CN116438195A - 用于针对轮状病毒疫苗接种的融合蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于以重组方式构建的多肽，其用于制备具体用于减少由轮状病毒感染引起之一或多种临床症状的疫苗。更具体地，本发明是关于一种在N端至C端方向上包含以下的融合蛋白质：(i)轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段及(ii)免疫球蛋白Fc片段，诸如IgG Fc片段，其中该融合蛋白质可用于减少由猪中轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中。
Description
【技术领域】
本发明关于以重组方式构建的多肽，其用于制备疫苗，特别是用于减少由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状。更特别是，本发明系关于一种在N端至C端方向上包含以下的融合蛋白质：(i)轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段及(ii)免疫球蛋白Fc片段，诸如IgG Fc片段，其中该融合蛋白质可用于减少由猪中的轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中。
【现有技术】
轮状病毒为包含呼肠孤病毒科(Reoviridae)内的病毒属的双股RNA病毒。已知轮状病毒感染会引起肠胃疾病且视为婴儿的胃肠炎的最常见原因。轮状病毒系通过粪便-经口途径传播且感染穿过小肠的细胞。受感染细胞产生肠毒素，其诱发胃肠炎，导致严重腹泻且有时经由脱水死亡。
轮状病毒具有由11个双股RNA(dsRNA)区段构成的基因组，且当前基于如通过国际病毒分类委员会(International Commitee on Taxonomy of Viruses；ICTV)定义且由Matthijnssens等人(Arch Virol 157:1177-1182(2012))概述的内部病毒衣壳蛋白6(VP6)的抗原特性及基于序列的分类分为八组(A-H)，其中本文所提及的此公开案及以下公开案以全文引用的方式并入。
轮状病毒的基因组编码六种结构蛋白(VP 1-VP4、VP6及VP7)及六种非结构蛋白(NSP 1-NSP6)，其中基因组区段1-10各自编码一种轮状病毒蛋白质，且基因组区段11编码两种蛋白质(NSP5及NSP6)。
在轮状病毒A的情况下，不同病毒株可基于结构蛋白VP7及VP4分类为基因型(由比较序列分析和/或核酸杂交数据定义)或血清型(由血清学分析定义)。VP7及VP4为最外部蛋白质层的组分(外部衣壳)，且两者均携带中和抗原表位。VP7为形成病毒粒子的外层或表面的醣蛋白(因此称为“G”)。VP7确定病毒株的G型及G血清型及G基因型的名称相同。VP4为蛋白酶敏感的(因此称为“P”)且确定病毒的P型。与G型相比，针对P血清型及基因型指定的数字不同(Santos N.et Hoshino Y.,2005,Reviews in Medical Virology,15,29-56)。因此，P血清型表示为P，接着指定为数字，且P基因型表示为P，接着指定为括号中的数字(例如，“P[7]”或“P[13]”)。属于相同基因型的病毒株具有高于89％氨基酸序列一致性(Estes及Kapikian.Rotaviruses.在Knipe,D.M.；Howley,P.M.Fields Virology,第5版；WoltersKluwer/Lippincott Williams&Wilkins Health:Philadelphia,PA,USA(2007)；Gorziglia等人Proc Natl Acad Sci U S A.87(18):7155-9(1990)中)。
轮状病毒尤其亦为具有针对几乎100％猪中所存在的A族及C族轮状病毒的抗体的猪的胃肠炎的主要原因(Vlasova等人Viruses.9(3):48(2017))。当前，仅针对轮状病毒A可获得经修饰的存活或经杀灭疫苗。无法在实验室中培养轮状病毒C会妨碍研发针对此群的疫苗，随后增加重组疫苗的吸引性。
重组抗轮状病毒疫苗的产生受轮状病毒衣壳的复杂性阻碍，该轮状病毒衣壳由配置于三个层中的四种蛋白质构成。最内层由60个具有T＝1对称性的VP2二聚体构成。对于中间层的恰当排序，需要VP2层，其由260个具有T＝13对称性的VP6三聚体形成。VP2与VP6之间的所得对称性错配产生五个不同的VP6三聚体位置及三种不同孔径类型。在VP2不存在的情况下，VP6易于以可表示病毒组装的副产物的盐及pH依赖性方式形成有序高分子量微管及球状体。在衣壳中，VP6层由VP7的260个Ca2+依赖性三聚体覆盖，其充当使VP4刺突蛋白保持在适当位置的夹具。VP7为糖基化的或G型抗原，且含有中和抗原表位。大部分中和抗体仅识别三聚VP7且被认为通过防止VP7三聚体解离而起作用，其反过来阻断刺突蛋白的释放。轮状病毒刺突蛋白以60个VP4的三聚体形式存在，其仅在II型孔隙处插入VP6层中。VP4含有中和抗原表位且为P型抗原，通过胰蛋白酶裂解为刺突蛋白碱基VP5*及细胞相互作用头VP8*，其在裂解后保持与VP5*相关。胰蛋白酶消化进入刺突蛋白用于细胞进入，在此期间该刺突蛋白经历深入的结构重排以暴露用于宿主细胞上的受体结合的活性位点。忽略以上组装方法的复杂性，难以达成在环境条件下将轮状病毒衣壳蛋白的化学计算量表达促进适当组装。
鉴于轮状病毒衣壳组装的困难，对亚单位疫苗方法感兴趣。VP7及VP4为含有中和抗原表位的两种蛋白质，然而VP7的使用将由于其糖基化及钙依赖性三聚而变得复杂。VP4的使用因其三聚、胰蛋白酶消化及潜在构形状态范围而变得复杂。VP8蛋白质，亦称为VP8结构域或VP8*，其通过VP4的胰蛋白酶消化产生，含有中和抗原表位，为单体，其结构测定为高分辨率(Dormitzer等人EMBO J.21(5):885-897(2002))且描述为高度稳定的。
此外，在VP8蛋白质内，被视为与宿主受体相互作用且涉及病毒附着至宿主细胞的凝集素样结构域(aa65-224)(Rodriguez等人,PloS Pathog.10(5):e1004157(2014))。
已描述研发针对儿童的轮状病毒亚单位疫苗的方法，其中N端连接至破伤风类毒素通用CD4+T细胞抗原表位(aa830-844)P2的截短VP8蛋白质(VP8*氨基酸残基64(或65)-223)产生于大肠杆菌中(Wen等人Vaccine.32(35):4420-7(2014))，且在婴儿及幼童中测试(Groome等人Lancet Infect Dis.17(8):843-853(2017))。然而，由于此使用单价亚单位疫苗(基于轮状病毒基因型P[8]的截短VP8蛋白质)引发针对异型轮状病毒病毒株的不良反应，因此最近亦测试三价疫苗调配物(包含用于组合基因型P[4]、P[6]、P[8]抗原的三种蛋白质)(Groome等人Lancet Infect Dis.S1473-3099(20)30001(2020))。
在另一方法中，N端截短VP8蛋白质，即“VP8-1”(aa26-241)的N端或C端与霍乱毒素(CTB)的五聚无毒性B亚单位融合。在所得五聚融合蛋白质(CTBA-VP8-1，VP8-1-CTB)中，在小鼠模型中，相比于VP8-1-CTB，仅CTB-VP8-1(亦即N端融合至CTB的VP8-1)被视为用于进一步研发的可行候选物，其展示较高的与GM1或与针对VP8*具有特异性的构形敏感性中和单株抗体的结合活性，且引起较高效价的中和抗体且赋予较高的保护功效(Xue等人HumVaccin Immunother.12(11)2959-2968(2016))。
然而，鉴于在轮状病毒衣壳组装中的困难，对替代亚单位疫苗方法感兴趣，特别是因为亚单位疫苗一般视为非常安全的。此外，强烈需要有效的轮状病毒亚单位抗原的重组表达，其使得难以培养的此类轮状病毒的疫苗抗原得到简单生产。此外，因为轮状病毒为猪的胃肠炎的主要原因，所以尤其非常需要具有用于猪的亚单位疫苗，其包括使得功效与当前可购得用于猪的MLV轮状病毒疫苗相当或甚至比其更高效的抗原。
【发明内容】
以上技术问题的解决方案系通过本发明及申请专利范围中所表征的实施例实现。
因此，本发明在其不同方面中系根据申请专利范围实施。
本发明系基于以下惊人发现：经由被动传递中和抗体，在用轮状病毒攻击后向母猪施用包含轮状病毒VP8蛋白质的片段，即连接于IgG Fc片段的C端处的N端延伸的凝集素样结构域显著减少其后代的腹泻及粪便排出。
在第一方面中，本发明因此系关于一种多肽，其包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，以及
-免疫球蛋白Fc片段，
且其中该多肽在下文中亦称为“本发明的多肽”。
在本发明的上下文中，亦出乎意料地发现此类多肽当在细胞中产生时，自细胞释放，且可随后自细胞周围的上清液而非自细胞本身回收。
本发明的多肽的另一优点为必要时，其可制备为包含/呈现不同轮状病毒的两个免疫原性片段的一种多肽，由此使得不必分别制备两种不同的单价多肽，随后需要组合所述多肽以用于相同目的。
优选地，将如本文所描述的免疫球蛋白Fc片段连接至
-轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，或
-轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端。
特别是，该免疫球蛋白Fc片段优选
-经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，或
-经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端。
在另一优选方面中，如本文所描述的免疫球蛋白Fc片段
-经由该免疫球蛋白Fc片段的N端氨基酸残基与轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，或
-经由该免疫球蛋白Fc片段的C端氨基酸残基与轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端氨基酸残基之间的肽键连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端。
最优选地，如本文所描述的免疫球蛋白Fc片段连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。
因此，本发明的多肽尤其为包含以下的多肽：
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，以及
-免疫球蛋白Fc片段，
其中该免疫球蛋白Fc片段连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。
本文所用的术语“多肽”尤其系指通过肽键连接在一起的氨基酸残基的任何链，且并非系指产物的特定长度。举例而言，“多肽”可指氨基酸残基的长链，例如长度为150至600个氨基酸残基或更长的氨基酸残基。术语“多肽”包括具有一或多个翻译后修饰的多肽，其中翻译后修饰包括例如糖基化、磷酸化、脂质化(例如豆蔻酰化等)、乙酰化、泛素化、硫酸化、ADP核糖基化、羟基化、Cys/Met氧化、羧化、甲基化等。术语“多肽”及“蛋白质”在本发明的上下文中可互换地使用。
术语“免疫原性片段”尤其理解为系指蛋白质的片段，其至少部分保留衍生其的蛋白质的免疫原性。因此，“轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段”尤其应理解为系指轮状病毒VP8蛋白质的片段，其至少部分保留全长VP8蛋白质的免疫原性。
如本文所描述，术语“VP8蛋白质”应理解为尤其等效于“VP8结构域”、“VP8*”或“VP4的VP8片段”，如在轮状病毒的情况下频繁使用。
如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc片段”系指含有免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)及重链恒定区3(CH3)，且更特别是，不含有免疫球蛋白的重链及轻链可变区及轻链恒定区1(CL1)的蛋白质。其可进一步包括免疫球蛋白的铰链区或铰链区的一部分(亦即重链恒定区处的铰链区)。此外，免疫球蛋白Fc片段可含有重链恒定区1(CH1)的一部分或全部。
应理解，如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc片段”等效于“免疫球蛋白Fc结构域”。
本文所用的术语“连接至”尤其系指用于在多肽内将免疫球蛋白Fc片段连接至轮状病毒VP蛋白质的免疫原性片段的C端或N端的任何方式。连接方式的实例包括(1.)免疫球蛋白Fc片段通过插入部分间接连接至轮状病毒VP 8蛋白质的免疫原性片段的C端，该插入部分直接连接至轮状病毒VP8蛋白的该免疫原性片段的C端，且亦结合该免疫球蛋白Fc片段；及(2.)通过共价键结将免疫球蛋白Fc片段直接连接至轮状病毒VP8蛋白的免疫原性片段的C端。术语“连接至”及“与......连接”在本发明的上下文中可互换地使用。
特别是，应理解，措辞“包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，以及
-免疫球蛋白Fc片段的多肽，
其中该免疫球蛋白Fc片段连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端”，
如本文所用，尤其等效于措辞
“在N端至C端方向上包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的氨基酸序列，及
-免疫球蛋白Fc片段的氨基酸序列的多肽”，
或等效于措辞
“包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，以及
-连接至该免疫原性片段的C端的免疫球蛋白Fc片段”。
根据一最优选方面，免疫球蛋白Fc片段经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。
如本文在本发明的上下文中所描述的接头部分优选为肽接头。
如本文所用的术语“肽接头”系指包含一或多个氨基酸残基的肽。更特别是，如本文所用的术语“肽接头”系指能够连接两种可变蛋白质和/或结构域的肽，例如轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段及免疫球蛋白Fc片段。
在一尤其优选方面中，免疫球蛋白Fc片段经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，其中
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段经由接头部分的N端氨基酸残基与轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至接头部分，以及
-接头部分经由免疫球蛋白Fc片段的N端氨基酸残基与接头部分的C端氨基酸残基之间的肽键连接至免疫球蛋白Fc片段。
此外，免疫球蛋白Fc片段可优选经由免疫球蛋白Fc片段的N端氨基酸残基与轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段。
应理解，本发明的多肽尤其为融合蛋白质。
如本文所用，术语“融合蛋白质”意谓通过融合(亦即接合)两种或更多种多肽的全部或部分所形成的蛋白质。通常，使用重组DNA技术，端对端接合编码两种或更多种多肽的多核苷酸来制得融合蛋白质。更特别是，术语“融合蛋白质”因此系指由组合编码第一多肽的第一核酸序列及至少编码第二多肽的第二核酸产生的核酸转录物翻译的蛋白质，其中融合蛋白质并非天然存在的蛋白质。核酸构建体可编码两种或更多种在融合蛋白质中接合的多肽。
在另一优选方面中，本发明提供一种多肽，尤其如上文所提及的多肽，其中该多肽为式x-y-z的融合蛋白质，其中
x由轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段组成或包含轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段；
y为接头部分；并且
z为免疫球蛋白Fc片段。
特别是，式x-y-z应理解为轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端氨基酸残基与该接头部分连接，优选经由肽键与该接头部分的N端氨基酸残基连接，且该免疫球蛋白Fc片段的N端氨基酸残基与该接头部分连接，优选经由肽键与该接头部分的C端氨基酸残基连接。
如本文所描述，措辞“x由轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段组成”特别理解为等效于“x为轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段”。
在一优选方面中，如本文所提及的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选能够在施用轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的个体内诱导针对轮状病毒的免疫反应。
在另一优选方面中，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段为长度为50至200个、优选140至190个氨基酸残基的多肽。
本文所提及的轮状病毒选自由轮状病毒A及轮状病毒C组成的群。因此，如本文所提及，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选选自由以下组成的群：轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段及轮状病毒C VP8蛋白质的免疫原性片段。
