DE3689144T2

DE3689144T2 - Pseudorabiesvirus-Protein.

Info

Publication number: DE3689144T2
Application number: DE86307705T
Authority: DE
Inventors: Erik A Petrovskis; Leonard E Post; James G Timmins
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-10-06
Publication date: 1994-03-03
Anticipated expiration: 2006-10-07
Also published as: DK35794A; JP2568384B2; DK288887A; EP0238618A1; DK175072B1; EP0223382B2; WO1987002058A1; JPH07107982A; EP0223382A1; ES2059305T3; CA1340848C; DK288887D0; AU601378B2; JP2638588B2; DE3689144D1; ES2059305T5; AU6375186A; KR880700074A; EP0223382B1; DE3689144T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die für Pseudorabiesvirus-Glycoproteine und mit diesen verwandte Polypeptide codieren. Diese DNA-Sequenzen eignen sich zum Durchtesten von Tieren, um festzustellen, ob sie mit PRV infiziert sind, und auch für die Expression der durch sie codierten Glycoproteine.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Pseudorabiesvirus (PRV) ist eine Krankheit, die weltweit viele Tierarten infiziert. PRV-Infektionen werden verschiedentlich mit infektiöser Bulbärparalyse, Aujeszky-Krankheit und "verrückter Juckreiz" (engl.: "mad itch") bezeichnet. Man kennt Infektionen bei wichtigen Haustieren, wie Schweinen, Rindern, Hunden, Katzen, Schafen, Ratten und Nerzen. Der Umfang der Wirte, die betroffen sein können, ist sehr groß und umfaßt die meisten Säuger, und, zumindest experimentell, viele Vogelarten(eine genaue Liste von Wirten findet sich bei D.P. Gustafson, "Pseudorabies" in Deseases of Swine, 5.Auflage, A.D. Leman et al., Hrsg. (1981)). Für die meisten infizierten Tiere ist die Krankheit tödlich. Erwachsene Schweine und möglicherweise Ratten werden jedoch durch die Krankheit nicht getötet und sind deshalb Träger.
Schweinepopulationen sind besonders empfänglich für PRV. Obwohl die ausgewachsenen Schweine selten Symptome zeigen oder infolge der Krankheit sterben, werden Ferkel auf eine Infektion hin akut krank, und der Tod tritt gewöhnlich innerhalb von 24-48 h ein, häufig ohne spezifische klinische Anzeichen (T.C. Jones und R.D. Hunt, "Veterinary Pathology", 5.Auflage, Lea & Febiger (1983)).
PRV-Impfstoffe sind mit Hilfe verschiedener Techniken hergestellt worden, und seit mehr als 15 Jahren wird die Impfung in edemischen Gebieten von Europa durchgeführt. Die Verluste sind durch die Impfung vermindert worden, aber die Impfung hat den Virus im Umfeld belassen. Es wurde kein Impfstoff erzeugt, der die Infektion verhindert. Geimpfte Tiere, die dem virulenten Virus ausgesetzt sind, überleben die Infektion und streuen anschließend noch mehr virulenten Virus aus. Geimpfte Tiere können deshalb Quelle für eine latente Infektion sein, die wieder aufflammen kann (s. D.P. Gustafson, oben).
Lebende, abgeschwächte und inaktivierte Impfstoffe für PRV sind in den Vereinigten Staaten im Handel erhältlich und wurden von der USDA genehmigt (s. C.E. Aronson, Hrsg., "Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals" (1983)).
Da erwachsene Schweine Träger von PRV sind, haben viele Staaten Screening-Programme ins Leben gerufen, um infizierte Tiere aufzuspüren. DNA/DNA-Hybridisierung kann verwendet werden, um unter Einsatz der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung aktiv infizierte Tiere zu diagnostizieren. Einige der erfindungsgemäßen PRV-Glycoproteine eignen sich auch für die Herstellung von Diagnostika für PRV-Infektionen und auch für die Herstellung von Impfstoffen gegen PRV.
PRV ist ein Herpesvirus. Die Herpesviren finden sich allgemein unter den komplexesten der Vieren, die tierische Lebewesen befallen. Ihre Genome codieren für mindestens 50 virusspezifische Proteine und enthalten mehr als 150 000 Nucleotide. Unter den am stärksten immunologisch reaktiven Proteinen der Herpesviren sind die Glycoproteine, die sich unter anderem in den Virion-Membranen und den Membranen infizierter Zellen finden. Die Literatur über PRV-Glycoproteine nennt mindestens vier virale Glycoproteine (T. Ben-Porat und A.S. Kaplan, "Virology", 41, 5.265-73 (1970); A.S. Kaplan und T. Ben-Porat, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 66, S. 799-806 (1970)).

