DE69132404T2

DE69132404T2 - Varicella-zoster virusantigen

Info

Publication number: DE69132404T2
Application number: DE69132404T
Authority: DE
Inventors: Abbas Vafai
Original assignee: Research Corp Technologies Inc
Current assignee: Research Corp Technologies Inc
Priority date: 1990-10-04
Filing date: 1991-10-04
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2011-10-05
Also published as: JP3990445B2; CA2068654A1; DE69132404D1; JPH05502595A; ES2150906T3; WO1992006989A1; CA2068654C; EP0504388B1; EP0504388A4; DK0504388T3; EP0504388A1; ATE196163T1; US6180369B1; KR920703614A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids, das zur Expression eines sekretorischen, verkürzten Glycoproteins (Tgp) von Varicella-Zoster-Virus (VZV) in Säugetierzellen befähigt ist. Das erfindungsgemäße sekretorische Tgp enthält mindestens ein Epitop, das zur Induktion einer Antikörper-Antwort befähigt ist. Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung und Verwendung dieses sekretorischen Tgp in einem Impfstoff gegen Windpocken und/oder Gürtelrose. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des sekretorischen Tgp in diagnostischen Tests zum Nachweis von VZV. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung erste Antikörper, die für sekretorisches Tgp spezifisch sind, und zweite Antikörper, die für die ersten Antikörper spezifisch sind. Diese zweiten Antikörper eignen sich ebenfalls in diagnostischen Tests für VZV.
Varicella-Zoster-Virus verursacht Windpocken bei Kindern (Varicella) und Gürtelrose (Zoster), zwei unterschiedliche klinische Erscheinungsformen. Varicella ist das Ergebnis der primären Begegnung (Infektion) mit VZV, während Zoster das Ergebnis einer VZV-Reaktivierung ist, die vorwiegend bei älteren und immunologisch geschwächten Personen, einschließlich Krebs- und AIDS-Patienten, auftritt. In den Vereinigten Staaten wird die Anzahl der jährlichen Fälle von Windpocken auf 2,5 Millionen und von Gürtelrose auf 1,2 Millionen geschätzt. Es wird erwartet, dass die Anzahl von Gürtelrose-Patienten mit zunehmendem Alter der Bevölkerung steigt. Zu einer der häufigsten Komplikationen bei Gürtelrose gehört eine postherpetische Neuralgie, die durch wechselweise Schmerzen gekennzeichnet ist, die nach dem Auftreten des Hautausschlags 4 Wochen bis mehrere Jahre anhalten. Zu weiteren Komplikationen einer VZV-Reaktivierung (Gürtelrose) gehören Enzephalitis, Pneumonitis und disseminierter Zoster.
VZV ist ein Mitglied der alpha-Herpesvirus-Familie. VZV enthält ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom mit annähernd 125 000 Basenpaaren und besteht aus der folgenden Sequenz: lange einmalige Folge (U1) - invertierte kurze Wiederholung (IRs) - kurze einmalige Folge (Us) - termi nale kurze Wiederholung(TR). VZV-DNA kodiert für fünf Glycoproteine mit den Bezeichnungen gpI, gpII, gpIII, gpIV und gpV, von denen gpI bis gpIV leicht in infizierten Zellen und in VZ-Virionen nachgewiesen werden (Davison und Scott, J. Gen. Virol., Bd. 67 (1986), S. 1759-1816; Davison et al., J. Virol., Bd. 57 (1986), S. 1195-1197). Diese Glycoproteine sind stark immunogen und rufen bei den infizierten Personen sowohl neutralisierende Antikörper als auch eine zellvermittelte Immunantwort hervor (Davison et al., a.a.O., (1986)).
VZV-gpI, das das am reichlichsten vorhandene und am stärksten immunogene Glycoprotein der Virion-Hüllglycoproteine darstellt, ruft die Bildung von komplementabhängigen neutralisierenden Antikörpern hervor und vermittelt ferner eine antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität. Das für gpI kodierende Gen befindet sich in der einmaligen kurzen Region (Us) des VZV-Genoms. Eine der wichtigen Antikörper-Bindungsstellen (Epitop) an einem VZV-Glycoprotein wurde in VZV-gpI identifiziert (Vafai et al., J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 2544. Die synthetischen Peptide (14 Aminosäurereste), die dieses Epitop (mit der Bezeichnung el) umfassen, induzierten eine Antikörperantwort, die von einem Zwischenprodukt mit hohem Mannosegehalt (82 kDa), aber nicht von der reifen Form (95 kDa) von VZV-gpI erkannt wurde (Vafai et al., Virus Res., Bd. 13 (1989), S. 319-336). Diese Ergebnisse ließen zusammen mit dem Fehlen einer VZV-neutralisierenden Aktivität von Antipeptid-Antikörpern darauf schließen, dass der Zustand und das Ausmaß der O-verknüpften und/oder N-verknüpften Glycosylierung des e1-Epitops die Konformation von gpI beeinträchtigen oder zu einer sterischen Hinderung führen, die die antigene Determinante, die von Antipeptid-Antikörpern erkannt wird, beeinflussen.
Ein abgeschwächter Varicella-Zoster-Virus-Impfstoff wird in Japan gegen Windpocken-Infektionen bei leukämischen Kindern sowie für eine routinemäßige Impfung im frühen Kindheitsstadium verwendet. Dieser Impfstoff wird gegenwärtig in den Vereinigten Staaten bei Kindern mit Leukämie getestet. Sein Einsatz bei gesunden Kindern und für die Verhinderung einer VZV-Reaktivierung (Gürtelrose) bei der älteren Bevölkerung wird erwartet. Obgleich gezeigt worden ist, dass der abgeschwächte Varicella-Impfstoff sicher ist und eine wirksame Immunität gegen eine VZV-Infektion herbeiführt, kommt es jedoch ähnlich wie bei einer natürlichen Infektion zu einem latenten Verbleiben des abgeschwächten Varicella-Impfstoffes in humanen dorsalen Wurzelganglien, die unter Entstehen von Gürtelrose mit den begleitenden neurologischen Komplikationen einer postherpetischen Neuralgie und einer Enzephalitis reaktiviert werden können.
Daher besteht der Wunsch nach einem Impfstoff für die Immunisierung von Kindern sowie für die Auffrischung der Immunreaktion bei älteren Personen, die gegenüber einer VZV-Reaktivierung (Gürtelrose) empfindlicher sind, wobei dieser Impfstoff diese Latenzerscheinungen vermeidet und beseitigt. Ein derartiger Untereinheit-Impfstoff, der erfindungsgemäß vorgesehen wird, lässt sich durch Konstruktion von rekombinanten Viren (z. B. Vaccinia-Virus), die ein oder mehr VZV-Glycoproteine exprimieren, herstellen oder er kann (wie es erfindungsgemäß insbesondere in Betracht kommt) aus sekretorischen, stark immunogenen VZV-Glycoproteinen zusammengesetzt sein, die in großen Mengen hergestellt und gereinigt werden und für eine Immunisierung und/oder Auffrischung der Immunreaktion gegen eine VZV-Infektion verwendet werden. Ferner lassen sich derartige hochgereinigte VZV-Glycoproteine als diagnostisches Hilfsmittel für die Bestimmung des Immunstatus gegen eine VZV-Infektion bei immunologisch geschwächten Personen (leukämische Kinder, AIDS- und Krebspatienten) sowie bei geimpften Personen und bei der älteren Bevölkerung verwenden.
Das Gen für VZV-gpi wurde in der Vergangenheit isoliert, in ein Plasmid eingesetzt und einem Vaccinia-Virus-Expressionssystem einverleibt. Obgleich das gpI-Protein durch das Vaccinia-Expressionssystem erzeugt wurde, verblieb das Produkt innerhalb der Zellen und war daher nicht dazu geeignet, in vivo eine antigene Reaktion hervorzurufen.
Die erfindungsgemäß bereitgestellte Innovation besteht in der Konstruktion eines Expressionsvektors, der eine verkürzte Form von VZV-gp erzeugt, die aus Säugetierzellen sezerniert wird.
Zu den Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden rekombinanten Vaccinia-Viren, die sekretorische, verkürzte VZV-Glycoproteine mit einem Gehalt an einem oder mehreren stark immunogenen viralen Epitopen exprimieren, gehören: (1) die Verwendung von derartigen rekombinanten Viren als Untereinheit-Impfstoffe gegen eine VZV-Infektion, wobei die Sekretion von VZV-Glycoprot einen im Anschluss an die Impfung eine stärkere Immunantwort gegen VZV-Glycoproteine sowie gegen VZV-Infektionen gewährleistet; (2) die Verwendung großer Mengen hochgereinigter und immunogener sekretorischer VZV-Glycoproteine mit einem Gehalt an einem oder mehreren Epitopen als Untereinheit-Impfstoff gegen eine primäre VZV-Infektion (Windpocken) bei gesunden Kindern sowie bei immunologisch geschwächten Personen und zur Auffrischungsimmunisierung gegen eine VZV-Reaktivierung (Gürtelrose) bei älteren Personen; und (3) die Verwendung von gereinigten Präparaten von sekretorischen, verkürzten VZV-Glycoproteinen in diagnostischen Kits als hochspezifische Zielantigene für den Nachweis und die Ermittlung des Antikörper-Status gegenüber VZV-Glycoproteinen. Da eine VZV-Reaktivierung bei Krebs- und AIDS-Patienten üblich ist, besteht ferner ein Bedürfnis nach einer serologischen Diagnose einer VZV-Infektion bei diesen Patienten. Da außerdem eine VZV-Reaktivierung im wachsenden Bevölkerungsanteil von älteren Personen zu Schmerzen vor dem Eintritt der klinischen Symptome führt und auch zu Enzephalitis, Pneumonitis und disseminiertem Zoster führen kann, liegt die einzige Hoffnung für eine frühe Behandlung dieser Patienten in einer raschen Diagnosemöglichkeit. Die Verwendung der vorliegenden, auf rekombinantem Wege hergestellten, sekretorischen VZV- Glycoproteine in diagnostischen Kits kann die Bereitstellung einer raschen und kostengünstigen Maßnahme zur Diagnose einer VZV-Infektion ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung ist auf einen Expressionsvektor für sekretorisches, verkürztes VZV-gp sowie auf die Konstruktion dieses Vektors, der eine extrazelluläre Sekretion des VZV-Proteins ermöglicht, abgestellt.
Insbesondere ist die Erfindung auf einen rekombinanten DNA-Expressionsvektor abgestellt, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die dazu befähigt ist, in einem infizierten, transfizierten oder transformierten Wirt ein reifes Polypeptid zu exprimieren, wobei das Polypeptid aus folgender Gruppe ausgewählt ist: die Sequenz mit 159 Aminosäuren von SEQ ID N0: 1, die Sequenz mit 511 Aminosäuren von SEQ ID N0: 2, die Sequenz mit 276 Aminosäuren, die durch einen EcoPI/EcoRI-Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster umfasst, definiert ist, eine Sequenz mit 316 Aminosäuren, die durch einen BstE2/EcoRI-Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster enthält, definiert ist, eine Sequenz mit 341 Aminosäuren, die durch einen NdeI/EcoRI-Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella- Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster umfasst, definiert ist, oder eine Sequenz mit 408 Aminosäuren, die durch einen EcoRI- Einzelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offe nen gpI-Leseraster enthält, definiert ist, und wobei das Polypeptid zur extrazellulären Sekretion aus diesem Wirt befähigt ist und dazu befähigt ist, eine VZV-Antikörperreaktion bei Säugetieren hervorzurufen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Plasmid, das für ein Varicella-Zoster-Virus-Polypeptid kodiert, wobei dieses Polypeptid aus der vorstehend aufgeführten Gruppe ausgewählt ist und wobei das Polypeptid zur extrazellulären Sekretion aus einem Wirt befähigt ist und dazu befähigt ist, in einem Säugetier eine VZV-Antikörperreaktion hervorzurufen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Verfahren zur Herstellung eines sekretorischen, verkürzten Varicella-Zoster-Virus- Glycoproteins abgestellt, wobei es sich beim Glycoprotein um ein Polypeptid handelt, das aus der vorstehend aufgeführten Gruppe ausgewählt ist und wobei das Polypeptid dazu befähigt ist, eine VZV-Antikörperreaktion in Säugetieren hervorzurufen, wobei das Verfahren folgende Stufen umfasst:
a) Bereitstellen eines Vektors, der eine für dieses Polypeptid kodierende Nucleotidsequenz umfasst, wobei die Nucleotidsequenz zur Expression durch einen Wirt, der den Vektor enthält, befähigt ist;
b) Einverleiben des Vektors in den Wirt; und
c) Aufrechterhalten des Wirts, der den Vektor enthält, unter Bedingungen, die zur Expression der Nucleotidsequenz unter Bildung des Glycoproteins geeignet sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes, sekretorisches, verkürztes VZV-gpI, bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das aus der vorstehend aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, wobei die Polypeptide extrazellulär aus Säugetierzellen, in denen die Polypeptide erzeugt werden, sezerniert werden und wobei die Polypeptide mindestens ein antigenes Epitop enthalten, das zur Herbeiführung einer Antikörperreaktion in einem Säugetierwirt befähigt ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung eines sekretorischen, verkürzten VZV-gp, bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das aus der vorstehend aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, für die Herstellung eines Impfstoffes zur Stimulierung einer Immunreaktion gegen Windpocken und/oder Gürtelrose.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von VZV, das folgendes umfasst: Kontaktieren von Serum, Gewebe oder Gewebeextrakten einer zu testenden Person mit einem Antikörper gegen ein sekretorisches, verkürztes VZV-gp, bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das aus der vorstehend aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, für eine Zeitspanne und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erforderlich sind, und Nachweisen eines etwaigen entstandenen Antikörper-Antigen-Komplexes.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombinanten Plasmids, das ein verkürztes VZV-gpI-Gen mit dem e1-Epitop trägt. VZV-gpI-Gen, das in den pGEM-4-Transkriptionsvektor (Vafai et al., a.a.O. (1988)) geklont war, wurde mit BglII (B)-Restriktionsenzym stromabwärts von e1-Epitop und mit EcoRI (E) im pGEM-Polylinker gespalten. Das verkürzte gpI-Gen wurde der Elektroelution unterzogen, stumpfendig gemacht und an der SmaI (S)-Stelle des Vaccinia-Virus-Insertionsvektors pSC11 geklont, wie ausführlich in den Beispielen beschrieben ist.
Fig. 2 belegt die Expression eines verkürzten VZV-gpI durch rekombinantes Vaccinia-Virus. BSC 1-Zellen wurden mit rekombinantem Vaccinia- Virus, das ein verkürztes VZV-gpI gemäß Fig. 1 (mit der Bezeichnung VVTgpIBglII) mit dem e1-Epitop trug, infiziert. Nach 22 Stunden wurden infizierte Zellen 1 Stunde mit [³&sup5;S]-Methionin markiert. Zelllysate wurden gemäß den Angaben in den Beispielen hergestellt. Die Zelllysate wurden mit den nachstehend angegebenen monoklonalen Antikörpern (MAbs) und einem Humanserum einer Immunopräzipitation unterzogen und durch SDS-12% Polyacrylamid-PAGE analysiert: MAb79.7, gegen das e1-Epitop gerichtet; Humanserum (H-Serum) von VZV-seropositiven Personen; MAbC1, gegen VZV-gpI gerichtet, das von el abweichende Epitope erkennt MAbG7, gegen VZV-gpI gerichtet, das nur die glycosylierte Form des e1-Epitops erkennt; MAbG6, gegen VZV-gpIV gerichtet; MAbF8, gegen VZV-gpII gerichtet; und MAbE10, gegen VZV-gpIII gerichtet. Die Größe (in Kilodalton) der Vorstufe und der glycosylierten Form des TgpIBglII sind auf der linken Seite dargestellt.
Fig. 3 belegt die Expression und Sekretion von TgpIXmaIII aus den infizierten Zellen. Im linken Feld wurden die Zellen mit VVTgpIXmaIII infiziert und nach 22 Stunden wurden infizierte Zellen 1 Stunde mit [³&sup5;S]-Methionin (200 uCi/ml) pulsmarkiert. Die Zellen wurden geerntet. Zelllysate (CL) wurden hergestellt, mit MAbs immunopräzipitiert und mit 9% SDS-PAGE analysiert. Im rechten Feld wurden die Zellen auf die vorstehend beschriebene Weise infiziert und markiert. Im Anschluss an den Pulsmarkierungszeitraum wurden die Zellen 5-mal mit serumfreiem Medium gewaschen und 2 Stunden bei 37ºC in serumfreiem Medium inkubiert. Gewebekulturflüssigkeit (TCF) wurde geerntet, mit MAbs immunopräzipitiert und mit 9% SDS-PAGE analysiert. MAbF9 ist gegen das VZV-Nucleocapsid-Protein gerichtet. Die Größen (in Kilodalton) des Kerns und prozessierter Formen von TgpIXmaIII sind auf der linken Seite angegeben.
Fig. 4 belegt die Expression und Sekretion von TgpIBglII aus den infizierten Zellen. Im linken Feld wurden die Zellen mit VVTgpIBglII infiziert und nach 22 Stunden wurden infizierte Zellen 10 Minuten mit [³&sup5;S]- Methionin (300 uCi/ml) pulsmarkiert. Die Zellen wurden entweder geerntet oder mit serumfreiem Medium gewaschen und die Markierung wurde 1, 2, 3 und 7 Stunden einer "Chase"-Behandlung unterzogen. Nicht-infizierte Zellen (Un) wurden 10 Minuten pulsmarkiert und 7 Stunden der "Chase"-Behandlung unterzogen. Zelllysate (CL) wurden hergestellt und mit MAb79.7 (a), das gegen das VZV-gpI-e1-Epitop gerichtet ist, und mit MAbC1 (b), das gegen VZV-gpI gerichtet ist, aber nur von el abweichende Epitope erkennt, immunopräzipitiert. Im rechten Feld wurde Gewebekulturflüssigkeit (TCF) von nicht-infizierten (Un) und von mit VVTgpIBglII infizierten Zellen, die 1, 2, 3 und 7 Stunden der "Chase"-Behandlung unterzogen worden waren, mit MAb79.7 (a) und MAbC1 (b) immunopräzipitiert. Die Proben wurden mit SDS-12% Polyacrylamid-PAGE gemäß den Angaben unter Materialien und Methoden analysiert. Die scheinbaren Größen (in Kilodalton) der Vorstufe und der glycosylierten reifen Formen von TgpI sind aufgeführt.
Fig. 5 belegt die Expression von rekombinantem Vaccinia-Virus, das ein VZV-gpI-Gen von voller Größe trägt (Bezeichnung VVgpI). Die Zellen wurden mit VVgpI (Cabirac et al., (1988)) infiziert. Nach 22 Stunden wurden die Zellen gemäß den Angaben zu Fig. 3 der Puls-Chase-Behandlung unterworfen. Zelllysate (CL) und Gewebekulturflüssigkeiten (TCF) aus nichtinfizierten (Un) und VVgpI-infizierten Zellen (VVgpI) wurden mit MAb79.7, das gegen das VZV-gpI-e1-Epitop gerichtet ist, immunopräzipitiert. Proben wurden mit SDS-8% Polyacrylamid-PAGE gemäß den Angaben in den Beispielen analysiert. Der Größenbereich von Vorläuferprodukten von VZV-gpI (Vafai et al., (1988)) ist angegeben.
Fig. 6 belegt die Immunopräzipitation von VZV-infizierten Zellen mit Kaninchen-Antikörpern gegen rekombinantes Vaccinia-Virus, das ein verkürztes VZV-gpI trägt und das e1-Epitop (VVTgpI) enthält. Die Zellen wurden mit VZV infiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen 10 Minuten mit [³&sup5;S]-Methionin (300 uCi/ml) in Abwesenheit oder Gegenwart von (15 ug/ml) Tunicamycin (TM), das die Addition von N-verknüpften Oligosacchariden an natives VZV-gpI hemmt, pulsmarkiert. Die Zellen wurden entweder geerntet oder gewaschen und 2 Stunden in Abwesenheit oder Gegenwart von TM (15 ug/ml) der Chase-Behandlung unterworfen. Zelllysate wurden hergestellt und mit MAbC1 (a), das sowohl VZV-gpI als auch -gpIV erkennt, und mit Kaninchen-anti-VVTgpI-Antikörpern (RAnti-VVTgpI) immunopräzipitiert. Proben wurden gemäß den Angaben in den Beispielen mit SDS-8% Polyacrylamid- PAGE analysiert. Die scheinbaren Größen (in Kilodalton) von Vorläuferprodukten von VZV-gpI und -gpIV (Vafai et al., a.a.O., (1988)) sind auf der rechten Seite angegeben. Lysozym (14,3 kDa), β-Lactoglobulin (18,4 kDa), α-Chymotrypsinogen (25,7 kDa), Ovalbumin (43,0 kDa), Rinderserumalbumin (68,0 kDa), Phosphorylase B (97,4 kDa) und Myosin (200,0 kDa) wurden als interne Größenmarker verwendet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids mit einem verkürzten VZV-gp (I, II, III, IV oder V)-Gen, das mindestens ein Epitop trägt, das zur Induktion einer Antikörperreaktion in Säugetierzellen befähigt ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Vaccinia-Virus-Expressionssystem, das zur Erzeugung von verkürztem VZV-gp befähigt ist, das aus Säugetierzellen in einen Wirtsorganismus in vivo sezerniert werden kann.
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids mit einem sekretorischen verkürzten VZV-gpI (als TgpIBglII oder VVTgpIBglII bezeichnet), das das e1- Epitop trägt, und die Herstellung eines Proteins durch den Vaccinia-Virus-Expressionsvektor in Säugetierzellen gemäß den hier gemachten Angaben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids mit einem sekretorischen verkürzten VZV-gpI (als TgpIXmaIII oder VVTgpIXmaIII bezeichnet) und die Herstellung dieses Proteins durch den Vaccinia-Virus-Expressionsvektor in Säugetierzellen gemäß den hier gemachten Angaben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Herstellung und die Verwendung einer Impfstoffzusammensetzung für die Behandlung von Windpocken und/oder Gürtelrose.
Bisher verwendete Impfstoffe umfassen im allgemeinen (I) einen Impfstoff vom Typ eines abgeschwächten Lebendvirus, wobei das Virus durch irgendeine Form von genetischer Abschwächung avirulent gemacht, jedoch nicht abgetötet worden ist; oder (II) spezifische virale Komponenten, die aus dem Virus isoliert und gereinigt und mit Formalin oder durch eine andere chemische oder physikalische Behandlung inaktiviert worden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft Impfstoffe vom Typ II, wobei es sich bei den spezifischen viralen Komponenten, die aus dem Virus isoliert und gereinigt und mit Formalin oder durch andere Behandlungen inaktiviert worden sind, um sekretorisches verkürztes VZV-gp handelt. Sofern in der Beschreibung und den Ansprüchen nichts anderes angegeben ist, hat VZV-gp die Bedeutung VZV-gpI, -gpII, -gpIII, -gpIV oder -gpV. Ferner ist der in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Ausdruck "verkürzt" als ein Segment des VZV-gp von unbestimmter Größe (jedoch nicht das VZV-gp von voller Größe) definiert, wobei ein wesentlicher Teil (oder die Gesamtheit) der Aminosäuresequenz der C-terminalen Region deletiert worden ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung eines rekombinanten sekretorischen verkürzten VZV-gp zur Verwendung in einem Impfstoff gegen VZV.
In einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf einen Impfstoff vom Typ II abgestellt, der sekretorisches verkürztes VZVgp enthält.