如本文分别提及的一或多个术语“轮状病毒A”及“轮状病毒C”分别系指如由ICTV(由Matthijnssens等人Arch Virol 157:1177-1182(2012)概述)所定义的轮状病毒A及轮状病毒C。
根据另一优选方面，本文所提及的轮状病毒为猪轮状病毒。
在一个尤其优选方面中，本文所提及的轮状病毒为轮状病毒A。因此，如本文所描述的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选为轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段。
在另一优选方面中，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段包含轮状病毒VP8蛋白质的凝集素样结构域。如本文所提及，“轮状病毒VP8蛋白质的凝集素样结构域”应优选理解为轮状病毒AVP8蛋白质的凝集素样结构域。
特别是，术语“轮状病毒VP8蛋白质的凝集素样结构域”系指轮状病毒VP8蛋白质的残基65-224或分别对应于由轮状病毒VP8蛋白质的氨基酸残基65-224组成的氨基酸序列，且其中轮状病毒VP8蛋白质的该氨基酸残基65-224优选为轮状病毒A VP8蛋白质的氨基酸残基65-224。
因此，“轮状病毒VP8蛋白质的凝集素样结构域”优选由轮状病毒VP8蛋白质，尤其轮状病毒A VP8蛋白质的氨基酸残基65-224的氨基酸序列组成。
轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选为轮状病毒VP8蛋白质的N端延伸的凝集素样结构域，其中N端延伸长度为1至20个氨基酸残基，尤其5至15个氨基酸残基。轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段最优选为轮状病毒VP8蛋白质的N端延伸的凝集素样结构域，其中N端延伸长度为八个氨基酸残基。
该N端延伸的氨基酸序列优选系在轮状病毒VP8蛋白质的氨基酸序列中侧接凝集素样结构域的N端氨基酸残基的各别长度的氨基酸序列。
因此，在特定方面中，如本文所提及的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选由以下组成：轮状病毒VP8蛋白质，尤其轮状病毒A蛋白质的氨基酸残基60-224、氨基酸残基59-224、氨基酸残基58-224、氨基酸残基57-224、氨基酸残基56-224、氨基酸残基55-224、氨基酸残基54-224、氨基酸残基53-224、氨基酸残基52-224、氨基酸残基51-224、氨基酸残基50-224或氨基酸残基49-224的氨基酸序列。
如本文所提及，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段最优选由轮状病毒VP8蛋白质，尤其轮状病毒A蛋白质的氨基酸残基57-224的氨基酸序列组成。
以上氨基酸残基编号(例如“65-224”或“57-224”)优选参考野生型轮状病毒VP8蛋白质，尤其野生型轮状病毒A VP8蛋白质的氨基酸序列。该野生型轮状病毒VP8蛋白质优选为SEQ ID NO:1中所列的蛋白质。
根据另一优选方面，本文所提及的轮状病毒为选自由以下组成的群的轮状病毒，尤其轮状病毒A：基因型P[6]轮状病毒、基因型P[7]轮状病毒及基因型P[13]轮状病毒。因此，如本文所提及，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选选自由以下组成的群：基因型P[6]轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段、基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段及基因型P[13]轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，且尤其选自由以下组成的群：基因型P[6]轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段、基因型P[7]轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段及基因型P[13]轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段。
如本文所用的术语“基因型P[6]轮状病毒”、“基因型P[7]轮状病毒”、“基因型P[13]轮状病毒”及“基因型P[23]轮状病毒”尤其系指轮状病毒的已确立VP4(P)基因型分类(例如P[6]、P[7]、P[13]或P[23])，其描述于Estes及Kapikian.Rotaviruses.在Knipe,D.M.；Howley,P.M.Fields Virology,第5版；Wolters Kluwer/Lippincott Williams&Wilkins Health:Philadelphia,PA,USA(2007)；Gorziglia等人Proc Natl Acad Sci U SA.87(18):7155-9(1990)中。
最优选地，本文所提及的轮状病毒为基因型P[7]轮状病毒。因此，如本文所提及，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段最优选为基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，尤其基因型P[7]轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段。
本文所提及的轮状病毒VP8蛋白质最优选包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或再更加至少99％序列一致性的氨基酸序列。
如本文所提及，轮状病毒VP8蛋白质的凝集素样结构域优选包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列。
在一个实例中，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段由与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
在另一优选方面中，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段由以下组成或为以下的共有序列：轮状病毒VP8蛋白质的一部分，尤其轮状病毒A VP8蛋白质的一部分。
如本文所用，术语“共有序列”系指由相关序列家族中最常见的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany1987))。在蛋白质家族中，共有序列中的各位置由该家族中最频繁出现于该位置处的氨基酸占据。术语“共有序列”因此表示所推断的氨基酸序列(或核苷酸序列)。共有序列表示多个类似序列。共有序列中的各位置对应于通过比对三个或更多个序列所确定的该位置处最频繁出现的氨基酸残基(或核苷酸碱基)。
优选地，如本文所提及的轮状病毒VP8蛋白质的一部分的共有序列可通过包含以下步骤的方法获得：
-将多个编码轮状病毒VP8蛋白质的一部分的核苷酸序列翻译为氨基酸序列，
-将所述氨基酸序列与已知轮状病毒VP8蛋白质比对，优选通过使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类法及预设空隙罚分参数，
-对所述比对序列进行种系发生分析且基于轮状病毒VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建，特别是将所述比对氨基酸序列导入MEGA7软件以用于种系发生分析且基于轮状病毒VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建，
-使用泊松(Poisson)校正法以及种系发生的自助重抽检验来计算最优树(n＝100)，
-按比例绘制最优树，其中分支长度等于在总共170个位置上以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离
-将自助重抽聚类关联大于70％的节点作为显著的，
-将具有大致10％距离及大于70％的自助重抽聚类关联的节点指定为聚类，以及
-选择聚类及通过鉴别该聚类内每个比对位置的最大频率来产生共有序列，
-且视情况，在其中在比对位置中观测到相等比例的氨基酸的情况下，基于所报导的流行病学数据以及预定产品保护概况选择氨基酸残基。
举例而言，在此情形下，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选由与选自由SEQID NO:4及SEQ ID NO:5组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
在另一优选方面中，本文所提及的轮状病毒为轮状病毒C。根据此方面，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选为轮状病毒C VP8蛋白质的免疫原性片段。
在此方面的情形下，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段优选由与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
根据本发明，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段因此优选由以下组成或为以下：
-轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段，尤其轮状病毒A VP8蛋白质的本文所描述的免疫原性片段中的任一者，或
-轮状病毒VP8蛋白质的一部分，诸如轮状病毒A VP8蛋白质的一部分的共有序列，优选在共有序列的情形下，本文所描述的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段中的任一者，或
-轮状病毒C VP8蛋白质的免疫原性片段，尤其轮状病毒C VP8蛋白质的本文所描述的免疫原性片段中的任一者。
在一尤其优选方面中，轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段为由与选自由SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成的多肽。
本文所描述的免疫球蛋白Fc片段的长度优选为至少220个氨基酸残基，且长度最优选为220至250个氨基酸残基。
根据另一尤其优选方面，本文所描述的免疫球蛋白Fc片段未经糖基化。如本文所用，术语“未经糖基化”尤其意谓免疫球蛋白Fc片段不具有附着至其上的寡醣分子。
优选地，如本文所提及的免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下组成：
-免疫球蛋白重链恒定区2(CH2)，及
-重链恒定区3(CH3)，
-及视情况铰链区或铰链区的一部分。
根据另一优选方面，本文所提及的免疫球蛋白选自由IgG、IgA、IgD、IgE及IgM组成的群。因此，免疫球蛋白Fc片段优选选自由以下组成的群：IgG Fc片段、IgA Fc片段、IgD Fc片段、IgE Fc片段及IgM Fc片段。
根据一最优选方面，本文所描述的免疫球蛋白Fc片段为IgG Fc片段。
如本文所提及的IgG优选选自由以下组成的群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5及IgG6。因此，根据另一优选方面，本文所提及的免疫球蛋白Fc片段选自由以下组成的群：IgG1Fc片段、IgG2 Fc片段、IgG3 Fc片段、IgG4 Fc片段、IgG5 Fc片段及IgG6 Fc片段。
最优选地，免疫球蛋白Fc片段为由肠细胞易受如本文所提及的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段所衍生的轮状病毒感染的物种的基因组编码的蛋白质。举例而言，若轮状病毒VP8蛋白质的片段为猪轮状病毒VP8蛋白质的片段，则免疫球蛋白Fc片段优选为由猪基因组编码的免疫球蛋白Fc片段。根据另一实例，若轮状病毒VP8蛋白质的片段为鸡轮状病毒VP8蛋白质的片段，则免疫球蛋白Fc片段优选为由鸡基因组编码的免疫球蛋白Fc片段。
更特别是，免疫球蛋白Fc片段优选为猪IgG Fc片段。
在另一优选方面中，免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下组成：与选自由SEQ IDNO:7及SEQ ID NO:8组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或尤其100％序列一致性的氨基酸序列。
本文所分别提及的接头部分或肽接头为长度优选为1至50个氨基酸残基，尤其长度为3至20个氨基酸残基的氨基酸序列。举例而言，接头部分可为长度为3、8或10个氨基酸残基的肽接头。
视目的而定，可能需要短接头以降低融合蛋白质搭配物之间的蛋白质水解风险。因此，在本发明的上下文中所描述的肽接头优选具有1-5个氨基酸残基、更优选2至4个氨基酸残基且最优选三个氨基酸残基的长度，或分别由其组成。
根据一优选方面，接头部分包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:9、SEQID NO:10及SEQ ID NO:11组成的群的序列具有至少66％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或尤其100％序列一致性的氨基酸序列。
优选地，本发明的多肽具有侧接轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的N端氨基酸残基的N端甲硫氨酸残基。
根据另一优选方面，本发明的多肽包含连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端的轮状病毒VP8蛋白质的另一免疫原性片段。
轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选由以下组成或为以下：
-轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段，尤其轮状病毒A VP8蛋白质的本文所描述的免疫原性片段中的任一者，或
-轮状病毒VP8蛋白质的一部分，诸如轮状病毒A VP8蛋白质的一部分的共有序列，优选在共有序列的情形下，本文所描述的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段中的任一者，或
-轮状病毒C VP8蛋白质的免疫原性片段，尤其轮状病毒C VP8蛋白质的本文所描述的免疫原性片段中的任一者。
特别是，轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:2至6组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列。
在一尤其优选方面中，轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选不同于C端连接至该免疫球蛋白Fc片段的轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段。
轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选经由接头部分，尤其经由本文所描述的接头部分中的任一者连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端。优选地，轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段经由轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段的N端氨基酸残基与接头部分的C端氨基酸残基之间的肽键连接至接头部分。
替代地，可轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段可优选经由轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段的N端氨基酸残基与该免疫球蛋白Fc片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端。
在一尤其优选方面中，本发明的多肽为包含以下或由以下组成的蛋白质：与选自由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％序列一致性的氨基酸序列。
优选地，本发明的多肽为包含以下或由以下组成的蛋白质：选自由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16组成的群的氨基酸序列。
应理解，如本文所用，措辞“由氨基酸序列组成(consisting of an amino acidsequence/consists of an amino acid sequence)”分别尤其亦关于受表达蛋白质或蛋白质结构域的细胞实现的氨基序列的任何共翻译和/或翻译后修饰或修饰。因此，除非另外明确提及，否则如本文所描述的措辞“由氨基酸序列组成(consisting of an amino acidsequence/consists of an amino acid sequence)”分别亦关于具有一或多个由表达蛋白质或蛋白质结构域的细胞影响的修饰，尤其在蛋白质生物合成和/或蛋白质加工中实现的氨基酸残基的修饰，优选选自由糖基化、磷酸化及乙酰化组成的群的修饰的氨基酸序列。
应理解，关于如本发明的上下文中所提及的术语“至少90％”，该术语优选地系指“至少91％”、更优选“至少92％”、仍更优选“至少93％”或尤其“至少94”。