LITERATURNACHWEISE

M.W. Wathen und L.K. Wathen, J. Virol., 51, S. 57-62 (1984) berichten über ein PRV mit einer Mutation in einem viralen Glycoprotein (gp50) und ein Verfahren zum Selektionieren der Mutante unter Verwendung von neutralisierenden monoklonalen, gegen gp50 gerichteten Antikörpern. Wathen und Wathen geben auch an, daß ein gegen gp50 gerichteter monoklonaler Antikörper ein starkes Neutralisierungsmittel für PRV ist, mit oder ohne Hilfe von Komplement, und daß polyvalentes Immunserum in hohem Maße gegen gp50 reaktiv ist, woraus sie schlossen, daß gp50 eines der wichtigen PRV-Immunogene sein kann. Andererseits wurde berichtet, daß monoklonale Antikörper, die mit dem Hüllglycoprotein mit MG 98 000 reagieren, die Infektiosität von PRV neutralisieren, daß jedoch gegen einige der anderen Membranglycoproteine gerichtete, monoklonale Antikörper sehr wenig neutralisierende Aktivität aufweisen (H. Hampl et al., "J. Virol.", 52, S. 583-90 (1984); und T. Ben- Porat und A.S. Kaplan, "Molecular Biology of Pseudorabies Virus", in B. Roizman, Hrsg., The Herpesviruses, 3, S. 105-73 (1984)).
L.M.K. Wathen et al., "Virus Research", 4, S. 19-29 (1985), berichten über die Herstellung und Charakterisierung von gegen PRV-Glycoproteine gerichteten monoklonalen Antikörpern, die als gp50 und gp83 identifiziert wurden, sowie über deren Verwendung für die passive Immunisierung von Mäusen gegen PRV-Infektion.
A.K. Robbins et al., "Localization of a Pseudorabies Virus Glycoprotein Gene Using an E. coli Expression Plasmid Library", in Herpesvirus, S. 551-61 (1984) berichten über die Konstruktion einer Bibliothek von E. coli-Plasmiden, die PRV- DNA enthalten. Sie berichten auch über die Identifizierung eines PRV-Gens, das für Glycoproteine mit MG 74 000 und 92 000 codiert. Die erfindungsgemäßen Glycoproteine nennen sie nicht.
A.K. Robbins et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 85400704.4 (Veröffentlichungsnr. 0 162 738) berichten über die Isolierung, Klonierung und Expression von PRV-Glycoproteinen, die als gII und gIII identifiziert wurden. Sie beziehen sich nicht auf die PRV-Glycoproteine der vorliegenden Erfindung.
T.C. Mettenleiter et al., "Mapping of the Structural Gene of Pseudorabies Virus Glycoprotein A and Identification of Two Non-Glycosylated Precursor Polypeptides", J. Virol., 53, S. 52-57 (1985) berichten über die Kartierung der codierenden Region von Glycoprotein gA (welches sie mit gI gleichsetzen) im BamHI 7-Fragment von PRV-DNA. Sie stellen ferner fest, daß das BamHI 7-Fragment für mindestens drei weitere virale Proteine mit MG von 65K, 60K und 40K codiert. Weder offenbaren sie die DNA-Sequenz, die für die erfindungsgemäßen Glycoproteine codiert, oder die Herstellung solcher Polypeptide mittels Verfahren mit rekombinanter DNA, noch legen sie dies nahe.
B. Lomniczi et al., "Deletions in the Genomes of Pseudorabies Virus Vaccine Strains and Existence of Four Isomers of the Genomes", J. Virol., 49, 5.970-79 (1984), berichten über PRV-Impfstoff-Stämme, die Deletionen in der einzelnen kurzen Sequenz zwischen den Kartierungseinheiten 0,855 und 0,882 aufweisen. Diese liegt in der Nachbarschaft des gI- Gens. T.C. Mettenleiter et al., "Pseudorabies Virus Avirulent Strains Fail to Express a Major Glycoprotein", J. Virol., 56, S. 307-11 (1985) zeigten, daß drei kommerziellen PRV-Impfstoffstämmen das Glycoprotein gI fehlt. Wir haben vor kurzem auch festgestellt, daß der Bartha-Impfstamm eine Deletion für den größten Teil des gp63-Gens aufweist.
T.J. Rea et al., J. Virol., 54, S. 21-29 (1985) berichten über das Kartieren und die Sequenzierung des Gens für dasjenige PRV-Glycoprotein, das im Medium infizierter Zellen akkumuliert (gX). Eingeschlossen zwischen die flankierenden Sequenzen des gX-Gens, die dort gezeigt sind, findet sich ein kleiner Teil der gp50-Sequenz, die präzise bei Base 1682 der dort gezeigten Fig. 6 beginnt. Diese Sequenz wurde jedoch nicht als gp50-Sequenz identifiziert. Außerdem finden sich Fehler in der von Rea et al. publizierten Sequenz. Die Basen 1586 und 1603 müßten gestrichen werden. Zwischen die Basen 1708 und 1709, die Basen 1737 und 1738, die Basen 1743 und 1744 und die Basen 1753 und 1754 müßten Basen insertiert werden. Die Folge dieser Irrtümer in der veröffentlichten Teilsequenz von gp50 ist eine Verschiebung des Leserahmens. Die Translation des offenen Leserahmens mit Beginn an der AUG- Startstelle würde eine inkorrekte Aminosäuresequenz für das gp50-Glycoprotein liefern.
Die EPA-0133200 bezieht sich auf einen diagnostischen antigenen Faktor, der zusammen mit bestimmten lectingebundenen PRV-Glycoproteinuntereinheit-Impfstoffen verwendet werden soll, um Träger und Nichtträger von PRV zu unterscheiden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante DNA- Moleküle zur Verfügung, die mit einer Expressionskontrollsequenz operativ verknüpfte DNA-Sequenzen enthalten, welche für Antigenität der PRV-Glycoproteine gp50, gp63 oder gI aufweisende Polypeptide codieren. Die Sequenzen der Glycoproteine und der entsprechenden DNA sind in den Diagrammen A, B und C abgebildet.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Wirtszellen zur Verfügung, die mit die DNA-Sequenzen enthaltenden, rekombinanten DNA-Molekülen transformiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung von gp63- und gI-Polypeptiden für die serologische Unterscheidung zwischen geimpften und infizierten Lebewesen zur Verfügung.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Existenz und räumliche Anordnung des für das Glycoprotein gp50 von PRV codierenden Gens wurde von M.W. Wathen und L.M. Wathen gezeigt (s. oben).
Das durch das Gen codierte Glycoprotein wurde als Glycoprotein definiert, das mit einem bestimmten monoklonalen Antikörper reagierte. Dieses Glycoprotein entsprach keinem der zuvor bekannten PRV-Glycoproteine. Wathen und Wathen kartierten eine gegenüber dem monoklonalen Antikörper unempfindliche Mutation, die, basierend auf dem bereits bekannten Beispiel aus herpes simplex Virus (z. B. T.C. Holland et al., J. Virol., 52, S. 566-74 (1984)), im Bereich des Strukturgens für gp50 angeordnet ist. Wathen und Wathen ordneten das gp50-Gen dem kleineren SalI/BamHI-Fragment aus dem Inneren des BamHI 7-Fragments von PRV zu. Rea et al. (s. oben) haben das Gen für das PRV-Glycoprotein gX in der gleichen Region kartiert.
Die Gene für PRV gp63 und gI wurden mit Hilfe des Durchtestens von PRV-DNA-Banken isoliert, die im Bakteriophagen-Expressionsvektor λgt11 erzeugt worden waren (J.G. Timmins et al., "A method for Efficient Gene Isolation from Phage λgt11 Libraries: Use of Antisera to Denatured, Acetone-Precipitated Proteins", Gene, 39, S. 89-93 (1985); R.A. Young und R.W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, S. 1194-98 (1983); R.A. Young und R.W. Davis, Science, 222, S. 778-82 (1983)).
Die ursprünglich von D.P. Gustafson an der Purdue University gewonnene genomische DNA von PRV, die aus dem PRV- "Rice"-Stamm stammte, wurde aus dem Cytoplasma von mit PRV infizierten Verozellen (ATCC CCL 81) isoliert. Die genomische DNA wurde mittels Ultraschall fragmentiert und dann in λgt11 kloniert, wodurch eine rekombinante λ/PRV (λPRV) DNA-Bank erzeugt wurde.
Antiseren für das Durchtesten der λPRV-Bank wurden durch das Impfen von Mäusen mit Proteinen, die aus mit PRV infizierten Zellen isoliert (Proteinen aus infizierten Zellen oder auch "ICP"s) und auf SDS-Gelen der Größe nach getrennt worden waren, und dann durch Isolieren der Antikörper hergestellt. Die durchzutestenden λPRV-Phagen wurden auf einen E. coli- Rasen ausplattiert. λgt11 enthält eine einzelne Klonierungsstelle im 3'-Ende des lacZ-Gens. In diese einzelne Stelle in der richtigen Orientierung und im richtigen Leserahmen insertierte fremde DNA's liefern bei der Expression an β-Galactosidase fusionierte Polypeptide. Ein Nitrocellulosefilter, der einen Induktor für die lacZ-Transkription zur Beschleunigung der Expression der PRV-DNA enthielt, wurde oben auf den Rasen aufgelegt. Nachdem die durch die λPRV's exprimierten Fusionspolypeptide ausreichend Zeit gehabt hatten, um an die Nitrocellulosefilter zu binden, wurden die Filter von den Rasen abgenommen und mit den Mäuseantiseren als Sonde durchgetestet. Plaques, die an die Mäuseseren bindendes Antigen erzeugten, wurden durch das Benutzen eines markierten Antikörpers für die Mäuseantiseren als Sonde identifiziert.
Ein positives Signal gebende Plaques wurden verwendet, um einen E. coli Wirt (Y1090, verfügbar bei der ATCC, Rockville, MD 20852) zu transformieren. Dann wurden die Kulturen über Nacht inkubiert, um die Stammkulturen der λPRV-Phagen zu erzeugen. Dieser Phagenbestand wurde verwendet, um E. coli K95 (D. Friedman in "The Bacteriophage Lambda", S. 733-38 , A.D. Hershey, Hrsg. (1971)) zu infizieren. Die vom transformierten E. coli K95 erzeugten Polypeptide wurden mittels präparativer Gelelektrophorese gereinigt. Polypeptide mit Molekulargewichten von mehr als 116 000 Dalton, die überproduziert wurden (infolge der Induktion der Transkription des lacZ-Gens), und die ferner in den λgtll-Kontrollkulturen fehlten, waren ß- Galactosidase-PRV-Fusionsproteine. Jedes einzelne Fusionsprotein wurde dann einer anderen Maus injiziert, um Antiseren zu erzeugen.
Markierte PRV ICP's wurden durch Infektion von Verozellen erzeugt, die in einem beispielsweise ¹&sup4;C-Glucosamin enthaltenden Medium wuchsen (T.J. Rea et al., s. oben). Die oben erwähnten Fusionsprotein-Antiseren wurden verwendet, um diese markierten ICP's einer Immunpräzipitation zu unterwerfen. Die auf diese Weise ausgefällten Polypeptide wurden mit Hilfe von Gelelektrophorese analysiert. Eines davon war ein Glycoprotein mit MG 110 kD (gI), und ein anderes ein Glycoprotein mit MG 63 kD (gp63). Es konnte also gezeigt werden, daß diejenigen in den Phagen klonierten Gene, die anti-gI- und anti-gp63-Serum hervorruf ende Hybridproteine erzeugten, die gI- und gp63-Gene waren. Es wurde erkannt, daß diese Gene kartographisch innerhalb des BamHI 7-Fragments des PRV-Genoms angeordnet sind (T.J. Rea et al., s. oben), wie auch die gp50-Sequenz (s. Diagramm D). Die Lokalisation des gI stimmt im großen und ganzen mit dem Gebiet überein, in dem Mettenleiter et al., s. oben, das gI-Gen kartiert hatten. Mettenleiter et al. hatten jedoch zu verstehen gegeben, daß sich das gI-Gen in das BamHI 12-Fragment erstreckt, was jedoch nicht der Fall ist.
Dieses Isolierungsverfahren für das λPRV-Gen ist im Vergleich zur DNA-Hybridisierung und zur in vitro-Translation selektionierter mRNAs schnell und effizient. Da gereinigte Glycoproteine nicht zur Verfügung standen, konnten wir weder aus den Daten über die Aminosäuresequenz auf schnelle Weise Oligonucleotidsonden konstruieren noch hochspezifische polyklonale Antiseren erzeugen. Deshalb verwendeten wir das oben dargelegte Verfahren.
Wie oben erwähnt, ließen sich die für gp50, gp63 und gI codierenden Gene dem BamHI 7-Fragment der PRV-DNA zuordnen. Das BamHI 7-Fragment von PRV läßt sich aus dem Plasmid pPRxh1 (ebenfalls bekannt als pUC1129) erhalten, und für die DNA- Sequenzanalyse geeignete Fragmente lassen sich durch standardmäßige Subklonierungsverfahren gewinnen. Das Plasmid pUC1129 läßt sich aus E. coli HB101, NRRL B-15772 gewinnen. Diese Kultur ist von der permanenten Kollektion des Northern Regional Research Center Fermentation Laboratory (NRRL), U.S. Department of Agriculture in Peoria, Illinois, U.S.A. zu beziehen.
pUC1129 enthaltendes E. coli HB101 kann in L-Medium nach gut bekannten Verfahren gezüchtet werden. Typischerweise wird die Kultur bis zu einer optischen Dichte von 0,6 wachsen gelassen, worauf Chloramphenicol zugesetzt und die Kultur über Nacht unter Schütteln sich selbst überlassen wird. Dann wird die Kultur unter Verwendung von beispielsweise hoher Salzkonzentration an SDS lysiert, und der Überstand wird einer Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugation mit Cäsiumchlorid/Ethidiumbroinid unterworfen, um die Plasmide zu erhalten.