Unter Impfstoff ist ein Mittel zu verstehen, das zur Stimulierung des Immunsystems eines lebenden Organismus verwendet wird, so dass ein immunologischer Schutz gegen zukünftige Schädigungen, die durch ein infektiöses Agens hervorgerufen werden, gewährleistet wird. Die Verabreichung eines erfindungsgemäß in Betracht kommenden Impfstoffes an einen Patienten (oder ein Tier) kann durch beliebige bekannte oder standardmäßige Techniken vorgenommen werden. Hierzu gehören die orale Einnahme, die intestinale Intubation oder ein bronchonasales Spray. Weitere Verfahren zur Verabreichung, wie eine intravenöse Injektion, die es dem Träger-Mikroorganismus ermöglichen, den Blutkreislauf des Menschen oder Tiers zu erreichen, können akzeptabel sein, wenn der Träger-Mikroorganismus zur Reproduktion unfähig ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Test für VZV und zusätzlich ein diagnostisches Kit für den Nachweis von VZV-Antikörpern bei verschiedenen klinischen Erscheinungen einer VZV-Infektion und bei geimpften Personen.
Die vorliegende Erfindung stellt gegenüber früheren Versuchen zur Bereitstellung von VZV-gp-Protein einen Fortschritt dar. Früher wurde das bekannte Gen für VZV-gpI in ein Plasmid inseriert und einem Vaccinia-Virus-Expressionssystem einverleibt. Jedoch blieb das durch dieses Expressionssystem erzeugte VZV-gpI intrazellulär, d. h. innerhalb der Säugetierzellen, so dass es nicht gelang, eine antigene Aktivität (die Bildung von Antikörpern) zu ermöglichen. Erfindungsgemäß wurde ein Expressionsvektor in Vaccinia-Virus aufgefunden, der zur Bildung, d. h. zur Expression, eines verkürzten VZV-gp, z. B. gpI, gpII, gpIII, gpIV oder gpV, befähigt ist, das aus Säugetierzellen sezerniert wird. Dieses verkürzte gp enthält ferner ein Epitop, das die Bildung von neutralisierenden Antikörpern in den betroffenen Wirten verursacht. Das VZV-gp-Gen wird im pGEM-Transkriptionsvektor geklont, mit Restriktionsenzymen, z. B. mit den EcoRI- und Bglil-Restriktionsenzymen gespalten (um einen Teil oder die Gesamtheit der C-terminalen Region zu entfernen), stumpfendig gemacht und an der SmaI-Stelle des Vaccinia-Virus-Insertionsvektors pSC11 gemäß der Darstellung in Fig. 1 geklont.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Konstruktion eines rekombinanten DNA-Expressionsvektors gemäß den folgenden Angaben. Ein 592 bp-DNA-Fragment, das 17 bp aus dem pGEM-4- Polylinker stromaufwärts von der SmaI-Stelle und 575 Nucleotide (die Nucleotide 115712 bis 116287 des VZV-Genoms) enthält, wird mit EcoRI bzw. BglII aus rekombinantem pGEM, das ein stumpfendiges VZV-BglI-DNA-Fragment (Nucleotide 115712 bis 118181) mit einem Gehalt an gpI-offenem Leseraster trägt, gespalten (Davison und Scott, a.a.O., (1986), S. 1800-1801; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Die verkürzte gpI (TgpI)-DNA, die für die N-terminale Region von gpi mit 159 Aminosäureresten und einer geschätzten Größe von 17,5 kDa kodiert, wird stumpfendig gemacht und an der SmaI-Stelle des pSC11-Plasmidvektors (Fig. 1) geklont und in das Vaccinia-Genom inseriert, wie in den Beispielen beschrieben ist. Das verkürzte gpI (TgpIBglII) enthält das e1-Epitop, das sich innerhalb von 14 Aminosäureresten zwischen den Resten 109 bis 123 der vorhergesagten Aminosäuresequenz von VZV-gpi befindet (Vafai et al., a.a.O., (1988); Vafai et al., a.a.O., (1989)). Dem TgpIBglII fehlen die 464 Aminosäurereste an der C-terminalen Region von gpI, die offensichtlich die Membranverankerungsregion von gpI umfasst.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Konstruktion eines rekombinanten Expressionsvektors auf folgende Weise. Ein 1647 bp-DNA-Fragment, das 17 bp aus dem pGEM-4-Polylinker stromaufwärts von der SmaI-Stelle und 1630 VZV-Nucleotide (Nucleotide 115712 bis 117342 des VZV-Genoms) enthält, wird mit EcoRI bzw. XmaIII aus rekombinantem pGEM, das ein stumpfendiges VZV-BglI- DNA-Fragment (Nucleotide 115712 bis 118181) trägt und einen gpI-offenen Leseraster enthält (Davison und Scott, a.a.O., (1986), S. 1800-1801), gespalten. Die verkürzte gpI (TgpIXmaIII)-DNA, die für die N-terminale Region von gpI mit 511 Aminosäureresten kodiert, wurde stumpfendig gemacht und an der SmaI-Stelle des pSC11-Plasmidvektors geklont und in das Vaccinia-Virus-Genom inseriert, wie in den Beispielen beschrieben ist. Dem TgpIXmaIII fehlen die 112 Aminosäurereste an der C-terminalen Region von gpI, die offensichtlich die Membranverankerungsregion von gpI umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist auf einen rekombinanten DNA-Expressionsvektor gemäß den vorstehenden Angaben abgestellt, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die dazu befähigt ist, in einem infizierten, transfizierten oder transformierten Wirt ein Tgp zu exprimieren, das extrazellulär aus dem Wirt sezerniert wird und das dazu befähigt ist, eine Antikörperreaktion in Säugetieren hervorzurufen. Vorzugsweise handelt es sich um ein reifes Polypeptid, das durch die folgende Sequenz mit 159 Aminosäuren definiert ist (SEQ ID N0: 1):
Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe 15
Giy Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala 30
Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu 45
Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala 60
Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr 75
Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly 90
Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly 105
Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu Arg Leu Het Gln Pro Thr Gln Met 120
Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile 135
Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp 150
Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys 159
oder um ein reifes Polypeptid, das durch die folgende Sequenz mit 511 Aminosäuren definiert ist (SEQ ID N0: 2):
Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe 15
Gly Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala 30
Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu 45
Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala 60
Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr 75
Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg. Asn Asp Tyr Asp Gly 90
Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asrt Gln Gly 105
Arg Gly Ile Asp Ser Gly GLu Arg Leu Met GLn Pro Thr Gln Met 120
Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile 135
Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp 150
Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys 165
Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His 180
Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Asg Ile Tyr Gly Val Arg 195
Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys Thr Gly 210
Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr Thr 225
Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr 240
Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys 255
Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Vei Asn Thr Ser Thr Leu 270
Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val 285
Leu Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile 300
Trp Asn Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe 315
Leu Val Thr Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro 330
Ala Val Thr Pro Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Het Trp Asn 345
Tyr His Ser His Val Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala 360
Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu 375
Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Het 390
Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro Asn Ala Pro Gln Cys 405
Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr Ser Pro His Leu 420
Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys Glu His Ala 435
Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met Glu Pro 450
Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys Phe 465
-Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val 480
Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser 495
Thr Val Asp Mis Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro 510
Pro 511
Beim erfindungsgemäß in Betracht kommenden infizierten, transfizierten oder transformierten Wirt kann es sich um Säugetierzellen, z. B. um Nierenzellen der grünen Meerkatze (BSC-1), COS-Affenzellen, HeLa-Zellen, Hamster-Nierenzellen und humane Fibroblastenzellen, handeln. Ferner kommen beliebige menschliche Gewebe als geeignete Wirte in Frage. Die vorliegende Erfindung betrifft die Tatsache, dass die infizierte, transformierte oder transfizierte Zelle gemäß den vorstehenden Ausführungen zur Produktion und Sekretion von Tgp (verkürztes VZV-Glycoprotein) und vorzugsweise von TgpIBglII gemäß der Definition in SEQ ID N0: 1 oder TgpIXmaIII durch den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Expressionsvektor veranlasst wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch weitere sekretorische TgpIs. Weitere TgpIs mit einem Gehalt an anderen immunogenen Epitopen lassen sich durch Klonieren und Exprimieren verschiedener verkürzter gpI-Gene erzeugen. Die weiteren gpIs lassen sich beispielsweise unter Verwendung der folgenden Restriktionsenzyme erhalten:
a) EcoPI und EcoRI, wobei EcoPI am Nucleotid 115751 spaltet und zur Bildung einer Sequenz mit 276 Aminosäuren führt;
b) BstE2 und EcoRI, wobei BstE2 am Nucleotid 116754 spaltet und zur Bildung einer Sequenz mit 316 Aminosäuren führt;
c) Ndel und EcoRI, wobei Ndel am Nucleotid 116831 spaltet und zur Bildung einer Sequenz mit 341 Aminosäuren führt;
d) EcoRI und EcoRI, wobei EcoRI am Nucleotid 117034 spaltet und zur Bildung einer Sequenz mit 408 Aminosäuren führt.
Die erfindungsgemäß in Betracht kommenden, verschiedenen TgpI-Typen gemäß den vorstehenden Ausführungen sind speziell so konstruiert, dass der Bereich der C-terminalen Region der Nucleotidsequenz beseitigt ist, der für die Region von VZV-gp kodiert, die die extrazelluläre Expression dieses VZV-gp (z. B. gpI, gpII, gpIII, gpIV oder gpV) verhindert, d. h. offensichtlich durch Beseitigung der Membranverankerungsregion des kodierten Proteins. Bei der Herstellung von geeigneten Expressionsvektoren für derartige verkürzte sekretorische Proteine ist es ferner erforderlich, mindestens ein Epitop, z. B. el, beizubehalten, so dass das kodierte Tgp (extrazellulär sezerniert) im Wirt eine Antikörperreaktion hervorruft. Mit den erfindungsgemäßen Erkenntnissen ist der Fachmann dazu in der Lage, verschiedene geeignete Expressionsvektoren zur Verwendung als Impfstoffe und Nachweissysteme, die alle erfindungsgemäß in Betracht kommen, zu konstruieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Modifikation des vorstehend beschriebenen rekombinanten DNA-Expressionsvektors, so dass man weitere verkürzte VZV-gps (z. B. II, III, IV oder V) erhält. Die DNA-Sequenz für VZV-gpII wird beispielsweise bei Davison und Scott, J. Gen. Virol., Bd. 67 (1986), S. 1759-1816, insbesondere S. 1780-1781, beschrieben. Die DNA-Sequenz für VZV-gpIII findet sich bei Davison und Scott, (1986), S. 1784. Die DNA-Sequenz für VZV-gpIV findet sich bei Davison und Scott, (1986), S. 1800. Die DNA-Sequenz für VZV-gpV findet sich bei Davison und Scott, (1986), S. 1768-1769. Auf der Grundlage der erfindungsgemäßen Lehre kann der Fachmann somit einen Expressionsvektor konstruieren, der die entsprechenden verkürzten VZV-gpII-, -gpIII-, -gpIV- oder -gpV-Gene enthält, die zur Expression von sekretorischem TgpII, TgpIII, TgpIV oder TgpV befähigt sind.