应理解，关于如本发明的上下文中所提及的术语“至少95％”，该术语优选地系指“至少96％”、更优选“至少97％”、仍更优选“至少98％”或尤其“至少99％”。
应理解，关于如本发明的上下文中所提及的术语“至少99％”，该术语优选地系指“至少99.2％”、更优选“至少99.4％”、仍更优选“至少99.6％”或尤其“至少99.8％”。
如本文所用，术语“具有100％序列一致性”应理解为等效于术语“为一致的”。
序列一致性百分比具有此项技术中公认的含义且存在多种方法量测两种多肽或多核苷酸序列之间的一致性。参见例如Lesk编,Computational Molecular Biology,Oxford University Press,New York,(1988)；Smith编,Biocomputing:Informatics AndGenome Projects,Academic Press,New York,(1993)；Griffin&Griffin编,ComputerAnalysis Of Sequence Data,Part I,Humana Press,New Jersey,(1994)；von Heinje,Sequence Analysis In Molecular Biology,Academic Press,(1987)；及Gribskov&Devereux编,Sequence Analysis Primer,M Stockton Press,New York,(1991).用于比对多核苷酸或多肽的方法编码于计算机程序中，包括GCG程序包(Devereux等人,Nuc.AcidsRes.12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人,J.Molec.Biol.215:403(1990))及Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,用于Unix的版本8,GeneticsComputer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,Wis.53711)，该Bestfit程序使用史密斯及Waterman的局部同源算法(Adv.App.Math.,2:482-489(1981))。举例而言，可使用采用FASTA算法的计算机程序ALIGN，其中存在空隙开放罚分-12及空隙扩展罚分-2的仿射空隙搜寻。出于本发明的目的，使用DNASTAR公司的MegAlign软件版本11.1.0(59),419中的Clustal W方法，使用程序中的默认多序列比对参数比对核苷酸序列(空隙罚分＝15.0，空隙长度罚分＝6.66，延迟发散序列(％)＝30％，DNA转化权重＝0.50及权重矩阵＝IUB)，且蛋白质/氨基酸序列分别使用DNASTAR公司的MegAlign软件版本11.1.0(59),419中的Clustal W方法，使用程序中的默认多序列比对参数比对(在空隙罚分＝10.0的情况下Gonnet连续蛋白质权重矩阵，间隙长度罚分＝0.2及延迟发散序列(％)＝30％)。
如本文所用，尤其应理解术语“与SEQ ID NO:X的序列的序列一致性”分别等效于术语“在SEQ ID NO:X的长度上与SEQ ID NO:X的序列的序列一致性”或等效于术语“在SEQID NO:X的全长上与SEQ ID NO:X的序列的序列一致性”。在此情形下，“X”系选自1至25的任何整数，使得“SEQ ID NO:X”表示本文所提及的SEQ ID NO中的任一者。
如本文所用，措辞“由SEQ ID NO:[…]、…及SEQ ID NO:[…]组成的群”与“由SEQID NO:[…]的序列、…及SEQ ID NO:[…]的序列组成的群”可互换。在此上下文中，“[…]”该序列的数字的占位符。举例而言，措辞“由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQID NO:6组成的群”与“由SEQ ID NO:3的序列、SEQ ID NO:4的序列、SEQ ID NO:5的序列及SEQ ID NO:6的序列组成的群”可互换。
根据另一尤其优选方面，本发明的多肽由以下组成：
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，尤其轮状病毒VP8蛋白质的本文所描述的免疫原性片段中的任一者，
-侧接轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端氨基酸残基的N端甲硫氨酸残基，以及
-免疫球蛋白Fc片段，尤其本文所描述的免疫球蛋白Fc片段中的任一者，
其中该免疫球蛋白Fc片段尤其经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，其中该接头部分优选为本文所描述的接头部分中的任一者，
-及视情况选用的连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端的轮状病毒VP8蛋白质的另一免疫原性片段，尤其经由接头部分，其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选为轮状病毒VP8蛋白质的本文所描述的其他免疫原性片段中的任一者，且其中该接头部分优选为本文所描述的接头部分中的任一者。
在又一优选方面中，本发明的多肽与本发明的另一多肽形成二聚体。最优选地，本发明的多肽与第二相同多肽形成同源二聚体。
因此，尤其应理解，术语“本发明的多肽”进一步涵盖由本发明的两种多肽构成的任何二聚体，且尤其涵盖由本发明的两种相同多肽构成的任何同源二聚体。
根据另一尤其优选方面，本发明提供一种多聚体，其包含多个本发明的多肽或由多个本发明的多肽构成，且其中该多聚体在下文中亦称为“本发明的多聚体”。
优选地，本发明的多聚体为由本发明的一种多肽与本发明的第二相同多肽形成的同源二聚体。
在特定理解中，术语“本发明的多聚体”进一步涵盖本发明的不同多聚体的任何混合物，例如以下的混合物：
-由本发明的一种多肽与本发明的第二相同多肽形成的同源二聚体，及
-由本发明的相同多肽中的超过两者形成的一或多种多聚体。
本发明进一步提供一种包含本发明的多肽和/或本发明的多聚体的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物在下文中亦称为“本发明的免疫原性组合物”。
因此，在一个优选实例中，本发明的免疫原性组合物包含
-由本发明的一种多肽组成的单体，及
-由本发明的两种相同多肽组成的同源二聚体，
-及视情况存在的由本发明的三种相同多肽组成的均三聚体，
其中优选地，
-本发明的该两种相同多肽中的每一者，
-及视情况选用的本发明的该三种相同多肽中的每一者，
包含与本发明的该一种多肽相同的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。
本发明的免疫原性组合物优选包含浓度为至少100nM、优选至少250nM、更优选至少500nM及最优选至少1μM的本发明的多肽。
根据另一优选方面，本发明的免疫原性组合物含有浓度为100nM至50μM、优选250nM至25μM及最优选1-10μM的本发明的多肽。
特别是，向个体施用1mL或视具体情况，2mL本发明的免疫原性组合物。因此，待施用个体的本发明的免疫原性组合物的剂量优选具有1mL或2mL的体积。
优选地，向个体施用一剂或两剂免疫原性组合物。
本发明的免疫原性组合物优选全身性或局部施用。常规使用的适合的施用途径为非经肠或经口施用，诸如肌肉内、皮内、静脉内、腹膜内、皮下、鼻内以及吸入。然而，视化合物的性质及作用模式而定，免疫原性组合物亦可通过其他途径施用。最优选为肌肉内施用免疫原性组合物。本发明的免疫原性组合物优选进一步包含医药学或兽医学上可接受的载剂或赋形剂。
如本文所用，“医药学或兽医学上可接受的载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌及抗真菌剂、等张剂、吸附延迟剂及其类似物。在一些优选实施例及尤其包括冻干免疫原性组合物的实施例中，用于本发明的稳定剂包括用于冻干或冷冻干燥的稳定剂。
在一些实施例中，本发明的免疫原组合物含有佐剂。
如本文所用，“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝、皂苷，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech公司,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals公司,Birmingham,AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液可尤其基于轻质液体石蜡油(欧洲药典(European Pharmacopeia)类型)；诸如鲨烷或鲨烯的类异戊二烯油；由烯烃，特别是异丁烯或癸烯寡聚产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂优选为非离子界面活性剂，特别是视情况经乙氧基化的脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如，油酸无水甘露糖醇)、乙二醇、聚丙三醇、丙二醇及油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是普洛尼克(Pluronic)产品，尤其L121。参见Hunter等人,The Theory and Practical Application of Adjuvants(Ed.Stewart-Tull,D.E.S.),JohnWiley and Sons,NY,第51-94页(1995)，及Todd等人,Vaccine 15:564-570(1997)。例示性佐剂为描述于“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”,M.Powell及M.Newman编,Plenum Press,1995的第147页上的SPT乳液及描述于此同一本书的第183页上的乳液MF59。
佐剂的另一实例为选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及顺丁烯二酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利佐剂化合物为尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。此等化合物通过术语卡波姆(carbomer)已知(Phameuropa第8卷,第2期,1996年6月)。本领域技术人员亦可参考美国专利第2,909,462号，其描述与具有至少3个羟基、优选不超过8个羟基的聚羟基化合物交联的此类丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子经具有至少2个碳原子的不饱和脂族基团置换。优选基团为例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不饱和基团的含有2至4个碳原子的不饱和脂族基团。不饱和基团本身可含有其他取代基，诸如甲基。以名称
出售的产品(BF Goodrich,Ohio,USA)为尤其适合的。其与烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交联。尤其可提及Carbopol 974P、934P及971P。最优选为使用/>
971P。在顺丁烯二酸酐与烯基衍生物的共聚物中为共聚物EMA(Monsanto)，其为顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物。此等聚合物溶解于水中产生酸溶液，优选地将该酸溶液中和至生理pH，以便得到并入免疫原性、免疫或疫苗组合物本身的佐剂溶液。
可自其选择佐剂的其他适合的佐剂尤其包括(但不限于)：RIBI佐剂系统(Ribi公司)、Block共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、单磷酰基脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)(重组或以其他方式)的不耐热肠毒素、霍乱毒素IMS 1314或胞壁酰二肽或天然存在或重组细胞介素或其类似物或内源性细胞介素释放刺激剂等等。
预期佐剂可以每剂约100μg至约10mg的量、优选每剂约100μg至约10mg的量、更优选每剂约500μg至约5mg的量、甚至更优选每剂约750μg至约2.5mg的量及最优选每剂约1mg的量添加。替代地，佐剂可以最终产物的体积计在约0.01％至50％的浓度下、优选在约2％至30％的浓度下、更优选在约5％至25％的浓度下、仍更优选在约7％至22％的浓度下且最优选在10％至20％的浓度下。
“稀释剂”可包括水、生理盐水、右旋糖、乙醇、甘油及其类似物。等张剂可尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。
根据一尤其优选方面，本发明亦提供一种免疫原性组合物，特别是本发明的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物包含以下或由以下组成：
-本发明的多肽和/或本发明的多聚体，及
-医药学或兽医学上可接受的载剂或赋形剂，
-以及视情况选用的佐剂。
在本发明的上下文中，佐剂优选选自由乳化水包油佐剂及卡波姆组成的群。
术语“免疫原性组合物”系指包含至少一种抗原的组合物，其在施用免疫原性组合物的宿主中引起免疫反应。此类免疫反应可为对根据本发明的免疫原性组合物的细胞和/或抗体介导的免疫反应。宿主亦描述为“个体”。优选地，本文所描述或提及的宿主或个体中的任一者为动物。
如本文所用，术语“动物”尤其系指哺乳动物，优选猪类，更优选猪，最优选猪崽。
通常，“免疫反应”包含(但不限于)：以下效果中的一或多个：产生或活化特异性针对本发明的免疫原性组合物中所包括的一或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或γ-δT细胞。优选地，宿主将呈现保护性免疫反应或治疗反应。
“保护性免疫反应”将由以下情形证明：受感染宿主通常所呈现的一或多种临床症状减少或缺失、恢复时间加快和/或感染持续时间减少，或受感染宿主的组织或体液或排泄物中的病原体效价降低。
如本文所提及的“病原体”或“特定病原体”尤其系有关衍生出轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的轮状病毒。举例而言，如本文所提及的病原体为轮状病毒A或轮状病毒C。
在宿主呈现保护性免疫反应使得对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重程度将降低的情况下，将免疫原性组合物描述为“疫苗”。
如本文所描述的“抗原”系指(但不限于)在宿主中引起针对包含此类抗原或其免疫活性组分的所关注的免疫原性组合物或疫苗的组分的免疫反应。特别是，如本文所用的术语“抗原”系指一种蛋白质或蛋白质结构域，其若向宿主施用，则可在宿主中引起免疫反应。
术语“治疗和/或预防”系指畜群中的特定病原体感染的发病率的减少，或由特定病原体感染所引起或与特定病原体感染有关的一或多种临床症状的严重程度的降低。因此，术语“治疗和/或预防”亦系指与动物未接受此类免疫原性组合物的动物组相比，在动物接受有效量的如本文所提供的免疫原性组合物的动物组中，感染特定病原体的畜群中的动物数目减少(＝特定病原体感染的发病率减少)或通常与病原体感染有关或由病原体感染所引起的一或多种临床症状的严重程度降低。
“治疗和/或预防”一般涉及向需要此类治疗/预防或可受益于此类治疗/预防的个体或畜群施用有效量的本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物。术语“治疗”系指一旦个体或畜群中的至少一些动物已感染此类病原体且其中此类动物已展示由此类病原体感染造成或与此类病原体感染相关联的一些临床症状，则施用有效量的免疫原组合物。术语“预防”系指在此类个体感染任何病原体前或至少在此类动物或动物组中的所有动物未展现由此类病原体感染所引起或与此类病原体感染有关的一或多种临床症状的情况下向个体施用。
如本文所用的术语“有效量”意谓(但不限于)抗原，特别是本发明的多肽和/或本发明的多聚体的量，其引起或能够引起个体的免疫反应。此类有效量能够降低畜群中特定病原体感染的发生率或降低特定病原体感染的一或多种临床症状的严重程度。优选地，与未经处理或未经在本发明前可获得的免疫原性组合物处理，但随后感染特定病原体的个体相比，一或多种临床症状的发生率或严重程度减轻至少10％、更优选至少20％、仍更优选至少30％、甚至更优选至少40％、仍更优选至少50％、甚至更优选至少60％、仍更优选至少70％、甚至更优选至少80％、仍更优选至少90％及最优选至少95％。
如本文所用，术语“临床症状”系指个体感染特定病原体的症状。感染的临床症状取决于所选病原体。此类临床症状的实例包括(但不限于)：腹泻、呕吐、发热、腹痛及脱水。
减少个体中由特定病原体感染引起或与特定病原体感染相关的一或多种临床症状的发生率或降低其严重程度可通过向个体施用一或多剂本发明的免疫原性组合物来达成。
术语“减少粪便排出”意谓(但不限于)减少每毫升粪便的病原病毒，诸如轮状病毒的RNA复本的数目或每分升粪便的溶菌斑形成集落的数目，与未接受组合物的个体相比，接受本发明的组合物的个体的粪便减少至少50％且可变得感染。更优选地，接受本发明的组合物的个体中粪便排出量减少至少90％、优选至少99.9％、更优选至少99.99％且甚至更优选至少99.999％。
如本文所用，术语“粪便排出”根据其在药品及病毒学中的普通含义使用且系指经由个体的大便自个体的细胞至感染个体中产生及释放病毒。
本发明的多肽优选为重组蛋白，尤其重组杆状病毒表达的蛋白质。