Die Verfügbarkeit dieser Gensequenzen ermöglicht die direkte Manipulation der Gene und Gensequenzen, was Modifikationen der Regulation der Expression und/oder der Struktur des vom Gen oder einem Fragment davon codierten Proteins ermöglicht. Die Kenntnis dieser Gensequenzen ermöglicht es auch, das entsprechende Gen oder ein Fragment davon aus einem beliebigen PRV-Stamm zu klonieren, wobei die bekannte Sequenz als Hybridisierungssonde dient, und das gesamte Protein oder ein Fragment davon mittels allgemein bekannter rekombinanter Techniken zu exprimieren.
Die Kenntnis dieser Gensequenzen versetzte uns in die Lage, die Aminosäuresequenz der entsprechenden Polypeptide (Diagramme A-C) abzuleiten. Im Ergebnis können Fragmente dieser Polypeptide mit PRV-Immunogenität mittels Standardverfahren der Proteinsynthese oder rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. Vorliegend werden die Begriffe "Immunogenität" und "Antigenität" synonym in der Bedeutung verwendet, daß sie sich auf die Fähigkeit beziehen, einen beliebigen Typus der adaptiven Immunantwort zu stimulieren, d. h. Antigen und Antigenität sind in ihrer Bedeutung nicht auf Substanzen beschränkt, die die Produktion von Antikörpern stimulieren.
Die Primärstrukturen (Sequenzen) der für gp50, gp63 und gI codierenden Gene sind ebenfalls in den Diagrammen A-C dargestellt.
Die Gene oder Fragmente davon können durch Verdauung der plasmidischen DNA aus pUC1129 mit geeigneten Endonuclease- Restriktionsenzymen aus einer Kultur von NRRL B-15772 extrahiert werden. Beispielsweise kann das BamHI 7-Fragment durch Verdauung einer Präparation von pUC1129 mit BamHI und Isolierung durch Gelelektrophorese gewonnen werden.
Alle Restriktionsendonucleasen, auf die hier Bezug genommen wird, sind im Handel erhältlich, und ihre Verwendung ist auf dem technischen Gebiet gut bekannt. Anweisungen für die Verwendung werden normalerweise von den gewerblichen Lieferanten der Restriktionsenzyme zur Verfügung gestellt.
Die ausgeschnittenen Gene oder Fragmente davon können an verschiedene Klonierungsvehikel für die Verwendung zur Transformierung einer Wirtszelle ligiert werden. Die Vektoren enthalten vorzugsweise DNA-Sequenzen für die Initiation, Kontrolle und Termination von Transkription und Translation (welche zusammen die Expression ausmachen) der PRV-Glycoprotein-Gene und sind deshalb operativ mit diesen verknüpft. Diese "Expressionskontrollsequenzen" sind vorzugsweise mit der zu transformierenden Zelle kompatibel. Wenn die Wirtszelle eine höhere Tierzelle ist, beispielsweise eine Säugetierzelle, können die natürlicherweise auftretenden Expressionskontrollsequenzen der Glycoproteingene allein oder zusammen mit heterologen Expressionskontrollsequenzen verwendet werden. Auch heterologe Sequenzen können alleine verwendet werden. Die Vektoren enthalten zusätzlich vorzugsweise ein Markierungsgen (beispielsweise Antibiotikaresistenz), um phänotypische Charakteristika für die Selektion der transformierten Wirtszellen bereitzustellen. Zusätzlich wird ein replizierender Vektor eine Replikon enthalten.
Typische Vektoren sind Plasmide, Phagen und Viren, die Tierzellen infizieren. Im wesentlichen kann man jede beliebige DNA-Sequenz verwenden, die sich für die Transformierung einer Wirtszelle eignet.
Der Ausdruck "Wirtszelle" bedeutet in seiner vorliegenden Verwendung eine Zelle, die mit der für ein Polypeptid codierenden DNA-Sequenz transformiert werden kann, wobei das Polypeptid PRV-Glycoprotein-Antigenität zeigt. Vorzugsweise ist die Wirtszelle in der Lage, das PRV-Polypeptid oder Fragmente davon zu exprimieren. Die Wirtszelle kann procaryontisch oder eukaryontisch sein. Beispielhafte procaryontische Zellen sind Bakterien, wie z. B. E. coli, B. subtilis, Pseudomonas und B. stearothermophilus. Beispielhafte eukaryontische Zellen sind Hefe oder höhere Tierzellen, wie z. B. Zellen, die aus Insekten, Pflanzen oder Säugetieren stammen. Säugetierzell- Systeme werden häufig in Form von Monoschichten der Zellen vorliegen, obwohl auch Säugetierzell-Suspensionen verwendet werden können. Säugetierzellinien umfassen beispielsweise VERO- und HeLa-Zellen, Ovarzellinien des chinesischen Hamsters (CHO), WI38-, BHK-, COS-7- oder MDCK-Zellinien. Insektenzelllinien umfassen die Sf9-Linie von Spodoptera frugiperda (ATCC CRL1711). Eine Zusammenfassung einiger verfügbarer eukaryontischer Plasmide, Wirtszellen und Verfahren zu deren Einsatz beim Klonieren und Exprimieren von PRV-Glycoproteinen kann in K. Esser et al, "Plasmids of Eukaryotes (Fundamentals and Applications)", Springer-Verlag (1986) gefunden werden, und diese Literaturstelle wird vom vorliegenden Text umfaßt.
Wie bereits oben erwähnt, enthält der Vektor, beispielsweise ein Plasmid, welches für die Transformierung der Wirtszelle verwendet wird, vorzugsweise kompatible Expressionskontrollsequenzen für die Expression der PRV-Glycoprotein-Gene oder von Fragmenten davon. Die Expressionskontrollsequenzen sind deshalb mit dem Gen oder Fragment operativ verknüpft. Wenn die Wirtszellen Bakterien sind, umfassen beispielhafte verwendbare Expressionskontrollsequenzen den trp-Promotor und -Operator (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057 (1980)); den lac-Promotor und -Operator (Chang et al., Nature, 275, 615 (1978)); den Promotor des äußeren Membranproteins (EMBO J., l, 771-775 (1982)); die Promotoren und Operatoren des Bacteriophagen λ (Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688 (1983)); den Promotor und Operator der α-Amylase (B. subtilis), Terminationssequenzen und andere Expressionsbeschleunigungs- und Kontrollsequenzen, die mit der gewählten Wirtszelle kompatibel sind. Wenn die Wirtszelle Hefe ist, umfassen beispielhafte verwendbare Expressionskontrollsequenzen beispielsweise den α-Mating- Faktor. Für Insektenzellen kann der Polyhedrin-Promotor von Baculoviren verwendet werden (Mol. Cell. Biol., 3, S. 2156-65 (1983)). Wenn die Wirtszelle ursprünglich von einem Insekt oder einem Säuger stammt, umfassen beispielhafte verwendbare Expressionskontrollsequenzen beispielsweise den SV-40-Promotor (Science, 222, 524-527 (1983)) oder beispielsweise den Metallothionein-Promotor (Nature, 296, 39-42 (1982)) oder einen Hitzeschock-(heat shock)-Promotor (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, S. 4949-53 (1985)). Wie bereits oben angemerkt, kann man, wenn die Wirtszelle eine Säugerzelle ist, die Expressionskontrollsequenzen für das PRV-Glycoprotein-Gen verwenden, vorzugsweise jedoch in Kombination mit heterologen Expressionskontrollsequenzen.
Das plasmidische oder replizierende oder integrierende DNA-Material, das die Expressionskontrollsequenzen enthält, wird mit Hilfe von Restriktionsenzymen geschnitten, nach notwendigen oder wünschenswerten Kriterien in der Größe angepaßt und mit dem PRV-Glycoprotein-Gen oder Fragmenten davon mit Hilfe gutbekannter Verfahren ligiert. Wenn Hefe-Wirtszellen oder solche höherer Tiere verwendet werden, können Polyadenylierungs- oder Terminatorsequenzen aus bekannten Hefe- oder Säugergenen in den Vektor eingebaut werden. Beispielsweise kann die Polyadenylierungssequenz des Rinderwachstumhormons (bGH) verwendet werden, die in der europäischen Veröffentlichung Nr. 0 093 619 beschrieben und vorliegend mitumfaßt ist. Weitere Gensequenzen für die Kontrolle der Replikation der Wirtszelle können in den Vektor eingebaut werden.
Die Wirtszellen sind transformationskompetent oder können auf verschiedene Weise dazu gemacht werden. Wenn Bakterienzellen die Wirtszellen sind, können sie durch Behandeln mit Salzen, typischerweise einem Calciumsalz, wie es allgemein von Cohen, PNAS, 69, 2110 (1972) beschrieben ist, kompetent gemacht werden. Eine Hefe-Wirtszelle wird im allgemeinen durch Entfernen ihrer Zellwand oder auf andere Weise, wie z. B. ionische Behandlung (J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)) kompetent gemacht werden. Es gibt eine Reihe von gut bekannten Verfahren zur Einführung von DNA in tierische Zellen, einschließlich beispielsweise der Fällung mit Calciumphosphat, Fusion der aufnehmenden Zellen mit bakteriellen Protoplasten, die die DNA enthalten, Behandeln der aufnehmenden Zellen mit die DNA enthaltenden Liposomen und Mikroinjektion der DNA direkt in die Zellen.
Die transformierten Zellen werden nach gutbekannten Verfahren gezüchtet (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982); "Biochemical Methods In Cell Culture And Virology", R.J. Kuchler, Dowden, Hutchinson und Ross, Inc. (1977); "Methods In Yeast Genetics", F. Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982)), und das exprimierte PRV-Glycoprotein oder das Fragment davon wird in denjenigen Systemen, in denen das Protein von der Wirtszelle sezerniert wird, aus dem Zellmedium, oder aber nach Aufbrechen des Wirtszellsystems durch beispielsweise mechanische oder enzymatische, im Stand der Technik gut bekannte Mittel aus der Zellsuspension geerntet.
Wie bereits oben angemerkt, sind die Aminosäuresequenzen der PRV-Glycoproteine, wie sie sich von den Genstrukturen ableiten, in den Diagrammen A bis C abgebildet. Polypeptide, die die Antigenität von PRV-Glycoprotein zeigen, umfassen die in den Diagrammen A bis C dargestellten Sequenzen und beliebige Teile der Polypeptidsequenzen, die in der Lage sind, eine Immunantwort in einem Lebewesen, beispielsweise einem Säuger, hervorzurufen, dem die Polypeptidsequenz injiziert wurde, wie auch immunologisch funktionelle Analoga der Polypeptide.
Wie hier zuvor erläutert, kann das gesamte für das PRV- Glycoprotein codierende Gen für die Konstruktion der Vektoren und die Transformation der Wirtszellen mit dem Ziel der Expression des PRV-Glycoproteins verwendet werden, oder aber es können Fragmente des für das PRV-Glycoprotein codierenden Gens eingesetzt werden, wodurch die entstandene Wirtszelle Polypeptide exprimieren wird, die PRV-Antigenität aufweisen. Jedes beliebige Fragment des PRV-Glycoprotein-Gens kann eingesetzt werden, das zur Expression eines Polypeptids führt, welches ein immunogenes Fragment des PRV-Glycoproteins oder ein Analoges davon ist. Wie gut in der Technik bekannt, erlaubt die Degenerierung des genetischen Codes die leichte Substitution von Basenpaaren unter Bildung funktionell äquivalenter Gene und Fragmente davon, welche für Polypeptide codieren, die die Antigenität von PRV-Glycoprotein aufweisen. Diese funktionellen Äquivalente werden von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt.
Die Diagramme D bis S sind zur Erläuterung der Konstruktionen in den Beispielen aufgeführt. Bestimmte Regeln werden verwendet, um die Plasmide und DNA-Fragmente wie folgt darzustellen:
(1) Die mit einer einzelnen Linie gezeichneten Figuren repräsentieren sowohl zirkuläre als auch lineare doppelsträngige DNA.
(2) Sternchen (*) geben an, daß das dargestellte Molekül zirkulär ist. Fehlen eines Sternchens gibt an, daß das Molekül linear ist.
(3) Interessierende Endonuclease-Restriktionsschnittstellen sind oberhalb der Linie angegeben.
(4) Gene sind unterhalb der Linie angegeben.
(5) Abstände zwischen Genen und Restriktionsschnittstellen sind nicht im Maßstab gehalten. Die Diagramme zeigen nur relative Positionen, sofern nichts anderes angegeben ist.
Die meisten der rekombinante DNA betreffenden Verfahren, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Standardverfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und beispielsweise im Detail in "Molecular Cloning", T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) und B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons (1984) beschrieben sind, welch letztere Zitate von der vorliegenden Beschreibung umfaßt sind.