Die der Erfindung zugrunde liegenden Befunde sind auf die Deletion der nativen (natürlicherweise vorkommenden) VZV-DNA, die für die C-terminale Region von gpII, gpIII, gpIV oder gpV kodiert, abgestellt, wie vorstehend für gpI beschrieben wurde, was zur Bildung von TgpII, TgpIII, TgpIV oder TgpV führt, die in den Außenbereich von Säugetierzellen sezerniert werden können und in vivo zu einer antigenen Aktivität, d. h. zur Stimulation einer Antikörperbildung, führen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines sekretorischen verkürzten Varicella-Zoster-Virus-gp. Dieses Verfahren besteht aus den folgenden Stufen:
a) Bereitstellen eines Vektors, der eine Nucleotidsequenz, die für das Polypeptid kodiert, umfasst, wobei die Nucleotidsequenz zur Expression durch einen den Vektor enthaltenden Wirt befähigt Ist und wobei die Nucleotidsequenz aus der Gruppe von Nucleinsäuren ausgewählt ist, die zur Kodierung (mit kontinuierlicher Nucleotidsequenz) eines Varicella-Zoster- Virus-gp befähigt sind, wobei ein wesentlicher Teil des VZV-gp-Genoms, der für die C-terminale Region des gp kodiert, deletiert ist und wobei das gp extrazellulär aus dem Wirt sezerniert wird und mindestens ein Epitop umfasst, das eine Antikörperreaktion in einem Säugetierwirt bewirkt, z. B. für ein Polypeptid des offenen Leserasters gemäß der Definition durch die Sequenz mit 159 Aminosäuren von SEQ ID N0: 1 oder ein Polypeptid des offenen Leserasters gemäß der Definition durch die Sequenz mit 159 Aminosäuren von SEQ ID N0: 2;
b) Einverleiben des Vektors in den Wirt; und
c) Belassen des den Vektor enthaltenden Wirts unter Bedingungen, die für die Expression der Nucleotidsequenz zum Polypeptid geeignet sind.
Dieses Verfahren kann einen Promotor umfassen, der funktionell mit der Nucleotidsequenz verbunden ist. Dieses Verfahren betrifft ferner die Nucleotidsequenz, die eine Region von Nucleotiden umfasst, die zur Kodierung einer Leader-Sequenz befähigt sind.
Die Expression von rekombinantem Vaccinia-Virus, das das Tgp (VVTgp) trägt, lässt sich durch Infektion beispielsweise von BSC-1-Zellen mit Tgp, wie VVTgpI, und durch Immunopräzipitation von Zelllysaten mit einer Gruppe von MAbs, die gegen VZV-gpI, -gpII, -gpIII, -gpIV und ein VZV-se ropositives Humanserum hergestellt worden sind, oder durch andere herkömmliche Maßnahmen, die dem Fachmann geläufig sind, analysieren.
Im Hinblick auf die Tatsache, dass das Tgp aus den infizierten Zellen sezerniert wird, lassen sich Zellen mit Tgp, z. B. VVTgpI infizieren und radioaktiv markieren.
Antikörper gegen Tgp, z. B. VVTgpI, lassen sich beispielsweise in Kaninchen erzeugen (z. B. Ränti-VVTgpI gemäß den Angaben in den Beispielen). Diese Antikörper lassen sich testen, um festzustellen, ob Tgp, z. B. VVTgpI, dazu befähigt ist, eine Antikörperreaktion hervorzurufen, die durch VZV-gp erkannt wird. Säugetierzellen, z. B. BSC-1-Zellen lassen sich mit VZV infizieren und in Abwesenheit oder Gegenwart von Tunicamycin radioaktiv markieren (Vafai et. al., (1989)). Das erfindungsgemäße Tgp ist dazu befähigt, eine Antikörperreaktion zu induzieren, die durch natives Epitop erkannt wird (z. B. el in TgpI gemäß der Definition durch SEQ ID N0: 1) und zur Neutralisation von VZV-Infektiosität in Gegenwart von Komplement befähigt ist.
Erfindungsgemäße Vaccine lassen sich parenteral verabreichen (z. B. durch intramuskuläre, subkutane oder intravenöse Injektion. Die erforderliche Menge variiert mit der Antigenizität des Genprodukts und muss lediglich ausreichen, um eine Immunreaktion zu induzieren, die für existierende Impfstoffe typisch ist. Durch routinemäßige Versuche lässt sich leicht die erforderliche Menge festlegen. Typische Anfangsdosierungen des Impfstoffes können etwa 0,001 bis 100 mg Antigen/kg Körpergewicht betragen, wobei steigende Mengen oder Mehrfachdosierungen je nach Bedarf herangezogen werden, um den gewünschten Grad des Schutzes zu erreichen.
Beim pharmazeutischen Trägerstoff, in dem der Impfstoff suspendiert oder gelöst werden kann, kann es sich um ein beliebiges Lösungsmittel oder einen Feststoff handeln, der gegenüber dem geimpften Tier nichttoxisch ist und mit dem Trägerorganismus oder dem Antigen-Genprodukt verträglich ist. Zu geeigneten pharmazeutischen Trägerstoffen gehören flüssige Trägerstoffe, wie normale Kochsalzlösung und andere nicht-toxische Salze in physiologischen oder nahezu physiologischen Konzentrationen und feste Trägerstoffe, wie Talcum oder Saccharose. Adjuvantien, wie komplettes oder inkomplettes Freund-Adjuvans, können zugesetzt werden, um die Antigenizität über die Bronchialröhren zu steigern, wobei der Impfstoff geeigneterweise in Form eines Aerosols vorliegt. Auffrischungsimmunisierungen können mit günstigen Ergebnissen mehrfach wiederholt werden.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zum Stimulieren der Immunreaktion gegen Windpocken und Gürtelrose bei einem Säugetierwirt abgestellt. Dieses Verfahren besteht in der Verabreichung einer wirksamen Menge von sekretorischem VZV-Tgp (z. B. TgpI, TgpII, TgpIII, TgpIV oder TgpV) unter Bedingungen, die ausreichen, die Bildung von Antikörpern gegen das Tgp hervorzurufen. Derartige Bedingungen sind vom Fachmann leicht zu erkennen. Die wirksame Dosierungsmenge beträgt 0,001-100 mg des sekretorischen VZV-Tgp/kg Körpergewicht.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch monoklonale oder polyklonale Antikörper, die sich zur therapeutischen Bekämpfung von Windpocken und/oder Gürtelrose eignen. Diese Antikörper lassen sich auf die vorstehend beschriebene Art und Weise und durch Injektion des inaktivierten Tgp oder von Derivaten davon an Säugetierspezies, z. B. Menschen, Pferde, Kaninchen, Schafe, Mäuse und dergl., und durch anschließende Reinigung dieser Antikörper unter Verwendung der in Betracht kommenden und nachstehend ausführlich beschriebenen Nachweissysteme herstellen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Entwicklung von spezifischen humanen oder anderen (z. B. Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze, COS-Affenzellen, HeLa-Zellen oder Zellen des chinesischen Hamsters) polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen sekretrorisches VZV-Tgp (I, II, III, IV oder V) sowie polyklonalen oder monoklonalen, chimären Mensch-Maus-Antikörpern zur Verabreichung bei der passiven Immunisierung gegen Windpocken und/oder Gürtelrose. Die Immunisierung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herbeiführung eines anhaltenden hohen Antikörperspiegels in einem Organismus, d. h. bei Menschen, wobei der Antikörper gegen ein Antigen gerichtet ist, dem der Organismus vorher ausgesetzt war.
Eine passive Immunisierung betrifft gemäß der hier geltenden Definition die Resistenz (z. B. ein temporärer oder anhaltender Schutz gegen Infektionen) auf der Grundlage der Verabreichung von vorher gebildeten Antikörpern aus einer in vivo- oder in vitro-Quelle an einen Patienten. Der Hauptvorteil der passiven Immunisierung besteht in der raschen Verfügbarkeit von großen Mengen an Antikörpern gegen VZV gemäß den Angaben in der vorstehenden Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Ein chimärer Antikörper bedeutet gemäß der hier geltenden Definition ein Antikörpermolekül, das durch rekombinante DNA-Technik unter Beteiligung von Immunoglobulingenen zweier unterschiedlicher Spezies hergestellt worden ist. Der chimäre Mensch-Maus-Antikörper wird durch Kombination des Fab-Teils des Mäuse-Immunoglobulingens und des Fc-Teils des humanen Immunoglobulingens durch rekombinante DNA-Technik hergestellt. Die Herstellung von chimären Mensch-Maus-Antikörpern ist vorteilhaft, da sich durch dieses System große Mengen an Antikörpern bilden lassen und chimäre Human-Maus-Antikörper durch Zellen des humanen Immunsystems erkannt werden, während nicht-chimäre Antikörper nicht ebenso leicht durch Zellen (z. B. phagozytische Zellen) des humanen Immunsystems erkannt werden. Die chimären Antikörper lassen sich in großen Mengen im Mäusesystem erzeugen und können VZV erkennen, wie es erfindungsgemäß in Betracht kommt. Ferner wurde festgestellt, dass Human-Maus-Immunoglobuline große Mengen an Antikörpern in Hefe bilden. Dieses System kommt ebenfalls hier in Betracht. Die folgenden Druckschriften erörtern die Methoden zur Herstellung derartiger Antikörper und werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht: Morrison et al., P.N.A.S., Bd. 81 (1984), S. 6851; Horowitz et al., P.N.A.S. Bd. 85 (1988), S. 8678; und Tao et al., J. Immunol., Bd. 143 (1989), S. 2595.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend beschriebenen Antikörper in einem Nachweisassay (Immunoassay) für VZV.
Ein breiter Bereich von Immunoassaytechniken steht für die erfindungsgemäße Anwendung bereit, wie sich beispielsweise aus US-4 016 043, US-4 424 279, US-4 018 653 und Harlow et al., a.a.O., ergibt. Dies umfasst selbstverständlich Assays vom nicht-kompetitiven Typ sowohl mit einer Stelle als auch mit zwei Stellen oder den "Sandwich"-Typ sowie herkömmliche kompetitive Bindungsassays. Sandwich-Assays gehören zu den geeignetsten und gebräuchlichsten Assays und werden für die vorliegende Erfindung bevorzugt. Es gibt eine Anzahl von Variationen der Sandwich- Assaytechnik, die alle für die vorliegende Erfindung vorgesehen sind.
In einem typischen orientierenden Assay wird ein unmarkierter Antikörper in einem festen Substrat immobilisiert. Die zu testende Probe wird mit dem gebundenen Molekül in Kontakt gebracht. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer für eine Zeitspanne, die zur Bildung eines binären Antikörper-Antigen-Komplexes ausreicht, wird ein zweiter Antikörper, der mit einem Reportermolekül, das zur Bildung eines nachweisbaren Signals befähigt ist, markiert ist, zugesetzt und für eine Zeitspanne, die zur Bildung eines ternären Komplexes des Antikörpers und des markierten Antikörpers ausreicht, inkubiert. Etwaiges nicht-umgesetztes Material wird ausgewaschen. Das Vorliegen des Antigens wird durch Beobachtung des sichtba ren Signals, das vom Reportermolekül erzeugt wird, bestimmt. Die Erfassung der Ergebnisse kann entweder qualitativ durch einfache Beobachtung des sichtbaren Signals oder quantitativ durch Vergleich mit einer Kontrollprobe, die bekannte Mengen an Hapten enthält, erfolgen.
