KR20230082653A - 로타바이러스에 대한 백신 접종에 유용한 융합 단백질 - Google Patents

로타바이러스에 대한 백신 접종에 유용한 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후를 감소시키기 위한 백신 제조에 유용한 재조합적으로 구축된 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편 및 (ii) 면역글로불린 Fc 단편, 예컨대 IgG Fc 단편을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 여기서 상기 융합 단백질은 돼지에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키는 방법에 사용가능하다.

Description

로타바이러스에 대한 백신 접종에 유용한 융합 단백질
본 발명은 특히 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후를 감소시키기 위한 백신 제조에 유용한 재조합적으로 구축된 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 N-말단에서 C-말단 방향으로 (i) 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편 및 (ii) 면역글로불린 Fc 단편, 예컨대 IgG Fc 단편을 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로서, 상기 융합 단백질은 돼지(swine)에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키는 방법에 사용가능하다.
로타바이러스(Rotavirus)는 레오바이러스과(Reoviridae)에 속하는 속을 포함하는 이중 가닥 RNA 바이러스다. 로타바이러스 감염은 위장관 질환을 일으키는 것으로 알려져 있으며 영유아 위장염의 가장 흔한 원인으로 꼽힌다. 로타바이러스는 분변-구강 경로를 통해 전파되며 소장 내벽 세포를 감염시킨다. 감염된 세포는 위장염을 유발하는 장독소를 생성하여 심각한 설사를 일으키고 때로는 탈수를 통해 사망에 이르게 한다.
바이러스 분류에 관한 국제 위원회(International Commitee on Taxonomy of Viruses, ICTV)에 의해 정의되고 Matthijnssens 등 (Arch Virol 157:1177-1182 (2012))에 의해 요약된 바에 따라, 로타바이러스는 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 11개 세그먼트로 구성된 게놈을 보유하고 있으며 항원 특성 및 내부 바이러스 캡시드 단백질 6(VP6)의 서열 기반 분류에 따라 현재 8개 그룹(A-H)으로 분류되고, 여기서 언급된 이 공개물 및 이후 공개물은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
로타바이러스의 게놈은 6개의 구조 단백질(VP1-VP4, VP6 및 VP7)과 6개의 비구조 단백질(NSP1-NSP6)을 암호화하며, 게놈 세그먼트 1 내지 10은 각각 하나의 로타바이러스 단백질을 암호화하고, 게놈 세그먼트 11은 두 개의 단백질(NSP5 및 NSP6)을 암호화한다.
로타바이러스 A와 관련하여, 다른 변종은 구조 단백질 VP7 및 VP4를 기반으로 유전자형(비교 서열 분석 및/또는 핵산 혼성화 데이터에 의해 정의됨) 또는 혈청형(혈청학적 분석에 의해 정의됨)으로 분류될 수 있다. VP7과 VP4는 가장 바깥쪽 단백질 층(외부 캡시드)의 구성 요소이며, 둘 다 중화 에피토프를 가지고 있다. VP7은 비리온(virion)의 외층 또는 표면을 형성하는 당단백질(따라서 "G"로 표시됨)이다. VP7은 균주의 G 유형을 결정하고 G 혈청형 및 G 유전자형에 대한 표시는 동일하다. VP4는 프로테아제 민감성(따라서 "P"로 표시됨)이며 바이러스의 P 유형을 결정한다. G 유형과 달리, P 혈청형 및 유전자형에 할당된 번호는 다르다 (Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56). 따라서, P 혈청형은 P로 표시 후 할당 번호가 표시되고, P 유전자형은 P 표시 후 괄호 안에 할당 번호가 표시된다 (예: "P[7]" 또는 "P[13]"). 동일한 유전자형에 속하는 균주는 89% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다 (Estes and Kapikian. Rotaviruses. In: Knipe, DM; Howley, PM Fields Virology, 5th ed.; Wolters Kluwer/ Lippincott Williams & Wilkins Health: Philadelphia, PA, USA (2007); Gorzigliaet al. Proc Natl Acad Sci USA. 87(18):7155-9(1990)).
로타바이러스는 특히 돼지의 거의 100%에 존재하는 그룹 A 및 C 로타바이러스에 대한 항체를 갖는 돼지의 위장염의 주요 원인이기도 하다 (Vlasova et al. Viruses. 9(3):48(2017)). 현재 로타바이러스 A에 대하여 변형된 생백신 또는 사백신만 사용할 수 있다. 실험실에서 로타바이러스 C를 배양할 수 없기 때문에 이 그룹에 대한 백신 개발에 어려움을 겪어 왔으며, 이는 재조합 백신의 매력에 더해졌다.
재조합 항로타바이러스 백신의 생성은 3개의 층으로 배열된 4개의 단백질로 구성된 로타바이러스 캡시드의 복잡성으로 인해 방해를 받는다. 가장 안쪽 층은 T=1 대칭을 갖는 60개의 VP2 이량체로 구성된다. VP2 층은 T=13 대칭인 260개의 VP6 삼량체에 의해 형성되는 중간 층의 적절한 순서를 위해 필요하다. VP2와 VP6 사이의 결과적인 대칭 불일치는 5개의 뚜렷한 VP6 삼량체 위치와 3개의 뚜렷한 공극 유형을 생성한다. VP2가 없는 경우, VP6은 바이러스 어셈블리의 부산물을 나타낼 수 있는 염 및 pH 의존적 방식으로 정렬된 고분자량 미세소관 및 회전 타원체를 쉽게 형성한다. 캡시드에서 VP6 층은 VP4 스파이크를 제자리에 고정하는 클램프 역할을 하는 VP7의 260개의 Ca2+-의존 삼량체에 의해 커버된다. VP7은 글리코실화된 항원 또는 G형 항원이며 중화 에피토프를 포함한다. 대부분의 중화 항체는 삼량체 VP7만 인식하고 VP7 삼량체의 해리를 방지하여 스파이크의 방출을 차단하는 역할을 하는 것으로 생각된다. 로타바이러스 스파이크는 공극 유형 II에서만 VP6 층에 삽입되는 60개의 VP4의 삼량체로 존재한다. VP4는 중화 에피토프를 포함하고 트립신에 의해 스파이크 염기 VP5* 및 세포 상호작용 헤드 VP8*로 절단되는 P형 항원이며, 절단 후 VP5*와 관련된 상태로 유지된다. 트립신처리는, 스파이크가 숙주 세포에 수용체 결합을 위한 활성 부위를 노출시키기 위해 심오한 구조적 재배열을 겪는 동안, 세포 진입을 위한 스파이크를 프라이밍한다. 상기 어셈블리 과정의 복잡성을 무시하고, 적절한 어셈블리를 촉진하기 위한 환경 조건을 갖는 로타바이러스 캡시드 단백질의 화학양론적 발현은 달성하기 어렵다.
로타바이러스 캡시드 어셈블리의 어려움에 비추어 서브유닛 백신 접근법에 대한 관심이 있었다. VP7 및 VP4는 중화 에피토프를 포함하는 두 단백질이지만 VP7의 사용은 그의 글리코실화 및 칼슘 의존 삼량체화로 인해 복잡하다. VP4의 사용은 삼량체화, 트립신화 및 잠재적 형태 상태의 범위로 인해 복잡하다. 중화 에피토프를 함유하는 VP4의 트립신화에 의해 생산되는 VP8 도메인 또는 VP8*으로도 명명된 VP8 단백질은 단량체이며, 고해상도로 결정된 구조를 가지며 (Dormitzer et al. EMBO J. 21(5): 885-897 (2002)) 매우 안정적이라고 기재되어 있다.
또한, VP8 단백질 내에서, 숙주 수용체와 상호 작용하고 바이러스가 숙주 세포에 부착하는데 관여하는 것으로 간주되는 것은 렉틴 유사 도메인(aa65-224)이다 (Rodriguez et al., PloS Pathog 10(5):e1004157 (2014)).
어린이를 위한 로타바이러스 서브유닛 백신을 개발하기 위한 접근법이 기재되었으며, 여기서 파상풍 톡소이드 범용 CD4+ T 세포 에피토프(aa830-844) P2에 N-말단이 연결된 절단된 VP8 단백질 (VP8*의 아미노산 잔기 64(또는 65)-223)은 대장균(Escherichia coli)에서 생산되었고 (Wen et al. Vaccine. 32(35):4420-7 (2014)), 영유아에서 테스트되었다 (Groome et al. Lancet Infect Dis.17(8):843- 853(2017)). 그러나, 이러한 (로타바이러스 유전자형 P[8]의 절단된 VP8 단백질에 기초하는) 1가 서브유닛 백신의 사용은 이형 로타바이러스 균주에 대해 불량한 반응을 이끌어냈고, 또한 3가 백신 제형 (유전자형 P[4], P[6], P[8] 항원을 조합하기 위한 3개의 단백질로 구성됨)이 최근에 테스트되었다 (Groome et al. Lancet Infect Dis. S1473-3099(20)30001 (2020)).
또 다른 접근법에서, N-말단 절단된 VP8 단백질인 "VP8-1"(aa26-241)은 콜레라 독소의 펜타머화 비독성 B 서브유닛(CTB)과 N-말단 또는 C-말단 융합되었다. 생성된 펜타머 융합 단백질(CTB-VP8-1, VP8-1-CTB) 중에서 CTB-VP8-1(즉, VP8-1 N-말단이 CTB에 융합됨)만이 추가 개발을 위한 실행 가능한 후보로 간주되었고, VP8-1-CTB에 비해, 그것은 마우스 모델에서 GM1 또는 VP8*에 특이적인 형태 민감성 중화 단일클론 항체에 더 높은 결합 활성을 보였고, 더 높은 역가의 중화 항체를 도출하고 더 높은 보호 효능을 부여했다 (Xue et al. Hum Vaccin Immunother 12(11) 2959-2968 (2016)).
그러나, 로타바이러스 캡시드 어셈블리의 어려움에 비추어, 특히 서브유닛 백신이 일반적으로 매우 안전한 것으로 간주되기 때문에 대안적인 서브유닛 백신 접근법에 대한 관심이 있다. 또한 배양이 어려운 로타바이러스의 백신 항원을 간단하게 생산할 수 있는 효과적인 로타바이러스 서브유닛 항원의 재조합 발현이 절실히 요구된다. 또한, 로타바이러스는 돼지 위장염의 주요 원인이기 때문에 특히 현재 시판되고 있는 돼지용 MLV 로타바이러스 백신과 대등하거나 더 효율적인 항원을 포함하는 돼지용 서브유닛 백신의 필요성이 절실하다.
상기 기술적 문제에 대한 해결책은 청구범위에서 특징지어지는 설명 및 구현예에 의해 달성된다.
따라서, 본 발명은 그 상이한 측면들에서 청구범위에 따라 구현된다.
본 발명은 로타바이러스 VP8 단백질의 단편, 즉 C-말단에서 IgG Fc 단편과 연결된 N-말단 연장된 렉틴-유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 암퇘지에게로의 투여가 중화 항체의 수동 전달을 통해 로타바이러스 감염 후 자손의 설사 및 분변 배출을 감소시킨다는 놀라운 발견에 기반한다.
제1 측면에 있어서, 따라서 본 발명은
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 및
- 면역글로불린 Fc 단편을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이며,
여기서 상기 폴리펩티드는 이하에서 "본 발명의 폴리펩티드"라고도 한다.
본 발명의 맥락에서, 이러한 폴리펩티드가 세포에서 생성될 때 세포로부터 방출된 다음 세포 자체로부터가 아니라 세포를 둘러싼 상청액으로부터 회수될 수 있다는 것이 또한 예기치 않게 발견되었다.
본 발명의 폴리펩티드의 또 다른 이점은, 원한다면, 2개의 상이한 로타바이러스의 면역원성 단편을 포함/제시하는 하나의 폴리펩티드로 제조될 수 있고, 이에 따라 같은 목적을 위해 결합될 필요가 있는 2개의 상이한 1가 폴리펩티드를 별도로 제조할 필요가 없다는 점이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같이, 상기 면역글로불린 Fc 단편은
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단, 또는
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단에 연결된다.
특히, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 바람직하게는
- 링커 모이어티를 통해 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단, 또는
- 링커 모이어티를 통해 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단에 연결된다.
또 다른 바람직한 측면에서, 본원에 기재된 바와 같이, 상기 면역글로불린 Fc 단편은
- 상기 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통한 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단, 또는
- 상기 면역 글로불린 Fc 단편의 C-말단 아미노산 잔기와 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단에 연결된다.
가장 바람직하게는, 본원에 기재된 바와 같이, 면역글로불린 Fc 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결된다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 특히 하기를 포함하는 폴리펩티드이다.
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 및
- 면역글로불린 Fc 단편,
여기서 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결된다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 특히 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 임의의 사슬을 지칭하며, 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 예를 들어, "폴리펩티드"는 아미노산 잔기의 장쇄, 예컨대 150개 내지 600개 이상의 아미노산 잔기 길이를 지칭할 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 하나 이상의 번역 후 변형을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 번역 후 변형은, 예컨대 글리코실화, 인산화, 지질화 (예를 들어, 미리스토일화 등), 아세틸화, 편재화, 황산화, ADP 리보실화, 하이드록실화, Cys/Met 산화, 카르복실화, 메틸화 등을 포함한다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 발명의 맥락에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "면역원성 단편"은 특히 그것이 유래된 단백질의 면역원성을 적어도 부분적으로 보유하는 단백질의 단편을 지칭하는 것으로 이해된다. 따라서, "로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편"은 특히 전장 VP8 단백질의 면역원성을 적어도 부분적으로 보유하는 로타바이러스 VP8 단백질의 단편을 지칭하는 것으로 이해된다.
용어 "VP8 단백질"은, 본원에 기재된 바와 같이, 특히 로타바이러스와 관련하여 자주 사용되는 "VP8 도메인", "VP8*" 또는 "VP4의 VP8 단편"과 동등한 것으로 이해된다.
용어 "면역글로불린 Fc 단편"은, 본원에 사용된 바와 같이, 면역글로불린의 중쇄불변영역 2(CH2)와 중쇄불변영역 3(CH3)을 포함하는 단백질을 의미하며, 특히 중쇄 및 경쇄의 가변 영역과 면역글로불린의 경쇄 불변 영역 1(CL1)을 포함하지 않음을 의미한다. 이는 면역글로불린의 힌지 영역 또는 그 힌지 영역의 일부(즉, 중쇄 불변 영역의 힌지 영역)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 중쇄불변영역 1(CH1)의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 Fc 단편"은 "면역글로불린 Fc 도메인"과 동등한 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 "연결된(linked to)"이라는 용어는 특히 폴리펩티드 내에서 면역글로불린 Fc 단편을 로타바이러스 VP 단백질의 면역원성 단편의 C-말단 또는 N-말단에 연결하기 위한 임의의 수단을 지칭한다. 연결 수단의 예는 (1.) 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 직접 연결되고, 상기 면역글로불린 Fc 단편과도 결합하는 개재 모이어티에 의한 면역글로불린 Fc 단편의 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단과의 간접적 연결, 및 (2.) 공유 결합에 의해 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 대한 면역글로불린 Fc 단편의 직접 연결을 포함한다. 상기 용어 "연결된(linked to)" 및 "연결된(linked with)"은 본 발명의 맥락에서 상호교환적으로 사용된다.
특히 "폴리펩티드는
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 및
- 면역글로불린 Fc 단편을 포함하고,
여기서 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결된다"라는 문구는
본원에 사용된 바와 같이, 특히
"폴리펩티드는 N- 에서 C-말단 방향으로,
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 아미노산 서열, 및
- 면역글로불린 Fc 단편의 아미노산 서열을 포함한다"라는 문구,
또는 "폴리펩티드는
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 및
- 상기 면역원성 단편의 C-말단에 연결된 면역글로불린 Fc 단편을 포함한다"라는 문구와 동등하다.
가장 바람직한 측면에 따르면, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 링커 모이어티를 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결된다.
본 발명의 맥락에서 본원에 기재된 상기 링커 모이어티는 바람직하게는 펩티드 링커이다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드 링커"는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 의미한다. 보다 구체적으로, 본원에서 사용되는 용어 "펩티드 링커"는 2개의 가변 단백질 및/또는 도메인, 예를 들어, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편 및 면역글로불린 Fc 단편을 연결할 수 있는 펩티드를 지칭한다.
특히 바람직한 측면에서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 링커 모이어티를 통해 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 면역원성 단편의 C-말단에 연결되며, 여기서
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 링커 모이어티의 N-말단 아미노산 잔기와 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 링커 모이어티에 연결되고,
- 상기 링커 모이어티는 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 링커 모이어티의 C-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 면역글로불린 Fc 단편에 연결된다.
또한, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단백질의 C-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편에 연결되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 특히 융합 단백질이라는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "융합 단백질"은 동일하지 않은 2개 이상의 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 융합(즉, 결합)함으로써 형성된 단백질을 의미한다. 전형적으로, 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 사용하여 2개 이상의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 종단 간(end to end) 결합에 의해 제조된다. 보다 구체적으로, "융합 단백질"이라는 용어는 따라서 제1 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열과 제2 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 제2 핵산을 조합함으로써 생성된 핵산 전사체로부터 번역된 단백질을 지칭하며, 여기서 융합 단백질은 자연적으로 발생하는 단백질이 아니다. 핵산 작제물은 융합 단백질에서 결합된 둘 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
또 다른 바람직한 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드, 특히 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드를 제공하며, 상기 폴리펩티드는 화학식 x-y-z의 융합 단백질이고, 여기서
x는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편으로 이루어지거나 그를 포함하고;
y는 링커 모이어티이고;
z는 면역글로불린 Fc 단편이다.
화학식 x-y-z는, 특히 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 면역원성 단편의 C-말단 아미노산 잔기가 바람직하게는 상기 링커 모이어티의 N-말단 아미노산 잔기와의 펩티드 결합을 통해 상기 링커 모이어티와 연결되고, 상기 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 아미노산 잔기는 바람직하게는 상기 링커 모이어티의 C-말단 아미노산 잔기와 펩티드 결합을 통해 상기 링커 모이어티와 연결된다는 것을 이해해야 한다.
본원에 기재된 바와 같이 "x는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진다"라는 문구는 특히 "x는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편이다"와 동등한 것으로 이해된다.
바람직한 측면에서, 본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편이 투여된 대상체에서 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다.
또 다른 바람직한 측면에서, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 길이가 50개 내지 200개, 바람직하게는 140개 내지 190개의 아미노산 잔기인 폴리펩티드이다.