B e i s p i e l 1

In diesem Beispiel geben wir Informationen über die Sequenzierung, Klonierung und Expression von PRV-Glycoprotein gp50.
1. Sequenzierung des gp50-Gens.
Das BamHI 7-Fragment der DNA des PRV-"Rice"-Stamms (Diagramm D), welches für das gp50-Gen codiert, wird aus pPRXh1 [NRRL B-15772] (s. oben) isoliert und in die BamHI- Schnittstelle des Plasmids pBR322 (Maniatis et al., s. oben) subkloniert.
Unter nun folgender Bezugnahme auf das Diagramm E wird das Fragment weiterhin unter Verwendung von Standardverfahren durch Verdauen von BamHI 7 mit PvuII, Isolieren der zwei BamHI/PvuII-Fragmente (1,5 und 4,9 kB) und deren Subklonierung zwischen die BamHI- und PvuII-Schnittstellen von pBR322 subkloniert, wobei die Plasmide pPR28-4 und pPR28-1 erzeugt werden, die das 1,5 bzw. 4,9 kB-Fragment enthalten (s. auch Rea et al., oben). Diese Subklone werden als Zellen für DNA für DNA-Sequenzierungsexperimente verwendet.
Diagramm F zeigt verschiedene Restriktionsenzym-Schnittstellen, die auf dem gp50-Gen und den flankierenden Regionen angeordnet sind. Die wie oben subklonierten Fragmente mit 1,5 und 4,9 kB werden mit diesen Restriktionsenzymen verdaut. Jedes der von den Restriktionsenzymen gebildeten Enden wird unter Verwendung von Polynucleotidkinase mit y -³²P-ATP markiert und nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert, Methods Enzymol., 65, 499-560 (1980) sequenziert. Das gesamte Gen wird mindestens zweimal auf beiden Strängen sequenziert. Die DNA- Sequenz von gp50 ist in Diagramm A abgebildet. Diese DNA kann verwendet werden, um aktiv mit PRV infizierte tierische Lebewesen aufzufinden. Beispielsweise könnte man einen Nasen- oder Rachenabstrich vornehmen und dann mittels Standardverfahren eine DNA/DNA-Hybridisierung vornehmen, um das Vorliegen von PRV aufzufinden.
2. Expression von gp50
Im folgenden sei nun auf Diagramm G hingewiesen. Eine NarI-Schnittstelle ist 35 Basenpaare stromaufwärts vom Initiationscodon des gp50-Gens gelegen angeordnet. Die erste Stufe bei der Expression ist die Insertion der passenden BamHI- Schnittste1le am Punkt der NarI-Schnittstelle. Das oben beschriebene Plasmid pPR28-4 wird mit der Restriktionsendonuclease NarI verdaut, wobei das DNA-Fragment 3 erzeugt wird, das das für den N-Terminus codierende Ende des gp50-Gens und einen Teil des gX-Gens enthält. An das Fragment 3 werden BamHI-Linker angefügt und das Fragment wird zur Entfernung der gx-Sequenz mit BamHI verdaut, wobei Fragment 4 entsteht. Dann werden die BamHI-Enden ligiert, wobei das Plasmid pPR28-4 Nar2 erzeugt wird.
Unter nun folgender Bezugnahme auf das Diagramm H zeigen wir den Zusammenbau des vollständigen gp50-Gens. pPR28-4 Nar2 wird mit BamHI und PvuII unter Bildung des Fragments 5 (160 Bp) verdaut, welches den für den N-Terminus codierenden Teil des gp50-Gens enthält. Das oben erwähnte Plasmid pPR28-1 wird außerdem mit PvuII und BamHI verdaut, wodurch ein 4,9 kB langes Fragment erzeugt wird, das den für den C-Terminus codierenden Teil des gp50-Gens enthält (Fragment 6). Das Plasmid pPGX1 (konstruiert wie in der US-Patentanmeldung SN 760 130 dargestellt) oder aber alternativ das Plasmid pBR322 wird mit BamHI verdaut, mit bakterieller alkalischer Phosphotase (BAP) versetzt und dann mit den Fragmenten 5 und 6 ligiert, wobei das Plasmid pBGP50-23 gebildet wird, das das vollständige gp50-Gen enthält.
Unter nun folgender Bezugnahme auf Diagramm I zeigen wir die Herstellung des Plasmids pD50. Das Plasmid pBG50-23 wird mit dem Restriktionsenzym MaeIII (K. Schmid et al., Nucl. Acids Res., 12, S. 2619 (1984)) geschnitten, wobei eine Mischung von Fragmenten entsteht. Die MaeIII-Enden werden mit T4 DNA-Polymerase glattendig gemacht und an die glatten Enden werden EcoRI-Linker angefügt, worauf mit EcoRI verdaut wird. Die gebildeten Fragmente werden mit BamHI geschnitten, und es wird ein 1,3 kB langes BamHI/EcoRI-Fragment isoliert, welches das gp50-Gen enthält (Fragment 7) Das Plasmid pSV2dhfr (erhalten von der American Type Culture Collection, Bethesda Research Laboratories, oder nach dem Verfahren von
S. Subramani et al., "Mol. Cell. Biol.", 2, S. 854-64 (1981) synthetisiert) wird mit BamHI und EcoRI verdaut, und das größere Fragment (5,0 kB) wird isoliert, wobei das den Dehydrofolat-Reduktase-(dhfr)-Marker enthaltende Fragment 8 gebildet wird. Dann werden die Fragmente 7 und 8 ligiert, wobei das Plasmid pD50 gebildet wird, das das gp50-Gen und den dhfr-Marker enthält.
Die folgenden Ausführungen beziehen sich auf Diagramm J.
Der Promotor aus der nächstgelegenen frühen Region (immediate early promoter) aus dem menschlichen Cytomegalovirus vom Towne-Stamm wird stromaufwärts vom gp50-Gen angefügt. pD50 wird mit BamHI verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase versetzt, wobei Fragment 9 entsteht.
Ein 760 Bp langes Sau3A-Fragment, das den nächstgelegenen frühen Promotor (immediate early promoter) des menschlichen Cytomegalovirus (Towne) enthält, wird nach dem in der U.S. Patentanmeldung SN 758 517 dargelegten Verfahren isoliert, wobei Fragment 10 entsteht (s. auch D.R. Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, S. 659-63 (1984)). Diese Fragmente werden dann durch eine BamHI/Sau3A-Fusion ligiert, wobei das Plasmid pDIE50 entsteht. Um sicherzustellen, daß sich der Promotor in der richtigen Orientierung befindet, um das gp50- Gen zu transkribieren, wird das Plasmid mit SacI und PvuII verdaut, und ein 185 Bp langes Fragment wird gebildet.
Im folgenden wird auf Diagramm K Bezug genommen. Das 0,6 kB lange PvuII/EcoRI-Fragment, das das Polyadenylierungssignal des Rinderwachstumshormons (BGH) enthält, wird durch Verdauung mit PvuII und EcoRI aus dem Plasmid pGH2R2 (R.P. Woychik et al., Nucl. Acids Res., 10, S. 7197-7210 (1982) isoliert, oder aber aus dem pSVCOW7 (s. oben), um das Fragment 11 zu bilden.
Fragment 11 wird zwischen die EcoRI- und SmaI-Schnittstellen von pUC9 (erhalten von Pharmacia/PL oder ATCC) kloniert, wobei pCOWT1 entsteht. pCOWT1 wird mit SalI geschnitten, die Enden werden mit T4 DNA-Polymerase glattendig gemacht, EcoRI- Linker werden hinzugefügt, die DNA wird mit EcoRI geschnitten, und das 0,6 kB lange Fragment (Fragment 12) wird isoliert. Dieses ist mit Fragment 11 identisch bis auf die Tatsache, daß es zwei EcoRI-Enden und eine Polylinker-Sequenz an einem Ende aufweist.
Das Plasmid pDIE50 wird mit EcoRI geschnitten und das Fragment 12 wird hierein kloniert, wobei das Plasmid pDIE50PA gebildet wird. Die Verdauung mit BamHI und PvuII liefert ein Fragment mit einer Länge von 1,1 kB für den Fall, daß sich das Polyadenylierungssignal in der richtigen Orientierung befindet. Das Plasmid kann auch durch Klonierung in die Polyadenylierungssequenz vor dem Promotor konstruiert werden.
Das Plasmid pDIE50PA wird verwendet, um CHO dhfr&supmin;-Zellen (DXB-11, G. Urlaub und L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, S. 4216-20 (1980)) mit Hilfe von Calciumphosphat-Copräzipitation mit Carrier-DNA von Lachssperma zu transfizieren (F.L. Graham und A.J. Van Der Eb, Virol., 52, S. 456-67 (1973)). Die Dihydrofolatreduktase-positiven (dhfr&spplus;), transfizierten Zellen werden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium plus Eagle's nicht-essentiellen Aminsäuren plus 10% fötalem Kälberserum selektioniert. Die selektionierten, dhfr&spplus; CHO-Zellen produzieren gp50, was sich durch Immunfluoreszenz mit dem monoklonalen Antikörper 3A-4 gegen gp50 oder durch Markieren mit ¹&sup4;C-Glucosamin und Immunpräzipitation mit 3A-4 nachweisen läßt. Der monoklonale Antikörper 3A-4 wird wie in der anhängigen U.S. Patentanmeldung SN 817 429 beschrieben, die am 9. Januar 1985 eingereicht wurde, hergestellt. Die Immunpräzipitationsreaktionen werden wie bereits früher beschrieben, durchgeführt (T.J. Rea et al., s. oben) mit der folgenden Änderung: Die Extrakte werden zuerst mit normalem Mäuseserum inkubiert, dann mit gewaschenen Staphylococcus aureus-Zellen, und 30 min lang in einem Beckman SW50.1-Rotor bei 40 000 Upm zentrifugiert. Nachdem die Extrakte mit monoklonalem oder polyklonalem Antiserum plus S. aureus-Zellen inkubiert worden sind, werden die Zellen dreimal in 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 1% NP40 und 0,5% Desoxycholat gewaschen. Die Analyse der Proteine erfolgt auf 11%igen SDS-Polyacrylamidgelen (L. Morse et al., J.Virol., 26, S. 389-410 (1984)). In zuvor durchgeführten Immunfluoreszenzstudien wurde gefunden, daß 3A-4 mit den mit pDIE50PA transfizierten CHO-Zellen reagierten, jedoch nicht mit nicht-transfizierten CHO-Zellen. Wenn die transfizierten CHO-Zellen mit ¹&sup4;C-Glucosamin markiert worden waren, erfolgte mit 3A-4 die Immunpräzipitation eines markierten Proteins aus denjenigen Zellen, die pDIE50PA enthielten, jedoch nicht aus Kontrollzellen, die menschliches Renin produzieren. Das ausgefällte Protein wanderte auf SDS-Polyacrylamidgelen gleichzeitig mit dem Protein, das durch 3A-4 aus PRV-infizierten Zellen ausgefällt worden war.
Ein Klon dieser transfizierten, gp50 produzierenden CHO- Zellen kann in Rollflaschen gezüchtet, in phosphatgepufferter Salzlösung mit 1 mM EDTA geerntet und zur Verwendung als Impfstoffim vollständigem Freund'schen Adjuvans vermischt werden.
Das gp50-Gen kann auch in einem Kuhpocken-(Vaccina)-Vektor exprimiert werden. In dieser Ausführungsform wird, nachdem pBG50-23 mit MaeIII verdaut worden ist und die Enden mit T4 DNA-Polymerase glatt gemacht worden sind, die DNA mit BamHI verdaut. Das 1,3 BamHI/glattendig gemachte Fragment, das das gp50-Gen enthält, wird isoliert. Plasmid pGS20 (Mackett et al., J. Virol., 49, S. 857-64 (1984)) wird mit BamHI und 5mal geschnitten, und das größere, 6,5 kB lange Fragment wird mittels Gelelektrophorese isoliert. Diese beiden Fragmente werden unter Bildung von pVV50 miteinander ligiert. Das Plasmid pVV50 wird in mit dem WR-Stamm des Vaccina-Virus (ATCC VR- 119) infizierte CV-1-Zellen (ATCC CCL 70) transfiziert und durch Ausplattieren auf 143-Zellen (ATCC CRL 8303) in 5-Bromdesoxyuridin (BUdR), wobei man den von Mackett et al. in DNA Cloning, Band 11: A Practical Approach, D.M. Glover, Hrsg., IRL Press, Oxford (1985) beschriebenen Verfahren folgte, auf Thymidinkinase-negative Rekombinanten selektioniert. Das gebildete Virus, Vaccina-gp50, exprimierte gp50 in infizierten Zellen, was durch Markieren der Proteine aus den infizierten Zellen mit ¹&sup4;C-Glucosamin und Immunpräzipitation mit dem monoklonalen Antikörper 3A-4 festgestellt wurde.

B e i s p i e l 2

In diesem Beispiel beschreiben wird den Schutz von Mäusen und Schweinen gegenüber der Exposition durch PRV unter Verwendung des gp50 aus Beispiel 1 als immunogenes Agens.
In den unten stehenden Tabellen 1 bis 3 wurde der Mikroneutralisationstest wie folgt durchgeführt: Zweifache Reihenverdünnungen von Serumproben wurden in Mikrotiterplatten (Costar) unter Verwendung von basalem Medium Eagle (BME) vorgenommen, das mit 3% fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt war. Ungefähr 1000 pfu (50 ul) PRV wurden zu jeweils 50 ul jeder Verdünnung gegeben. Komplement vom Kaninchen wurde mit einer Verdünnung von 1 : 5 für die Mäuseserum-Tests in die Virus-Aliquots hineingegeben, jedoch nicht bei den Schweineserum-Tests. Die Proben wurden entweder 1 h (Schweineseren) oder 3 h (Mäuseseren) bei 37ºC inkubiert. Nach dem Inkubationszeitraum wurde pro PRV-Probe jedem Serum eine kleine Menge (50 ul) Schweinenieren-15 (PK-15)-Zellen (300 000 Zellen/ml) in Eagle's Minimum Essential Medium zugesetzt. Die Proben wurden daraufhin 2 Tage bei 37ºC inkubiert. Die Neutralisationstiter stellen den Kehrwert der höchsten Verdünnungen dar, die 50% der Zellen vor cytopathischen Effekten schützten.
Tabelle 1 zeigt den Schutz von Mäusen gegenüber der Exposition durch virulentes PRV durch Immunisieren mit gp50, das in Vaccina-Virus erzeugt worden war. Mäuse wurden durch Einbringen von 25 ul in den Schwanz oder von 50 ul auf dem Weg über die Pfote immunisiert. Die Mäuse wurden 28 Tage vor der Exposition immunisiert (bis auf diejenigen Mäuse, denen PR-Vac gegeben wurde; diese wurden 14 Tage vor der Exposition immunisiert). TABELLE 1 Immunisierungsagens Dosis (PFU) Route Neutralisierungstiter a % Überlebende Schwanz Pfote Vaccina c a Neutralisierungstiter gegen PRV am Tag der Exposition (+ Complement). b Exposition mit 10 LD50 des PRV Rice-Stamms auf interperitonealem Weg. c Kontrollvirus. d Basalmedium Eagle, Negativkontrolle. e Norden Laboratories, Lincoln, NE, inaktivierter PRV-Impfstoff, Positivkontrolle.
Tabelle 2 zeigt den Schutz von Mäusen gegenüber der Exposition durch virulentes PRV durch Immunisierung mit in CHO- Zellen produziertem gp50. Die Mäuse wurden 28 Tage, 18 Tage und 7 Tage vor der Exposition immunisiert. Die Mäuse erhielten mit der ersten Dosis subkutan Präparationen mit Adjuvans und mit der zweiten und dritten Dosis intraperitoneal Präparationen in Salzlösung. Jede Maus erhielt 106 zerstörte Zellen/Dosis. TABELLE 2 Immunisierendes Agens/Adjuvans Neutralisierende Titer a % Überlebende (2 Dosen) gp50/Salzlösung CHO-Renin e/CFA a Neutralisierender Titer gegen PRV am Tag der Exposition (+ Komplement). b Exposition mit 30 LD50 des PRV Rice-Stamms auf dem Weg durch die Pfote. c Vollständiges Freund'sches Adjuvans. d Unvollständiges Freund'sches Adjuvans. e Reninexprimierende Kontrollzellen. f Norden Laboratories, Lincoln, NE, inaktivierter PRV-Impfstoff, Positivkontrolle.
Tabelle 3 zeigt den Schutz von Schweinen gegenüber der Exposition mit virulentem PRV durch Immunisierung mit in CHO-Zellen hergestelltem gp50. Die Schweine wurden 21 Tage und 7 Tage vor der Exposition immunisiert. Die Schweine erhielten 2 · 10&sup7; zertrümmerte Zellen pro Dosis. Die erste Dosis wurde mit vollständigem Freund'schen Adjuvans vermischt, während die zweite Dosis in Salzlösung suspendiert wurde. Beide Dosen wurden intramuskulär verabreicht. TABELLE 3 Immunisieerndes Agens/Adjuvans Geometrisches Mittel Titer a % Überlebende b CHO-Renin/CFA a Neutralisierungstiter gegen PRV am Tag der Exposition. b Exposition durch den PRV-Rice-Stamm mit 1 · 10&sup5; pfu/Schwein auf intranasalem Wege.
Diese drei Tabellen zeigen, daß gp50 neutralisierende Antikörper hervorrufen und Mäuse und Schweine gegenüber der letalen PRV-Exposition schützen kann.
In einer anderen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung erzeugten wir ein Derivat des Glycoproteins gp50 durch Entfernen der für das C-terminale Ende von gp50 codierenden DNA. Das gebildete Polypeptid weist eine Deletion der Aminosäuresequenz auf, die notwendig ist, um gp50 in der Zellmembran zu verankern. Bei der Expression in Säugerzellen wird dieses gp50 Derivat in das Medium sezerniert. Die Reinigung dieses gp50- Derivats aus dem Medium für die Verwendung als Untereinheits- Impfstoff ist wesentlich einfacher als die Fraktionierung der ganzen Zellen. Die Entfernung der Verankerungssequenz zum Zwecke der Umwandlung eines Membranproteins in ein sezerniertes Protein wurde zuerst für das Influenza-Hämagglutinin-Gen (M.-J. Gething und J. Sambrook, Nature, 300, S. 598-603 (1982)) gezeigt.
Im folgenden sei nun auf Diagramm L Bezug genommen. Das oben beschriebene Plasmid pDIE50 wird mit SalI und EcoRI verdaut. Die 5,0 und 0,7 kB langen Fragmente werden isoliert. Das für einen Teil von gp50 codierende, 0,7 kB lange Fragment wird mit Sau3A verdaut, und ein 0,5 kB langes Sall/Sau3A-Fragment wird isoliert. Um ein Stop-Codon hinter das verkürzte gp50-Gen einzuführen, werden die folgenden Oligonucleotide synthetisiert:
Das 5,0 kB lange EcoRI/Sall-Fragment, das 0,5 kB lange Sall/Sau3A-Fragment und die verschmolzenen Oligonucleotide werden ligiert, wobei das Plasmid pDIE50T entsteht. Die Verdauung mit EcoRI und SalI liefert ein 580 Bp langes Fragment. pDlE5oT wird mit EcoRI geschnitten, und das 0,6 kB lange EcoRI-Fragment, das die bGH-polyA-Stelle (Fragment 12) enthält, wird einkloniert, wobei das-Plasmid pDIE50TPA erzeugt wird. Die Verdauung von pDIE50TPA mit BamHI und PvuII liefert ein 970 Bp langes Fragment, sofern das Polyadenylierungs- Signal in der richtigen Orientierung angeordnet ist.
pDIE50TPA wird verwendet, um CHO dhfr&supmin;-Zellen zu transfizieren. Selektionierte dhfr&spplus; CHO-Zellen liefern eine verkürzte Form von gp50, die, wie durch Markieren mit ³&sup5;S-Methionin und Immunpräzipitation gefunden werden konnte, in das Medium sezerniert wird.