Zu Variationen des orientierenden Tests gehören ein gleichzeitiger Test, bei dem sowohl die Probe als auch markierter Antikörper gleichzeitig zum gebundenen Antikörper zugegeben werden oder ein umgekehrter Test, bei dem markierter Antikörper und die zu testende Probe zuerst vereinigt und inkubiert werden und anschließend der unmarkierte, oberflächenmarkierte Antikörper zugesetzt wird. Diese Techniken sind dem Fachmann geläufig. Die Möglichkeiten für kleinere Variationen sind für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
Der hier verwendete Ausdruck "Sandwich-Assay" bezieht sich auf sämtliche Variationen der grundlegenden Doppelstellentechnik. Beispielsweise können diese Antikörper zum Nachweis von sekretorischem Tgp, z. B. TgpI, TgpII, TgpIII, TgpIV, TgpV oder insbesondere von sekretorischem gpI gemäß der Definition durch SEQ ID N0: 1, unter Verwendung von spezifischen Antigendeterminanten (z. B. e1-Epitop) als immobilisierten Immunoadsorbentien verwendet werden. Serum wird aus den zu testenden Subjekten erhalten. Dieses Serum wird mit immobilisierten, viralen Immunoadsorbentien in Kontakt gebracht. Wenn dieses Serum Antikörper gegen die Immunoadsorbentien enthält, ergibt sich die Bildung eines Antikörper-Adsorbens-Konjugats. Nach Entfernen von überschüssigem Serum und ungebundenen Antikörpern wird ein zweiter Antikörper, der für den ersten Antikörper spezifisch ist (wobei der erste Antikörper zur Bildung eines Konjugats mit dem Immunoadsorbens befähigt ist), zugegeben, was zur Bildung eines doppelten Antikörper-Adsorbens-Konjugats führt. Dieses doppelte Antikörper-Adsorbens-Konjugat entsteht nur, wenn das Testserum Antikörper gegen das Immunoadsorbens enthält. Infolgedessen können standardmäßige Nachweistechniken zur Identifizierung des Konjugats verwendet werden.
Bei einem weiteren Immunoassay, dem kompetitiven Bindungsassay, wird eine begrenzende Menge eines für das Molekül von Interesse (entweder ein Antigen oder ein Hapten) spezifischen Antikörpers mit bestimmten Volumina von Lösungen, die eine unbekannte Menge des nachzuweisenden Moleküls enthalten, und einer Lösung, die eine nachweisbar markierte, bekannte Menge des nachzuweisenden Moleküls oder eines Analogen davon enthält, vereinigt. Markierte und unmarkierte Moleküle konkurrieren sodann um die verfügbaren Bindungsstellen am Antikörper. Eine Phasentrennung der freien und antikörpergebundenen Moleküle erlaubt die Messung der in jeder Phase vorhandenen Markierungsmenge, was einen Hinweis auf die Menge an Antigen oder Hapten in der zu testenden Probe ergibt. Derzeit gibt es eine Anzahl von Variationen dieses allgemeinen kompetitiven Bindungstests.
Bei beliebigen der bekannten Immunoassays wird für praktische Zwecke einer der Antikörper für das Antigen (sekretorisches, verkürztes VZV-gp) typischerweise an eine feste Phase gebunden und ein zweites Molekül, bei dem es sich entweder bei einem Sandwich-Test um den zweiten Antikörper oder bei einem kompetitiven Test um die bekannte Antigenmenge handelt, trägt eine nachweisbare Markierung oder ein Reportermolekül, um einen sichtbaren Nachweis der Antikörper-Antigen-Reaktion zu ermöglichen. Bei Verwendung von zwei Antikörpern, wie beim Sandwich-Test, ist es lediglich erforderlich, dass einer der Antikörper spezifisch beispielsweise für sekretorisches, verkürztes VZV-gpI, -II, -III, -IV oder -V ist. Die folgende Beschreibung bezieht sich auf eine Erörterung eines typischen orientierenden Sandwich-Tests. Jedoch sind die allgemeinen Techniken so zu verstehen, dass sie auch auf beliebige der in Frage kommenden Immunoassays angewendet werden können.
Beim typischen orientierenden Sandwich-Test wird ein erster Antikörper mit Spezifität beispielsweise für sekretorisches TgpI, -II, -III, -IV oder -V oder das reife Polypeptid gemäß der Definition durch SEQ ID N0: 1 oder dessen antigene Fragmente entweder kovalent oder passiv an eine feste Oberfläche gebunden. Bei der festen Oberfläche handelt es sich typischerweise um Glas oder um ein Polymeres. Die gebräuchlichsten Polymeren sind Cellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polypropylen. Die festen Träger können in Form von Röhrchen, Kügelchen, Scheiben oder Mikroplatten oder in Form von beliebigen anderen Oberflächen, die sich zur Durchführung eines Immunoassays eignen, vorliegen. Die Bindungsverfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt und bestehen im allgemeinen aus einer Vernetzung, kovalenten Bindung oder physikalischen Adsorbtion des Moleküls an den unlöslichen Träger. Im Anschluss an die Bindung wird der Polymer-Antikörper-Komplex bei der Vorbereitung der Testprobe gewaschen. Eine Aliquotmenge der zu testenden Probe wird sodann zum Festphasenkomplex gegeben und bei 25ºC für eine Zeitspanne, die zur Bindung von etwaigen im Antikörper vorhandenen Untereinheiten ausreicht, inkubiert. Die Inkubationsdauer kann variieren, liegt aber üblicherweise im Bereich von etwa 2-40 Minuten. Im Anschluss an die Inkubationsdauer wird die Antikörper-Untereinheit-Festphase gewaschen, getrocknet und mit einem zweiten Antikörper, der für einen Teil des Haptens spezifisch ist, inkubiert. Der zweite Antikörper ist mit einem Reportermolekül verknüpft, das zur Anzeige der Bindung des zweiten Antikörpers an das Hapten verwendet wird.
Unter dem in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Ausdruck "Reportermolekül" ist ein Molekül zu verstehen, das aufgrund seiner chemischen Natur ein analytisch identifizierbares Signal liefert, das den Nachweis von antigengebundenem Antikörper erlaubt. Der Nachweis kann entweder qualitativ oder quantitativ sein. Die gebräuchlichsten Reportermoleküle bei diesem Testtyp sind Moleküle, die Enzyme, Fluorophore oder Radionucleotide enthalten.
Im Fall eines Enzym-Immunoassays (EIA) wird ein Enzym mit dem zweiten Antikörper konjugiert, im allgemeinen mittels Glutaraldehyd oder Periodat. Wie jedoch leicht erkennbar ist, gibt es eine Vielzahl von verschiedenen Konjugationstechniken, die für den Fachmann leicht verfügbar sind. Zu üblicherweise verwendeten Enzymen gehören unter anderem Meerrettich-peroxidase, Glucose-oxidase, β-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Die zusammen mit den spezifischen Enzymen zu verwendenden Substrate werden im allgemeinen so gewählt, dass sich bei der Hydrolyse durch das entsprechende Enzym eine nachweisbare Farbänderung ergibt. Beispielsweise eignet sich p-Nitrophenylphosphat zur Verwendung zusammen mit Konjugaten von alkalischer Phosphatase. Für Peroxidase-Konjugate werden üblicherweise 1,2-Phenylendiamin, 5-Aminosalicylsäure oder Tolidin verwendet. Ferner ist es möglich, fluorogene Substrate zu verwenden, die statt der vorerwähnten chromogenen Substrate ein fluoreszierendes Produkt ergeben.
Der enzymmarkierte Antikörper wird zum ersten Komplex aus Antikörper und Hapten gegeben. Man lässt ihn eine Bindung eingehen und wäscht dann überschüssiges Reagenz aus. Eine Lösung, die das geeignete Substrat enthält, wird södann zu dem ternären Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex gegeben. Das Substrat reagiert mit dem Enzym, das an den zweiten Antikörper gebunden ist, wodurch sich ein qualitatives, sichtbares Signal ergibt, das zusätzlich quantitativ bestimmt werden kann (üblicherweise spektrophotometrisch), wodurch man einen Hinweis auf die Menge des Haptens, die in der Probe vorhanden war, erhält.
Alternativ können fluoreszierende Verbindungen, wie Fluorescein und Rhodamin, chemisch an Antikörper gekuppelt werden, ohne dass man ihre Bindungskapazität verändert. Bei Aktivierung durch Bestrahlung mit Licht einer speziellen Wellenlänge absorbiert der mit dem Fluorochrom markierte Antikörper die Lichtenergie, was zur Bildung eines Zustands der Anregbarkeit im Molekül führt, wonach sich eine Emission des Lichts in einer charakteristischen Farbe anschließt, das mit einem Lichtmikroskop visuell nachweisbar ist. Wie beim EIA lässt man den fluoreszierenden markierten Antikörper eine Bindung mit dem Komplex aus erstem Antikörper und Hapten eingehen. Nach Auswaschen von nicht-gebundenem Reagenz wird der verbleibende ternäre Komplex mit Licht geeigneter Wellenlänge belichtet, wobei die beobachtete Fluoreszenz die Anwesenheit des in Frage stehenden Haptens anzeigt. Immunofluoreszenz- und EIA-Techniken sind gut eingeführt und werden derzeit für das vorliegende Verfahren besonders bevorzugt. Jedoch können auch andere Reportermoleküle, z. B. Radioisotope, chemilumineszierende oder biolumineszierende Moleküle verwendet werden. Für den Fachmann ist es ersichtlich, wie er das Verfahren abändern kann, um die erforderlichen Aufgaben zu erfüllen. Ferner ist es ersichtlich, dass die vorstehenden Ausführungen auch zum direkten oder indirekten (d. h. über Antikörper) Nachweis von VZV verwendet werden können.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von VZV, das das Kontaktieren von Serum, Gewebe oder Gewebeextrakten einer zu testenden Person mit einem Antikörper gegen sekretorisches verkürztes VZV-gp (z. B. gpI, gpII, gpIII, gpIV oder gpV) oder ein aktives Fragment davon für eine Zeitspanne und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erforderlich sind, und den anschließenden Nachweis von etwaigen gebildeten Antikörper-Antigen-Komplexen umfasst. Derartige Bedingungen sind dem Durchschnittsfachmann geläufig.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Kit zum Nachweis von Antikörpern, die in Reaktion auf sekretorisches Tgp (z. B. TgpI, TgpII, TgpIII, TgpIV, TgpV, TgpIBglII gemäß der Definition durch SEQ ID N0: 1 oder TgpIXmaIII gemäß der Definition durch SEQ ID N0: 2) oder dessen antigene Fragmente (Epitop oder Epitope) erzeugt worden sind, wobei das Kit so kompartimentiert ist, dass es einen ersten Behälter, der zur Aufnahme eines Antikörpers mit Spezifität für diesen Antikörper gegen Tgp oder Fragmente davon geeignet ist, und einen zweiten Behälter aufweist, der einen für den ersten Antikörper spezifischen Antikörper enthält und mit einem Reportermolekül, das zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals befähigt ist, enthält. Wenn es sich beim Reportermolekül um ein Enzym handelt, so wird ein dritter Behälter, der ein Substrat für dieses Enzym enthält, bereitgestellt.
Das erfindungsgemäße diagnostische Kit kann zum Nachweis des Antikörperstatus von VZV-Glycoproteinen verwendet werden. Dieses Kit ermöglicht ein rasches Verfahren zur Diagnose und zum Nachweis von VZV bei Personen, die verschiedene klinische Anzeichen von VZV aufweisen, sowie bei geimpften Personen.

