mivel egy hatékony vakcina alkalmazása jelentősen csökkentheti a BHV-1 keringését, és egy olyan teszt, amely képes különbséget tenni egy vakcina és egy vad típusú vírus között, lehetővé teszi, hogy kimutassuk (majd eltávolítsuk) a fertőzött szarvasmarhákat egy vakcináit populációból.

Közben kifejlesztettek olyan BHV-1 vakcinákat, amelyek biztonságosabbnak tűnnek, mint a szokásos vakcinák, és megkülönböztethetők a vad típusú vírustól. Egy timidin-kináz deléciós mutánst izoláltak, amely kevésbé abortogén, nem válik olyan gyakran latenssé, és nem reaktiválható. Emellett, rekombináns DNS-technika alkalmazásával, egy olyan BHV-1 vakcinát készítettek, amely a glll glikoproteingénben egy deléciót tartalmaz, ami ezt a vakcinát megkülönböztethetővé teszi a vad típusú BHV-1-tői, szerológiai technikák alkalmazásával. Azonban ezzel a vakcinával szemben is vannak még kifogások. Egyrészt a timidin-kináz részt vesz a vírus replikációjában, és a kisebb replikáció kisebb védelmet eredményezhet. Másrészt, a glll glikoprotein fontos a védőantitestek előállításában, ami a glll vakcinákat kevésbé hatékonnyá teszi. Egy gyakorlati probléma, hogy az orron át való beadás, amely általában a legjobb védelmet biztosítja, rekombináns vakcinák esetében néhány országban nem engedélyezett. Ennek megfelelően, igény van egy olyan vakcinára, amely biztonságos, valamint hatékony, mégis megkülönböztethető a vad típusú BHV-1-tői, emellett kívánatos, hogy az ilyen vakcinák közül legalább egy inkább olyan víruson alapuljon, amelyet a szokásos módon attenuáltak, mint egy olyanon, amelyet rekombináns DNS-technikával állítottak elő.

Sejttenyészetekben való passzálással egy olyan BHV-1 törzset kaptunk, amelyből hiányzik a gE glikoproteingénje. Kísérleteink első eredményei azt mutatják, hogy ez a gén nagyon jól használható arra, hogy szerológiailag megkülönböztessük a vad típusú BHV-l-et, és a gén részt vesz a virulencia expresszálásában. Ennélfogva ennek deléciója hozzájárul a biztonsághoz, és a timidin-kináz-deléciókat fölöslegessé teszi. A gE glikoprotein kevésbé tűnik fontosnak a védelem indukciójában, mint a glll glikoprotein. Egyedülálló az olyan szokásosan attenuált BHV-1 törzs, amely szerológiailag megkülönböztethető a vad típusú vírustól. A gE gén lokalizációja és DNS-szekvenciája, amelyet itt írunk le először, nem volt ismert korábban, és azok az oligonukleotidok, polipeptidek, oligopeptidek sem voltak ismertek, amelyek ebből származnak. A gE gén alapján végzett szerológiai megkülönböztetés is egyedülálló.

Ennek a „konvencionális” gE deléciós mutánsnak egy fontos előnye (a „konvencionális” szakkifejezés arra utal, hogy egy attenuált vírus izolálására egy szoká2

HU 219 602 Β sós módszert használtunk), hogy beadható intranazálisan is olyan országokban, amelyekben ez a rekombináns vakcinák esetében meg van tiltva. Megfelelő módon figyelembe véve a biztonság különböző szempontjait, - e mellett a szokásos módszenei előállított gE deléciós vakcina mellett - jól meghatározott rekombináns verziókat is készítettünk. Ezekben a rekombináns verziókban is megvan a gE deléció - és vagy van, vagy nincs deléció a timidin-kináz génben is - és ezek használhatók vektorként is, különböző heterológ gének expresszálására. Az összes ilyen rekombináns vakcinát meg lehet különböztetni a vad típusú vírustól, ugyanazon gE-specifikus teszt alapján. A különböző vakcinákra vonatkozó standard teszt használatának nagy előnye lehet a BHV-1 leküzdésében, egy nemzetközi erőfeszítés keretében. Ilyen megközelítést nem írtak le korábban a BHV-1 vakcinák területén.

A szarvasmarha által adott anti-BHV-1 válasz szerológiai elemzése azt mutatta, hogy az anti-gE antitestek egy fontos frakciója egy, a gE glikoprotein és egy másik BHV-1 glikoprotein, a gl által képzett komplex ellen irányul. Az olyan szerológiai tesztek tehát, amelyek képesek az ilyen komplexspecifikus antitestek jelenlétét (is) kimutatni, érzékenyebbek, mint azok a tesztek, amelyek csak az anti-gE antitesteket mutatták ki. Az egyetlen gE deléciós mutációt tartalmazó vakcinával szarvasmarha termelhet olyan anti-gl antitesteket, amelyek kölcsönhatásba léphetnek az anti-gl/gE antitestekkel. Ennek következtében a találmány a gl/gE dupla deléciókat tartalmazó vakcinára is vonatkozik.

A találmány tárgyát elsősorban egy olyan mutáns BHV-1 vírus képezi, mely a gE glikoproteingénben deléciót tartalmaz. A „deléció” szó jelentése egy egész gén deléciójára is vonatkozhat.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja egy olyan BHV-1 deléciós mutációra vonatkozik, amely a gE glikoproteingénben tartalmaz mutációt, amelyet egy attenuációs eljárással hozunk létre. Ilyen például a Difivac-1 deléciós mutáns, amelyet a továbbiakban ismertetünk.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja egy olyan BHV-1 deléciós mutáns, amely a gE glikoproteingénben tartalmaz deléciót, amelyet rekombináns DNS-technikával állítottuk elő, ilyen például az 1B7 vagy 1B8 deléciós mutáns, amelyeket az alábbiakban ismertetünk.

A találmány egy további előnyös megvalósítási módja a BHV-1 egy kettős deléciós mutánsa, amely a gE glikoproteingénben és a gl glikoproteingénben tartalmaz deléciót, ilyen például a Difivac-IE gl/gE kettős deléciós mutáns, amelyet az alábbiakban ismertetünk.

Továbbá, a maximális biztonság szem előtt tartásával, az a BHV-1 deléciós mutáns az előnyös, amely a gE glikoproteingénben tartalmaz deléciót, és emellett a timidin-kináz génben is tartalmaz deléciót. A találmány vonatkozik továbbá egy olyan BHV-1 deléciós mutánsra, amely a gE glikoproteingénben, a gl glikoproteingénben és a timidin-kináz génben tartalmaz mutációt.

A találmány tárgya továbbá állatok, különösen emlősök, legfőképpen szarvasmarha vakcinálására alkalmas olyan vakcinakészítmény, amely alkalmas arra, hogy megvédje őket a BHV-1 ellen, és amely a BHV- 1-nek egy, az előzőkben ismertetett deléciós mutánsát tartalmazza, valamint egy megfelelő hordozót vagy adjuvánst. Az említett készítmény lehet élő vagy inaktivált vakcinakészítmény.

A találmány tárgya továbbá egy mutáns BHV-1 vírus, amely a gE génben deléciót hordoz, és egy heterológ gént tartalmaz, amelyet rekombináns DNS-technikával juttattunk bele. Ez előnyösen egy olyan mutáns BHV-1, amely egy heterológ gént tartalmaz, rekombináns DNS-technikával bejuttatva a gE glikoproteingén helyére, amely heterológ gén a gE gén szabályozószekvenciáinak szabályozása alatt áll, és adott esetben a gE génnek szignálpeptidet kódoló részéhez van kötve. Az említett heterológ gén lehet a BHV-1-nek egy eltérő promotere szabályozása alatt is, illetve egy heterológ promoter szabályozása alatt is. Ha a mutáns BHV-1 a gE glikoproteingénben levő mutációk mellett egyéb deléciókat is tartalmaz, így például a timidinkináz génben és/vagy a gl glikoproteingénben, akkor az említett heterológ gént ezeknek a további delécióknak a helyére is beépíthetjük. Újabb lehetőséget jelent a többszörös beépítés, akár az egyik deléció helyén együtt, akár a különböző deléciók helyén elosztva.

A bejuttatott heterológ gén előnyösen egy másik patogén immunogén fehérjéjét vagy peptidjét, illetve egy citokint kódol, amely fokozza az immunválaszt. Megfelelő citokin lehet például az interleukin-2, az interferon-α és az interferon-γ.

A találmány tárgya továbbá egy olyan (élő vagy inaktivált) vakcinakészítmény állatok, különösen emlősök, legfőképpen szarvasmarhák vakcinálására, amely alkalmas arra, hogy megvédjük őket egy (másik) patogén fertőzéstől, és amelyben egy olyan mutáns BHV -1 található, amelyben az említett másik patogén egy immunogén fehérjéjét kódoló heterológ gén található, valamint tartalmaz még egy megfelelő hordozót vagy adjuvánst. A védelem vonatkozhat egynél több patogénre, azaz multivalens vakcinára, amelyben a mutáns számos különböző heterológ gént tartalmaz.

A találmány tárgya továbbá egy készítmény, amely olyan rekombináns nukleinsavat tartalmaz, amely a BHV-1 gE glikoproteingénjét tartalmazza, vagy ennek a gE glikoproteingénnek egy részét, vagy az ebből a gE glikoproteingénből származó nukleinsavszekvenciát. Ez a készítmény tartalmazhat egy klónozó- vagy expressziós vektort, amelyben egy rekombináns nukleinsavinszerció található, amely tartalmazza a BHV-1 gE glikoproteingénjét, vagy ennek a gE glikoproteingénnek egy részét vagy az ebből a glikoproteingénből származó nukleinsavszekvenciát.

A találmány tárgya továbbá egy készítmény, amely a BHV-1 gE glikoproteint, ennek a gE glikoproteinnek egy részét, egy ebből a gE glikoproteinből származó peptidet vagy a gE és gl glikoproteinek komplexét tartalmazza, valamint egy olyan készítmény, amely a BHV-1 gE glikoproteinjére specifikus antitestet, a gE glikoprotein egy részét, az ebből a gE glikoproteinből származó peptidet vagy a gE és gl glikoproteinek komp3

HU 219 602 Β lexét tartalmazza. Az „antitest” szakkifejezés alatt mind poliklonálisantitest-készítményt, mind monoklonálisantitest-készítményt értünk, a legtöbb alkalmazásban a monoklonálisantitest-készítmény az előnyös. A „gE glikoprotein egy része” szakkifejezés és a „gE glikoproteinből származó peptid” szakkifejezés alatt gE-specifikus aminosavszekvenciákat értünk, amelyek legalább 8 aminosav hosszúságúak.

A találmány tárgya továbbá egy diagnosztikus kit BHV-1 nukleinsav kimutatására egy mintából, különösen biológiai mintából, például vérből vagy vérszérumból, vérsejtekből, tejből, testfolyadékokból, azaz könnyből, tüdőmosófolyadékból, orrfolyadékból, spermából, különösen ondófolyadékból, nyálból, köpetből vagy szövetből, különösen idegszövetből, amely egy állatból, különösen emlősből származik, főleg szarvasmarhából, amely kit egy nukleinsavpróbát vagy indítómolekulát, amelynek nukleotidszekvenciája a HBV-1 gE glikoproteingénjéből származik, valamint egy, a nukleinsavkimutatási vizsgálatban használható kimutatási eszközt tartalmaz.

A találmány tárgya továbbá egy diagnosztikai kit BHV-l-re specifikus antitestek kimutatására mintából, különösen vérből vagy vérszérumból, tejből, testfolyadékokból, azaz könnyből, tüdőmosófolyadékból, orrfolyadékból, nyálból, köpetből vagy szövetből, amely egy állatból, különösen emlősből származik, főleg szarvasmarhából, amely kit a BHV -1 gE glikoproteint, ennek a gE glikoproteinnek egy részét, egy ebből a gE glikoproteinből származó pepiidet vagy a gE és gl glikoproteinek komplexét tartalmazza, valamint egy eszközt amely az antitestkimutatási vizsgálatban használható. Egy ilyen diagnosztikai kit tartalmazhat még egy vagy több olyan antitestet, amely specifikus a BHV-1 gE glikoproteinjére, illetve a BHV-1 gE és gl glikoproteinjeinek komplexére.

A találmány tárgya továbbá diagnosztikai kit BHV-1 kimutatására egy mintából, például vérből vagy vérszérumból, vérsejtekből, tejből, testfolyadékokból, azaz könnyből, tüdőmosófolyadékból, orrfolyadékból, spermából, különösen ondófolyadékból, nyálból, köpetből vagy szövetből, különösen idegszövetből, amely egy állatból, különösen emlősből származik, főleg szarvasmarhából, amely kit egy vagy több olyan antitestet tartalmaz, amely specifikus a BHV-1 gE glikoproteinjére, illetve a BHV-1 gE és gl glikoproteinjeinek komplexére, valamint egy olyan kimutatási eszközt, amely egy fehérjedetektálási vizsgálatban használható.

A találmány szerinti megoldás alkalmas BHV-1 fertőzés kimutatására egy állatban, főleg emlősben, legfőképpen szarvasmarhában, amelynek során egy az állatból származó mintában, például vérben vagy vérszérumban, vérsejtekben, tejben, testfolyadékokban, azaz könnyben, tüdőmosófolyadékban, orrfolyadékban, spermában, különösen ondófolyadékban, nyálban, köpetben vagy szövetben, különösen idegszövetben, vizsgáljuk a BHV-1 gE glikoproteingént tartalmazó nukleinsav jelenlétét, vagy a BHV-1 gE glikoprotein jelenlétét, vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinjei komplexének jelenlétét, vagy olyan antitestek jelenlétét, amelyek a BHV-1 gE glikoproteinre vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinjei komplexére specifikusak. A vizsgálandó minta származhat egy olyan állatból, amelyet korábban nem vakcináltak a találmány szerinti vakcinakészítménnyel, illetve egy olyan állatból, amelyet korábban a találmány szerinti vakcinakészítménnyel vakcináltak.

A találmány tárgya közelebbről egy sorozat BHV-1 vakcina, amelyek lehetnek élők vagy inaktiváltak, és amelyekben az a közös, hogy részben vagy egészben hiányzik belőlük a gE glikoproteingén. Ez a sorozat tartalmaz természetes gE deléciós mutánst, valamint konstruált gE deléciós mutánsokat, amelyekben a timidin-kináz gén és/vagy a gl glikoproteingén vagy tartalmaz deléciót vagy nem, valamint olyan konstruált gE deléciós mutánsokat, amelyeket heterológ gének expresszálására használhatunk. A találmány tárgyát képezik továbbá a BHV-1 gE glikoproteingént kódoló nukleinsavszekvenciák, az ezekből a szekvenciákból származó oligonukleotidok, a gE glikoprotein maga, az ezekből származtatható peptidek, és (monoklonális, valamint poliklonális) antitestek, amelyek a gE glikoprotein ellen, valamint a belőle származtatható peptidek ellen irányulnak. A találmány tárgya továbbá a BHV-1 gE és gl glikoproteinjeinek komplexei, valamint az ilyen komplexek elleni antitestek.