B e i s p i e l 3

In diesem Beispiel erläutern wir die Isolierung, Klonierung und Sequenzierung der gp63- und gI-Gene.
1. Konstruktion der Genbank
Genomische DNA von PRV wurde, wie zuvor beschrieben, hergestellt (T.J. Rea et al., s. oben). Fragmente von 0,5-3,0 kB Länge wurden durch zweimaliges, jeweils 4 sec dauerndes Beschallen der genomischen PRV-DNA des PRV Rice-Stammes erhalten, wobei ein Branson 200-Ultraschallapparat auf Stufe 2 eingestellt wurde. Nachdem die Fragmente mit T4 DNA-Polymerase glattendig gemacht worden waren, wurden die Fragmente an mit Kinase behandelte EcoRI-Linker (T. Maniatis et al., s. oben) ligiert. Nach Überverdauung mit EcoRI (da PRV-DNA keine EcoRI- Schnittstelle besitzt, war eine Methylierung unnötig), wurden überschüssige Linker mit Hilfe von Agarose-Gelelektrophorese entfernt. Die PRV-DNA-Fragmente im gewünschten Größenbereich wurden mit Hilfe der Glasschlammethode (glass slurry method) (B. Vogelstein und D. Gillespie, Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 76, S. 615-19 (1979)) eluiert. Eine Bank von 61 000 λ/PRV- Rekombinanten (λPRVs) wurde durch Ligieren von 500 ng PRV- DNA-Fragmente an 750 ng von mit EcoRI verdauter λgt11 (R.A. Young und R.W. Davis, s. oben) DNA in 50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP, 400 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) in einem Endvolumen von 10 ul konstruiert. Die ligierte DNA wurde mit Hilfe des Packagene-Extrakts (Promega Biotec, Madison, Wisconsin) in Virions des Bakteriophagen λ verpackt.
2. Durchtesten der λPRV-Bank
Die λPRV-Bank wurde, wie bereits beschrieben, durchgetestet (J.G. Timmins et al., s. oben; R.A. Young und R.W. Davis, s. oben). Pro 150 mm LB-Ampicillinschale wurden 20 000 Phagen durchgetestet. Die Test-Antiseren wurden erzeugt, indem Mäusen der Größe nach fraktionierte Proteine von mit PRV infizierten Zellen (ICP's) injiziert wurden, die aus SDS-Polyacrylamid- Gelen eluiert worden waren (J.G. Timmins et al., s. oben). Plaques, die beim Durchtesten mit Antiseren positive Signale lieferten, wurden mit einer sterilen Pasteurpipette von den Agarschalen aufgenommen, in 1 ml 5M-Puffer (T. Maniatis et al., s. oben) resuspendiert und nochmals durchgetestet. Das Durchtesten wurde so lange wiederholt, bis die Plaques bezüglich ihrer positiven Reaktion homogen waren.
Ungefähr 43 000 λPRV-Rekombinanten wurden mit Mäuse- Antiseren gegen Proteine von mit PRV infizierten Vero-Zellen durchgetestet, die aus SDS-Polyacrylamidgelen isoliert worden waren. 60 positive λPRV-Phagen wurden isoliert.
3. Phagen-Stammpräparationen
Phagen-Stammlösungen mit hohem Titer (10¹&sup0;-10¹¹ pfu/ml) wurden mit Hilfe des Schalenlysat-Verfahrens (T. Maniatis et al., s. oben) hergestellt. Ein einzelner, gut isolierter, ein positives Signal gebender Plaque wurde ausgesucht und in 1 ml SM resuspendiert. 100 ul der Suspension wurden 15 min lang bei 37ºC an 300 ul E. coli Y1090 (zu beziehen von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland) adsorbiert, mit 10 ml LB-Top-Agarose verdünnt, gleichmäßig auf eine 150 mm LB-Ampicillin-Schale ausgegossen und über Nacht bei 42ºC inkubiert. Die Top-Agarose wurde mit einer abgeflämmten Glasscheibe vorsichtig abgeschabt und in ein 30 ml fassendes Corex-Röhrchen überführt. 8 ml SM und 250 ul Chloroform wurden zugesetzt, es wurde gemischt und bei 37ºC 15 min lang inkubiert. Das Lysat wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 10 000 Upm im HB-4-Rotor geklärt. Die Phagen-Stammlösung wurde bei 4ºC mit 0,3% Chloroform gelagert.
4. Herstellung und Analyse von Fusionsprotein
LB Medium (Maniatis et al., s. oben) wurde 1 : 50 mit einer frischen, über Nacht gezogenen Kultur von E. coli K95 (sup&supmin;, λ&supmin;, gal&supmin; strr, nusA&supmin;; D. Friedman, s. oben) beimpft und bei 30ºC bis zu einer OD&sub5;&sub5;&sub0;= 0,5 wachsengelassen. 25 ml Kultur wurden 5fach mit λPRV-Phagen infiziert und 25 min lang in einem rüttelnden Wasserbad von 42ºC und sodann einem 2- bis 3- stündigen Übergang auf 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden 10 min lang im HB-4-Rotor bei 5 000 Upm pelletisiert und in 100 ul 100 mM Tris (pH 7,8), 300 mM NaCl resuspendiert. Das gleiche Volumen an 2 · SDS-PAGE-Probenpuffer wurde zugesetzt, und die Probe wurde 10 min lang gekocht. 5 ul jeder Probe wurden durch Elektrophorese auf analytischen SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, wie in L. Morse et al., J. Virol, 26, S. 389-410 (1978) beschrieben. Die Fusionspolypeptid-Präparationen wurden für Mäuseinjektionen im 10fachen Maßstab erzeugt. Die β-Galactosidase/PRV-Fusionspolypeptide wurden nach Anfärben eines Gelstreifens mit Coomassie-Blau isoliert (L. Morse et al., s. oben; K. Weber und M. Osborn, in "The Proteins", 1, S. 179-223 (1975)). Die Mengen an Fusionspolypeptid wurden mit Hilfe der analytischen SDS-PAGE geschätzt. Zellysate von mit λPRV infizierten E. coli K95- Kulturen wurden in 9,25%igen SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt. Banden überproduzierter Polypeptide mit Molekulargewichten von mehr als 116 000 Dalton, die in mit λgt11 infizierten Kontrollen fehlten, waren β-Galactosidase-PRV-Fusionspolypeptide. Die β-Galactosidase-PRV-Fusionspolypeptide lagen im Größenbereich von 129 000 bis 158 000 Dalton. Ungefähr 50-75 ug Fusionspolypeptid wurde in vollständigem Freund'schen Adjuvans resuspendiert und pro Maus subkutan und interperitoneal injiziert. Spätere Injektionen erfolgten intraperitoneal in vollständigem Freund'schen Adjuvans.
5. Antiseren-Analyse
Immunpräzipitationen von ¹&sup4;C-Glucosamin ICP's, ³&sup5;S-Methionin ICP's und ¹&sup4;C-Glucosamin gX wurden, wie zuvor beschrieben (T.J. Rea et al., s. oben) ausgeführt. Diese Techniken zeigten, daß gp63 und gI in einem rekombinanten λgt11- Phagen isoliert worden waren. Wir nannten diese Phagen λ37 und λ36 (gp63) und λ23 (gI).
6. DNA Mini-preps
Bakteriophagen wurden schnell aus Schalenlysaten isoliert (T.J. Silhavy et al., "Experiments With Gene Fusions", (1984)). 5% und 40% Glycerin (jeweils 3 ml in 5M-Puffer) wurden gestuft in ein SW41-Röhrchen geschichtet. Ein Schalenlysat ( 6 ml) wurde als Schicht aufgebracht und bei 35 000 Upm 60 min lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Phagenpellet wurde in 1 ml SM resuspendiert. DNAse I und RNAse A wurden bis zur jeweiligen Endkonzentrationen von 1 ug/ml und 10 ug/ml zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37ºC wurden 200 ul SDS Mix (0,25 m EDTA, 0,5 M Tris (pH 7,8), 2,5% SDS) und Proteinase K (auf 1 mg/ml) zugesetzt und bei 68ºC 30 min lang inkubiert. Die NDNA wurde dreimal mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Ein durchschnittliches 150 mm Schalenlysat ergibt 5- 10 ug NDNA.
7. Analyse der λPRV-DNA
PRV-DNA wurde vollständig mit BamHI und KpnI verdaut, in 0,8%iger Agarose elektrophoretisch aufgetrennt und mit Hilfe des Verfahrens von Southern (J. Mol. Biol., 98, S. 503-17 (1975)) auf Nitrocellulose übertragen. Die Blots wurden in 4 mm breite Streifen zerschnitten und entwässert bei 20-25 gelagert. λPRV-DNAs wurden bis auf spezifische Aktivitäten von ungefähr 10&sup8; cpm/ug Nick-translatiert (Amersham). Die Prähybridisierung erfolgte 1 h lang bei 70ºC in 6x SSC, 30% Formamid, 1x Denhardt's-Reagens (jeweils 0,02% Ficoll, Polyvinylpyrrolidon und Rinderserumalbumin), 0,1% SDS, 50 ug/ml heterologe DNA. Die Hybridisierung erfolgte 16 h lang in derselben Lösung bei 70ºC. 15 min dauernde Waschstufen wurden zweimal in 2x SSC, 0,1% SDS und zweimal in 0,1x SSC und 0,1% SDS ausgeführt, jeweils bei 20-25ºC. Die Blots wurden mit einem Verstärkerverfahren bei -70ºC über Nacht autoradiographiert.
Durch Southernblots ließen sich die PRV-Glycoproteingene, die in λ23, λ36 und λ37 enthalten waren, dem BamHI 7- Fragment in der einzelnen kleinen Region (s. T.J. Rea et al., oben) zuordnen. Eine genauere Kartierung dieses Fragmentes zeigte, daß das λ23 (gI)-Gen distal zum gX-Gen angeordnet war, und daß sich die Kartierung von λ37 der internen Region von BamHI 7 zuordnen ließ, wie in Diagramm D dargestellt.
8. Sequenzierung der gp63- und gI-Gene
Es wurde festgestellt, daß die PRV-DNA in λ36 und λ37 eine StuI-Schnittstelle enthielt. Es gibt nur eine StuI- Schnittstelle im BamHI 7-Fragment; deshalb wurde der offene Leserahmen, der die StuI-Schnittstelle enthielt, sequenziert. Diagramm E zeigt verschiedene Restriktionsenzym-Schnittstellen, die im gp63-Gen und den flankierenden Regionen vorhanden sind. BamHI 7 wurde subkloniert und mit diesen Restriktionsenzymen verdaut. Jedes der durch die Restriktionsenzyme gebildeten Enden wurde unter Verwendung von Polynukleotidkinase mit γ-³²P-ATP markiert und nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert, Methods Enzymol., 65, 499-560 (1980) sequenziert.
Das Plasmid pPR28 wird durch Klonieren des aus pUC1129 isolierten BamHI 7-Fragments in Plasmid pSV2 gpt (R.C. Mulligan und P. Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5.2072- 76 (1981)) gebildet.
Das Plasmid pPR28-1 wurde durch Verdauen von pPR28 mit PvuII und dann Rezirkularisierung desjenigen Stücks, welches den E. coli-Ursprung der Replikation und das bla-Gen enthält, erzeugt, wobei ein Plasmid entstand, das ein die DNA-Sequenz für gI enthaltendes, 4,9 kB langes PvuII/BamHI 7-PRV-Fragment enthält.
Diagramm N zeigt verschiedene Restriktionsenzym-Schnittstellen, die im gI-Gen und flankierenden Regionen angeordnet sind. BamHI 7 wurde wie oben erläutert, subkloniert, verdaut, markiert und sequenziert.
Die DNA-Sequenzen für die Glycoproteine gp63 und gI sind jeweils in den Diagrammen B und C dargestellt. Diese DNA kann verwendet werden, um aktiv mit PRV infizierte Tiere auf zufinden. Beispielsweise könnte man einen Nasen- oder Rachenabstrich nehmen und dann mit Hilfe von standardmäßigen DNA/DNA- Hybridisierungsverfahren das Vorliegen von PRV detektieren.

