JPH05502595A

JPH05502595A - バリセラ・ゾースターウィルス抗原

Info

Publication number: JPH05502595A
Application number: JP3518065A
Authority: JP
Inventors: バフェイ，アバス
Original assignee: リサーチ　コーポレーション　テクノロジーズ　インコーポレーテッド
Priority date: 1990-10-04
Filing date: 1991-10-04
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2022-10-10
Also published as: DE69132404T2; ATE196163T1; JP3990445B2; ES2150906T3; DK0504388T3; KR920703614A; CA2068654A1; DE69132404D1; US6180369B1; EP0504388A4; EP0504388B1; WO1992006989A1; CA2068654C; EP0504388A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】バリセラ・シースターウィルス抗原技術分野本発明は、哺乳動物の細胞でおけるバリセラ・シースター（Ｖａｒｉｃｅｌ−１ａ−ｚｏｓｔｅｒ）ウィルス（ＶＺＶ）の分泌性の切形の（ｔｒｕｎｃａｔ−ｅｄ）糖蛋白質（Ｔｇｐ）を発現できる組換えプラスミドの構築に関する。本発明の分泌性Ｔｇｐは抗体反応を誘発できる少なくとも一つのエピトープを含む。

本発明は、水痘及び／又は帯状ヘルペスに対するワクチンにおけるこの分泌性Ｔｇｐの生成及び利用を包含する０本発明は、又■Ｚ■の検出のための診断アッセイにおける分泌性Ｔｇｐの使用に間する０本発明は、又分泌性Ｔｇｐに特異的な第一の抗体、及び第一の抗体に特異的な第二の抗体にも関する。これらの第二の抗体は、又■Ｚ■に関する診断アッセイに有用である。

背景技術バリセラ・シースターウィルスは、二つのはつきりした臨床上の症状の発現である小児水痘（バリセラ）及び帯状ヘルペス（シースター）の原因物質である。

バリセラは、ｖＺｖによる一次的な出会い（感染）の結果であり、一方ゾースターは、癌及びＡＩＤＳの患者を含む高齢者及び免疫抑制者に主として起こるｖＺ ■再活性化の結果である。米国において年間２５０万の推定の水痘患者及び１２０万の帯状ヘルペスの患者がある。？！Ｆ状ヘルペスの患者の数は、人口が高齢化するにつれ増加することが予想される。帯状ヘルペスの最も普通の合併症の一つは、皮膚の発疹の開始後４週から数年にわたって続く相互に影響しあう痛みを特徴とするヘルペス後神経痛を含む、ＶＺＶ再活性化（帯状ヘルペス）の他の合併症は、脳炎、肺炎及び播種性シースターを含む。

ＶＺＶは、アルファヘルペスウィルスの群の一つである。ＶＺＶは、約１２５ｏｏＯ塩基対の線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを含み、長ユニーク（Ｕｌ）−逆方向短尺１（ＩＲｓ）−類ユニーク（Ｕｓ）−末端短反復（ＴＲｓ）の塩基配列よりなる。ＶＺＶ（７）ＤＮＡｉ；ｔ、ｇｐＩ、ｇｐＩｒ、ｇｐｍ、ｇｐｌＶ及びｇｐｖと名付けられた５種の糖蛋白質をエンコードし、その内ｇｐｒ−ｇｐｌＶは、感染した細胞及びＶＺピリオンで容易に検出される（Ｄａｖｉｓｏｎ及び５ｃｏｔｔ、Ｊ。

Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６７．１７５９−１８１６．１９８６、Ｄａｖｉｓｏｎら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５７．１１９り−１１９７，１９８６）、これらの糖蛋白質は、非常に免疫原性であり、感染したヒトの不活性化抗体及び細胞媒介免疫応答の両者を導きだす（Ｄａｖｉｓｏｎら、同上、１９８６）。

ピリオンエンベロープ糖蛋白質の中で最も多くしかも免疫原性であるＶＺＶのａｐｒは、補体依存不活性化抗体の形成を引き出し、又抗体依存細胞障Ｗ計媒介する。遺伝子をエンコードするａｐｒは、■Ｚｖゲノムのユニーク短（Ｕｓ）領域に位置する。ｖＺｖ糖蛋白質上の主な抗体結合部位（エピトープ）の一つは、ＶＺＶのｇｐｒで同定されている（Ｖａｆａｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２．２５４４　（１９８８））、このエピトープ（ｅｌと名付けられる）よりなる合成ペプチド（１４個のアミノ酸残基）は、高マンノース中間体（８２ｋＤａ）により認識されたが、ＶＺＶｇｐＩの成熟形（９５ｋＤａ）により認識されなかった抗体応答を誘発した（Ｖａｆａｉら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、１３．３１９−３３６（１９８９）、抗ペプチド抗体の■Ｚｖ不活性化活性の欠如とともにこれらの結果は、ｅｌエピトープの〇−結合及び／又はＮ結合グリコジル化の状態及び程度は、ｇｐＩの立体配座に影響するか、又は抗ペプチド抗体により認識される抗原性決定因子に影響する立体障害を生じさせることを示唆していた。

減感されたバリセラ・シースターウィルスワクチンは、幼児における従来行われているワクチン投与とともに、白血病の小児におけろ水痘の感染に対して日本で使用されてきた。このワクチンは、最近米国において白血病の小児にテストされており、そして健康な小児に使用し、さらに高齢者の■ｚ■再活性化（帯状ヘルペス）の予防に使用することが予想される。減感したバリセラワクチンは、■ｚｖｍ染に対して免疫を誘発するのに安全且つ有効であることが示されているが、天然の感染と同様に、減感したバリセラワクチンは、ヒトの後板神経節に潜伏し、そして再活性化して、ヘルペス後神経痛及び脳炎のその付随する神経性の合併症とともに、帯状ヘルペスを生成する。

そのため、潜伏を避けそして排除するサブユニットワクチンは、■Ｚ■再活性化（帯状ヘルペス）に、よりかかりやすい高齢者に免疫応答を上昇させるとともに、小児の免疫化に望ましい。本発明により含まれるようなこのサブユニットワクチンは、１種以上の■ｚ■糖蛋白質を発現する組換えウィルス（例えばワクシニアウィルス）の構築により製造されるが、又は本発明により特に含まれるように、多量に製造されそして精製されさらに■Ｚ■感染に対する免疫化及び／又は免疫応答の上昇に使用される分泌性の高度に免疫原性の■Ｚ■糖蛋白質の１種以上より構成できる。さらに、これら非常に精製されたＶＺＶ＠蛋白質は、ワクチンを接種されたヒト及び高齢者と＠様に、免疫抑制のヒト（白血病の小児、ＡＩＤＳ及び癌の患者）における■ＺＶ感染に対する免疫の状態の評価のための診断手段として使用できる６ｖｚｖｇｐｒのための遺伝子は、既に単離され、プラスミドに挿入されそしてワクシニアウィルス発現系に組込まれている。ｇｐＩ蛋白質はワクシニア発現系により生成されていたが、生成物は、細胞内に残り、そのため生体内で抗原性応答を導き出すのに適していなかった。

発明の開示本発明の新規さは、哺乳動物の細胞から分泌される切形の形のＶＺＶｇｐを生成する発現ベクターの構築にある。

１種以上の高度に免疫原性のウィルス性エピトープを含む分泌性の切形のＶＺ■ 糖蛋白質を発現する本発明の組換えワクシニアウィルスの応用は、以下のものを含む、（１）ＶＺＶ感染に対するサブユニットワクチンのような組換えウィルスを使用する。ワクチン接種後のＶＺｖ糖蛋白質の分泌は、■ＺＶ感染に対すると同様に■Ｚ■糖蛋白質に対する、さらに強力な免疫応答をもたらす。（２）免疫不全者とともに健康な小児における一次的ＶＺＶ感染（水痘）に対して、そして高齢者におけるＶＺＶ再活性化（帯状ヘルペス）に対する免疫性を上昇させるサブユニットワクチンとして、１種以上のエピトープを含む非常に精製されしかも免疫原性の分５ｖｚｖ糖蛋白質を多量に使用する。（３）ＶＺＶ糖蛋白質に対する抗体の状態の検出及び評価のための高度に特異的なターゲット抗原としての診断キットにおいて、分泌性の切形のＶＺＶＷ蛋白質の精製した標品を使用する、ＶＺＶ再活性化は、癌及びＡＴＤｓの患者に普通に見られるので、これらの患者における■Ｚ■感染の血清上の診断も必要になる。さらに、高齢者の人口の上昇におけるｖＺ■再活性化が臨床上の徴候の開始前に痛みを生じさせ、モして又脳炎、肺炎及び播種性シースターをもたらすので、これらの患者の早い治療への唯一っの希望は、診断の早い手段に在る０本発明の組換えで製造した分泌性の■Ｚ ■糖蛋白質の診断キットへの応用は、ｖＺＶ感染の診断の早いしがも安価な手段を提供する。

本発明は、分泌性の切形のＶＺＶｇｐのための発現ベクター、並びに■Ｚ■蛋白質の細胞外分泌を行う該ベクターの構築に関する。

さらに詳細には、本発明は、感染した、トランスフェクションした又は形質転換した宿主から細胞外に分泌されるバリセラ・シースターウィルス（Ｖ　Ｚ　Ｖ）の切形の糖蛋白質（ｇｐ）（該糖蛋白質は、哺乳動物にＶＺｖ抗体応答を生じさせる）を、該宿主に発現できるヌクレオチド塩基配列よりなる組換えＤＮＡ発現ベクターに関する。

本発明の他の態様は、哺乳動物の細胞における分泌性の切形のＶＺＶｇｐｌ、■ 、■、■又はＶの組換え生産を含む。

本発明のさらに他の態様は、分泌性の切形のバイセラ・シースターウィルスｇｐを生成する方法に関する。

さらに詳しくは、本発明は、分泌性の切形のバイセラ・シースターウィルス糖蛋白質を生成する方法に関し、該方法は、ａ）該ポリペプチドについてコードするヌクレオチド配列よりなるベクターを提供し、ヌクレオチド配列は、ベクターを含む宿主により発現でき、そしてヌクレオチド配列は、欠失した糖蛋白質のＣ− 末端領域についてコードする領域の実質的部分を有するバコノセラ・シースターウィルス糖蛋白質を連続的なヌクレオチド配列によりエンコードできる核酸の群から選ばれ、それにより該ｇｐは該宿主がら細胞外に分泌され、そして該ｇｐは哺乳動物にＶｚＶ抗体応答を生ずることができる段階、ｂ）宿主中にベクターを組み入れる段階、Ｃ〕該精糖蛋白質中ヌクレオチド配列の発現に好適な条件下ベクターを含む宿主を維持する段階よりなる。

本発明の他の態様は、分泌性の切形のｖ　ｚ　ｖ　ｇ　ｐ　ｉ、：関する。

本発明のさらに他の態様は、ＶＺＶの診断アッセイに分泌性の切形のＶＺＶｇｐを用いることに関する。

本発明の他の態様は、水痘及び／又は帯状ヘルペスに対するワクチンを生産するために分泌性の切形のｖｚｖｇｐの使用である。

本発明の別の他の態様は、■Ｚ■抗体の診断及びモニターのためのキットを包含する。

さらに詳しくは、本発明は、分泌性の切形のｖｚｖｇｐ抗体の検出のためのコンパートメント化キットを包含し、それは、該ＶＺＶｇｐ抗体に対して特異性を有する抗体を得るように適合された少なくとも１個の第一の容器、並びに前記の第一の容器の抗体を検出可能なリポータ−分子を含むように適合された少なくとも１個の第二の容器よりなる。

