PT94479B - Processo para a preparacao de uma proteina - Google Patents
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Description
SMITHKLIÍME BIOL.GGICALS <s„a„>
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA PROTEíWA”
PEaóRIA^ESÇRmVA
KSsUsBQ
O presente invento diz respeito & u.is processo para. a preparação de tuna proteína a partir das glicoprotsínas do vírus da varicsla-Zostsr consistindo em gpl sem a região de ancoragem, gpll sem a região de ancoragem ou gpIH sem a região de ancorageoj„ referido processo consiste, essencialmente, em se efectuar a expressão ds uma sequência de DNA codificadora da referida proteína numa célula hospedeira recombinante e a recuperação do produto proteico»
Ests invento está relacionada caos a expressão ds glicoproteínas de Vírus vsriceia-Zoster e ca® uma vacina compreendendo uma quantidade iraunoprotectora de tal proteína,
Vírus da Varicela-Zoster ÍVZV) è um vírus herpes humano que é o agente etíológico da varicela e de herpes-zóster, A varicela resulta de uma infecçâo inicial, ou primária, -geralmente contraída durante a infância e que è relativamente benigna. No entanto, para os adultos que não foram expostos à varicela durante a infância, e ocasionalmente para os indivíduos que estão imunocomprometidos, o VZV pode ser uma ameaça para a vida. De modo semelhante, uma infscção por VZV pode pôr em risco a vida de recém-nascidos, pois o vírus pode atravessar a placenta,
Sabs-se que por contacto directo, a varicela é uma doença infec™ ciosa al tamen te transmissível
Tal como a maior parte dos Vírus Herpes, o VZV tem uma tendência para infectar alqumas células nas quais o seu desenvolvimento é travado, Após um periodo latente variável, o vírus Varicela-Zoster CVZ) pode ser libertado para iniciar infecção noutras células. Esta reactívaçâo do vírus VZ provoca aproximadamente 5 milhões de casos de zóster anualmente CPlotkin et al,, Postqrad nsd J 61; 155-63 (1985)1, Ozéster é caracterizado por inflamação dos gânqlios cerebrais e nervos periféricos e está associado a dor aguda, Presentemente os factores que reactivam o vírus estão mal definidos.
Demonstrou-se que os humanos vacinados com estirpes atenuadas de VZV receberam imunidade protectora contra ir-íscçíSes por VZV CArheter st al,, J, Pediatr 1¾¾ 886-93 (1982) s Brune!1 et a!,, i í a 1o69-72 (1982)), Se bem que eficaz, este método tem limitações devido á dificuldade de propagação do vírus Varicela— -Zoster, Tem sido gasto um esforço considerávelpara identificar
X ϊ
os componen tes antigénicos do virus VZ . Pará'permitir o desenvolvimento de vacinas melhoradas contra o VZV. especialmente vacinas de subunidades, é importante isolar as proteínas do invólucro do VZv. Forghani et al. (3. Virol., 52s55-62 (1984)), Okuno et al. (Virol.,129s357-68 C1983) e Keller et ah, <3» Virol. 52s293-7 (1984)? identificaram numerosas glicoproteinas especificas do viros em células infectadas com VZV e viriSes de VZ.
Em áreas ds investigação separadas mas relacionadas, o genorna do VZv foi elucidado por análise com endonuclesses de restrição. Foram determinados mapas físicos do DNA de VZV e de fragmentos de DNA clonsdos para onze endonuclesses ds restrição (Consultar Ecker et al =, Pr5c„,Natl _Acad__Sçi............USA Z2“ 156-160 (1982), Straus et al., Proc Natl Acad Sei LISA 79s993-7 (1982), Straus st al. . 3 Ssn Virol 64 g 1031-41 (Í983) e Davidson st al„5 3 Sen Virol 64s1811-1814 (1983)).
Como resultado destes estudos, proliferou o conhecimento cientifico sobre o VZV, Em adição, houve uma proliferação simultânea da nomenclatura. Davidson et al. (3 Virol 57¾1195-7 C1986)) fez uma reunião de trabalha para normalização da nomenclatura dos genes das glicoproteinas do VZV e seus produtos. Os três produtos mais importantes dos genes do invólucro foram designados gpl. gpll e gplll, apresentadas pela ordem decrescente de abundância. Todas estas três glicoproteinas. gpl-gplll induzem anticorpos neutralizantes in vitro.
Pouco depois foi publicada toda a sequência de núcleotideos do VZV, por Davison et al. (3. Sen Virol. 67^1759-1816. (1986)). Isto levou a identificação ds vários genes de glicoproteínas e ajudou a clarificar as relações precursor produto de várias glicoproteinas virais. Tal como acontece con? outros virus herpes, o genoma do VZV é bastante complexo. Ele contem 7® grelhas de leitura abertas CORFs), as quais codificam cinco possíveis genes de glicoproteínas, designados gpl , gpll, gpíll, gpIV e gpV» Com base na sua sequência de aminoãcidos deduzida encontrou-se que possuem vários graus de homologia com as glicoproteinas do vírus herpes simplex (HSV-1) gE, qB = gHs gl s gC, respectivamente (Davison et ai ·,, Id e Longnecker et al =, Proc Netl_Açad_.Sçi_USA 84 s 4303-4-507 <1987).·. Desconhece-se ss a hosisiogia de aminoãcidos entre as glicoproteínas do VZV e do HSV-i significa uma homologia funcional» Se bem que existam resultados consideráveis sobre a função das glicoproteínas do HSV-i, existem poucos estudos sobre as glicoproteínas do VZV» Estes estudos têm focado principalmente glicoproteínas envolvidas na neutralizaçãodo vírus (Davison et al. s supra» Keller st al = 5 supra s vafai et al», J Virol 52s953-9 (1984))«
Ellis et al», (Patente U.S» 4,769,239) descreve o isolamento de duas sequências codificadoras ds gpl de mRNft de VZV= Ellis st al, descreve a sequência de um polipeptídeo contendo gpl mais 38 codSes adicionais encontrados no extremo terminal assina. Ellis et al., também descreve uma molécula, que codifica um fragmento de 3®© aminoácidos de gpl, gpl nativa tem 623 aminoácidos«
Ellis et al = 5 -3 Virols 53s81-88 <1985), descreve duas abordagens para ssapear o gene gpl» Fragmentos pequenos da digestão ao acaso do DNA de VZV foram inseridos num vector de· expressão bacteriano» Abiblioteca de colónias bacterianas transformadas por este vector foi despistada quanto à expressão de gpl como uma proteína ds fusão gpI/lacZ. Esta proteína hibrida foi reconhecida por anticorpos monoclonais CmAb) induzidos contra gpl» Em adição, seleccionou-se mRNft ds células infectadas com VZV por hibridação com uma série de plasmídeos recombinantes- de· VZV e traduzido in vitro. Db produtos rssultantss foram imunoprecíipitados por soro ds soster covalescente contra gpl,,
EIlis st 5.1,= ,· (Patente U.S» 4,812,559) descreve a sequência ds gpll do VZV, EIlis st al» também descrevem a purificação ds gpíl a partir ds fibroblastos diplóitíes humanos MRC--5 infectados com o vírus VZ» Em - adição,, gpll purificado do VZV induziu anticorpos neutralizantes em cobaios quando testados in vitro.