B e i s p i e l 4

In diesem Beispiel erläutern wir die Expression von gI in Säugerzellen.
Ein das gI-Gen enthaltendes BamHI 7-Fragment wird aus dem Plasmid pPR28 (s. oben) durch Verdauen des Plasmids mit BamHI, Auftrennen der Fragmente auf Agarosegel und dann Ausschneiden des Fragmentes aus dem Gel isoliert.
Nachfolgend wird nun auf Diagramm O Bezug genommen. Das wie oben isolierte BamHI 7-Fragment wird dann in das Plasmid puC19 (bezogen von Pharmacia/PL) kloniert, wobei Plasmid A gebildet wird. Plasmid A wird mit DraI verdaut. DraI spaltet die pUC19-Sequenz an verschiedenen Stellen, jedoch nur einmal in der BamHI 7-Sequenz zwischen den gp63- und gI-Genen (Diagramm D), wobei u. a. Fragment 1 entsteht. An die DraI-Enden der Fragmente einschließlich des Fragmentes 1 werden BamHI-Linker ligiert, und die gebildete Fragment-Mischung wird mit BamHI verdaut. Die erzeugten Fragmente werden durch Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, und das das gI-Gen enthaltende Fragment 2 (2,5 kB) wird gereinigt. Fragment 2 wird in mit BamHI verdautes puC19 kloniert, wobei Plasmid pUCD/B entsteht. Von den zwei so gebildeten Plasmiden wird dasjenige Plasmid, das das gI-Gen in der passenden Orientierung enthält, durch Verdauen der Plasmide mit BsmI und EcoRI bestimmt; das Plasmid in der richtigen Abfolge enthält ein charakteristisches 759 Bp langes BsmI/EcoRI-Fragment.
Im folgenden sei nun auf Diagramm P Bezug genommen. Das Plasmid pUCD/B (Diagramm O) wird mit BsmI und EcoRI verdaut und das größere Fragment (Fragment 3, 4,4 kB) wird mit Hilfe von Agarosegel-Elektrophorese gereinigt. Die folgenden beiden Oligonukleotide werden chemisch mit Hilfe von gutbekannten Techniken synthetisiert oder aber von einem gewerblichen Dienstleistungsunternehmen, das Synthesen auf Anforderung anbietet, bezogen:
Diese Oligonukleotide werden an Fragment 3 ligiert, wobei die Codierungssequenz für den C-Terminus des gI-Gens ersetzt wird, welches durch die BsmI-Spaltung weggefallen war. Das gebildete Plasmid, pGI, enthält eine vollständige Codierungsregion des gI-Gens mit einer BamHI-Schnittstelle stromaufwärts und einer EcoRI-Schnittstelle stromabwärts zu den für gI codierenden Sequenzen gelegen.
Plasmid pGI wird mit EcoRI und BamHI verdaut, und ein 1,8 kB langes, das gI-Gen enthaltendes Fragment (Fragment 4) wird auf einem Agarosegel gereinigt.
Das Plasmid pSV2dhfr (s. oben) wird mit EcoRI und dann mit BamHI geschnitten, wobei das den dhfr-Marker enthaltende Fragment 5 (5,0 kB) gebildet wird, welches mit Agarosegel- Elektrophorese isoliert wird. Dann werden die Fragmente 4 und 5 ligiert, wobei das Plasmid pDGI erzeugt wird, welches die Dihydrofolatreduktase- und Ampicillinresistenz-Marker, den Protomor und den Replikationsursprung aus SV40 und das gI-Gen enthält.
Nachfolgend sei nun auf Diagramm Q Bezug genommen. Der nächstgelegene frühe Promotor (immediate early promoter) aus dem Towne-Stamm des humanen Cytomegalovirus wird stromaufwärts zum gI-Gen angefügt. Das Plasmid pDGI wird mit BamHI verdaut, wobei Fragment 6 erzeugt wird. Der nächstgelegene frühe Promotor des humanen Cytomegalovirus (Towne) wird isoliert (s. oben), wobei Fragment 7 erzeugt wird. Die Fragmente 6 und 7 werden dann unter Bildung des Plasmids pDIEGIdhfr ligiert. Um sicherzustellen, daß der Promotor in der richtigen Orientierung angeordnet ist, wird das Plasmid mit den Restriktionsenzymen SacI und BstEII verdaut. Die Erzeugung eines etwa 400 Bp langen Fragmentes zeigte die richtige Orientierung an.
Ein das Polyadenylierungssignal des Rinderwachstumshormons (BGH) enthaltendes, 0,6 kB langes PvuII/EcoRI-Fragment wird aus dem Plasmid pSVCOW7 (s. oben) isoliert, wobei Fragment 8 gebildet wird. Fragment 8 wird zwischen die Schnittstellen SmaI/EcoRI von pUC9 (s. oben) kloniert, wobei das Plasmid pCOWT1 entsteht. pCOWT1 wird mit SalI geschnitten und mit T4 DNA-Polymerase versetzt, und daran werden EcoRI-Linker ligiert. Die so erzeugte Fragmentmischung wird dann mit EcoRI verdaut, und ein 0,6 kB langes Fragment wird isoliert (Fragment 9). Fragment 9 wird in die EcoRI-Schnittstelle von pUC19 kloniert, wobei das Plasmid pCOWT1E gebildet wird. pCOWT1E wird mit EcoRI verdaut, wobei das Fragment 10 (600 Bp) entsteht.
Das Plasmid pDIEGIdhfr wird mit EcoRI verdaut und mit dem das Polyadenylierungssignal von bGH enthaltenden Fragment 10 ligiert, wobei das Plasmid pDIEGIPA entsteht. Daß dieses Plasmid das gI-Gen in der richtigen Orientierung aufweist, wird durch Bildung eines 1400 Bp langen Fragments auf Verdauen von BamHI und BstEII hin gezeigt.
Das gebildete Plasmid wird in dhfr&supmin; Ovariumzellen des chinesischen Hamsters transfiziert, und dhfr&spplus;-Zellen werden zur Gewinnung von gI exprimierenden Zellinien selektioniert (Subramani et al., Mol. Cell Biol., 1, S. 854-64 (1981)). Die Expression von gI wird durch die Selektion von Klonen transfizierter Zellen amplifiziert, welche das Wachstum in zunehmend höheren Konzentrationen Methotrexat (McCormick et al., Mol. Cell Biol., 4, S. 166-72 (1984)) überleben.

B e i s p i e l 5

In diesem Beispiel beschreiben wir die Expression von gp63 in Säugerzellen.
Das BamHI 7-Fragment von PRV-DNA (s. oben) wird aus pPRXh1 [NRRL B-15772] isoliert und für die Verwendung zum Sequenzieren und Produzieren von mehr Kopien des gp63-Gens in die BamHI-Schnittstelle des Plasmids pBR322 wie in Beispiel 1 subkloniert.
Im folgenden wird auf Diagramm R Bezug genommen. Aus dem Inneren von BamHI 7 wird ein 1,9 kB langes BstEII/KpnI- Fragment (Fragment 1) subkloniert, indem BamH7 mit BstEII geschnitten wird, die Enden-mit T4 DNA-Polymerase versetzt werden und dann mit KpnI geschnitten wird. Das Fragment 1 wird isoliert und zwischen die KpnI- und SmaI-Schnittstellen in pUC19 (bezogen von Pharmacia/PL, Piscataway, NJ) kloniert, wobei das Plasmid pPR28-IBK entsteht.
Das Plasmid pPR28-IBK wird mit DraI plus MaeIII geschnitten, wobei das Fragment 2 (1,1 kB) entsteht. Die DraI-Schnittstelle liegt außerhalb der codierenden Region des gp63-Gens und stromabwärts von seinem Polyadenylierungssignal. Die MaeIII-Schnittstelle schneidet 21 Basen stromabwärts vom ATG- Initiationscodon des gp63-Gens. Um die vom gp63-Gen entfernte codierende Region zu ersetzen, werden die folgenden beiden Oligonukleotide chemisch synthetisiert oder von einem gewerblichen Dienstleistungsunternehmen, das Synthesen auf Anforderung anbietet, bezogen (Fragment 4):
Das Plasmid pSV2dhfr, s. oben, wird mit EcoRI geschnitten, mit T4 DNA-Polymerase versetzt und dann mit BamHI geschnitten, und das größere (5,0 kB lange) Fragment wird isoliert, wobei das den dhfr-Marker enthaltende Fragment 4 gebildet wird. Dann werden die Fragmente 2, 3 und 4 ligiert, wobei das Plasmid pGP63dhfr gebildet wird.
Nachfolgend soll nun auf Diagramm S Bezug genommen werden. Der nächstgelegene frühe Promotor (immediate early promoter) des Towne-Stamms des humane Cytomegalovirus wird stromaufwärts vom gp63-Gen angefügt. pGP63dhfr wird mit BamHI verdaut und mit bakterieller alkalischer Phosphatase versetzt, wobei das Fragment 5 gebildet wird. Ein 760 Bp langes Sau3A- Fragment, welches den nächstgelegenen frühen Promotor des humanen Cytomegalovirus (Towne) enthält, wird unter Bildung des Fragments 6 isoliert. Diese Fragmente werden dann ligiert, wobei das Plasmid pIEGP63dhfr entsteht. Um sicherzustellen, daß der Promotor in der richtigen Orientierung angeordnet ist, wird das Plasmid mit SacI und PvuII verdaut, und ein 150 Bp langes Fragment wird gebildet.
Das gebildete Plasmid wird in dhfr&supmin; Ovariumzellen des chinesischen Hamsters transfiziert, und dhfr&spplus;-Zellen werden selektioniert, um gp63 exprimierende Zellinien zu gewinnen. Da die Syntheserate von gp63 mit diesem System zu gering war, um mit den von uns verwendeten Verfahren aufgefunden zu werden, erzeugten wir das Polypeptid in Vaccina-Virus, wie nachfolgend beschrieben.