Ezeket a találmány szerinti anyagokat az alábbi célokra lehet használni:

1. szarvasmarhák BHV-1 fertőzés által okozott betegségei elleni vakcinálására, oly módon, hogy meg lehessen különböztetni a BHV-1-gyei fertőzött állatokat és a vakcináit állatokat; a szokásos és a konstruált vakcina egymás mellett használható;

2. szarvasmarhák vakcinálására mind BHV-1 betegségek, mind más patogének által okozott betegségekkel szemben, amely utóbbiak a protektív antigéneket kódoló szekvenciáit be lehet építeni a BHV-1 deléciós mutánsokba;

3. szarvasmarhából származó vér, szérum, tej vagy egyéb testfolyadék vizsgálatára, hogy szerológiai módszerekkel vagy nukleinsavkimutatási technikákkal (például PCR-rel) meg lehessen határozni, hogy az állat vad típusú BHV-l-gyel fertőzött, vagy egy gE deléciós mutánssal volt vakcináivá.

Az alábbiakban ismertetjük a BHV-1 gE glikoproteingén és gl glikoproteingén kódolószekvenciájából származó oligopeptidek, polipeptidek és glikoproteinek szintézisét.

A gE glikoproteingén DNS-szekvencia-elemzéseredményei (3A. ábra, az elemzést a példákban írjuk le), valamint az ezt a gént kódoló izolált DNS-fragmensek lehetővé teszik, hogy standard molekuláris biológiai módszerekkel szintetizáljuk a gE fehérje peptidjeit (oligo- vagy polipeptidek), és a gE fehérjét teljes egészében vagy nagyrészt expresszáljuk prokariótaszervezetben (baktériumokban) vagy eukariótaszervezetben (például rágcsálósejtekben). Ezeknek a módszereknek az alkalmazásával előállítható gE-specifikus antigén, amely például gE-specifikus monoklonális antites4

HU 219 602 Β tek (Mab-ok) előállításához szükséges. Emellett a gEspecifikus antigén (és a gE-specifikus Mab-ok) használhatók szerológiai tesztekben, hogy lehetővé váljon a különbségtétel egy BHV-1 gE deléciós vakcinával vakcináit, valamint a vad típusú BHV- 1-gyel fertőzött állatok között.

A gl glikoproteingén részleges DNS-szekvenciaelemzésének eredményei - ezeket a példákban közöljük valamint az ezt a gént kódoló izolált DNS-íragmensek, a gE glikoproteint expresszáló eukariótasejtekkel együtt lehetővé teszik a gl/gE komplex expreszszióját eukariótasejtekben (lásd 13. és 14. példa). Ez a glikoprotein-komplex használható a gl/gE specifikus monoklonális antitestek előállítására. A gl/gE komplex használható emellett antigénként is szerológiai vizsgálatokban, amelyekben meg lehet különböztetni a gE deléciós BHV-1 mutánssal vakcináit, a dupla gl/gE deléciós BHV-1 mutánssal vakcináit, valamint a vad típusú BHV-1 vírussal fertőzött állatokat.

gE-specifikus peptidek

Az ismert fehérjekódoló szekvenciák alapján, automatizált szintetizátorok segítségével 40-50 aminosav hosszúságú polipeptidek állíthatók elő. Mivel felderítettük a BHV-1 Lám törzs gE glikoprotein-kódoló szekvenciáját (3A. ábra), ennek a BHV-1 gE glikoproteinnek a polipeptidjei szintetizálhatók. Az ilyen polipeptidekkel a standard módszerek alkalmazásával a kísérleti állatok, például az egerek vagy nyulak immunizálhatok gE-specifikus antitestek előállítása érdekében. Ezután, ezeknek a gE-specifikus peptideknek az alkalmazásával tovább specifikálhatok azok a helyek, ahol az anti-gE antitestek reagálnak a gE fehérjékkel (az epitópokkal), például a PEPSCAN-módszer alkalmazásával [Geysen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 3998-4002 (1984)]. A gE-specifikus oligopeptidek használhatók szerológiai tesztekben is, amelyek az anti-gE antitesteket demonstrálják. gE prokariótaexpressziója

A gE fehérje baktériumban való előállításához (azaz a gE prokariótaexpresszálásához) a gE glikoproteint kódoló DNS-fragmenseket vagy azok részeit kell klónoznunk prokariótaexpressziós vektorba. A prokariótaexpressziós vektorok cirkuláris DNS-molekulák, amelyek baktériumokban képesek fenntartani magukat mint önállóan replikálódó molekulák (plazmidok). Ezek az expressziós vektorok egy vagy több markergént tartalmaznak, amelyek egy antibiotikumrezisztenciát kódolnak, és így lehetővé teszik az expressziós vektort tartalmazó baktériumok szelekcióját. Az expressziós vektor emellett tartalmaz egy (gyakran szabályozható) promoterrégiót, ami mögé a DNS-fragmenseket be lehet ligálni, és expresszálni lehet a promoter hatására. Számos jelenleg használt prokariótaexpreszsziós vektorban a keresett fehérje úgy expresszálódik, hogy egy úgynevezett hordozófehérjéhez kötődik. Ebből a célból a vektorban a promoter mögött egy a hordozó fehérjét kódoló régió található, közvetlenül annak szomszédságában, amelyhez a keresett DNS-fragmenst lehet iktatni. A fúziós fehérjék gyakran stabilabbak, és ezeket könnyebb felismerni és/vagy izolálni. Az az állandó szint, amit egy adott fúziós fehérje elérhet bizonyos baktériumtörzsekben, fúzióról fúzióra, valamint törzsről törzsre változhat. Ezért célszerű különböző kombinációk kipróbálása.

A glikoprotein gE génjének eukariótaexpressziója

Jóllehet a fehérjék prokariótaexpressziója szolgál némi előnnyel, a fehérjékről hiányzanak a módosítások, például a glikozilezés és hasonlók, amelyek az eukariótasejtekben előfordulnak. Ennek eredményeképpen az eukariótasejtekben expresszálódott fehérjék gyakran alkalmasabb antigének. A fehérjék heterológ expressziója céljából eukariótasejtekben, például rágcsálósejtekben, eukariótaexpressziós vektorokat használunk. Ezek a vektorok olyan plazmidok, amelyek nemcsak Escherichia coli sejtekben képesek szaporodni, hanem stabilan fennmaradnak eukariótasejtekben is. A prokariótaszelekciós marker mellett eukariótaszelekciós markert is tartalmaznak. A prokariótaexpressziós vektorokkal analóg módon az eukariótaexpressziós vektorok tartalmaznak egy promoterrégiót, amely mögé a kívánt gént be lehet építeni. Az eukariótavektorokban levő promoterszekvenciák azonban az eukariótasejtekre specifikusak. Emellett az eukariótavektorokban a hordozófehéijével való fúziót csak ritkán alkalmazzák. Ezeket a vektorokat a standard transzfekciós módszerrel juttatják be az eukariótasejtekbe [F. L. Graham and A. J. van dér Eb, Virology, 52, 456-467 (1973)]. Az eukarióta-plazmidvektorok mellett léteznek vírusvektorok is, amelyekben a heterológ gént egy vírus genomjába (például retrovírus, herpeszvírus és vakcíniavírus) építik be. Az eukariótasejtek azután a rekombináns vírusokkal fertőzhetők.

Általában nem jósolható meg, hogy melyik vektor és sejttípus a legalkalmasabb egy adott géntermékhez. A legtöbbször számos kombinációt kell kipróbálni.

A gE glikoprotein és a gl glikoprotein eukariótaexpressziója

Az egy fehérje által felvett végső szerkezet függ az adott fehéije primer aminosavszekvenciájától, a másodlagos szerkezetétől, a poszttranszlációs módosításoktól, stb. A fehéije kölcsönhatása egy vagy több más fehérjével lényegesen hozzájárul a fehéije szerkezetéhez. Úgy találtuk, hogy a BHV-1 gE glikoprotein komplexet képez legalább egy másik glikoproteinnel, a BHV-1 gl glikoproteinnel. Egy ilyen komplex létezésére az első jelzés az anti-gE Mab-jdőltekkel (1, 51, 67, 75 és 78, lásd a 2. táblázatot) kapott eredményeinkből következtethettünk. Ezek a Mab-ok nem reagáltak a Difivac-1gyel, sem a Lám gE -vel, sőt, nem voltak képesek felismerni a gE-t expresszáló 3T3 sejteket. Ezek a Mab-ok azonban reagáltak a gE-t expresszáló 3T3 sejtekkel a Difivac-1-gyel való fertőzés után, mutatva ezzel, hogy komplementálófaktorokra van szükség ahhoz, hogy a gE glikoprotein felvegye azt a megfelelő antigénkonformációt, ami megfelel ezeknek a Mab-oknak. A Mab 81-gyel végzett néhány radioimmunprecipitációs kísérletünkben koprecipitációt figyeltünk meg egy 63 kD látszólagos molekulatömegű fehérjével. Abból a tényből, hogy a herpesz szimplex vírus gE glikoproteinje komplexet képez egy fehérjével, amelynek hasonló a molekulatömege (HSV1 gl glikoprotein), arra a következtetés5

HU 219 602 Β re jutottunk, hogy a gE BHV-1 glikoprotein komplexet képez a gl glikoprotein BHV-1 homológjával. Ennek a BHV-1 gE/gl komplexnek a tanulmányozására, valamint a gE antigén megfelelő antigénstruktúrával való előállítására mindkét glikoproteint egyetlen eukariótasejtben expresszáltuk. Ebből a célból ugyanazt az eljárást alkalmaztuk, mint amit a gE glikoprotein eukariótaexpressziós rendszerben egyedül történő expreszszálására leírtunk. Az egyetlen további előfeltétel az eltérő eukariótaszelekciós markereket hordozó expreszsziós vektorok alkalmazása.

Szerológiai tesztek

A Difivac-1-gyel vakcináit szarvasmarhák és a vad típusú BHV- 1-gyel fertőzött szarvasmarhák megkülönböztetésére használt, a gE elleni antitesteken alapuló szerológiai módszerek előnyösen a gE elleni monoklonális antitesteken alapulnak. Ezeket az alábbi módokon lehet használni:

a) Van Oirschot és munkatársai által leírt módszer [Journal of Virological Methods, 22, 191-206 (1988)]. Ebben az ELISA-ban, amelyet arra a célra dolgoztak ki, hogy megkülönböztessék a gl antitestet az Aujeszki-betegség vírusától, az antitesteket azon az alapon mutatják ki, hogy blokkolják két Mab reakcióját, amelyek két különböző epitóppal reagálnak a gl-n. A vizsgálatot az alábbiak szerint hajtjuk végre. Mikrotiterlemezeket borítunk a Mab 1-gyel egy éjszakán át 37 °C-on, majd 4 °C-on, illetve -20 °C-on tároljuk. A vizsgálandó szérumot előinkubáljuk az antigénnel egy külön, borítatlan mikrotiterlemezen, például 2 óra hosszat 37 °C-on. A Mab 1-gyel borított lemezeket mossuk, például ötször, majd tormaperoxidázzal (HRPO) kapcsolt Mab 2-t adunk ezekhez a lemezekhez. Ezután az előinkubált szérum-antigén keveréket azokra a lemezekre visszük át, amelyekben a két Mab megtalálható, majd inkubáljuk, például 1 óra hosszat 37 °C-on. A lemezeket azután mossuk, és szubsztrátot adunk minden egyes mélyedésbe. Mondjuk két órát inkubáljuk szobahőmérsékleten, majd a lemezeket spektrofotometriásán leolvassuk. Négy negatív kontrollszérumot és a pozitív szérumból négy sorozathígítást tartalmaz minden egyes lemez. Azt a szérumot tekintjük pozitívnak, amelynek az optikai sűrűsége (OD) kisebb, mint az ugyanazon a lemezen vizsgált négy negatív kontrollszérum átlagos ODértékének 50%-a.

b) Az indirekt kettős antitest szendvics (IDAS)-elv alapján. Ennél a mikrotiterlemezeket a gE fehérje elleni Mab-bal vagy egy poliklonális szérummal borítjuk. A gE-antigén készítménnyel való inkubálás azt eredményezi, hogy a gE hozzákötődik a borításhoz. A vizsgálandó szarvasmarhaszérumban levő gE elleni specifikus antitestek ezt követően hozzákötődnek a gE-hez. Ezeket a megkötött antitesteket egy antiszarvasmarhaimmunglobulin-konjugátummal lehet felismerni. Az ebben a konjugátumban levő antitesteket kovalensen kötjük a peroxidázenzimhez. Végezetül, a megkötött konjugátumot kromogén szubsztrát hozzáadásával tesszük láthatóvá. A reakció specifikusságát úgy ellenőrizzük, hogy ugyanezt az eljárást gE-antigén készítmény helyett alkalmazott gE-negatív kontrollkészítménnyel is elvégezzük. Minden egyes mikrotiterlemezen pozitív és negatív kontrollszérum is van. A teszt akkor értékelhető, ha a pozitív szérum bizonyos hígításokban pozitívnak értékelhető. Egy szérum pozitív, ha OD-je a standard negatív szérumának 0,2-szerese.

c) A fenti pontban ismertetett IDAS-elv szerint, azzal a különbséggel, hogy a vizsgálandó szérum inkubálása után egy anti-gE Mab/HRPO-t használunk az antiszarvasmarhaimmunglobulin-konjugátum helyett. Egy anti-gE szérum vagy egy anti-gE poliklonális szérum használható az anti-gE Mab helyett. A lemezeket mossuk, majd minden egyes mélyedéshez kromogén szubsztrátot adunk. Két óra hosszat tartjuk szobahőmérsékleten, majd a lemezeket spektrofotometriásán leolvassuk. Négy negatív kontrollszérumot és a pozitív szérumból négy sorozathígítást tartalmaz minden egyes lemez. Azt a szérumot tekintjük pozitívnak, amelynek az optikai sűrűsége (OD) kisebb, mint az ugyanazon a lemezen vizsgált négy negatív kontrollszérum átlagos OD-értékének 50%-a.

d) Egy blokkoló ELISA-elve alapján, ahol a mikrotiterlemezt egy éjszakán át beborítjuk tisztított, illetve nem tisztított vírusantigénnel. Ezekben a lemezekben a vizsgálandó szérumot például egy óra hosszat vagy hosszabban inkubáljuk 37 °C-on. Mosás után egy antigE Mab-ot adunk a lemezekhez, majd például egy óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on. Anti-gE peptidszérumot vagy anti-gE poliklonális szérumot használhatunk az anti-gE Mab helyett. A lemezeket mossuk, majd mindegyik mélyedéshez kromogén szubsztrátot adunk. Mondjuk 2 óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk, majd a lemezeket spektrofotometriásán leolvassuk. Négy negatív kontrollszérumot és a pozitív szérumból négy sorozathígítást tartalmaz minden egyes lemez. Azt a szérumot tekintjük pozitívnak, amelynek az optikai sűrűsége (OD) kisebb, mint az ugyanazon a lemezen vizsgált négy negatív kontrollszérum átlagos ODértékének 50%-a.