図面の簡単な説明図１は、ｅ１エピトープを有する切形のＶＺＶｇｐ遺伝子を含む組換えプラスミドの構築の概略口である。ｐＧＥＭ−４転写ベクターにクローンしたＶＺＶｇｐｒ遺伝子（Ｖａｆａｉら、同上、１９８８）は、ｅ１エピトープがら下流でＢｇｌｌＩ（Ｂ）制限酵素により、モしてｐＧＥＭポリリンカーにおいてＥｃｏＲ’ １（Ｅ）により開裂された。切形のｇｐＩ遺伝子は、実施例で詳述したように、電気溶出され、平滑末端され、そしてワクシニアウィルス挿入ベクターｐｓｃ１１のＳｍａ工　（Ｓ）でクローンされた。

図２は、組換えワクシニアウィルスによる切形のｖｚｖｇｐｉの発現を示す。

ＥＳＣ−１細胞は、図２において記載されたような切形のＶＺＶｇｐＩを有ししかもｅ１エピトープを含む組換えワクシニアウィルス（ＶＶＴｇｐ　ＩＢｇ　Ｉ　ＩＩと名付けられる）により感染された。２２時間後、感染された細胞は、１時間［３５Ｓ］メチオニンによりラベルされ、そして細胞ライゼートは、実施例で記載されたように製造された。細胞ライゼートは、以下のモノクローナル抗体（ＭＡｂＳ）及びヒト血清により免疫沈降され、５ＤＳ−１２％ポリアクリルアミドＰＡＧＥにより分析された。ｅｌエピトープに対してＭＡｂ７９．７、ｖＺ ■血清陽性ヒトからのヒト血清（Ｈ−ｓｅｒｕｍ）　、ＶＺＶｇｐＩに対ししかもｅ１以外の１種以上のエピトープを認識するＭＡｂＣｌ、ＶＺＶｇｐＩに対ししかもｅ１エピトープのグリコジル化形のみを認識するＭＡｂＧ７、ＶＺＶｇｐｒＶに対するＭＡｂＧ６、ＶＺＶｇｐｌＩに対するＭＡｂＦ８、及びＶＺＶｇｐＩｆｆに対するＭＡｂＥｌｏ、ＴｇｐＩＢｇｌＩ［のプレカーサー及びグリコジル形のサイズ（キロダルトン）は、左に示される。

図３は、感染された細胞からのＴｇｐＩＸｍａｌの発現及び分泌を示す、左のパネルでは、細胞は、ＶＶＴｇｐ　ＩＸｍａｌＩ［により感染され、そして２２時間後、感染された細胞は、１時間［”Ｓ］メチオニン（２００μＣｉ／ｍＬ）によりパルスラベルされた。細胞を採集し、細胞ライゼート（ＣＬ）を製造し、ＭＡｂにより免疫沈降させ、そして９％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。右のパネルにおいて、細胞は、上記のように感染され、そしてラベルされた。パルス・ラベル期間後、細胞を５回無血清培地により洗い、２時間３７°で無血清培地にインキュベートした。組織培養流体（ＴＣＰ）を採集し、ＭＡｂにより免疫沈降させ、そして９％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＭＡｂＦ９は、ＶＺＶヌグレオキャブシド蛋白質に対する。ＴｇｐＩＸｍａｌｎの芯及び処理した形のサイズ（キロダルトン）は、左に指示される。

図４は、感染された細胞からのＴｇｐＩＢｇｌｌＩの発現及び分泌を示す、左のパネルにおいて、細胞は、ＶＶＴｇｐＩＢｇｌｌＩにより感染され、そして２２時間後、感染された細胞は、１０分間［”３１メチオニン（３００μＣｉ　／　ｍ　Ｌ　）によりパルスラベルされた。細胞を採集するか又は無血清培地により洗い、ラベルを１．２．３及び７時間追跡した。未感染細胞（Ｕｎ）を１０分間パルスラベルし、７時間追跡した。細胞ライゼート（ＣＬ）を製造し、ＶＺＶｇｐＩｅｌエピトープに対しるＭＡｂ７９゜７　（ａ）　、及びＶＺＶｇｐＩに対するがｅ１以外の１種以上のエピトープのみを認識するＭＡｂＣｌ　（ｂ）により免疫沈降した。

右のパネルにおいて、１．２．３及び７時間追跡した未感染（Ｕｎ）及びＶＶＴｇｐＩＢｇｌＩＩ感染した細胞からの組織培養流体（ＴＣＦ）を、ＭＡｂ７９．７（ａ）及びＭＡｂＣｌ　（ｂ）により免疫沈降した。サンプルを、上記のように５ＤＳ−１２％ポリアクリルアミドＰＡＧＥにより分析した。ＴｇｐＩのプレカーサー及びグリコジル化成熟形の見かけのサイズ（キロダルトン）を示す。

＠５は、フルサイズＶＺＶｇｐＩ遺伝子を有する組換えワクシニアウィルス（ＶＶｇｐＩと名付けられる）の発現を示す、細胞は、ｖｖｇｐｒにより感染され（Ｃａｂｉｒａｃら、１９８８）、そして２２時間後細胞は図３に記載されたようにパルス追跡され、そして未感染（Ｕｎ）及びｖｖｇｐｒ感染した細胞（ＶＶｇｐＩ）からの細胞ライゼート（ＣＬ）及び組織培養流体（ＴＣＰ）を、ＶＺＶｇｐＩに対するＭＡｂ７９．７により免疫沈降した。サンプルを実施例に記載したように５ＤＳ−８％ポリアクリルアミドＰＡＧＥにより分析した。ＶＺＶｇｐＩのプレカーサー・生成物のサイズ範囲（Ｖａｆａｉら、１９８８）は指示される。

図６は、切形のｖｚｖｇｐｒを有しそしてｅ１エピトープを含む組換えワクシニアウィルス（ＶＶＴｇｐＴ）に対して製造されたウサギ抗体による■Ｚ■感染した細胞の免疫沈降を示す。細胞は、■ｚ■により感染され、そして４８時間後、天然のｖｚｖｇｐｒへのＮ−結合オリゴ糖の付加を妨げるツニカマイシン（ＴＭ）（１５μｇ／ｍＬ）の存在又は不存在下１０分間［３５Ｓ］メチオニン（３００μＣｉ／ｍＬ）によりパルスラベルされた。細胞は、採集されるか、又は洗浄され、モしてＴＭ（１５μｇ　／　ｍ　Ｌ　）の存在又は不存在下２時間追跡された。

細胞ライゼートを製造し、ｖｚｖｇｐｒ及びｇｐＩの両者及びウサギ抗ＶＶＴ　ｇｐＩ抗体（ＲＡｎｔ　ｉ−ＶＶＴｇｐ　Ｔ）を認識するＭＡｂＣＬ　（ａ）により免疫沈降した。サンプルを、実施例に記載したように５ＤＳ−８％ポリアクリルアミドＰＡＧＥにより分析した。ＶＺＶｇｐＩ及びｇｐＩのプレカーサー・生成物の見かけのサイズ（キロダルトン）　（Ｖａ　ｆ　ａ　ｉら、同上、１９８ｇ）は、右に指示される。リゾチーム（１４，３ｋＤａ）、β−ラクトグロブリン（１８，４ｋＤａ）、α−キモトリプシノーゲン（２５，７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３，０ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６８，０ｋＤａ）、ホスホリラーゼＢ（９７，４ｋＤａ）及びミオシン（２００，０に、　Ｄ　ａ　）を、内サイズマーカーとして使用した。

発明を実施するための最良の形態本発明は、哺乳動物の細胞において抗体応答を誘発できる少なくとも１種のエピトープを有する組換えプラスミドの構築を含む。特に、本発明は、生体内で宿主生物中に哺乳動物の細胞から分泌できる、切形のＶＺＶｇｐを生成できるワクシニアウィルス発現系に関する。

一つの態様において、本発明は、本明細書に記載されたように、ｅ１エピトープを有ｔ６分泌性の切形のＶＺＶｇｐｒ　（ＴｇｐＩＢｇｌｌＩ又はＶＶＴｇｐＩＢｇｌＩ［として呼ばれる）を有する組換えプラスミドの構築及び哺乳動物の細胞におけるワクシニアウィルス発現ベクターによる該蛋白質の生成に関する。

他の態様では、本発明は、本明細書に記載されたように１分泌性の切形のＶＺＶｇｐＩ　（ＴｇｐｌＸｍａｍ又はＶＶＴ　ｇ　ｐ　Ｉ　Ｘｍａ　ＤＩとして呼ばれる）を有する組換えプラスミドの構築及び哺乳動物の細胞におけるワクシニアウィルス発現ベクターによる該蛋白質の生成に関する。

他の態様では、本発明は、水痘及び／又は帯状ヘルペスの治療のためのワクチン組成物の製造及び使用を含む。

既に使用されているワクチンは、一般に、（ｒ）ウィルスは無毒にされているが成る形の遺伝的減感により殺されていない、減感された生ウイルス形のワクチン、又は（Ｉ［）ウィルスから単離され精製され、そしてホルマリン又は成る他の化学的又は物理的処理により不活性化された特異的なウィルスコンポーネントよりなる６本発明は、タイプ■のワクチンを含み、ウィルスから単離され精製され、そしてホルマリン又は他の処理により不活性化された特異的なウィルスコンポーネントは、分泌性の切形のｖｚｖｇｐであると考えられる。明細書及び請求の範囲テ他ニ特定シテイナイ限り、Ｖ　Ｚ　Ｖ　ｇ　ｐ　ｉ、ｔ、ＶＺＶｇｐｌ、ｇｐＩＩ、ｇｐ［ＩＩ、ｇｐｌＶ又はｇｌ）Ｖを意味する。さらに、明細書及び請求の範囲で使用される「切形の」は、ＶＺＶｇｐの中間のサイズのセグメント（フルサイズのＶＺＶｇｐではない）として規定され、領域のアミノ酸配列Ｃ− 末端の実質的な部分（又は全て〉が、削除されている０本発明は、又■Ｚ■に対するワクチンに使用するための組換えの分泌性の切形のＶＺＶｇｐの製造を含む。

他の態様では、本発明は、分泌性の切形のＶＺＶｇｐを含むタイプロワクチンに関する。

ワクチンにより、感染源により起される将来の害に対する免疫学的保護がもたらせられるように生物の免疫系を刺激するのに使用される剤を意味する。患者（又は動物）に対する本発明によるワクチンの投与は、全ての周知又は標準の技術により行うことができる。これらは、経口の消化、消化器官への挿管又は気管支・鼻へのスプレィを含む。ヒト又は動物の血流に担体ミクローブを到達させる、静脈内注射のような投与の他の方法は、担体ミクローブが再生できないとき、許容できる。

さらに他の態様では、本発明は、■Ｚｖ用の診断アッセイ、そしてさらに、ＶＺ ■感染の種々の臨床上の顕在並びにワクチン接種されたヒトにおける■Ｚ■抗体の検出用の診断キットに関する。