Keller et al, , Viroloqy =, 152s 181--191 (1986) sugere que gpíl madura é um heterodímero ligado por pontes dissulfureto o qual é- gerado por uma clivagem proteolítica in vivo na célula hospedeira»
Keller et al = CEP~A--2443155) descreve u?n fragmento ds DMA codificador de gplII e a purificação de gplII a partir de fibroblastos diplóitíes humanos infectados com o vírus VZV, In vitro os anti-soros contra gplII neutralisaram VZV,
Msnhuma das referências atrás referidas, no entanto, ensina ou sugere como produzir glicoproteínas do VZV em quantidades clinicamente úteis. Foram feitos esforços para desenvolver sistemas de expressão alternativos» Cahriac et al=5 Virus____Res, s205-14 (1988) descreve um vírus da vacina recombinante expressando gpí qus foi localizada na membrana de células infectadas com virus recombinante. No entanto,, Cabriac et al, não descrevem um método de produção de gpí que possa ser fácilments purificada»
DiNocera et al „ 3 Proc Natl Acad Sei USA, 80;· 7095-8 C1983)5 divulgam a expressão transitória de genes estranhos em células de Srosophila em cultura. Os plasmideos recombinantes i ϊ
descritos estão sob o controle de promotores da proteína ds choqus térmico 7® Chsp> de Drosophila du Copia»
Baurouis et ah, Embo 3 „ 2:1099-11.04 (1983)? descrevem a integração de genes estranhos no genoma ds células de Drosophila ©m cultura..
No sistema de expressão de baculovírus? pode-se usar um promotor forte regulado temporalsnente? para expressar alguns genes heterólogos» Smith et ah (Patente LhS» 4?745?05i) e Mstsuurs et al» (J Sen Virol» 6-8 g1233-5© (1987?) descrevem vectores de baculovírus contendo o promotor do gene da poliedrina para expressar determinados genes procariéticos e eucarióticos»
Fraeer st ah CPTCZW088Z®7®82> descreve uma proteína de fusão da poliedrina que forma corpos de oclusão» Demonstrou-se que uma proteína ds fusão poliedrina-iniluenca expressava um epítopo da proteína hemaglutinina que foi reconhecida por anticorpos contra o virião da influsnza»
Míller et al» (PCTZWO88Z0203O) descreve um método para a produção ds genes heterólogos empregando uma mistura de pelo menos dois haculovírus geneticamente distintos»
Em adição? demonstrou-se que certos antigénios virais derivados ds células de insecto infectadas com baculovírus recombinante são antigénica e imunoqéniemente semelhantes às suas eontrapartes nativas-» Cochrsne -et al» CEF'-A-265?785) e Rusebe et al» (EP-ft-272?858) descrevem a clonagssi e expressão das glicoproteinas gp!20 e gplóO do invólucro do vírus da imunodeficiência CHIV)» ί ΐ
Cochran et al« <EP-A-2285®363 descreve® a expressão de fsetor de crescimento ds vacina <VGF) num baculovírus recombinan— te» Em adição, Cochrsn et sk apresentam uma lista hipotética de proteínas que podem ser expressas num baculovírus recombinante, incluindo o antigénio ds superfície da hepatite b e polipeptideos de Plasmodiuro,,
Bishop st ab (EP-A-260,0903 e Tekehers et al, (J Gen virol:, 69s2763-77 C19883) descrevem a expressão dos antigênios de superfície da Hepatite B em baculovírus»
Estes et al», (EP-A-260,09Θ3 descrevem a expressão de genes de rotavírus num sistema baculovírus»
Jacobs et al» (Pedido de Patente U.S» N2 de Série 07/287934 e PCT/US89/055503 descrevem a expressão de proteínas do circunsporosóito do plasm-ódio num sistema de baculovírus»
Num aspecto este invento proporciona uma vacina melhorada contra varicela-costerconsistintío em glicoproteínas antigénicss expressas em células de insectos»
Num outro aspecto, este invento é uma molécula de DNA recombinante ou vector compreendendo uma sequência de DNA, a qual codifica glicoproteínas do vírus varicela-zoster, operacionalmente ligada a uma região reguladora que funciona numa célula hospedeira de insecto»
Num outro aspecto, este invento ê um processo para apreparação de uma glicoprotsína do virus Varicela-Zoster, processo este que se caractariza pela expressão da referida sequência de DMA numa célula ds insecto e recuperação do produto proteico»
X
Em aspectos relacionados,, este invento é ura baculovírus recombinante comprendendo a molécula de DNA recombinante e orna célula hospedeira de insscto infectada com o haculovírus recombinante»
Noutros aspectos relacionados,, este invento é um baculovírus recombinante compreendedo a molécula de DNA recombinants s uma célula hospedeira de insecto infectada com o haculovírus recombinante»
Ainda? noutros aspectos relacionados o invento é uma glicoproteina do vírus Varicela-Zoster produzida pelas células hospedeiras do invento? uma vacina compreendendo uma quantidade imunoprotectora da referida glicoproteina? a referida glicoproteina para usar na vacina? e utilização da referida glicoproteina na obtenção da vacina»
Este invento também está relacionado com um método para para a protecção de humanos contra a infecção pelo vírus Varicela -Zostsrf o qual se caracteriza pela administração de uma quantidade segura e eficaz da vacina»
Este invento proporciona ainda uma proteina das glico— proteínas do vírus Varicela-Zoster consistindo eni opi sem ancoragem» gpll sem ancoragsm ou gplíl sem ancoragem,
Em aspectos relacionados^ o invento proporcionasuma sequência ds DNA qus codifica a referida glicoproteína sem ancoragem? um vector de expressão replicàvel capaz, numa célula hospedeira,, de expressar a sequência de DNA» uma célula hospedeira transformada com o referido vector de expressão replicàvel? uma vacina compreendendo uma quantidade imunoprotectora da referida glicoproteina sem ancorageis? um método para protege?'· » r
A.1 ε ϊ ΐχ,-u.pL-XtJ νχΓΧνϊΰ· y-SU^Xu© χ Η—£wtot^V η O OLi^l '_=u iautfcfv iza pela administração de uss quantidade segura e efi· o a r e τ e π d a v a c i n a= ft sequencia ss nucieotídeos completa, do i esc ri ta por Da vison
k.ii.,S.£;i êZ.» 1 /b’/—1810 tl9S6>. As sequências de nwft nas do VZV Cqp) I, II g m u a λ a ? u_____issn oe .uwi-i oas cjlicoprotex™ deduzioab, estão descritas abaixos ρ l ORA tna «Ilno 4tll itnuoncl
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primeiro ATS codifica uma metioninã M-terminale o último codão, TBA ou TAA, é um sinal ds terminação Ci »e»paragem) da tradução.