Mindegyik fenti elrendezésben szokásosan szaporított vírusantigén használható, amely tartalmazza a gE-t, de használható prokariótákban vagy eukariótákban expresszált gE antigén is. Egy másik módszer szerint a BHV-1 gE szekvenciáján alapuló oligopeptidek is használhatók a fenti diagnosztikai tesztekben a szokásos antigén helyett. Emellett az ilyen oligopeptidek használhatók az úgynevezett „cow-side” teszt kidolgozására, amelyet Kemp és munkatársai közöltek [Science, 241, 1352-1354 (1988)]. Egy ilyen vizsgálat alapulhat az oligopeptid antigénszekvenciájának a gE elleni antitestekhez való kötődésén, amely a fertőzött állatokban található. Egy ilyen vizsgálathoz az oligopeptidet egy szarvasmarha-eritrocita elleni Mab-hoz kell kapcsolni. Nukleinsavak elemzése PCR-módszerrel

Oligonukleotidok (próbák és indítómolekulák) használhatók például a polimeráz-láncreakcióban, hogy a vakcináit és fertőzött állatok között különbséget tegyünk. A polimeráz-láncreakció (PCR) egy olyan technika, amelyben egy patogénnek a nukleinsavai rövid idő alatt milliárdszorosra sokszorozhatok [De polymerase kettingreactie, P. F. Hilderink, J. A. Wagenaar,

HU 219 602 Β

J. W. B. van dér Giessen and B. A. M. van dér Zeijst, Tijdschrift voor Diergeneskunde deel /75, 1111-1117 (1990)]. A gE oligonukleotidok úgy választhatók meg, hogy egy gE-pozitív genomban más termék keletkezzen mint egy gE-negatív genomban. Ennek az az előnye, hogy egy olyan állat is, amelyet egy gE deléciós vakcinával vakcináltak, pozitív jelet ad a PCR-tesztben. Ez a megközelítés azonban a vírus nukleinsavainak a mintában, például a vizsgálandó állatból származó vérben való jelenlététől függ.

Egy akut BHV-1 fertőzés után nagy esélye van annak, hogy BHV-1-specifikus nukleinsavak mutathatók ki a vérből, de azt még nem határozták meg, hogy vajon a BHV-1 nukleinsavak a latenciaperiódusban is kimutathatók-e a vérből.

BHV-1 alkalmazása vektorként

Heterológ gének BHV-1 genomban történő expresszálásához az kell, hogy rendelkezésünkre álljon a pontos információ arról, hogy a heterológ gént hova lehet beépíteni. A lényeges szekvenciákat nem szabad megzavarni, és a szabályozószekvenciáknak elérhetőeknek kell lenniük, hogy a heterológ gén expresszálódjon. Elvileg a gE glikoproteingén egy megfelelő hely a heterológ gén expresszálására. A gE gén nem lényeges, ennélfogva nem baj, ha a gE gént heterológ génnel helyettesítjük. Ennek következtében a heterológ gént úgy helyezhetjük el, hogy a gE gén szabályozószekvenciáinak szabályozóhatása alá essen. Azonban nem szükségszerű a gE gén szabályozószekvenciáinak az alkalmazása. A heterológ gének expresszióját szabályozhatjuk másképpen is, például erősebb, más génből származó szabályozószekvenciákkal. Az is lehetséges, hogy a heterológ gént a gE gén (export) szignálpeptidjéhez ligáljuk, és ezzel a heterológ géntermék szekrécióját befolyásolhatjuk. Nyilvánvaló tehát, hogy a gE gén és a gE fehérje részletes ismerete lehetőséget nyújt arra, hogy a BHV-l-et vektorként alkalmazhassuk, szabályozott módon. A kifejlesztett vektorokat emellett szerológiailag megkülönböztethetjük a vad típustól. A heterológ géneket expresszáló BHV-1 mutánsokat ugyanúgy készíthetjük, mint a példákban bemutatott gE deléciós mutánsokat. A deléciós ffagmenst azonban azután helyettesíteni kell egy olyan fragmenssel, amelyen egy heterológ gén található a deléció helyén.

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.

1. példa

Természetes gE deléciós mutáns izolálása és azonosítása

a) Természetes mutáns izolálása

Genomiális DNS-t izoláltunk számos, szokásosan attenuált vakcinából, standard módszerek alkalmazásával, majd restrikciós enzimekkel elemeztük. Pontosabban, olyan genomiális devianciákat kerestünk, amelyek alkalmasak lehetnek arra, hogy velük különbséget lehessen tenni a vad típusú BHV-1 vírustól.

Különösen a BHV-1 genom U_s régiójára fordítottuk a figyelmet, mivel ebben a régióban - a herpesz szimplex vírussal analóg módon - valószínűleg számos olyan gén található, amely nem esszenciális glikoproteineket kódol [Identification of a herpes simplex vírus 1 glycoprotein gene within a gene cluster dispensable fór growth in cell culture, R. Longnecker, S. Chatterjee, R. J. Whitley and B. Roizman, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 4303-4307 (1987)].

Egy, a Zágrábi Egyetemről származó BHV-1 vakcinasarzsról [Lugovic et al., Veterinarski arhiv, 55, 241-245 (1985)] számos, szarvasmarha-embrionálisvesesejten és szarvasmarhaembrionálistrachea (Ebtr)-sejten végzett passzálás után kiderült, hogy egy deviáns U_s régió található benne a normál U_s régió mellett. Erről a vakcináról még az is kiderült, hogy mind nagy, mind kis tarfoltot képes Ebtr-sejteken létrehozni. Ebből a kevert populációból egy deviáns U_s régióval rendelkező vírust izoláltunk három határhígítási lépésben, minden alkalommal a kis tarfoltokat választva ki. Az ezen az úton izolált vírust tovább vizsgáltuk, és Difivac-1 nek neveztük el. Letétbe helyeztük az Institute Pasteurnél 1992. május 27-én, letéti száma I-1213.

b) A gE gén deléciójának azonosítása a Difivac1-ben

Ennek az U_s régiónak a további elemzése céljából a Difivac-1 genomiális DNS-ét standard módszerekkel izoláltuk, majd Southem-blot-elemzésnek vetettük alá (1A. ábra). Ennek a blotnak ³²P-vel jelzett vad típusú HindlIIK fragmenssel való hibridizálása kiderítette, hogy ez a ffagmens, amely az U_s régió közepén helyezkedik el, és körülbelül 1 kb-sal rövidebb a Difivac-1ben. Ez az elemzés emellett lehetővé tette, hogy a hiányzó rész helyét is megbecsüljük (1B. ábra). Ennek a deléciónak a további elemzése céljából a vad típusú BHV-1 Lám törzs U_s régióját izoláltuk, majd prokariótavektorokba klónoztuk. Ebből a célból, a standard módszerek szerint genomiális DNS-t izoláltunk a Lám törzsből, (2A. ábra), majd a pUC18, pACYC és pBR322 vektorokba klónoztuk (2B. ábra). A deléció feltételezett pozíciója körüli terület fizikai térképét elkészítettük (2C. ábra). Ebből a fizikai térképből kiindulva az ezen terület nukleotidszekvenciája meghatározására alkalmas szubklónokat elkészítettük a pKUN19 és a pUC18 vektorokban (2D. ábra). Ezeknek a szubklónoknak az alkalmazásával a teljes terület két szálának nukleotidszekvenciáját meghatároztuk (lásd 2C. ábra), Sanger módszerének alkalmazásával. Ezt a nukleotidszekvenciát (1. szekvencia) a PC/Gene programmal elemeztük. A számítógépes transzlációból kiderült, hogy a 168-1893-as nukleotidok egy 575 aminosavból álló nyitott leolvasási keretet kódolnak (3A. ábra). A további elemzés azt mutatta, hogy ez az aminosavszekvencia egy transzmembrán-glikoprotein jellemzőivel rendelkezik (3B. ábra). Tény, hogy az első 26 aminosav (aa) egy tipikus eukarióta-exportszignál jellemzőit viseli, és a 423-450-es aminosavak transzmembránrégióként ismerhetők fel. Emellett három potenciális N-kapcsolt glikozilezési hely is előfordul ebben a szekvenciában. Ez a megjósolt aminosavszekvencia egyértelmű hasonlóságokat mutat a herpesz szimplex vírus (HSV) gE glikoproteingénjével; lásd a 4A. és 4B. ábrát. Ezek, és

HU 219 602 Β egyéb hasonlóságok igazolják azt a konklúziót, hogy a megtalált gén a BHV-1 gE homológja. Emiatt a gént gE-nek neveztük. Annak meghatározására, hogy ez a BHV-1 gE gén milyen terjedelemben hiányzik a Difivac- 1-ből, a p318 ffagmenst izoláltuk. A p318 ffagmens a feltételezett BHV-1 gE nyitott leolvasási keret előtt 55 nukleotiddal található Alul hellyel kezdődik, és 133 nukleotiddal utána végződik. A genomiális Difivac-1 DNS-t ezzel a p318 fragmenssel elemeztük, Southem-blot-hibridizálás segítségével. Ennek alapján kiderült, hogy a Difivac-1 nem tartalmaz p318-cal detektálható szekvenciákat (5. ábra). Ez a kísérlet megerősíti, hogy a Difivac-1 deléciót tartalmaz, és világosan igazolja, hogy ez a deléció a teljes gE génre kiterjed.

A deletált régió méretének és pozíciójának meghatározására a Difivac-1 U_s régióját lefedő genomiális szekvenciákat prokariótavektorokba klónoztuk (lásd 11C. ábra). A 14,5 kb méretű EcoRI fragmenst a pACYC vektorba klónoztuk, ennek jele p775. A 7,4 kb méretű HindlII ffagmenst ettől függetlenül a pUC18 vektorba klónoztuk, ennek jele p728. A p728 kiónból két szubklónt izoláltunk: az 1,4 kb méretű PstI ffagmenst a p737-ben és a 350 bp méretű Alul-Pstl ffagmenst a p754 kiónban. Ezeknek a kiónoknak a restrikciós enzimekkel végzett elemzése és Southem-blotelemzése (nem közölt adatok) azt igazolja, hogy a Difivac-l-ben levő gE deléció 2,7 kb hosszú, közvetlenül a gE gén 5’-részénél kezdődik, és az U_s régió határán végződik. Ezt a 2,7 kb-t egy 1 kb méretű szegmens duplikálódása helyettesíti, amely a gE génnel szemben levő U_s régióban található, mint az ismétlődő régió egy aberráns extenziója (lásd 11B. ábra). Ezen elemzés eredményeinek a megerősítésére és a pontos rekombináns pont meghatározására, a p754 klón inzertjének a nukleotidszekvenciáját meghatároztuk, és összehasonlítottuk a vad típusú szekvenciákkal (lásd 12. ábra). Ez az elemzés azt mutatja, hogy a rekombináns pont 77 bázispárral a gE gén startkodonja előtt helyezkedik el.

c) A Difivac-1 biztonságosságának és hatékonyságának értékelése

A Difivac-l-et héthetes, BHV-l-szeronegatív specifikus patogénmentes borjakban vizsgáltuk. Nyolc borjút intranazálisan vakcináltunk 10⁵ TCID50-nel 2 miben, 1-1 ml-t permetezve az orrlyukakba. Nyolc héthetes korú BHV-l-szeronegatív specifikus patogénmentes botjúnak, amelyeket egy elkülönített egységben tartottunk, 2 ml táptalajt adtunk intranazálisan, ezek voltak a nem vakcináit kontrollok. Öt héttel a vakcinálás után a vakcináit és kontrollborjakat 10⁷ TCIDS0 nagyon virulens BHV-1 Iowa törzzsel fertőztük. A fertőzés után hat héttel mindegyik borjút öt napig intramuszkulárisan dexametazonnal kezeltük, hogy a feltételezett latens vírust reaktiváltuk. A klinikai tüneteket, a végbél hőmérsékletét és a testnövekedést feljegyeztük. Vírust izoláltunk az orr nyálkahártyájából, majd a semlegesítőantitest-titereket meghatároztuk a szérumból.

A vakcinálás után a borjak viselkedése, étvágya, végbélhőmérséklete és növekedési sebessége normális maradt, de a vakcináit borjaknak folyt az orruk és hipernyáladzást mutattak. Az ormyálkahártyában nem volt megfigyelhető léziók kialakulása. A Difivac-1 kiválasztódott az ormyálkahártyába a vakcinálás után (17. ábra). Mindegyik vakcináit borjú termelt BHV-1 elleni semlegesítőantitestet.

A fertőzés után mindegyik vakcinálatlan kontrollállat apátiába esett, elvesztette az étvágyát, szeme és orra folyt, az alsó állkapocs ínye kivörösödött, súlyos léziók keletkeztek az ormyálkahártyában 14 nappal a fertőzés után, és a növekedés 4 nap után leállt. A vakcináit borjaknak kisméretű, gyorsan gyógyuló lézióik voltak az ormyálkahártyájukban, és nem állt le a növekedésük. A napi klinikai megfigyeléseket, a végbélhőmérsékletet és a testtömeg változását a 18., 19. és 20. ábrán mutatjuk be. A fertőzés után mindegyik borjú orrában megjelent a vírus, de a vírus kibocsátásának a mennyisége és periódusa lényegesen lecsökkent a vakcináit borjak esetében (21. ábra). Mind a vakcináit, mind a nem vakcináit borjakban egy szekunder antitestválasz fejlődött ki, és mindegyik termelt antitesteket a fertőzés után.

A reaktiválás után a fertőző vírust izolálni lehetett az egyik vakcináit borjúból és 5 nem vakcináit borjúból. A Difivac-l-et nem lehetett reaktiválni.

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a Difivac-1 alig indukált betegségre utaló bármilyen jelet a fiatal borjakban, és nem volt reaktiválható. A Difivac-1 jelentősen csökkentette a betegség súlyosságát valamint a víruskibocsátás mennyiségét a fertőzés után.

A következtetés az, hogy a Difivac-1 egy biztonságos és hatékony vakcina a borjak BHV-1 fertőzése ellen.

2. BHV-1 rekombináns gE deléciós mutánsok készítése

Abból a célból, hogy rendelkezésünkre álljanak olyan megkülönböztethető BHV-1 vakcinák, amelyek molekulárisán jobban definiáltak, mint a Difivac-1, és amelyek - ha szükséges, akkor - a gE génben levő deléció mellett deléciót tartalmaznak például a timidinkináz génben, rekombináns gE deléciós mutánsokat készítettünk a Difivac-1 mellett. A gE glikoproteingén meghatározott pozíciójától kiindulva, és azokat a klónozott DNS-ffagmenseket használva, amelyek határolják a gE gént, egy gE deléciós ffagmens készíthető. Standard technika alkalmazásával [F. L. Graham and A. J. van dér Eb, Virology, 52, 456-467 (1973)] ezt a deléciós fragmenst rekombinálhatjuk a vad típusú BHV-1 törzs genomjával, így kaphatjuk a gE deléciós mutánsokat.

a) A gE deléciós fragmens készítése

A gE deléciós fragmens készítéséhez egy olyan ffagmensre van szükség, amelyből hiányzik a teljes gE szekvencia, valamint elegendő határolószekvenciát tartalmaz ahhoz, hogy lehetővé tegye a vad típusú genommal való rekombinációt. Az 5’-oldalon az 1,2 kb méretű Pstl-AsuII fragmenst választottuk, amely 18 nukleotiddal a gE gén startkodonja előtt végződik. 3’-fragmensként az 1,2 kb mérettel EcoNI-Dral fragmenst választottuk, amely 2 nukleotiddal a gE gén startkodonja előtt kezdődik (6. ábra).