本発明は、ＶＺＶｇｐ蛋白質を得る初めの試みからさらに進んだ段階を提供する。以前では、ＶＺＶｇｐＩに関する周知の遺伝子は、プラスミド中に挿入され、そしてワタシニアウィルス発現系中に組込まれた。しかし、この発現系により生成されるｖｚｖｇｐ　Ｉは、細胞内即ち哺乳動物の細胞内に止まり、従って抗原性活性（抗体の生成）を行わせることができない６本発明が見出したことは、哺乳動物の細胞から分泌する切形のＶＺＶｇｐ例えばｇｐｌ、ｇｐＩＩ、ｇｐｍ、ｇｐＩ又はｇｐｌを生成即ち発現できるワクシニアウィルスにおける発現ベクターである。この切形のｇｐは、さらに侵入された宿主においで不活性化抗体の生成を生じさせるエピトープを含む、ＶＺＶｇｐ遺伝子は、図１に示されるように、ｐＯＥＭ転写ベクターでクローンされ、制限酵素例えばＥｃｏＲＩ及びＢｇＬＩＩ制限酵素により開裂され（Ｃ−末端領域の一部又は実質的に全てを除き）、平滑末端され、そしてワクシニアウィルス挿入ベクターｐｓｃＬｉのＳｍ、ａＩ部位でクローンされる。

好ましい態様では、本発明は、以下のように組換えＤＮＡ発現ベクターの構築を含む、５７５ヌクレオチド（ＶＺＶゲノムのヌクレオチド１１５７１１−１１６２８７に及ぶ）及びＳｍａＩ部位から上流のｐＧＥＭ−４ポリリンカーがら１７ｂｐを含む５９２−ｂｐＤＮＡフラグメントは、ｇｌ）Ｉオーブンリーディングフレームを含む平滑末端ＶＺＶＢｇ　Ｉ　ｌＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド１１５７１２−ＬＬ８１８１に及ぶ）を有するｐＧＥＭ組換え体から、それぞれＥｃｏＲＩ及びＢｇｌ…により開裂される（Ｄａｖｉｓｏｎ及び５ｃｏｔｔ、同上、ｐ、１８００−１８０１．１９８６、参考としてここに引用される）、１５９アミノ酸残基によりｇｐｌのＮ−末端領域をエンコードしそして１７．５ｋＤａの推定サイズを有する切形のｇｐ　Ｉ　（Ｔｇｐ　Ｉ）ＤＮＡは、平滑末端され、ｐＳＣ１丁プラスミドベクターのＳｍａｒ部位でクローンされ（図１）、そして実施例に記載されたようにワクシニアゲノム中に挿入される。切形のｇｐＩ　（ＴｇｐＩＢｇ　Ｉ　ＩＩ）は、ｖｚｖｇｐＩの予言されたアミノ酸配列の残基１０９及び１２３の間の１４アミノ酸残基内に位置するｅ１エピトープを含む（Ｖａｆａｉら、同上、１９８８、Ｖａｆａｉら、同上、１９８９）、ＴｇｐｌＢｇｌｌＩは、ｇｐｒのＣ−末端領域で４６４アミノ酸残基を欠き、それは明らかにｇｐｌの膜足場領域を含む。

他の好ましい態様では、本発明は、以下のように組換え発現ベクターの構築に関する。ＳｍａＩ部位から上流のｐＧＥＭ−４ポリリンカーから１７ｂｐ及び１６３０ＶＺＶヌ／７レオチド（ＶＺＶゲノムノヌクレオチド１１５７１２−１１７３４２に及ぶ）を含む１６４７−ｂｐＤＮＡフラグメントは、ｇｐｒオーブンリーディングフレームを含む平滑末端ＶＺＶＢｇｌ　ｌＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド１１５７１２−１１８１８１に及ぶ）を有するｐＧＥＭ組換え体から、それぞれＥｃｏＲｒ及びＸｍａＬＵにより開裂される（Ｄａｖｉｓｏｎ及びＳｃ。

１．１．同上、ｐ、１８００−１８０１．１９８６）、５１１アミノ酸残基によりｇｐｒのＮ−末端領域をエンコードした切形のｇｐＩ　（ＴｇｐＩＸｍａｌＩＩ）ＤＮＡは、平滑末端され、ｐｓｃｌＩプラスミドベクターのＳｍａＩ部位でグローンされ、そして実施例に記載されたようにワクシニアウィルスゲノム中に挿入される。Ｔｇｐｇｐｍａｌｆｆは、ｇｐｒのＣ−末端領域で１１２アミノ酸残基を欠き、それは明らかにｇｐＩの膜足場領域を含む。

本発明は、上記のような組換えＤＮＡ発現ベクターに関し、それは、感染され、トランスフェクションされた又は形質転換された宿主において、該宿主から細胞外で分泌されしかも哺乳動物で抗体応答を生じさせ得るＴｇｐを発現できるヌクレオチド配列、そして好ましくは１５９アミノ酸配列（Ｓｅｑ、、Ｉｄ、Ｎｏ、Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＡＳＰ　１５０Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＶａＬ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　１５９又は５１１アミノ酸配列（Ｓｅｑ、ｒｄ、Ｎｏ、２）により規定される成熟ポリペプチド、Ｍｅｔ　ＧＬｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｇｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｈａｔ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　１５Ｇｌｙ　工ｉｓ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　’Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｌａ　３０Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　ＴＹｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　）ｌｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　４５ＡＩｉｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉ（ｉｓ　Ａｈａ　６O ＧＬｕ　Ｓ＠ｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　７５Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ａｇｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　９０Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　）ｌｉｓ　）ｌｉｓ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　１P０５Ａｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｅｌ２０Ｓｅｒ　ＡＬａ　Ｇｉｎ　ＧＬｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＧＬｙ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　’Ｉｌｅ　１３T Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｒｑ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　１５０Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｇｕｙ　Ａｓｐ　ＶａＬ　ＰｈｅＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｇｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　１６５Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＧＬｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　１８０Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｑ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　１９５Ａｓｐ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　ｒｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　２２５Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　ＧＬｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　２４０Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　２５５Ｌｙａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　２７０Ｐｈｉ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　２８５Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｉ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　工１＠３００Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｈａｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　３１５Ｌａｕ　Ｖａｌτｈｒτｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａ＋＋ｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙ＋ｉ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｇｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　３３０ＡＬａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＰｈｅＨｌｓ　Ｍｅｔ　Ｔｒｐ　ｊｖｓｎ　３４５Ｔｙｒ　Ｈｌｇ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠　Ｓｅｒ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　Ｓｅｒ　’Ｌｅｕ　Ａｌａ　３６O Ｍａｊ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＩＩｓ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｉ、ｌｌｕ　Ｌｅｕ　３V５Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｘ１ｍ　Ａｉｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　３９０Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａ＋＋ｎ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　４０T Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　）ｌｉｓ　ＭｅＦ＋Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　４２O Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＡＬａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　４３５Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　）ｊｉｇ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　４：■ Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＠４６５Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠Ｖａｌ　Ｖａｌ　４８０Ｔｙｒ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　４９５Ｔｈｒ’Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　５１０を含む０本発明により包含される感染した、トランスフェクションした又は形質転換した宿主は、哺乳動物の細胞例えばミドリザル腎臓細胞（ＥＳＣ−１）　、ＣＯＳモンキー細胞、ＨｅＬａ＃胞、ハムスター腎臓細胞及びヒト繊維芽細胞である。

さらに、全てのヒト組織は、好適な宿主として含まれる。本発明は、上記の感染した、トランスフェクションした又は形質転換した細胞が、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターによりＴｇｐ　’、切切形■Ｚ■糖蛋白質）そして好ましくはＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１により規定されるようなＴｇｐＩＢｇｌｌＩ又はＴｇｐｌ、ＸｍａｌＩＩを生成せしめそして分泌せしめることを含む。

本発明は、又他の分泌性のＴｇｐＩを含む、他の免疫原性エピトープを含む他のＴｇｐＩは、種々の切形のｇｐ工遺伝子をクローンし発現することにより発生できる。他のｇｐＩは、例えば以下の制限酵素を利用することにより得ることができる。

ａ）ＥｃｏＰＩ及びＥｃｏＲＩ　（ＥｃｏＰＩは、ヌクレオチド１１５７５１で開裂し、２７６アミノ酸配列の発生を生じさせる）。

ｂ）ＢｓｔＥ２及びＥｃｏＲＩ　（ＢｓｔＥ２は、ヌクレオチド１１６７５４で開裂し、３１６アミノ酸配列の発生を生じさせる）。

ｃ）Ｎｄｅｌ及びＥｃｏＲｒ　（Ｎｄｅｌは、ヌクレオチド１１６８３１で開裂し、３４１アミノ酸配列の発生を生じさせる）。

ｄ）ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＴ　（ＥｃｏＲＩは、ヌクレオチド１１７０３４で開裂し、４０８アミノ酸配列の発生を生じさせる）。

上記のように本発明により含まれる種々のタイプのＴｇｐＩは、特異的に構築されて、即ち、明らかにエンコードされた蛋白質の膜足場領域を排除することにヨリ、ＶＺＶｇｐ　＜例えばｇｐｒ、ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩｌ、ｇ　ｐｆＶ又ハｇ　ｐ　Ｖ）　（７）Ｍ胞外の発現を妨げるＶＺＶｇｐの領域をエンコードするヌクレオチド配列のＣ−末端領域のその部分を排除する。これらの切形の分泌性の蛋白質のための好適な発現ベクターを製造するのに、エンコードされたＴｇｐ（、細胞外に分泌された）は、宿主に抗体応答を引き出すようために、少なくとも一つのエピトープ例えばｅｌを維持することも必要である１本発明により当業者は、ワクチン及び検出系として使用される種々の好適な発現ベクターを構築することができ、これらは、全て本発明に含まれる。

本発明は、又他の切形のｖｚｖｇｐ　（例えば■、■、■又はＶ）を得るために、上記の組換えＤＮＡ発現ベクターの修飾を含む。ＶＺＶｇｐｌＩのＤＮＡ配列は、例えばＤａｖｉｓｏｎ及び５ｃｏｕｔ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６７．１７５９−１８１６．１９８６のｐ、１７８０−１７８１に開示されている。ＶＺＶｇｐｌＩ［のＤＮＡ配列は、Ｄａｖｉｓｏｎ及び５ｃｏｔｔ、１９８６のｐ、１７８４に開示されている。ＶＺＶｇｐｒＶのＤＮＡ配列は、Ｄａｖｉｓｏｎ及び５ｃ−ｏｔ、ｔ、１９８６のｐ、１８００に開示されている。ＶＺＶｇｐｌＶのＤＮＡ配列は、Ｄａｖｉｓｏｎ及び５ｃｏｔｔ、１９８６のｐ、１７６８−１７６９に開示されている０本発明の教示により、当業者は、次に分泌性Ｔｇｐｎ、Ｔｇｐｍ、ＴｇｐＩＶ又はＴｇｐＶを発現できる適切な切形のｖＺＶｇｐ■、ｇｐｍ、ｇｐｌＶ又はｇｌ）Ｖ遺伝子を含む発現を構築できる。