Conforme aqui são usados, os termos «gpl», «gpll» ou «gplíIsincluem ss glicoproteínas de membrana de tamanho completo do vírus yarícela-zoster? essencialmente como exemplificado atrás s todos os seus derivsdos imunogénicos incluindo variantes sem ancoragem» 0 termo «derivado imunogénico» engloba qualquer molécula como seja uma glicoproteína VZV truncada ou outras derivados que mantenham a capacidade de induzir uma resposta imune contra o VZV após administração ao homem» Tais outros derivados podem ser preparados pela adição, deleção» substituição ou rearranjo de aminoácidos ou por modificações químicas deles»
As glicoproteínas do VZV do invento compreendem as glicoproteínas de tamanho completo do VZV ou seus derivados incluindo derivados de glicoproteínas sem ancoragem a que falta 4 a Ξ© por cento dos resíduos de aminoácidos totais no extremo carboxilo, como discutido mais tíetalhadamente abaixo»
Como exemplo, a gpl usada no presente invento é substancialmente a mesma Ci»e» difere em não mais do que i© aminoácidos) proteína codificada pela sequência de DNA atrás apresentada ou a que falta a região de ancoragem do extremo carboxilo (aproximadamente aminoácidos 547-623)= De modo semelhante, gpll S gplll do presente invento são substancialmente os mesmos dos divulgados atrás ou em que falta os aminoácidos 699-868 (gpll) e 803-841 (gplll) respectivamente.
derivado imunogénico do invento pode ser um híbrido, gue ê, us poiipeptídeo de fusão contendo sequências adicionais que podem ser portadoras de um ou mais epitopos de outras glicoproteínas do VZV, s.g. gpl-gpll, gpl-gplΙΣ‘ou gpí-gplϊ-gplIϊ outros antigênios doVZV ou outros antigénios que não sejam do VZV» Como alternativa, o derivado iounogénico do invento pode ser fundido com ufa polipeptideo veículo que tenha propriedades isuro-sstisulsdorfis, como no caso de um adjuvante ou que ds outro modo aumente a resposta imune à glieoproteína do VZV ou que ssjaútil na expressão, purificação ou formulação da glieoproteína VZV»
Num outro aspecto, o invento proporciona um processo para a preparação de unta glieoproteína do VZV sen? sncorsgsffl ds acordo com o invento, processo este que se caracteriza pela expressão de uma sequência da DMA codificadora da referida glieoproteína numa célula hospedeira recombinante e recuperação do produto glieoproteína.
processo do invento pode ser realizado por técnicas rscomhinantes convencionais tais como as descritas; em hlaniatis et al» Molecular Cloning - A Laboratory Manuais Cold Spring Harbor, 1982 e DNA Cloning vols I, ΣΙ e III CD» li» Glover ed.? IRL Press Ltd)»
As moléculas de DMA comprendendo tais sequências cidíficadoraspodemser derivadas do mRMA do VZV usando técnicas conhecidas Ce„g» obtenção de DMA complementar ou cDNA a partir de um molde ds mRNA) ou podem ser isoladas a partir ds DNA gsnómico do VZV» Ver Ecker et al.5 Proc Matl Acad Sei__USA 79 s150-160
C19825, Straus et al., Proc Natl Acad Sei USA 79s993-7 C19825, Straus et aí = , d Sen Vi rol 64sí©31-4í C19S3) e Davíson st al» , 3 Sen Virol 6421811-1814 C19835» Como alternativa as moléculas de DMA codificadoras deqpl, gp'£I e gpIII podem ser sintetizadas por técnicas de síntese de DNA convencionais»
invento também proporciona ura processo para a preparação da ssquãncia de DMA pela condensação das unidades de preparação pode ser eTecttsads por síntese quími cu por uma combinação dos dois métodos5 in vx cr o ou m ds? OíM^ pocJs?
preparada pela ligação enzimática dos fragmentos ds DMA adequavivo conforme acequaco,
Lm,
S SSCIlf^nC Λ -5.
oos« por mêroooo convencinnsáís ?&: Robsrts et al« em Biochemstry 198’
Os fragmentos de DNA podem ser obtidos por digestão ds DMA contendo as sequências de nucleotídeos necessárias com as enzimas de restrição adequadas, por síntese química5 por polime—
A digestão com as enzimas de restriçãopode ser efectua— , . . - - O O —
-ís. nufh u-âinp^o câChSQtvscio -s unis ‘c^fiipísrs/turs cis 20 ~·70 u, um volume de 5® μΐ ou menos com pgde DNA,
A polimerização enzimática do DMA pode ser efectuadí vitro usando uma DÍMft-poli me rase í i rsaCiUtef! i
Kisnowj num adequado contendo os trifosfatos de nucleosideo dAíP, dUH, dGTK e dTTP conforme necessário a usa temperatura tíe i®5-'— 37°C» geral— mente num volume oe 5® 1 ou menos, .A ligação enzimática dos fragmentos de DMA pode ser efectuada usando uma DNA-ligase» como seja a DNA-lioase de T4 num tampão adequado s uma temperatura entre 4° e temperatura ambien— cegera 1 mente num volume de b® 1 ou menos.