如本文所用，术语“重组蛋白”尤其系指通过重组DNA技术产生的蛋白质，其中通常将编码所表达蛋白质的DNA插入适合的表达载体中，其继而用于转型或在病毒载体的情况下感染宿主细胞以产生异源蛋白质。因此，如本文所用的术语“重组蛋白”尤其系指自重组DNA分子表达的蛋白质分子。如本文所用，“重组DNA分子”系指由藉助于分子生物技术接合在一起的DNA区段构成的DNA分子。用于产生重组蛋白的适合的系统包括(但不限于)：昆虫细胞(例如杆状病毒)、原核系统(例如大肠杆菌)、真菌(例如嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophile)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis))、酵母菌(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、甲醇酵母(Pichia pastoris))、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢、HEK293)、植物(例如红花)、海藻、禽类细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞及无细胞系统(例如家兔网状红血球溶解物)。
根据另一方面，本发明提供一种多核苷酸，其包含编码本发明的多肽的序列，其中该多核苷酸，在下文中亦称为“根据本发明的多核苷酸”优选为经分离的多核苷酸。
优选地，根据本发明的多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或尤其100％序列一致性的核苷酸序列。
本文所描述的多核苷酸的生产属于此项技术中的技术范围内且可在其他场合中根据Sam brook等人,2001,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Amusable等人,2003,CurrentProtocols In Molecular Biology,Greene Publishing Associates&WileyInterscience,NY；Innis等人(编),1995,PCR Strategies,Academic Press公司,SanDiego；以及Erlich(编),1994,PCR Technology,Oxford University Press,New York中所描述的重组技术进行，所有文献均以引用的方式并入本文中。
在另一方面中，本发明提供一种含有编码本发明的多肽的多核苷酸的载体。
出于本发明的目的，“载体”以及“含有编码本发明的多肽的多核苷酸的载体”系指适合的表达载体，优选杆状病毒表达载体，其继而用于转染或在杆状病毒表达载体的情况下用于感染宿主细胞以产生由DNA编码的蛋白质或多肽。载体及用于制备和/或使用载体(或重组体)进行表达的方法可通过以下或类似于以下所揭示的方法制得或进行：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第4,722,848号、第5,942,235号、第5,364,773号、第5,762,938号、第5,770,212号、第5,942,235号、第382,425号、PCT公开案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti,“Applications of pox virus vectors to vaccination:An update”,PNASUSA 93:11349-11353,1996年10月；Moss,“Genetically engineered poxviruses forrecombinant gene expression,vaccination,and safety”,PNAS USA 93:11341-11348,1996年10月；Smith等人,美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Richardson,C.D.(编者),Methods in Molecular Biology 39,“Baculovirus Expression Protocols”(1995Humana Press公司)；Smith等人,“Production of Human Beta Interferon inInsect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”,Molecular andCellular Biology,1983年12月,第3卷,第12期,第2156-2165页；Pennock等人,“Strongand Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cellswith a Baculovirus vector”,Molecular and Cellular Biology 1984年3月,第4卷,第3期,第406页；EPA0 370 573；1986年10月16日申请的美国申请案第920,197号；欧洲专利申请案第265785号；美国专利第4,769,331号(重组疱疹病毒)；Roizman,“The function ofherpes simplex virus genes:A primer for genetic engineering of novelvectors”,PNAS USA 93:11307-11312,1996年10月；Andreansky等人,“The applicationof genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment ofexperimental brain tumors”,PNAS USA 93:11313-11318,1996年10月；Robertson等人,“Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”,PNAS USA 93:11334-11340,1996年10月；Frolov等人,“Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications”,PNAS USA 93:11371-11377,1996年10月；Kitson等人,J.Virol.65,3068-3075,1991；美国专利第5,591,439号、第5,552,143号；WO 98/00166；均在1996年7月3日申请的所允许的美国申请案系列第08/675,556号及第08/675,566号(重组腺病毒)；Grunhaus等人,1992,“Adenovirus as cloning vectors”,Seminars inVirology(第3卷)第237-52页,1993；Ballay等人EMBO Journal,第4卷,第3861-65页,Graham,Tibtech 8,85-87,1990年4月；Prevec等人,J.Gen Virol.70,42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994),J.Biol.Chem.269,2550-2561,Science,259:1745-49,1993；以及McClements等人,“Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D orglycoprotein B,alone or in combination,induces protective immunity in animalmodels of herpes simplex virus-2disease”,PNAS USA 93:11414-11420,1996年10月；及美国专利第5,591,639号、第5,589,466号以及第5,580,859号，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人,Nature,及尤其Furth等人,Analytical Biochemistry,relating to DNA expression vectors。亦参见WO 98/33510；Ju等人,Diabetologia,41:736-739,1998(慢病毒表达系统)；Sanford等人,美国专利第4,945,050号；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人,Seminars inImmunology第9卷,第271-283页(1997),(DNA载体系统)；Szoka等人,美国专利第4,394,448号(将DNA插入活细胞的方法)；McCormick等人,美国专利第5,677,178号(细胞病变病毒的用途)；以及美国专利第5,928,913号(用于基因递送的载体)；以及本文所引用的其他文献。
优选病毒载体包括杆状病毒，诸如BaculoGold(BD Biosciences Pharmingen,SanDiego,CA)，特别是，其限制条件为产生细胞为昆虫细胞。尽管杆状病毒表达系统为优选的，但本领域技术人员应理解包括上文所描述的彼等表达系统的其他表达系统将有效达成本发明的目的，即重组蛋白的表达。
因此，本发明亦提供含有多核苷酸的杆状病毒，该多核苷酸包含编码本发明的多肽的序列。该杆状病毒，在下文中亦称为“根据本发明的杆状病毒”优选为经分离的杆状病毒。
此外，本发明因此亦提供一种质粒，优选表达载体，其包含有包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸。该质粒，在下文中亦称为“根据本发明的质粒”尤其为经分离的质粒。
本发明亦提供一种由杆状病毒感染和/或含有杆状病毒的细胞，该杆状病毒包含有包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸，或包含有包含编码本发明的多肽的序列的多核苷酸的质粒，优选表达载体。该细胞，在下文中亦称为“根据本发明的细胞”优选为经分离的细胞。
当用于经分离的细胞的上下文中时，术语“经分离”系除其天然环境以外存在且因此不为自然界产物的细胞。
在另一方面中，本发明亦关于本发明的多肽；本发明的多聚体；根据本发明的杆状病毒；本发明的免疫原性组合物；根据本发明的多核苷酸；根据本发明的病毒样粒子；根据本发明的质粒；和/或根据本发明的细胞用于制备药剂，优选疫苗的用途。
在此上下文中，本发明亦提供生产本发明的多肽的方法，其中该方法包含用根据本发明的杆状病毒感染细胞，优选昆虫细胞的步骤。
此外，本发明亦提供一种生产本发明的多肽的方法，其中该方法包含用根据本发明的质粒转染细胞的步骤。
本发明的多肽优选以足够稳定自组装可随后用于疫苗接种的病毒样粒子的高量表达。
如本文所用，术语“疫苗接种(vaccination/vaccinating)”意谓(但不限于)一种方法，其包括向个体施用抗原(诸如免疫原性组合物中所包括的抗原)，其中当向该个体施用时，该抗原(例如本发明的多肽或本发明的多聚体)引起或能够引起该个体中的保护性免疫反应。
本发明亦提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物，其用作药剂，优选用作疫苗。
特别是，提供本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状或疾病的方法中，其中轮状病毒优选为具有编码轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的基因组的群组中的轮状病毒。本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物尤其提供用于减少或预防由轮状病毒感染引起的粪便排出的方法中，其中病毒优选为具有编码轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的基因组的群组中的轮状病毒。因此，在一个特定实例中，若如本文所提及的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段由轮状病毒A的基因组编码，则本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防由轮状病毒A感染引起的一或多种临床症状、死亡率、粪便排出或疾病的方法中。
更特别是，本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物提供用于减少或预防个体的由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中或用于治疗或预防个体的轮状病毒感染的方法中。
如本文所提及的轮状病毒感染尤其系指感染轮状病毒A或轮状病毒C。
此外，本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物提供用于诱导针对个体的轮状病毒的免疫反应。
如本文所提及，个体优选为哺乳动物，诸如猪或牛；或鸟类，诸如鸡。特别是，个体为猪，且其中猪优选为猪崽或母猪，诸如怀孕母猪。最优选地，在诱导针对个体内的轮状病毒的免疫反应的情况下，该个体为怀孕母猪。在减少或预防个体中的由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出或治疗或预防个体的轮状病毒感染的情形下，该个体最优选为猪崽。
根据一个优选方面，本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于减少或预防猪崽中的由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中，其中该猪崽将由已施用免疫原性组合物的母猪哺乳。已施用免疫原性组合物的该母猪优选为已施用免疫原性组合物的母猪，而该母猪已怀孕，特别是怀有该猪崽。
此外，本发明系关于一种用于治疗或预防轮状病毒感染、减少、预防或治疗由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出或预防或治疗由轮状病毒感染引起的疾病的方法，其包含向个体施用本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物。
此外，提供一种用于在优选怀孕母猪中诱导产生对轮状病毒具有特异性的抗体的方法，其中该方法包含向该母猪施用本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物。
此外，本发明提供一种减少或预防猪崽中由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法，其中该方法包含
-向母猪施用本发明的多肽或根据本发明的免疫原性，及
-允许该母猪哺乳该猪崽，
且其中该母猪优选为怀孕母猪，特别是怀有该小猪。
优选地，该两种前述方法包含以下步骤：
-向怀有该猪崽的母猪施用本发明的多肽或根据本发明的免疫原性，
-允许该母猪生产该猪崽，以及
-允许该母猪哺乳该猪崽。
此外，提供一种减少猪崽中由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法，其中猪崽由已施用本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物的母猪哺乳。
如本文所提及的一或多种临床症状优选选自由以下组成的群：
-腹泻，
-轮状病毒定殖，特别是肠道轮状病毒定殖，
-病变，特别是宏观病变，以及
-减少的平均每日体重增加。
根据一个实例，本文所提及的一或多种临床症状为肠道，特别是小肠的轮状病毒定殖。根据另一实例，本文所提及的一或多种临床症状为肠病变，特别是宏观肠病变。
根据另一尤其优选方面，本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物用于上文所描述的任一方法中，其中
-该轮状病毒感染为感染基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒，
-该感染轮状病毒为感染基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒，
-针对轮状病毒的该免疫反应为针对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的免疫反应，或
-对轮状病毒具有特异性的所述抗体为对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒具有特异性的抗体，
且其中优选地，本发明的该多肽为或本发明的该免疫原性组合物分别包含本文所描述的包含基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的本发明的多肽中的任一者，特别是由与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
在一个特定方面中，如本文所提及的“感染基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒”为感染基因型P[23]轮状病毒。
在另一优选方面中，如本文所提及的“感染基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒”为感染基因型P[23]轮状病毒及基因型P[7]轮状病毒。
在一个特定方面中，如本文所提及的“针对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的免疫反应”为针对基因型P[23]轮状病毒的免疫反应。
在另一优选方面中，如本文所提及的“针对基因型[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的免疫反应”为针对基因型P[23]轮状病毒及基因型p[7]轮状病毒的免疫反应。