本発明が見出したことは、ｇｐｒについて上記のようなｇｐＩＩ、ｇｐｍ、ｇｐＩ又はｇｐＶのＣ−末端領域をエンコードする天然のＶＺＶＤＮＡを欠失し、哺乳動物の細胞の外側に分泌できるＴｇｐｎ、Ｔｇｐｍ、Ｔｇｐｒｖ又は’ｒｇｐｖの生成をもたらし、そして生体内で抗原性活性を生じさせ即ち抗体の形成を刺激させることに関する。

本発明は、又分泌性の切形のバリセラ・シースターウィルスｇｐを生成する方法を含む。この方法は、以下の段階よりなる。

ａ）該ポリペプチドについてコードするヌクレオチド配列よりなるベクターを提供し、ヌクレオチド配列は、ベクターを含む宿主により発現でき、そしてヌクレオチド配列は、バリセラ・シースターウィルスｇｐを連続的なヌクレオチド配列によりエンコードできる核酸の群から選ばれ、ｇｐのＣ−末端領域についてコードするＶＺＶｇｐゲノムの実質的部分は欠失され、そして該ｇｐは該宿主から細胞外に分泌され、モして哺乳動物の宿主に抗体応答を行う少なくとも１ａｉのエピトープ、さらに例えばＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１の１５９アミノ酸配列により規定されるオーブンリーディングフレームのポリペプチド又はＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ。

２の１５９アミノ酸配列により規定されるオーブンリーディングフレームのポリペプチドを含む段階。

ｂ）宿主中にベクターを組み入れる段階。

Ｃ）該ポリペプチド中でヌクレオチド配列の発現に好適な条件下ベクターを含む宿主を維持する段階、この方法は、該ヌクレオチド配列に操作上伴うプロモーターを含むことができる。この方法は、さらにリーダー配列をエンコードできるヌクレオチドの領域を含む該ヌクレオチド配列を含む。

Ｔｇｐ　（ｖｖｒｇｐ）を有する組換えワクシニアウィルスの発現は、例えばＴｇｐ例えばｖｖＴｇｐ　ＩにＪ６ＢＳＣ−１細胞の感染、並びＬＶＺＶｇｐｌ、ｇｐＩ［、ｇｐ■、ｇｐｌＶ及びｇｐＶ及び■Ｚ■血清陽性ヒト血清に対して製造されたＭＡｂのパネル又は当業者に周知の他の従来がらの手段による細胞ライゼートの免疫沈降により分析できる。

該Ｔｇｐが感染された細胞から分泌されるという事実に間して、細胞は、Ｔｇｐ例えばＶＶＴｇｐＩにより感染され、そして放射能ラベルできる。

Ｔ　ｇ　ｐ　ｆｐＩえばＶＶＴｇｐ　Ｉに対する抗体は、例えばウサギで発生できる（例えば実施例に記載されたようなＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐｒ）、これらの抗体は、Ｔｇｐ例えばＶＶＴｇｐＩがｖｚｖｇｐにより認識される抗体応答を誘発できるかどうかを決めるためにテストできる。哺乳動物の細胞例えばＥＳＣ− １細胞は、ＶＺｖにより感染され、ツニカマイシンの存在又は不存在下放射能ラベルできる（Ｖａｆａｉら、１９８９）、本発明のＴｇｐは、天然のエピトープ（例えばＳａｑ、Ｉｃｅ、Ｎｏ、１により規定されたＴｇｐＩに見出されるようなｅｌ）により認識され抗体応答を誘発でき、さらに補体の存在下■Ｚ■感染性を不活性化できる。

本発明のワクチンは、非経口（例えば筋肉内、皮下又は静脈内注射により）で投与される。必要な量は、遺伝子生成物の抗原性により変化し、存在するワクチンの代表的な免疫応答を誘発するのに十分な量を要するのみである６日常的な実験は、容易に必要量を決めるだろう。ワクチンの代表的な最初の投与量は、約０．００１−１００ｍｇ抗原／ｋ抗原型であり、所望のレベルの保護をもたらすのに必要なとき使用されるマルチ投与の量は、増加することになる。

ワクチンが懸濁又は溶解される製薬上の担体は、接種された動物に対して無毒でありモして担体生物又は抗原遺伝子生成物と両立できる全ての溶媒又は固体でよい、好適な製薬上の担体は、液体担体例えば通常の塩水及び生理学的な濃度又はその付近の他の無毒な塩、並びに固体担体例えばタルク又は砂糖を含む、助剤例えばＦｒｅｕｎｄの助剤（完全又は不完全）は、気管支管を経て抗原性を増加するために加えられ、ワクチンは好適にはエロゾルの形で存在する。ブースター免疫化が、多数回繰返されて有利な結果を得る。

本発明は、又哺乳動物の宿主において水痘及び帯状ヘルペスに対する免疫応答を刺激する方法に関する。この方法は、該Ｔｇ９に対する抗体の生成を生じさせるのに十分な条件下で、有効量の分泌性のＶＺＶＴｇｐ　（例えばＴｇｐＩ、ＴｇｐＩＩ、’ｒｇｐｍ、’ｒｇｐｒｖ又はＴｇｐＶ）を投与することよりなり、それは当業者により十分に認識されている。投与の有効量は、体重１ｋｇ当りＯ，００１−１００ｍｇの分泌性ｖｚｖＴｇｐである。

本発明は、又水痘及び／又は帯状ヘルペスの治療的なコントロールに有用な、モノクローナル又はポリクローナルの抗体を包含する。該抗体は、上記のようにして製造され、哺乳動物例えばヒト、ウマ、ウサギ、ヒツジ、マウスなどに不活性化Ｔｇｐ又はその誘導体を注射し、次に以下に詳述される検出系を用いて該抗体を精製することにより製造される。

他の態様では、本発明は、水痘及び／又は帯状ヘルペスに対する受動免疫化における投与のための、ヒト・マウスキメラポリグローナル又はモノクローナル抗体、並びに分泌性ＶＺＶＴｇｐ　（Ｉ、■、迅、■又は■）に対する特異的なヒト又は他の（例えばアフリカミトリモンキー腎臓細胞、ＣＯＳモンキー細胞、ＨｅＬａ細胞又はチャイニーズ・ハムスター細胞）ポリクローナル又はモノクローナル抗体の開発に関する。免疫化は、生物が既に曝されていた抗原に対する、生物即ちヒトに連続する高い抗体レベルを誘発する方法に関する。

ここで規定される受動免疫化は、生体内又は生体外の源力）ら患者に予め形成された抗体を与えることに基づく、抵抗性（例えば感染に対する一時的又は保持された保護）に関する。受動免疫化の主な利点は、本発明の上記の態様に記載されたようなＶＺｖに対する多量の抗体の早い利用性である。

ここで規定されるキメラ抗体は、二つの異なる種の免疫グロブリン遺伝子を含む組換えＤＮＡ技術により製造される抗体分子である。ヒト・マウスキメラ抗体は、組換えＤＮＡ技術により、マウス免疫グロブリン遺伝子のＦａｂ部分とヒト免疫グロブリン遺伝子のＦｃ部分とを組合せることにより製造される。ヒト・マウスキメラ抗体の製造は、多量の抗体がこの系で製造でき、そしてヒト・マウスキメラ抗体は、ヒト免疫系の細胞により認識できるが、一方弁キメラ抗体は、ヒト免疫系の細胞（例えば食細胞ンにより容易には認識されないために、有利である。キメラ抗体は、マウス系で多量に製造でき、そして本発明に含まれるＶＺｖを認識できる。ヒト・マウス免疫グロブリンは、又イースト中で多量の抗体を作ることが見出され、そしてこの系も又本発明に含まれる。以下の文献は、これら抗体を製造する方法を論じており、ここに引用される。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、８１．６８５１　（１９８４）、Ｈｏｒｏｗｉ　ｊｚら、Ｐ、Ｎ。

Ａ、Ｓ、８５．８６７８　（１９８８）及びＴａｏら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３．２５９５　（１９８９）。

本発明は、さらに■ｚ■に対する検出アッセイ（免疫アッセイ）における上記の抗体の使用を含む。

広い範囲の免疫アッセイ技術は、例えば米国特許第４０１６０４３．４４２４２７９及び４０１８６５３号及びＨａｒｌｏｗら、同上に示されたように、本発明における利用に使用できる。これは、もちろん、従来の競合的結合アッセイにおけるとともに非競合的タイプの単一点及び二点即ち「サンドウィッチＪの両方のアッセイを含む。サンドウィッチアッセイは、最も有用なしがも普通に使用されるアッセイであり、本発明に使用して好ましい。サンドウィッチアッセイ技術の多数の変法が存在し、そして全ては本発明により含まれる。

代表的な前進アッセイでは、ラベルされていない抗体は、固体基体に不動化され、そしてテストされるべきサンプルは、結合した分子と接触させられる６抗体・抗原の二元複合体め形成を行うのに十分な時間のインキュベーションの好適な期間後、検出可能な信号を生成できるレポート分子をラベルした第二の抗体を次に加え、抗体・ラベルされた抗体の三元の複合体の形成に十分な時間インキュベートする。全ての未度応物質を洗い流し、そして抗原の存在は、リポート分子により生成する肉眼で認め得る信号の観察により決められる。結果は、肉眼で認め得る信号の簡単なＩｌｌ察により定性的であるか、又は既知の量のハブテンを含むコントロールサンプルと比較することにより定量的である。

前進アッセイの変法は、サンプル及びラベルした抗体の両者が結合した抗体に同時に加えられる同時アッセイ、又はラベルされた抗体及びテストされるべきサンプルが先ず混合され、インキュベートされ、次にラベルされていない表面に結合した抗体に加えられる逆アッセイを含む、これらの技術は、当業者に周知であり、そして小さい変化の可能性は、当業者にとり容易に明らかであろう。

ここで使用されるとき、「サンドウィッチアッセイ」は、基本的な二点技術に関する全ての変法を含む０例えば、これらの抗体は、分泌性のＴｇｐ例えばＴｇｐＩ、Ｔｇｐｎ、Ｔｇｐｍ、ＴｇｐＩＶ又は’ｒｇｐｖ又はさらに詳しくは不動化免疫吸着物として特異的な抗原性決定因子（例えばｅｌエピトープ）の使用によりＳｅｑ、ｒｄ、Ｎｏ、１により規定されるような分泌性のｇｐ■を検出するのに使用できる。血清は、テストされるべき対象物から得られ、該血清は、不動化されたウィルス性の免疫吸着物に接触する。もし該血清が該免疫吸着物に対する抗体を含むならば、抗体・吸着物コンジュゲートが生ずるだろう、過剰の血清及び非結合抗体を除いた後、第一の抗体に特異的な第二の抗体（前記の第一の抗体は、該免疫吸着物とコンジュゲートを形成できる）は、加えられて二重抗体・吸着物コンジュゲートを生ずる。この二重抗体・吸着物コンジュゲートは、もしテスト血清が、免疫吸着物に対する抗体を含むならば、生ずるに過ぎない。従って、標準の検出技術が、コンジュゲートを同定するのに使用できる。

他の免疫アッセイである競合的結合アッセイでは、制限された量の、問題の分子（抗原又はハブテンの何れか）に特異的な抗体は、特定の容積の、未知の量の検出されるべき分子の溶液、並びに検出されるべき分子又はそのアナローブを検出されるようにラベルされた既知の量含む溶液と組み合わされる。ラベルされた及びラベルされていない分子は、次いで抗体の利用可能な結合部位に競合する。