íincese GLUiTccs da ssauência
DMA· uu seus tos pode ser efectuada por química de fosfotriêster, fosTragmenitOir- OL*.
fosforamidetos, usando técnicas ds fase solida tais como as descritas em «Chemical and Enzymatic Synthesis of Sene Fragmente - a Laboratory Manual» Ced. H=G, Gasssn s A. Lanq>= Verlag Chemie, Weinhsim (1982) ou noutras nuhlicsçSes clentíficas,, por exemplo !*L 3. Sait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B = S» Sproat s R.C. Titmas, Mucleic Aclds Research, 1982, í®s 6243; B«S» Sproat e W. Bannwsrth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771, M.D. Msitsucci e fLH. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980. 21.. 719; M.D. fistteucci e rLH„ Csrutbers, Journal of ths American Chemical Society, 1981. 105, 3185; S.P. Adams et al , , Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J» McMsnnus e H. Koester, Mucleic Acids Research, 1984, 12., 4539; e H.W.D. Matthes et a 1.. * EMBO Journal, 1984, 3, S®1 =
Emprega-se de prefência um sintetizador automático de DNA.
A sequência ds DNA é de preferência preparada por ligação de duas ou mais moléculas de DMA que em conjunto constituem uma sequência codificadora da gliccproteína.
As moléculas de DMA podem ser obtidas por digestão de vectores portadores das sequências necessárias com enzimas de restrição adequadas.
A estructura precisa das moléculas de DNA e o modo como são obtidas depende da estructura do produto glicoprotsína pretendido. 0 protocolo de um-a estratégia adequada: para a construção da molécula de DNA adequada codificadora da glicoprotsina è uma questão de rotina para os familiarizados com a matéria.
A expressão da sequência ds DNA codificadora da glicoproteína sem ancoragem numa célula hospedeira recombinante pode ser efectuada através ds um vector de expressão replicável capaz, numa célula hospedeira, de expressar a sequência de DMA.
i t
vector de expressão replicávei pode ssr preparado de acordo ll® o invento, por clivagens ds um vector compatível com a célula hospedeira para proporcionar um segmento de DNA linear tendo um replicão infecto e combinando o referido segmento linear com uma ou mais moléculas de DMA, as quais juntamente com o referido segmento linear codificam a glicoprotslna sem ancoragem? em condiçSes de ligação
A ligação do segmento linear e mais de uma molécula ds DMA pode ser efectuado simultãneamsnte ou sequenciadafisnís, conforme se desejar»
Assim3 a sequência de DNA pode ser preformada ou formada durante a construção do vector, conforme se pretender»
A escolha do vector serã determinada em parte pelo hospedeiro., α qual pode ser uma célula procariótica, como seja E. coli ou uma célula eucariótica, como seja C127 de ratinho, mieloma de ratinho., HeLa humana, células de ovário de hamster chinês, leveduras ou células tíe insecto» 0 hospedeiro pode também ser um animal transgénico» Vectores adequados incluem plasmídeos, bacteriófagos, ccsaídecs e plasmídeos recombinantes, por exemplo derivados de baculovírus e do vírus da vacina»
A preparação do vector de expressão replicávei pode ser efectuada convencionaImsnte com as encimas adequadas de restrição, polimerização e ligação do DNA, por processos descritos por exemplo em Maniatis et a 1»» referido atrás» Ai polimerização e ligação podem ser efectuadas como descrito atrás para a preparação do polímero de DNA» A digestão com encimas de restrição pode ssr efectuada num tampão adequada a uma temperatura da L©': ' C, geralmente num volume de- 50 piou menos com ©,i-l€> pg de DMA»
A célula hospedeira recombinante é preparada, de acordo com o invento, por transformação de uma célula hospedeira coo um vector de expressão replicável do invento em condiçSes de transformação, As condições ds trsnsformação adequadas são convencionais e estão descritas por exemplo em Maniatis et al,, referido atrás, ou «DNA Cloning» Vol«II, D = M, Glover ed,, IRL Press Ltd, 1985.
A escolha das condiçSes de transformação é determinada pela célula hospedei ra. Assim, um hospedeiro bacterlano como seja. Ε, o o li pode ser tratado com uma solução ds CaCl^ CCohsn et al, Proc, Natl, Acad, Sei,, 1973, 69,511®) ou cora uma solução compreendendo uma mistura de RbCl-,,, MnClo? acetato de potássio e glicrerole depois com ácido S-tN-morfolinoj-propano-sulfónico, RbCl a glicerol, As células de mamífero era cultura podem ser transformadas por coprecipitação do DNA vector com cálcio sobre as células,
A cultura da célula hospedeira transformada em condi— çSes que permitem a expressão da sequência de DNA é efectuada de modo convencional, por exemplo como descrito em Maniatis st al, e «DNA Cloning» referido atrás. Assim, de preferência a célula é cultivada num meio nutritivo e incubada a ume. temperatura inferior a 45°C» produto de expressão glicoprotsina sem ancoragem é recuperado por métodos convencionais de soordes com a célula hospedeira. Assim, sempre que a célula hospedeira seja bacteriana, por exemplo E, coli, ela pode ser lisada por meios físicos, químicos ou encimáticos e o prduto proteico isolado a partir do lisado resultante. Sempre que a célula hospedeira seja de mamífero, o produto pode geralmsnts ser isolado a partir do meio nutritivo.