Beispiele

1) Materialien und Methoden

Varicella-Zoster-Virus (VZV) Stamm VZV86, der ursprünglich aus einem Patienten mit Zoster isoliert worden war, wurde in Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (BSC-1) nach dem von Vafai et al. (Virus Res., Bd. 13 (1989), S. 319-336) beschriebenen Verfahren gezüchtet und vermehrt. Vaccinia-Virus (Stamm IHDJ) wurde in BSC-1 Zellen bis zu einer Multiplizität der Infektion (m.o.i.) von 0,01 plaquebildenden Einheiten (PFU) gemäß den Angaben von Cabirac et al. (Virus Res., Bd. 10 (1988), S. 205-214) gezüchtet.

2) Herstellung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern

Monoklonale Antikörper (MAbs) gegen VZV-Glycoprotein I (gpI) und gpIV (MAb79.7, MAbC1, MAbG7, MAbG6); gpII (MAbF8) und gpIII (MAbE10) wurden gemäß den von Vafai et al., J. Virol., Bd. 52 (1984), S. 953-959; Vafai et al., J. Virol. Bd. 62 (1988), S. 2544-2551; Cabirac et al., Virus Res., Bd. 10 (1988), S. 205-214; und Vafai et al., Virus Res., Bd. 13 (1989), S. 319-336, beschriebenen Verfahren hergestellt. Humanseren wurden von einem Zoster-Patienten 6 Wochen nach Einsetzen des Hautausschlags gewonnen. Antikörper gegen VZV-Virionen wurden in Kaninchen gemäß Vafai et al., Virus Res., Bd. 7 (1987), S. 325-333, hergestellt.

3) Konstruktion von rekombinantem Vaccinia-Virus

Fig. 1 erläutert die Konstruktion des Insertionsvektors, der zur Erzeugung eines rekombinanten Vaccinia-Virus, der ein verkürztes VZV-gpI (VVTgpIBglII) trägt, verwendet wurde. Das rekombinante Plasmid (pGEM-4) mit einem Gehalt an dem VZV-gpI-Gen (Vafai et al., J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 2544-2551) wurde mit BglII stromabwärts vom e1-Epitop an der VZV-Nucleotidsequenz Position 116287 (Davison und Scott, J. Gen. Virol., Bd. 67 (1986), S. 1759-1816) und mit EcoRI in pGEM-4-Polylinker gespalten. Das verkürzte gpI-Gen, das für ein Polypeptid mit 159 Aminosäuren kodiert, wurde der Elektroelution unterzogen, mit T4-DNA-Polymerase gemäß den Angaben von Maniatis et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)) stumpfendig gemacht und in die SmaI-Stelle des Insertionsvektors pSC11 (Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 5 (1985), S. 3403-3409) ligiert. Das rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pVVTgpIBglII) und ist in Fig. 1 dargestellt. Das rekombinante Vaccinia-Virus wurde gemäß dem von Mackett et al., "The Construction and Characterization of Vaccinia Virus Recombinants Expressing Foreign Genes", in DNA Cloning: A Practical Approach, (D.M. Glover, Hrsg.), IRL Press, Oxford (1985), S. 191- 211, beschriebenen Verfahren unter Modifikationen erzeügt. 143B-TK--Zellen (Mackett et al., (1985)) wurden über Nacht in Abwesenheit von Bromdesoxyuridin (BudR) gezüchtet und sodann mit Vaccinia-Virus (Stamm IHDJ) mit einem m.o.i.-Wert von 0,01 PFU infiziert und 90 Minuten bei 37ºC inkubiert. Infizierte Zellen wurden sodann mit 30 ug pVVTgpI und 50 ug Lipofectin-Reagenz (BRL) gemäß den Angaben des Herstellers transfiziert. Zellen wurden 48 Stunden nach der Infektion-Transfektion geerntet. Der gebildete Virus-Vorrat wurde einer 2-fachen Passage in TK&supmin;-Zellen in Gegenwart von 25 ug/ml BudR unterzogen. Rekombinantes Vaccinia-Virus wurde von spontanem TK&supmin;-Virus durch Färben mit "bluo-gal" (BRL) unterschieden und klonmäßig durch drei Plaque-Reinigungszyklen isoliert.
Um ein stärker immunogenes, sekretorisches verkürztes VZV-gpI herzustellen, wurde die gleiche Methodik mit der Modifikation angewandt, dass das rekombinante Plasmid (pGEM-4), das das VZV-gpI-Gen enthielt, mit XmaIII an der Position 117342 der VZV-Nucleotidsequenz und mit EcoRI (anstelle von BglII und EcoRI) gespalten wurde. Das verkürzte gpI-Gen, das für die N-terminale Region von gpI mit 511 Aminosäureresten kodiert, wurde gemäß den vorstehenden Angaben der Elektroelution unterzogen, stumpfendig gemacht und in pSC11 ligiert. Das rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pVVTgpIXmaIII. Das rekombinante Vaccinia-Virus wurde gemäß den vorstehenden Angaben erzeugt und erhielt die Bezeichnung VVTgpIXmaIII.

4) Expression von rekombinantem Vaccinia-Virus

Die Expression von rekombinantem Vaccinia-Virus, das das verkürzte VZV-gpI-Gen trägt (mit der Bezeichnung VVTgpIBglII und VVTgpIXmaIII) wurde durch Infektion von BSC-1-Zellen mit VVTgpI bei einem m.o.i.-Wert von 1,0 PFU analysiert. Nach 22-stündiger Inkubation bei 37ºC setzte man die infizierten Zellen 1 Stunde einem Mangel an Methionin in einem methioninfreien Medium aus und markierte sie dann 1 Stunde mit [³&sup5;S]- Methionin (100-200 uCi/ml). Anschließend wurden die Zellen 3-mal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 4 ml Lysis-Puffer (0,02 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,6, 0,1 M NaCl, 1% Triton-X-100, 0,5% Desoxycholat, 0,1% SDS) aufgebrochen. Die Lysate wurden 2 Stunden auf Eis gehalten und sodann 2 Stunden bei 5ºC mit 40 000 U/min in einem Beckman SW60-Rotor zentrifugiert. Die Überstände wurden bis zur Immunopräzipitation mit monoklonalen und polyklonalen Antikörpern gegen VZV- Proteine bei -70ºC gelagert (vergl. Fig. 2 und 3).
Die Ergebnisse in Fig. 2 belegen die Expression eines primären Translationsprodukts von 25 kDa durch VVTgpTBglII, das während der 1- stündigen Markierungsperiode zu einem Polypeptid mit 32 kDa prozessiert wurde. Sowohl das 25 kDa- als auch das 32 kDa-Protein ließen sich durch MAb79.7, das gegen das e1-Epitop gerichtet ist (Vafai et al., (1988)) erkennen. Humanserum reagiert mit der 25 kDa-Spezies (Fig. 2, Bahn 2). Längere Einwirkungszeiten der Gele zeigen eine schwache Reaktivität von Humanserum mit der reifen Form (32 kDa) von TgpI. Das 32 kDa-Protein wurde ferner mit MAbG7 (Fig. 2, Bahn 4) umgesetzt, das die vollständig glycosylierte Form von VZV-gpI erkennt. Jedoch reagiert MAbC1, das gegen VZV-gpI gerichtet ist, jedoch nur von el abweichende Epitope erkennt, nicht mit TgpI (Fig. 2, Bahn 3). Gegen VZV-gpIV (MAbG6), -gpII (MAbF8) und gpIII (MAbE10) gerichtete MAbs reagieren auch nicht mit dem Vorläuferprodukt von TgpI (Fig. 2, Bahnen 5, 6 und 7), was die Spezifität von TgpI für MAb79.7 zeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das durch VVTgpIBglII exprimierte TgpI die native Konformation, die für die Erkennung durch MAb79.7 sowie durch VZV-seropositives Humanserum erforderlich ist, beibehält. Es wurde festgestellt, dass das primäre Translationsprodukt von TgpI mit 25 kDa größer als der erwartete Wert von 17,5 kDa ist, der von 159 Aminosäureresten, die durch TgpI kodiert werden, abgeleitet ist.
Die in Fig. 3 aufgeführten Ergebnisse belegen die Expression eines primären Translationsprodukts mit 60 kDa, das durch VVTgpIXmaIII während der 1-stündigen Markierungsdauer zu einem Polypeptid mit 76 kDa prozessiert wurde. Sowohl das 60 kDa- als auch das 76 kDa-Protein werden durch MAb79.7 und MAbC1, die das Vorläuferprodukt von VZVgpI erkennen, sowie durch MAbG7, das nur die reife Form und die vollständig glycosylierte Form von VZVgpI erkennt, erkannt (Fig. 3, Bahnen 1, 2 und 3). MAbF8 (gegen gpII gerichtet) und MAbF9 (gegen VZV-NCP gerichtet) reagierten nicht mit dem Vorläuferprodukt von TgpI-XmaIII (Fig. 3, Bahnen 4 und 5). Die Reaktivität von MAbC1 mit TgpIXmaIII, jedoch nicht mit TgpIBglII belegt die Anwesenheit von einem oder mehreren zusätzlichen Epitopen an TgpIXmaIII.