遊離及び抗体結合分子の相分離は、各相に存在するラベルの量を測定し、それによりテストされるサンプル中の抗原又はハブテンの量を示す。この一般的な競合的結合アッセイの多数の変法が、現在存在する。

全ての既知の免疫アッセイにおいて、実際的な目的のために、抗原に対する抗体の一つ（分泌性の切形のＶＺＶｇｐ）は、概して固相に結合し、そしてサンドウィッチアッセイにおける第二の抗体又は競合的アッセイにおける既知の量の抗原の何れかの第二の分子は、抗体・抗原反応の肉眼による検出を行うために、検出可能なラベル又はレポーター分子を有する。二つの抗体が、サンドウィッチアッセイにおけるように用いられるとき、抗体の一つが、例えば分泌性の切形のＶＺＶｇｐＬＩＩ、■、■又は■に特異的であることが必要であるに過ぎない、以下の記述は、代表的な前進サンドウィッチアッセイに関するが、一般的な技術は、考慮されている免疫アッセイの全てに応用できるものとして理解されるべきである。

代表的な前進サンドウィッチアッセイにおいて、例えば分泌性ＴｇｐＩ、ｆｆ、Ｉｌｌ、ＩＶ又は■に対して特異性を有する第一の抗体又はＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１により規定されている成熟ポリペプチド又はその抗原性フラグメントは、固体の表面に共有的に又は受動的に結合される。固体の表面は、概してガラス又は重合体であり、最も普通に使用される重合体は、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固体の支持体は、管、ビーズ、ディスク又はミクロプレート、又は免疫アッセイを行うのに好適な任意の他の表面の形であってよい、結合方法は、当業者に周知であり、一般に不溶性の担体に分子を橋かけ結合、共有結合又は物理的に吸着することよりなる。結合後、重合体・抗体複合体は、テストサンプルの製造で洗浄される。テストされるべきサンプルの一部は、次に固相複合体に加えられ、そして抗体に存存する全てのサブユニットの結合を行うのに十分な時間２５℃でインキュベートされる。インキュベーション時間は変化するが、一般に約２−４０分の範囲であろう、インキュベーション時間後、抗体サブユニット固相を洗浄し、乾燥し、そしてハブテンの部分に特異的な第二の抗体とともにインキュベートされる。第二の抗体は、ハブテンへの第二の抗体の結合を示すのに使用されるレポーター分子に結合される。

「レポーター分子」により、本明細書及び請求の範囲で使用されるとき、その化学的性質により、抗原に結合した抗体の検出を行う分析上同定可能な信号をもたらす分子を意味する。検出は、定性的又は定量的の何れがである。このタイプのアッセイで最も普通に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア−又は放射ヌクレオチド分子の何れがである。

酵素免疫アッセイ（Ｅ　工Ａ）の場合、酵素は、一般にゲルタールアルデヒド又は過沃素酸塩により、第二の抗体にコンジュゲートする。しかし、容易に分かるように、広い範囲の異なるコンジュゲーション技術が存在し、それは当業者に容易に利用できる。普通に使用される酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスフェート等を含む、特定の酵素とともに使用される基質は、対応する酵素の加水分解により検出可能な色の変化を生ずるように選ばれる０例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとともに使用するのに好適であり、そしてペルオキシダーゼコンジュゲートでは、１．２−フェニレンジアミン、５−アミノサルチル酸又はトリジンが通常使用される。蛍光発生基質を使用することも可能であり、それは前記の色発生基質よりむしろ蛍光発生生成物を生ずる。

酵素をラベルした抗体は、第一の抗体ハブテンコンプレックスに加えられ、結合され、そして過剰の試薬は洗い流される。適切な基質を含む溶液を次に抗体・抗原・抗体の三元コンプレックスに加える。基質は、第二の抗体に結合した酵素と反応して定性的な可視の信号を生じ、それはさらに通常分光測光的に定量化されて、サンプルに存在したハブテンの量を指示する。

一方、蛍光化合物例えばフロオレセイン及びローダミンは、それらの結合能力を変えることなく抗体に化学的にカップリングできる。特別の波長の光による照明により活性化されるとき、フルオロクロムをラベルした抗体は、光エネルギーを吸収し、分子中に励起性の状態を誘発し、次に光学顕微鏡により肉眼で検出可能な特徴的な色で光を発する。ＥＩＡにおけるように、蛍光ラベル抗体は、第一の抗体・ハブテンコンプレックスに結合せしめられる。未結合試薬を洗い流した後、残りの三元コンプレックスを次に適切な波長の光に曝し、観察された蛍光は、問題のハブテンの存在を示す。免疫蛍光及びＥＩＡ技術は、ともに極めてうまく確立されたものであり、特に本発明の方法に好ましい、しかし、他のレポーター分子例えばラジオアイソトープ、生物発光分子の化学発光も又使用できる。必要な目的に適合するように方法をいかに変えるかは、当業者にとり容易に明らかであろう。前記の方法が、直接的に又は間接的に（即ち抗体を経て）ＶＺＶを検出するのに使用できることは、又明らかであろう。

本発明は、又テストされるべき個体の血清、組織又は組織抽出物を、分泌性の切形のｖｚｖｇｐ　＜例えばｇｐｒ、ｇｐＩｒ、ｇｐｌＩ［、ｇｐｌＶ又はｇｐＶ）に対する抗体又はその活性フラグメントと、抗体・抗原コンプレックスを形成するのに必要な時間及び条件下接触させ、次に任意の得られた抗体・抗原コンプレックスを検出することよりなる、ＶＺＶを診断する方法を含む、これらの条件は、当業者により十分に認識されている。

他の態様において、本発明は、又分泌性の’ｒｇｐ（例えばＴｇｐｉ、ｒｇｐｎ、’ｒｇｐｍ、Ｔ　ｇ　ｐ　ｒＬ’、ＴｇｐＶ、Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１により定義されるようなＴｇｐｌＢｇｌｌＩ又はＳｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、２により定義されるようなＴｇｐ　Ｉ　Ｘｍａ　ｌ　ＩＴ）及びその抗原性フラグメント（一つ以上のエピトープ）への応答を生成する抗体の検出のためのキットに関し、該キットは、Ｔｇｐヌはそのフラグメントに対する該抗体に対し特異性を有する抗体を含むように適合された第一の容器、並びに第一の抗体に対し特異的でありしかも検出可能な信号を与えることができるレポーター分子をラベルした抗体を含む第二の容器を受容するようにコンパートメントになっている。もしレポーター分子が酵素であるならば、該酵素に対する基質を含む第三の容器が設けられる。

本発明の診断キットは、■Ｚ■糖蛋白質の抗体の状態を検出するのに使用できる。このキットは、ワクチン接種の個体とともにＶＺＶの種々の臨床上の症状を示す個体のｖＺｖの診断及び検出の迅速な方法をもたらす。

実施例１）材料及び方法シースター感染患者から最初単離されたバリセラ・シースターウィルス（ＶＺＶ）株ＶＺＶ８６を、Ｖａｆａｉら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、１３．３１９−３３６（１９８９）に記載された共培養法によりアフリカンミドリザル腎臓細胞（ＢＳＣ−１）で成長させ、増殖させた。ワクシニアウィルス（菌株ＩＨＤＪ）は、Ｃａｂｉ　ｒａｃら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、１０．２０５−２１４　（１９８８）に記載されているように０．０１プラ一ク形成単位（ＰＦＵ）の感染の多重度（ｍ、　ｏ、ｉ、　）でＢＳＣ−１細胞に成長させた。

２）モノクローナル及びポリクローナル抗体の製造■Ｚ■糖蛋白質ｒ（ｇｐｒ）及びｇｐｌＶ（ＭＡｂ７９．７、ＭＡｂＣｌ、ＭＡｂＧ７、ＭＡｂＧ６）、ｇｐＩＴ　（ＭＡｂＦ８）及びｇｐｍ　（ＭＡｂＥｌｏ）　に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、Ｖａｆａｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５２．９５３−９５９　（１９８４）、Ｖａｆａｉら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２．２５４４−２５５１　（１９８８）　、Ｃａｂｉ　ｒａｃら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、１０．２０５−２１４　（１９８８）及びＶａｆａｉら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、１３．３１９−３３６　（１９８９）に既に記載された方法により製造された。ヒト血清は、皮膚の発疹の開始６週間後シースター患者から得られた。ＶＺＶピリオンに対する抗体は、Ｖａｆａｉら、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、７．３２５−３３３　（１９８７）に記載されたようにウサギで製造された。

３）組換えワクシニアウィルスの構築図１は、切形のＶＺＶｇｐＩを含む岨換えワクシニアウィルス（ＶＶＴｇｐＩＥｇｌｌＩ）を生ずるのに使用される挿入ベクターの構築を説明する０組換えプラスミド（ｐＧＥＭ−４）を含むＶＺＶｇｐＩ遺伝子（Ｖａｆａｉら、Ｊ、Ｖｉ− ｒｏｌ、６２．２５４４−２５５１　（１９８８）　）は、ＶＺＶヌグレオチド配列１１６２８７でｅ１エピトープから下流でＢｇｌＩ［により（Ｄａｖｉｓｏｎ及び５ｃｏｔｔ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６７．１７５９−１８１６　（１９８６））、そしてｐＧＥＭポリリンカーにおいてＥｃｏＲＩにより開裂された。１５９アミノ酸のポリペプチドをエンコードする切形のｇｐ■遺伝子は、電気溶出され、（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂ−ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙｌＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、、ＮｅｗＹｏｒｋ　（１９８２））に記述されたように、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端され、そして挿入ベクターｐｓｃＩＬのＳｍａＩ部位中にリゲーションされた（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ　ｉら、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５．３４０３−３４０９　（Ｉ９８５））、組換えプラスミドは、ｐｖｖＴｇｐＩＢｇ　Ｉ　Ｉ［と名付けられ（そして図１に示される）１組換えワクシニアウィルスは、Ｍ　ａ　−ｃｋｅｔｔら、　ｒＴｈｅ　Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃ　−ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｃｏｍｂ−ｉｎａｎｔｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　ＧｅｎｅｓＪＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ、Ｗ、Ｇｌ−ｏｖｅｒ編）ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、○ｘｆｏｒｄ、ｐ、１９１−２１１　（１９８５）（修正あり）により記述された方法により得た。１４３Ｂ　ＴＫ−細胞（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８５）を、ブロモデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）の不存在下−晩成長させ、次にＯ，０ＩＰＦＵのｍ、ｏ、ｉ、でワクシニアウィルス（菌株ＩＨＤＪ）により感染させ、そして９０分間３７℃でインキュベートした。感染した細胞は、次に業者の指示により３０μｇのｐＶＶＴｇｐＩ及び５０μｇのりボッエフチン試薬（ＢＲＬ）によりトランスフェクションされた。細胞を感染・トランスフェクション後４８時間で採集し、得られるウィルスを２５μｇ／ｍＬのＢｕｄＲの存在下ＴＫ−細胞中で２回継代した０組換えワクシニアウィルスを、ｂ　ｌ　ｕｏ−ｇａ　ｌ　（ＢＲＬ）により染めることにより、自然発生のＴＫ−ウィルスから区別いそして３サイクルのプラーク精製によりクローン的に単離した。