B e i s p i e l 6

In diesem Beispiel erläutern wird die Expression von gp63 in Vaccina-Virus. Das hier verwendete Verfahren umfaßt Ausgestaltungen anderer Synthesen, auf die oben hingewiesen wurde.
Die Fragmente 1, 2, 3 und 4 werden gemäß Beispiel 5 erzeugt.
Das Plasmid pGS20 (Mackett et al., J. Virol., 49, S. 857-64 (1984)) wird mit BamHI und 5mal geschnitten und das größere, 6,5 kB lange Fragment wird mit Hilfe von Gelelektrophorese isoliert. Das Fragment 2, die Oligonukleotide und das pGS20-Fragment werden unter Bildung von Plasmid pVV63 miteinander ligiert. Dieses Plasmid wird in mit dem WR-Stamm des Vaccina-Virus (ATCC VR-199) infizierte CV-1-Zellen (ATCC CCL 70) transfiziert, durch Ausplattieren auf 143-Zellen (ATCC CRL 8303) in BUdR auf Thymidinkinase-negative Rekombinanten selektioniert, wobei die von Mackett et al. in DNA-Cloning, Band II: "A Practical Approach", D.M. Glover, Hrsg., IRL Press, Oxford (1985) beschriebenen Verfahren verwendet wurden. Das gebildete Virus, Vaccina-gp63, exprimiert gp50 in infizierten Zellen, was durch Markieren der Proteine der infizierten Zel- Zellen, was durch Markieren der Proteine der infizierten Zellen mit ¹&sup4;C-Glucosamin und Immunpräzipitation mit Antiserum gegen gp63 getestet wurde.
Das BamHI/EcoRI-Fragment aus Plasmid pGI, das DraI/MaeIII-Fragment aus Plasmid pPR28-lBK, oder das BamHI/MaeIII-Fragment aus pBGP50-23, die alle voranstehend beschrieben wurden, können auch mit Bal31 behandelt und in pTRZ4 (hergestellt wie in der anhängigen U.S.-Patentanmeldung SN 606 307 beschrieben) insertiert werden, wie in Rea et al., s. oben, beschrieben, und zur Transformation von E. coli verwendet wurden. Mit Hilfe dieses Verfahrens können gp50, gp63 und gI als Fusionsprotein in E. coli gebildet werden.
Auch könnte beispielsweise durch Substitution von pSV2dhfr in obigem Beispiel durch pSV2neo (zu beziehen von der American Type Culture Collection) das rekombinante, das PRV- Glycoprotein-Gen enthaltende Plasmid in andere Wirtszellen transformiert werden. Die transformierten Zellen würden durch Resistenz gegenüber Antibiotikum G418 selektioniert werden, welche durch das Plasmid codiert wird.
Man kann auch die Polypeptide der vorliegenden Erfindung in Insektenzellen wie folgt exprimieren: Durch das Anfügen eines BamHI-Linkers an die EcoRI-Schnittstelle von pD50 und Verdauung mit BamHI oder das Anfügen eines BamHI-Linkers an die EcoRI-Schnittstelle von pGP63dhfr und Verdauung mit BamHI, oder durch Verdauen von pUCD/B mit BamHI erhält man BamHI- Fragmente, die das gp50-, das gp63- bzw. das gI-Gen enthalten. Diese BamHI-Fragmente können in eine stromabwärts zum Polyhedrin-Promotor gelegene BamHI-Schnittstelle in pAC373 (Mol. Cell. Biol., 5, S. 2860-65 (1985)) kloniert werden. Die so gebildeten Plasmide können zusammen mit DNA aus Baculovirus Autographa californica in Sf9-Zellen cotransfiziert und rekombinante Viren durch in diesem Artikel beschriebene Verfahren isoliert werden. Diese rekombinanten Viren erzeugen nach Infektion von Sf9-Zellen gp50, gp63 oder gI.
Ein unter Verwendung eines Glycoproteins der vorliegenden Erfindung oder eines immunogenen Fragments davon hergestellter Impfstoff kann aus fixierten Wirtszellen, einem Wirtszellextrakt oder einer teilweise oder vollständig gereinigten PRV- sche Synthese erzeugt bestehen. Das erfindungsgemäß hergestellte PRV-Glycoprotein-Immunogen ist vorzugsweise frei von PRV-Virus. Deshalb besteht das Impfstoff-Immunogen der Erfindung im wesentlichen gänzlich aus dem gewünschten immunogenen PRV-Polypeptid und/oder anderen PRV-Polypeptiden, die PRV- Antigenität aufweisen.
Das Immunogen kann mit Hilfe gut bekannter Verfahren als Impfstoff-Dosisform hergestellt werden. Der Impfstoff kann intramuskulär, subkutan oder intranasal verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung, beispielsweise als intramuskuläre Injektion, kann das Immunogen mit einem geeigneten Träger zusammengegeben werden, beispielsweise kann es in Wasser, Salzlösung oder gepufferten Vehikeln mit oder ohne verschiedenen Adjuvantien oder immunmodulierenden Agentien einschließlich Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat; Aluminiumkaliumsulfat (Alaun), Berylliumsulfat, Siliziumdioxid, Kaolin, Kohlenstoff bzw. Kohle, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Öl-in-Wasser- Emulsionen, Muramyldipeptid, bakteriellem Endotoxin, Lipid X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnes), Bordetella pertussis, Polyribonucleotiden, Natriumalginat, Lanolin, Lysolecithin, Vitamin A, Saponin, Liposomen, Levamisol, DEAE- Dextran, Block-Copolymeren oder anderen synthetischen Adjuvantien verabreicht werden. Solche Adjuvantien sind kommerziell von verschiedenen Quellen zu beziehen, beispielsweise Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.). Ein anderes geeignetes Adjuvans ist das Freund'sche unvollständige Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Michigan).
Der Anteil an Immunogen und Adjuvans kann innerhalb eines weiten Bereichs schwanken, sofern beide Teile in wirksamen Mengen vorliegen. Beispielsweise kann Aluminiumhydroxid in einer Menge von etwa 0,5% der Impfstoffmischung vorhanden sein (Al&sub2;O&sub3; als Basis). Bezogen auf die Dosis kann die Konzentration des Immunogens von etwa 1,0 ug bis etwa 100 mg pro Schwein reichen. Ein bevorzugter Bereich ist etwa 100 ug bis etwa 3,0 mg pro Schwein. Eine geeignete Dosisgröße beträgt etwa 1-10 ml, vorzugsweise etwa 1,0 ml. Dementsprechend würde beispielsweise eine Dosis für die intramuskuläre Injektion 1 ml mit einem Gehalt von 1,0 mg Immunogen in Mischung mit 0,5% Aluminiumhydroxid enthalten. Vergleichbare Dosisformen können auch für die parenterale Verabreichung an Ferkel hergestellt werden, jedoch wird hier die Menge an Immunogen pro Dosis geringer sein, beispielsweise etwa 0,25 bis etwa 1,0 mg/Dosis.
Für die Impfung von Mutterschweinen kann ein Schema mit zwei Dosierungen verwendet werden. Die erste Dosierung kann von einigen Monaten bis zu etwa 5-7 Wochen vor dem Ferkeln verabreicht werden. Die zweite Dosis des Impfstoffs sollte dann einige Wochen nach der ersten Dosis, beispielsweise etwa 2-4 Wochen später, gegeben werden, und der Impfstoff kann dann bis zum Ferkeln, jedoch davor, verabreicht werden. Alternativ kann der Impfstoff in einer einzelnen, 2 ml umfassenden Dosis, beispielsweise 5-7 Wochen vor dem Ferkeln, verabreicht werden. Die Verabreichung in zwei Dosen wird jedoch für die wirksamste Immunisierung der Ferkel bevorzugt. Für das Züchten von Tieren wird die halbjährliche Auffrischung empfohlen. Eber können jederzeit nachgeimpft werden. Auch kann die Impfung von weiblichen Schweinen aufgefrischt werden, bevor sie trächtig sind. Von ungeimpften Mutterschweinen geborene Ferkel können nach etwa 3-10 Tagen, nochmals nach 4-6 Monaten und daraufhin jährlich oder vorzugsweise halbjährlich geimpft werden.
Der Impfstoff kann auch mit anderen Impfstoffen für andere Krankheiten kombiniert werden, um mehrfach wirksame Vaccine herzustellen. Er kann auch mit anderen Arzneimitteln, beispielsweise Antibiotika, zusammengegeben werden. Eine pharmazeutisch wirksame Menge des Impfstoffs kann mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel verwendet werden, um Tiere, wie beispielsweise Schweine, Rinder, Schafe, Ziegen und andere Säugetiere zu impfen.
Andere Impfstoffe können nach den Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannten Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise in I. Tizard, "An Introduction to Veterinary Immunology", 2. Auflage (1982) beschrieben und diese Literaturstelle wird vorliegend durch das Zitieren umfaßt.
Wie weiter oben erläutert, wurde gefunden, daß in den kommerziellen Impfstoff-PRV's die gI- und gp63-Gene deletiert sind. Deshalb können die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten gI- und gp63-Polypeptide als diagnostische Mittel zur Unterscheidung zwischen mit diesen kommerziellen Vaccinen geimpften Tieren und solchen, die mit virulentem Virus infiziert sind, verwendet werden.
Man könnte beispielsweise zur Unterscheidung zwischen infizierten und geimpften Tieren einen ELISA-Test durchführen. Man kann gI- oder gp63-Protein, das beispielsweise in E. coli mit Hilfe von Techniken mit rekombinanter DNA (Rea et al., s. oben) hergestellt wurde, in die Vertiefungen geeigneter Kunststoffschalen geben und ausreichend Zeit lassen, damit es an den Kunststoff absorbiert wird (beispielsweise über Nacht, 20-25ºC). Die Schalen werden gewaschen, und ein Blockierungsmittel (beispielsweise BSA) wird zugesetzt, um eventuell unumgesetzte Steilen auf der Kunststoffoberfläche zu neutralisieren. Es schließt sich ein Waschschritt an, und dann wird das Schweineserum in die Vertiefungen gegeben. Nach etwa lstündiger Inkubation bei 20-25ºC werden die Vertiefungen gewaschen, und ein Protein A-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat wird für eine etwa 1-stündige Inkubation bei 20-25ºC zur jeder Vertiefung zugegeben. Ein weiterer Waschschritt schließt sich an und das Enzymsubstrat (o-Phenylendiamin) wird in die Vertiefungen gegeben, und die Reaktion wird mit Säure beendet. Die Absorption wird bei 492 Nanometer gemessen, um die im Serum vorhandene Menge an gI- oder gp63-Antikörper quantitativ zu bestimmen. Ein Fehlen von gI oder gp63 zeigt, daß das Tier nicht infiziert ist. Beim Testen auf andere PRV-Antigene könnte man feststellen, ob ein bestimmtes Tier geimpft war oder nicht. DIAGRAMM A DIAGRAMM A (Fortsetzung): DIAGRAMM B DIAGRAMM B (Fortsetzung): DIAGRAMM C DIAGRAMM C (Fortsetzung): DIAGRAMM C (Fortsetzung): DIAGRAMM D. BamHI 7-Fragment von PRV x = Glycoprotein X (gX) 50 = Glycoprotein 50 (gp50) 63 = Glycoprotein 63 (gp63) I = Glycoprotein I (gI)

DIAGRAMM E. Konstruktion von pPR28-4 und pPR28-1

(a) BamHI 7 wird mit BamHI und PvuII verdaut und liefert die Fragmente 1 (1,5 kB) und 2 (4,9 kB). Fragment
(b) Die Fragmente 1 und 2 werden separat zwischen die BamHI- und PvuII-Schnittstellen von pBR322 insertiert, wobei
entsteht. DIAGRAMM F. Restriktionsenzym-Schnittstellen, die für Sequenzierung von gp50 verwendet werden.