在一个特定方面中，如本文所提及的“对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒具有特异性的抗体”为对基因型[23]轮状病毒具有特异性的抗体。
在另一优选方面中，如本文所提及的“对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒具有特异性的抗体”包含或为对基因型P[23]具有特异性的抗体及对基因型P[7]轮状病毒具有特异性的抗体。
在另一方面中，施用本发明的多肽或本发明的免疫原性组合物以在动物中，优选在怀孕母猪中诱导对轮状病毒C具有特异性的抗体的产生。优选地，在此另一方面中，本发明的该多肽为或本发明的该免疫原性组合物分别包含本文所描述的包含轮状病毒C VP8蛋白质的免疫原性片段的本发明的多肽中的任一者，尤其由与SEQ ID NO:15的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
本发明进一步提供一种生产本发明的多肽和/或本发明的多聚体的方法，其中该方法包含用本发明的质粒转染细胞。
此外，提供一种生产本发明的多肽和/或本发明的多聚体的方法，其中该方法包含用本发明的杆状病毒感染细胞，优选昆虫细胞。
此外，本发明系关于一种生产本发明的免疫原性组合物的方法，其中该方法包含以下步骤：
(a)允许用包含编码本发明的多肽的核酸序列的载体感染培养物中的易感细胞，其中该多肽由该载体表达；
(b)其后特别是在该经培养细胞的上清液中回收该多肽，其中细胞碎片优选经由分离步骤与该多肽分离，该分离步骤优选地包括经由至少一个过滤器、优选两个过滤器的微过滤，其中该至少一个过滤器的孔径优选为约1μm至约20μm和/或约0.1μm至约4μm；
(c)通过向步骤(b)的混合物中添加二亚乙基亚胺(BEI)使载体灭活；
(d)通过添加硫代硫酸钠至由步骤(c)产生的混合物中来中和BEI；以及
(e)通过利用过滤器的过滤步骤自混合物移除一部分液体来浓缩由步骤(d)产生的混合物中的多肽，该过滤器的滤膜的分子量截止值在约5kDa与约100kDa之间，优选在约10kDa与约50kDa之间；
(f)及视情况将在步骤(e)后残余的混合物与选自由医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成的群的另一组分掺合。
在该方法的步骤(a)中，所述细胞优选为昆虫细胞且该载体优选为本发明的杆状病毒。
在该方法的步骤(b)中，该多肽最优选回收于所述经培养细胞的上清液中，而非自细胞内部回收。
此外，本发明提供本发明的免疫原性组合物及该免疫原性组合物在本文所描述的方法中的任一者中的用途，其中该免疫原性组合物可通过前述产生本发明的免疫原性组合物的方法获得。
此外，本发明提供一种多肽，其包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，以及
-异源二聚结构域，
其中该异源二聚结构域连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。
如本文所用的术语“二聚结构域”尤其系指能够特异性结合至另一二聚合结构域或与另一二聚合结构域缔合以形成二聚体的氨基酸序列。在一个实施例中，二聚结构域为能够结合至具有相同氨基酸序列的另一二聚结构域或分别与其均缔合以形成同源二聚体的氨基酸序列。二聚结构域可含有一或多个半胱氨酸残基，使得[a]一或多个二硫键可形成或已分别在缔合二聚结构域之间形成。
在本发明情形下，“异源二聚结构域”尤其系指衍生自除衍生如本文所提及的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的轮状病毒以外的实体的二聚结构域。举例而言，异源二聚结构域为由除轮状病毒以外的病毒的基因组或优选由真核细胞或原核细胞，尤其哺乳动物或禽类细胞的基因组编码的二聚结构域。
优选地，异源二聚结构域为由肠细胞对由衍生如本文所提及的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的轮状病毒感染敏感的物种的基因组编码的二聚结构域。举例而言，若轮状病毒VP8蛋白质的片段为猪轮状病毒VP8蛋白质的片段，则异源二聚结构域优选为由猪基因组编码的二聚结构域。根据另一实例，若轮状病毒VP8蛋白质的片段为鸡轮状病毒VP8蛋白质的片段，则异源二聚结构域优选为由鸡基因组编码的二聚结构域。
根据另一优选方面，异源二聚结构域分别能够形成或形成同源二聚体。
在一个优选实例中，本文所提及的异源二聚结构域为卷曲螺旋结构域，尤其亮氨酸拉链结构域。
该亮氨酸拉链结构域优选为c-Jun亮氨酸拉链结构域，诸如猪c-Jun亮氨酸拉链结构域。
实例
以下实例仅意欲说明本发明。其不应以任何方式限制申请专利范围的范畴。
实例1
融合蛋白质的设计、生产及测试：
构建体设计：
轮状病毒A VP4序列最初自最紧密匹配GenBank序列JX971567.1且归类为P[7]基因型的猪粪便样本获得。使用VP4氨基酸57-224(SEQ ID NO:3)，在下文中亦命名为“AVP8”，且对应于VP8蛋白质的凝集素样结构域，但其中N端延长八个氨基酸残基。接头部分为Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:9)。猪IgG Fc序列(SEQ ID NO:7)匹配IgG重链恒定前驱体的氨基酸242-470(Genbank序列BAM75568.1)。接收编码AVP8的IDT Gblock、Gly-Gly-Ser接头及猪IgG Fc序列(SEQ ID NO:17)，所有密码子均针对昆虫细胞优化且在本文中命名为AVP8-IgGFc。由AVP8-IgG Fc编码的蛋白质(SEQ ID NO:12)在本文中亦称为“AVP8-IgG Fc蛋白质”。
克隆、表达及纯化：
AVP8-IgG Fc为TOPO克隆的，且随后使用BamHI及NotI限制位点插入杆状病毒转移质粒pVL1393中，接着与BaculoGold共转染至Sf9细胞中以产生重组杆状病毒。生产AVP8-IgG Fc蛋白质系如下进行：在0.2MOI下，于3L转瓶中的1L Sf+细胞用捕获4DPI的消耗培养基感染，在15,000g下离心20分钟且经0.2μm过滤。添加1mL的MabSelect SuRE LX树脂浆料(GE Healthcare，目录号17-5474-01)且在4℃下通过适度搅拌培育隔夜。通过过滤再捕获树脂，经4×10mL的温和结合缓冲液(Pierce，目录号21012)洗涤且在7×5mL体积的温和洗提缓冲液(Pierce，目录号21027)中洗提。合并洗提份且在4℃下针对3.5L TBS透析一次缓冲液变化。进行BCA分析(Thermo Scientific，目录号23227)以测定含量(80μg/mL)。
血清学研究：
用具有87.5％抗原及12.5％佐剂的Emulsigen D调配蛋白质A纯化的AVP8-IgG Fc蛋白质。大致七周龄的小猪通过IM在颈部侧面上接受2mL剂量，其中21天后增强。每周收集血清样本持续七周。通过ELISA评估来自疫苗接种如下文所描述(“用于ELISA的方案”)AVP8-IgG Fc蛋白质的猪的血清(图1)，及如下文所描述(“用于病毒中和分析的方案”)病毒中和分析法(图2)。与非相关疫苗对照相比，来自经AVP8-IgG Fc蛋白质疫苗接种的猪的IgGELISA结果展示在第14天SP比率峰值增加且在第21天增强后再次升高。病毒中和效价类似地展示第7天及第14天增加，接着第21天增强后第28天的第二峰值。
用于ELISA的方案
对于IgA ELISA，用稀释于1×PBS 1:16中的完整轮状病毒抗原涂布培养基蛋白结合96孔ELISA培养盘。在4℃下培育培养盘隔夜。培育后，使用1×PBST洗涤培养盘且随后在37℃下用酪蛋白阻断溶液阻断1小时。在洗涤后，将100μL于阻断缓冲液中稀释至1:40的最终稀释液的初级抗体添加至培养盘中且在37℃下培育1小时。在洗涤后，孔涂布有100μl的辣根过氧化酶(HRP)-缀合-羊-抗猪-IgA的1:3200稀释液且在37℃下培育一小时。在洗涤后，在室温下用3,5,3',5'-四甲基联苯胺显影培养盘15分钟，且在450nm处的光学密度(OD)量测前，用1N HCl来终止反应。包括阳性及阴性对照的样本在重复孔中运作且结果报导为(样本-阴性对照)至(阳性-阴性对照)比率(S-N)/(P-N)的平均值。
对于IgG ELISA，用稀释于1×PBS 1:8中的完整轮状病毒抗原涂布培养基蛋白结合96孔ELISA培养盘。在4℃下培育培养盘隔夜。培育后，使用1×PBST洗涤培养盘且随后在37℃下用印迹级阻断溶液阻断1小时。在洗涤后，将100μL于阻断缓冲液中稀释至1:625的最终稀释液的初级抗体添加至培养盘中且在37℃下培育1小时。在洗涤后，孔涂布有100μl的辣根过氧化酶(HRP)-缀合-羊-抗猪-IgG的1:8000稀释液且在37℃下培育一小时。在洗涤后，在室温下用3,5,3',5'-四甲基联苯胺显影培养盘10分钟且在450nm处的光学密度(OD)量测前，用1N HCl来终止反应。包括阳性及阴性对照的样本在重复孔中运作且结果报导为(样本-阴性对照)至(阳性-阴性对照)比率(S-N)/(P-N)的平均值。
用于病毒中和分析的方案
将所有血清及牛奶样本在56℃下加热灭活30分钟。将样本在轮状病毒生长培养基(MEM+2.5％HEPES+0.3％胰蛋白磷酸酯培养液+0.02％酵母+10μg/mL胰蛋白酶)中自1:40连续稀释至1:2,560。将轮状病毒A分离株(效价7.0对数TCID50/mL)1:25,000稀释至轮状病毒生长培养基中。将总共200μl经稀释的血清添加至200μl经稀释的病毒中；在37℃±5％CO2下培育混合物一小时。自接种有MA104细胞的三四天龄的96孔盘无菌移除生长培养基。在培育后，将200μl的病毒-血清混合物转移至细胞培养盘中。在37℃±5％CO2下培育细胞72小时。在使用当天滴定储备液及经稀释的病毒以确定分析中所使用的稀释度。在培育后，丢弃上清液且将培养盘用200μL/孔1×PBS洗涤一次。为固定，添加100μL/孔的50％/50％丙酮/甲醇。将培养盘在室温下培育15分钟，风干，随后用100μL/孔1×PBS复水。初级抗体(兔抗轮状病毒A多株血清，内部产生)在1×PBS中以1:1000稀释。添加100μL/孔的经稀释的初级抗体，且将培养盘在37℃±5％CO2下培育一小时。在培育后，培养盘用100μL/孔1×PBS洗涤两次。将二级抗体(Jackson ImmunoResearch FITC标记的羊-抗家兔IgG，目录号111-095-003)在1×PBS中以1:100稀释。添加100μL/孔的经稀释的二级抗体，且将培养盘在37℃±5％CO2下培育一小时。在培育后，培养盘用100μL/孔1×PBS洗涤两次。使用紫外辐射显微镜读取培养盘以供存在荧光。若发现经稀释的病毒的效价(使用Reed-Muench方法产生)为2.8±0.5对数TCID50/mL，则该分析视为有效的。另外，各分析中包括已知阳性及阴性样本作为对照。血清效价报导为最高稀释度，其中未观测到染色。
实例2
攻击研究：
此研究的主要目的为评价向猪提供针对毒力轮状病毒A攻击的被动保护的常规母猪施用原型疫苗,在本文中亦称为“IgG:AVP8”，包括AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12)及非相关对照疫苗，在本文中称为“安慰剂”。此外，为了比较，在该研究中使用可商购的MLV轮状病毒痘苗(
Rota,Merck Animal Health)，在本文中亦称为“商业产品”或“商业疫苗”。以与上文实例1中所描述的生产类似的方式生产原型疫苗，但其中不同体积用于感染且培育时段更长，如下文章节“IgG:AVP8的生产”中所描述。商业产品系根据用于疫苗
TGE/Rota的由制造商提供的标签说明书(剂量及方向，以及用于猪的口服疫苗接种的建议方法)。
研究中包括总共16只母猪。将母猪随机分为三个处理组及一个严格对照组，如下表1中所描述。将T02及T04中的母猪共混于三个房间之间。将T06及T07中的母猪圈养在两个单独的房间中。所有母猪均通过如表1中所列的适当途径接种适当物质。T07中的母猪保持未经疫苗接种(严格对照)。在整个疫苗接种时段期间定期自母猪收集血清且分析血清转化的证据。在分娩前收集粪便样本且通过RT-qPCR筛选以证实母畜在分娩前未主动排出轮状病毒。每日记录各母猪的整体健康状况观测结果。使分娩天然进行直至母猪到达妊娠第114天。此后，诱导分娩。在分娩时，猪崽入选试验中。仅将在出生时健康的猪崽标记，根据设施标准操作程序处理且包括于试验中。当猪为零至五日龄时，对其进行抽血，收集粪便拭子，且攻击猪(不包括T07)。在攻击时，向猪胃内施用5mL剂量的碳酸氢钠，随后胃内施用5mL剂量的攻击物质。在整个攻击时段，每日监测所有动物是否存在肠道疾病(腹泻及行为变化)。在整个攻击时段定期收集粪便样本。在攻击后两天(DPC 2)，使大致三分之一的来自各窝的猪安乐死。安乐死后，进行尸体剖检且评估猪的宏观病变。收集肠切片用于显微及免疫组织化学评价。收集肠拭子用于RT-qPCR评价。在DPC 21，对所有剩余猪进行称重、抽血且收集粪便拭子。在样本收集后，将猪安乐死。评价猪的宏观病变且收集肠拭子。
表1：研究设计
*IM＝肌肉内，IN＝鼻内
在整个研究中，来自T07(严格对照)的母猪的血清VN效价保持恒定或下降，指示缺乏暴露及有效研究(如上文在实例1中所描述来评估病毒中和(“用于病毒中和分析的方案”)，结果展示于图3)。在疫苗接种阶段，在疫苗接种IgG:AVP8(T04)原型疫苗的母猪血清中观测到最高中值VN效价。在此组中，在分娩前六周施用的一剂导致在T04(IgG:AVP8)中的3/5动物到D14时效价增加四倍或更多。在猪攻击前，T04(IgG:AVP8)中的5/5只动物的效价增加四倍或更多。在疫苗接种阶段，安慰剂组(T02)中的母猪的血清VN效价无显著增加(<2倍)。直至D35，在T06(商业疫苗)中的母猪的血清VN效价无显著增加(<2倍)。在猪攻击前，T06(商业疫苗)的两只母猪的效价增加四倍。在外肌暴露至攻击物质后，T02(安慰剂)及T06(市售疫苗)中的母猪的VN血清效价增加。相反，在4/5母猪中，T04(IgG:AVP8)中的母猪的VN血清效价保持恒定或降低。关于初乳及乳汁VN效价，在组T04(IgG:AVP8)中，在分娩时VN效价最高，在攻击前样本中降低且在攻击后样本中进一步降低。在安慰剂组(T02)中，在分娩及攻毒前VN效价较低，但在外肌暴露至攻击物质后增加。
在攻击前猪血清中的VN效价在T04(IgG:AVP8)中的大部分猪中较高(>1280)，表明来自母猪的免疫性被动转移至小猪。相反，T02(安慰剂)及T06商业疫苗)中的猪的大部分效价较低(<1280)。
在整个攻击阶段中，在T02(安慰剂)中观测到最高死亡率数目，其中8/57(14.0％)的猪死亡。相反，在T04(IgG:AVP8)中仅1/46(2.2％)猪死亡，在T06(商业疫苗)中1/22(4.5％)猪死亡，且在T07(严格对照)中1/27(3.7％)猪死亡。在整个研究中，在T07(严格对照)中的猪中未观测到腹泻的临床症状。在攻击后第1天或第2天，T02(安慰剂)中的猪开始腹泻的临床症状且在DPC10在大部分动物中消退。总体而言，在研究期间至少一次在T02(安慰剂)中的44/57(77.2％)的动物中观测到腹泻的临床症状。在此等44只动物中，腹泻在29(65.9％)只动物中视为严重的。相比的下，在T04(IgG:AVP8)中的猪中腹泻的临床症状减少。关于各组的临床腹泻结果的概述，参见下表2。
表2：各组具有异常腹泻(曾有)的动物的百分比
| 组别 | 曾经异常* | 曾经严重** |
| T02-安慰剂 | 44/57(77.2％) | 29/44(65.9％) |
| T04-IgG:AVP8 | 15/46(32.6％) | 8/15(53.3％) |
| T06-商业疫苗 | 13/22(59.1％) | 10/13(76.9％) |
| T07-严格对照 | 0/27(0.0％) | 不适用 |
*包括在研究期间至少一次得分为1或2的猪除以每组猪的总数
**包括在研究期间至少一次得分为2的猪除以曾经异常的猪的总数
在攻击前，通过RT-qPCR未检测到轮状病毒A RNA，表明为有效研究。另外，在整个研究中，在来自T07(严格对照)母猪或猪中通过RT-qPCR未检测到轮状病毒A RNA。在攻击后的猪中，在T02(安慰剂)中的排出最普遍。在大部分猪中，在DPC1-3开始排出且持续直至DPC14。最关注的系与T02(安慰剂)及T06(商业疫苗)相比，T04(IgG:AVP8)中观测到的排出减少。排出的百分比及所检测的RNA的中值量均减少(参见图4，关于研究日的组中值对数轮状病毒A RNA基因组复本数(gc)/mL粪便)；测试如下文所描述进行(“用于轮状病毒A qRT-PCR的方案”)。
将来自各组的随机选择的猪子集安乐死且在DPC2进行尸体剖检。评价猪的存在宏观肠病变(薄壁、气扩张的小肠、纯液体含量等)、显微病变(萎缩性肠炎)及通过免疫组织化学(IHC)特定染色的轮状病毒A。下表3呈现在按组尸体剖检时具有肠病变的猪的数目。攻击视为成功的，因为安慰剂组(T02)中的84.2％(16/19)猪具有宏观病变且彼等的63.2％(12/19)具有染色。最关注的系在T04(IgG:AVP8)中仅1/15猪缺乏轮状病毒A染色。另外，相比于T02(安慰剂)及商业产品(T06)，在T04(IgG:AVP8)中具有宏观病变的猪的百分比降低。
表3.在按组尸体剖检时具有肠病变及IHC染色的动物的百分比.
*表示在DPC2处具有肠病变的猪的数目除以DPC2处的猪尸体剖检的总数目
**其中得分1＝<10％的绒毛含有抗原，得分2＝10％至50％的绒毛含有抗原，得分3＝>50％的绒毛含有抗原
§不适用，因为来自T07的猪不进行尸体剖检
计算存活猪的平均每日体重增加(以kg为单位)且呈现于下表4中。在来自T04(IgG:AVP8)的猪中观测到ADWG中的最高数值益处。疫苗接种后ADWG的增加与T02(安慰剂)相比显著不同。
表4.按组的以kg为单位的平均每日体重增加(标准偏差).