A gE deléciós fragmens készítéséhez az 1,4 kb méretű Pstl-Smal ffagmenst, amely a BHV-1 Lám törzs

HU 219 602 Β

8,4 kb méretű HindlII K fragmenséből származik, és a gE gén 5’-végénél található, a pUC18 plazmid Smal és PstI hasítási helyére szubklónoztuk. Ennek a kiónnak a jele p515. Az EcoNI-Smal fragmenst, amely a gE 3’-végénél helyezkedik el, és a 4,1 kb méretű HindlII-EcoRI kiónból származik, a p515 plazmid egyetlen AsuII hasítási helyére klónoztuk. Ezáltal a gE deléciós fragmens készítése teljes, az így készült klón jele p519. Jóllehet elvileg a p519 teljes Pstl-Smal inzertje használható gE deléciós fragmensként, ez azonban nem tanácsos, ugyanis a Pstl-Smal fragmens körülbelül 100-150 bázispár hosszan belenyúlik az ismétlődő szekvenciába, amely az U_s régiót határolja. Ez a 100-150 bázispár méretű darab rekombinálódhat az U_s terület másik oldalán levő ismétlődő szekvenciával, ahol nem található a gE gén, és ezáltal nemkívánatos rekombináns termékek keletkezéséhez vezethet. Emiatt a Pstl-Dral fragmenst választottuk ki a rekombinációs kísérletekhez, és az ismétlődő szakasz 100 bázispárját eltávolítottuk.

b) gE deléciós fragmens rekombinációja a vad típusú BHV-1 genomjával

Abból a célból, hogy létrehozzuk a rekombinációt a konstruált gE deléciós fragmens és a vad típusú BHV-1 genomja között, a két DNS-molekulából mikrogramm mennyiségeket kotranszfektáltunk embrionális szarvasmarhatrachea (Ebtr)-sejtekbe, standard módszer alkalmazásával [F. L. Graham and A. J. van dér Eb, Virology, 52, 456-467 (1973)]. A celluláris rekombinációs mechanizmusok a DNS-molekulák kis százalékának (2-4%) a rekombinációjához vezetnek, amelyek beépülnek a sejtekbe. A rekombinálódott gE deléciós mutánsok szelektálására a transzfekció után keletkező víruskeveréket friss Ebtr-tenyészetben szaporítottuk. A legtöbb esetben az így kifejlődő külön víruspopulációk (tarfolt) egy vírusból származnak. A BHV-1 Lám törzs gE deléciós mutánsainak izolálására ezek közül a tarfoltok közül 230-at izoláltunk, majd standard immunológiai módszerekkel vizsgáltunk olyan BHV-1-specifikus monoklonális antitestek (Mab-ok) alkalmazásával, amelyek nem reagálnak a Difivac-l-gyel fertőzött sejtekkel. Ezek a Mab-ok a gE glikoprotein elleni specifitással rendelkeznek. A 230 tarfolt közül öt nem reagált ezekkel a Mab-okkal. Ennek az 5 tarfoltnak a DNS-ét tovább vizsgáltuk.

c) A BHV-1 Lám törzs konstruált gE deléciós mutánsainak DNS-elemzése

Az előzőkben említett 5 feltételezett gE deléciós mutánsból háromnak a DNS-ét (1B7, 1B8 és 2H10) tovább vizsgáltuk, standard Southem-blot-technikával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezeknek a DNS-készítményeknek a PstI és Dral restrikciós enzimekkel végzett kettős emésztésével, majd gélelektroforézisével és a 2,3 kb méretű Pstl-Dral deléciós fragmenssel mint próbával végzett Southem-blot-hibridizálásával kiderült, hogy az 1B7 és 1B8 víruspopuláció genomjából a gE gén pontosan a kívánt módon szakadt ki; lásd 7A. és 7B. ábrát. A 2H10 populációban egy deviáns Pstl-Dral fragmens található. A gE-specifikus próbával végzett Southemblot-hibridizálások azt mutatják, hogy nincs gE szekvencia a három DNS-preparátum közül egyikben sem (nem közölt eredmények). Az 1B7 és 1B8 BHV-1 víruspopulációk feltételezett gE deléciós mutánsok. Az 1B7 BHV-1 víruspopulációt vizsgáltuk meg, hogy vakcinaként milyen tulajdonságai vannak.

d) Timidin-kináz/gE kettős deléciós mutánsok készítése

Mivel egy olyan BHV-1 rekombináns deléciós mutánsnak, amelyben csak az egyik génben van deléció, esetleg nem csökkent le eléggé a virulenciája, a BHV-1 Lám és Harberink törzsekben a timidin-kináz (TK) génben is létrehoztunk deléciókat. Ezeket a mutánsokat azzal analóg módon hoztuk létre, amelyet az előzőkben említett gE deléciós mutánsoknál alkalmaztunk (nem közölt eredmények). Ezeket a timidin-kináz deléciós mutánsokat használtuk TK/gE kettős deléciós mutánsok készítésére.

e) gl glikoprotein/gE glikoprotein deléciós mutánsok készítése

Mivel az egyetlen gE deléciót tartalmazó mutánssal vakcináit szarvasmarha termelhet anti-gl antitesteket, amelyek kölcsönhatásba léphetnek az anti gl/gE antitestekkel (az alábbiakban részletesen tárgyaljuk), ezért kidolgoztuk a gl/gE kettős deléciót tartalmazó vakcinát is. Az ilyen gl/gE kettős deléciós mutánst ugyanazzal az eljárással készíthetjük, mint amelyet a gE deléció készítésére használtunk. Az 1,8 kb méretű PstI fragmens 5’végének - amely a gE gén 5’-végét fedi - részleges nukleotidszekvencia-elemzése azt mutatta, hogy ott egy nyitott leolvasási keret található, amely jelentős homológiát mutat a más herpeszvírusokban talált gl homológokkal (lásd 13. és 14. ábra). A 350 bp méretű Smal-PstI fragmens alkalmazásával, amely a gl gén feltételezett 5’-végét tartalmazza, valamint az EcoNI-Smal fragmens alkalmazásával, amely a gE gén után található, egy gl/gE deléciós fragmens készíthető. Ez a fragmens rekombinálható a vad típusú genommal, így kapunk egy BHV-1 gl/gE deléciós mutánst (lásd 16. ábra). Az a 80-90 aminosav, amely elvileg képződhet még, nem elegendő ahhoz, hogy olyan antitestek képződését indukálja, amelyek zavarhatják az anti-gl/gE antitestek képződését. A gl gén szekvenciájának további elemzése lehetővé teszi egy olyan gl deléció készítését, amely a gl teljes kódolórégióját lefedi. Ezt a gl/gE kettős deléciós mutánst nevezzük Difivac-IE-nek.

fi A Lám gE~ és a Lám gE~, TK mutánsok biztonságosságának és hatékonyságának értékelése

A Lám gE- és a Lám gE-, TK- BHV-1 mutáns törzsek vakcinatulajdonságait héthetes, BHV-l-szeronegatív, specifikus patogénektől mentes borjakban vizsgáltuk. Mindegyik mutáns törzset intranazálisan permeteztük 6 borjúba. Mindegyik borjúnak összesen 10⁵TCIDS0-et adtunk be 2 ml táptalajban, amelyet 1 mlenként permeteztünk az egyes orrlyukakba. Hat másik borjút intranazálisan permeteztünk vírusmentes táptalajjal, ezek szolgáltak vakcinálatlan kontrollként. Öt héttel azután, hogy az összes vakcináit és a kontrollborjút intranazálisan 10⁷ TCID50 nagyon virulens BHV-1

HU 219 602 Β

Iowa törzzsel fertőztük. A vakcinálás és a fertőzés után öt hétig a klinikai tüneteket, a végbél hőmérsékletét és a testnövekedést feljegyeztük. Vírust izoláltunk az orr nyálkahártyájából, hogy meghatározzuk a vírus hány napig rejtőz az orrban.

A vakcinálás után a boqak viselkedése, étvágya, végbélhőmérséklete és növekedési sebessége normális maradt, de a vakcináit borjaknak folyt az orruk, és az ormyálkahártyában megfigyelhető volt kisméretű léziók kialakulása. A vakcináit borjak orrából körülbelül hét napig lehetett izolálni a vírust (1. táblázat).

A fertőzés után mindegyik vakcinálatlan kontrollállat apátiába esett, elvesztette az étvágyát, szeme és orra folyt, az alsó állkapocs ínye kivörösödött, súlyos léziók keletkeztek az ormyálkahártyában és a növekedés csökkent. A Lám gE~, TK~ törzzsel vakcináit borjaknak kisméretű, gyorsan gyógyuló lézióik voltak az ormyálkahártyájukban. Nem mindegyik Lám gE~ törzzsel vakcináit borjúnak kezdett el folyni az orra, illetve lett lézió az ormyálkahártyájában. Apátia, az étvágy elvesztése vagy egyéb klinikai tünetek nem voltak megfigyelhetők a vakcináit boijaknál. A végbél hőmérséklete, a növekedés és a klinikai megfigyelések a 22., 23. és 24. ábrán láthatók. A vakcinálatlan állatok orrában kétszer hosszabb ideig volt található meg a vírus mint a vakcináit borjak orrában (1. táblázat).

A fenti eredmények azt mutatják, hogy a Lám gE~ és a Lám gE~, TK BHV-1 mutáns törzsek a betegségnek szinte semmilyen klinikai jelét nem hozták létre a fiatal borjakban. Mindkét mutáns törzs megakadályozta a betegséget a fertőzés után, és 50%-kal csökkentette a vírus orrban való tartózkodásának idejét.

A Lám gE és a Lám gE~, TK- mutáns törzsek biztonságosak és hatékonyak, borjak BHV-1 vírussal való fertőzése elleni vakcinaként.

3. A gE expressziója prokariótában

A BHV-1 gE glikoproteingén prokariótaexpreszsziójához eddig a pGEX expressziós vektort használták [D. B. Smith and K. S. Johnson, Gene, 67, 31-40 (1988)]. A pGEX vektor a Schisostosoma japonicumból származó glutation-S-transzferáz (GST) hordozófehérjét kódolja, amely a tac promoter szabályozóhatása alatt áll, és amely promoter izopropil-p-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) indukálható. A GST-gE fúziós fehérjére például egy pGEX-2T600s3 konstrukció (8A. ábra). Ebben a konstrukcióban standard molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] egy 600 bp méretű, a gE fehéije N-terminális 200 aminosavát kódoló Smal fragmens volt ligáivá a GST gén mögé. Ezt a konstrukciót három párhuzamosban terveztük, az egyes esetekben a 600 bp méretű fragmenst más leolvasási fázisban ligáltuk a GST-hez. Mindegyik konstrukciót Escherichia coli DH5a törzsbe juttattuk be, IPTG-vel indukáltuk, majd a keletkező fehérjéket poliakrilamidgél-elektroforézis után nitro-cellulózmembránra vittük át Westem-blot segítségével. Az anti-GST antitestekkel végzett immunológiai kimutatás azt igazolta, hogy csak a gE fehérjét kódoló helyes leolvasási fázisban levő (3. számú) konstrukció vezet az előre megjósolt méretű (27 kD GST+20 kD gE=47 kD) kívánt fúziós fehérje expressziójához. Izoláltunk három olyan Mab-ot, amely nem reagált Difivac-l-gyel, de felismerte a 47 kD méretű GST-gE fúziós fehérjét egy Westem-blotban (lásd 8. ábra).

4. gE glikoproteingén expressziója eukariótákban

A gE glikoproteingén eukariótákban való expressziójához a továbbiakban többek között a pEVHis vektort használtuk. A pEVHis vektor eukariótamarkerként a HisD gént tartalmazza, amely a hisztidinol-dehidrogenáz fehérjét kódolja (EC 1.1.1.23) [C. Hartmann and R. Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 8047-8051 (1988)], aminek az a tulajdonsága, hogy lehetővé teszi a sejteknek, hogy túléljék a 2,5 mmol/l-es toxikus hisztidinolkoncentrációt. A vektor emellett tartalmazza a humán citomegalovírus (HCMV) közvetlen korai génjének promoterrégióját, amely mögött egyedi restrikciós enzimes hasítási helyek találhatók. Egy pEVHis/gE expressziós vektor készítéséhez azt a fragmenst használtuk, amely a gE glikoproteingén teljes kódolórégióját tartalmazta. Ez a gE feltételezett leolvasási kerete előtt 55 bázispárral levő Alul hasítási hellyel indul, és 133 bázispárral a leolvasási keret után fejeződik be. Ezt a régiót a pEVHis vektor HCMV promotere mögé klónoztuk, így kaptuk a pEVHis/gE konstrukciót (9. ábra). A pEVHis/gE-t Escherichia coli DH5a sejtekben amplifikáltuk, majd cézium-klorid-gradiensen tisztítottuk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezzel a tisztított DNS-sel BALB/C-3T3 sejteket transzfektáltunk [F. L. Graham and A. J. van dér Eb, Virology, 52, 456-467 (1973)]. A transzformált sejteket hisztidinollal szelektáltuk, így kaptunk húsz hisztidinolrezisztens telepet. Ezeket a telepeket Mab 81-gyei vizsgáltuk, immunperoxidáz monolayer esszében (IPMA). Négy telepről igazolódott be, hogy expresszálják a gE fehérjét. Ebből a négy telepből a 9-es 3T3 gE kiónt választottuk ki egy olyan szubklón izolálása céljából, amelyben a gE magas szinten expresszálódik. Az ily módon izolált kiónt (3T3gE 9.5) használtuk a feltételezett anti-gE monoklonális antitestek jellemzésére.

5. A gE BHV—1 glikoprotein és a gl BHV—1 glikoprotein expresszálása ugyanabban az eukariótasejtben

Ahhoz, hogy a gl BHV-1 glikoproteint ugyanabban a sejtben expresszáljuk, mint a gE BHV-1 glikoproteint, először meghatároztuk a BHV-1 gl gén helyzetét. Mivel a herpesz szimplex vírus gl glikoproteingénje közvetlenül a gE glikoproteingén előtt található, ezért azt feltételeztük, hogy a BHV-1 gl gén is a megfelelő pozícióban található. Ennek vizsgálatához egy olyan 283 nukleotidból álló régió szekvenciáját meghatároztuk, amely körülbelül 1 kb-sal a BHV-1 gE gén előtt található. Ennek a régiónak a lefordítása azt mutatta, hogy a második leolvasási keret egy 94 aminosavból álló szekvenciát kódol, amely homológ a herpesz szimplex vírus gl glikoproteinjével (13. és 14. ábra). Mivel a homológ szegmens körülbelül 80 aminosav távolságra van a

HU 219 602 Β startkodontól, ezért a BHV-1 gl gén nyitott leolvasási keretének a feltételezett startpozícióját a szekvenált régió előtt körülbelül 250 nukleotid előttre becsültük. Ebből az következik, hogy az az 1,7 kb méretű Smal ffagmens, amely 400 nukleotiddal a szekvenált régió előtt kezdődik, és a gE génben végződik, a BHV-1 gl gén teljes kódolórégióját tartalmazza. Ezt az 1,7 kb méretű Smal ffagmenst klónoztuk az MSV-weo eukariótavektorba (lásd 15. ábra). Ez a vektor tartalmazta a rágcsálószarkóma-vírus erős promotert és a neo szelekciós gént, amely a G-418 antibiotikum szulfátja (Geneticin) elleni rezisztenciát kódolja. A kapott MSVneoGI konstrukciót Escherichia coli DH5 a sejtekben amplifikáltuk, majd 3T3gE 9.5 sejtekbe vittük át [F. L. Graham and A. J. van dér Eb, Virology, 52, 456-467 (1973)]. A transzfektált sejteket 400 pg/ml Geneticinkoncentrációval a táptalajban szelektáltuk, majd a rezisztens telepeket izoláltuk és azokkal a feltételezett anti-gE Mab-okkal vizsgáltuk, amelyek nem voltak képesek reagálni a 3T3gE 9.5 sejtekkel. Ezek közül a 3T3gE/gI R20-as kiónt választottuk, amely reagál például a Mab 66-tal, valamint a vad típusú BHV- 1-gyel is.