A sequência ds DNA pode ser montada em vectores destinados ao isolamento de linhas celulares estáveis de mamífero expressando a glicoproteína sem ancoragsms e = g = vectores de vírus do papilooa bovino ou vectores amplificados sm células de ovário de hafijster chinês (DNA Cloning Vol»II D = M = Glover ed = IRL Press 1985? Kaufman, R,J= st al = ,Molecular and Celular Biology 5, 1750-1759, 1985si Pavlakis G = N = s Hamsr, D.H=, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) SO, 397-401, 19832 Sosddel, D„V = et al= Pedido de Patente Europeia N3©©936Í9, 1983) =
Existe uma variedade de células de insectos e ds sistemas de expressão disponíveis para a expressão de proteínas heterólogas» Os hospedeiros insectos tipicamente incluem células de Drosophila e Lepidoptera= Em geral, estes sistemas empregam uma molécula de SNA recombinante compreendendo uma sequência codificadora para o gene com interesse, sob o controle de um elemento regulador e uma marca seleccionável ·. Um elemento regulador S uma região ou regiões de DNA que englobam funçSes necessárias ou desejáveis para a transcrição ou tradução»
As células de insecto que podem ser usadas no invento incluem células Si, S2, 83, KC-Q de Drosophila e células de D» hydei. Consultar por exemplo Schneider et al=, 3 Embryol Exp
Morplb 27s353 C1972) 5 Schultz et al =, Proc Natl,......Acad_.Sc.l__......USA,
183s9428 (1986)5 Sinclair et al = , Mol Cell Biol, 5s3208 (1985)= As células de Droscphiia foram transfectadas por técnicas convencionais, incluindo precipitação com fosfato de cálcio, elsctroporação e transfseção viral= As células foram cultivadas de acordo com processos convencionais ds cultura de tecidos numa variedade de meios nutritivos, incluindo e = g=, meio H3 que consiste sm sais equilibrados s aminoácidos essenciais» Ver, Lindquist st al=, DIS CDrosophila Information Services), 582163 (1982)=
Os promotores que ss conhecem como úteis em Drosophila incluem promotores de células de mamífero assim como promotores ds Drosophila, os últimos sendo os preferidos. São exemplos ds promotores de Drosophila úteis os promotores da metalotioneína de Drosophila, σ promotor da proteina de choque térmico de 7@ kilodaltons <H8P7®> e a LTR de COPIA. Ver por exemplo^ DiNocera st al = 3 Proc Natl Acad Sei USA, S0g 7D95 (1983)= McSarry et al. = Cel1---. 42s903 (198575 õohsnsen et al., Pedido de Patente Europeia M2 88 3®4®93=3 (ΕΡ-Α-Ξ90201)=
Numa realização deste invento, as glicoproteínas do VZV são expressas em células de Lepidoptera para produzir proteínas imunogénicas, Para a expressão das glicoproteínas em células de Lspidoptera é preferido usar um sistema ds expressão de baculovírus. Em tal sistema? uma cassete de expressão compreendendo uma sequência codificadora da proteína do VZv? opsracionalmente ligada (i.e. sob controle) a um promotor de baculovírus,,· tipicamente á colocada num vector vai-vea. Tal vector contem uma quantidade suficiente de DNA bacteriano par-a propagar o vector v-ai-ve-m era E. coli ou noutra hospedeira procariótico -adequada,: Tal vector vai—vem também contem· uma quantidade suficiente de DNA de baculovírus deliraitante da sequência codificadora da glicoproteína do VZV de modo a permitir a a recombinação entre um um baculovírus tipo selvagem e o gene heterólogo, 0 vector recombinante © então cofransfeetado para células de Lepidoptera com um DNA ds baculovírus tipo selvagem. Os hsculovírus recombinantes que surgem ds. recombinação homóloga são então seleccionados e purificados por placas usando técnicas convencionais. Ver Smith et al=? TAE5 Buli (Texas Agricultural Experimental Station Bulletin) NR 1555, Maios 1987.
Os promotores para usar em células de Lepidoptera incluem promotores ds um genoma da baculovírus. έ preferido o promotor do gene da poliedrina pois a proteína de polisdrina é naturalmenfc super-expressa relativamente a outras proteínas dos baculovírus, □ promotor preferido do gene da poliedrina è do baculovírus AcMNPv, Ver, Smith et al=; Proc Natl Acad Sei USA, 82 a 84©4 <1985)? e Cochran, EP-A-228,036=
As células de Lepidoptsra úteis incluem células de lÕShsaiuMâ ni? Spodoptera frugifierda, HeUothis zea, Autoarashica çalifonúca, Bachiplusia or, galíeria melonella, nanduca sexta ou outras células que podem ser infectadas com baculovírus» Estes incluem vírus da políedrose nuclear CNPV), vírus de nucleocápside simples CsNPV) s vírus de nucleocspsides múltiplas CnNPV), Os baculovírus preferidos são baculovírus NPV ou RNPV ooi estes contêm o promotor do gene da poliedrina que é altamente expresso em células infectadas» è particularmente exemplifiçado abaixo o vírus MNPV de fiutoqraghica california CAcMNPV), No entanto, podem também ser empregues outros vírus MHPV s NPV como seja o vírus do bicho da seda, Bsombyx moriAs células ds Lepidoptera são trsnsíectadas com o baculovírus recombinante do invento, segundo técnicas de transfecção convencionais, Estas incluem, mas não estão limitadas a precipitação com fosfato de cálcio, electroporação e transferência mediada por lipossomas» As células são cultivadas segundo técnicas convencionais de cultura ds tecidos numa variedade de meios nutitivos, incluindo por exemplo TC100 CGibco Europes Gardiner et al,, <j_ Ivert Path, 25 g365 <1975) suplentado com 10% de soro fetal de vitela (FCS) e cultivadas entre 27~ e 28^0, entre 18 s 24 horas. Como alternativa, um meio sem soro que suporta o crescimento cie células de insecto foi descrito por Maiors Ila et al» ÍBÃSZl. Technologyη 6.21406-1410 <1988/ ou PCT/WD89/0Í02B), São conseguidos excelentes rendimentos ds produtos codificados por vírus recombinantes através da infecção de culturas em crescimento activo em densidades de 1 a 1,2 xl©a células/ml, Ver Mil ler et ai»., em Setlow e Hollader Ceds» ) , Senetic Enqineerinqg Principies and Nsthods» Vel 8» p277“98? Plenum Publishíng Co.5 New York,, 1986» Murhammer et al =, íBio/Tegi'?!'ioloqv, 6gí4íi-1418 (1988) (eu PCT/W089/@l©29)»