总的，用IgG:AVP8原型疫苗(包含SEQ ID NO:12的多肽)在分娩前六周及两周对常规母猪进行疫苗接种在母猪血清及初乳中产生较高中和抗体效价。如通过在来自疫苗接种的母猪的猪血清中检测高效价(>1280)所证明，此等中和抗体被动传输至出生后的猪。猪中存在较高中和抗体效价引起临床保护。特别是，相比于安慰剂对照及商购疫苗生出的猪，接种疫苗的母猪生出的猪具有减少的轮状病毒A RNA的粪便排出、降低的死亡率、减少的腹泻临床症状、减少的在DPC2处的轮状病毒A的定殖、减少的在DPC2处的宏观病变及增加的ADWG。
用于轮状病毒A qRT-PCR的方案
为了测定粪便样本中的轮状病毒A RNA，定量一步RT-PCR套组(iTaq Universal一步RT-PCR套组；BioRad，目录号1725140)用于分析。关于引物及探针信息参见下表5。
表5：引物(F/R)及探针(Pr1/Pr2)信息
在含有5μl的所提取总核酸、1μl的各探针(5μM)、1μl的各引物(10μM)、10μl的2×RT-PCR混合、0.5μl iScript逆转录酶及0.5μl的经DEPC处理的水的20μl反应物中进行实时RT-PCR。使用CFX96实时PCR检测系统(BioRad)在以下条件下进行反应：初始逆转录在50℃下10min，接着初始变性在95℃下3min，40个周期的95℃下的变性15s及60℃下退火及延伸45s。为产生相对定量数据，两种轮状病毒A g阻断液的连续稀释液包括于各运行中。使用5.0×107个基因组复本/μL作为起始浓度，在运行中包括相等量的g阻断液中的每一者。使用CFX管理器软件分析光学数据。对于各测定，使用循环临限值(Ct)测定模式的回归设置自动地计算临限值线。使用减去基线的模式自动进行基线减除。人工校正基线末端值小于10的曲线。
IgG:A VP8的生产
在5L摇瓶中用1.7mL的含有轮状病毒A VP8核-猪IgG Fc融合蛋白质(BaculoGold(BG)/pVL1393-AVP8-IgG；1.18×108TCID50/mL)的重组杆状病毒储备液感染于摇瓶中的大致1×106个细胞/毫升浓度的2L Sf+(草地黏虫Spodoptera frugiperda))细胞。将摇瓶在28℃±2℃下在以90rpm的持续搅拌下培育五天。将细胞及培养基无菌转移至3×1L离心瓶中，且在4℃下以10,000g使细胞集结20分钟。使所得上清液通过0.2μm过滤器(ThermoScientific，目录号567-0020)，随后在4℃下在适度搅拌下用2.5mL的MabSelect SuRe LX蛋白A树脂(GE Healthcare，目录号17-5474-01)培育隔夜。树脂通过0.2μm过滤(ThermoScientific，目录号567-0020)回收，随后用12×10mL体积的温和Ag/Ab结合缓冲液(ThermoScientific，目录号21012)洗涤。使用7×10mL体积的温和Ag/Ab洗提缓冲液(ThermoScientific，目录号21027)自树脂洗提AVP8-IgG。将VP8-IgG相对于3.5L的20mM Tris pH7.5、150mM NaCl渗析一次缓冲液变化。在37℃下将残余杆状病毒用5mM BEI灭活24小时。所得物质在1×PBS(Gibco，目录号10010-023)中稀释至70μg/mL的目标浓度。用12.5％Emulsigen D调配经稀释的物质。
实例3
血清学研究：
此研究的主要目的为评价向常规母猪施用原型疫苗(包括AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12))及对照疫苗(本文中称为“安慰剂”)是否产生针对轮状病毒A的血清学反应。原型疫苗(包含Emulsigen D或Carbopol作为佐剂，参见下表7A及表7B)，在本文中亦称为“IgG-AVP8”系以类似于上文在实例1及2中所描述的生产方式生产，但其中不同体积用于感染及更长的培育期，如下文在章节“疫苗生产：IgG-A VP8”中所描述。
研究中包括总共20只母猪。将母猪随机分为四个处理组，如下表6中所描述。在整个研究中，将母猪共混。所有母猪在D0及D21时肌肉内疫苗接种适当物质，如表4中所列出。在整个研究中定期自母猪收集血清且通过病毒中和分析来分析血清转化的证据。每日记录各母猪的整体健康状况观测结果。在D42终止研究。
表6：研究设计
*IM＝肌肉内
在整个研究中，来自T06及T07(安慰剂组)中的母猪的血清VN效价保持恒定或下降，表明缺乏暴露及有效研究(病毒中和系如上文在实例1中所描述评估(“用于病毒中和分析的方案”)，其中评价增加的稀释度-1:40至1:40,960的修改)。在疫苗接种阶段，经IgG-AVP8/Emulsigen D(T02)及IgG-AVP8/Carbopol(T03)原型疫苗接种的母猪的效价显著增加(>4倍)。对于两组(T02及T03)，在一次疫苗接种后各组平均效价高于640且在整个研究时段中保持高于640。相比的下，安慰剂组(T06及T07)中的母猪在整个研究中血清VN效价无显著增加(＜2倍)。
总的，用IgG-AVP8原型疫苗(包含SEQ ID NO:12的多肽)在分娩前六周及两周对常规母猪进行疫苗接种在母猪血清中产生较高中和抗体中和抗体。
疫苗生产：IgG-A VP8
对于0.22的MOI，用1.19×108TCID50/mL的15mL BG/pVL1393-AVP8-IgG感染于有夹套的10L Sartorius Biostat B玻璃容器中的8L的1.00×106个细胞/毫升的Sf+细胞。生物反应器在27℃下在100rpm搅拌下运作且在0.3slpm下鼓泡氧气。在6DPI下捕获容器，在10,000g及4℃下离心20分钟，且以0.8/0.2μm过滤上清液(GE Healthcare,目录号6715-7582)。在27℃下用5mM BEI使2750mL的澄清上清液灭活五天。在残余BEI用硫代硫酸钠中和后，使用10kDa中空纤维过滤器(GE,目录号UFP-10-C-4MA)浓缩2750mL大致12×至225mL。浓度测定为255μg/mL。
表7A.疫苗调配物
| 组分 | 目标 | 体积 | 浓度 |
| AVP8-IgG蛋白质 | 抗原 | 16.5mL | 27.5％ |
| PBS | 稀释液 | 31.5mL | 52.5％ |
| Carbopol | 佐剂 | 12mL | 20％ |
表7B.疫苗调配物
| 组分 | 目标 | 体积 | 浓度 |
| AVP8-IgG蛋白质 | 抗原 | 16.5mL | 27.5％ |
| PBS | 稀释液 | 36mL | 60％ |
| Emulsigen D | 佐剂 | 7.5mL | 12.5％ |
实例4
此研究的主要目的为评价经IgG-AVP8(包括AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12))疫苗接种的动物是否能够交叉中和除P[7]以外的各种G型及P型的各种轮状病毒A血清型/基因型，AVP8-IgG Fc蛋白质系自该研究设计。此将指示AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12)针对其他分离株具有保护性的能力。
简言之，来自经IgG-AVP8疫苗接种的猪的热灭活血清以1:200开始在自列A至列G的稀释阻断液中在MEM中稀释2倍。列H不含血清。在另一稀释阻断液中，各种G型及P型的轮状病毒A在来自第1行至第11行的6.0Log10TCID50/mL开始的整个稀释盘中稀释1.5倍。第12栏不含病毒。将来自相应孔的250μL病毒及250μL血清合并且在37℃下培育1小时。在培育1小时后，将100μL病毒-血清混合物覆盖于单层MA104细胞上，且在37℃下培育72小时并且通过IFA染色且读取病毒的存在。病毒的存在记录为培养盘上的“+”且病毒的缺乏记录为“0”。随后将此等结果转移至表8。
将以下六种轮状病毒A分离株与此分析进行比较；G9P[7]、G9P[23]、G4P[23]、G3P[7]、G5P[7]及G4P[7]。表1中的结果表明P型P[23]交叉中和P[7]。包括P[7]或P[23]的所有G型亦经中和，指示在此分析中，G型在病毒的中和中并不显著。
表8：研究设计及结果
总之，经IgG-AVP8(包括AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12))疫苗接种的动物将交叉中和轮状病毒基因型P[7]及P[23]。G型在病毒中和方面发挥显著作用。
实例5
猪中的概念实验验证：
总共40只动物用于此研究。猪随机分为四个处理组，每组10只猪。在整个研究中，将猪共混。在处理前获取整体健康状况观测结果、筛选前血清样本及筛选前粪便样本以确认动物健康，确定对轮状病毒A的基线血清学反应且在疫苗接种前或在疫苗接种时证实无活性轮状病毒A感染。研究第零天(D0)时，动物肌肉内疫苗接种以下物质：T01：IgG-P[7]AVP8疫苗(包含SEQ ID NO:12的多肽)；T02：IgG-P[13]AVP8疫苗(包含SEQ ID NO:14的多肽)；T03：P[7]AVP8-IgG-P[13]AVP8疫苗(包含SEQ ID NO:16的多肽)；T04：安慰剂。在研究第0、7、14、21、28、36、42及49天采集血清样本。在研究D49时在尸体剖检时对所有动物进行人道安乐死。通过病毒中和分析法测试血清样本以测定随时间推移对疫苗原型的血清学反应。经T01疫苗接种的动物具有抗体中和轮状病毒基因型P[7]及P[23]，经T02疫苗接种的动物具有抗体中和轮状病毒基因型P[13]且经T03疫苗接种的动物具有抗体中和轮状病毒基因型P[7]、P[13]及P[23]。
实例6
SDS PAGE：
存在及不存在DTT(图5A))的经蛋白质A纯化的AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12)产物的SDS-PAGE：产生用于SDS-PAGE影像的样本的方法简化如下:在37℃下用10mM BEI灭活杆状病毒收获上清液36小时且随后中和。随后使用蛋白A树脂纯化样本。所有样本随后使用具有25mM DTT(最终)或等体积水的NuPAGE 4×LDS样本缓冲液(Invitrogen，目录号NP0007)变性，且在95℃下加热10分钟。样本在180V下的4％-12％SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，目录号NP0335BOX)上运行45分钟且染色(eStain L1，GenScript目录号M00548-1；destain目录号M00549-1)。
因此，发现在具有还原(+DTT(二硫苏糖醇))样本的色带中,主要一个条带(单体AVP8-IgG Fc蛋白质，其结合下文所描述的免疫印迹法的结果考虑)。在用未经还原的样本(-DTT)运行的色带中可见其他条带。额外条带的分子量范围各自为单体的倍数。
免疫印迹法：
抗猪IgG Fc片段免疫印迹法(图5B))：在BEI添加前，用1mL样本收集在生物反应器中产生的AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12)产物。样本在20,000g及4℃下离心5分钟，将上清液倾析至新试管中，且将集结粒与上清液储存于-70℃下。集结粒及上清液经解冻，将集结粒再悬浮于1mL 8M脲中，随后在还原条件(+DTT)下在SDS-PAGE上运行等量集结粒及上清液，且转移至PVDF膜。用HRP结合羊抗猪的1:1000稀释液来探测免疫印迹以检测猪IgG Fc片段。
因此，未在细胞集结粒样本中出乎意料地发现AVP8-IgG Fc蛋白质。实际上，在细胞培养物上清液样本中有利地发现所有AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12)。
实例7
共有序列的产生：
产生SEQ ID NO:4(基于基因型P[6]轮状病毒VP8蛋白质)及SEQ ID NO:5(基于基因型P[13]轮状病毒VP8蛋白质)的共有序列，如下文中所描述：
序列由公开可获得的猪轮状病毒VP4核苷酸序列自NCBI病毒变化数据库及内部衍生的轮状病毒分离序列编译。亦编译序列的额外后设数据，包括用于以下元数据：分离株名称、分离株P型、地理来源及可获得时的分离日期。将核苷酸序列翻译成蛋白质序列，且使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类法及预设空隙罚分参数比对至已知VP8蛋白质。修整未比对的VP5氨基酸且丢弃。将VP8比对蛋白质序列导入MEGA7软件以进行种系发生分析，且基于VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建。使用泊松校正法以及种系发生的自助重抽检验来计算最优树(n＝100)且按比例绘制，其中分支长度等于在总共170个位置上以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离。其中将自助重抽法聚类关联大于70％的节点视为显著的。将具有大致10％距离及大于70％的自助重抽聚类关联的节点指定为聚类。将不拟合至大聚类中的离群序列个别地针对序列质量及P型来源进行评估。自分析中移除疑似低质量序列，而保留来自在猪轮状病毒中很少观测到的P型的序列。基于所需产物保护概况以及活体外血清交叉中和研究选择用于产生共有序列的聚类。根据每个比对位置的最大频率产生共有序列，在其中在比对位置中观测到相等比例的氨基酸的情况下，基于所报导的流行病学数据以及产物保护概况选择氨基酸残基。
实例8
攻击研究：
此研究的主要目的为评价向猪提供针对毒力轮状病毒A攻击的被动保护的常规母畜施用原型疫苗,在本文中亦称为“IgG#AVP8”，包括AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12)及非相关对照疫苗，在本文中称为“安慰剂”。以与上文实例1中所描述的生产类似的方式生产原型疫苗，但其中不同体积用于感染及不同的纯化方法，如下文章节“IgG#A VP8的生产”中所描述。
研究中包括总共20只母畜。将母畜随机分为两个处理组及一个严格对照组，如下表9中所描述。将T01及T03中的母畜在三个房间之间共混。将T07中的母畜圈养在独立的房间中。所有母畜均通过如表9中所列的适当途径接种适当物质。T07中母畜保持未经疫苗接种(严格对照)。在整个疫苗接种时段期间定期自母畜收集血清且分析血清转化的证据。在分娩前收集粪便样本且通过RT-qPCR筛选以证实母畜在分娩前未主动排出轮状病毒。每日记录各母猪的整体健康状况观测结果。使分娩天然进行直至母猪到达妊娠第114天。此后，诱导分娩。在分娩时，猪崽入选试验中。仅将在出生时健康的猪崽进行标记，根据设施标准操作程序处理且包括于试验中。当猪一至五日龄时，对其进行抽血，收集粪便拭子，且攻击猪(不包括T07)。在攻击时，向猪胃内施用5mL剂量的碳酸氢钠，随后胃内施用1mL剂量的攻击物质。在整个攻击时段，每日监测所有动物是否存在肠道疾病(腹泻及行为变化)。在攻击后一天(DPC1)收集粪便样本。在DPC2，使T01及T03中的所有猪安乐死。收集肠切片用于显微及免疫组织化学评价。
表9：研究设计
*IM＝肌肉内
在整个研究中，来自T07(严格对照)的母畜的血清VN效价增加低于4倍，表明缺乏暴露及有效的研究(如上文实例1(“用于病毒中和分析的方案”)中所描述来评估病毒中和，结果展示于表10及图6中)。在疫苗接种阶段，在疫苗接种原型疫苗IgG#AVP8(组T03)的母畜血清中观测到最高平均值VN效价。在此组中，在分娩前六周施用的一剂导致T03(IgG#AVP8)中6/8动物到D14时效价增加四倍或更多。在疫苗接种阶段，组T01(安慰剂)中的母畜中无一者具有显著的血清VN效价增加(<2倍)。母畜初乳VN效价：组T03(IgG#AVP8)中的母畜具有相比于组T01(安慰剂)中的母畜更高的平均VN效价。
表10：VN结果
*DOF＝分娩日
在攻击前猪血清中的VN效价在T03(IgG#AVP8)中的大部分猪中较高(>1280)，表明来自母畜的免疫性被动转移至小猪。相反，在T02(安慰剂)中的猪中大部分效价较低(<1280)。
在组T01(安慰剂)及T03(IgG#AVP8)中,若轮状病毒抗原系通过至少一个肠部分中的免疫组织化学(IHC)来检测，则猪被定义为感染的,且动物在攻击后至少一天具有异常粪便为了。频率分布列于下表11中。基于此案例定义的用途，在分娩前6周及2周用原型疫苗IgG#AVP8(组T03)疫苗接种的母畜在用异源轮状病毒A P[7]攻击物质攻击后的猪中避免轮状病毒相关的疾病；预防分率0.926，95％信赖区间0.734、0.979。
表11.案例定义的频率分布
*案例定义：若回肠或空肠组织样本中的一或多者对轮状病毒A为IHC阳性(分数>0)且在攻击后的任一天具有至少一个异常粪便得分，则猪被视为感染的。得分0＝未感染；1＝感染的总之，在分娩前六周及两周用原型疫苗IgG#AVP8(包含SEQ ID NO:12的多肽)对常规母畜进行疫苗接种在母猪血清及初乳中产生较高中和抗体效价。如通过在来自疫苗接种的母畜的猪血清中检测高效价(>1280)所证明，此等中和抗体被动传输至出生后的猪。猪中存在较高中和抗体效价引起临床保护。特别是，相比于安慰剂对照生出的猪,疫苗接种的母畜生出的较少的猪视为感染的。
IgG#A VP8的生产
将两个10L有夹套的Sartorius Biostat B玻璃容器以1.00×106个细胞/毫升接种3L Sf+细胞。在接种后三天，各容器以0.1的MOI感染且使用实例细胞420无血清培养基(SAFC目录号14420C-1000mL)将各容器的体积调节至8L。生物反应器在27℃下在100rpm搅拌下运行，其中溶氧设定为40％或高于40％，且CCA覆层在1.3slpm下。在接种后7天收集容器；在4℃下以10,000g使流体离心20分钟，且以0.8/0.2μm过滤上清液(GE Healthcare，目录号6715-7582)。在37℃下通过5mM BEI在有夹套的Sartorius Biostat B玻璃容器中使澄清的上清液(8L/容器)灭活三天。在灭活后，用硫代硫酸钠中和残余BEI。在中和后，使用10kDa中空纤维过滤器(GE，目录号UFP-10-C-5A)将7000mL浓缩大致10×至700mL。用5个体积(3500mL)的1×PBS对经浓缩的物质进行透滤。疫苗用12.5％Emulsigen D、28％浓缩物质及59.5％1×PBS(体积:体积)调配。
实例9
猪中的概念实验验证：
总共20只动物用于此研究。猪随机分为两个处理组，每组10只猪。在整个研究中，将猪共混。在处理前获取整体健康状况观测结果、筛选前血清样本及筛选前粪便样本以确认动物健康，确定对轮状病毒C的基线血清学反应且在疫苗接种前或在疫苗接种时证实无活性轮状病毒C感染。研究第零天(D0)及D28时，动物肌肉内疫苗接种以下物质：T01：IgG-PCVP8疫苗(包含SEQ ID NO:15的多肽)；T02：安慰剂。在研究第0、7、14、21、28、36及42天采集血清样本。在研究D42时在尸体剖检时对所有动物进行人道安乐死。通过ELISA测试血清样本以测定随时间推移对疫苗原型的血清学反应。经T01疫苗接种的动物的抗轮状病毒C抗体平均含量高于经T02疫苗接种的动物，其效价未增加。
【附图说明】
图1：针对猪轮状病毒A疫苗接种经Emulsigen D调配的AVP8-IgG Fc蛋白质(在标记中称为“AVP8-IgG”)或安慰剂(“非相关对照”)的猪的血清IgG反应。
图2：在疫苗接种经Emulsigen D调配的AVP8-IgG Fc蛋白质(在标记中称为“AVP8-IgG”)或安慰剂(“非相关对照”)的猪的样本中，针对能够中和猪轮状病毒A病毒的检测及定量抗体所进行的病毒中和(virus neutralization；VN)分析的结果。
图3：在分组日及研究日，针对母猪血清中的轮状病毒的平均VN效价，其中研究日D0及D28表示时间点“分娩前六周及两周”(亦即，当试验用产品分别施用研究组T02及T04时)且研究日D7、D28及D35表示时间点“分娩前五周、两周及一周”(亦即，当商用疫苗施用T06时)。
图4：研究日的组中值对数粪便中的轮状病毒A RNA基因组复本数(gc)/毫升。
图5：A)经二硫苏糖醇还原(“+DTT”)或未还原(“-DTT”)的经蛋白质A纯化的AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12)产物样本的SDS-PAGE；B)AVP8-IgG Fc蛋白质(SEQ ID NO:12)生物反应器产物的免疫印迹法，其中样本经离心以分离出细胞集结粒洗提份(“集结粒”)及上清液洗提份(“上清液”)，该样本在冷冻-解冻制程后在还原条件(+DTT)下溢流于SDS-PAGE上，传递至PVDF膜且经缀合羊抗猪的HRP探测以检测猪IgG Fc片段。