본원에 언급된 로타바이러스는 바람직하게는 로타바이러스 A 및 로타바이러스 C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편 및 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
여기에 언급된 바와 같이, 각각의 "로타바이러스 A" 및 "로타바이러스 C"라는 용어는 각각 ICTV에서 정의된 바와 같이 로타바이러스 A 및 로타바이러스 C와 관련된다 (Mattijnssens et al. Arch Virol 157: 1177-1182 (2012)에 의해 요약됨).
다른 바람직한 측면에 따르면, 본원에 언급된 로타바이러스는 돼지(porcine) 로타바이러스이다.
특히 바람직한 일 측면에서, 본원에 언급된 로타바이러스는 로타바이러스 A이다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편이다.
추가의 바람직한 측면에서, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴 유사 도메인을 포함한다. 본원에 언급된 바와 같이, "로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴-유사 도메인"은 바람직하게는 로타바이러스 A VP8 단백질의 렉틴-유사 도메인인 것으로 이해된다.
상기 용어 "로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴-유사 도메인"은 특히 로타바이러스 VP8 단백질의 잔기 65-224를 지칭하거나, 또는 각각 로타바이러스 VP8 단백질의 아미노산 잔기 65-224로 이루어진 아미노산 서열에 해당하고, 여기서 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 아미노산 잔기 65-224는 바람직하게는 로타바이러스 A VP8 단백질의 아미노산 잔기 65-224이다.
따라서, "로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴-유사 도메인"은 바람직하게는 로타바이러스 VP8 단백질, 특히 로타바이러스 A VP8 단백질의 아미노산 잔기 65-224의 아미노산 서열로 이루어진다.
바람직하게는, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 N-말단 연장된 렉틴-유사 도메인이고, 상기 N-말단 연장은 길이가 1개 내지 20개의 아미노산 잔기, 특히 5개 내지 15개의 아미노산 잔기이다. 가장 바람직하게는, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 N-말단 연장된 렉틴-유사 도메인이며, 여기서 N-말단 연장은 길이가 8개인 아미노산 잔기이다.
상기 N-말단 연장의 아미노산 서열은 바람직하게는 로타바이러스 VP8 단백질의 아미노산 서열에서 렉틴-유사 도메인의 N-말단 아미노산 잔기 측면에 있는 각각의 길이의 아미노산 서열이다.
따라서, 특정 측면에서, 본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는 로타바이러스 VP8 단백질, 특히 로타바이러스 A 단백질의 아미노산 잔기 60-224, 아미노산 잔기 59-224, 아미노산 잔기 58-224, 아미노산 잔기 57-224, 아미노산 잔기 56-224, 아미노 아미노산 잔기 55-224, 아미노산 잔기 54-224, 아미노산 잔기 53-224, 아미노산 잔기 52-224, 아미노산 잔기 51-224, 아미노산 잔기 50-224, 또는 아미노 잔기 49-224의 아미노산 서열로 이루어진다.
가장 바람직하게는, 본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질, 특히 로타바이러스 A 단백질의 아미노산 잔기 57-224의 아미노산 서열로 이루어진다.
아미노산 잔기의 상기 넘버링(예를 들어 "65-224" 또는 "57-224")은 바람직하게는 야생형 로타바이러스 VP8 단백질, 특히 야생형 로타바이러스 A VP8 단백질의 아미노산 서열을 참조한다. 상기 야생형 로타바이러스 VP8 단백질은 바람직하게는 SEQ ID NO:1에 제시된 단백질이다.
추가의 바람직한 측면에 따르면, 본원에 언급된 로타바이러스는 로타바이러스, 특히 유전자형 P[6] 로타바이러스, 유전자형 P[7] 로타바이러스 및 유전자형 P[13] 로타바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 로타바이러스 A이다. 따라서, 본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는 유전자형 P[6] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편 및 유전자형 P[13] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 유전자형 P[6] 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편, 유전자형 P[7] 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편 및 유전자형 P[13] 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "유전자형 P[6] 로타바이러스", "유전자형 P[7] 로타바이러스", "유전자형 P[13] 로타바이러스" 및 "유전자형 P[23] 로타바이러스"는 특히 로타바이러스의 확립된 VP4(P) 유전자형 분류 (예를 들어, P[6], P[7], P[13] 또는 P[23])에 관한 것이고, 이는 문헌 [Estes and Kapikian. Rotaviruses. In: Knipe, D.M.; Howley, P.M.　Fields Virology, 5th ed.;　Wolters Kluwer/Lippincott Williams　&　Wilkins Health:　Philadelphia,　PA,　USA (2007); Gorziglia et al. Proc Natl Acad Sci U S A.　87(18):7155-9 (1990)]에 기재되어 있다.
가장 바람직하게는, 본원에 언급된 로타바이러스는 유전자형 P[7] 로타바이러스이다. 따라서, 본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 가장 바람직하게는 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 유전자형 P[7] 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편이다.
본원에 언급된 로타바이러스 VP8 단백질은 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:1의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴-유사 도메인은 바람직하게는 SEQ ID NO:2의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
일 예에서, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:3의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
또 다른 바람직한 측면에서, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 일부, 특히 로타바이러스 A VP8 단백질의 일부의 공통 서열로 이루어지거나 또는 그 공통 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공통 서열(consensus sequence)"은 특히 관련 서열 패밀리에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산(또는 뉴클레오티드)으로부터 형성된 서열을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)] 참조). 단백질 패밀리에서, 공통 서열의 각 위치는 패밀리의 해당 위치에서 가장 자주 발생하는 아미노산이 차지한다. 따라서 용어 "공통 서열"은 추론된 아미노산 서열(또는 뉴클레오티드 서열)을 의미한다. 공통 서열은 다수의 유사한 서열을 나타낸다. 공통 서열의 각 위치는 3개 이상의 서열을 정렬하여 결정되는 해당 위치에서 가장 빈번하게 발생하는 아미노산 잔기(또는 뉴클레오티드 염기)에 해당한다.
바람직하게는, 본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질 일부의 공통 서열은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다:
- 로타바이러스 VP8 단백질의 일부를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 아미노산 서열로 번역하는 단계,
- 바람직하게는 MUSCLE 서열 정렬 소프트웨어 UPGMB 클러스터링 및 디폴트 갭 페널티 파라미터를 사용하여 상기 아미노산 서열을 공지된 로타바이러스 VP8 단백질에 정렬하는 단계,
- 상기 정렬된 서열을 계통발생학적 분석에 적용하고 로타바이러스 VP8 단백질 서열에 기초하여 이웃 결합 계통발생 재구성을 생성하는 단계로서, 특히 계통 발생학적 분석을 위해 상기 정렬된 아미노산 서열을 MEGA7 소프트웨어로 가져오고 로타바이러스 VP8 단백질 서열에 기초하여 이웃 결합 계통발생 재구성을 생성하는 단계,
- 계통 발생의 부트스트랩 테스트(n=100)와 함께 푸아송 보정 방법을 사용하여 최적의 트리를 드로잉하는 단계,
- 부트스트랩 클러스터 연결이 70% 이상인 노드를 유의미한 것으로 간주하는 단계,
- 약 10%의 거리와 70%보다 큰 부트스트랩 클러스터 연결을 갖는 노드를 클러스터로 지정하는 단계,
- 클러스터를 선택하고 상기 클러스터 내에서 정렬된 위치당 최대 빈도를 식별하여 공통 서열을 생성하는 단계,
- 및 선택적으로, 동일한 비율의 아미노산이 정렬된 위치에서 관찰되는 경우, 미리 정의된 생성물 보호 프로파일과 함께 보고된 역학 데이터를 기반으로 아미노산 잔기를 선택하는 단계.
예를 들어, 이 맥락에서 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는 SEQ ID NO:4 및 SEQ ID NO:5로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
추가의 바람직한 측면에서, 본원에 언급된 로타바이러스는 로타바이러스 C이다. 이러한 측면에 따르면, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편이다.
이러한 측면의 맥락에서, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는 SEQ ID NO:6의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진다.
따라서 본 발명에 따르면, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 바람직하게는
- 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 본원에 기재된 임의의 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편, 또는
- 로타바이러스 A VP8 단백질의 일부와 같은, 바람직하게는 공통 서열의 맥락에서 본원에 기재된 로타바이러스 VP8 단백질의 임의의 면역원성 단편의 로타바이러스 VP8 단백질의 일부의 공통 서열, 또는
- 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 본원에 기재된 임의의 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편이거나 또는 그로 이루어진다.
특히 바람직한 측면에서, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드이다.
본원에 기재된 면역글로불린 Fc 단편은 바람직하게는 길이가 적어도 220개인 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 길이가 220개 내지 250개인 아미노산 잔기이다.
특히 바람직한 다른 측면에 따르면, 본원에 기재된 면역글로불린 Fc 단편은 글리코실화되지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "글리코실화되지 않는(non-glycosylated)"은 특히 면역글로불린 Fc 단편에 올리고당 분자가 부착되어 있지 않음을 의미한다.
바람직하게는, 본원에 언급된 바와 같이, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린의
- 중쇄 불변 영역 2(CH2), 및
- 중쇄 불변 영역 3(CH3),
- 및 선택적으로 힌지 영역 또는 그 힌지 영역의 일부로 이루어지거나 또는 그를 포함한다.
또 다른 바람직한 측면에 따르면, 본원에 언급된 면역글로불린은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 면역글로불린 Fc 단편은 바람직하게는 IgG Fc 단편, IgA Fc 단편, IgD Fc 단편, IgE Fc 단편 및 IgM Fc 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직한 측면에 따르면, 본원에 기재된 면역 글로불린 Fc 단편은 IgG Fc 단편이다.
본원에서 언급된 바와 같이, IgG는 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5 및 IgG6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 또 다른 바람직한 측면에 따르면, 본원에 언급된 면역글로불린 Fc 단편은 IgG1 Fc 단편, IgG2 Fc 단편, IgG3 Fc 단편, IgG4 Fc 단편, IgG5 Fc 단편 및 IgG6 Fc 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직하게는, 면역글로불린 Fc 단편은 본원에 언급된 바와 같이 장관 세포가 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편이 유래된 로타바이러스에 의한 감염에 민감한 종의 게놈에 의해 암호화된 단백질이다. 예를 들어, 로타바이러스 VP8 단백질의 단편이 돼지 로타바이러스 VP8 단백질의 단편이라면, 면역글로불린 Fc 단편은 바람직하게는 돼지 게놈에 의해 암호화된 면역글로불린 Fc 단편이다. 또 다른 예에 따르면, 로타바이러스 VP8 단백질의 단편이 닭 로타바이러스 VP8 단백질의 단편이라면, 면역글로불린 Fc 단편은 바람직하게는 닭 게놈에 의해 암호화된 면역글로불린 Fc 단편이다.
보다 구체적으로, 면역글로불린 Fc 단편은 돼지 IgG Fc 단편인 것이 바람직하다.
추가의 바람직한 측면에서, 면역글로불린 Fc 단편은 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본원에 언급된 링커 모이어티 또는 펩티드 링커는 각각 바람직하게는 길이가 1개 내지 50개의 아미노산 잔기, 특히 길이가 3개 내지 20개의 아미노산 잔기인 아미노산 서열이다. 예를 들어, 상기 링커 모이어티는 길이가 3개, 8개 또는 10개 아미노산 잔기인 펩티드 링커일 수 있다.
목적에 따라, 융합 단백질 파트너 간의 단백질 분해 위험을 줄이기 위해 짧은 링커가 필요할 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 기재된 펩티드 링커는 바람직하게는 각각 1-5개의 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 2-4개의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 3개의 아미노산 잔기의 길이를 갖거나 또는 그로 이루어진다.
바람직한 측면에 따르면, 링커 모이어티는 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 66%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기 측면에 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는다.
다른 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결된 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편을 포함한다.
상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 바람직하게는
- 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 본원에 기재된 임의의 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편, 또는
- 로타바이러스 A VP8 단백질의 일부, 바람직하게는 공통 서열의 맥락에서 본원에 기재된 로타바이러스 VP8 단백질의 임의의 면역원성 단편와 같은 로타바이러스 VP8 단백질의 일부의 공통 서열, 또는
- 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 본원에 기재된 임의의 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편이거나 또는 그로 이루어진다.
특히, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 바람직하게는 SEQ ID NO:2 내지 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
특히 바람직한 측면에서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 C-말단이 상기 면역글로불린 Fc 단편에 연결된 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편과 상이하다.
상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 바람직하게는 링커 모이어티를 통해, 특히 본원에 기재된 임의의 링커 모이어티를 통해 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결된다. 바람직하게는, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기 및 링커 모이어티의 C-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 링커 모이어티에 연결된다.
대안적으로, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 사이의 펩티드 결합을 통해 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결되는 것이 바람직할 수 있다.
특히 바람직한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 단백질이다.
본원에 사용된 "아미노산 서열로 이루어진" 또는 "아미노산 서열로 이루어진다"라는 표현 각각은 특히 임의의 공동번역 및/또는 번역후 변형 또는 단백질 또는 단백질 도메인이 발현된 세포에 의해 아미노산 서열에 의해 영향을 받는 변형에 관한 것으로 이해된다. 따라서, 본원에 기재된 "아미노산 서열로 이루어진" 또는 "아미노산 서열로 이루어진다"라는 표현 각각은 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 단백질 또는 단백질 도메인이 발현된 세포에 의해 영향을 받는 하나 이상의 변형을 갖는, 특히 단백질 생합성 및/또는 단백질 프로세싱에 영향을 받는 아미노산 잔기의 변형, 바람직하게는 글리코실화, 인산화 및 아세틸화로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 갖는 아미노산 서열과 관련있다.
"적어도 90%"라는 용어와 관련하여, 본 발명의 맥락에서 언급된 바와 같이, 상기 용어는 바람직하게는 "적어도 91%", 보다 바람직하게는 "적어도 92%", 더욱 더 바람직하게는 "적어도 93%" 또는 특히 "적어도 94%"와 관련된 것으로 이해된다.
"적어도 95%"라는 용어와 관련하여, 본 발명의 맥락에서 언급된 바와 같이, 상기 용어는 바람직하게는 "적어도 96%", 보다 바람직하게는 "적어도 97%", 더욱 더 바람직하게는 "적어도 98%" 또는 특히 "적어도 99%"와 관련된 것으로 이해된다.
"적어도 99%"라는 용어와 관련하여, 본 발명의 맥락에서 언급된 바와 같이, 상기 용어는 바람직하게는 "적어도 99.2%", 보다 바람직하게는 "적어도 99.4%", 더욱 더 바람직하게는 "적어도 99.6%" 또는 특히 "적어도 99.8%"와 관련된 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "100% 서열 동일성을 갖는"은 용어 "동일하다"와 동등한 것으로 이해된다.
퍼센트 서열 동일성은 당 분야에서 인식된 의미를 가지며 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 있다. 예를 들어, 문헌 [Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); and Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991). Methods for aligning polynucleotides or polypeptides are codified in computer programs, including the GCG program package (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)), and Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) which uses the local homology algorithm of Smith and Waterman (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))] 참조. 예를 들어, FASTA 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램 ALIGN은 -12의 갭 오픈 페널티와 -2의 갭 확장 페널티를 갖는 아핀 갭 검색과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, DNASTAR Inc.의 MegAlign 소프트웨어 버전 11.1.0(59), 419의 Clustal W 방법을 사용하여 프로그램에 설정된 기본 다중 정렬 매개변수 (갭 페널티 =15.0, 갭 길이 페널티=6.66, 지연 발산 서열(%)= 30%, DNA 전이 중량 =0.50 및 DNA 중량 매트릭스= IUB)를 사용하여 뉴클레오티드 서열이 정렬되고, 및 각각 단백질/아미노산 서열은 DNASTAR Inc.의 MegAlign 소프트웨어 버전 11.1.0(59), 419의 Clustal W 방법을 사용하여 프로그램에 설정된 기본 다중 정렬 매개변수 (갭 페널티 = 10.0, 갭 길이 페널티 = 0.2 및 지연 발산 시퀀스(%) = 30%가 있는 Gonnet 시리즈 단백질 중량 매트릭스)를 사용하여 정렬된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "SEQ ID NO:X 서열과의 서열 동일성"은 용어 "SEQ ID NO:X의 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:X의 서열과의 서열 동일성" 또는 용어 "SEQ ID NO:X의 전체 길이에 걸쳐 SEQ ID NO:X의 서열과의 서열 동일성"과 각각 동등한 것으로 이해된다. 이와 관련하여, "X"는 1 내지 25로부터 선택된 임의의 정수이므로 "SEQ ID NO:X"는 본원에 언급된 임의의 SEQ ID NO를 나타낸다.
"SEQ ID NO:[...],... 및 SEQ ID NO:[...]로 이루어진 군"이라는 문구는, 본원에 사용된 바와 같이, "SEQ ID NO:[...]의 서열,... 및 SEQ ID NO:[…]의 서열로 이루어진 군"과 상호교환 가능하다. 이 문맥에서 "[...]"는 서열 번호에 대한 자리 표시자이다. 예를 들어, "SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군"이라는 문구는 "SEQ ID NO:3의 서열, SEQ ID NO:4의 서열, SEQ ID NO:5의 서열 및 SEQ ID NO:6의 서열로 이루어진 군"과 상호교환 가능하다.
또 다른 특정 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 하기로 이루어진다:
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 본원에 기재된 임의의 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편,
- 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기 측면에 있는 N-말단 메티오닌 잔기, 및
- 면역글로불린 Fc 단편, 특히 본원에 기재된 임의의 면역글로불린 Fc 단편
(여기서 상기 면역글로불린 Fc 단편은 특히 링커 모이어티를 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되며, 여기서 상기 링커 모이어티는 바람직하게는 본원에 기재된 임의의 링커 모이어티이다),
- 및 선택적으로 특히 링커 모이어티를 통해 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C -말단에 연결된 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편 (여기서 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 바람직하게는 본원에 기재된 임의의 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편이고, 여기서 상기 링커 모이어티는 바람직하게는 본원에 기재된 임의의 링커 모이어티이다).
또 다른 추가 바람직한 측면에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 추가의 폴리펩티드와 이량체를 형성한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드는 제2의 동일한 폴리펩티드와 동종이량체를 형성한다.
따라서 용어 "본 발명의 폴리펩티드"는 본 발명의 2개의 폴리펩티드로 구성된 임의의 이량체를 추가로 포함하고, 특히 본 발명의 2개의 동일한 폴리펩티드로 구성된 임의의 동종이량체를 포함하는 것으로 특히 이해된다.
또 다른 특정 바람직한 측면에 따르면, 본 발명은 다수의 본 발명의 폴리펩티드를 포함하거나 그로 구성된 다량체를 제공하며, 상기 다량체는 이하에서 "본 발명의 다량체"라고도 한다.