6. A feltételezett anti-gE Mab-ok jellemzése

Mab-okat termeltünk a vad típusú BHV-1 ellen, és azon az alapon szelektáltuk őket, hogy melyik nem képes reagálni a Difivac- 1-gyel fertőzött embrionális trachea (Ebtr)-sejtekkel. Ezeket a Mab-okat az alábbi reaktivitás alapján vizsgáltuk:

a) a Lám gE deléciós mutánssal;

b) az előzőkben ismertetett prokariótaexpressziós termékkel Westem-blotban;

c) az előzőkben ismertetett gE-t expresszáló Balb/c3T3 sejtekben;

d) a c) pontban említett sejtekkel, és a Difivac-1gyel fertőzött sejtekkel, valamint

e) a gE/gl komplexet expresszáló Balb/c-3T3 sejtekkel.

Az a), c), d) és e) pontokban végzett reaktivitási vizsgálatokban IPMA-t használtunk. A 2. táblázatban látható eredmények azt mutatják, hogy előállítottunk olyan Mab-okat, amelyek a gE-re specifikusak (2, 3, 4,

52, 66, 68, 72 és 81), valamint olyan Mab-okat (1, 51,

53, 67, 75 és 78), amelyek a gE/gl komplex konformációs antigéndoménjeire specifikusak. A különböző Mab-ok által felismert antigéndomének térképezésére végzett kompetíciós IPMA azt mutatja, hogy legalább 4 antigéndomén van jelen a gE glikoproteinen, és ezt az egy domént feltehetőleg a gE/gl komplex hozza létre (2. táblázat).

Az anti-gE antitestek kimutatása BHV-1-gyel fertőzött borjakban

Annak vizsgálatára, hogy a fertőzött borjak szérumában gE elleni antitestek vannak-e, indirekt blokkoló IPMA-t hajtottunk végre aló feltételezett gE-Mab-bal, és az alábbi 8 kiválasztott szérummal:

- 2 szérum olyan szarvasmarhákból, amelyeket Difivac-1-gyel vakcináltunk, és a virulens Iowa törzzsel fertőztünk, és 14 nappal a fertőzés után vettünk le;

- 2 szérum olyan szarvasmarhákból, amelyeket kísérletesen fertőztünk a BHV-1 1-es altípusú vírusával, és 20 hónappal a fertőzés után vettünk le. Az egyik szarvasmarha kontakt fertőzés útján kapta a vírust;

- 2 szérum olyan szarvasmarhákból, amelyeket kísérletesen fertőztünk a BHV-1 2b altípusú vírusával, és 20 hónappal a fertőzés után vettünk le. Az egyik szarvasmarha kontakt fertőzés útján kapta a vírust;

- egy specifikus patogénektől mentes borjúból származó szérum, amelyet egy ts mutáns vakcinával vakcináltunk, és három héttel később BHV-1 2b altípusú vírussal fertőztünk; a szérumot 7 héttel a fertőzés után vettük le;

- egy gnotobiotikus borjúból származó szérum, amelyet egy ts mutáns vakcinával vakcináltunk, és három héttel később BHV-1 2b altípusú vírussal fertőztünk; a szérumot 7 héttel a fertőzés után vettük le;

A 2. táblázatban látható, hogy mindegyik említett szérum a gE ΠΙ-as és IV-es antigéndoménje elleni antitesteket tartalmaz, valamint az I-es antigéndomén elleni antitesteket, amelyek valószínűleg a gE/gl komplexen találhatók. Levonhatjuk azt a következtetést, hogy a gE egy megfelelő szerológiai markemek tűnik ahhoz, hogy különbséget tegyünk a BHV- 1-gyel fertőzött és a vakcináit boijak között.

7. A BHV-1 nukleinsavak kimutatása PCR-rel, BHV-1 gE-specifikus indítómolekulák alkalmazásával

Kiindulva a BHV-1 gE gén meghatározott nukleotidszekvenciájából, egy, a PCR-hez alkalmas indítómolekula-párt választottunk, a Lowe és munkatársai által közölt indítómolekula-szelekciós program alkalmazásával [T. Lowe, J. Sharefkin, S. Qi Yang and C. W. Dieffenbach, Nucleic Acids Research, 18, 1757-1761 (1990)]. Ezeket az indítómolekulákat P₃ és P₄jelzéssel láttuk el, és a 10. ábrán mutatjuk be. Az indítómolekulák 159 nukleotid távolságban helyezkednek el egymástól, és egy 200 nukleotid hosszúságú ffagmens amplifikálását eredményezik. A P₃ és P₄ indítómolekulák és az izolált BHV-1 DNS alkalmazásával a PCR-eljáráshoz szükséges körülményeket optimalizáltuk. Ebbe beletartozik a MgCl₂-koncentráció, a glicerinkoncentráció és a ciklusok változtatása. A BHV-1 DNS P₃és P₄ indítómolekulákkal való amplifikálásához optimálisnak talált puffer összetétele: 10 mmol/1 TRIS (pH=8,0), 50 mmol/1 KC1, 0,01% zselatin, 2,6 mmol/1 MgCl₂ és 20% glicerin. Az optimális ciklus (Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler) az 1-5-ös ciklusokhoz: 1 perc 98 °C, 30 s 55 °C, 45 s 72 °C; a 6-35-ös ciklusokhoz: 30 s 96 °C, 30 s 55 °C és 45 s 72 °C. A PCR-amplifikálás után a kapott 200 nukleotid méretű ffagmenst 2%-os agarózgélen elektroforézisnek vetettük alá, nitro-cellulóz-membránra blottoltuk, majd Southem-blot-elemzésnek vetettük alá. A Southemblot-elemzéshez használt ³²P-dCTP-vel jelzett próba az a 137 bázispár méretű Taql ffagmens volt, amely az indítómolekulák kötési helye között helyezkedik el (10. ábra). A hibridizált szűrők autoradiografálása után egy 200 bázispár méretű csík figyelhető meg. Ezen az úton csak 10 BHV-1 genom amplifikálása (körülbelül

1,5 x 10 ¹⁵ pg DNS) ad még egy megfelelően kimutatható jelet (nem közölt eredmények). Összehasonlítható módon kifejlesztettünk egy PCR-eljárást, olyan inditó11

HU 219 602 Β molekulák alkalmazásával, amelyek a BHV-1 glll glikoprotein kódolószekvenciáján alapulnak [D. R. Fitzpatrick, L. A. Babiuk and T. Zamb, Virology, 173, 46-57 (1989)]. Hogy különbséget tudjunk tenni egy vad típusú BHV-1 DNS és egy gE deléciós mutáns vakcina között, a DNS-mintákat mind gE-specifikus PCR-eljárásnál, mind glll-specifikus PCR-eljárásnak alávetettük. Egy ilyen vizsgálatban kiderült, hogy a Difivac-1 DNS-készítmény glll-pozitív és gE-negatív.

Mivel a BHV-1 DNS kimutatása szarvasmarha ondófolyadékában a BHV-1-specifikus PCR-eljárás fontos alkalmazási területe, ezért megpróbáltuk a gE-specifikus PCR-t BHV-l-gyel fertőzött szarvasmarhaondófolyadékra alkalmazni. Azonban az ondófolyadékban levő ismeretlen komponensek erős gátlóhatást fejtenek ki a polimeráz-láncreakcióra. Ennek következtében kidolgoztunk egy eljárást BHV-1 DNS izolálására szarvasmarha-ondófolyadékból. A szarvasmarha-ondófolyadékból való DNS-izoláláshoz 30 μΐ ondófolyadékot inkubáltunk 1 mg/ml proteináz K-val 300 μΐ össztérfogatban 0,15 mol/1 NaCl, 0,5% Na-szarkozil és 40 mmol/1 DTT összetételű pufferben 60 °C-on. Egy óra elteltével a mintát hagytuk szobahőmérsékletre hűlni, majd 300 μΐ 6 mol/1 NaI-t adtunk hozzá, majd 5 percig inkubáltuk. Ebből az elegyből DNS-t izoláltunk a standard kloroform/izoamil-alkohol extrakcióval, majd 1 térfogat izoamil-alkohollal kicsaptuk. A csapadékot

2,5 mol/1 NH₄Ac/70%-os etanol eleggyel mostuk, majd 10 mmol/1 TRIS (pH=7,4), 1 mmol/1 EDTA, 0,5% Tween 80 és 0,1 mg/ml Proteináz K összetételű pufferben szuszpendáltuk, és másodszor is inkubáltuk 1 óra hosszat 60 °C-on. Ezt a DNS-készítményt közvetlenül be lehet vinni polimeráz-láncreakcióba.

Az alábbiakban közöljük az ábrák leírását.

1. ábra

A BHV-1 Difivac-1 és Iowa törzsek Southem-blotelemzése

A) Autoradiogram a Difivac-1 és Iowa genomiális DNS Southem-blotjáról. Az 1-es és 3-as csíkban a Difivac-1 DNS-t látjuk HindlII és PstI restrikciós enzimekkel végzett emésztés után. A 2-es és 4-es csíkokban az Iowa DNS látható HindlII és PstI restrikciós enzimekkel végzett emésztés után. A fragmensek méretét kb-ban adtuk meg.

A vírus-DNS-t úgy izoláltuk, hogy a vírussal fertőzött Ebtr-sejtek táptalaját (70 ml/forgópalack, körülbelül 450 cm²) centrifugáltuk 2 óra hosszat egy 25%-os (térfogat/térfogat) szacharózpámán keresztül, 10 mmol/1 TRIS pH=7,4, 150 mmol/1 NaCl és 1 mmol/1 EDTA összetételű oldatban 20 000/perc fordulatszámmal a Beckman L5-65 ultracentrifuga SW27-es rotorjában. Az így kapott vírusüledékből standard módszerekkel DNS-t izolálunk [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezzel a DNS-sel restrikciós enzimes emésztést végeztünk a Boehringer Mannheimtől vásárolt enzimekkel, a gyártó által szállított SuRe/cut pufferekben.

0,7%-os horizontális gélen végzett elektroforézissel való elválasztás, valamint nitro-cellulóz-membránra való blotolás után (Schleicher &Schuell, Inc.) a szűrőlapot 6 óra hosszat 42 °C-on előhibridizáltuk 50% formamid, 3 χ SSC (1 χ SSC=0,15 mol/1 NaCl és 0,015 mol/1 Na-citrát, pH=7,4), 50 μΐ denaturált lazacsperma-DNS (Sigma)/ml, 0,02% Ficoll és 0,1% Na-dodecil-szulfát (SDS) összetételű oldatban. A hibridizálást ezután úgy végeztük, hogy ugyanehhez az oldathoz hozzáadtuk a ³²P-dCTP-vel (Amersham) jelzett HindlII K ffagmenst [a HindlII K fragmens választása az alábbi publikáción alapul: Cloning and cleavage site mapping of DNS írom bovine herpesvirus 1 (Cooper strain), John F. Mayfíeld, Peter J. Good, Holly J. Van Oort, Alphonso R. Campbell and Dávid A. Reed, Journal of Virology, 259-264 (1983)]. 12-14 óra hosszat végzett hibridizálás után a szűrőlapot 2 óra hosszat mostuk 0,1% SDS és 0,1 χ SSC összetételű oldatban 60 °C-on. A HindlII K ffagmenst a pUC18 vektorba klónoztuk, a standard klónozási eljárások alkalmazásával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. A pUC18 vektor pUC/8,4 HindlII K klón HindlII restrikciós enzimmel végzett emésztése után a vektort ismét elektroforézissel választottuk el a 8,4 kb méretű HindlII K fragmenstől, 0,7%-os alacsony olvadáspontú agarózgélen (BRL, Life Technologies, Inc.), majd izoláltuk az agarózból standard fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással. Az izolált HindlII K ffagmenst az 1004.760 Random Prímed DNS-jelző kittel jeleztük (Boehringer Mannheim). A hibridizált szűrőlapok autoradiográfiáját 36 órás expozícióval végeztük Kodak XAR filmen, -70 °C-on, erősítőfólia alkalmazásával.

B) Az Iowa törzs 8,4 kb méretű HindlII K ffagmensének és a Difivac-1 7,4 kb méretű Hind K ffagmensének fizikai térképe. A 6 kb méretű PstI fragmensek együttvándorlása, és az 1,8 kb méretű PstI fragmens hiánya a Difivac-l-ben azt mutatja, hogy a deléció a bevonalkázott területen van.

2. ábra

A Difivac-l-ből hiányzó régió körülötti vad típusú BHV-1 fragmensek szubklónozása

A BHV-1 genom A komponenseiben az alábbiak láthatók: az egyedi hosszú (U_L) régió; az egyedi rövid (U_s) régió és a két ismétlődő szakasz (ír és Tr). Ez a térkép a Cooper törzs publikált elemzésén alapul [John F. Mayfield, Peter J. Good, Holly J. Van Oort, Alphonso R. Campbell and Dávid A. Reed, Journal of Virology, 259-264 (1983)].

Az U_s régióból az alábbi fragmensek láthatók a Bben, amelyeket prokariótavektorokba klónoztunk: egy 15,2 kb méretű EcoRI fragmens pACYC-ban, egy 8,4 kb méretű HindlII fragmens pUC 18-ban és egy 2,7 kb valamint egy 4,1 kb méretű EcoRI-HindlII fragmens pBR322-ben. A virális DNS-ffagmensek izolálását az 1 A. ábra magyarázatában említett eljárásokkal végeztük. Ezeknek a ffagmenseknek a különböző vektorokba való klónozását standard módszerekkel végeztük [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].

HU 219 602 Β

A C-ben annak a régiónak a fizikai térképe látható, ahol a Difivac-1 feltételezett deléciója található.

A D-ben ennek a régiónak néhány szubklónját mutatjuk be, amelyeket a további elemzésekhez használtunk. A két PstI fragmenst pKUN 19-be, a megmaradt fragmenseket pUC 18-ba klónoztuk.

3. ábra

A: a BHV-1 Lám törzs U_s régiójából annak a 2027 nukleotidnak a szekvenciája látható, amelyek a Difivac-l-ben található deléció körül helyezkednek el, amint azt a 2C. ábrán mutatjuk be (a bal szélen levő Alul felismerési helytől a jobb szélen levő HincII felismerési helyig). A 2D. ábrán bemutatott szubklónok inzertjeinek nukleotidszekvenciáját a két szál elemzésével határoztuk meg, Sanger és munkatársai didezoxi-szekvenálási módszerének alkalmazásával [F. Sanger, S. Nicklen and A. R. Coulson, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463-5467 (1977)]. Ebből a célból a Pharmacia T7 szekvenálókitjét használtuk a gyártó előírásai szerint. A radioaktív jelzéshez [³⁵S]dATP-t használtunk (Amersham). A kompressziós műtermékeket mutató GC-gazdag régiók szekvenciaelemzését a Pharmacia kit 7-deaza-dGTP variánsával ismételtük meg. A nukleotidszekvencia alatt hárombetűs kóddal láthatjuk az 575 aminosavcsoport nyitott leolvasási keretének az aminosavszekvenciáját, amelyet a nukleotidszekvencia lefordításával kaptunk. Ez a transzláció az univerzális kódon alapul, és a PC/gene programmal határoztuk meg (PC/gene 1.03-as verzió, 1987. november). Ez az 575 aminosavból álló nyitott leolvasási keret metioninnal indul a 168-as nukleotidnál és az 1893-as nukleotidnál levő stopkodonnal végződik.