图6：在分组日及研究日，针对母猪血清中的轮状病毒的平均VN效价，其中研究日D0及D28表示时间点“分娩前六周及两周”(亦即，当试验用产品分别施用研究组T01及T03时)。
【在序列表/来源及地理来源(在适用情况下)中】：
SEQ ID NO:1对应于来源于North Carolina,USA的农场的(基因型P[7])轮状病毒VP8蛋白质的序列，
SEQ ID NO:2对应于来源于North Carolina,USA的农场的(基因型P[7])轮状病毒VP8蛋白质的凝集素样结构域的序列，
SEQ ID NO:3对应于来源于North Carolina,USA的农场的(基因型P[7])轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的序列，
SEQ ID NO:4对应于轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的序列，亦即，轮状病毒VP8蛋白质(基于基因型P[6])的一部分的共有序列，
SEQ ID NO:5对应于轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的序列，亦即，轮状病毒VP8蛋白质(基于基因型P[13])的免疫原性片段的共有序列的一部分的共有序列，
SEQ ID NO:6轮状病毒C VP8蛋白质的免疫原性片段的序列，
SEQ ID NO:7对应于猪IgG Fc片段的序列，
SEQ ID NO:8对应于天竺鼠IgG Fc片段的序列，
SEQ ID NO:9对应于接头部分的序列，
SEQ ID NO:10对应于接头部分的序列，
SEQ ID NO:11对应于接头部分的序列，
SEQ ID NO:12对应于包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:7的序列的多肽(融合蛋白质)的序列，
SEQ ID NO:13对应于包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:7的序列的多肽(融合蛋白质)的序列，
SEQ ID NO:14对应于包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:7的序列的多肽(融合蛋白质)的序列，
SEQ ID NO:15对应于包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:7的序列的多肽(融合蛋白质)的序列，
SEQ ID NO:16对应于包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:5的序列的多肽(融合蛋白质)的序列，
SEQ ID NO:17对应于编码SEQ ID NO:12的多肽(融合蛋白质)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:18对应于编码SEQ ID NO:13的多肽(融合蛋白质)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:19对应于编码SEQ ID NO:14的多肽(融合蛋白质)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:20对应于编码SEQ ID NO:15的多肽(融合蛋白质)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:21对应于编码SEQ ID NO:16的多肽(融合蛋白质)的多核苷酸的序列，
SEQ ID NO:22-25：引物及探针序列(表5)。
本文中亦揭示以下技术方案。因此，本发明进一步包括由以下技术方案特性化的方面：
1.一种多肽，其包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，以及
-免疫球蛋白Fc片段。
2.如技术方案1的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，
或其中该免疫球蛋白Fc片段连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端。
3.如技术方案1或2的多肽，其中
该免疫球蛋白Fc片段经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，
或其中该免疫球蛋白Fc片段经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端。
4.如技术方案1至3中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段经由该免疫球蛋白Fc片段的N端氨基酸残基与轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，
或其中该免疫球蛋白Fc片段经由轮状病毒VP8蛋白质的该免疫球蛋白Fc片段的C端氨基酸残基与该免疫原性片段的N端氨基酸残基之间的肽键连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端。
5.如技术方案1至4中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。
6.如技术方案1至5中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，
或其中该免疫球蛋白Fc片段经由该免疫球蛋白Fc片段的N端氨基酸残基与轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。
7.如技术方案1至6中任一项的多肽，其中该多肽为融合蛋白质。
8.一种多肽，特别是如技术方案1至7中任一项的多肽，其中该多肽为式x-y-z的融合蛋白质，其中
x由轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段组成；
y为接头部分；并且
z为免疫球蛋白Fc片段。
9.如技术方案1至8中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段能够在施用轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的个体内诱导针对轮状病毒的免疫反应。
10.如技术方案1至9中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的长度为50至200个、优选140至190个氨基酸残基。
11.如技术方案1至10中任一项的多肽，其中该轮状病毒为猪轮状病毒。
12.如技术方案1至11中任一项的多肽，其中该轮状病毒选自由以下组成的群：轮状病毒A及轮状病毒C。
13.如技术方案1至12中任一项的多肽，其中该轮状病毒为轮状病毒A。
14.如技术方案1至13中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段包含轮状病毒VP8蛋白质的凝集素样结构域。
15.如技术方案1至14中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段为轮状病毒VP8蛋白质的N端延伸的凝集素样结构域，其中该N端延伸的长度为1至20个氨基酸残基，优选5至15个氨基酸残基。
16.如技术方案14或15的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的凝集素样结构域由轮状病毒VP8蛋白质的氨基酸残基65-224的氨基酸序列组成。
17.如技术方案15或16的多肽，其中该N端延伸的氨基酸序列为在轮状病毒VP8蛋白质的氨基酸序列中侧接凝集素样结构域的N端氨基酸残基的各别长度的氨基酸序列。
18.如技术方案1至17中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由以下的氨基酸序列组成：
轮状病毒VP8蛋白质的氨基酸残基60-224、氨基酸残基59-224、氨基酸残基58-224、氨基酸残基57-224、氨基酸残基56-224、氨基酸残基55-224、氨基酸残基54-224、氨基酸残基53-224、氨基酸残基52-224、氨基酸残基51-224、氨基酸残基50-224或氨基酸残基49-224。
19.如技术方案1至18中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由轮状病毒VP8蛋白质的氨基酸残基57-224的氨基酸序列组成。
20.如技术方案16至19中任一项的多肽，其中该氨基酸残基的编号系指野生型轮状病毒VP8蛋白质，特别是野生型轮状病毒A VP8蛋白质的氨基酸序列，且其中该野生型轮状病毒VP8优选为SEQ ID NO:1中所列的蛋白质。
21.如权利要求1至20中任一项的多肽，其中该轮状病毒选自由以下组成的群：基因型P[7]轮状病毒、基因型P[6]轮状病毒及基因型P[13]轮状病毒。
22.如技术方案1至21中任一项的多肽，其中该轮状病毒VP8蛋白质包含以下或由以下组成：与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列。
23.如技术方案14至22中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该凝集素样结构域由与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
24.如技术方案1至23中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段由与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
25.如技术方案1至24中任一项的多肽，轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由以下组成或为以下的共有序列：轮状病毒VP8蛋白质的一部分，特别是轮状病毒A VP8蛋白质的一部分，
且其中轮状病毒VP8蛋白质的一部分的该共有序列优选可通过包含以下步骤的方法获得：
-将多个编码轮状病毒VP8蛋白质的一部分的核苷酸序列翻译为氨基酸序列，
-将所述氨基酸序列与已知轮状病毒VP8蛋白质比对，优选通过使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类法及预设空隙罚分参数，
-对所述比对序列进行种系发生分析且基于轮状病毒VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建，特别是将所述比对氨基酸序列导入MEGA7软件以用于种系发生分析且基于轮状病毒VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建，
-使用泊松校正法以及种系发生的自助重抽检验来计算最优树(n＝100)，
-按比例绘制最优树，其中分支长度等于在总共170个位置上以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离，
-将自助重抽聚类关联大于70％的节点作为显著的，
-将具有大致10％距离及大于70％的自助重抽聚类关联的节点指定为聚类，以及
-选择聚类及通过鉴别该聚类内每个比对位置的最大频率来产生共有序列，
-且视情况，在其中在比对位置中观测到相等比例的氨基酸的情况下，基于所报导的流行病学数据以及预定产品保护概况选择氨基酸残基。
26.如技术方案1至25中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由与选自由SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
27.如技术方案1至26中任一项的多肽，其中该轮状病毒为轮状病毒C。
28.如技术方案1至27的多肽，其中旋轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由与SEQ ID NO:6的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
29.如技术方案1至28中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由以下组成或为以下：
-轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段，如技术方案9至24中任一项或多项所指定，或
-轮状病毒VP8蛋白质的一部分，特别是A VP8蛋白质的一部分的共有序列，如技术方案9至13、25及26中任一项所指定，或
-轮状病毒C VP8蛋白质的免疫原性片段，如技术方案9至12、27及28中任一项所指定。
30.如技术方案1至29中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由与选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
31.如技术方案1至30中任一项的多肽，
其中该免疫球蛋白Fc片段的长度为至少220个氨基酸残基，优选长度为220至250个氨基酸残基，
和/或其中该免疫球蛋白Fc片段未经糖基化。
32.如技术方案1至31中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段包含免以下或由以下组成：免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)及重链恒定区3(CH3)及视情况存在的铰链区或铰链区的一部分。
33.如技术方案1至32中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白选自由以下组成的群：IgG、IgA、IgD、IgE及IgM。
34.如技术方案1至33中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段为由其肠道细胞易受轮状病毒感染的物种的基因组编码的免疫球蛋白Fc片段，轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段系衍生自该轮状病毒。
35.如技术方案1至34中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段为猪IgG Fc片段。
36.如技术方案1至35中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或尤其100％序列一致性的氨基酸序列。
37.如技术方案3至36中任一项的多肽，其中该接头部分为长度为1至50个氨基酸残基的氨基酸序列。
38.如技术方案3至37中任一项的多肽，其中该接头部分包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11组成的群的序列具有至少66％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或尤其100％序列一致性的氨基酸序列。
39.如技术方案5至38中任一项的多肽，其中该多肽具有侧接轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端氨基酸残基的N端甲硫氨酸残基。
40.如技术方案5至39中任一项的多肽，其中该多肽包含连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端的轮状病毒VP8蛋白质的另一免疫原性片段。
41.一种多肽，特别是如技术方案1至40中任一项的多肽，其包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段(1)，
-免疫球蛋白Fc片段，以及
-轮状病毒VP8蛋白质的另一免疫原性片段(2)，
其中该免疫球蛋白Fc片段连接至该免疫原性片段(1)的C端，
且其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段(2)连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端。
42.如技术方案40或41的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段由以下组成或为以下：
-轮状病毒A VP8蛋白质的免疫原性片段，如技术方案9至24中任一项或多项所指定；或
-轮状病毒VP8蛋白质的一部分，特别是A VP8蛋白质的一部分的共有序列，如技术方案9至13、25及26中任一项或多项所指定；或
-轮状病毒C VP8蛋白质的免疫原性片段，如技术方案9至12、27及28中任一项或多项所指定。
43.如技术方案40至42中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:2至6组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列，
和/或其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段不同于C端连接至该免疫球蛋白Fc片段的轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段。
44.如技术方案40至43中任一项的多肽，
其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段经由接头部分连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端，其中该接头部分优选为如技术方案37或38中所指定的接头部分，
或其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段经由轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段的N端氨基酸残基与该免疫球蛋白Fc片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端。
45.如技术方案1至44中任一项的多肽，其中该多肽由以下组成：
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，特别是，如技术方案9至30中任一项或多项所指定的轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，
-侧接轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的N端氨基酸残基的N端甲硫氨酸残基，以及
-免疫球蛋白Fc片段，特别是，如技术方案31至36中的任一项或多项所指定的免疫球蛋白Fc片段，
其中该免疫球蛋白Fc片段尤其经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，其中该接头部分优选为如技术方案37或38中所指定的接头部分，
-及视情况选用的尤其经由接头部分连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端的轮状病毒VP8蛋白质的另一免疫原性片段，其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选为如技术方案41至44中任一项或多项所指定的另一免疫原性片段，且其中该接头部分优选为如技术方案37或38中所指定的接头部分。
46.如技术方案1至45中任一项的多肽，其中该多肽为包含以下或由以下组成的蛋白质：与选自由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或尤其100％序列一致性的氨基酸序列。
47.如技术方案1至46中任一项的多肽，其中该多肽为重组蛋白，特别是重组杆状病毒表达的蛋白质。
48.如技术方案1至47中任一项的多肽，其中该多肽与第二相同多肽形成同源二聚体。
49.一种多聚体，其包含多个如技术方案1至48中任一项的多肽或由其构成，且其中该多聚体优选为由具有第二相同多肽的如技术方案1至48中任一项的多肽形成的同源二聚体。