바람직하게는, 본 발명의 다량체는 본 발명의 하나의 폴리펩티드와 본 발명의 제2 동일한 폴리펩티드에 의해 형성된 동종이량체이다.
특히 "본 발명의 다량체"라는 용어는 본 발명의 상이한 다량체의 임의의 혼합물, 예를 들어
- 본 발명의 하나의 폴리펩티드와 본 발명의 제2 동일한 폴리펩티드에 의해 형성된 동종이량체, 및
- 2개 이상의 본 발명의 동일한 폴리펩티드에 의해 형성된 하나 이상의 다량체를 포함한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 다량체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 상기 면역원성 조성물은 이하에서 "본 발명의 면역원성 조성물"이라고도 한다.
따라서, 바람직한 일 예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은
- 본 발명의 하나의 폴리펩티드로 이루어진 단량체, 및
- 본 발명의 2개의 동일한 폴리펩티드로 이루어진 동종이량체,
- 및 선택적으로 본 발명의 3개의 동일한 폴리펩티드로 이루어진 동종삼량체를 포함하고,
여기서 바람직하게는
- 본 발명의 상기 2개의 동일한 폴리펩티드 각각,
- 및 선택적으로 본 발명의 상기 3개의 동일한 폴리펩티드 각각은
본 발명의 상기 하나의 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진다.
본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드를 적어도 100 nM, 바람직하게는 적어도 250 nM, 보다 바람직하게는 적어도 500 nM, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 1 μM의 농도로 포함한다.
다른 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 100 nM 내지 50 μM, 바람직하게는 250 nM 내지 25 μM, 그리고 가장 바람직하게는 1 내지 10 μM의 농도로 함유한다.
특히 1mL 또는 경우에 따라 2mL의 본 발명의 면역원성 조성물이 대상체에게 투여된다. 따라서, 다상체에 투여되는 본 발명의 면역원성 조성물의 용량은 바람직하게는 1 mL 또는 2 mL의 부피를 갖는다.
바람직하게는 상기 면역원성 조성물의 1회 용량 또는 2회 용량이 대상체에게 투여된다.
본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 전신적으로 또는 국소적으로 투여된다. 통상적으로 사용되는 적합한 투여 경로는 비경구 또는 경구 투여, 예컨대 근육내, 피내, 정맥내, 복강내, 피하, 비강내 및 흡입 투여이다. 그러나, 화합물의 성질 및 작용 방식에 따라, 상기 면역원성 조성물은 다른 경로로도 투여될 수 있다. 가장 바람직한 것은 면역원성 조성물이 근육내로 투여되는 것이다. 본 발명의 면역원성 조성물은 바람직하게는 약제학적 또는 수의학상 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 "약제학적 또는 수의학상 허용되는 담체"는 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 희석제, 방부제, 항균제 및 항진균제, 등장화제, 흡착 지연제 등을 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 특히 본 발명에서 사용하기 위해 동결건조된 면역원성 조성물, 안정화제를 포함하는 것들은 동결건조(lyophilization) 또는 동결건조(freeze-drying)를 위한 안정제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 보조제(adjuvant)를 함유한다.
본원에 사용된 "보조제"는 수산화알루미늄 및 인산알루미늄, 사포닌, 예를 들어, Quil A, QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), 수중유 에멀전, 유중수 에멀젼, 수중유중수 에멀젼을 포함할 수 있다. 에멀젼은 특히 가벼운 액체 파라핀 오일(유럽 약전 유형); 스쿠알란 또는 스쿠알렌과 같은 이소프레노이드 오일; 알켄, 특히 이소부텐 또는 데센의 올리고머화로부터 생성된 오일; 선형 알킬기를 함유하는 산 또는 알코올의 에스테르, 보다 특히 식물성 오일, 에틸 올레이트, 프로필렌 글리콜 디-(카프릴레이트/카프레이트), 글리세릴 트리-(카프릴레이트/카프레이트) 또는 프로필렌 글리콜 디올레이트; 분지형 지방산 또는 알코올의 에스테르, 특히 이소스테아르산 에스테르를 기반으로 할 수 있다. 오일은 유화제와 함께 사용되어 에멀젼을 형성한다. 유화제는 바람직하게는 비이온성 계면활성제, 특히 소르비탄의, 만니드(예: 안히드로만니톨 올레에이트)의, 글리콜의, 폴리글리세롤의, 프로필렌 글리콜의 및 특히 선택적으로 에톡실화된 올레산, 이소스테아르산, 리시놀레산 또는 히드록시스테아르산의 에스테르, 및 폴리옥시프로필렌-폴리옥시에틸렌 공중합체 블록, 특히 Pluronic 제품, 특히 L121이다. 문헌 [Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)] 참조. 예시적인 보조제는 M. Powell 및 M. Newman이 편집한 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", Plenum Press, 1995의 147페이지에 설명된 SPT 에멀젼 또는 동일한 책의 183페이지에 설명된 에멀젼 MF59이다.
보조제의 추가 예는 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체 및 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체로부터 선택되는 화합물이다. 유리한 보조제 화합물은 특히 당 또는 폴리알코올의 폴리알케닐 에테르와 가교결합된 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체이다. 이들 화합물은 카보머(carbomer)라는 용어로 알려져 있다(Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996). 당업자는 또한 미국 특허 제2,909,462호를 참조할 수 있으며 이는 예컨대 3개 이상, 바람직하게는 8개 이하의 히드록실기, 2개 이상의 탄소 원자를 갖는 불포화 지방족 라디칼로 대체된 3개 이상의 히드록실의 수소 원자를 갖는 폴리히드록실화 화합물로 가교결합된 아크릴 중합체를 개시한다. 바람직한 라디칼은 2개 내지 4개의 탄소 원자, 예를 들어, 비닐, 알릴 및 기타 에틸렌성 불포화 기를 함유하는 것이다. 불포화 라디칼 자체는 메틸과 같은 다른 치환체를 함유할 수 있다. CARBOPOL®이라는 이름으로 판매되는 제품; (BF Goodrich, 오하이오, 미국)이 특히 적합하다. 이들은 알릴 자당 또는 알릴 펜타에리트리톨과 가교 결합된다. 그 중에서 카보폴(Carbopol) 974P, 934P 및 971P를 언급할 수 있다. 가장 바람직한 것은 CARBOPOL® 971P를 사용하는 것이다. 말레산 무수물과 알케닐 유도체의 공중합체 중에는, 말레산 무수물과 에틸렌의 공중합체인 공중합체 EMA(Monsanto)가 있다. 이들 중합체를 물에 용해시키면 면역원성, 면역학적 또는 백신 조성물 자체가 혼입될 보조제 용액을 제공하기 위해, 바람직하게는 생리학적 pH로, 중화될 산성 용액으로 유도된다.
보조제가 선택될 수 있는 추가의 적합한 보조제는 다른 많은 것들 중에서 RIBI 보조제 시스템(Ribi Inc.), 블록 공중합체(CytRx, Atlanta GA), SAF-M(Chiron, Emeryville CA), 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 보조제, E. coli로부터의 열-불안정 장독소(재조합 또는 기타), 콜레라 독소, IMS 1314 또는 무라밀 디펩티드, 또는 천연 발생 또는 재조합 시토카인 또는 그의 유사체 또는 내인성 시토카인 방출 자극제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
보조제는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양, 바람직하게는 용량당 약 100㎍ 내지 약 10mg의 양, 보다 바람직하게는 용량당 약 500㎍ 내지 약 5mg의 양, 훨씬 더 바람직하게는 용량당 약 750㎍ 내지 약 2.5mg의 양, 그리고 가장 바람직하게는 용량당 약 1mg의 양으로 첨가될 수 있는 것으로 예상된다. 대안적으로, 보조제는 최종 제품 부피의 약 0.01% 내지 50%의 농도, 바람직하게는 약 2% 내지 30%의 농도, 더 바람직하게는 약 5% 내지 25%의 농도, 더욱 더 바람직하게는 약 7% 내지 22%의 농도, 그리고 가장 바람직하게는 10% 내지 20% 농도일 수 있다.
"희석제"는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제는 특히 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함할 수 있다. 안정제는 특히 알부민 및 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함한다.
특히 바람직한 측면에 따르면, 본 발명은 또한 면역원성 조성물, 특히 본 발명의 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은
- 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 다량체, 및
- 약제학적 또는 수의학상 허용되는 담체 또는 부형제,
- 및 선택적으로 보조제를 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
본 발명의 맥락에서 보조제는 바람직하게는 유화 수중유 보조제 및 카보머로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "면역원성 조성물"은 면역원성 조성물이 투여되는 숙주에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 조성물을 의미한다. 이러한 면역학적 반응은 본 발명에 따른 면역원성 조성물에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응일 수 있다. 숙주는 "대상체"라고도 한다. 바람직하게는, 본원에 기재되거나 언급된 임의의 숙주 또는 대상체는 동물이다.
본원에서 사용되는 용어 "동물"은 특히 포유동물, 바람직하게는 돼지(swine), 보다 바람직하게는 돼지(pig), 가장 바람직하게는 새끼 돼지(piglet)에 관한 것이다.
일반적으로, "면역학적 반응"은 다음 효과 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 항체, B 세포, 보조 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포 및/또는 본 발명의 면역원성 조성물에 포함된 항원 또는 항원들에 특이적으로 지시된 감마-델타 T 세포의 생성 또는 활성화. 바람직하게는, 숙주는 보호 면역 반응 또는 치료 반응을 나타낼 것이다.
"보호 면역 반응"은 감염된 숙주가 일반적으로 나타내는 하나 이상의 임상 징후의 감소 또는 결여, 더 빠른 회복 시간 및/또는 감염 지속 시간 감소 또는 감염된 숙주의 조직 또는 체액 또는 배설물의 병원체 역가 감소로 입증된다.
본원에 언급된 "병원체(pathogen)" 또는 "특정 병원체"는 특히 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편이 유래된 로타바이러스에 관한 것이다. 예를 들어, 병원체는 본원에 언급된 바와 같이 로타바이러스 A 또는 로타바이러스 C 이다.
숙주가 새로운 감염에 대한 저항성이 강화되고/되거나 질병의 임상적 중증도가 감소되도록 보호 면역학적 반응을 나타내는 경우, 면역원성 조성물은 "백신"으로 기재된다.
본원에 기재된 바와 같은 "항원"은 이러한 항원 또는 그의 면역학적 활성 성분을 포함하는 관심 있는 면역원성 조성물 또는 백신에 대해 숙주에서 면역학적 반응을 유도하는 성분을 지칭하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본원에서 사용되는 용어 "항원"은 숙주에 투여되는 경우 숙주에서 면역학적 반응을 유도할 수 있는 단백질 또는 단백질 도메인을 의미한다.
용어 "치료 및/또는 예방"은 무리에서 특정 병원체 감염의 발생률 감소 또는 특정 병원체 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 하나 이상의 임상 징후의 중증도 감소를 의미한다. 따라서, "치료 및/또는 예방"이라는 용어는 또한 특정 병원체에 감염되는 무리의 동물 수의 감소(= 특정 병원체 감염의 발병률 감소) 또는 동물 그룹에서 병원체 감염에 의해 유발되거나 이와 적상적으로 관련된 하나 이상의 임상 징후의 중증도 감소를 의미하고 이 동물은 이러한 면역원성 조성물을 투여받지 않은 동물의 그룹과 비교하여 본원에 제시된 바와 같은 면역원성 조성물의 유효량을 투여받은 동물이다.
"치료 및/또는 예방"은 일반적으로 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물의 유효량을 그러한 치료/예방을 필요로 하거나 이로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체 또는 대상체 무리에 투여하는 것을 포함한다. 용어 "치료"는 대상체 또는 무리 중 적어도 일부 동물이 그러한 병원체에 이미 감염되어 그러한 병원체 감염에 의해 유발되거나 그와 관련된 일부 임상 징후를 보일 때 면역원성 조성물의 유효량을 투여하는 것을 의미한다. "예방"이라는 용어는 대상체가 병원체에 감염되기 전 또는 적어도 그러한 동물 또는 동물 그룹의 모든 동물이 그러한 병원체에 의한 감염에 의해 유발되거나 그와 관련된 하나 이상의 임상 징후를 나타내지 않는 경우에 대상체에게 투여하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 유도할 수 있는 항원, 특히 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 다량체의 양을 의미하지만, 이에 제한되지 않는다. 그러한 유효량은 무리에서 특정 병원체 감염의 발생을 감소시키거나 특정 병원체 감염의 하나 이상의 임상 징후의 중증도를 감소시킬 수 있다. 바람직하게는, 면역원성 조성물로 치료를 받지 않았거나 또는 본 발명 이전에 이용 가능했던 면역원성 조성물로 치료받았지만 이후에 특정 병원체에 의해 감염된 대상체와 비교하여, 하나 이상의 임상 징후는 발생률 또는 중증도가 적어도 10%, 더 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 감소된다.
본원에서 사용되는 용어 "임상 징후"는 특정 병원체로부터의 대상체의 감염 징후를 의미한다. 감염의 임상 징후는 선택된 병원체에 따라 다르다. 이러한 임상 징후의 예에는 설사, 구토, 열, 복통 및 탈수가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
대상체에서 특정 병원체 감염에 의해 유발되거나 그와 관련된 하나 이상의 임상 징후의 발생률 감소 또는 중증도 감소는 본 발명의 면역원성 조성물의 1회 이상의 용량을 대상체에게 투여함으로써 달성될 수 있다.
용어 "분변 배출 감소"는 대변 1mL당 로타바이러스와 같은 병원성 바이러스의 RNA 복제 수 또는 대변의 데시리터당 플라크 형성 콜로니 수의 감소를 의미하지만, 이에 제한되지 않으며, 상기 조성물을 투여받지 않고 아마도 감염된 대상체와 비교하여 본 발명의 조성물을 받은 대상체의 대변에서 적어도 50% 감소된다. 보다 바람직하게는, 분변 배출 수준은 본 발명의 조성물을 투여받은 대상체에서 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 99.9%, 보다 바람직하게는 적어도 99.99%, 보다 더 바람직하게는 적어도 99.999% 감소된다.
본원에 사용된 용어 "분변 배출"은 의학 및 바이러스학에서 평범한 통상적 의미에 따라 사용되며 감염된 대상체의 대변을 통해 대상체의 세포에서 바이러스가 생성되어 환경으로 방출되는 것을 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 재조합 단백질, 특히 재조합 바큘로바이러스(baculovirus) 발현 단백질이다.
본원에서 사용되는 "재조합 단백질"이라는 용어는, 특히 재조합 DNA 기술에 의해 생산되는 단백질을 말하며, 여기서 일반적으로 발현된 단백질을 암호화하는 DNA는 형질전환 또는 바이러스 벡터의 경우 숙주 세포를 감염시켜 이종 단백질을 생산하는데 차례로 사용되는 적합한 발현 벡터에 삽입된다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "재조합 단백질"은 특히 재조합 DNA 분자로부터 발현되는 단백질 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 기술에 의해 함께 결합된 DNA 세그먼트로 구성된 DNA 분자를 의미한다. 재조합 단백질의 생산에 적합한 시스템은 곤충 세포(예: 바큘로바이러스), 원핵생물 시스템(예: 대장균), 진균 (예: 마이셀리오프토라 열성균(Myceliophthora thermophile), 아스페르길루스 오리제(Aspergillus oryzae), 우스틸라고 메이디스(Ustilago maydis)), 효모(예: 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)), 포유류 세포(예: 차이니즈 햄스터 난소, HEK293), 식물(예: 잇꽃), 해조류, 조류 세포, 양서류 세포, 어류 세포 및 무세포 시스템(예: 토끼 망상적혈구 용해물)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드(이하 "본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드"라고도 함)는 바람직하게는 분리된 폴리뉴클레오티드이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 제조는 당업계의 기술 범위 내에 있으며, 다른 것들 중에서 전체내용이 본원에 참조로서 포함된 문헌 [Sam brook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Amusable, et al., 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; and Erlich (ed), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York]에 기재된 재조합 기술에 따라 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
"벡터" 및 "본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터"는 본 발명의 목적을 위해 적합한 발현 벡터, 바람직하게는 바큘로바이러스 발현 벡터를 의미하며, 이는 형질감염 또는 바큘로바이러스 발현 벡터가 감염되는 경우 숙주 세포가 DNA에 의해 암호화되는 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하는데 차례로 사용될 수 있다. 발현을 위한 벡터(또는 재조합체)의 제조 및/또는 사용을 위한 벡터 및 방법은 하기에 개시된 방법에 의해 만들거나 수행할 수 있거나 유사할 수 있다: 미국 특허번호 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, PCT 공보 WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; 문헌 [Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996; Smith et al.], US 특허번호 4,745,051 (재조합 바큘로바이러스); 문헌 [Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406]; EPA0 370 573; 1986년 10월 16일자로 출원된 미국 출원번호 920,197; EP 특허 공개번호 265785; 미국 특허번호 4,769,331 (재조합 헤르페스바이러스); 문헌 [Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996; Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996; Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996; Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991]; 미국 특허번호 5,591,439, 5,552,143; WO 98/00166; 특허결정된 미국 출원번호 08/675,556 및 08/675,566 (둘 모두 1996년 7월 3일에 출원)(재조합 아데노바이러스); 문헌 [Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993; and McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996]; 및 미국 특허번호 5,591,639, 5,589,466 및 5,580,859 뿐만 아니라 WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660; 문헌 [Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors, inter alia]. 또한, WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (렌티바이러스 발현 시스템); Sanford et al., 미국 특허번호 4,945,050; Fischbachet al.(인트라셀); WO 90/01543; Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA 벡터 시스템); Szoka et al., 미국 특허번호 4,394,448 (DNA를 살아있는 세포에 삽입하는 방법); McCormick et al., 미국 특허번호 5,677,178 (세포 변성 바이러스 사용); 및 미국 특허번호 5,928,913 (유전자 전달용 벡터); 뿐만 아니라 여기에 인용된 다른 문서들 참조.
바람직한 바이러스 벡터는 특히 생산 세포가 곤충 세포인 경우 바큘로골드 (BaculoGold)(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)와 같은 바큘로바이러스를 포함한다. 바큘로바이러스 발현 시스템이 바람직하지만, 상기 기재된 것을 포함하는 다른 발현 시스템, 즉 재조합 단백질의 발현이라는 본 발명의 목적을 위해 작용할 것이라는 것이 당업자에 의해 이해된다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바큘로바이러스를 제공한다. 상기 바큘로바이러스(이하에서는 "본 발명에 따른 바큘로바이러스"라고도 함)는 바람직하게는 분리된(isolated) 바큘로바이러스이다.