5) Analyse von sezerniertem verkürztem VZV-gpI

BSC-1-Zellen wurden mit VVTgpIBglII mit einem m.o.i.-Wert von 1,0 PFU infiziert. Nach 22-stündiger Inkubation wurden die Zellen 10 Minuten einer Pulsmarkierung mit [³&sup5;S]-Methionin (300 uCi/ml) unterzogen. Die Zellen wurden entweder geerntet oder 5-mal mit serumfreiem Medium gewaschen. Die Markierung wurde 1, 2, 3 und 7 Stunden einer "Chase"-Behandlung unterzogen: Nicht-infizierte Zellen wurden 10 Minuten einer Pulsmarkierung und 7 Stunden einer "Chase"-Behandlung unterworfen. Zelllysate wurden gemäß den vorstehenden Angaben hergestellt und mit MAb79.7, das gegen das VZVgpIBglII-Epitop (el) (Vafai et al., J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 2544-2551) gerichtet ist, und mit MAbC1, das gegen VZVgpIBglII gerichtet ist, aber von el abweichende Epitope erkennt, immunopräzipitiert. Gewebekulturflüssigkeiten von nicht-infizierten und mit VVTgpIBglII infizierten Zellen wurden gesammelt und 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Überstände wurden gesammelt. Nach Zugabe von gleichen Volumina an Lysispuffer zu den einzelnen Proben wurden die Proben 2 Stunden bei 5ºC mit 40 000 U/min in einem Beckman SW60-Rotor zentrifugiert. Die Überstände wurden mit MAb79.7 und MAbC1 immunopräzipitiert (vergl. Fig. 4),
Die in Fig. 4 aufgeführten Ergebnisse belegen, dass die Vorstufe TgpIBglII (25 kDa), die in den infizierten Zellen während einer 10-minütigen Pulsmarkierungsdauer nachgewiesen wurde, während der 1-stündigen "Chase"-Behandlung zu einem 32 kDa-Protein prozessiert wurde und dass die Intensität sowohl der 25 kDa- als auch der 32 kDa-Bande während der 7- stündigen "Chase"-Dauer abnahm (Fig. 4, CL). Die Ergebnisse zeigen ferner, dass die reife glycosylierte Form von TgpIBglII (32 kDa) in der Gewebekulturflüssigkeit der infizierten Zellen innerhalb der 1-stündigen "Chase"-Behandlungsdauer auftrat und die Intensität des 32 kDa-TgpIBglII während einer 7-stündigen "Chase"-Behandlung zunahm (Fig. 4, TCF). Diese Ergebnisse zeigen, dass die vollständig prozessierte Form von TgpIBglII aus den infizierten Zellen freigesetzt wird und durch MAb79.7, jedoch nicht durch MAbC1, das nur gegen von el abweichende gpI-Epitope gerichtet ist, erkannt wird. Ferner zeigt die Western-Blot-Analyse des aus den infizierten Gewebekulturflüssigkeiten gereinigten TgpIBglII mit 32 kDa, dass sekretorisches TgpIBglII durch MAb79.7 erkannt wurde.
Kontrollen für diese Experimente wurden durch Infektion von BSC-1- Zellen mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus, der das unverkürzte (volle Größe) VZV-gpI-Gen trug und unverkürztes VZV-gpI (VVgpI) (Cabirac et al., Virus Res., Bd. 10 (1988), S. 205-214) exprimierte, bereitgestellt. Puls- Chase-Versuche wurden auf die vorstehend beschriebene Weise durchgeführt. Im Gegensatz zu VVTgpIBglII zeigte eine Analyse von Zelllysaten und Gewebekulturflüssigkeiten aus VVgpI-infizierten Zellen, dass natives VZV-gpI nicht aus den infizierten Zellen sezerniert wurde (Fig. 5).
Um festzustellen, ob TgpI-XmaIII aus den Zellen sezerniert wird, wurden infizierte Zellen einer 1-stündigen Pulsmarkierung [³&sup5;S]-Methionin unterzogen, mit serumfreiem Medium gewaschen und 2 Stunden mit serumfreiem Medium inkubiert. Gewebekulturflüssigkeiten (TCF) wurden geerntet und mit MAbs auf die vorstehend beschriebene Weise immunopräzipitiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die reife und vollständig glycosylierte Form von TgpIXmaIII aus den Zellen sezerniert wurde und durch anti-qpl-MAbs (Fig. 3, Bahnen 7, 8 und 9), jedoch nicht durch MAbF8 und MAbF9, die gegen VZVgpII bzw. VZV-NCP gerichtet sind (Fig. 1, Bahnen 10 und 11), erkannt wurde.

6) Herstellung von anti-VVTgpI-Antikörpern

Antikörper gegen VVTgpI wurden in einem Kaninchen durch bekannte Immunisierungsverfahren (Vafai et al., Virus Res., Bd. 7 (1987), S. 325- 333; und Virus Res., Bd. 13 (1989), S. 319-336) erzeugt. Ein weißes weibliches Neuseeland-Kaninchen wurde subkutan an mehreren Stellen am Rücken und den Hinterläufen immunisiert. Nach einer Blutentnahme vor der Immunisierung (für Kontrollseren) erhielt das Tier 1 · 10&sup7; PFU/ml VVTgpI. Anschließend erfolgten drei wöchentliche Injektionen mit jeweils 1 · 10&sup7; PFU/ml VVTgpI. Sieben Tage nach der letzten Injektion wurden dem Tier Blut abgenommen. Das Serum (mit der Bezeichnung RAnti-VVTgpI) wurde durch Immunopräzipitation auf die nachstehend beschriebene Weise getestet.

7) Radioaktive Markierung von VZV-infizierten Zellproteinen

VZV wurde in BSC-1-Zellen durch Cokultivierung gezüchtet. Nach 48 Stunden wurden infizierte Zellen 10 Minuten in Abwesenheit oder Anwesenheit von Tunicamycin (15 ug/ml) mit [³&sup5;S]-Methionin (300 pCi/ml) markiert. Die Zellen wurden entweder geerntet oder 3-mal mit serumfreiem Medium gewaschen. Die Markierung wurde 2 Stunden in Abwesenheit oder Gegenwart von Tunicamycin (15 ug/ml) einer "Chase"-Behandlung in normalem Medium unterworfen. Sodann wurden die Zellen 3-mal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Zelllysate wurden auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt und mit RAnti-VVTgpI immunopräzipitiert.

8) Immunopräzipitation

Zelllysate (400 ul) von nicht-infizierten, mit VVTgpIBglII infizierten, mit VVgpI-infizierten und mit VZV-infizierten Zellen und Lysate (500 ul) von Gewebekulturflüssigkeit von nicht-infizierten, mit VVTgpI-infizierten und mit VVgpI-infizierten Zellen wurden 2 Stunden bei 4ºC mit 40 ul einer mit 10% Formalin fixierten Suspension von Protein A enthaltendem Staphylococcus aureus Cowan I (Kesler, J. Immunol., Bd. 115 (1975), S. 1614-1617) inkubiert. Nach 20-minütiger Zentrifugation mit 9000 · g wurden VZV-spezifische Proteine 20 Stunden bei 4ºC in Gegenwart von 50 ul polyklonalen Antikörpern (Humanseren und RAnti-VVTgpI) oder 100 ul monoklonalen Antikörpern gegen VZV-Proteine immunopräzipitiert. Schließlich wurden 30 ul einer mit 10% Formalin fixierten S. aureus-Suspension zugegeben. Nach 2 Stunden bei 4ºC wurden absorbierte Immunkomplexe 3-mal mit Lysispuffer gewaschen und in 20 ul TNE-Puffer (50 mM Tris, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA) suspendiert. Nach Zugabe von 10 ul 3 · Probenpuffer (150 mM Tris, pH-Wert 7,0, 6% SDS, 15% 2-Mercaptoethanol, 0,03% Bromphenolblau) wurde die Suspension 4 Minuten in siedendem Wasser erwärmt, auf Eis gekühlt und durch 8 bis 12% Polyacrylamid-SDS-PAGE gemäß den Angaben von Vafai et al. (J. Virol. Bd. 52 (1984), S. 953-959; und J. Virol., Bd. 62 (1988), S. 2544-2551) analysiert (vergl. Fig. 5).
Zelllysate wurden mit MAbC1, das VZV-gpI und -gpIV erkennt, sowie mit RAnti-VVTgpIBglII immunopräzipitiert und durch SDS-PAGE analysiert. Wie die Figg. 6A und 6B belegen, zeigen die Ergebnisse, dass RAnti- VVTgpIBglII ähnlich wie MAbC1 in Gegenwart oder Abwesenheit von Tunicamycin mit Vorläuferprodukten von nativem VZV-gpI reagiert. Dies zeigt, dass das durch VVTgpIBglII exprimierte e1-Epitop eine Antikörperreaktion induzierte, die durch natives VZV-gpI-e1-Epitop erkannt wird.