Az 575 aminosav nyitott leolvasási keretének szerkezeti elemzését is elvégeztük a PC/gene számítógépprogrammal. Az első 26 aminosav egy eukariótaexportszignált képez, amelyet az ábrán „szignálpeptid”-del jelzünk. 6,2-es értékkel ennek a szignálszekvenciának a hasítását a 26-os és a 27-es aminosav közé jósoljuk. Az 575 aminosavból álló szekvencián három lehetséges N-glikozilezési hely található (NXT/S), amit az aminosavcsoportok aláhúzásával jelzünk. A Rao- és az Argos-módszerek szerint egy transzmembránrégió található a 423-as és a 450-es aminosavak között, amit az ábrán „transzmembránhélix”-szel jelölünk. Az AsuII, Smal, HindlII és az EcoNI restrikciós enzimek felismerési helyeit aláhúztuk. Ennek a polipeptidnek a számított molekulatömege 61 212.

B: az előzőkben említett 575 aminosavból álló nyitott leolvasási keret szerkezeti jellemzőinek sematikus ábrázolása.

4. ábra

A BHV-1 gE gén aminosavszekvenciájának összehasonlítása a herpesz szimplex vírus (HSV) gE génjének aminosavszekvenciájával és más homológ gE gének aminosavszekvenciájával [pszeudorabieszvírus (PRV) gl és varicella zooster (VZV) gpl]

Az ebben az összehasonlításban használt szekvenciákat az alábbi publikációkból vettük:

HSV: Sequence determination and genetic content of the short unique region in the genome of herpes simplex vírus type 1. D. J. McGeogh, A. Dolan, S. Donald and F. J. Rixon, Journal of Molecular Biology, 181, 1-13 (1985)].

VZV: DNA sequence of the U_s component of the varicella-zooster vírus genome. A. J. Davidson, EMBO Journal, 2, 2203-2209 (1983)].

PRV: Use of lambda gtl 1 to isolate genes fór two pseudorabies vírus glycoproteins with homology to herpes simplex vírus and varicella-zooster vírus glycoproteins. E. A. Petrovskis, J. G. Timmins and L. E. Post, Journal of Virology, 60, 185-193 (1986)].

Ezeket a szekvenciákat hasonlítottuk össze a Múltaim szekvenciaelemző program alkalmazásával [F. Corpet, Nucleic Acids Research, 16, 10 881-10 890 (1988)].

Az A-ban egy diagram látható, amelyben mind a négy aminosavszekvenciát bemutatjuk, sematikusan. Itt a megjósolt transzmembránrészeket (TM) mutatjuk, egymás alatt. A megjósolt export-szignálszekvenciák (PS) és a lehetséges N-glikozilezési helyek (I) mellett két konzervált területet is bemutatunk, amelyekben a ciszteincsoportok relatív pozíciója gyakran változatlan (C C C).

A B-ben a négy gE verzió centrális helyzetű ciszteinben gazdag régiójának Multalin összehasonlításával kapott eredmények láthatók. Csillagok jelzik az azonos aminosavakat és vesszők az analóg aminosavakat.

5. ábra

A Difivac-1 és az Iowa Southem-blot-elemzésekor kapott fényképek rajzai

A panel: a Difivac-1 és az Iowa genomiális DNS restrikciós enzimes emésztése BstI (1,2), EcoRI (3,4) és HindlII (5,6) enzimekkel, 0,7%-os agarózgélen elektroforézissel elválasztva, nitro-cellulóz-membránra blotolva, majd a BHV-1 Lám törzsnek az 1 A. ábra magyarázatában leírt eljárásokkal ³²P-vei jelzett HindlII K fragmensével hibridizálva.

B panel: ugyanennek a gélnek a nitro-cellulózblotja a BHV-1 gE-specifikus p318 próbával hibridizálva. Ez a próba tartalmazza a teljes, a 2C. ábrán bemutatott AluI-HincII régiót.

6. ábra

A BHV-1 gE deléciós ffagmens készítése

Az A-ban a gE gén pozíciója és a használt kiónok láthatók. A BHV-1 genom komponensei: az egyedi hosszú (U_L) régió; az egyedi rövid (U_s) régió és a két ismétlődő szakasz (IR és TR). A gE gén 5’-oldalán található régió kinyeréséhez a BHV-1 Lám törzs 8,4 kb méretű HindlII K fragmensének 1,4 kb méretű Pstl-Smal íragmensét a pUC18 plazmid Smal-PstI hasítási helyére klónoztuk. Ennek a kiónnak p515 a jele, és a B-ben látható. A gE 3’-oldalán található EcoNI-Smal fragmenst, amely a 4,1 kb méretű HindlII-EcoRI kiónból származik, a p515 egyedi AsuII hasítási helyére klónoztuk. Ahhoz, hogy az EcoNI-et az AsuII-be lehessen klónozni, a p515 kiónt AsuII enzimmel emésztettük, majd Klenow-enzimmel és dCTP-vel kezeltük (Boehringer Mannheim), hogy az AsuII végen egy citozincsoportot kapjunk, a standard módszerek szerint [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

HU 219 602 Β

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezt a hozzáadott citozint a D-ben egy csillaggal jelöljük. A p515-öt ezután Smal restrikciós enzimmel emésztettük, és ezután az EcoNI fragmenst ebbe a vektorba lehet ligálni. Az így kapott klón jele p519.

7. ábra

A: az 1B7, 1B8 és 2H10 DNS-preparátumok Southem-blot-elemzésekor kapott fénykép rajza. A DNSizolálást, a restrikciós enzimes emésztéseket, a biotolást és a hibridizálást az 1A. ábra magyarázatában leírtak szerint végeztük. Az 1B7,1B8 és 2H10 DNS-preparátumok Pstl-Dral kettős emésztése után a fragmenseket 0,7%-os agarózgélen választottuk el, majd ezt követően nitro-cellulóz-membránra blotoltuk. Ezt a membránt ³²P dCTP-vel jelzett 2,3 kb méretű Pstl-Dral deléciós ffagmenssel mint próbával hibridizáltuk. Az 1-3. sávokban az 1B7, 1B8 és 2H10 mintákat választottuk el. A 4-es sávban a vad típusú BHV-1 Lám törzset, az 5-ös sávban a 2,3 kb méretű deléciós fragmenst vizsgáltuk.

B: a BHV-1 Lám törzs 15,2 kb méretű EcoRI fragmensének fizikai térképe. A térkép a PstI, Dral és HindlII hasítási helyek pozícióját, valamint a 7A-ban említett hibridizációs próba pozícióját mutatja.

8. ábra

A BHV-1 gE prokariótaexpressziója

A BHV-1 gE prokariótaexpressziója érdekében a gE gén 600 bp méretű Smal fragmensét három leolvasási keretben a Schisostosoma japonicum glutation-Stranszferáz-génjének kódolórégiójához kötjük a pGEX-2T vektorban [D. B. Smith and K. S. Johnson, Gene, 67, 31-40 (1988)]. A Smal fragmenst a megfelelő (syn) orientációban tartalmazó rekombináns molekulákat standard módszer alkalmazásával, restrikciós enzimes emésztéssel azonosítottuk. Az ezt a fúziós konstrukciót tartalmazó Escherichia coli DH5a kiónokat pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 és pGEX-2T600s3 jelzéssel láttuk el.

A: az egyik pGEX-2T600s konstrukció diagramja. A GST-gE fúziós terméket kódoló régió N-terminális oldalán van az izopropil^-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) indukálható tac promoter régió.

B: a pGEX-2T600s vektorra transzformált DH5a sejtekből készített összfehérje Western-blot-elemzéséről készített fénykép rajza. A pGEX-2T600sl, pGEX-2T600s2 és pGEX-2T600s3 konstrukciókkal transzformált Escherichia coli DH5a sejtek éjszakán át szaporított tenyészetét 1/10 arányban átoltottuk Luria-Bertani (LB)-táptalajba, amely 50 pg/ml ampicillint tartalmazott, majd 1 órás szaporítás után izopropilβ-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG) indukáltuk 5 óra hosszat. Ezeket az indukált tenyészeteket 5 percig centrifúgáljuk 6000 χ g-vel, majd 1 χ fedőkeverékbe kevertük (összetétele: 2% SDS, 10% glicerin, 5% β-merkapto-etanol és 0,01% brómfenolkék) (1,5 ml tenyészetet tettünk 500 μΐ fedőkeverékhez), majd 5 percig 95 °C-on tartottuk. Ezután sávonként 50 μΐ-t választottunk el 12,5%-os vertikális poliakrilamidgélen, standard módszerek alkalmazásával, utána félszárazon blotoltuk egy nitro-cellulóz-membránra, az LKB-multiphor II Nova Biot rendszer alkalmazásával, a gyártó által meghatározott körülmények között.

Az M sávban előre festett markerfehérjéket alkalmaztunk (BRL Life Technologies Inc., 236 kD, 112 kD, 71 kD, 44 kD, 28 kD, 18 kD és 15 kD), majd az 1., 2., és 3-as sávokban a három megfelelő leolvasási keretet tartalmazó pGEX-2T600s, pGEX-2T600s2 és pGEX-2T600s3 vektorokkal transzformált Escherichia coli DH5a sejtekből készített össz-fehéijekészítményt futtattuk.

Az A panelben az anti-GST szérummal végzett Westem-blot eredménye látható. Ebből a célból a membránt standard módszerek szerint inkubáltuk [E. Harlow and D. Lane, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)], utána blokkolópufferben (PBS+2%-os tejpor és 0,05% Tween 20), végül pedig poliklonális anti-GST nyúlszérummal. A membránt ezután mostuk és tormaperoxidázzal (HRPO) konjugált kecske-antinyúl immunglobulin szérummal inkubáltuk. A megkötött kecskeantitesteket ezután immunkémiailag kimutattuk kromogénnel (diamino-bemzidin, klór-naftol és hidrogénperoxid). A GST fúziós terméket nyíllal jelezzük, mérete megfelel a várt méretnek (körülbelül 47 kD), de csak a 3-as leolvasási keretet tartalmazó vektort tartalmazó sejtekben.

A B panelben a Mab 4 monoklonális antitesttel végzett Westem-blot-elemzés eredménye látható, amely monoklonális antitest felismeri a gE fehérjét. Ennek érdekében egy ugyanolyan membránt, mint amilyet az A panelben használtunk, blokkoltunk, a Mab-bal inkubáltuk, mostuk majd HRPO-val konjugált nyúl-antiegér szérummal inkubáltuk. Ezután a megkötött nyúlantitesteket kromogénnel immunkémiailag detektáltuk. A 3. sávban (3-as leolvasási keret) látható csík mérete 47 kD, nyíl mutatja.

9. ábra

A pEVHisgE plazmid készítése a BHV-1 gE gén eukariótaexpresszálására

A gE gén eukariótaexpresszálására a teljes gE kódolórégiót a megfelelő orientációban a pEVHis expressziós vektor HCMV promoterrégiója mögé klónoztuk, standard módszerek alkalmazásával [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ennek érdekében a 394 bp méretű Alul fragmenst, amely a gE nyitott leolvasási kerete előtt 55 bázispárral kezdődik, pUC18 vektorba klónoztuk, jele p201. Ezután a p201 HincII restrikciós enzimes emésztése után az 1740 bázispár méretű HincII fragmenst, amely a gE gén nagy részét tartalmazza, p201-be klónoztuk. így kaptuk a p318 plazmidot, amely a pUC18 polilinkerében tartalmazta a teljes gE kódolórégiót a gE startkodonja előtt 55 bázispárral található Alul helytől a gE stopkodonja után 133 bázispárral található HincII hasítási helyig. A vektor polilinkerében levő restrikciós hasítási helyek felhasználásával ezt a fragmenst kivágtuk a p318 plazmidból, BamHI és Sphl enzimeket alkalmazva. Először a p318 plazmidot Sphl restrikciós enzimmel

HU 219 602 Β emésztettük, majd az Sphl végeket Klenow-polimeráz és dNTP-k felhasználásával feltöltöttük. A BamHI restrikciós enzimmel végzett emésztés után az 1,9 kb méretű inzertet elválasztottuk a pUC18 vektortól alacsony olvadáspontú agarózban, majd a pEVHis vektorba ligáltuk, amelyet előtte BamHI és EcoRV enzimekkel emésztettünk. Az így keletkező plazmid jele pEVHis/gE.

10. ábra

A BHV-1 DNS kimutatásához használt PCR-eljárásban alkalmazott gE-specifikus indítómolekulák és a próba pozíciója

Az ábrán a BHV-1 gE glikoprotein nukleinsavszekvenciája látható az 1272-2027. nukleotidok között (a szekvenciát a 3. ábrából vettük át). A gE-specifikus PCR-eljárásban használt indítómolekulák jele P₃ és P₄. A P₃ és P₄ elsődleges kötőhelye alá van húzva. A P₃nukleotidszekvenciája 5’-ACG-TGG-TGG-TGGCAG-TTA-GC-3’ (2. szekvencia). A P₄ nukleotidszekvenciája (komplementer az előzőkben megadott primer kötőszekvenciával) 5 ’-ACC-AAA-CTT-TGA-ACCCAG-AGC-G-3’ (3. szekvencia). A Southem-blot-hibridizálásban a PCR-rel amplifikált DNS kimutatására használt próba a 137 bázispár méretű Taql fragmens, amely a primer kötődési helyek között található; ennek a ffagmensnek a végeit jeleztük. A 3. ábrával való összehasonlítás céljából a HindlII és az EcoNI hasítási helyeket is jeleztük.

11. ábra

A Difivac-1 gE deléciójának térképezése

Az A-ban látható a vad típusú BHV-1 Lám törzs

15,5 kb méretű EcoRI ffagmensének fizikai térképe. Bben látható a Difivac-1 14,5 kb méretű EcoRI ffagmensének fizikai térképe. Mindkét EcoRI fragmens lefedi a megfelelő vírusok genomjának egyedi rövid régióit (U_s). A gE gén pozícióját és a gl gén feltételezett pozícióját üres négyszögekkel jeleztük. Az A és B térképeket egymáshoz képest úgy helyeztük el, hogy az egyes térképekben található 6 kb méretű PstI fragmensek egymás fölött helyezkedjenek el. Mindkét térképen a belső ismétlődő szakasz és a végen található ismétlődő szakasz szekvenciáját vonalkázott négyszögek jelzik. Az ismétlődések alatti nyilak ezeknek a szekvenciáknak az orientációját jelzik.

Az A-ban az U_s régiónak azt a részét, amely a Difivac-1 törzsből hiányzik, külön jelezzük.