또한, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 상기 플라스미드 (이하에서는 "본 발명에 따른 플라스미드"라고도 함)는 특히 분리된 플라스미드이다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바큘로바이러스에 의해 감염되고/되거나 그를 함유하는 세포, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 상기 세포 (이하에서는 "본 발명에 따른 세포"라고도 지칭됨)는 바람직하게는 분리된 세포이다.
분리된 세포라는 맥락에서 사용될 때 "분리된(isolated)"이라는 용어는 사람의 손에 의해 자연 환경과 떨어져 존재하고 따라서 자연의 산물이 아닌 세포를 의미한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드; 본 발명의 다량체; 본 발명에 따른 바큘로바이러스; 본 발명의 면역원성 조성물; 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드; 본 발명에 따른 바이러스 유사 입자; 본 발명에 따른 플라스미드; 및/또는 약제, 바람직하게는 백신의 제조를 위한 본 발명에 따른 세포의 용도에 관한 것이다.
이와 관련하여, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 발명에 따른 바큘로바이러스로 세포, 바람직하게는 곤충 세포를 감염시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 백신접종에 사용될 수 있는 바이러스 유사 입자의 안정한 셀프-어셈블리에 충분히 높은 양으로 발현된다.
본원에서 사용되는 용어 "백신접종(vaccination)" 또는 "백신접종(vaccinating)"은 면역원성 조성물에 포함된 항원과 같은 항원을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 과정을 의미하지만, 이에 제한되지 않으며, 상기 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 다량체는 상기 대상체에게 투여될 때 상기 대상체에서 보호 면역학적 반응을 유도하거나 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 약제, 바람직하게는 백신으로서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 제공한다.
특히, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 로타바이러스 감염에 의해 야기되는 하나 이상의 임상 징후 또는 질병을 감소시키거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위해 제공되며, 여기서 로타바이러스는 바람직하게는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편을 암호화하는 게놈을 갖는 그룹의 로타바이러스이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 특히 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위해 제공되며, 여기서 바이러스는 바람직하게는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편을 암호화하는 게놈을 갖는 그룹의 로타바이러스이다. 따라서, 특정 일 예에서, 본원에 언급된 바와 같이, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편이 로타바이러스 A의 게놈에 의해 암호화되면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 임상 징후, 사망률, 분변 배출 또는 로타바이러스 A 감염으로 인한 질병을 감소시키거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 대상체에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위해 또는 대상체에서 로타바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위해 제공된다.
본원에서 언급된 로타바이러스 감염은 특히 로타바이러스 A 또는 로타바이러스 C에 의한 감염을 의미한다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 대상체에서 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위해 제공된다.
본 명세서에서 언급된 대상체는 바람직하게는 돼지 또는 소와 같은 포유동물 또는 닭과 같은 조류이다. 특히, 대상체는 돼지이고, 여기서 돼지는 새끼 돼지 또는 암퇘지, 예를 들어 임신한 암퇘지인 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 대상체에서 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 맥락에서, 상기 대상체는 임신한 암퇘지이다. 대상체에서 로타바이러스 감염에 의해 유발된 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하거나, 또는 대상체에서 로타바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 맥락에서, 상기 대상체는 가장 바람직하게는 새끼 돼지이다.
하나의 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 새끼 돼지에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이며, 여기서 새끼 돼지는 면역원성 조성물이 투여된 암퇘지에 의해 젖을 먹어야 한다. 면역원성 조성물이 투여된 상기 암퇘지는, 바람직하게는 상기 암퇘지가 특히 상기 새끼 돼지를 임신한 동안 면역원성 조성물을 투여받은 암퇘지이다.
또한, 본 발명은 로타바이러스 감염의 치료 또는 예방, 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출의 감소, 예방 또는 치료, 또는 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또한, 바람직하게는 임신한 암퇘지에서 로타바이러스에 특이적인 항체의 생산을 유도하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 상기 암퇘지에 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 새끼 돼지에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
- 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 암퇘지에게 투여하는 단계, 및
- 상기 암퇘지가 상기 새끼 돼지에게 젖을 먹일 수 있도록 하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 암퇘지는 바람직하게는 특히 상기 돼지를 임신한 암퇘지이다.
바람직하게는, 상기 두 가지 방법은
- 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명에 따른 면역원성 조성물을 상기 새끼 돼지를 임신한 암퇘지에게 투여하는 단계,
- 상기 암퇘지가 상기 새끼 돼지를 출산하도록 하는 단계, 및
- 상기 암퇘지가 상기 새끼 돼지에게 젖을 먹일 수 있도록 하는 단계를 포함한다.
또한, 새끼 돼지에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망율 또는 분변 배출을 감소시키는 방법이 제공되며, 여기서 상기 새끼 돼지는 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 투여받은 암퇘지의 젖을 먹었다.
본원에 언급된 바와 같이, 하나 이상의 임상 징후는 바람직하게는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
- 설사,
- 로타바이러스 콜로니화(colonization), 특히 장관의 로타바이러스 콜로니화,
- 병변, 특히 거시적 병변, 및
- 일일 평균 체중 증가율 감소.
일 예에 따르면, 본원에 언급된 하나 이상의 임상 징후는 장관, 특히 소장의 로타바이러스 콜로니화이다. 또 다른 예에 따르면, 본원에 언급된 하나 이상의 임상 징후는 장 병변, 특히 거시적 장 병변이다.
또 다른 특히 바람직한 측면에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 임의의 상기 기재된 방법에서 사용하기 위한 것이며, 여기서
- 상기 로타바이러스 감염은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염이거나,
- 상기 로타바이러스에 의한 감염은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염이거나,
- 상기 로타바이러스에 대한 면역 반응은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 대한 면역 반응이거나, 또는
- 상기 로타바이러스에 특이적인 항체는 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 특이적인 항체이고,
그리고 바람직하게는 각각 본 발명의 상기 폴리펩티드는 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 SEQ ID NO:3의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 본원에 기재된 본 발명의 임의의 폴리펩티드이거나, 또는 본 발명의 상기 면역원성 조성물은 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 SEQ ID NO:3의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 본원에 기재된 본 발명의 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
한 특정 측면에서, 본원에 언급된 바와 같이, "유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염"은 유전자형 P[23] 로타바이러스에 의한 감염이다.
다른 바람직한 측면에서, 본원에 언급된 바와 같이, "유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염"은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염이다.
한 특정 측면에서, 본원에 언급된 바와 같이, "유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 대한 면역 반응"은 유전자형 P[23] 로타바이러스에 대한 면역 반응이다.
다른 바람직한 측면에서, 본원에 언급된 바와 같이, "유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 대한 면역 반응"은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및 유전자형 P[7] 로타바이러스에 대한 면역 반응이다.
한 특정 측면에서, 본원에 언급된 바와 같이, "유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 특이적인 항체"는 유전자형 P[23] 로타바이러스에 특이적인 항체이다.
또 다른 바람직한 측면에서, 본원에 언급된 바와 같이, "유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 특이적인 항체"는 유전자형 P[23]에 특이적인 항체 및 유전자형 P[7]에 특이적인 항체이거나 그를 포함한다.
추가의 측면에서, 각각 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 동물, 바람직하게는 임신한 암퇘지에서 로타바이러스 C에 특이적인 항체의 생산을 유도하기 위해 투여된다. 바람직하게는 이러한 추가 측면에서, 본 발명의 상기 폴리펩티드는 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 SEQ ID NO:15의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 포함하는 본원에 기재된 본 발명의 임의의 폴리펩티드이거나, 또는 본 발명의 면역원성 조성물은 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 SEQ ID NO:15의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것을 포함하는 본원에 기재된 본 발명의 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 다량체를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 다량체를 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포, 바람직하게는 곤충 세포를 본 발명의 바큘로바이러스로 감염시키는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은
(a) 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 갖는 배양물에서 감수성 세포의 감염을 허용하는 단계로서, 상기 폴리펩티드는 상기 벡터에 의해 발현되는 것인, 상기 단계;
(b) 이후 상기 폴리펩티드를, 특히 세포 배양 상청액에서 회수하는 단계로서, 바람직하게는 세포 파편이 적어도 하나의 필터, 바람직하게는 2개의 필터를 통해 바람직하게는 미세 여과를 포함하는 분리 단계를 통해 상기 폴리펩티드로부터 분리되고, 상기 적어도 하나의 필터는 바람직하게는 약 1㎛ 내지 약 20㎛ 및/또는 약 0.1㎛ 내지 약 4㎛의 공극 크기를 갖는 것인, 상기 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 혼합물에 이원 에틸렌이민(binary ethylenimine, BEI)을 첨가하여 상기 벡터를 불활성화시키는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 혼합물에 티오황산나트륨을 첨가하여 상기 BEI를 중화시키는 단계; 및
(e) 약 5 kDa 내지 약 100 kDa, 바람직하게는 약 10 kDa 내지 약 50 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 여과막을 갖는 필터를 사용하는 여과 단계에 의해 상기 혼합물로부터 액체의 일부를 제거함으로써 단계 (d)로부터 생성된 혼합물에서 폴리펩티드를 농축하는 단계;
(f) 및 선택적으로 단계 (e) 후에 남아있는 혼합물을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 성분과 혼합하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 단계 (a)에서, 상기 세포는 바람직하게는 곤충 세포이고 상기 벡터는 바람직하게는 본 발명의 바큘로바이러스이다.
상기 방법의 단계 (b)에서, 상기 폴리펩티드는 가장 바람직하게는 세포 내부로부터보다는 상기 배양된 세포의 상청액에서 회수된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물 및 본원에 기재된 임의의 방법에서의 상기 면역원성 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 상기 면역원성 조성물은 전술한 본 발명의 면역원성 조성물의 제조 방법에 의해 수득가능하다.
또한, 본 발명은
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 및
- 이종 이량체화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고,
여기서 상기 이종 이량체화 도메인은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이량체화 도메인"은 특히 이량체를 형성하는 것과 같이 하나의 추가적인 이량체화 도메인에 특이적으로 결합하거나 회합할 수 있는 아미노산 서열에 관한 것이다. 일 예에서, 이량체화 도메인은 동종이량체를 형성하기 위해 동일한 아미노산 서열을 갖는 다른 하나의 이량체화 도메인에 결합하거나, 또는 각각 동종결합할 수 있는 아미노산 서열이다. 이량체화 도메인은 하나 이상의 시스테인 잔기(들)를 함유할 수 있어서 [a] 디설파이드 결합(들)이 연관된 이량체화 도메인들 사이에 각각 형성될 수 있거나 형성되었다.
본 문맥에서 "이종 이량체화 도메인"은 특히 본원에 언급된 바와 같은 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편이 유래되는 로타바이러스 이외의 개체로부터 유래된 이량체화 도메인에 관한 것이다. 예를 들어, 이종 이량체화 도메인은 로타바이러스 이외의 바이러스의 게놈 또는 바람직하게는 진핵 세포 또는 특히 포유동물 또는 조류 세포의 원핵 세포의 게놈에 의해 암호화되는 이량체화 도메인이다.
바람직하게는, 이종 이량체화 도메인은 본원에 언급된 바와 같이 장관 세포가 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편이 유래된 로타바이러스에 의한 감염에 민감한 종의 게놈에 의해 암호화된 이량체화 도메인이다. 예를 들어, 로타바이러스 VP8 단백질의 단편이 돼지 로타바이러스 VP8 단백질의 단편이라면, 이종 이량체화 도메인은 바람직하게는 돼지 게놈에 의해 암호화된 이량체화 도메인이다. 또 다른 예에 따르면, 로타바이러스 VP8 단백질의 단편이 닭 로타바이러스 VP8 단백질의 단편이라면, 이종 이량체화 도메인은 바람직하게는 닭 게놈에 의해 암호화된 이량체화 도메인이다.
또 다른 바람직한 측면에 따르면, 이종 이량체화 도메인은 각각 동종이량체를 형성할 수 있거나 형성한다.
바람직한 일 예에서, 본원에 언급된 이종 이량체화 도메인은 코일드-코일 도메인(coiled-coil domain), 특히 류신 지퍼 도메인이다.
상기 류신 지퍼 도메인은 바람직하게는 돼지 c-Jun 류신 지퍼 도메인과 같은 c-Jun 류신 지퍼 도메인이다.
도 1 : 돼지 로타바이러스 A에 대한 에멀시젠(Emulsigen) D로 제형화된 AVP8-IgG Fc 단백질(라벨링에서 "AVP8-IgG"로 지칭됨) 또는 위약("비관련 대조군")으로 백신접종된 돼지의 혈청 IgG 반응.
도 2 : 에멀시젠 D로 제형화된 AVP8-IgG Fc 단백질(라벨링에서 "AVP8-IgG"로 지칭됨) 또는 위약("비관련 대조군")으로 백신접종된 돼지 샘플에서 돼지 로타바이러스 A 바이러스를 중화할 수 있는 항체를 검출하고 정량화하기 위해 수행된 VN(바이러스 중화) 분석의 결과.
도 3 : 그룹 및 연구일별 암퇘지 혈청의 로타바이러스에 대한 평균 VN 역가로서, 여기서 연구일 D0 및 D28은 "분만 6주 전 및 2주 전" 시점(즉, 연구 제품이 연구 그룹 T02 및 T04 각각에 투여되었을 때)을 나타내고 및 연구일 D7, D28 및 D35는 "분만 5주 전, 2주 전 및 1주 전" 시점(즉, 상업적 백신이 T06에 투여되었을 때)을 나타낸다.
도 4 : 연구일별 분변에서 그룹 중앙값 로그 로타바이러스 A RNA 게놈 복제물(gc)/mL.
도 5 : A) 디티오트레이톨로 환원되거나("+DTT") 환원되지 않은("-DTT") 단백질 A 정제된 AVP8-IgG Fc 단백질(SEQ ID NO:12) 생성물 샘플의 SDS-PAGE; B) AVP8-IgG Fc 단백질(SEQ ID NO:12) 바이오반응기 생성물의 웨스턴 블롯으로서, 여기서 샘플은 세포 펠릿 분획("Pellet") 및 상청액 분획("상청액")을 분리하기 위해 원심분리되고, 동결 후-해동 과정은 환원 조건(+DTT) 하에서 SDS-PAGE에서 실행되었고, PVDF 막으로 옮겨 돼지 IgG Fc 단편을 검출하기 위해 HRP 접합된 염소 항-돼지로 프로브되었다.
도 6 : 그룹 및 연구일별 암퇘지 혈청의 로타바이러스에 대한 평균 VN 역가로서, 여기서 연구일 D0 및 D28은 "분만 6주 전 및 2주 전" 시점(즉, 연구 제품이 연구 그룹 T01 및 T03에 각각 투여되었을 때)을 나타낸다.
실시예
하기 실시예는 단지 본 개시내용을 설명하기 위한 것이다. 어떤 식으로든 청구 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
융합 단백질의 설계, 제조 및 테스트 :
작제물 설계:
로타바이러스 A VP4 서열은 원래 돼지 분변 샘플에서 수득하였고, 이는 GenBank 염기서열 JX971567.1과 가장 가깝게 일치하며 P[7] 유전자형으로 분류된다. 이후 "AVP8"로도 명명되는 VP4 아미노산 57-224(SEQ ID NO:3)가 사용되었고 이는 8 단백질의 렉틴-유사 도메인에 해당하지만 8개의 아미노산 잔기에 의해 연장된 N-말단을 갖는다. 링커 모이어티는 Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:9)이다. 돼지 IgG Fc 서열(SEQ ID NO:7)은 IgG 중쇄 불변 전구체(GenBank 서열 BAM75568.1)의 아미노산 242-470과 일치한다. AVP8, Gly-Gly-Ser 링커 및 돼지 IgG Fc 서열을 암호화하는, 곤충 세포에 최적화된 모든 코돈인 IDT Gblock이 접수되었고 (SEQ ID NO:17), 본원에서는 AVP8-IgG Fc로 명명되었다. AVP8-IgG Fc에 의해 암호화된 단백질(SEQ ID NO:12)은 본원에서 "AVP8-IgG Fc 단백질"이라고도 한다.
클로닝, 발현 및 정제:
AVP8-IgG Fc는 TOPO 클로닝되었고 이어서 BamHI 및 NotI 제한 부위를 사용하여 바큘로바이러스 전달 플라스미드 pVL1393에 삽입된 다음, 재조합 바큘로바이러스를 생성하기 위해 BaculoGold와 함께 Sf9 세포에 공동 형질감염되었다. AVP8-IgG Fc 단백질의 제조는 다음과 같이 수행되었다: 3L 스피너 플라스크에 있는 1L의 Sf+ 세포를 4DPI 수확된 소모 배지로 0.2MOI로 감염시키고, 15,000g에서 20분 동안 원심분리하고, 0.2μm로 여과했다. 1mL의 MabSelect SuRE LX 수지 슬러리(GE Healthcare, cat# 17-5474-01)를 첨가하고 적당한 교반과 함께 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 수지를 여과에 의해 재포집하고, 4x10mL 젠틀 바인딩 버퍼(Pierce, cat# 21012)로 세척하고, 7x5mL 부피의 젠틀 엘루션 버퍼(Pierce, cat# 21027)로서 용출했다. 분획들을 합하고 4℃에서 3.5L TBS에 대해 한 번의 완충액 교환으로 투석하였다. BCA 분석(Thermo Scientific, cat# 23227)을 수행하여 농도(80μg/mL)를 결정했다.
혈청학 연구:
단백질-A 정제된 AVP8-IgG Fc 단백질은 87.5% 항원 및 12.5% 보조제를 갖는 에멀시젠 D로 제형화되었다. 생후 약 7주령의 돼지는 2mL 용량을 목 옆에 IM으로 투여받았고, 21일 후에 부스트를 투여받았다. 혈청 샘플은 7주 동안 매주 수집되었다. AVP8-IgG Fc 단백질로 백신 접종된 돼지의 혈청을, 하기 기재된 바와 같이 ("ELISA 프로토콜"), ELISA에 의해 평가하였고, 하기 기재된 바와 같이 ("바이러스 중화 분석을 위한 프로토콜") 바이러스 중화 분석에 의해 평가하였다. 비관련 백신 대조군과 비교하여, AVP8-IgG Fc 단백질로 백신접종된 돼지의 IgG ELISA 결과는 SP 비율의 증가가 14일차에 정점에 이르렀고 21일차에 부스트 후 다시 증가하는 것으로 나타났다. 바이러스 중화 역가도 유사하게 7일과 14일차에 증가를 나타냈고 이후 21일차 부스트 후 28일차에 두 번째 최고점을 기록했다.