A purificação das glicoproteínas do VZV a partir da cultura celular é efectuada por técncas convencionais ds isolamento de proteínas, e„g« precipitação selectiva, cromatografia de absorção e cromatograf ia de afinidade,, incluindo uma coluna de afinidade com anticorpos monoclonais, com descrito abaixo»
A produção nas células de insecto pode também ser conseguida infectando larvas de insectos» Por exemplo, as glicoqroteínas de VZV podem ser produzidas es? lagartas de Hei.íothis virescens infectando-as com o baculovírus recombinante do invento juntamente com pequenas quantidades de baculovírus tipo selvagem s depois extraindo a proteina a partir da hemolinfa após cerca de dois dias» Ver, por exisplo, Millsr et sl „ , PCT/W088/07032»
Em adição, a produção de proteínas de fusão da poliedri na qus são capazes de formar corpos ds oclusão foram descritas por Frazer st al » » PCT/WDBS/07082,,
Este invento também está relacionado com uma vacina contendo suma quantidade imunoprotectora de glicoproteínaCs) do VZV ds acordo com o invento» □ termo «imunoprotectora» refer-se a uir quantidade suficiente de glicoproteína(s) do VZV, que quando administrada ao homem induz uma resposta protectora com anticorpos ou imune contra uma infecção subsequente pelo VZV suficiente para evitar ou minimiza?1· a doença»
Na vacina do invento pode ser usada uma solução aquosa da glicoproteínaCs) do VZV» Como alternativa, aís)
glicoproteínaís) do VZV com ou sem liofilizaçao prévia5 podem ser misturadas umas oom as outras ou com qualquer um dos vários adjuvantes conhecidos. Tais adjuvantes incluem, mas não estão limitados a hidróxido de alumínio,, muramildipeptídeo e saponinas tais com Quil A, Como exemplo alternativo, a proteína pode ser encapsulada dentro de micropartículas tais como liposscmas, Ainda noutro exemplo alternativo, aís) glicoproteínaís) doVZV podem ser conjugadas com uma macromolécula imuno—estimuladora, como seja Bordetslla morta ou toxóids do tétano,
A preparação de vacinas está descrita de um modo generalizada ss Nsw...Trends,^nd_Develoornent in...Açacc.ines., Vol ler st al, ísds,)s University Park Press, Bsltiíoor®? Baltimore Maylancl, 1978, A encapsulação dentro de lipossomas está descrita por Fullsrton, Patente US 4S235S877, A conjugação de proteínas com macromoíèculss está descrita porexemplo por Llkhitsj Patente US 43372;i954 e Armor et al Patente US 4,474-757, A utilização de Quil A estã descrita por Dalsgaard et al ,5 Acta vet Scand, 18ã349 í1977)„
Os exemplos que se seguem são exemplificativos mas não limitantes do invento. As enzimas de restrição e outros reagentesforam usados substancialmente ds acordo com as instruções dos fornecedores.
Exemplo!,Construção de Vectores
H > ^MJÍjg^-ancj3r^a^»..L...Pla^d^_jÉjIV20.U.
Isolou-se DNA genésico do VZV a partir de um doente com varicela (professor Rentier? Institut de Pathologie? Université ds Liege,, Sart Tilman., Liège? Bslgium), 0 DNA virai foi digerido com BamHI e isolado um fragmento de 4 Kilopares de bases.
correspondendo às bases 114 @42 a 118 @@4 (ver Davison st ah, J Ssn Virol. 67¾1759-1816 (1986)). Este fragmento foi clonado ni sitio BafflHí do plasmideo pUC9, um vector no sitio BamHI do plasmideo pUC9, um vector de clonagem convencional para Ξ. coli, para criar o plasmideo pNIV2@@5.0 plasmideo pNIV2@@5 inclui toda a proteína gpl do VZV de 623 aminoàcidos, incluindo uma sequência sinal putativa, mais DNA 53 e 3S não traduzido.
Um fragmento Esq11 -Bc 11 de 1965 pares de bases do pNlV2@@5 foi tornado cerse com DNA-polimerase I (i.e. Klsnow) e clonado num sitio ds extremos cerses HindiII-BclI ds um vector vai-vem típico, aqui referido como TigiMD. para criar o plasmideo pNXV2@@l.
plasmideo TigND á um derivado do plasmideo TND (Connors et ai., DMA. 7s651-661 (1988))= 0 plasmideo TigND difere do plasmideo TIMD por LTR ds Rous ser substituída pela sequência potenciadora da cadeia pesada gama 2b ds ratinho.
Para remover o DNA 55 não traduzido, pNIV2@@l foi digerido com NspI11, Bql X X e PpumI. Isolou-se dois fragmentos, um fragmento NspIII (extremo cerse) - BqIII de 532 pares de bases (pb) e um fragmento BglII-PpumI de 7 187 pb. Estes fragmentos forsmligados com um fragmento PpumI-HindIII (extremo cerse) ds 741 pb do plasmideo TigND para criar o plasmideo pNIV2@@2. Em pNIV2@®2, o sitio HindIII foi recreado 56 pares de bases a montante do ATG.
A partir do plasmideo pNIV2@©2, construiu-se um plasmídec< contendo a região codificadora ds gpí do VZV sem a sequência terminal carboxilo de ancoragem m-as retendo uma sequência sinal. Este vector foi criado pela ligação de um fragmento Hindi1I-Hqifll de 861 pares de bases (codificador dos aminoàcidos 1 a 268) a um
fragmento HqiaAI-AvalI ds 817 pares ds bases (codificador dos aminoácidos 269 a 541) ambos isolados a partir do pNIVSOôS, a um adaptador sintético 'Aval I-Bell, o qual codifica os aminoácidos 542-546 b um codão ds terminaçãos
5> SACCSSA6GGCTTGCAT <3
3> SCCTCCCGAACGTACTAB <5
Isto foi ligada nos sítios HindiII-BclI do plasmídeo TndHBB para criar o vector piMIV20@4 = (0 plasmídeo TndHBB ê uma modificação do plasmídeo pTND (referido atrás) em que os sítios Notl são introduzidos delimitando a sequência do pUC9„3 Este vector codifica os aminoácidos 1-546 s é delimitado pelos sítios de restrição HindIII no extremo 5’ s Bc 11 no extremo?.5 „ plasmídeo pftcYMl é um vector vai-vem de baculovírus contendo sequências do genoma de AcMNPV que inclui o promotor do gene da políedrina, mas não o gene da poliedrína, e sequências de um plasmídeo bacteriana de elevado número de cópias, pIJCQ» ver Matsuura et al„9 J Sen Virol, 68s1535-50 C1987)»
A partir de pWIV2®@4 isolou-se um fragmento HindiIí-Bc1ΐ de 1695 pb contendo a sequência de gpl sem ancoragem e foi dotado de extremos cerses com DNA-polimerase I» Este fragmento foi então ligado a um sitio BamHI com extremos cerses do plasmídeo pAcYMÍ,, o- qual está imediatamente adjacente a 3S do promotor da poliedrins» Este novo plasmídeo è aqui referido como pNIV2©il» S) ao,1L.ançoragem»„,s„„Ρ1 asaidea_gNIV2ei4.