9) Neutralisationstest

Neutralisationstests wurden mit der Technik mit konstantem Virus und variierendem Serum gemäß Vafai et al., (1987) durchgeführt. Kurz zusammengefasst, wurden BSC-1-Zellen (108) durch Cokultivation mit VZV infiziert. Nachdem die infizierten Kulturen 3 Tage später 80-90% cytopathische Effekte zeigten, wurden Zellen abgekratzt, in das Gewebekulturmedium gebracht und 20 Minuten bei 4ºC mit 2000 · g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 4 ml serumfreien Medium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde einer "Dounce"-Homogenisation (150 Hübe) auf Eis in einem mit Teflon beschichteten Homogenisator unterworfen. Die Homogenisate wurden 10 Minuten mit 800 · g zentrifugiert. Die Überstände wurden für Neutralisa tionstests verwendet. Aliquotanteile (0,5 ml) mit einem Gehalt an 100-200 PFU wurden mit gleichen Volumina verschiedener Verdünnungen (0,1 : 10, 1 : 50 und 1 : 100) von RAnti-VVTgpI- oder Kaninchen-anti-VZV-Antikörpern (RAnti- VZV), die gegen VZV-Virionen hergestellt worden waren (Vafai et al., (1987)), oder Präimmunseren und 0,25 ml Meerschweinchen-Komplement vermischt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert und auf zwei Vertiefungen mit BSC-1-Zellen, die in Platten mit 6 Vertiefungen gezüchtet worden waren, überimpft. Nach 3-stündiger Inkubation bei 37ºC wurde das Inokulum entfernt. Die Zellen wurden gewaschen und mit Medium mit einem Gehalt an 2% fötalem Kälberserum (FBS) überschichtet und 5-7 Tage bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit Formaldehyd fixiert und mit Cresylviolett gefärbt. Die Plaques wurden gemäß den Angaben von Vafai et al. (1984) gezählt.
Die Ergebnisse zeigen eine Plaquereduzierung von beispielsweise 100% mit der 1 : 10-Verdünnung von RAnti-VZV-Antikörpern gegen gereinigte VZV-Virionen (Vafai et al., (1987)) in Gegenwart oder Abwesenheit von Komplement und eine Plaquereduzierung von 50% mit der 1 : 10-Verdünnung von RAnti-WTqpI in Gegenwart von Komplement.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER: Vafai, Abbas
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Varicella-Zoster Virus Antigen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: Scully, Scott, Murphy & Presser
(B) STRASSE: 400 Garden City Plaza
(C) ORT: Garden City
(D) STAAT: New York
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 11530
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy Disk
(H) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.24
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) Anmeldetag: 3. Oktober 1990
(C) Klassifikation:
(viii) ANGABEN ÜBER DEN ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: DiGiglio, Frank S.
(B) REGISTRIERNUMMER: 31,346
(C) AKTENZEICHEN: 7980
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: (516) 742-4343
(2) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 159 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 1:
Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe 15
Gly Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala 30
Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu 45
Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala 60
Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr 75
Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly 90
Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly 105
Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu Arg Leu Het Gln Pro Thr Gln Met 120
Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile 135
Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp 150
Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys 159
(3) ANGABEN ZU SEQ ID N0: 2
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 511 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID N0: 2:
Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe 15
Gly Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala 30
Ser Vai Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu 45
Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala 60
Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr 75
Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly 90
Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gin Gly 105
Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met 120
Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile 135
Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp 150
Gln Arg Gln Tyr Giy Asp Val Phe Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys 165
Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His 180
Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr Gly Val Arg 195
Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys Thr Gly 210
Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr Thr 225
Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr 240
Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys 255
Lys GLu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu 270
Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val 285
Leu Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile 300
Trp Asn Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe 315
Leu Val Thr Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro 330
Ala Val Thr Pro Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn 345
Tyr His Ser His Val Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala 360
Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu 375
Lau Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp Pro Thr Cys Gln Prv Het 390
Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro Asn Ala Pro Gln Cys 405
Leu Ser His Het Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr Ser Fro His Leu 420
Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys Glu His Ala 435
Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met Glu Pro 450
Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys Phe 465
Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val 480
Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser 495
Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Prv 510
Pro 511

Claims

1. Rekombinanter DNA-Expressionsvektor, umfassend eine Nucleotidsequenz, die dazu befähigt ist, in einem infizierten, transfizierten oder transformierten Wirt ein reifes Polypeptid zu exprimieren, wobei das Polypeptid aus folgender Gruppe ausgewählt ist: die Sequenz mit 159 Aminosäuren von SEQ ID N0: 1, die Sequenz mit 511 Aminosäuren von SEQ ID N0: 2, die Sequenz mit 276 Aminosäuren, die durch einen EcoPI/EcoRI-Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI- Leseraster umfasst, definiert ist, eine Sequenz mit 316 Aminosäuren, die durch einen BstE2/EcoRI-Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster enthält, definiert ist, eine Sequenz mit 341 Aminosäuren, die durch einen NdeI/EcoRI-Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster umfasst, definiert ist, oder eine Sequenz mit 408 Aminosäuren, die durch einen EcoRI-Einzelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster enthält, definiert ist, und wobei das Polypeptid zur extrazellulären Sekretion aus diesem Wirt befähigt ist und dazu befähigt ist, eine VZV-Antikörperreaktion bei Säugetieren hervorzurufen.

2. Rekombinanter DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem infizierten, transfizierten oder transformierten Wirt um Nierenzellen der grünen Meerkatze (BSC-1), COS-Affenzellen, HeLa-Zellen, Hamster-Nierenzellen, humane Fibroblastenzellen oder humane Gewebezellen handelt.

3. Zelle, die mit einem rekombinanten DNA-Expressionsvektor nach Anspruch 1 transformiert oder transfiziert ist, wobei die Zelle durch den Vektor zur Bildung und Sekretion von verkürztem VZV-gpI veranlasst wird.

4. Plasmid, kodierend für ein Varicella-Zoster-Virus-Polypeptid, wobei das Polypeptid aus der in Anspruch 1 aufgeführten Gruppe ausgewählt ist und wobei das Polypeptid extrazellulär von einem Wirt sezerniert werden kann und in einem Säugetier eine VZV-Antikörperreaktion hervorrufen kann.

5. Verfahren zur Herstellung eines sekretorischen, verkürzten Varicella-Zoster-Virus-Glycoproteins, wobei es sich bei dem Glycoprotein um ein aus der in Anspruch 1 aufgeführten Gruppe ausgewähltes Polypeptid handelt, das zur Herbeiführung einer VZV-Antikörperreaktion in Säugetieren befähigt ist, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst;

a) Bereitstellen eines Vektors, der eine für dieses Polypeptid kodierende Nucleotidsequenz umfasst, wobei die Nucleotidsequenz zur Expression durch einen Wirt, der den Vektor enthält, befähigt ist;

b) Einverleiben des Vektors in den Wirt; und

c) Aufrechterhalten des Wirts, der den Vektor enthält, unter Bedingungen, die zur Expression der Nucleotidsequenz unter Bildung des Glycoproteins geeignet sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Vektor einen Promotor einschließt, der funktionell mit der Nucleotidsequenz verbunden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei es sich bei dem Wirt um eine Säugetierzelle handelt und wobei die Nucleotidsequenz ferner eine Region von Nucleotiden einschließt, die für eine Leadersequenz kodieren.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-7, wobei es sich bei den Wirtszellen um Nierenzellen der grünen Meerkatze (BSC-1), COS-Affenzellen, HeLa-Zellen, Hamster-Nierenzellen, humane Fibroblastenzellen oder humane Gewebezellen handelt.

9. Verfahren nach Anspruch 5-8, wobei es sich beim Expressionsvektor um ein Plasmid handelt.

10. Rekombinantes, sekretorisches, verkürztes VZV-gpI, bei dem es sich um ein Polypeptid, das aus der in Anspruch 1 aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, handelt und wobei diese Polypeptide extrazellulär aus Säugetierzellen, in denen die Polypeptide gebildet worden sind, sezerniert werden und wobei die Polypeptide mindestens ein antigenes Epitop einschließen, das zur Herbeiführung einer Antikörperreaktion in einem Säugetierwirt befähigt ist.

11. Impfstoff zur Immunisierung gegen Windpocken und/oder Gürtelrose, umfassend eine wirksame Menge eines rekombinanten, sekretorischen, verkürzten VZV-gpI, bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das aus der in Anspruch 1 aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, und einen herkömmlichen Impfstoffträger.

12. Verwendung des sekretorischen, verkürzten VZV-gp, bei dem es sich um einPolypeptid, das aus der in Anspruch 1 aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, handelt, zur Herstellung eines Impfstoffes zur Stimulätion einer Immunreaktion gegen Windpocken und/oder Gürtelrose.

13. Verfahren zum Diagnostizieren von VZV, umfassend das Kontaktieren von Serum, Gewebe oder Gewebeextrakten eines zu testenden Individuums mit einem Antikörper gegen ein sekretorisches, verkürztes VZV-gp, bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das aus der in Anspruch 1 aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, für eine Zeitspanne und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes notwendig sind, und das Nachweisen von etwaigen entstandenen Antikörper-Antigen-Komplexen.

14. Sekretorisches, verkürztes VZV-gp, bestehend aus SEQ ID N0: 1.

15. Sekretorisches, verkürztes VZV-gp, bestehend aus SEQ ID N0: 2.

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines sekretorischen, verkürzten Varicella-Zoster-Virus-Glycoproteins, wobei es sich beim Glycoprotein um ein aus der folgenden Gruppe ausgewähltes Polypeptid handelt: die Sequenz mit 159 Aminosäuren von SEQ ID N0: 1, die Sequenz mit 511 Aminosäuren von SEQ ID N0: 2, die Sequenz mit 276 Aminosäuren, die durch einen EcoPI/EcoRI- Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster umfasst, definiert ist, eine Sequenz mit 316 Aminosäuren, die durch einen BstE2/EcoRI-Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster- Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster enthält, definiert ist, eine Sequenz mit 341 Aminosäuren, die durch einen NdeI/EcoRI-Doppelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster umfasst, definiert ist, oder eine Sequenz mit 408 Aminosäuren, die durch einen EcoRI-Einzelverdau eines DNA-Fragments, das die Nucleotide 115712 bis 118181 von Glycoprotein I von Varicella-Zoster-Virus überspannt und einen offenen gpI-Leseraster enthält, definiert ist, wobei das Polypeptid dazu befähigt ist, eine VZV-Antikörperreaktion bei Säugetieren hervorzurufen, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

b) Einverleiben des Vektors in den Wirt; und

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Vektor einen Promotor umfasst, der funktionell mit der Nucleotidsequenz verbunden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem Wirt um eine Säugetierzelle handelt und wobei die Nucleotidsequenz ferner eine Region von Nucleotiden einschließt, die für eine Leadersequenz kodieren.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei es sich bei den Wirtszellen um Nierenzellen der grünen Meerkatze (BSC-1), COS-Affenzellen, HeLa-Zellen, Hamster-Nierenzellen, humane Fibroblastenzellen oder humane Gewebezellen handelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei es sich beim Expressionsvektor um ein'Plasmid handelt.

6. Verwendung des sekretorischen, verkürzten VZV-gp, bei dem es sich um ein Polypeptid, das aus der in Anspruch 1 aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, handelt, zur Herstellung eines Impfstoffes zur Stimulation einer Immunreaktion gegen Windpocken und/oder Gürtelrose.

7. Verfahren zum Diagnostizieren von VZV, umfassend das Kontaktieren von Serum, Gewebe oder Gewebeextrakten eines zu testenden Individuums mit einem Antikörper gegen ein sekretorisches, verkürztes VZV-gp, bei dem es sich um ein Polypeptid handelt, das aus der in Anspruch 1 aufgeführten Gruppe ausgewählt ist, für eine Zeitspanne und unter Bedingungen, die zur Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes notwendig sind, und das Nachweisen von etwaigen entstandenen Antikörper-Antigen-Komplexen.