さらに免疫原性の分泌性の切形ＶＺＶｇｐｌを製造するために、同じ方法を使用したが、ＶＺＶｇｐ　ｒ遺伝子を、ＶＺＶヌ／７Ｌ、オチド配列ＩＬ７３４２でＸｍａＩ［［によりモしてＥｃｏＲｌにより（ＢｇｌＩ［及びＥｃｏＲｌの代わりに）開裂する修正を行った。５１１アミノ酸残基によりｇｐＩのＮ−末端領域をエンコードする切形のｇｐｒ遺伝子を、前記のように、電気溶出し、平滑末端し、そしてｐｓｃｎ中にリゲーションした０組換えプラスミドを、ｐＶＶＴｇｐｒＸｍａｎｌと名付けた０組換えワクシニアウィルスを上記のようにして得て、ＶＶＴｇｐＩＸｍａｌＩ［と名付けた。

４）岨換えワクシニアウィルスの発現切形のｖｚｖｇｐｒ遺伝子を有する岨換えワクシニアウィルス（ＶＶＴｇｐｌＢｇＬｌｌ及びＶＶＴｇｐ　ＩＸｍａＩ［Ｉと名付けられた）の発現は、１．０ＰＦＵのｍ、ｏ、ｉ、　でＶＶＴｇｐＩＩＣよるＥＳＣ−１細胞に感染により分析された＃３７℃で２２時間のインキュベーション後、感染された細胞を、１時間無メチオニン培地でメチオニンを欠乏させ、次に１時間［３５ｓ］メチオニン（１００−２００μＣｉ／ｍＬ）によりラベルした。Ａｆｌｌ胞を次に３同情ホスフェート緩衝塩水により洗い、そして４ｍＬの溶解緩衝液（０，０２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，６、Ｏ，１ＭＮａｃ１．１％Ｔｒｉｔ、ｏｎ　Ｘ−１００，０，５％デオキシコレート、０．１％５ＤＳ）で分裂させた。ライゼートを２時間氷上に置き、５℃で２時間、Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ６０ローターで４０００Ｏｒｐｍで遠心分離した。上澄液を、■Ｚ■蛋白質に対して製造されたモノクローナル及びポリグローナル抗体による免疫沈降まで一７０℃で貯蔵された（図２及び３を参照）。

図２に示された結果は、１時間のラベリング時間中３２ｋＤａポリペプチドに処理されたＶＶＴｇｐ　Ｉ　Ｂｇ　ｌ　ＩＩによる２５ｋＤａの一次翻訳生成物の発現を示す、２５ｋＤａ及び３２ｋＤａの両方の蛋白質は、ｅｌエピトープに対するＭＡｂ７９．７により認識できる（Ｖａｆａｉら、１９８８）、ヒト血清は、２５ｋＤａのものと反応しく図２、ライン２）、そしてゲルのより長い暴露は、ＴｇｐＩの成熟形（３２ｋＤａ）によるヒト血清のがすがな反応性を示す。３２ｋＤａ蛋白質は、又ＶＺＶｇｐＩの十分にグリコジル化形を認識するＭＡｂＧ７と反応した（図２、ライン４）、しがし、ＶＺＶｇｐＩに向けられるがｅ１以外の一つ以上のエピトープのみを認識するＭＡｂＣｌは、Ｔｇｐｌとは反応しない（図２、ライン３）、ＶＺＶｇｐｌＶ　（ＭＡｂＧ６）、ｇｐＨ（ＭＡｂＦ８）及びｇｐｍ（ＭＡｂＥｌｏ）に対するＭＡｂは、又Ｔｇｌ）Ｉのプレカーサー生成物と反応せず（図２、ライン５．６．７）、ＭＡｂ７９．７に対するＴｇｐ　Ｉの特異性を示す。

これらの結果は、ＶＶＴｇｐｒＢｇｌｌＩにより発現されｔ：ＴｇｐＩが、ＶＺＶ血清陽性ヒト血清と同じ＜ＭＡｂ７９．７による認識に必要な天然の立体配座を維持していることを示す。２５ｋＤａのＴｇｐＩの一次翻訳生成物は、Ｔｇｐｒによりエンコードされる１５９アミノ酸残基から導き出される予想された１７゜５ｋＤａより大きいことが分かった。

図３に示される結果は、１時間のラベリング時間中７６ｋＤａポリペプチドに処理されたＶＶＴｇｐＩＸｍａｍにより６０ｋＤａの一次翻訳生成物の発現を示す、６０ｋＤａ及び７６ｋＤａの両方の蛋白質は、ＭＡｂ７９．７及びＭＡｂＣｌ　（ＶＺＶｇｐＩのプレカーサー・生成物を認識する）及びＭＡ、ｂＧ７　（ＶＺＶｇｐＩの成熟したしかも十分にグリコジル化した形のみを認識する）により認識される（図３、レーン１．２及び３）、ＭＡｂＦ８　ＣｇｐＨに対する）及びＭＡｂＦ９　（ＶＺＶ　ＮＣＰに対する９は、ＴｇｐＩ−ＸｍａＩ［Ｉのプレカーサー・生成物と反応しなかった（図３、レーン４及び５）、ＴｇｐＩＸｍａ［［ＩとのしかしＴｇｐＩＢｇｌＩＩとではないＭＡｂＣｌの反応性は、ＴｇｐＩＸｍａＩＩ［への追加の１種以上のエピトープの存在を証拠室てる。

５）分泌されたＶＺＶ切形ｇｐＩＥＳＣ−１細胞は、１．０ＰＦＵのｍ、　ｏ、ｉ、でＶＶＴｇｐＩＢｇＩ　Ｕにより感染され、そして２２時間のインキュベーション後、細胞を、１０分間［３５Ｓ］メチオニン（３００μＣｉ／ｍＬ）によりパルスラベルした。細胞を、採集するか又は５回無血清培地により洗い、そしてラベルを１．２．３及び７時間追跡した。未感染細胞を１０分間パルスラベルし、７時間追跡した。細胞ライゼ −トを上記のように製造し、そしてＶＺＶｇｐｒＢｇｌｌｌエピトープ（ｅｌ）に対するＭＡｂ７９．７　（Ｖａｆａｉら、Ｊ、ＶＬｒｏｌ、６２．２５４４− １５５１　（１９８８））、並びにＶＺＶｇｐＩＢｇｌＩＩに対するがｅ１以外の１種以上のエピトープを認識するＭＡｂＣｌにより免疫沈降した。未感染及びＶＶＴ　ｇ　ｐＩＢｇｌｌＩ感染細胞からの組織培養流体を集め、ミクロフユージで１０分間遠心分離した。上澄液を集め、各サンプルに等容積の溶解緩衝液の添加後、サンプルを５℃で２時間Ｂｅｃｋｍａｎ　５Ｗ６０ローターで４０００Ｏｒｐｍで遠心分離した。上澄液を、ＭＡｂ７９．７及びＭＡｂＣｌにより免疫沈降した（図４参照）。

図４に示される結果は、１０分間のパルスラベリング時間中感染された細胞で検出されるプレカーサーＴｇｐＩＢｇｌＩＩ　（２５ｋＤａ）が、１時間の追跡時間中に３２ｋＤａの蛋白質になり、そして２５ｋＤａ及び３２ｋＤａの両方のバンドの強度が、７時間の追跡時間中減少することを示す（図４、ＣＬ）。結果は、又ＴｇｐＩＢｇ１ｍ　（３２ｋＤａ）の成熟グリコジル化の形が、１時間の追跡時間内で感染された細胞の組織培養流体に現われ、さらに３２ｋＤａＴｇｐＩＢｇＩｆｆの強度が、７時間の追跡時間中増大することを示す（＠４、ＴＣＰ）。これらの結果は、ＴｇｐＩＢｇｌｍの十分に処理された形が、感染された細胞から放出され、モしてｅ１以外の一つ以上のｇｐ■エピトープに対してのみ向けられるＭＡ、ｂＣｌではなくＭＡｂ７９．７により認識されることを示す、さらに、感染された組織培養流体から精製された３２ｋＤａＴｇｐＩＢｇｌＩｒのウェスタン・プロット分析は、分泌性のＴｇｐＩＢｇｌＩＩがＭＡｂ７９．７により認識されたことを示す。

゛これらの実験のコントロールは、未切形（フル・サイズ）ＶＺＶｇｐ　ｒを有ししかも未切形ｖｚｖｇｐｒを発現する組換えワクシニアウィルス（ＶＶｇｐＩ）によるＥＳＣ〜１細胞の感染によりもたらさられる（Ｃａｂｉｒａｃら、Ｖｉ　−ｒｕｓ　Ｒｅｓ、１０．２０５−２１４　（１９８８））、上記のパルス追跡の実験が行われた。ＶＶＴｇｐＩＥｇｌＩＩとは対照的に、ｖｖｇｐｒ感染細胞がらの組織培養流体及び細胞ライゼートの分析は、天然のＶＺＶｇｌ）Ｉが感染した細胞から分泌されなかったことを指示した（図５）。

Ｔｇｐｌ−ＸｍａｌＵが細胞から分泌されるがどうかを知るために、感染した細胞を、１時１”ｓ’ｌ［”Ｓ］メチオニンによりパルスラベルし、無血清培地により洗いそして２時間無血清培地によりインキュベートした０組織培養流体（ＴＣＰ）を採集し、上記のようにＭＡｂにより免疫沈降した。結果は、成熟及び十分にグリコジル化した形のＴｇｐｒＸｍａｌＩ［が細胞から分泌され、そしてそれぞれｖＺＶｇｐｎ及びＶＺＶＮＣＰ！＝向つＭＡ　ｂ　Ｆ　８及びＭＡｂＦ９　（図１、レーン１ｏ及び１１）によってではなく抗ｇｐＩＭＡｂ（図３、レーン７．８及び９）により認識されたことを示す。

６）抗ｖｖＴｇｐｒ抗体の製造ＶＶＴｇｐＩに対する抗体は、既に記述された方法（Ｖａｆａｉら、Ｖｉｒ−ｕｓ　Ｒｅｓ、７．３２５−３３３　（１９８７）及びＶｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、１３．３１９−３３６　（１９８９）により、ウサギで生成させた。ニューシーラントホワイト雌ウサギを、背中及び後足の多数の部位で皮下で免疫化した。免疫前の出血（コントロール血清のため）後、動物は、ｌＸ１０’ＰＦＵ／ｍＬのＶＶＴｇｐＩを受けり、コれは、それぞｎ１Ｘ１０’ＰＦＵ／ｍＬのＶＶＴｇｐＩよＪなる３回の毎週の注射をともなった。

７）ＶＺＶ感染細胞蛋白質の放射ラベリング■Ｚｖは、共培養によりＥＳＣ−１細胞で成長し、４８時間後、感染した細胞をツニカマイシン（１５μｇ　／　ｍ　Ｌ　）の存在又は不存在下１０分間［３５Ｓ］メチオニン（３０ｐ　ｃ　ｉ／ｍＬ）によりラベルされた。細胞は、採集されるが、又は３回無血清培地により洗われ、そしてラベルは、ツニカマイシン（１５μ゛ｇ／ｍ　Ｌ　）の存在又は不存在下２時間標準の培地で追跡された。ＡＩ胞を次に３同情ホスフェート緩衝塩水により洗い、細胞ライゼートを上記のようにして製造し、ＲＡｎｔｉ−ＶＶＴｇｐＩにより免疫沈降した。