C-ben azok a klónozott Difivac-1 fragmensek láthatók, amelyeket a gE deléció térképezésére és a B-ben látható fizikai térkép kidolgozására használtunk. A p728, p737 és p754 kiónok inzertjei alatti nyilak azokat a régiókat jelölik, amelyeket szekvenáltunk, a rekombinációs pont meghatározása céljából.

Rövidítések: A=AluI, E=EcoRI, P=PstI, H= =HindIII, r=rekombinációs pont, IR=belső ismétlődés, TR=végen levő ismétlődés.

12. ábra

A pontos rekombinációs pont meghatározása a Difivac-1 U_s régiójában

A Difivac-1 törzsben talált gE deléció pontos határainak meghatározására a p754-es kiónt, valamint a p728 és p737 kiónok végeit szekvenáltuk. Ezeknek a kiónoknak az inzertjeit all. ábrán jeleztük. Az alkalmazott szekvenálási eljárásokat a 3. ábra magyarázatában közöltük.

A-ban az AluI-PstI fragmens legnagyobb részének szekvenciája látható. Ez a szekvencia a gE gén promoterrégiójában kezdődik. A feltételezett TATA boxot aláhúztuk. Az r pontban (=rekombinációs pont) ezt a promoterrégiót egy olyan szekvenciával fúzionáltattuk, amely szintén megtalálható az U_s régióval szembeni oldalon, ez a fordított ismétlődés. A pontos rekombinációs pontot úgy határoztuk meg, hogy a gE promoterrégiónál talált ismétlődést összehasonlítottuk az U_s régió másik oldalán talált ismétlődésmásolattal. Azt a pontot, ahol ezek a szekvenciák eltérnek, a B-ben jeleztük (az I alatt) ,r’-rel. Hasonló összehasonlítást végeztünk a Difivac-1-ben talált gE promoterszekvencia és a vad típusú LAm törzsben levő promoterszekvencia között. Azt a pontot, ahol ezek a szekvenciák eltérnek, a B-ben mutattuk (II alatt), és szintén ,r’-rel jelöltük. A talált rekombinációs pontok azonosak.

13. ábra

A BHV-1 gl génjének részleges szekvenciaelemzése

A BHV-1 Lám törzs 1,8 kb méretű PstI kiónjának felhasználásával, amely belenyúlik a BHV-1-nek mind a gl, mind a gE génjébe (lásd 11. ábra), a BHV-1 gl kódolórégiójában található 284 nukleotidszekvenciáját meghatároztuk. Az alkalmazott szekvenálási eljárásokat a 3. ábra magyarázatában közöltük. A szekvenciát lefordítottuk az univerzális kód alapján, a PC/gene program 1.03-as verziójának (1987. november) alkalmazásával. A második leolvasási keret által kódolt aminosavszekvenciát a nukleotidszekvencia alatt adjuk meg, egybetűs kódok formájában. Ez a szekvencia homológ más herpeszvírus gl homológok kódolórégiójával (lásd

14. ábra).

14. ábra

A feltételezett BHV-1 gl gén részleges aminosavszekvenciájának összehasonlítása a herpesz szimplex vírus (HSV1) gl génjének, a pszeudorabieszvírus (PRV) gp63 génjének és a varicella-zooster vírus (VZV) gpIV génjének aminosavszekvenciájával

A PRV szekvencia a 82-es aminosavnál kezdődik, a HSV1 szekvencia a 80-as aminosavnál kezdődik, a VZV szekvencia a 76-os aminosavnál kezdődik. A használt szekvenciákat a 4. ábra magyarázatában említett publikációkban közlik. Az összehasonlítást a Multiplan számítógépes programmal végeztük. A csillagok az azonos aminosavakat jelölik, a vesszők az analóg aminosavakat jelölik.

15. ábra

A BHV-1 gl gén eukariótaexpressziójához szükséges MSVneoGI plazmid készítése

A BHV-1 gl gén részleges aminosav-összehasonlítása alapján a BHV-1 gl gén feltételezett pozícióját megbecsültük. Ennek a becslésnek az alapján az a feltételezésünk, hogy az 1,7 kb méretű Smal ffagmensnek tartalmaznia kell a BHV-1 gE gén teljes kódolórégióját. Ennek az 1,7 kb méretű Smal ffagmensnek a po15

HU 219 602 Β zícióját A-ban jelöltük. A kapott terméket BamHI restrikciós enzimmel emésztettük, majd az MSV-neo eukariótaexpressziós vektorba ligáltuk. Az MSV-neo vektor egyetlen BamHI hasítási hellyel rendelkezik az MSV-LTR mögött, amely erős promoteraktivitással 5 rendelkezik. Ezt a vektort Rijsewijk és munkatársai írták le [EMBO J„ 6, 127-131 (1987)].

16. ábra

A BHV-1 gl/gE kettős deléciós fragmens készítése

A gE glikoproteingén pozícióját és a gl gén feltétele- 10 zett pozícióját a BHV-1 U_s régiójában az A diagramon mutatjuk be. A vonalkázott négyszögek jelzik azokat az ismétlődéseket, amelyek az U_s régiót határolják.

B mutatja néhány lényeges restrikciós enzim fizikai térképét, mindkét gén pozíciójához viszonyítva. A gE/gl 15 deléciós fragmens készítéséhez a pl.7-SmaI/o kiónt, amely a gl-gént tartalmazó 1,7 kb méretű Smal fragmenst hordozza, PstI restrikciós enzimmel emésztettük.

A megmaradó 350 bázispár méretű Smal-PstI inzert PstI végét tompa véggé alakítottuk, standard 20 molekuláris-biológiai módszerek alkalmazásával. Az EcoNI-Smal fragmenst (lásd 6B. ábra), amelyet a 4,1 kb méretű, a 6A. ábránál leírt HindlII-EcoRI fragmenst is tompa végűvé tettük, és a módosított PstI helyre ligáltuk. Ezt a C és D részben ábrázoljuk. A kelet- 25 kező pdeltalE kiónból az 1,4 kb méretű Smal-Dral fragmenst izolálhatjuk, hogy a vad típusú BHV-1 DNS-sel rekombináljuk.

Rövidítések:

E=EcoRI, H=HindIII, S=SmaI, P=PstI, ENI=

EcoNI, D=DraI, kb=kilobázis és U_s=egyedi rövid.

17. ábra

A vírus átlagos előfordulási ideje a borjak orrában vakcinálás után *=Difivac-1 -gyei vakcináivá;

O=vakcinálatlan kontroll.

18. ábra

Átlagos napi klinikai tünetek mértéke virulens BHV-1 törzzsel való fertőzés után; kulcs ugyanaz mint a 17. ábránál.

19. ábra

Átlagos végbélhőmérséklet virulens BHV-1 törzzsel fertőzött borjaknál; kulcs ugyanaz mint a 17. ábránál.

20. ábra

Borjak átlagos növekedése egy virulens BHV-1 törzzsel való fertőzés után; a kulcs ugyanaz mint a 17. ábránál.

21. ábra

A vírus átlagos előfordulási ideje a borjak orrában virulens BHV-1 törzzsel való fertőzés után; kulcs ugyanaz mint a 17. ábránál.

22. ábra

Átlagos végbélhőmérséklet virulens BHV-1 törzszsel fertőzött borjaknál.

*=Lam gE^-vel vakcináivá

0=Lam gE-/TK--val vakcináivá x =vakcinálatlan kontroll.

23. ábra

Borjak átlagos növekedése egy virulens BHV-1 törzzsel való fertőzés után; a kulcs ugyanaz mint a 22. ábránál.

24. ábra

Átlagos napi klinikai tünetek mértéke virulens BHV-1 törzzsel való fertőzés után; kulcs ugyanaz mint a 22. ábránál.

1. táblázat

A vírus borjak orrában való tartózkodásának ideje 30 Lám gE vagy Lám gE-/TK~ törzzsel való vakcinálás, valamint egy virulens BHV-1 törzzsel való fertőzés után, a vakcináit és kontrollborjaknál

A vírus orrban tartózkodásának átlagos hossza napokban
Csoport	Vakcinálás után	Fertőzés után
Kontroll	0	10,33±l,51
Lám gE	7,00±0,89	4,83±1,17
Lám gE	7,17±1,33	5,17±0,98

2. táblázat

A gE-Mab-ok jellemzése

Mab	A feltételezett gE-Mab-ok reaktivitása
	Difivac-1 3T3/EBTR	Lám ge~	Prok.	3T3 gE	3T3 gE Difivac-1	3T3 gE/gl	Ag csoport	Abboqú
1	-	-	na	-	+	?	I	+
2	-	-	-	+	+	+	II	-
3	-	-	+	+	+	+	?	-
4	-	-	+	+	+	+	9	-
42	-	-	na	-	-	?	V?	±
51	-	-	na	-	+	+	III	+
52	-	-	+	+	+	+	9	-
53	-	-	na	-	+	+	III	+
59	-	-	na	-	-	+	III	+

HU 219 602 Β

2. táblázat (folytatás)

Mab	A feltételezett gE-Mab-ok reaktivitása
	Difivac-1 3T3/EBTR	Lám ge~	Prok.	3T3gE	3T3gE Difivac-1	3T3 gE/gl	Ag csoport	Ab borjú
66	-	-	na	+	+	+	III	+
67	-	-	na	-	+	+	III	+
68	-	-	-	+	+	+	IV	+
72	-	-	-	+	+	+	V	±
75	-	-	na	-	+	9	I	+
78	-	-	na	-	+	?	na	-
81	-	-	-	+	+	+	II?	-

+: Mind a 8 vizsgált szérum >50% blokkolást mutat indirekt blokkoló IPMA-ban ±: A szérumok ± 50%-os blokkolást mutatnak -: A szérumok <50% blokkolást mutatnak

Szekvencialista 20 Típus: nukleotid és aminosav

Szekvencia száma: 1 Szálszám: egyszeres

Hossz: 2027 nukleotid, 575 aminosav

AGGGCGGAGC GTTGAGCGGC CCGACCGCCG CCGGGTTGTT AAATGGGTCT CGCGCGGCTC 60 I Difivac'í-ben törölve

GTGGTTCCAC ACCGCCGGAG AACCAGCGCG AGCTTCGCTG CGTGTGTCCC GCGAGCTGCG 120

Asull

TTCCGGGGAA CGGCGCACGC GAGAGGGTTC GAAAAGGGCA TTTGGCA 167

ATG CAA CCC ACC GCG CCG CCC CGG CGG CGG TTG CTG CCG CTG CTG CTG 215

Met Gin Pro Thr Alá Pro Pro Arg Arg Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu

5 _t 10 15 ————— ---azZGNKL PEPTID

CCG CAG

TTA TTG CTT TTC GGG CTG ATG GCC GAG GCC AAG CCC GCG

ACC

253

Pro

Gin

Leu

Leu Phe Gly

Leu

Met

Alá

Glu

Alá

Lys

Pro

Alá

Thr

20

25

30

GAA

ACC

Saal CCG GGC

TCG

GCT

TCG

GTC

GAC

ACG

GTC

TTC

ACG

GCG

CGC

GCT

311

Glu

Thr

Pro Gly

Ser

Alá

Ser

Val

Asp

Thr

Val

Phe

Thr

Alá

Arg

Alá

35

40

45

GGC

GCG

CCC

GTC

TTT

CTC

CCA

GGG

CCC

GCG

CGC

CCG

GAC

GTG

CGC

359

Gly

Alá

Pro

Val

Phe

Leu

Pro

Gly

Pro

Alá

Arg

Pro

Asp

Val

Arg

50

55

60

GCC GTT

CGC GGC TGG AGC GTC CTC GCG GGC

GCC TGC TCG

CCG CCC GTG

407

Alá

Val

Arg

Gly

Trp

Ser

Val

Leu

Alá

Gly

Alá

Cys

Ser

Pro

Val

65

70

75

• 80

CCG

GAG

CCC

GTC

TGC

CTC

GAC

CGC

GAG

TGC

TTC

ACC

GAC

GTG

GCC

455

Pro

Glu

Pro

Val

Cys

Leu

Asp

Arg

Glu

Cys

Phe

Thr

Asp

Val

Alá

85

90

95

HU 219 602 Β

CTG GAC GCG GCC TGC CTG CGA ACC GCC CGC GTG GCC CCG CTG GCC ATC 503

Leu Asp Alá Alá Cys Leu Arg The Alá Arg Val Alá Pro Leu Alá Ile

100 105 110

GCG GAG CTC GCC GAG CGG CCC GAC TCA ACG GGC GAC AAA GAG TTT GTT 551

Alá Glu Leu Alá Glu Arg Pro Asp Ser Thr Gly Asp Lys Glu Phe Val

115 120 125

PvuII

CTC GCC GAC CCG CAC GTC TCG GCG CAG CTG GGT CGC AAC GCG ACC GGG 599

Leu Alá Asp Pro His Val Ser Alá Gin Leu Gly Arg asn aia Thr Gly

130 135 140

GTG CTG ATC GCG GCC GCA GCC GAG GAG GAC GGC GGC GTG TAC TTC CTG 647

Val Leu Ile Alá Alá Alá Alá Glu Glu Asp Gly Gly Val Tyr Phe leu

145 150 155 160

TAC GAC CGG CTC ATC GGC GAC GCC GGC GAC GAG GAG ACG CAG TTG GCG 695

Tyr Asp Arg Leu Ile Gly Asp Alá Gly Asp Glu Glu Thr Gin Leu Alá

165 170 175

CTG ACG CTG CAG GTC GCG ACG GCC GGC GCG CAG GGC GCC GCG CGG GAC 743

Leu Thr Leu Gin Val Alá Thr Alá Gly Alá Gin Gly Alá Alá Arg Asp

180 185 190

GAG GAG AGG GAA CCA GCG ACC GGG CCC ACC CCC GGC CCG CCG CCC CAC 791

Glu Glu Arg Glu Pro Alá Thr Gly Pro Thr Pro Gly Pro Pro Pro His

195 200 205

CGC ACG ACG ACA CGC GCG CCC CCG CGG CGG CAC GGC GCG CGC TTC CGC 839

Arg Thr Thr Thr Arg Alá Pro Pro Arg Arg His Gly Alá Arg Phe Arg

210 215 220

Snal

GTG CTG CCG TAC CAC TCC CAC GTA TAC ACC CCG GGC GAT TCC TTT CTG 887

Val Leu Pro Tyr His Ser His Val Tyr Thr Pro Gly Asp Ser Phe Leu

225 230 235 240

CTA TCG GTG CGT CTG CAG TCT GAG TTT TTC GAC GAG GCT CCC TTC TCG 935

Leu Ser Val Arg Leu Gin Ser Glu Phe Phe Asp Glu Alá Pro Phe Ser

245 250 255

GCC AGC ATC GAC TGG TAC TTC CTG CGG ACG GCC GGC GAC TGC GCG CTC 983

Alá Ser Ile Asp Trp Tyr Phe Leu Arg Thr Alá Gly Asp Cys Alá Leu

260 265 270

ATC CGC ATA TAC GAG ACG TGC ATC TTC CAC CCC GAG GCA CCG GCC TGC 1031

Ile Arg Ile Tyr Glu Thr Cys Ile Phe His Pro Glu Alá Pro Alá Cys

275 280 285

CTG CAC CCC GCC GAC GCG CAG TGC AGC TTC GCG TCG CCG TAC CGC TCC 1079

Leu His Pro Alá Asp Alá Gin Cys Ser Phe Alá Ser Pro Tyr Arg Ser

290 295 300

HU 219 602 Β

GAG

ACC

GTG

TAC

AGC

CGG

CTG

TAC

GAG

CAG

TGC

CGC

CCG

GAC

CCT

GCC

1127

Glu

Thr

val

Tyr

Ser

Arg

Leu

Tyr

Glu

Gin

Cys

Arg

Pro

Asp

Pro

Alá

305

310

315

320

GGT CGC

TGG

CCG

CAC

GAG

TGC

GAG

GGC

GCC

GCG

TAC

GCG

CCC

GTT

1175

Gly Arg

Trp

Pro

HiS 325

Glu

Cys

Glu

Gly

Alá 330

Alá

Tyr

Alá

Pro 335

Val

GCG

CAC

CTG

CGT

CCC

GCC

AAT

AAC

AGC

GTA

GAC

CTG

GTC

TTT

GAC GAC

1223

Alá

His

Leu

Arg

Pro

Alá

Aaa.