50.一种免疫原性组合物，其包含如技术方案1至48中任一项的多肽和/或如技术方案49的多聚体。
51.如技术方案50的免疫原性组合物，其中该免疫原性组合物进一步包含医药学或兽医学上可接受的载剂或赋形剂。
52.如技术方案50或51的免疫原性组成物，其中该免疫原性组成物进一步包含佐剂。
53.一种免疫原性组合物，其包含以下或由以下组成：
-如技术方案1至48中任一项的多肽和/或如技术方案49的多聚体，及
-医药学或兽医学上可接受的载剂或赋形剂，
-以及视情况选用的佐剂。
54.如技术方案52或53的免疫原性组合物，其中该佐剂为乳化水包油佐剂。
55.如技术方案52或53的免疫原性组合物，其中该佐剂为卡波姆。
56.一种多核苷酸，其包含编码如技术方案1至48中任一项的多肽的核苷酸序列，
57.如技术方案56的多核苷酸，其中该多核苷酸包含与选自由SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或尤其100％序列一致性的核苷酸序列。
58.一种质粒，优选表达载体，其包含有包含编码如技术方案1至48中任一项的多肽的序列的多核苷酸。
59.一种细胞，其包含质粒，优选表达载体，该质粒包含有包含编码如技术方案1至48中任一项的多肽的序列的多核苷酸。
60.一种杆状病毒，其含有多核苷酸，该多核苷酸包含编码如技术方案1至48中任一项的多肽的序列。
61.一种细胞，优选昆虫细胞，其包含杆状病毒，该杆状病毒含有包含编码如技术方案1至48中任一项的多肽的序列的多核苷酸。
62.一种用途，其使用以下以制备药剂，优选疫苗：
-如技术方案1至48中任一项的多肽，
-如技术方案49的多聚体，
-如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，
-如技术方案56或57的多核苷酸，
-如技术方案58的质粒，
-如技术方案60的杆状病毒，和/或
-如技术方案59或61的细胞，
63.如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，其用作药剂。
64.如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，其用作疫苗。
65.如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，其用于在个体中诱导针对轮状病毒的免疫反应的方法中。
66.如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，其用于减少或预防个体的由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中或用于治疗或预防个体的轮状病毒感染的方法中。
67.如技术方案65或66的多肽或免疫原性组合物，其中该个体为哺乳动物或鸟类，且其中该鸟类优选为鸡。
68.如技术方案65至67中任一项的多肽或免疫原性组合物，其中该个体为哺乳动物，且其中该哺乳动物优选为猪或牛。
69.如技术方案65至68中任一项的多肽或免疫原性组合物，其中该个体为猪，且其中该猪优选为猪崽或母猪。
70.如技术方案65的多肽或免疫原性组合物，其中该个体为怀孕母猪。
71.如技术方案66的多肽或免疫原性组合物，其中该个体为猪崽。
72.如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，其用于减少或预防猪崽中由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中，其中该猪崽由已施用该免疫原性组合物的母猪哺乳。
73.如技术方案72的多肽或免疫原性组合物，其中已施用该免疫原性组合物的该母猪为已施用该免疫原性组合物所施用的母猪，同时该母猪已怀孕，特别是怀有该猪崽。
74.一种方法，其用于治疗或预防轮状病毒感染，减少、预防或治疗由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出，或预防或治疗由轮状病毒感染引起的疾病，该方法包含向个体施用如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物。
75.一种方法，其用于在母猪中诱导产生对轮状病毒具有特异性的抗体，其中该方法包含向该母猪施用如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物。
76.一种方法，其减少或预防猪崽中由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出，其中该方法包含
-向母猪施用如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，以及
-允许该母猪哺乳该猪崽。
77.如技术方案76的方法，其中该母猪为怀孕母猪，特别是怀有该猪崽。
78.如技术方案76或77的方法，其包含以下步骤：
-向怀有该猪崽的母猪施用如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，
-允许该母猪生产该猪崽，以及
-允许该母猪哺乳该猪崽。
79.一种方法，其减少猪崽中由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出，其中该猪崽由该母猪哺乳，向该母猪施用如技术方案1至48中任一项的多肽或如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物。
80.如技术方案66至73中任一项的多肽或免疫原性组合物或如技术方案74至79中任一项的方法，其中该一或多种临床症状选自由以下组成的群：
-腹泻，
-轮状病毒定殖，
-病变，特别是宏观病变，
-减少的平均每日体重增加，以及
-胃肠炎。
81.如技术方案80的多肽或免疫原性组合物或如技术方案80的方法，其中该轮状病毒定殖为肠的轮状病毒定殖和/或其中所述病变为肠病变。
82.如技术方案65至73、80及81中任一项的多肽或免疫原性组合物，或如技术方案74至81中任一项的方法，其中
-该轮状病毒感染为感染基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒，
-该感染轮状病毒为感染基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒，
-针对轮状病毒的该免疫反应为针对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的免疫反应，或
-对轮状病毒具有特异性的所述抗体为对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒具有特异性的抗体。
83.如技术方案82的多肽，其中该多肽包含基因型P[7]轮状病毒VP 8蛋白的免疫原性片段，且其中该多肽优选为如技术方案21至26及29至48中任一项所指定的多肽。
84.如技术方案82的免疫原性组合物或方法，其中该免疫原性组合物包含如技术方案21至26及29至48中任一项所指定的多肽，其轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段为基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段。
85.如技术方案83的多肽或如技术方案84的免疫原性组合物或方法，其中基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
86.一种方法，其产生如技术方案1至48中任一项的多肽和/或如技术方案49的多聚体，其包含用如技术方案58的质粒转染细胞。
87.一种方法，其产生如技术方案1至48中任一项的多肽和/或如技术方案49的多聚体，其包含用如技术方案60的杆状病毒感染细胞，优选昆虫细胞。
88.一种方法，其制备如技术方案50至55中任一项的免疫原性组合物，其中该方法包含以下步骤：
(a)允许用载体感染培养物中的易感细胞，该载体包含编码如技术方案1至48中任一项的多肽的核酸序列，其中该多肽由该载体表达；
(b)其后回收该多肽，特别是在细胞培养物上清液中回收该多肽，其中细胞碎片优选经由分离步骤与该多肽分离，该分离步骤优选地包括经由至少一个过滤器、优选两个过滤器的微过滤，其中该至少一个过滤器的孔径优选为约1μm至约20μm和/或约0.1μm至约4μm；
(c)通过向步骤(b)的混合物中添加二亚乙基亚胺(BEI)使载体灭活；
(d)通过添加硫代硫酸钠至由步骤(c)产生的混合物中来中和BEI；以及
(e)通过利用过滤器的过滤步骤自混合物移除一部分液体来浓缩由步骤(d)产生的混合物中的多肽，该过滤器的滤膜的分子量截止值在约5kDa与约100kDa之间，优选在约10kDa与约50kDa之间；
(f)及视情况将在步骤(e)后残余的混合物与选自由医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成的群的另一组分掺合。
89.如技术方案50至55、63至73及80至85中任一项的免疫原性组合物、技术方案62的用途或如技术方案74至82、84及85中任一项的方法，其中该免疫原性组合物可通过如技术方案88的方法获得。
90.一种多肽，其包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，以及
-异源二聚结构域，
其中该异源二聚结构域连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。
91.如技术方案90的多肽，其中该异源二聚结构域为卷曲螺旋结构域，特别是亮氨酸拉链。
Claims (22)
1.一种多肽，其包含
-轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段，及
-免疫球蛋白Fc片段。
2.如权利要求1的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段经由接头部分连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端，
或其中该免疫球蛋白Fc片段经由该免疫球蛋白Fc片段的N端氨基酸残基与轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段的C端。
3.一种多肽，特别是如权利要求1或2的多肽，其中该多肽为式x-y-z的融合蛋白质，其中
x由轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段组成；
y为接头部分；并且
z为免疫球蛋白Fc片段。
4.如权利要求1-3中任一项的多肽，其中该轮状病毒为猪轮状病毒，
和/或其中该轮状病毒选自由以下组成的群：轮状病毒A及轮状病毒C。
5.如权利要求1-4中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段为轮状病毒VP8蛋白质的N端延伸的凝集素样结构域，其中该N端延伸的长度为1至20个氨基酸残基，优选5至15个氨基酸残基。
6.如权利要求1-5中任一项的多肽，其中该轮状病毒选自由以下组成的群：基因型P[7]轮状病毒、基因型P[6]轮状病毒及基因型P[13]轮状病毒。
7.如权利要求1-6中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由以下组成或为以下的共有序列：轮状病毒VP8蛋白质的一部分，特别是轮状病毒A VP8蛋白质的一部分，
且其中轮状病毒VP8蛋白质的一部分的该共有序列优选可通过包含以下步骤的方法获得：
-将多个编码轮状病毒VP8蛋白质的一部分的核苷酸序列翻译为氨基酸序列，
-将所述氨基酸序列与已知轮状病毒VP8蛋白质比对，优选通过使用MUSCLE序列比对软件UPGMB聚类法及预设空隙罚分参数，
-对所述比对序列进行种系发生分析且基于轮状病毒VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建，特别是将所述比对氨基酸序列导入MEGA7软件以用于种系发生分析且基于轮状病毒VP8蛋白质序列产生邻近连接种系发生重建，
-使用泊松(Poisson)校正法以及种系发生的自助重抽检验来计算最优树(n＝100)，
-按比例绘制最优树，其中分支长度等于在总共170个位置上以每个位点的氨基酸取代为单位的进化距离，
-将自助重抽聚类关联大于70％的节点作为显著的，
-将具有大致10％距离及大于70％的自助重抽聚类关联的节点指定为聚类，以及
-选择聚类及通过鉴别该聚类内每个比对位置的最大频率来产生共有序列，
-且视情况，在其中在比对位置中观测到相等比例的氨基酸的情况下，基于所报导的流行病学数据以及预定产品保护概况选择氨基酸残基。
8.如权利要求1-7中任一项的多肽，其中轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由与选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
9.如权利要求1-8中任一项的多肽，其中该免疫球蛋白Fc片段为由其肠道细胞易受该轮状病毒感染的物种的基因组编码的免疫球蛋白Fc片段，轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段衍生自该轮状病毒，
和/或其中该免疫球蛋白Fc片段优选为猪IgG Fc片段，
和/或其中该免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:7及SEQID NO:8组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或特别是100％序列一致性的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项的多肽，其中该接头部分为长度为1至50个氨基酸残基的氨基酸序列，
和/或其中该接头部分包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:11组成的群的序列具有至少66％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或特别是100％序列一致性的氨基酸序列。
11.如权利要求2-10中任一项的多肽，其中该多肽包含连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端的轮状病毒VP8蛋白质的另一免疫原性片段，其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选经由接头部分连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端，其中该接头部分特别是为如权利要求10中所指定的接头部分，
或其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段经由轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段的N端氨基酸残基与该免疫球蛋白Fc片段的C端氨基酸残基之间的肽键连接至该免疫球蛋白Fc片段的C端，
且其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选包含以下或由以下组成：与选自由SEQ ID NO:2至6组成的群的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列，
和/或其中轮状病毒VP8蛋白质的该另一免疫原性片段优选不同于C端连接至该免疫球蛋白Fc片段的轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段。
12.如权利要求1-11中任一项的多肽，其中该多肽为包含以下或由以下组成的蛋白质：与选自由SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:16组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或特别是100％序列一致性的氨基酸序列。
13.一种多聚体，其包含多个如权利要求1至12中任一项的多肽或由该多个多肽构成，且其中该多聚体优选为由如权利要求1至12中任一项的多肽与第二相同多肽形成的同源二聚体。
14.一种免疫原性组合物，其包含如权利要求1至12中任一项的多肽和/或如权利要求13的多聚体。
15.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1至12中任一项的多肽的核苷酸序列，且其中该多核苷酸优选包含与选自由SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20及SEQ ID NO:21组成的群的序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、仍更优选至少95％或特别是100％序列一致性的核苷酸序列。
16.如权利要求1至12中任一项的多肽或如权利要求14的免疫原性组合物，其用作药剂，优选地用作疫苗。
17.如权利要求1至12中任一项的多肽或如权利要求14的免疫原性组合物，其用于减少或预防个体的由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出的方法中；或用于治疗或预防个体的轮状病毒感染的方法中；或用于治疗或预防个体的轮状病毒感染的方法中；和/或用于在个体中诱导针对轮状病毒的免疫反应的方法中。
18.一种方法，其减少或预防猪崽中由轮状病毒感染引起的一或多种临床症状、死亡或粪便排出，其中该方法包含
-向母猪施用如权利要求1至12中任一项的多肽或如权利要求14的免疫原性组合物，以及
-允许该母猪哺乳该猪崽。
19.如权利要求17的多肽或免疫原性组合物，或如权利要求18的方法，其中该一或多种临床症状选自由以下组成的群：
-腹泻，
-轮状病毒定殖，
-病变，特别是宏观病变，
-减少的平均每日体重增加，以及
-胃肠炎。
20.如权利要求17或19的多肽或免疫原性组合物，或如权利要求18或19的方法，其中
-该轮状病毒感染为感染基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒，
-该感染轮状病毒为感染基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒，
-针对轮状病毒的该免疫反应为针对基因型P[23]轮状病毒和/或基因型P[7]轮状病毒的免疫反应。
21.如权利要求20的多肽或免疫原性组合物，或如权利要求20的方法，
其中该多肽包含基因型P[7]轮状病毒VP 8蛋白质的免疫原性片段，或其中该免疫原性组合物包含有包含基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白质的免疫原性片段的多肽，
且其中优选地基因型P[7]轮状病毒VP8蛋白质的该免疫原性片段由与SEQ ID NO:3的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％或仍更优选至少99％序列一致性的氨基酸序列组成。
22.一种方法，其制备如权利要求14的免疫原性组合物，其中该方法包含以下步骤：
(a)允许用载体感染培养物中的易感细胞，该载体包含编码如权利要求1至12中任一项的多肽的核酸序列，其中该多肽由该载体表达；
(b)其后回收该多肽，特别是在细胞培养物上清液中回收该多肽，其中细胞碎片优选经由分离步骤与该多肽分离，该分离步骤优选地包括经由至少一个过滤器、优选两个过滤器的微过滤，其中该至少一个过滤器的孔径优选为约1μm至约20μm和/或约0.1μm至约4μm；
(c)通过向步骤(b)的混合物中添加二亚乙基亚胺(BEI)使载体灭活；
(d)通过添加硫代硫酸钠至由步骤(c)产生的混合物中来中和BEI；以及
(e)通过利用过滤器的过滤步骤自混合物移除一部分液体来浓缩由步骤(d)产生的混合物中的多肽，该过滤器的滤膜的分子量截止值在约5kDa与约100kDa之间，优选在约10kDa与约50kDa之间；
(f)及视情况将在步骤(e)后残余的混合物与选自由医药学上可接受的载剂、佐剂、稀释剂、赋形剂及其组合组成的群的另一组分掺合。
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