ELISA 프로토콜
IgA ELISA의 경우, 중간 단백질 결합 96-웰 ELISA 플레이트를 1x PBS 1:16에 희석된 전체 로타바이러스 항원으로 코팅했다. 플레이트를 4℃의 온도에서 밤새 인큐베이팅했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1x PBST를 사용하여 세척한 다음 37℃에서 1시간 동안 카제인 차단 용액으로 차단했다. 세척 후, 차단 완충액에서 1:40의 최종 희석액으로 희석된 100μL의 1차 항체를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 세척 후, 웰을 1:3200으로 희석한 홀스-래디쉬 과산화효소(horse-radish peroxidase, HRP)-접합 염소-항-돼지-IgA 100㎕로 코팅하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 세척 후 플레이트를 실온에서 15분 동안 3,5,3',5'-테트라메틸벤지딘으로 전개하고(develop) 450nm에서 광학 밀도(OD) 측정 전에 1N HCl로 반응을 정지시켰다. 양성 및 음성 대조군을 포함하는 샘플을 복제 웰에서 실행하고 결과를 (샘플 - 음성 대조군)-대-(양성 - 음성 대조군) 비율(S-N) /(P-N)의 평균으로 보고하였다.
IgG ELISA의 경우, 중간 단백질 결합 96-웰 ELISA 플레이트를 1x PBS 1:8에 희석된 전체 로타바이러스 항원으로 코팅했다. 플레이트를 4℃의 온도에서 밤새 인큐베이팅했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 1x PBST를 사용하여 세척한 다음 블로팅 등급 차단 용액으로 37℃에서 1시간 동안 차단했다. 세척 후, 차단 완충액에서 1:625의 최종 희석액으로 희석된 100μL의 1차 항체를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 세척 후, 웰을 1:8000으로 희석한 홀스-래디쉬 과산화효소(HRP)-접합 염소-항-돼지-IgG 100㎕로 코팅하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 세척 후 플레이트를 실온에서 10분 동안 3,5,3',5'-테트라메틸벤지딘으로 전개하고 450nm에서 광학 밀도(OD) 측정 전에 1N HCl로 반응을 정지시켰다. 양성 및 음성 대조군을 포함하는 샘플을 복제 웰에서 실행하고 결과를 (샘플 - 음성 대조군)-대-(양성 - 음성 대조군) 비율(S-N)/(P-N)의 평균으로 보고하였다.
바이러스 중화 분석을 위한 프로토콜
모든 혈청 및 우유 샘플은 56℃에서 30분 동안 열 불활성화되었다. 샘플을 로타바이러스 성장 배지(MEM + 2.5% HEPES + 0.3% 트립토스 인산염 브로스 + 0.02% 효모 + 10μg/mL 트립신)에서 1:40 내지 1:2,560까지 연속 희석했다. 로타바이러스 A 분리물 (역가 7.0 log TCID50/mL)을 로타바이러스 성장 배지에 1:25,000으로 희석했다. 총 200μl의 희석된 혈청을 200μl의 희석된 바이러스에 첨가했다; 그 혼합물을 37℃에서 ± 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 성장 배지는 MA104 세포가 심어진 3-4일 된 96-웰 플레이트에서 무균적으로 제거되었다. 인큐베이션 후, 200㎕의 바이러스-혈청 혼합물을 세포 배양 플레이트로 옮겼다. 세포를 37℃에서 ± 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이팅하였다. 스톡 및 희석된 바이러스는 분석에 사용된 희석을 확인하기 위해 사용 당일에 적정하였다. 인큐베이션 후, 상청액을 버리고 플레이트를 200μL/웰 1X PBS로 1회 세척했다. 고정을 위해 100μL/웰의 50%/50% 아세톤/메탄올을 첨가했다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하고, 공기 건조시킨 다음, 100μL/웰 1X PBS로 재수화시켰다. 1차 항체(토끼 항-로타바이러스 A 다클론 혈청, 내부적으로 생성됨)를 1X PBS에 1:1000으로 희석했다. 100μL/웰의 희석된 1차 항체를 첨가하고 플레이트를 37℃에서 ± 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 100μL/웰의 1X PBS로 2회 세척했다. 2차 항체(Jackson ImmunoResearch FITC 표지 염소-항-토끼 IgG cat# 111-095-003)를 1X PBS에 1:100으로 희석했다. 100μL/웰의 희석된 2차 항체를 첨가하고 플레이트를 37℃에서 ± 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 100μL/웰의 1X PBS로 2회 세척했다. 플레이트를 자외선 현미경을 사용하여 형광의 존재에 대해 판독하였다. 분석은 희석된 바이러스의 역가(Reed-Muench 방법을 사용하여 생성됨)가 2.8 ± 0.5 log TCID50/mL인 것으로 확인된 경우 유효한 것으로 간주되었다. 또한 알려진 양성 및 음성 샘플이 각 분석에 대조군으로 포함되었다. 혈청 역가는 염색이 관찰되지 않은 가장 높은 희석액으로 보고되었다.
실시예 2
공격접종시험 (challenge) 연구:
본 연구의 주요 목적은 본원에서 "IgG:AVP8"이라고도 지칭되는, AVP8-IgG Fc 단백질 (SEQ ID NO:12)을 포함하는 프로토타입 백신 및 본원에서 "위약"으로 지칭되는 비관련 대조군 백신을 기존의 암퇘지에게 투여하는 것이 악성 로타바이러스 A 시험감염에 대해 돼지에게 수동적 보호를 부여하는지 여부를 평가하는 것이었다. 또한, 비교를 위해, 상업적으로 이용 가능한 MLV 로타바이러스 백신(ProSystem® Rota, Merck Animal Health) (본 명세서에서 "상업용 제품" 또는 "상업용 백신"으로도 지칭됨)이 연구에 사용되었다. 프로토타입 백신은 아래 "IgG:AVP8의 제조" 섹션에 설명된 바와 같이 감염에 사용되는 상이한 부피들과 더 긴 인큐베이션 기간을 제외하고는 상기 실시예 1에 설명된 제조와 유사하게 제조되었다. 상업용 제품은 백신 ProSystem® TGE/Rota에 대해 제조업체가 제공한 라벨 지침(복용량 및 사용법, 및 돼지의 경구 백신접종 권장 방법)에 따라 사용되었다.
총 16마리의 암퇘지가 연구에 포함되었다. 암퇘지를 하기 표 1에 기재된 바와 같이 3개의 처리군과 1개의 엄격한 대조군으로 무작위 배정하였다. T02 및 T04의 암퇘지는 3개의 방 사이에서 혼합되었다. T06 및 T07의 암퇘지는 2개의 별도 방에 수용되었다. 모든 암퇘지는 표 1에 나열된 적절한 경로를 통해 적절한 물질로 백신접종을 받았다. T07의 암퇘지는 백신을 접종하지 않은 상태로 유지되었다(엄격한 대조군). 백신접종 기간 동안 주기적으로 암퇘지로부터 혈청을 수집하였고 혈청전환의 증거에 대해 분석하였다. 분만 전에 분변 샘플을 수집하고 RT-qPCR로 스크리닝하여 어미(dam)가 분만 전에 활발하게 로타바이러스를 배출하지 않았는지 확인했다. 일반적인 건강 관찰은 각 암퇘지에 대해 매일 기록되었다. 분만은 암퇘지가 임신 114일에 도달할 때까지 자연적으로 발생하도록 허용되었다. 이 시간 이후에 분만을 유도했다. 새끼 돼지는 분만 시 시험에 등록되었다. 태어날 때 건강한 새끼 돼지만 태그되고, 시설 표준 운영 절차에 따라 처리하고, 시험에 포함시켰다. 돼지가 생후 0 내지 5일령일 때, 채혈하고, 분변 샘플을 수집하고, 돼지를 시험감염시켰다(T07 제외). 시험감염 시점에, 돼지에게 위내 5mL 용량의 중탄산나트륨을 투여한 다음, 위내 5mL 용량의 시험감염 물질을 투여했다. 시험감염 기간 내내, 모든 동물은 장 질환(설사 및 행동 변화)의 존재에 대해 매일 모니터링되었다. 시험감염 기간 동안 분변 샘플을 주기적으로 수집했다. 시험감염 2일 후(DPC 2), 각 새끼 돼지의 약 1/3이 안락사되었다. 안락사 후, 부검을 수행하고 육안적 병변에 대해 돼지를 평가하였다. 현미경 및 면역조직학적 평가를 위해 장관 절편을 수집하였다. RT-qPCR 평가를 위해 장관 샘플을 수집했다. DPC 21에서, 나머지 모든 돼지의 무게를 재고 채혈하고 분변 샘플을 수집했다. 샘플 수집 후, 돼지를 안락사시켰다. 거시적 병변에 대해 돼지를 평가하고 장관 샘플을 수집했다.
표 1: 연구 설계
Figure pct00001
연구 전반에 걸쳐, T07(엄격한 대조군)의 암퇘지에서 혈청 VN 역가는 일정하게 유지되거나 감소하여 노출 부족 및 유효한 연구를 나타내었다 [바이러스 중화는 실시예 1("바이러스 중화 분석에 대한 프로토콜")에 기술된 바와 같이 평가되었으며, 결과는 도 3에 제시됨]. 백신접종 단계 동안, 혈청 중 가장 높은 중앙 VN 역가는 IgG:AVP8(T04) 프로토타입 백신으로 백신접종된 암퇘지에서 관찰되었다. 이 그룹에서 분만 6주 전에 투여된 1회 용량은 D14까지 T04(IgG:AVP8)의 3/5 동물에서 역가가 4배 이상 증가했다. 돼지 시험감염 시기 전에, T04(IgG:AVP8)의 5/5 동물은 역가가 4배 이상 증가했다. 위약 그룹(T02)의 암퇘지는 백신접종 단계 동안 혈청 VN 역가의 유의한 증가(< 2배)가 없었다. T06(상업용 백신)의 암퇘지는 D35까지 혈청 VN 역가에서 유의한 증가(< 2배)가 없었다. 돼지 시험감염 시기 전에, T06(상업용 백신)의 두 암퇘지는 역가가 4배 증가했다. 시험감염 물질에 대한 측면 노출 후, T02(위약) 및 T06(상업용 백신)의 암퇘지에서 VN 혈청 역가가 증가했다. 반대로, T04(IgG:AVP8)의 암퇘지에서 VN 혈청 역가는 4/5 암퇘지에서 일정하게 유지되거나 감소했다. 초유 및 우유 VN 역가와 관련하여, 그룹 T04(IgG:AVP8)에서 VN 역가는 분만 시 가장 높았고, 시험감염 전 샘플에서 감소했으며, 시험감염 후 샘플에서 더욱 감소했다. 위약 그룹(T02)에서, VN 역가는 분만 및 시험감염 전에서 낮았지만 시험감염 물질에 대한 측면 노출 후에는 증가했다.
시험감염 전 돼지 혈청의 VN 역가는 T04(IgG:AVP8)의 대부분의 돼지에서 높았으며(>1280), 이는 암퇘지에서 돼지로 면역이 수동적으로 전이되었음을 나타낸다. 반대로, T02(위약) 및 T06(상업용 백신)에서 돼지의 대부분의 역가는 낮았다(<1280).
시험감염 단계 전체에 걸쳐, T02(위약)에서 가장 높은 사망률이 관찰되었으며 돼지의 8/57(14.0%)이 사망했다. 반대로, T04(IgG:AVP8)에서는 1/46(2.2%)의 돼지만이 사망했고, T06(상업용 백신)에서는 1/22(4.5%)의 돼지가 사망했으며, T07(엄격한 대조군)에서는 1/27(3.7%)의 돼지가 사망했다. 연구 전체에 걸쳐 T07(엄격한 대조군)의 돼지에서 설사의 임상 징후는 관찰되지 않았다. T02(위약)의 돼지에서 설사의 임상 징후는 시험감염 후(DPC) 1일 또는 2일에 시작되었고 대부분의 동물에서 DPC10까지 해결되었다. 전반적으로, 설사의 임상적 징후는 연구 동안 적어도 한 번 T02(위약)의 동물의 44/57(77.2%)에서 관찰되었다. 이 44마리 동물 중 29마리(65.9%)에서 설사가 심각한 것으로 간주되었다. 대조적으로, 설사의 임상 징후는 T04(IgG:AVP8)의 돼지에서 감소되었다. 하기 표 2의 그룹별 임상 설사 결과 요약 참조.
표 2: 그룹별 비정상 설사가 (한번이라도) 있는 동물의 백분율
Figure pct00002
시험감염 전에, 유효한 연구를 나타내는 RT-qPCR에 의한 로타바이러스 A RNA의 검출이 없었다. 또한, 연구 전체에 걸쳐 T07(엄격한 대조군)의 암퇘지 또는 돼지에서 RT-qPCR에 의한 로타바이러스 A RNA의 검출이 없었다. 시험감염 후 돼지에서, 배출(shedding)은 T02(위약)에서 가장 일반적이었다. 대부분의 돼지에서, 배출은 DPC1-3에서 시작하여 DPC14까지 계속되었다. 가장 흥미로운 것은 T02(위약) 및 T06(상업용 백신)과 비교하여 T04(IgG:AVP8)에서 관찰된 배출의 감소였다. 배출 비율과 검출된 RNA의 중간 양은 모두 감소했다 (연구 일자별 분변에서 그룹 중간 로그 로타바이러스 A RNA 게놈 복제물(gc)/mL에 대해서 도 4 참조); 테스트는 아래에 설명된 대로 수행되었다("로타 A qRT-PCR에 대한 프로토콜").
각 그룹에서 무작위로 선택된 돼지 하위집합을 안락사시키고 DPC2에 부검했다. 육안적 장 병변(얇은 벽, 가스 팽창성 소장, 순수한 액체 내용물 등), 현미경적 병변(위축성 장염) 및 면역조직화학(IHC)에 의한 로타바이러스 A 특이적 염색의 존재에 대해 돼지를 평가했다. 하기 표 3은 부검 시 장 병변이 있는 돼지의 수를 그룹별로 나타내었다. 위약 그룹(T02)의 돼지 중 84.2%(16/19)가 육안적 병변을 갖고 그 중 63.2%(12/19)가 염색되었기 때문에 시험감염은 성공적인 것으로 간주되었다. 가장 흥미로운 것은 T04(IgG:AVP8)의 1/15 돼지에서만 동물에서 로타바이러스 A 염색이 없다는 것이다. 또한, T04(IgG:AVP8)에서는 T02(위약) 및 상업용 제품(T06)과 비교하여 육안적 병변이 있는 돼지의 비율이 감소했다.
표 3. 그룹별 부검 시 장 병변 및 IHC 염색이 있는 동물의 백분율.
Figure pct00003
평균 일일 체중 증가(average daily weight gain)는 살아남은 돼지(kg)에 대해 계산되었으며 아래 표 4에 제시되어 있다. T04(IgG:AVP8)의 돼지에서 ADWG의 가장 높은 수치적 이점이 관찰되었다. 백신접종 후 ADWG의 증가는 T02(위약)와 비교하여 상당히 달랐다.
표 4. 그룹별 평균 일일 평균 체중 증가(kg)(표준 편차).
Figure pct00004
결론적으로, IgG:AVP8 프로토타입 백신(SEQ ID NO:12의 폴리펩티드 포함)으로 분만 6주 전 및 2주 전 기존 암퇘지의 백신접종은 암퇘지 혈청 및 초유에서 높은 중화 항체 역가를 초래한다. 이러한 중화 항체는 백신접종된 암퇘지의 돼지 혈청에서 높은 역가(>1280)의 검출에 의해 입증된 바와 같이 출생 후 수동적으로 돼지에게 전달되었다. 돼지에서 높은 중화 항체 역가의 존재는 임상적 보호로 이어진다. 특히, 백신을 접종한 암퇘지에서 태어난 돼지는 위약 대조군 및 상업적으로 이용 가능한 백신에서 태어난 돼지에 비해 로타바이러스 A RNA의 분변 배출 감소, 사망률 감소, 설사의 임상 징후 감소, DPC2에서 로타바이러스 A 콜로니화 감소, DPC2에서 거시적 병변 감소 및 ADWG 증가를 갖는다.
로타 A qRT-PCR 용 프로토콜
분변 샘플에서 로타바이러스 A RNA를 결정하기 위해 정량적 원스텝 RT-PCR 키트(iTaq Universal One-Step RT-PCR 키트; BioRad, 카탈로그 번호 1725140)를 분석에 사용했다. 프라이머 및 프로브 정보는 아래 표 5 참조.
표 5: 프라이머(F/R) 및 프로브(Pr1/Pr2) 정보
Figure pct00005
실시간 RT-PCR은 5μl의 추출된 총 핵산, 1μl의 각 프로브(5μM), 1μl의 각 프라이머(10μM), 10μl의 2X RT-PCR 믹스, 0.5μl의 iScript 역전사 효소 및 0.5μl의 DEPC 처리수를 포함하는 20μl 반응에서 수행되었다. 상기 반응은 다음 조건 하에서 CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(BioRad)을 사용하여 발생했다: 50℃에서 10분 동안 초기 역전사 후, 95℃에서 3분 동안 초기 변성, 95℃에서 15초 동안 40주기 변성 및 60℃에서 45초 동안 어닐링 및 연장. 상대적 정량 데이터를 생성하기 위해 두 개의 로타바이러스 A g-블록의 연속 희석이 각 실행에 포함되었다. 시작 농도로서 5.0x107 게놈 복제본/μL를 사용하여 동일한 양의 각 g-블록이 실행에 포함되었다. 광학 데이터는 CFX 매니저 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 각 결정에 대해, 주기 임계값(Ct) 결정 모드에 대한 회귀 설정을 사용하여 임계값 라인이 자동으로 계산되었다. 기준선 차감(subtraction)은 기준선 차감 모드를 사용하여 자동으로 수행되었다. 기준선 끝 값이 10 미만인 곡선은 수동으로 수정되었다.