DMA genómico do VZV (referir ã parte A> foi digerido com a enzima de rsstríção.,EcoRI „ Um fragmento de 15 kilobases, correspondendo ás bases 49 362 a 64 735 (ver Davison et al.;i supra) foi isolado, dotado ds extremos cerses e clonado no sítio HindiI Ido plasmídeo pUC19? um outro vector de clonagem frequentemente usado» Este nova plasmídea, referido como pMIV2®08, codifica a proteína gpll completa do VZV de 868 aminoácidos, a qual inclui uma sequência sinal putativa {aminoácidos 1-9), mais DNA 5’ s 3 não traduzida»
Para se obter um clone sem o DNA não traduzido e sem uma sequência de ancoragem do extremo carboxilo, foram hneosssárias mais duas construções de plasmídeos» A primeira foi para remover o DNA 5’ nao traduzido por ligação de um adaptador sintético Hindi I I-riael I í Co qual codifica os dois primeiros aminoácidos)s
5> AGCTTACCATSTTT <3 3> ATGGTACAAACAATG <5 com um fragmento MasIII-PstI do pNIV2®®8 (codificador dos aminoácidos 3 a 283) e depois ligação deste fragmento nos sítios Hindi1I-PstI de um vector pUC19:·. Este vector, contendo a fracção de aminoácidos de gpll foi referido como clone «A»» Um fragmento HindiII-PstI de 354 pb do clone «A» foi isolado e ligado ao fragmento PstI-SacII de 1235 pb do pNIV20©8 (codificador dos aminoácidos 284 a 694) e um adaptador sintético, o qual codifica os aminoácidos 695-698 e um codão de terminação ou de paragems
5> SSSCCASGCCSTTTAAGTTAACG 3<
3> CGCCCGGTCCGGCAAATTCAATTGCTTAA 5<
Estes fragmentos foram então ligados nos sítios HindiII -EcoRI de pUC19 para criar o clone «C» CpNIV2©39)= Este vector codifica os aminoácidos 1-69S de gpll Ci=e=incluindo a sequência *s sinal s sem a sequência ds ancoragsrale é delimitado pelos sítios ds restrição HindiII no extremo 55 HindiI no extremo 35=
Um fragmento Hindi I I-Hindi1 de 2Í@S pb contendo a sequência de gpll «sem ancoragem» foi isolado a partir do clone «C» e dotado de extremos cerses com DMA- pol ime rase I <í»e,· Klenow)» Este fragmento foi então ligado num sitio BamHI csrse do plssffiídeo pAcYMí, o qual está imedíatamente 3? relativamente so promotor da poliedrina» Neste plasmídso, referido como pNIV2©14, o A do ATS sstá situado 9 bases a jusante da junção ds ligação»
O dpiII «sem, ancoragem»; Plasmídso gNIV2©12
Um fragmento EcoRI de 12,9 Kpb (ver parte B) correspondendo às bases 64 735 a 77 656 (ver Davison et al =, supra) foi isolado e ligado no sítio EcoRI do pUC9 = Esta plasmídso resultante, pNIV2®07, codifica a proteína gplII completa do VZVde 84i asninoácidos, sequência sinal inclusive (a sequência sinal foi deduzida pela sua hidroíohicidade), mais o DiMA do VZV não traduzido»
Para facilitar posteriores construções, um fragmento HIuI ds 44©© pb foi dotado de extremos cerses s ligado a um sitio de restrição HindIII de extremos cerses do plasmítieo pUC19» Este plasmídso é daqui em diante referido como pNIV2oo3»
A partir de pNIV2©@3 construiu-se um plasmídso contendo a região codificadora de gpílí do VZV a qual não possui a sequência de ancoragem do extremo carboxilo mas contem a sequência sinal» Quatro fragmentos foram ligados ao sítio HindIII-Bcl1 do plasmideo TndHBB (referido atrás)» Eles comprendem um fragmento ds DMA sintático HindIII-AvaII que codifica os aminoácidos 1-13?
5>AGCTTACCAT6TTTSCBCTASTTTTASCBGTBSTAATTCTTCCTCTTTS <3 3> ATBBTACAAACBCBATCAAAATCBCCACCATTAABAABBASAAACCTB <5 um fragmento AvalI-AatII de 231 pb< dopWIV2®03 (codificador dos -aminoácidos 14 a 91), um fragmento AatII-Asul I de 2103 do pNIV2©®3 (codificador dos aminoácidos 92 a 792) s um fragmento sintético AsulI-BclI que codifica os aminoácidos 793-802 mais (Am codão de terminação§
5> CBAACSACBACAABCCATACBAATSTCSBBATBATCTABAT <3
3> TTGCTSCTGTTCGSTATSCTTACASCCCTACTASATCTAGTAB <3
Este vector resultante codifica os aminoácidos í-802 e é delimitado pelos sítios de restrição Hindi 11 no extremo 5? e Xbal no extrema 3? =
Um fragmento HindiII-Xbal de 2422 ob contendo a sequência de gpIII «sem ancoragem» foi dotado de extremos cerse com DWA-polimsrase I íi„es Klenon) e isolado, Este fragmento foi então ligado ao sítio BamHI com extremos cerses do plasmídeo pAc¥Mls o qual está imediatamente 35 relativamente ao promotor da poliedrina5 para criar o plasmídeo pNIV20í2,
Exsnsplo 2
Expressão em Células Infectadas
As células de Spodoptera......_frugi.serda 9 <Sf9) foram adequiridas à ATCC íRocRville,· MD,, USA), As células SÍ9 foram cotransfectadas com um dos seguintes vectores recombinantes^ plasmídeo pNlV2@íí? pNIV2©14 ou pNIV2®12 e com DNA de AcMNPV tipo selvagem.! a 5Θ ug e 1 ug respectivamente?, substancial mente como » '. * ússcrito por Sáummers referido atrás»
al „, Tfibi? Buli, WR í bO5, Maio 1987 lartículas de vírus resultantes
Tnr^f jb tidascolhendo os- sobren-adant.es-» 0 meio contenda a virus- foi usado para infectar células- Sf‘? num ensaio de placas» -Subsequente infecção de células Sf9 com um baculovirus recombinante purificado por placas resultou sm células expressando as glicoproteínas. do VZV em vez da proteína oolisdrina» derivadas de pNIV201Í secretaram e expressaram uma proteína opl5 sem uma sequência de -ancoragem do extremo carboxilo. A análise de transferências Western feita com anti—soro policlonal de coelho induzido contra partículas completas- de VZV mostrou essencialmen— te ut«a aproximadamente 6® kilodaltons,
As- células infectadas- com báculo-vírus recombinante derivadas de pNlV2014 expressam uma proteina gpll, sem a sequência de ancoragem do extremo carboxilo. A análise de transferências Western feitas como para gpl mostrou sssencialraente duas bandas de aproximadamente 6-3 ε >55 Kilodaltons·.