８）免疫沈降未感染、ＶＶＴｇｐｌＥｇｌｆｆ感染、ＶＶｇｐＩ感染、ｖｚｖ感染細胞かラノ細胞ライゼート（４００μＬ）　及び未感染、ＶＶＴｇｐＩＢｇｌ１１感染、ＶＶｇｐ工感染細胞からのライゼート（５００μＬ）組織培養流体を、蛋白質Ａ含有スタヒロコッカス・アウレウスＣｏｗａｎＩの１０％ホルマリン固定懸濁液４０／。

Ｌとともに４℃で２時間インキュベートした（ＫｅｓｌｅｒｌＪ、Ｉｍｍｕｎ− ｏｌ、１１５．１６１４−１６１７．１９７５）、２０分間９０００Ｘｇで遠心分離した後、ｖＺ■特異性蛋白質を、■Ｚｖ蛋白質に対して製造したポリクローナル抗体（ヒト血清及びＲＡｎｔ、ｉ−ＶＶＴｇｐＩ）５０μＬ又はモノクローナル抗体１００μＬの存在下２０時間４℃で免疫沈降した。最後に、３ｏμＬの１０％ホルマリン固定Ｓ、アウレウス懸濁液を加え、４℃で２時間後、吸着した免疫コンプレックスを３回溶解緩衝液により洗い、２ｏμＬのＴＮＥＡｌａＥ液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７，４、ｉ５０ｍＭＮａｃｌ、５ｍＭＥＤＴＡ＞に懸濁し　た、１０μＬの３×サンプル緩衝液（１５０ｍＭｈ５０ｍＭトリス０．６％ＳＤＳ、１５％２−メルカプトエタノール、０．０３％ブロモフェノールブルー）の添加後、懸濁液を４分間沸騰水中で加熱し、氷で冷却し、Ｖａｆａｉら、Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、５２．９５３−９５９．１９８４及びＪ、Ｖｉｒｏｌ、６２．２５４４−２５５１．１９８８に記載されたように、８−１２％ポリアクリルアミド５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析したく図５参照）。

細胞ライゼートは、ＶＺＶｇｐＩを認識するＭＡｂＣｌ及びｇｐｒＶ及びＲＡｎｔ　ｉ−ＶＶＴｇｐ　Ｔ　Ｂｇ　Ｉ　ＩＩにより免疫沈降し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した０図６Ａ及び已に示されたように、結果は、ＭＡｂＣｌと同じく、ＲＡｎｔ、ｉ−ＶＶＴｇｐ　Ｔ　Ｂｇ　ｌ　ＩＩは、ツニカマイシンの存在又は不存在下精製のＶＺＶｇｐＩのプレカーサー・生成物と反応するにれは、ＶＶＴｇｐＩＢｇｌＩＩにより発現されたｅ１エピトープが、■ｚ■の天然のｇｐＩｅｌエピトープにより認識される抗体応答を誘発したことを示す。

９）中和テスト中和テストは、記述（Ｖａｆａｉら、１９８７）されたように一定のウィルス変化血清技術により行われた。簡単には、ＢＳＣ−ＩＪｆｌｌ胞（１０’）は、共培養によりＶＺＶによって感染された。３日後、感染した培養物が、８０−９０％の細胞変性を示したとき、細胞は、組織培養培地中にこすり落とされ、４℃で２０分間２０００Ｘｇで遠心分離し、細胞ベレットを４ｍＬの無血清培地に再懸濁した。細胞懸濁液を、テフロン被覆ホモジナイザー中で氷でダウンス（ｄｏｕｎ−ｃｅ）ホモゲナイズ（１５０回転）した。ホモジネートを、１０分間８００Ｘｇで遠心分離し、上澄液を中和テストに用いた。１００−２００ＰＦＵを含む部分（０、５ｍ　Ｌ　）を、ＶＺＶピリオン（Ｖａｆａｉら、１９８７）に対して製造されたＲＡｎｔ　ｉ−ＶＶＴｇｐ　Ｉ又はウサギ抗ＶＺＶ抗体（ＲＡｎｔ　１−ＶＺＶ）又は免疫前の血清及び０．２５ｍＬのモルモット補体の異なる希釈（０，１：１０．１：５０及びｌ：１００）の等容積と混合した。混合物を、２時間３７℃でインキュベートし、６穴プレートで成長したＢＳＣ−１細胞の２穴に接種した。

３時間３７℃でインキュベーションした後、接種物を取出し、細胞を洗い、２％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含む培地を上に載せ、５−７日間３７℃でインキュベートした。細胞を次にホルムアルデヒドにより固定し、クレシルバイオレットにより染め、プラークを記述（Ｖａｆａｉら、ｔ９８４）されたようにカウントした。

結果は、例えば補体の存在又は不存在下精製した■Ｚｖピリオン（Ｖａｆａｉら、１９８７）に対して製造したＲＡｎｔｉ−ＶＺＶ抗体の１：１０希釈で１００％のプラーク減少を示し、そして補体の存在下ＲＡｎｔ　ｉ−ＶＶＴｇｐ　Ｉの１：１０希釈で５０％のプラーグ減少を示す。

配列表（１）一般的な情報。

（ｉ）　出願人　：　バフアイ、アバス（ｉｉ）　発明の名称・　バリセラ・シースターウィルス抗原（ｉｉ）　配列の数　：　２（ｉｖ）　郵便宛先（Ａ）　名前　、　スカージー、スコツト、マーフィー　アンドブレッサー（Ｂ）　通り　ガーデン　シティ−プラザ　４００（Ｅ）　国　：　米国（Ｆ）　郵便番号・　１１５３０（Ｖ）　コンピュータ読取りフオーム：（Ａ）　媒体　：　フロッピー・ディスク（Ｂ）　コンピュータ：ＩＢＭＰＣコンｌくチブル（Ｃ）　オペレーション・システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）　ソフトウェア：　パテント　イン　リリース　８１．２４（ｖｉ）　現在の出願データ：（Ａ）　出願番号：（Ｂ）　出願日　：　１９９０年１０月３日（Ｃ）　分類（ｉ）　代理人（Ａ）　名前　・　デギグリオ、フランク　ニス（Ｂ）　登録番号：　３１．３４６（Ｃ）　リファレンス／ドケット番号・　７９８０（１ｘ）　通信法。