IgG:AVP8의 제조
5L 쉐이커 플라스크에서 대략 1x106 세포/mL의 농도로 2L의 Sf+(스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)) 세포를 로타바이러스 A VP8 코어-돼지 IgG Fc 융합 단백질(바큔로골드(BaculoGold(BG))/pVL1393-AVP8-IgG; 1.18x108 TCID50/mL)를 함유하는 1.7mL의 재조합 바큘로바이러스 스톡으로 감염시켰다. 상기 쉐이커 플라스크를 28℃ ± 2℃에서 90rpm으로 일정하게 교반하면서 5일 동안 인큐베이팅했다. 세포 및 배지를 무균 상태로 3x1L 원심분리기 병으로 옮기고 세포를 4℃에서 20분 동안 10,000g으로 펠릿화했다. 생성된 상청액을 0.2μm 필터(Thermo Scientific, cat# 567-0020)에 통과시킨 다음 2.5mL의 MabSelect SuRe LX 단백질 A 수지(GE Healthcare cat# 17-5474-01)와 함께 밤새 4℃에서 적당한 교반으로 인큐베이팅했다. 수지를 0.2μm 여과(Thermo Scientific, cat# 567-0020)로 회수한 다음 12x10mL 부피의 Gentle Ag/Ab 바인딩 완충액(Thermo Scientific, cat# 21012)으로 세척했다. AVP8-IgG는 7x10mL 부피의 Gentle Ag/Ab 용출 완충액(Thermo Scientific, cat# 21027)을 사용하여 수지에서 용출되었다. AVP8-IgG는 3.5L의 20mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl에 대해 한 번의 완충액 교체로 투석되었다. 잔류 바큘로바이러스를 37℃에서 24시간 동안 5mM BEI로 불활성화시켰다. 생성된 물질을 1x PBS(Gibco cat# 10010-023)에서 목표 농도 70μg/mL로 희석했다. 희석된 물질은 12.5% 에멀시젠 D로 제형화되었다.
실시예 3
혈청학 연구:
본 연구의 주요 목적은 AVP8-IgG Fc 단백질 (SEQ ID NO:12)을 포함하는 프로토타입 백신 및 본 명세서에서 "위약"으로 명명된 대조군 백신을 기존 암퇘지에게 투여하는 것이 로타바이러스 A에 대한 혈청학적 반응을 생성하는지 여부를 평가하는 것이었다. 본원에서 "IgG-AVP8"이라고도 하는 프로토타입 백신(보조제로서 에멀시젠 D 또는 카보폴(Carbopol)을 포함함, 하기 표 7A 및 7B 참조)은 상기 실시예 1 및 2에서 기재된 제조와 유사하게 제조되었지만, 하기 "백신 제조: IgG-AVP8" 섹션에 설명된 대로 감염 및 더 긴 인큐베이션에 사용되는 상이한 부피가 사용되었다.
총 20마리의 암퇘지가 연구에 포함되었다. 암퇘지를 하기 표 6에 기재된 바와 같이 4개의 처리군으로 무작위화하였다. 암퇘지는 연구 전반에 걸쳐 혼합되었다. 모든 암퇘지는 표 4에 나열된 바와 같이 D0 및 D21에 근육내로 적절한 물질로 백신접종되었다. 혈청은 연구 전반에 걸쳐 주기적으로 암퇘지로부터 수집되었고 바이러스 중화 분석에 의해 혈청전환의 증거에 대해 분석되었다. 일반적인 건강 관찰은 각 암퇘지에 대해 매일 기록되었다. 연구는 D42에 종료되었다.
표 6: 연구 설계
Figure pct00006
연구 전반에 걸쳐, T06 및 T07(위약 그룹)의 암퇘지에서 혈청 VN 역가는 일정하게 유지되거나 감소하여 노출 부족 및 유효한 연구를 나타내었다 [바이러스 중화는 증가된 희석이 1:40 내지 1:40,960까지로 평가된 변형으로 실시예 1("바이러스 중화 분석을 위한 프로토콜")에 기재된 바와 같이 평가됨]. 백신접종 단계 동안, IgG-AVP8/에멀시젠 D(T02) 및 IgG-AVP8/카보폴(T03) 프로토타입 백신으로 백신 접종된 암퇘지는 역가가 상당히 증가했다 (> 4배). 두 그룹(T02 및 T03)의 경우, 그룹 평균 역가는 1회 백신접종 후 640 이상이었고 연구 기간 내내 640 이상을 유지했다. 대조적으로, 위약 그룹(T06 및 T07)의 암퇘지는 연구 전반에 걸쳐 혈청 VN 역가에서 유의한 증가(< 2배)를 나타내지 않았다.
반대로, IgG-AVP8 프로토타입 백신(SEQ ID NO:12의 폴리펩티드 포함)으로 분만 6주 전 및 2주 전에 기존의 암퇘지를 백신접종하면 암퇘지 혈청에서 높은 중화 항체 역가가 발생합니다.
백신 제조: IgG-AVP8
10L 자르토리우스 비오쉬타트(Sartorius Biostat) B 유리 재킷 용기에서 1.00x10^6 세포/mL의 Sf+ 세포 8L를 MOI 0.22에 대해 15mL의 BG/pVL1393-AVP8-IgG, 1.19x10^8 TCID50/mL로 감염시켰다. 바이오반응기는 100rpm 교반 및 0.3 slpm에서 살포된 산소로 27℃에서 가동되었다. 용기를 6 DPI에서 수확하고 10,000g 및 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 0.8/0.2μm 여과했다 (GE Healthcare, cat# 6715-7582). 2750mL의 정화된 상청액을 27℃에서 5일 동안 5mM BEI로 불활성화시켰다. 잔류 BEI를 티오황산나트륨으로 중화한 후, 2750mL를 10kDa 중공 섬유 필터(GE, cat# UFP-10-C-4MA)를 사용하여 약 12x를 225mL로 농축했다. 농도는 255μg/mL로 측정되었다.
Figure pct00007
실시예 4
이 연구의 주요 목적은 IgG-AVP8 (AVP8-IgG Fc 단백질 (SEQ ID NO:12) 포함)로 백신 접종된 동물이 AVP8-IgG Fc 단백질이 설계된 것으로부터 P[7]보다 다양한 G 및 P 유형의 다양한 로타바이러스 A 혈청형/유전자형을 교차 중화할 수 있는지 여부를 평가하는 것이었다. 이것은 AVP8-IgG Fc 단백질 (SEQ ID NO:12)이 다른 분리물에 대하여 보호될 수 있는 능력을 나타낼 것이다.
간략히 설명하면, IgG-AVP8로 백신접종한 돼지의 열 불활성화 혈청을 A행에서 G행까지의 희석 블록의 MEM에서 1:200부터 시작하여 2배 희석했다. H행은 혈청을 함유하지 않았다. 별도의 희석 블록에서, 다양한 G 및 P 유형의 로타바이러스 A를 컬럼 1에서 컬럼 11까지 6.0 Log10 TCID50/mL에서 시작하여 희석 플레이트를 가로질러 1.5배 희석했다. 컬럼 12에는 바이러스가 포함되지 않았다. 해당 웰의 바이러스 250μL와 혈청 250μL를 합치고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 1시간 인큐베이션 후, 100μL의 바이러스-혈청 혼합물을 MA104 세포의 단일층에 오버레이하고 37℃에서 72시간 동안 인큐베이팅하고 IFA로 염색하고 바이러스의 존재를 판독했다. 바이러스가 있는 경우는 플레이트에 '+'로, 바이러스가 없는 경우는 '0'으로 기록하였다. 그런 다음 이 결과를 표 8로 옮겼다.
다음 6개의 로타바이러스 A 분리물이 이 분석과 비교되었다; G9P[7], G9P[23], G4P[23], G3P[7], G5P[7] 및 G4P[7]. 표 1의 결과는 P 유형 P[23]이 P[7]을 교차 중화함을 나타낸다. P[7] 또는 P[23]을 포함하는 모든 G 유형도 중화되었으며, 이는 이 분석에서 G 유형이 바이러스의 중화에 중요하지 않음을 나타낸다.
표 8: 연구 설계 및 결과
Figure pct00008
Figure pct00009
결론적으로, IgG-AVP8 (AVP8-IgG Fc 단백질(SEQ ID NO:12) 포함)로 백신접종된 동물은 로타바이러스 유전자형 P[7] 및 P[23]을 교차 중화시킬 것이다. G형은 바이러스의 중화에 큰 역할을 하지 않았다.
실시예 5
돼지 컨셉트 실험 증명:
총 40마리의 동물이 이 연구에 사용되었다. 돼지는 그룹당 10마리의 돼지로 4개의 처리군으로 무작위 배정되었다. 돼지는 연구 전반에 걸쳐 혼합된다. 동물의 건강을 확인하고, 로타바이러스 A에 대한 기준선 혈청학적 반응을 결정하고, 백신 접종 전 또는 그 시점에 활성 로타바이러스 A 감염이 없음을 확인하기 위해 일반 건강 관찰, 사전 스크리닝 혈청 샘플 및 사전 스크리닝 분변 샘플을 치료 전에 채취하였다. 연구 0(D0)에서, 동물은 하기 물질로 근육내로 백신접종된다: T01: IgG-P[7]AVP8 백신(SEQ ID NO:12의 폴리펩티드 포함), T02: IgG-P[13]AVP8 백신(SEQ ID NO:14의 폴리펩티드 포함), T03: P[7]AVP8-IgG-P[13]AVP8 백신(SEQ ID NO:16의 폴리펩티드 포함), T04: 위약. 연구 0, 7, 14, 21, 28, 36, 42 및 49일차에 혈청 샘플을 채취했다. 모든 동물은 부검 시 연구 D49에서 인도적으로 안락사시켰다. 혈청 샘플은 시간 경과에 따른 백신 프로토타입에 대한 혈청학적 반응을 결정하기 위해 바이러스 중화 분석으로 테스트된다. T01로 백신을 접종한 동물은 로타바이러스 유전자형 P[7] 및 P[23]을 중화하는 항체를 갖고, T02로 백신을 접종한 동물은 로타바이러스 유전자형 P[13]를 중화시키는 항체를 갖고, T03으로 백신을 접종한 동물은 로타바이러스 유전자형 P[7], P[13] 및 P[23]을 중화시키는 항체를 가진다.
실시예 6
SDS PAGE:
DTT가 있거나 없는 단백질 A 정제된 AVP8-IgG Fc 단백질(SEQ ID NO:12) 생성물의 SDS-PAGE (도 5a): SDS-PAGE 이미지를 위한 샘플을 생성하는 방법은 간략히 다음과 같다: 바큘로바이러스 수확 상청액을 37℃에서 36시간 동안 10mM BEI로 불활성화시킨 다음 중화시켰다. 그런 다음 단백질 A 수지를 사용하여 샘플을 정제했다. 그런 다음 모든 샘플을 25mM DTT(최종) 또는 동일한 부피의 물과 함께 NuPAGE 4x LDS 샘플 완충액(Invitrogen cat# NP0007)을 사용하여 변성시키고 95℃에서 10분 동안 가열했다. 샘플을 4-12% SDS-PAGE 겔(Invitrogen cat# NP0335BOX)에서 180V에서 45분 동안 실행하고 염색했다(eStain L1, GenScript cat# M00548-1; destain cat# M00549-1).
그 결과, 감소된(+DTT(Dithiothreitol)) 샘플을 사용한 레인 런(lane run)에서 주로 하나의 밴드(모노머 AVP8-IgG Fc 단백질, 이는 하기 기재된 웨스턴 블롯의 결과와 함께 고려됨)가 확인되었다. 감소되지 않은 샘플(-DTT)을 사용한 레인 런에서 추가 밴드가 나타났다. 추가 밴드는 각각 단량체의 배수인 분자량 범위 내에 있었다.
웨스턴 블롯:
항-돼지 IgG Fc 단편 웨스턴 블롯(도 5b): 바이오반응기에서 생성된 AVP8-IgG Fc 단백질(SEQ ID NO:12) 생성물을 BEI 첨가 전에 1mL 샘플로 수확하였다. 샘플을 20,000g 및 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 새 튜브로 옮기고, 펠릿과 상청액 둘 모두 -70℃에 보관했다. 펠렛과 상청액을 해동하고, 펠렛을 1mL의 8M 우레아에 재현탁한 다음, 동량의 펠렛과 상청액을 환원 조건(+DTT) 하에서 SDS-PAGE에서 실행하고, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. HRP 접합된 염소 항-돼지의 1:1000 희석액으로 웨스턴 블롯을 탐침하여 돼지 IgG Fc 단편을 검출하였다.
그 결과, 예상외로 세포 펠릿 샘플에서 AVP8-IgG Fc 단백질이 전혀 보이지 않았다. 대신 모든 AVP8-IgG Fc 단백질(SEQ ID NO:12)이 세포 배양 상청액 샘플에서 유리하게 발견되었다.
실시예 7
공통 서열의 생성:
SEQ ID NO:4(유전자형 P[6] 로타바이러스 VP8 단백질 기반) 및 SEQ ID NO:5(유전자형 P[13] 로타바이러스 VP8 단백질 기반)의 공통 서열을 하기 설명과 같이 생성했다.
서열은 NCBI 바이러스 변이 데이터베이스로부터 공개적으로 이용가능한 돼지 로타바이러스 VP4 뉴클레오티드 서열 및 내부적으로 유도된 로타바이러스 분리 서열로부터 종합되었다. 분리명, 분리 P-유형, 지리적 기원 및 가능한 경우 분리 날짜에 대한 메타데이터를 포함하여 시퀀스에 대한 추가 메타데이터도 종합되었다. 뉴클레오티드 서열을 단백질 서열로 번역하고, MUSCLE 서열 정렬 소프트웨어 UPGMB 클러스터링 및 디폴트 갭 페널티 파라미터를 사용하여 알려진 VP8 단백질에 정렬했다. 정렬되지 않은 VP5 아미노산은 트리밍되고 폐기되었다. VP8 정렬된 단백질 서열은 계통발생학적 분석을 위해 MEGA7 소프트웨어로 가져왔고 VP8 단백질 서열에 기초하여 계통발생 재구성에 이웃 결합이 생성되었다. 최적의 트리는 계통 발생(n=100)의 부트스트랩 테스트와 함께 포아송 보정 방법을 사용하여 계산되었으며 총 170개 위치에 걸쳐 부위당 아미노산 치환 단위의 진화 거리와 동일한 가지 길이로 규모에 맞게 드로잉되었다. 부트스트랩 클러스터 연결이 70%보다 큰 노드는 중요한 것으로 간주되었다. 거리가 약 10%이고 부트스트랩 클러스터 연결이 70%보다 큰 노드를 클러스터로 지정했다. 큰 클러스터에 맞지 않는 이상값 서열은 서열 품질 및 P 유형 기원에 대해 개별적으로 평가되었다. 돼지 로타바이러스에서 거의 관찰되지 않는 P-유형의 서열이 유지되는 동안 의심되는 낮은 품질의 서열은 분석에서 제거되었다. 공통 서열을 생성하는 데 사용되는 클러스터는 원하는 생성물 보호 프로파일 및 체외 혈청 교차 중화 연구를 기반으로 선택되었다. 공통 서열은 정렬된 위치당 최대 빈도로 생성되었으며, 동일한 비율의 아미노산이 정렬된 위치에서 관찰된 경우, 아미노산 잔기는 생성물 보호 프로필과 함께 보고된 역학 데이터를 기반으로 선택되었다.
실시예 8
시험감염 연구:
본 연구의 주요 목적은, 본원에서 "IgG#AVP8"이라고도 지칭되는, AVP8-IgG Fc 단백질 (SEQ ID NO:12)을 포함하는 프로토타입 백신 및 본원에서 "위약"으로 지칭되는 비관련 대조군 백신을 기존의 어미에게 투여하는 것이 악성 로타바이러스 A 시험감염에 대하여 돼지에게 수동적 보호를 부여하는지 여부를 평가하는 것이었다. 프로토타입 백신은 하기 "IgG#AVP8의 제조" 섹션에 기재된 바와 같이 감염에 사용된 상이한 부피와 상이한 정제 방법을 제외하고는 상기 실시예 1에 기재된 제조와 유사하게 제조되었다.
총 20마리의 어미가 연구에 포함되었다. 어미는 하기 표 9에 기재된 바와 같이 2개의 처리군과 1개의 엄격한 대조군으로 무작위화되었다. T01과 T03의 어미는 3개의 방 사이에 섞여 있었다. T07의 어미는 별도의 방에 보관되었다. 모든 어미는 표 9에 열거된 적절한 경로에 의해 적절한 물질로 백신접종되었다. T07의 어미는 백신접종되지 않은 상태로 유지되었다(엄격한 대조군). 백신접종 기간 동안 주기적으로 어미로부터 혈청을 수집하고 혈청전환의 증거에 대해 분석하였다. 분만 전에 분변 샘플을 수집하고 RT-qPCR로 스크리닝하여 어미가 분만 전에 활발하게 로타바이러스를 배출하지 않았는지 확인했다. 일반적인 건강 관찰은 각 암퇘지에 대해 매일 기록되었다. 분만은 암퇘지가 임신 114일에 도달할 때까지 자연적으로 발생하도록 허용되었다. 이 시간 이후에 분만을 유도했다. 새끼 돼지는 분만 시 시험에 등록되었다. 태어날 때 건강한 새끼 돼지만 태그되었고, 시설 표준 운영 절차에 따라 처리하고, 시험에 포함시켰다. 돼지가 생후 1일 내지 5일령일 때 채혈하고, 분변 샘플을 수집하고, 돼지를 시험감염시켰다(T07 제외). 시험감염 시점에 돼지에게 위내 5mL 용량의 중탄산나트륨을 투여한 다음, 위내 1mL 용량의 시험감염 물질을 투여했다. 시험감염 기간 전반에 걸쳐, 모든 동물을 장 질환(설사 및 행동 변화)의 존재에 대해 매일 모니터링했다. 시험감염 1일 후(DPC1) 분변 샘플을 수집하였다. DPC2에, T01 및 T03의 모든 돼지를 안락사시켰다. 현미경 및 면역조직학적 평가를 위해 장관 절편을 수집하였다.
표 9: 연구 설계
Figure pct00010
연구 전반에 걸쳐, T07(엄격한 대조군)의 어미에서 혈청 VN 역가는 4배 미만으로 증가하였고 이는 노출 부족 및 유효한 연구를 나타내고(바이러스 중화는 실시예 1("바이러스 중화 분석을 위한 프로토콜")에 기재된 바와 같이 평가되었다), 결과는 표 10 및 도 6에 나타내었다. 백신접종 단계 동안, 프로토타입 백신 IgG#AVP8로 백신접종된 어미(그룹 T03)에서 혈청 중 가장 높은 평균 VN 역가가 관찰되었다. 이 그룹에서, 분만 6주 전에 투여된 1회 용량은 D14까지 T03(IgG#AVP8)의 6/8 동물에서 역가가 4배 이상 증가하는 결과를 낳았다. 그룹 T01(위약)의 어미는 백신접종 단계 동안 혈청 VN 역가가 유의하게 증가하지 않았다(< 2배). 어미 초유 VN 역가: 그룹 T03(IgG#AVP8)의 어미는 그룹 T01(위약)의 어미와 비교하여 더 높은 평균 VN 역가를 가졌다.
표 10: VN 결과
Figure pct00011
시험감염 전 돼지 혈청의 VN 역가는 그룹 T03(IgG#AVP8)의 대부분의 돼지에서 높았으며(>1280) 면역력이 어미에서 돼지로 수동적으로 전이되었음을 나타낸다. 반대로, T02(위약)의 돼지에서 대부분의 역가는 낮았다(<1280).