Exemplo 3
Expr ’o de qpil em células l-HO
Cyns-trucão do plasmideo píMIV'2034
| Um f r ag ssen to | HindIII (cerse· | i—Hindi I | de 2108 | pb contendo | ||
| a | sequênci | a gpll «sem | ancoragem» foi i | Isolado a | partir | de pWíV2039 |
| e | introduz | ido entre H | intí III ( ) | e EcoRV | d ri pl í“ — | asm i deo TON |
| \ J | referido | atrás) para | Líe&f U U i <2í’3-sTs 2. ú | oíMrv2®3â |
2> §ê3£Ç£iS_Jos_çlmes_lML^íJâí^Ss^^
As células CHO DHFR foram electroporadas coo pMIV2®34« As células transformadas foram selsccionadas com base na sua resistência ao antibiótico G4ÍS= 0 meio de cultura metabolizado assim como os extractos celulares de aproximadamente 10® clones para cada construção foram testados quanto à presença de gpll » Os clones mais promissores foram submetidos à amplificação com metotrexato SnM» Cerca de 24 clones para cada construção foram novamente testados»
Exemplo 4
Vacinas Contendo Slicoproteínas do VZV
Uma vacina exemplificativa deste invento é prepada como se segue. As glicoproteínas recombinantes do VZV deste invento, como sejam glicoproteínas derivadas ds insectos, são adicionadas coo: agitação para uma concentração final de ®,1 a 1©®® pg/ml de polipeptídeo, de preferência 1 a i©0 yg/ml, numa solução salina tamponada (15® mM NaCl, fosfato de sódio 1® mM pH 6,8? esterilizada por filtração) contendo ®,5 mg Al’-1* (como gel de hidróxido de alumínio) por ei. 0 pH foi mantido a pH 6;, 8 s a mistura foi deixado durante a noite a cerca de ®„®©©5%» O pH foi testado e ajustado, se necessário, a pH 6,8»
A quantidade de glicoprotsína do VZV derivada de insectos presente em cada; vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem indução ds efeitos secundários adversos. Tal quantidade variará dependendo do polipsptídeo específico empregue e se a proteína tem ou não •adjuvante» Pode-se determinar uma quantidade óptima 'para uma vacina particular por estudos convencionais envolvendo observação •> ♦
dos títulos ds anticorpos e outras rsspostas em indivíduos» Após uma vacinação inicial? os indivíduos recebem doses de memória com os intervalos necessários para aumentar e manter uraa resposta imune profcectora»
A vacina é ds preferencia administrada parenteralmente? e»g» intrsniuscularmente íim) ou subcutâneamente ísc>? se bem que outras vias ds administração possam ssr usadas para induzir uma resposta protectora»
A descrição e os exemplos atrás descrevem na totalidade o invento e as suas realizações preferidas» 0 invento não está limitado âs realizações especificamente descritas? mas antes inclui todas as suas variações e modificações qus estejam dentro do Smbito das reivindicações que ss seguem»
Claims (9)
- lê. ~ Processo para a preparação de uma proteína das glicóprotsínas do Vírus da Varicsla-Zoster consistindo so gpl sem região ds ancoragem, gpll sem região de ancoragem ou gpIII ssa região ds ancoragem, caracterizado por se efectuar a expressão de uma sequência de DNA codificadora da referida proteína numa célula hospedeira recombinante e a recuperação do produto proteico.
- 2ê= - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por faltar na proteína entre 4 e 2© por cento dos; resíduos ds aminoácidos totais da glicoprotsina de tamanho completo no extremo carboxilo terminal.
- 3a. - Processo ds acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por ss preparar uma proteína seleccionada entre gpí 1-546, αρίϊ 1-698 e gpIII 1-802.
- 4ã. - Processo de acordo com qualquer uma das reívintíi-caçSes 1 a 3, caracterizado por se produzir proteína em células de ovário de hamster chinês.be<» - rrocesso para a preparação de uma glicoprotsina de VZV produzida em células recombinantes de insecto, caracterizado por se efectuar a expressão de uma sequência de DNA que codifica a referida proteína numa célula de insecto e a recuperação do produto proteico.
- 6s. - Processo de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por se preparar uma glicoprotsína de VZV que é gpí, gpll ou gpíII.* A t
- 7ã« - Processo de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por se preparar uma glicoprotsína de VZV que não possui a sequência de ancoragem do extremo carboxilo»
- 8ã« - Processo de acordo co© a Reivindicação 7, caracterizado por se preparar uma glicoproteína de VZV seleccionada entre gpl 1-546, gpll 1-698 e gpIII í-802»
- 9s» - Processo de acordo co© com qualquer uma das Reivindicações 5 a 8, caracterisado por se preparar proteína numa célula de Lepidoptera ou numa célula de Drosophila»
- 10ê= - Processo para a preparação de uma vacina para a protecção de humanos contra a varicela e zoster, caracterizado por compreender a mistura tíe uma quantidade imunoprotectora da proteína definida em qualquer uma das Reivindicações 1 a 8, com um veículo farmaceuticamente aceitável»
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