（Ａ）　電話　：　（５１６）　７４２−４３４３（２）配列番号＝　１（ｉ）　配列の特徴：（Ａ）　長さ　＝　１５９　アミノ酸（Ｂ）　型　：　アミノ酸（Ｄ）　トポロジｍ：　直線状Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｍｅｊ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　１ｓＧｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｒｑ　Ａｌａ　３０Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　４５Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　［（ｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　６０Ｇｌｕ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｈａ　Ｔｙｒ　７５Ａｓｐ　ＨｉｇＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｐｆｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　９０Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　１１０５Ａｒ　Ｇｌｙ　ＩＬｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｍｅｌｌ、Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　！４＠ｔ、１Q０Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　）ｌｉｓ　Ｖａｌ　ＩＩｓ　ｌコT Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　）ｌｉｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　１５O Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　１５９（３｝　配列番号　２（ｉ）　配列の特徴．（Ａ）　長さ　５１１　アミノ酸（Ｂ）　型　アミノ酸（Ｄ）　トボロジ一二　線状（ｉｉ）　配列の種類　ペプチド（ｘｉ）　配列　：　配列番号　２ｓ＊ＬＧｌｙＴｈｒＶａＬＡｓｎＬｙｅＰｒｏＶａｌＶａｌＧｌｙＶａＬＬａｕＭ＠ｔＧｌｙＰｈ＠ＩｓＧｌｙＩｌ＠ｒｌｓ丁ｈｒ’Ｇｌｙ丁ｈｒＬａｕＡｒｑＩｌｅ丁ｈｒＡｍｎＰｒｏＶａｌＡｒｇ八ｌａ〕ＯＢａｒＶａｌＬ＊ｕ＾１゜ｑ丁ｙｒＡｓｐＡｓｐＰｈｅｌ口１丁ｈｒＡｓｐＧｌｕ八ｓｐＬｙｓＬ會ｕ４５八寥ｐＴｈｒ＾ａｎＳ＠ｒＶａｌτｙｒＧｌｕＰｒｏ丁ｙｒＴｙｒｌｌ１ｇ５唸ｒＡｓｐＨｌｓｌａ６０ＧｌｕＳ＠ｒＳａｔ丁ｒＰＶａＬ八ｇｎＡｒｇＧｌｙＧｌｕＳｅｔＢ＠ｒＡｒｇＬｙｅＡｌａＴｙｒフ５ＡｓｐＨｉｔ八ｓｎＳｅｔＰｚｏＴｙｒ１１●ＴｒｐＰｒｏＡｒｇＡｓｎＡｓｐＴｙｒ八ｓｐＧｌｙ９０Ｐｈ＠Ｌ＠ｕＧｌｕＡｓｎＡＩＩ１１１１ｉＧｌｕＨ１ｇ８１ｓＧｌｙＶａｌ丁ｙｒ八ｓｎＧｉｎＧｌｙ１０５ＡｒｇＧｌｙ工１ｅＡｓｐＳ＠ｒＧｌｙＣｌｕ八（ｇＬＩＩｕｊｌ＊ｔＧｉｎＰｒｏ丁ｈｒＧｉｎＨａｔ．１２０ＢａｒＡｌａＧｉｎＧＬｕＩＶｐＬｅｕＧｌｙＡｓｐＡｓｐＴｈｒＧＩＹ１１＠Ｈｉ．ｇＶａｌｒＬ＋＋１１５Ｉ’ｒｏ　丁ｈｚ　Ｌ．ｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｍｐ　八ｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｙｅ　工Ｌ管’Ｖａｌ　八８ｎ　ν●１　＾ｓｐ　１T０Ｇｉｎ　八ｘｑ　Ｇｉｎ　丁ｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｇｐ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ．Ｌｙｅ　１６５Ｐｒｏ　（ｉｌＩＧｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｘｑ　Ｌａｕ　ＩＩ＠　Ｇｌｕ　Ｖａ１　５＊ｒνａｌ　Ｇｌｕ　Ｃｌｕ＾ｉｎ　ｌｌｉｓ　ｉｌｌＯf １’ｒａｔ’ｈａ丁ｈｒＬ會ｕＡｒｑＡＬａＰｒｏｌｉ＠ＧｉｎＡｒｇＸｉｓＴｙｒＧｌｙＶａｔＡｒｇ１９５ＦｙｒＴｈｒＧｌｕＴｈｒ丁ｒｐＳ＠ｔＰｈｌＩＬａｕＰｒｏＳｓｒＬｅｕＴｈｒＣｙｓ丁ｈ【Ｇｌｙ２１０Ａｓｐ　Ａｉａ　八五ａ　Ｐｒｏ　八ｌａ　ｌｉｅ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌ＠ｕ　しｙｓ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　２２５ＣｙｓＰｌｌ＠ＧｉｎＡｓｐＶａｌＶａｌＶａｌＡｓｐＶａｌＡｓｐＣｙｇＡｌａＧｌｕＡｉｎ丁ｈｒ２４０Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ｇｌ．ｕ　Ｉｌ轡ｓｓｒτｙ【＾ｒ９ＰｈＩＩＧｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　２５５Ｌｙｍ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　ｆｉｇ　Ｖａｌ　νａｌ　Ａｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ＠Ｕ　２７０Ｐｈａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌ＊ｕ　Ｇｌｕ　’Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｉｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙνａｌ　２８５ＬｅｕＬｙｇＶａｌＬ＊ｕＡｒｇＴｈｒＧｌｕＬｙ＊ＧｉｎＴｙｒＬ＊ｕＧｌｙＶａｌＴｙｒＩＩｓコ００丁ｒｐ　Ａｌｌｌ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｃｌｙ　Ｓｉｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｓｒ　τｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈ＠　３１T ＬｅｕＶａｌ↑ｈｒＴｒｐＬｙｓＧｌｙＡ＊ｐＧｌｕＬｙｓＴｈｒＡｒｑＡｓｎＰｒｏＴｈｒ．Ｐｒｏ３３０八ｌ．ａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　八ｒ＋１ＧＬｙ　Ａｌａ　ＧＬｕ　Ｐｈ＠　Ｈｌｉ　Ｈａヒ　τｒｐ　Ａｇｎ　３４T しｅｕＧｌｕ丁ｒｐＬａｕ丁Ｙ【νａｌ．ＰｒｏＩＩｓ八ｓｐＰｒｏ丁ｈｒＣｙｇＧｉｎＰｒｏＭｅｔ１９０八ｒｇＬｅｕＴｙｒＳｅｒ丁ｈｒＣｙｓＬａｕ丁ｙｒＩ１１ｇＰｒｏ八ｉｎＡｌａＰｒｏＧｉｎＣｙｓ４０５Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　八ｌａ　Ｓ＠ｒ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｇ　Ｇｌｕ　ｌｌｉｓ　八ｌａ　４３T 八１ｐ　八１ロ　丁Ｙ【丁ｈｒ　八ｉｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｇ　Ｌ＊ｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌ＊　Ｓ＠ｒ　Ｈｉ＠　Ｍ＠Ｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　４：ＯＳａｒＰｈ＠ＧｌｙＬ＠ｕｌｉ＠Ｌ着ｕｌＩ１ｇｈｉｐＧｌｙＧｌｙＴｈｒＴｈｒＬ＊ｕＬｙｉＰｈ蛾４６５νａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓ＠ｒ　Ｌ．ｅｕ　Ｓａｔ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｔｙｒ　ＶａＩ　Ｐｌ＋ｅνａｌ　Ｖａｌ　４８O ＴｙｒＰｈａＡｇｎｄｌｙ．ｌＩＩ＠ＶａｌＧｌｕＡｌａＶａｌＡＩＩＩＴｙｒＴｈｒＶａｌＶａｌ５ｅｒ４９５丁ｈｒ’ＶａｌＡｓｐＨ１ｓＰｈｅＶａｌＡｉｎＡｌａＸ↓＊Ｇ１ｕＧｌｕＡｒｇＧｌｙＰｈ＠Ｐｒｏ５１０Ｐｒｏ　５１１図　１．切り出されたＶＺＶ　ｇｐｌの組換えワタシニアウイルスによる発現図２．ｅｌエピトープを有する切り出されたＶＺＶ　ｇＩ）１遺伝子を持つ組換えプラスミドの構築禰−−　一一−　ｌ＃ｌ　一一−　１１１−　”　′−１ク− ＦＩＧ．３ＦＩＧ、４ＡＵｎ　ＷＴ９ＰＩＨＷＴ＠１図５．全長のｇｐｌ遺伝子（ＶＶｇｐｌ）を有するワクシニアウィルスにおけるＶＺＶｇｐ　Ｉの発現要　約　畜国際調査報告？ｎｔｓｒｒ：ａｔ二Ｑｒ、！二　＾ｐ；二１Ｃａｔｉｃ、、ｌＩ＊　ｂｅ。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．感染され、トランスフェクションされ又は形質転換された宿主から細胞外に分泌されるバリセラ・ゾースターウィルス（ＶＺＶ）切形糖蛋白質（ｇｐ）を該宿主に発現できるヌクレオチド配列よりなり、そして該糖蛋白質は、哺乳動物にＶＺＶ抗体応答を生じさせる組換えＤＮＡ発現ベクター。
２．前記の感染され、トランスフェクションされ又は形質転換された宿主は、ミドリザル腎臓細胞（ＢＳＣ−１）、ＣＯＳモンキー細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター腎臓細胞、ヒト線維芽細胞又はヒト組織細胞である請求項１の組換えＤＮＡ発現ベクター。
３．該ＶＺＶｇＰは、ＶＺＶｇｐＩ、ＶＺＶｇｐＩＩ、ＶＺＶｇｐＩＩＩ、ＶＺＶｇｐＩＶ又はＶＺＶｇｐＶである請求項１又は２の組換えＤＮＡ発現ベクター。
４．ヌクレオチド配列は、Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．１の１５９アミノ酸配列又はＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎ０．２の５１１アミノ酸配列により規定される成熟ポリペプチドを、感染され、トランスフェクションされ又は形質転換された宿主に発現可能である請求項１−３の何れかの一つの項の組換えＤＮＡ発現ベクター。
５．細胞が、ベクターにより切形のＶＺＶｇｐＩを生成そして分泌せしめられる請求項１−４の何れかの一つの項の組換えＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された又はトランスフェクションされた細胞。
６．細胞外に分泌されそして哺乳動物に抗体応答を生じさせるバリセラ・ゾースターウィルスポリペプチドをエンコードするプラスミド。
７．該プラスミドは、ｐＶＶＴｇｐＩＢｇ１ＩＩ又はｐＶＶＴｇｐＩＸｍａＩＩＩである請求項６のプラスミド。
８．分泌性の切形のバリセラ・ゾースターウィルス糖蛋白質を生成する方法において、ａ）該ポリペプチドについてコードするヌクレオチド配列よりなるベクターを提供し、ヌクレオチド配列は、ベクターを含む宿主により発現でき、そしてヌクレオチド配列は、糖蛋白質のＣ−東端領域についてコードするＶＺＶｇｐゲノムの実質的部分が欠失されそれにより該ｇｐは該宿主から細胞外に分泌されるバリセラ・ゾースターウィルス糖蛋白質を連続的なヌクレオチド配列によりエンコードできる核酸の群から選ばれ、そして該ｇｐは哺乳動物の宿主に抗体応答を行うことができる段階、ｂ）宿主中にベクターを組み入れる段階、ｃ）該糖蛋白質へのヌクレオチド配列の発現に好適な条件下ベクターを含む宿主を維持する段階、よりなる方法。
９．該ベクターは、該ヌクレオチド配列と操作上でともなうプロモーターを含む請求項８の方法。
１０．該宿主は、哺乳動物の細胞であり、そして該ヌクレオチド配列は、さらにリーダー配列をエンコードできるヌクレオチドん領域を含む請求項８又は９の方法。
１１．該哺乳動物細胞は、ミドリザル腎臓細胞（ＢＳＣ−１）、ＣＯＳモンキー細胞、ＨｅＬａ細胞、ハムスター腎臓細胞、ヒト線維芽細胞又はヒト組織細胞である請求項８−１０の何れか一つの項の方法。
１２．糖蛋白質は、Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．１の１５９アミノ酸配列又はＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．２の５１１アミノ酸配列により規定されるオープン・リーディングフレームのポリペプチドである請求項８−１１の何れか一つの項の方法。
１３．該発現ベクターは、プラスミドである請求項８−１２の何れか一つの項の方法。
１４．プラスミドは、ｐＶＶＴｇｐＩＢｇ１ＩＩ又はｐＶＶＴｇｐＩＸｍａＩＩＩである請求項１３の方法。
１５．Ｃ−末端の実質的な部分が欠失され、それによりその中で該ポリペプチドが生成する哺乳動物細胞から細胞外に該ポリペプチドが分泌され、しかも該ポリペプチドは、哺乳動物の宿主に抗体応答を引き出しうる少なくとも一つの抗原性のエピトープを含むＶＺＶｇｐ。
１６．該ｇｐは、ｇｐＩ、ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、ｇｐＩＶ又はｇｐＶである請求項１５のＶＺＶｇｐ。
１７．Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．１のアミノ酸配列又はＳｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．２のアミノ酸配列を有する組換え分泌性切形ＶＺＶｇｐＩ。
１８．Ｃ−末端の実質的な部分が欠失され、それによりその中で該ポリペプチドが生成する哺乳動物細胞から細胞外に該ポリペプチドが分泌され、しかも該ポリペプチドは、哺乳動物の宿主に抗体応答を引き出しうる少なくとも一つの抗原性のエピトープを含むＶＺＶｇｐに対する抗体。
１９．分泌性の切形のＶＺＶｇｐＩ、ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、ｇｐＩＶ又はｇｐＶに対する抗体。
２０．該抗体は、モノクローナル又はポリクローナルである請求項１、２又は４の何れか一つの項の糖蛋白質に対する抗体。
２１．請求項１８−２０の何れか一つの項の抗体に対する抗体。
２２．従来のワクチン担体とともに有効量の分泌性の切形のＶＺＶｇｐ又はその活性フラグメントを投与することよりなる水痘及び／又は帯状ヘルペスに対する免疫化のためのワクチン。
２３．投与量の有効な範囲は、約０．００１−１００ｍｇ抗原／ｋｇ体重である請求項２２のワクチン。
２４．分泌性の切形ＶＺＶｇｐに対する抗体の生成を生じさせるのに十分な条件下で、有効量の前記の分泌性の切形ＶＺＶｇｐを投与することによる水痘及び帯状ヘルペスに対する免疫応答を刺激する方法。
２５．投与量の有効な範囲は、０．００１−１００ｍｇの分泌性の切形ＶＺＶｇｐ／ｋｇ体重である請求項２４の方法。
２６．テストされるベき個体の血清、組織又は組織抽出物を、分泌性の切形のＶＺＶｇｐに対する抗体又はその活性フラグメントと、抗体・抗原コンプレックスを形成するのに必要な時間及び条件下接触させ、次にすべての得られた抗体・抗原コンプレックスを検出することよりなるＶＺＶを診断する方法。
２７．該抗体は、ｇｐＩ、ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、ｇｐＩＶ又はｇｐＶに対する抗体である請求項２６の方法。
２８．分泌性の切形のＶＺＶｇｐ抗体の検出のためのコンパートメント化キットにおいて、該ＶＺＶｇｐ抗体に対し特異性を有する抗体を含むように適合された少なくとも１個の第一の容器、並びに第一の容器の抗体を検出可能なレポーター分子を含むように適合された少なくとも１個の第二の容器よりなるキット。
２９．該ＶＺＶｇｐは、ｇｐＩ、ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、ｇｐＩＶ又はｇｐＶである請求項２８のキット。
３０．レポーター分子は、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光分子、化学発光分子又は生物発光分子である請求項２８のキット。
３１．キットは、さらに酵素に対する基質を含む第三の容器を含む請求項２８− ３０の何れか一つの項のキット。