그룹 T01(위약) 및 T03(IgG#AVP8)에서 돼지는 면역조직화학(IHC)에 의해 적어도 하나의 장관 섹션에서 로타바이러스 항원이 검출되고 동물이 시험감염 후 적어도 하루 동안 비정상 분변 점수를 갖는 경우, 영향을 받은 것으로 정의되었다. 빈도 분포는 아래 표 11에 나열되어 있다. 이 사례 정의의 사용에 기초하여, 프로토타입 백신 IgG#AVP8(그룹 T03)로 분만 6주 전 및 2주 전에 어미를 백신접종하면 이종 로타바이러스 AP[7] 시험감염 물질로 시험감염한 후 돼지의 로타바이러스 관련 질병을 예방했다; 예방 분율 0.926, 95% 신뢰구간 0.734, 0.979.
표 11. 사례 정의의 빈도 분포
Figure pct00012
결론적으로, 분만 6주 전 및 2주 전에 기존 어미에 프로토타입 백신 IgG#AVP8(SEQ ID NO:12의 폴리펩타이드를 포함)을 백신접종하면 암퇘지 혈청과 초유에서 높은 중화 항체 역가를 초래한다. 이러한 중화 항체는 백신 접종된 어미 돼지의 혈청에서 높은 역가(>1280)의 검출에 의해 입증된 바와 같이 출생 후 수동적으로 돼지에게 전달되었다. 돼지에서 높은 중화 항체 역가의 존재는 임상적 보호로 이어진다. 구체적으로, 위약 대조군에서 태어난 돼지에 비해 영향을 받는 것으로 간주되는 백신접종된 어미에서 태어난 돼지의 수가 적다.
IgG#AVP8의 제조
2개의 10L 자르토리우스 비오쉬타트 B 유리 재킷 용기에 1.00x10^6 세포/mL의 Sf+ 세포 3L를 접종했다. 심은지 3일 후, 각 용기를 0.1의 MOI로 감염시키고 각 용기의 부피를 Ex-cell 420 무혈청 배지(SAFC cat# 14420C-1000mL)를 사용하여 8L로 조정하였다. 바이오반응기는 27℃에서 100rpm 교반으로 작동되었으며, 용존 산소는 40% 또는 그 이상으로 설정되었고, CCA 오버레이는 1.3 slpm이었다. 용기는 접종 7일 후 수확되었고; 유체를 10,000g에서 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 0.8/0.2μm 여과했다(GE Healthcare, cat# 6715-7582). 정화된 상청액(8L/용기)을 자르토리우스 비오쉬타트 B 유리 재킷 용기에서 37℃에서 3일 동안 5mM BEI로 비활성화했다. 비활성화 후, 잔류 BEI를 티오황산나트륨으로 중화시켰다. 중화 후, 7000mL를 10kDa 중공 섬유 필터(GE, cat# UFP-10-C-5A)를 사용하여 약 10x를 700mL로 농축했다. 농축된 물질이 1x PBS 5부피(3500mL)로 다이아필터되었다(diafiltrated). 백신은 12.5% 에멀시젠 D, 28% 농축 물질 및 59.5% 1x PBS(부피:부피)로 제형화되었다.
실시예 9
돼지 컨셉트 실험 증명:
총 20마리의 동물이 이 연구에 사용되었다. 돼지는 그룹당 10마리의 돼지를 갖는 2개의 처리군으로 무작위 배정되었다. 돼지는 연구 내내 혼합된다. 동물의 건강을 확인하고, 로타바이러스 C에 대한 기준선 혈청학적 반응을 결정하고, 백신 접종 전 또는 그 시점에 활성 로타바이러스 C 감염이 없음을 확인하기 위해 일반 건강 관찰, 사전 스크리닝 혈청 샘플 및 사전 스크리닝 분변 샘플을 치료 전에 채취하였다. 연구 0일(D0) 및 D28일에 동물에게 하기 물질을 근육내로 백신접종하였다: T01: IgG-CVP8 백신(SEQ ID NO:15의 폴리펩티드 포함), T02: 위약. 연구 0, 7, 14, 21, 28, 36 및 42일차에 혈청 샘플을 채취하였다. 모든 동물은 부검 시 연구 D42에 인도적으로 안락사시켰다. 혈청 샘플은 시간 경과에 따른 백신 프로토타입에 대한 혈청학적 반응을 결정하기 위해 ELISA에 의해 테스트되었다. T01로 백신을 접종한 동물은 T02로 백신을 접종한, 역가가 증가하지 않은 동물 보다 로타바이러스 C 에 대한 평균 항체 수치가 더 높다.
서열 목록 / 소스 및 지리적 출처(해당하는 경우):
SEQ ID NO:1은 미국 노스캐롤라이나주의 한 농장에서 공급되는 (유전자형 P[7]) 로타바이러스 VP8 단백질의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:2는 미국 노스캐롤라이나주의 한 농장에서 공급되는 (유전자형 P[7]) 로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴 유사 도메인의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:3은 미국 노스캐롤라이나주의 한 농장에서 공급되는 (유전자형 P[7]) 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:4는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 서열, 즉 로타바이러스 VP8 단백질 일부의 공통 서열 (유전자형 P[6]에 기초함)에 해당하며,
SEQ ID NO:5는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 서열, 즉 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 공통 서열 일부의 공통 서열 (유전자형 P[13]에 기초함)에 해당하며,
SEQ ID NO:6은 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:7은 돼지 IgG Fc 단편의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:8은 기니피그 IgG Fc 단편의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:9는 링커 모이어티의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:10은 링커 모이어티의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:11은 링커 모이어티의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:12는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 폴리펩티드(융합 단백질)의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:13은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 폴리펩티드(융합 단백질)의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:14는 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 폴리펩티드(융합 단백질)의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:15는 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9 및 SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 폴리펩티드(융합 단백질)의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:16은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:5의 서열을 포함하는 폴리펩티드(융합 단백질)의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:17은 SEQ ID NO:12의 폴리펩티드(융합 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:18은 SEQ ID NO:13의 폴리펩티드(융합 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:19는 SEQ ID NO:14의 폴리펩티드(융합 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:20은 SEQ ID NO:15의 폴리펩티드(융합 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:21은 SEQ ID NO:16의 폴리펩티드(융합 단백질)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열에 해당하며,
SEQ ID NO:22 내지 SEQ ID NO:25 : 프라이머 및 프로브 서열(표 5).
다음 항목들도 본원에 개시된다. 따라서, 본 개시내용은 하기 항목들에 의해 특징지어지는 측면을 추가로 포함한다 :
1. 하기를 포함하는, 폴리펩티드:
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 및
- 면역 글로불린 Fc 단편.
2. 항목 1에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되거나,
또는 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단에 연결되는 것인, 폴리펩티드.
3. 항목 1 또는 2에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 링커 모이어티를 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되거나,
또는 상기 면역글로불린 Fc 단편은 링커 모이어티를 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단에 연결되는 것인, 폴리펩티드.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 면역원성 단편의 C-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되거나,
또는 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 아미노산 잔기와 상기 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 면역원성 단편의 N-말단에 연결되는 것인, 폴리펩티드.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되는 것인, 폴리펩티드.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 여기서 상기 면역글로불린 Fc 단편은 링커 모이어티를 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되거나,
또는 상기 면역글로불린 Fc 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 상기 면역원성 단편의 C 말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 면역원성 단편의 C-말단에 연결되는 것인, 폴리펩티드.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 융합 단백질인, 폴리펩티드.
8. 폴리펩티드, 특히 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 화학식 x-y-z의 융합 단백질이고, 여기서
x는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편으로 이루어지며;
y는 링커 모이어티이고; 그리고
z는 면역글로불린 Fc 단편인, 폴리펩티드.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 면역원성 단편이 투여되는 대상체에서 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 것인, 폴리펩티드.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 길이가 50개 내지 200개, 바람직하게는 140개 내지 190개 아미노산 잔기인, 폴리펩티드.
11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스는 돼지 로타바이러스인, 폴리펩티드.
12. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스는 로타바이러스 A 및 로타바이러스 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스는 로타바이러스 A인, 폴리펩티드.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴 유사 도메인을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 N-말단 연장된 렉틴-유사 도메인이고, 여기서 N-말단 연장은 길이가 1개 내지 20개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 5개 내지 15개의 아미노산 잔기인, 폴리펩티드.
16. 항목 14 또는 15에 있어서, 로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴-유사 도메인은 로타바이러스 VP8 단백질의 아미노산 잔기 65-224의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
17. 항목 15 또는 16에 있어서, 상기 N-말단 연장부의 아미노산 서열은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 아미노산 서열에서 렉틴-유사 도메인의 N-말단 아미노산 잔기 측면에 있는 각각의 길이의 아미노산 서열인, 폴리펩티드.
18. 항목 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은
로타바이러스 VP8 단백질의 아미노산 잔기 60-224, 아미노산 잔기 59-224, 아미노산 잔기 58-224, 아미노산 잔기 57-224, 아미노산 잔기 56-224, 아미노산 잔기 55-224, 아미노산 잔기 54-224, 아미노산 잔기 53-224, 아미노산 잔기 52-224, 아미노산 잔기 51-224, 아미노산 잔기 50-224, 또는 아미노산 잔기 49-224의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
19. 항목 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 아미노산 잔기 57-224의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
20. 항목 16 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 넘버링은 야생형 로타바이러스 VP8 단백질, 특히 야생형 로타바이러스 A VP8 단백질의 아미노산 서열을 지칭하고, 상기 야생형 로타바이러스 VP8은 바람직하게는 SEQ ID NO:1에 제시된 단백질인, 폴리펩티드.
21. 항목 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스는 유전자형 P[7] 로타바이러스, 유전자형 P[6] 로타바이러스 및 유전자형 P[13] 로타바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드.
22. 항목 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질은 SEQ ID NO:1의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
23. 항목 14 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 렉틴-유사 도메인은 SEQ ID NO:2의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
24. 항목 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:3의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
25. 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 일부, 특히 로타바이러스 A VP8 단백질의 일부의 공통 서열로 이루어지거나 또는 그 공통 서열이고,
여기서 상기 로타바이러스 VP8 단백질 일부의 상기 공통 서열은 바람직하게는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는 것인, 폴리펩티드:
- 로타바이러스 VP8 단백질의 일부를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 아미노산 서열로 번역하는 단계,
- 바람직하게는 MUSCLE 서열 정렬 소프트웨어 UPGMB 클러스터링 및 디폴트 갭 페널티 파라미터를 사용하여 상기 아미노산 서열을 공지된 로타바이러스 VP8 단백질에 정렬하는 단계,
- 상기 정렬된 서열을 계통발생학적 분석에 적용하고 로타바이러스 VP8 단백질 서열에 기초하여 이웃 결합 계통발생 재구성을 생성하는 단계로서, 특히 계통 발생학적 분석을 위해 상기 정렬된 아미노산 서열을 MEGA7 소프트웨어로 가져오고 로타바이러스 VP8 단백질 서열에 기초하여 이웃 결합 계통발생 재구성을 생성하는 단계,
- 계통발생의 부트스트랩 테스트(n=100)와 함께 푸아송 보정 방법을 사용하여 최적의 트리를 계산하는 단계,
- 총 170개 위치에 걸쳐 부위당 아미노산 치환 단위의 진화 거리와 동일한 분지 길이로 연장하기 위한 최적의 트리를 드로잉하는 단계,
- 부트스트랩 클러스터 연결이 70% 이상인 노드를 유의미한 것으로 간주하는 단계,
- 약 10%의 거리와 70%보다 큰 부트스트랩 클러스터 연결을 갖는 노드를 클러스터로 지정하는 단계,
- 클러스터를 선택하고 상기 클러스터 내에서 정렬된 위치당 최대 빈도를 식별하여 공통 서열을 생성하는 단계,
- 및 선택적으로, 동일한 비율의 아미노산이 정렬된 위치에서 관찰되는 경우, 미리 정의된 생성물 보호 프로파일과 함께 보고된 역학 데이터를 기반으로 아미노산 잔기를 선택하는 단계.
26. 항목 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ 4 및 SEQ ID NO:5로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
27. 항목 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스는 로타바이러스 C인, 폴리펩티드.
28. 항목 1 내지 27에 있어서, 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:6의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
29. 항목 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은
- 항목 9 내지 24 중 어느 하나 이상에 명시된 바와 같은 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편, 또는
- 항목 9 내지 13, 25, 및 26 중 어느 하나에 명시된 바와 같은 로타바이러스 VP8 단백질의 일부, 특히 로타바이러스 A VP8 단백질의 일부의 공통 서열, 또는
- 항목 9 내지 12, 27, 및 28 중 어느 하나에 명시된 바와 같은 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편이거나 또는 그로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
30. 항목 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
31. 항목 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 길이가 적어도 220개 아미노산 잔기, 바람직하게는 길이가 220개 내지 250개 아미노산 잔기이고,
및/또는 여기서 상기 면역글로불린 Fc 단편은 글리코실화되지 않은(non-glycosylated) 것인, 폴리펩티드.
32. 항목 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3), 및 선택적으로 면역글로불린의 힌지 영역 또는 상기 힌지 영역의 일부를 포함하거나 그로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
33. 항목 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린은 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드.
34. 항목 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 장관 세포가 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편이 유래된 로타바이러스에 의한 감염에 민감한 종의 게놈에 의해 암호화된 면역글로불린 Fc 단편인, 폴리펩티드.
35. 항목 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 돼지 IgG Fc 단편인, 폴리펩티드.
36. 항목 1 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
37. 항목 3 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커 모이어티는 길이가 1개 내지 50개의 아미노산 잔기인 아미노산 서열인, 폴리펩티드.
38. 항목 3 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 링커 모이어티는 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 66%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
39. 항목 5 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기의 측면에 있는 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는 것인, 폴리펩티드.
40. 항목 5 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결된 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편을 포함하는 것인, 폴리펩티드.
41. 폴리펩티드, 특히 항목 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서,
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편(1),
- 면역글로불린 Fc 단편, 및
- 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편(2)을 포함하고,
여기서 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 면역원성 단편(1)의 C-말단에 연결되고,
상기 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 추가 면역원성 단편(2)은 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결되는, 폴리펩티드.
42. 항목 40 또는 41에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은
- 항목 9 내지 24 중 하나 이상에 명시된 바와 같은 로타바이러스 A VP8 단백질의 면역원성 단편; 또는
- 항목 9 내지 13, 25 및 26 중 임의의 하나 이상에 명시된 바와 같은 로타바이러스 VP8 단백질의 일부, 특히 로타바이러스 A VP8 단백질의 일부의 공통 서열; 또는
- 항목 9 내지 12, 27 및 28 중 임의의 하나 이상에 명시된 바와 같은 로타바이러스 C VP8 단백질의 면역원성 단편이거나 또는 그로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
43. 항목 40 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 SEQ ID NO:2 내지 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어지고,
및/또는 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 C-말단이 상기 면역글로불린 Fc 단편에 연결된 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편과 상이한 것인, 폴리펩티드.
44. 항목 40 내지 43 중 어느 하나에 있어서,
상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 링커 모이어티를 통해 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결되고, 여기서 상기 링커 모이어티는 바람직하게는 항목 37 또는 38에 명시된 바와 같은 링커 모이어티이거나,
또는 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결되는 것인, 폴리펩티드.
45. 항목 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 특히 항목 9 내지 30 중 임의의 하나 이상에 명시된 바와 같은 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편,
- 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기 측면에 있는 N-말단 메티오닌 잔기, 및
- 면역글로불린 Fc 단편, 특히 항목 31 내지 36 중 임의의 하나 이상에 명시된 바와 같은 면역글로불린 Fc 단편
(여기서 상기 면역글로불린 Fc 단편은 특히 링커 모이어티를 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되며, 상기 링커 모이어티는 바람직하게는 항목 37 또는 38에 명시된 링커 모이어티이다),
- 및 선택적으로, 특히 링커 모이어티를 통해, 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결된 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편 (여기서 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 바람직하게는 항목 41 내지 44의 임의의 하나 이상에 명시된 바와 같은 추가 면역원성 단편이고, 여기서 상기 링커 모이어티는 바람직하게는 항목 37 또는 38에 명시된 바와 같은 링커 모이어티이다)으로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
46. 항목 1 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어진 단백질인, 폴리펩티드.
47. 항목 1 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 재조합 단백질, 특히 재조합 바큘로바이러스 발현 단백질인, 폴리펩티드.
48. 항목 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제2의 동일한 폴리펩티드와 동종이량체를 형성하는 것인, 폴리펩티드.
49. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 다수 포함하거나 그로 이루어진 다량체로서, 상기 다량체는 바람직하게는 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드와 제2의 동일한 폴리펩티드에 의해 형성된 동종이량체인, 다량체.
50. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 및/또는 항목 49의 다량체를 포함하는, 면역원성 조성물.
51. 항목 50에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 약제학적 또는 수의학상 허용되는 담체 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
52. 항목 50 또는 51에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 보조제를 추가로 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
53. 하기를 포함하거나 또는 하기로 이루어진 면역원성 조성물:
- 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 및/또는 항목 49의 다량체, 및
- 약제학적- 또는 수의학상- 허용되는 담체 또는 부형제,
- 및 선택적으로 보조제.
54. 항목 52 또는 53에 있어서, 상기 보조제는 유화된 수중유 보조제인, 면역원성 조성물.
55. 항목 52 또는 53에 있어서, 상기 보조제는 카보머인, 면역원성 조성물.
56. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
57. 항목 56에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
58. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 플라스미드, 바람직하게는 발현 벡터.
59. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 바람직하게는 발현 벡터를 포함하는 세포.
60. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바큘로바이러스.
61. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 바큘로바이러스를 포함하는 세포, 바람직하게는 곤충 세포.
62. 약제, 바람직하게는 백신의 제조용인 하기의 용도:
- 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드,
- 항목 49의 다량체,
- 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물,
- 항목 56 또는 57의 폴리뉴클레오티드,
- 항목 58의 플라스미드,
- 항목 60의 바큘로바이러스, 및/또는
- 항목 59 또는 61의 세포.
63. 약제로서 사용하기 위한 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
64. 백신으로서 사용하기 위한 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
65. 대상체에서 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
66. 대상체에서 로타바이러스 감염에 의해 야기되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 또는 또는 대상체에서 로타바이러스에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물.
67. 항목 65 또는 66에 있어서, 상기 대상체는 포유동물 또는 새이고, 새는 바람직하게는 닭인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물.
68. 항목 65 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 포유동물이고, 상기 포유동물은 바람직하게는 돼지 또는 소인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물.