DIAGRAMM G. Konstruktion von pPR28-4 Nar2

(a) pPR28-4 wird mit NarI verdaut, wobei Fragment 3 entsteht.
(b) BamHI-Linker werden dem Fragment zugefügt, und dann wird es mit BamHI versetzt, wobei Fragment 4 entsteht.
(c) Fragment 4 wird mit DNA-Ligase zirkularisiert, wobei pPR28-4 Nar2 entsteht.

DIAGRAMM H. Anordnung des vollständigen gp50-Gens.

(a) pPR28-4 Nar2 wird mit BamHI und PvuII verdaut, wobei Fragment 5 (160 Bp) entsteht.
(b) pPR28-1 wird mit BamHI und PvuII verdaut, wobei Fragment 6 (4,9 kB) entsteht.
(c) pPGXl wird mit BamHI verdaut, mit BAP versetzt und dann mit den Fragmenten 5 und 6 ligiert, wobei pBGP50-23 entsteht.

DIAGRAMM I. Herstellung des Plasmids pD50

(a) pBGP50-23 wird mit MaeIII geschnitten und mit T4 DNA- Polymerase glattendig gemacht, EcoRI-Linker werden zugesetzt, und es wird mit EcoRI verdaut, worauf mit BamHI geschnitten wird. Es entsteht Fragment 7 (1,3 kB).
(b) Plasmid pSV2dhfr wird mit BamHI und EcoRI geschnitten, wobei man Fragment 8 (5,0 kB) erhält.
(c) Plasmid pD50 wird durch Ligieren der Fragmente 7 und 8 erzeugt. dhf r = Dihydrofolatreduktase-Gen SV40 Ori = Promotor und Replikationsursprung von SV40 Amp® = Ampicillinresistenz-Gen

DIAGRAMM J. Herstellung des Plasmids pDIE50

(a) pD50 wird mit BamHI verdaut und mit BAP versetzt, wobei Fragment 9 entsteht.
(b) Fragment 10 (760 Bp) wird isoliert, das den nächstgelegenen frühen Promotor (immediate early promoter) des humanen Cytomegalovirus (Towne) enthält.
(c) Die Fragmente 9 und 10 werden unter Bildung des Plasmids pDIE50 ligiert.

DIAGRAMM K. Herstellung des Plasmids pDIE50PA

(a) Plasmid pSVCOW7 wird mit PvuII und EcoRI geschnitten, wobei das Fragment 11 erzeugt wird. Fragment
(b) Fragment 11 wird in pUC9 kloniert, wobei pCoWT1 gebildet wird. wird.
(c) pCOWT1 wird mit SalI geschnitten, mit T4 DNA-Polymerase glattendig gemacht, und EcoRI-Linker werden angefügt, worauf unter Bildung von Fragment 12 (0,6 kB) mit EcoRI verdaut wird. (auf der aufgefüllten SalI-Schnittstelle)
(d) Plasmid pDIE50 wird mit EcoRI geschnitten, und unter Erzeugung von Plasmid pDIE50PA wird Fragment 12 dorthinein kloniert. A = Rinderwachstums- (bGH) Polyadenylierungssignal G = genomisches Rinderwachstumshormon (bGH) P = nächstgelegener (immediate) früher Promotor des humanen Cytomegalovirus (Towne)

DIAGRAMM L. Herstellung des Plasmids pDIE50T

(a) Plasmid pDIE50 wird mit SalI und EcoRI verdaut, wobei ein 5,0 kB langes Fragment
und ein 0,7 kB langes Fragment
entsteht.
(b) Das 0,7 kB lange Fragment wird mit Sau3AI verdaut, und ein 0,5 kB langes SalI/Sau3AI-Fragment wird isoliert.
(c) Das 5,0 kB lange EcoRI/Sall-Fragment, das 0,5 kB lange SalI/Sau3AI-Fragment und die miteinander hybridisierten Oligonukleotide (s. Text) werden ligiert, wobei Plasmid pDIE50T entsteht. T = Stopcodon. DIAGRAMM M. Für die Sequenzierung von gp63 verwendete Restriktionsenzym-Schnittstellen DIAGRAMM N. Für die Sequenzierung von gI verwendete Restriktionsenzym-Schnittstellen.

DIAGRAMM O. Konstruktion des Plasmids pUCD/B

(a) Ein BamHI 7-Fragment wird unter Bildung des Plasmids A in Plasmid pUC19 kloniert.
(b) Plasmid A wird mit DraI unter Erzeugung des Fragments 1 verdaut.
(c) Nach dem Anheften von BamHI-Linkern an Fragment 1 wird dieses mit BamHI verdaut, wobei Fragment 2 (2,5 kB) entsteht.
(d) Fragment 2 wird in mit BamHI verdautes pUC19 kloniert, wobei Plasmid pUCD/B gebildet wird. 7 = BamHI 7-Fragment I = Glycoprotein gI

DIAGRAMM P. Konstruktion des Plasmids pDGI

(a) Plasmid pUCD/B wird mit BsmI und EcoRI verdaut, wobei Fragment 3 (4,4 kB) entsteht.
(b) Man erhält die folgenden beiden synthetischen Oligonukleotide:
(c) Die synthetischen Oligonukleotide und Fragment 3 werden ligiert, wobei Plasmid pGI entsteht.
(d) Plasmid pGI wird unter Bildung des Fragments 4 (1,8 kB) mit EcoRI und BamHI verdaut.
(e) Plasmid pSV2dhfr wird mit EcoRI geschnitten und dann mit BamHI geschnitten, wobei man Fragment 5 (5,0 kB) erhält.

DIAGRAMM P (Fortsetzung):

(f) Die Fragmente 4 und 5 werden unter Erzeugung des Plasmids pDGI ligiert. dhfr = Dihydrofolatreduktase-Gen SV40 Ori = Promotor und Replikationsursprung von SV40 Amp® = Ampicillinresistenz

DIAGRAMM Q. Konstruktion des Plasmids pDIEGIPA

(a) Plasmid pDGI wird unter Bildung des Fragments 6 mit BamHI geschnitten.
(b) Das den nächstgelegenen (immediate) frühen Promotor des humanen Cytomegalovirus (Towne) enthaltende Fragment 7 (760 Bp) wird isoliert.
(c) Die Fragmente 6 und 7 werden unter Erzeugung des Plasmids pDIEGIdhfr ligiert.
(d) Das Plasmid pSVCOW7 wird unter Bildung des Fragments 8 mit PvuII und EcoRI geschnitten.

DIAGRAMM Q (Fortsetzung):

(e) Fragment 8 wird in pUC9 kloniert, wobei das Plasmid pCOWTl entsteht.
(f) pCOWT1 wird mit SalI geschnitten und mit T4 DNA-Polymerase behandelt. Dann werden EcoRI-Linker anligiert, worauf mit EcoRI unter Erzeugung des Fragments 9 (0,6 kB) verdaut wird. (auf der aufgefüllten SalI-Schnittstelle)
(g) Das Fragment 9 wird in die EcoRI-Schnittstelle von pUC19 kloniert, wobei Plasmid pCOWTlE entsteht.
(h) pCOWT1E wird mit EcoRI verdaut, wobei Fragment 10 (600 Bp) entsteht.
(i) Plasmid pDIEGIdhfr wird mit EcoRI verdaut und mit dem das bGH-Polyadenylierungssignal enthaltenden Fragment 10 ligiert, wobei Plasmid pDIEGIPA gebildet wird. A = Rinderwachstums- (bGH- ) Polyadenylierungssignal G = genomisches Rinderwachstumshormon (bGH) P = nächstgelegener (immediate) früher Promotor des humanen Cytomegalovirus (Towne)

DIAGRAMM R. Konstruktion von pGP63dhfr

(a) BamHI 7 wird mit BstEII verdaut, mit T4 DNA-Polymerase versetzt und dann mit KpnI geschnitten, wobei Fragment 1 (1,9 kB) entsteht.
(b) Fragment 1 wird dann zwischen die KpnI- und Smal-Schnittstellen des Plasmids pUC19 kloniert, wobei Plasmid pPR28-1BK entsteht.
(c) Das Plasmid pPR28-1BK wid mit DraI und MaeIII geschnitten, wobei Fragment 2 (1,1 kB) gebildet wird.
(d) Das Plasmid pSV2dhfr wird mit EcoRIugeschnitten, mit T4 DNA-Polymerase versetzt und dann mit BamHI geschnitten, wobei Fragment 3 (5,0 kB) erhalten wird.
(e) Zwei Oligonukleotide werden zur Bildung des Fragments 4 synthetisiert.

DIAGRAMM R (Fortsetzung):

(f) Die Fragmente 2, 3 und 4 werden dann unter Bildung des Plasmids pGP63dhfr ligiert. dhfr = Dihydrofolatreduktase-Gen SV40 Ori = Promotor und Replikationsursprung von SV40 Amp® = Ampicillinresistenz

DIAGRAMM S.

(a) pGP63dhfr wird mit BamHI verdaut und mit BAP behandelt, wobei Fragment 5 entsteht.
(b) Das den nächstgelegenen (immediate) frühen Promotor des humanen Cytomegalovirus (Towne) enthaltende Fragment 6 (760 Bp) wird isoliert.
(c) Die Fragmente 5 und 6 werden ligiert, wobei das Plasmid pIEGP63dhfr gebildet wird.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine DNA-Sequenz, die operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, wobei die DNA-Sequenz für ein die Immunogenität des Pseudorabiesvirus-Glycoproteins gp50, gp63 oder gI aufweisendes Polypeptid codiert, und das Glycoprotein die in Diagramm A, B bzw. C dargestellte Aminosäuresequenz besitzt.

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, worin die für das Polypeptid codierende DNA-Sequenz die in Diagramm A, B oder C dargestellte Nukleotidsequenz oder ein Fragment oder ein Derivat davon ist, welches für ein die Immunogenität von Pseudorabiesvirus aufweisendes Polypeptid codiert.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Glycoprotein bzw. die Nukleotidsequenz das bzw. die in Diagramm C gezeigte ist.

4. Mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der voranstehenden Ansprüche transformierte Wirtszelle.

5. Wirtszelle nach Anspruch 4, die bakteriellen, fungalen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs ist.

6. Wirtszelle nach Anspruch 5, die E. coli, eine Hefezelle oder eine Ovariumzelle des chinesischen Hamsters ist.

7. Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids wie in Anspruch 1 definiert, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 4 bis 6.

8. Verwendung eines die Immunogenität von Pseudorabiesvirus-Glycoprotein gp63 oder gI aufweisenden Polypeptids, wobei das Glycoprotein die in Diagramm B bzw. C abgebildete Aminosäuresequenz besitzt, für die serologische Unterscheidung zwischen einem Lebewesen, dem ein Pseudorabiesvirus-Impfstoff verabreicht wurde, dem gp63 oder gI fehlt, und einem mit Pseudorabiesvirus infizierten Lebewesen, ohne das Lebewesen zu töten.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Glycoprotein die in Diagramm C gezeigte Sequenz besitzt und dem Virus gI fehlt.

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, umfassend einen Enzym-assoziierten Immunosorbens-Test.

11. Kit für die Verwendung bei der serologischen Unterscheidung wie in einem der Ansprüche 8 bis 10 definiert, umfassend eine vielzahl von Behältern, von denen einer das Polypeptid enthält.