-53IL

Sfi£

Val

Asp

Leu

Val

Phe

Asp Asp

340

345

350

GCG

CCG

GCT

GCG

GCC

TCC

GGG

CTT

TAC GTC

TTT

GTG

CTG

CAG

TAC

AAC

1271

Alá

Pro

Alá

Ser

Gly

Leu

Tyr Val

Phe

Val

Leu

Gin

Tyr

Asn

355 360 365

HindlII

GGC CAC	GTG Val	GAA GCT TGG GAC TAC AGC CTA GTC GTT ACT TCG GAC CGT	1319
Gly	His 370	Glu Alá Trp Asp Tyr Ser Leu Val Val	Thr	Ser	Asp	Arg
375	380
TTG	GTG	CGC	GCG GTC ACC GAC	CAC ACG CGC CCC GAG	GCC	GCA	GCC	GCC	1367
Leu 385	Val	Arg	Alá Val Thr Asp 390	His Thr Arg Pro Glu 395	Alá	Alá	Alá	Alá 400
GAC	GCT	CCC	GAG CCA GGC CCA	CCG CTC ACC AGC GAG	CCG	GCG	GGC	GCG	1415
Asp	AXa	Pro	Glu Pro Cly Pro 405	Pro Leu Thr Ser Glu 410	Pro	Alá	Gly 415	Alá
CCC	ACC	GGG	CCC GCG CCC TGG	CTT GTG GTG CTG GTG	GGC	GCG	CTT	GGA	1463
Pro	Thr	Gly	Pro Alá Pro Trp 420	Leu Val Val Leu Val Gly Alá 425 , '430 —— TRANSMEMBRAN hélix	Leu	Gly
CTC	GCG	GGA	CTG GTG GGC ATC	GCA GCC CTC GCC GTT	CGG	GTG	TGC	GCG	1511
Leu	Alá	Gly 435	Leu Val Gly xlé	Αία Alá Leu Alá Val 440	Axy 445	Val	Cys	Alá
CGC	CGC	GCA	AGC CAG AAG CGC	ACC TAC GAC ATC CTC	AAC	CCC	TTC	GGG	1559
Arg	Arg 450	Alá	Ser Gin Lys Arg 455	Thr Tyr Asp Ile Leu 460	Asn	Pro	Phe	Gly
CCC	GTA	TAC	ACC AGC TTG CCG	ACC AAC GAG CCG CTC	GAC	GTG	GTG	GTG	1607
Pro 465	Val	Tyr	Thr Ser Leu Pro 470	Thr Asn Glu Pro Leu 475	Asp	Val	Val	Val 480
CCA	GTT	AGC	GAC GAC GAA TTT	TCC CTC GAC GAA GAC	TCT	TTT	GCG	GAT	1655
Pro	Val	Ser	Asp Asp Glu Phe 48S	Ser leu Asp Glu Asp 490	Ser	Phe	Alá 495	Asp

HU 219 602 Β

GAC GAC AGC GAC GAT GAC GGG CCC GCT AGC AAC CCC CCT GCG GAT GCC 1703

Asp Asp Sec Asp Asp Asp Gly Pro Alá Ser Asn Pro Pro Alá Asp Alá

500 SOS 510

TAC GAC CTC GCC GGC GCC CCA GAG CCA ACT AGC GGG TTT GCG CGA GCC 1751

Tyr Asp Leu Alá Gly Alá Pro Glu Pro Thr Ser Gly Phe Alá Arg Alá

SIS 520 525

CCC GCC AAC GGC ACG CGC TCG AGT CGC TCT GGG TTC AAA GTT TGG TTT 1799

Pro Alá *«n filv Thr Arg Ser Ser Arg Ser Gly Phe Lys Val Trp Phe

530 535 540

AGG GAC CCG CTT GAA GAC GAT GCC GCG CCA GCG CGG ACC CCG GCC GCA 1847

Arg Asp Pro Leu Glu Asp Asp Alá Alá Pro Alá Arg Thr Pro Alá Alá

545 550 555 560

EcoNI

CCA GAT TAC ACC GTG GTA GCA GCG CGA CTC AAG TCC ATC CTC CGC TAG 1895

Pro Asp Tyr Thr Val Val Alá Alá Arg Leu Lys Ser Ile Leu Arg *

565 570 575 fiCGCCCCCCC CCCCCCGCGC GCTGTGCCGT CTGACGGAAA GCACCCGCGT GTAGGGCTGC 1955 ATATAAATGG AGCGCTCACA CAAAGCCTCG TGCGGCTGCT TCGAAGGCAT GGAGAGTCCA 2015 CGCAGCGTCG TC 2027

Szekvencia szama: 2 30

Hossz: 20 nukleotid

ACGTGGTGGT GCCAGTTAGC

Szekvencia száma: 3

Hossz: 22 nukleotid 35

ACCAAACTTT GAACCCAGAG CG

Típus: nukleotid

Szálszám: egyszeres

Típus: nukleotid

Szálszám: egyszeres

Claims

1.1-es típusú szarvasmarhaherpesz-vírus (BHV-1) mutáns, amely a gE glikoproteingénben deléciót hordoz, a gE gén a BHV-1 genomban a 6. ábrán bemuta- 45 tott helyen található, azzal jellemezve, hogy az említett deléció lehetővé teszi, hogy a mutáns szerológiailag megkülönböztethető legyen a vad típusú BHV-1-től.

2. Az 1. igénypont szerinti mutáns, azzal jellemezve, hogy az említett, a gE glikoproteingénben levő délé- 50 ció attenuációval jött létre.

3. A 2. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy a jelzése Difivac-1 (Institut Pasteur, Franciaország, letéti szám 1-1213).

4. Az 1. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy az említett, a gE glikoproteingénben deléció rekombináns DNS-technikával készült.

5. A 4. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy jelzése 1B7 vagy 1B8, és a 7. ábrán bemutatott Southem-blot-profillal rendelkezik.

6. Az 1. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy a gE glikoproteingénben létrehozott deléció mellett a timidin-kináz génben is deléciót tartalmaz.

7. Az 1. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy a gE glikoproteingénben létrehozott deléció mellett a gl glikoproteingénben is deléciót tartalmaz.

8. Az 1. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy a gE glikoproteingénben létrehozott deléció mellett a timidin-kináz génben és a gl glikoproteingénben is deléciót tartalmaz.

9. Az 1. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy rekombináns DNS-technikával bejuttatott heterológ gént tartalmaz.

10. A 9. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy az említett heterológ gént a gE glikoprotein helyén tartalmazza, és ez szabályozószekvenciák, előnyösen a gE gén vagy egy heterológ gén szabályozószekvenciáinak hatása alatt áll, és adott esetben a

HU 219 602 Β gE génnek egy szignálpeptidet kódoló részéhez van hozzákötve.

11. A 9. igénypont szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy a gE glikoproteingénben létrehozott deléció mellett a timidin-kináz génben a gl glikoproteingénben vagy mindkettőben is deléciót tartalmaz, az említett heterológ gén legalább az egyik deléció helyére van beépítve.

12. A 9-11. igénypontok bármelyike szerinti BHV-1 mutáns, azzal jellemezve, hogy az említett heterológ gén egy másik patogén immunogén fehérjéjét vagy peptidjét kódolja vagy egy citokint kódol.

13. Diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy rekombináns nukleinsavat tartalmaz, amely a BHV-1 gE glikoproteingénjét, ennek a gE glikoproteingénnek egy részét vagy ebből a gE glikoproteingénből származó nukleotidszekvenciát tartalmaz, és az említett gE gén a BHV-1 genomban a 6. ábrán látható helyen található.

14. A 13. igénypont szerinti diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy egy klónozó- vagy expressziós vektort tartalmaz, amelyben a BHV-1 gE glikoproteingénjét hordozó rekombináns nukleinsavinzert, vagy ennek a gE glikoproteingénnek egy része vagy egy, ebből a gE glikoproteingénből származó nukleotidszekvencia található.

15. Diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy a BHV-1 gE glikoproteinjét, a gE glikoprotein egy részét, az ebből a gE glikoproteinből származó pepiidet, vagy BHV-1 gE és gl glikoproteinjeinek komplexét tartalmazza.

16. Diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy egy olyan antitestet tartalmaz, amely specifikus a BHV-1 gE glikoproteinjére, ennek a gE glikoproteinnek egy részére, egy ebből a gE glikoproteinből származó peptidre, vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinek komplexére.

17. A 16. igénypont szerinti diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan monoklonális antitestet tartalmaz, amely specifikus a BHV-1 gE glikoproteinjére, ennek a gE glikoproteinnek egy részére, egy ebből a gE glikoproteinből származó peptidre, vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinek komplexére.

18. A 16. igénypont szerinti diagnosztikai készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan poliklonális antitestet tartalmaz, amely specifikus a BHV-1 gE glikoproteinjére, ennek a gE glikoproteinnek egy részére, egy ebből a gE glikoproteinből származó peptidre, vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinek komplexére.

19. Vakcinakészítmény állatok, főleg emlősök, különösen szarvasmarhák BHV-1 elleni vakcinálására, azzal jellemezve, hogy az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti BHV-1 mutánst, valamint egy alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.

20. Vakcinakészítmény állatok, főleg emlősök, különösen szarvasmarhák patogének elleni vakcinálására, azzal jellemezve, hogy alkalmas hordozóanyag és/vagy adjuváns mellett olyan BHV-1 mutánst tartalmaz, amely egy, a mutánst a vad típusú BHV-1-től szerológiailag megkülönböztethetővé tevő deléciót hordoz a gE glikoproteingénben, és tartalmaz egy rekombináns DNStechnikával bejuttatott olyan heterológ gént, amely a patogén egy immunogén fehérjéjét vagy peptidjét kódolja.

21. Diagnosztikai készlet BHV-1 nukleinsav kimutatására egy mintában, különösen biológiai mintában, előnyösen vérből vagy vérszérumból, vérsejtekből, tejből, testfolyadékokból, azaz könnyből, tüdőváladékból, orrfolyadékból, spermából, különösen ondófolyadékból, nyálból, köpetből vagy szövetből, különösen idegszövetből vett mintában, amely egy állatból, különösen emlősből, előnyösen szarvasmarhából származik, azzal jellemezve, hogy egy nukleinsavpróbát vagy indítómolekulát tartalmaz, amelynek nukleotidszekvenciája a BHV-1 gE glikoproteingénjéből származik, az említett gE gén a BHV-1 genomban a 6. ábrán bemutatott pozícióban található, és emellett tartalmaz a nukleinsav kimutatására alkalmas eszközöket.

22. Diagnosztikai készlet BHV-l-re specifikus antitestek kimutatására egy mintában, különösen biológiai mintában, előnyösen vérből vagy vérszérumból, vérsejtekből, tejből, testfolyadékokból, azaz könnyből, tüdőváladékból, orrfolyadékból, spermából, különösen ondófolyadékból, nyálból, köpetből vagy szövetből, különösen idegszövetből vett mintában, amely egy állatból, különösen emlősből, de előnyösen szarvasmarhából származik, azzal jellemezve, hogy a BHV-1 gE glikoproteinjét, ennek a gE glikoproteinnek egy részét, egy, ebből a gE glikoproteinből származó pepiidet, vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinek komplexét, valamint antitestkimutatási vizsgálatban használható kimutatási eszközöket tartalmaz.

23. A 22. igénypont szerinti diagnosztikai készlet, azzal jellemezve, hogy egy vagy több további olyan antitestet tartalmaz, amelyek specifikusak a BHV-1 gE glikoproteinjére, vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinjeinek komplexére.

24. Diagnosztikai készlet BHV-1 fehérjék kimutatására egy mintában, különösen biológiai mintában, előnyösen vérből vagy vérszérumból, vérsejtekből, tejből, testfolyadékokból, azaz könnyből, tüdőváladékból, orrfolyadékból, spermából, különösen ondófolyadékból, nyálból, köpetből vagy szövetből, különösen idegszövetből vett mintában, amely egy állatból, különösen emlősből, de leginkább szarvasmarhából származik, azzal jellemezve, hogy a BHV-1 gE glikoproteinjére, ennek a gE glikoproteinnek egy részére, egy, ebből a gE glikoproteinből származó peptidre, vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinek komplexére specifikus antitestet, valamint fehérjekimutatási vizsgálatban használható kimutatási eszközöket tartalmaz.

25. Eljárás egy állat, főleg emlős, különösen szarvasmarha BHV-l-gyel való fertőzöttségének meghatározására, azzal jellemezve, hogy egy állatból származó mintában, pontosabban biológiai mintában, azaz vérből vagy vérszérumból, vérsejtekből, tejből, testfolyadékokból, azaz könnyből, tüdőváladékból, orrfolyadékból, spermából, különösen ondófolyadékból, nyálból, köpetből vagy szövetből, különösen idegszövetből vett mintában, vizsgáljuk a BHV-1 gE glikoproteingént tartalmazó nukleinsav jelenlétét, az említett gE glikoproteingén

HU 219 602 Β a 6. ábrán bemutatott pozícióban található a BHV-1 genomban, vagy vizsgáljuk a BHV-1 gE glikoprotein vagy a BHV-1 gE és gl glikoprotein-komplex jelenlétét vagy a BHV-1 gE glikoproteinre vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinjeinek komplexére specifikus anti- 5 testek jelenlétét.

26. Eljárás egy állat, főleg emlős, különösen szarvasmarha BHV-1-gyei való fertőzöttségének meghatározására, azzal jellemezve, hogy egy állatból származó mintában, pontosabban biológiai mintában, azaz vérből vagy vérszérumból, vérsejtekből, tejből, testfolyadékokból, azaz könnyből, tüdőváladékból, orrfolyadékból, spermából, különösen ondófolyadékból, nyálból, köpetből vagy szövetből, különösen idegszövetből vett mintá bán, vizsgáljuk a BHV-1 gE glikoproteingént tartalmazó nukleinsav jelenlétét, az említett gE glikoproteingén a 6. ábrán bemutatott pozícióban található a BHV-1 genomban, vagy vizsgáljuk a BHV-1 gE glikoprotein vagy a BHV-1 gE és gl glikoprotein-komplex jelenlétét vagy a BHV-1 gE glikoproteinre vagy a BHV-1 gE és gl glikoproteinjeinek komplexére specifikus anti10 testek jelenlétét, ahol a vizsgálandó minta egy olyan állatból származik, amelyet a 19. igénypont szerinti vakcinakészítménnyel vakcináltunk.