69. 항목 65 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 돼지이고, 상기 돼지는 바람직하게는 새끼 돼지 또는 암퇘지인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물.
70. 항목 65에 있어서, 상기 대상체는 임신한 암퇘지인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물.
71. 항목 66에 있어서, 상기 대상체는 새끼 돼지인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물.
72. 새끼 돼지에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물로서, 여기서 상기 새끼 돼지는 상기 면역원성 조성물을 투여받은 암퇘지에 의해 젖을 먹는 것인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물.
73. 항목 72에 있어서, 상기 면역원성 조성물을 투여받은 암퇘지는 특히 상기 새끼 돼지를 임신한 동안 상기 면역원성 조성물을 투여받은 암퇘지인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물.
74. 로타바이러스 감염의 치료 또는 예방, 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출의 감소, 예방 또는 치료, 또는 로타바이러스 감염으로 인해 야기되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 방법으로서, 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
75. 암퇘지에서 로타바이러스에 특이적인 항체의 생산을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 암퇘지에게 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
76. 새끼 돼지에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법으로서,
- 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 암퇘지에 투여하는 단계, 및
- 상기 새끼 돼지가 상기 암퇘지에 의해 젖을 먹도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
77. 항목 76에 있어서, 상기 암퇘지는 특히 상기 새끼 돼지를 임신한 암퇘지인, 방법.
78. 항목 76 또는 77에 있어서,
- 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 상기 새끼 돼지를 임신한 암퇘지에게 투여하는 단계,
- 상기 암퇘지가 상기 새끼 돼지를 출산하도록 허용하는 단계, 및
- 상기 새끼 돼지가 상기 암퇘지에 의해 젖을 먹도록 하는 단계를 포함하는, 방법.
79. 새끼 돼지에서 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키는 방법으로서, 상기 새끼 돼지는 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 투여받은 암퇘지에 의해 젖을 먹도록 하는 것인, 방법.
80. 항목 66 내지 73 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물 또는 항목 74 내지 79 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 상기 하나 이상의 임상 징후는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물 또는 방법:
- 설사,
- 로타바이러스 콜로니화,
- 병변, 특히 거시적 병변,
- 일일 평균 체중 증가율 감소 및
- 위장염.
81. 항목 80에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물 또는 항목 80의 방법으로서, 상기 로타바이러스 콜로니화는 장관의 로타바이러스 콜로니화이고/이거나 상기 병변은 장 병변인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물 또는 방법.
82. 항목 65 내지 73, 80 및 81 중 어느 하나에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물, 또는 항목 74 내지 81 중 어느 하나의 방법으로서,
- 상기 로타바이러스 감염은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염이거나,
- 상기 로타바이러스에 의한 감염은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염이거나,
- 상기 로타바이러스에 대한 면역 반응은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 대한 면역 반응이거나, 또는
- 상기 로타바이러스에 특이적인 항체는 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 특이적인 항체인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물 또는 방법.
83. 항목 82에 따른 폴리펩티드로서, 여기서 상기 폴리펩티드는 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP 8 단백질의 면역원성 단편을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 바람직하게는 항목 21 내지 26 및 29 내지 48 중 어느 하나에 명시된 폴리펩티드인, 폴리펩티드.
84. 항목 82에 따른 면역원성 조성물 또는 방법으로서, 상기 면역원성 조성물은 항목 21 내지 26 및 29 내지 48 중 어느 하나에 명시된 폴리펩티드를 포함하고, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편인, 면역원성 조성물 또는 방법.
85. 항목 83의 폴리펩티드, 또는 항목 84에 따른 면역원성 조성물 또는 방법으로서, 상기 유전자형 P[7]로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:3의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물 또는 방법.
86. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 및/또는 항목 49의 다량체를 제조하는 방법으로서, 항목 58의 플라스미드로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
87. 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드 및/또는 항목 49의 다량체를 제조하는 방법으로서, 세포, 바람직하게는 곤충 세포를 항목 60의 바큘로바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
88. 항목 50 내지 55 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) 항목 1 내지 48 중 어느 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 갖는 배양물에서 감수성 세포의 감염을 허용하는 단계로서, 상기 폴리펩티드는 상기 벡터에 의해 발현되는 것인, 상기 단계;
(b) 이후 상기 폴리펩티드를, 특히 세포 배양 상청액에서 회수하는 단계로서, 바람직하게는 세포 파편이 적어도 하나의 필터, 바람직하게는 2개의 필터를 통해 바람직하게는 미세 여과를 포함하는 분리 단계를 통해 상기 폴리펩티드로부터 분리되고, 상기 적어도 하나의 필터는 바람직하게는 약 1㎛ 내지 약 20㎛ 및/또는 약 0.1㎛ 내지 약 4㎛의 공극 크기를 갖는 것인, 상기 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 혼합물에 이원 에틸렌아민(BEI)을 첨가하여 상기 벡터를 불활성화시키는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 혼합물에 티오황산나트륨을 첨가하여 상기 BEI를 중화시키는 단계; 및
(e) 약 5kDa 내지 약 100kDa, 바람직하게는 약 10kDa 내지 약 50kDa의 분자량 컷오프를 갖는 여과막을 갖는 필터를 사용하는 여과 단계에 의해 상기 혼합물로부터 액체의 일부를 제거함으로써 단계 (d)로부터 생성된 혼합물에서 폴리펩티드를 농축하는 단계;
(f) 및 선택적으로 단계 (e) 후에 남아있는 혼합물을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 성분과 혼합하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
89. 항목 50 내지 55, 63 내지 73 및 80 내지 85 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물, 항목 62의 용도, 또는 항목 74 내지 82, 84 및 85 중 어느 하나의 방법으로서, 여기서 상기 면역원성 조성물은 항목 88의 방법에 의해 얻을 수 있는 것인, 면역원성 조성물 또는 용도 또는 방법.
90. 폴리펩티드로서,
- 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 및
- 이종 이량체화 도메인을 포함하고,
여기서 상기 이종 이량체화 도메인은 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되는 것인, 폴리펩티드.
91. 항목 90에 있어서, 상기 이종 이량체화 도메인은 코일드-코일 도메인, 특히 류신 지퍼인, 폴리펩티드.
SEQUENCE LISTING <110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH <120> Fusion protein useful for vaccination against rotavirus <130> 01-3438 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 247 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 1 Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val 1 5 10 15 Asn Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Ala Lys Ser Gln Asp 20 25 30 Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Gly Tyr Ala Pro Val 35 40 45 Asn Trp Gly Ala Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu 50 55 60 Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr 65 70 75 80 Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr 85 90 95 Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val 100 105 110 Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu 115 120 125 Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser 130 135 140 Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser 145 150 155 160 Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr 165 170 175 Tyr Ser Gly Thr Thr Pro Asn Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr 180 185 190 Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile 195 200 205 Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu 210 215 220 Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Val Ser Leu Ser Ala 225 230 235 240 Arg Glu Ile Val His Thr Arg 245 <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 2 Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr 1 5 10 15 Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr 20 25 30 Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val 35 40 45 Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu 50 55 60 Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser 65 70 75 80 Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser 85 90 95 Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr 100 105 110 Tyr Ser Gly Thr Thr Pro Asn Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr 115 120 125 Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile 130 135 140 Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu 145 150 155 160 <210> 3 <211> 168 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 3 Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr 1 5 10 15 Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val 20 25 30 Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala 35 40 45 Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn 50 55 60 Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr 65 70 75 80 Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr 85 90 95 Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met 100 105 110 Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr Tyr Ser Gly Thr Thr Pro Asn Ala 115 120 125 Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr 130 135 140 Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys 145 150 155 160 Thr Glu 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sequence <400> 5 Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr 1 5 10 15 Thr Phe Asn Pro Pro Ile Glu Tyr Trp Thr Leu Phe Ala Pro Asn Asp 20 25 30 Lys Gly Val Val Ala Glu Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Trp Leu Ala 35 40 45 Ile Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val Pro Gln Glu Leu Arg Thr Tyr Thr 50 55 60 Ile Phe Gly Gln Gln Val Asn Leu Val Ile Glu Asn Thr Ser Gln Thr 65 70 75 80 Lys Trp Lys Phe Ala Asp Phe Arg Arg Arg Ser Gln Asn Asp Thr Tyr 85 90 95 Val Leu Asn Asp Thr Leu Leu Ser Asp Thr Lys Leu Gln Ala Ala Met 100 105 110 Lys Tyr Gly Ala Arg Leu Phe Thr Phe Thr Gly Asp Thr Pro Asn Ala 115 120 125 Ala Pro Gln Glu Tyr Gly Tyr Glu Thr Asn Asn Tyr Ser Ala Ile Glu 130 135 140 Ile Arg Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Met Pro Arg Glu 145 150 155 160 Val Cys Arg Asn Tyr Ile Asn His Gly Leu 165 170 <210> 6 <211> 181 <212> PRT <213> Rotavirus <400> 6 Glu Ser Thr Phe Lys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Pro His Asn Asn Thr 1 5 10 15 Val Ile Glu Trp Ser Asn Leu Met Asn Ser Asp Ile Trp Leu Leu 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gacacgcgag ccacaggtgt acaccctgcc accgcatgca 960 gaagagctga gccgatccaa ggtatccata acctgcctgg tgatcggatt ctaccccccc 1020 gatatcgacg tcgagtggca gaggaatggc cagccggagc cagagggcaa ctaccggacc 1080 acgcctccgc agcaggatgt cgatggtaca tattttctgt acagcaaatt tagcgtggac 1140 aaggccagtt ggcagggcgg cggtatcttc cagtgtgctg tcatgcacga ggcactccac 1200 aatcattaca cccagaaatc catttcgaag acgccgggca agtag 1245 <210> 21 <211> 1740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encodes fusion protein <400> 21 atggacagca cgacggttga accgctactg gacggaccat accaacctac tacatttaat 60 cctccaacaa gttattgggt tctgcttgct cctacagtcg agggagtgat aatacagggg 120 acaaataata cggaccggtg gttagctaca attttgatcg aaccgaatgt gcaaacgact 180 aatcgcatat acaatttatt cggccaacag gtaaccttaa gtgtggagaa cacctcgcaa 240 actcaatgga aatttattga tgtctccaca acaaccccca ctggatcgta cactcaacac 300 gggccgctct tctctacccc taaactatac gcggttatga aatttagtgg gagaatctac 360 acttattctg gtactacacc caatgcgacc actggttact attcaaccac aaactacgac 420 actgtcaata tgacgtcctt 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ataattttca aac 23

Claims (22)

  1. 폴리펩티드로서,
    - 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편, 및
    - 면역 글로불린 Fc 단편을 포함하는, 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 링커 모이어티를 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되거나,
    또는 상기 면역글로불린 Fc 단편은 상기 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편의 C-말단에 연결되는 것인, 폴리펩티드.
  3. 폴리펩티드, 특히 제1항 또는 제2항의 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 화학식 x-y-z의 융합 단백질이고, 여기서
    x는 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편으로 구성되고;
    y는 링커 모이어티이고;
    z는 면역글로불린 Fc 단편인, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 로타바이러스는 돼지 로타바이러스이고,
    및/또는 상기 로타바이러스는 로타바이러스 A 및 로타바이러스 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 N-말단 연장된 렉틴-유사 도메인이고, 상기 N-말단 연장은 길이가 1개 내지 20개의 아미노산 잔기, 바람직하게는 5개 내지 15개의 아미노산 잔기인, 폴리펩티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 로타바이러스는 유전자형 P[7] 로타바이러스, 유전자형 P[6] 로타바이러스 및 유전자형 P[13] 로타바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 일부, 특히 로타바이러스 A VP8 단백질의 일부의 공통 서열로 이루어지거나, 또는 그 공통 서열이고,
    상기 로타바이러스 VP8 단백질의 일부의 공통 서열은 바람직하게는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 것인, 폴리펩티드:
    - 로타바이러스 VP8 단백질의 일부를 암호화하는 복수의 뉴클레오티드 서열을 아미노산 서열로 번역하는 단계,
    - 바람직하게는 MUSCLE 서열 정렬 소프트웨어 UPGMB 클러스터링 및 디폴트 갭 페널티 파라미터를 사용하여 상기 아미노산 서열을 공지된 로타바이러스 VP8 단백질에 정렬하는 단계,
    - 상기 정렬된 서열을 계통발생학적 분석에 적용하고 로타바이러스 VP8 단백질 서열에 기초하여 이웃 결합 계통발생 재구성을 생성하는 단계로서, 특히 계통 발생학적 분석을 위해 상기 정렬된 아미노산 서열을 MEGA7 소프트웨어로 가져오고 로타바이러스 VP8 단백질 서열에 기초하여 이웃 결합 계통발생 재구성을 생성하는 단계,
    - 계통발생의 부트스트랩 테스트(n=100)와 함께 푸아송 보정 방법을 사용하여 최적의 트리를 계산하는 단계,
    - 총 170개 위치에 걸쳐 부위당 아미노산 치환 단위의 진화 거리와 동일한 분지 길이로 연장(scale)하기 위한 최적의 트리를 드로잉하는 단계,
    - 부트스트랩 클러스터 연결이 70% 이상인 노드를 유의미한 것으로 간주하는 단계,
    - 약 10%의 거리와 70%보다 큰 부트스트랩 클러스터 연결을 갖는 노드를 클러스터로 지정하는 단계,
    - 클러스터를 선택하고 상기 클러스터 내에서 정렬된 위치당 최대 빈도를 식별하여 공통 서열을 생성하는 단계,
    - 및 선택적으로, 동일한 비율의 아미노산이 정렬된 위치에서 관찰되는 경우, 미리 정의된 생성물 보호 프로파일과 함께 보고된 역학 데이터를 기반으로 아미노산 잔기를 선택하는 단계.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 장관 세포가 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편으로부터 유래된 로타바이러스에 의한 감염에 취약한 종의 게놈에 의해 암호화된 면역글로불린 Fc 단편이고,
    및/또는 상기 면역글로불린 Fc 단편은 바람직하게는 돼지 IgG Fc 단편이고,
    및/또는 상기 면역글로불린 Fc 단편은 SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 것인, 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 모이어티는 길이가 1개 내지 50개의 아미노산 잔기인 아미노산 서열이고,
    및/또는 상기 링커 모이어티는 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:11 로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 66%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지는 것인, 폴리펩티드.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결된 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편을 포함하고, 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 바람직하게는 링커 모이어티를 통해 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결되고, 상기 링커 모이어티는 특히 제10항에 명시된 링커 모이어티이거나,
    또는 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 로타바이러스 VP8 단백질의 상기 추가 면역원성 단편의 N-말단 아미노산 잔기와 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C 말단 아미노산 잔기 사이의 펩티드 결합을 통해 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C-말단에 연결된 것이고,
    및 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 바람직하게는 SEQ ID NO:2 내지 SEQ ID NO:6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 더욱 더 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그를 포함하고,
    및/또는 상기 로타바이러스 VP8 단백질의 추가 면역원성 단편은 바람직하게는 C-말단이 상기 면역글로불린 Fc 단편에 연결된 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편과 상이한 것인, 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 또는 특히 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 단백질인, 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 다수로 이루어지거나 또는 그를 포함하는 다량체로서, 상기 다량체는 바람직하게는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드와 제2의 동일한 폴리펩티드에 의해 형성된 동종이량체인, 다량체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및/또는 제13항의 다량체를 포함하는, 면역원성 조성물.
  15. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:21로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 특히 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  16. 약제로서 사용하기 위한, 바람직하게는 백신으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제14항의 면역원성 조성물.
  17. 대상체의 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 또는 대상체의 로타바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한, 또는 대상체의 로타바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 사용하기 위한
    및/또는 대상체의 로타바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제14항의 면역원성 조성물.
  18. 새끼 돼지의 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 하나 이상의 임상 징후, 사망률 또는 분변 배출을 감소시키거나 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은
    - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제14항의 면역원성 조성물을 암퇘지에게 투여하는 단계, 및
    - 상기 새끼 돼지가 상기 암퇘지의 젖을 먹도록 하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  19. 제17항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물, 또는 제18항에 따른 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 임상 징후는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물, 또는 방법:
    - 설사,
    - 로타바이러스 콜로니화, 특히 장의 로타바이러스 콜로니화,
    - 병변, 특히 거시적 병변,
    - 일일 평균 체중 증가율 감소, 및
    - 위장염.
  20. 제17항 또는 제19항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물, 또는 제18항 또는 제19항에 따른 방법에 있어서,
    - 상기 로타바이러스 감염은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염이거나,
    - 상기 로타바이러스에 의한 감염은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 의한 감염이거나, 또는
    - 상기 로타바이러스에 대한 면역 반응은 유전자형 P[23] 로타바이러스 및/또는 유전자형 P[7] 로타바이러스에 대한 면역 반응인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물, 또는 방법.
  21. 제20항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물, 또는 제20항의 방법에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편을 포함하거나, 또는 상기 면역원성 조성물은 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 포함하고,
    바람직하게는 상기 유전자형 P[7] 로타바이러스 VP8 단백질의 면역원성 단편은 SEQ ID NO:3의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 98% 또는 훨씬 더 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 폴리펩티드 또는 면역원성 조성물, 또는 방법.
  22. 제14항의 면역원성 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 갖는 배양물에서 감수성 세포의 감염을 허용하는 단계로서, 상기 폴리펩티드는 상기 벡터에 의해 발현되는 것인, 상기 단계;
    (b) 이후 상기 폴리펩티드를, 특히 세포 배양 상청액에서 회수하는 단계로서, 바람직하게는 세포 파편이 적어도 하나의 필터, 바람직하게는 2개의 필터를 통해 바람직하게는 미세 여과를 포함하는 분리 단계를 통해 상기 폴리펩티드로부터 분리되고, 상기 적어도 하나의 필터는 바람직하게는 약 1㎛ 내지 약 20㎛ 및/또는 약 0.1㎛ 내지 약 4㎛의 공극 크기를 갖는 것인, 상기 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 혼합물에 이원 에틸렌이민(BEI)을 첨가하여 상기 벡터를 불활성화시키는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 생성된 혼합물에 티오황산나트륨을 첨가하여 상기 BEI를 중화시키는 단계; 및
    (e) 약 5kDa 내지 약 100kDa, 바람직하게는 약 10kDa 내지 약 50kDa의 분자량 컷오프를 갖는 여과막을 갖는 필터를 사용하는 여과 단계에 의해 상기 혼합물로부터 액체의 일부를 제거함으로써 단계 (d)로부터 생성된 혼합물에서 폴리펩티드를 농축하는 단계;
    (f) 및 선택적으로 단계 (e) 후에 남아있는 혼합물을 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제, 희석제, 부형제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가 성분과 혼합하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
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