TW202241928A - 對冠狀病毒具有特異性的抗原結合多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公開文本大體上涉及特異性結合至冠狀病毒的刺突（S）蛋白的抗原結合多肽，例如抗體及其抗原結合片段；包含所述抗體的醫藥組合物；以及使用方法。本公開文本的抗體可用于抑制或中和冠狀病毒活性，由此提供治療或預防冠狀病毒感染的手段。還提供可用於鑒定或產生這樣的抗體和抗原結合片段的重組核酸、重組細胞、組合物和方法，以及使用這樣的抗體和抗原結合片段用於治療、預防或改善與病毒感染（例如，冠狀病毒感染）相關的健康狀況的方法。

Description

對冠狀病毒具有特異性的抗原結合多肽及其用途
本公開文本涉及特異性結合至冠狀病毒刺突蛋白的抗體和抗原結合片段，以及使用這樣的抗體和片段的治療和診斷方法。
嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）是最近鑒定的新出現的冠狀病毒，其引起稱為COVID-19的急性呼吸窘迫症候群，與由密切相關的SARS-CoV引起的嚴重急性呼吸症候群（SARS）類似。迄今，SARS-CoV-2繼續在世界範圍內傳播，在190個國家中有超過8000萬個確診病例和接近兩百萬例死亡。鑒於對人類健康的持續性威脅，迫切地需要用於SARS-CoV-2控制的預防性和治療性抗病毒療法。因為這種病毒使用其刺突糖蛋白與細胞受體ACE2和絲胺酸蛋白酶TMPRSS2相互作用以進入靶細胞，此刺突蛋白代表抗體療法的靶標。特別地，以高親和力特異性結合至SARS-CoV-2刺突蛋白（SARS-CoV-2-S）並且抑制病毒感染力的完全人抗體在COVID-19的預防和治療中可能是重要的。
需要對冠狀病毒的刺突（S）蛋白具有特異性結合親和力的抗體，包括中和治療性抗體，以及使用它們來治療或預防冠狀病毒感染。本公開文本通過提供抗SARS-CoV-2 S抗體及其抗原結合片段以及使用這樣的抗體和片段用於治療病毒感染的治療方法部分解決此需求。
本公開文本大體上涉及特異性結合至冠狀病毒的刺突（S）蛋白的抗原結合分子，例如，抗體和抗原結合片段。還提供編碼至少一種如本文所公開的抗原結合分子的核酸、包括至少一種如本文所公開的抗原結合分子或核酸的重組細胞，以及用於鑒定這樣的抗原結合分子（例如，抗體和片段）的方法，以及使用這樣的抗原結合分子（例如，抗體和片段）的治療和診斷方法。
在本公開文本的一態樣，本文提供特異性結合至嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體選自TXG-0153、TXG-0115、TXG-140和TXG-154，其中：(a) TXG-0153的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 88、168、248、328、408和488中所示的胺基酸序列；(b) TXG-0115的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 72、152、232、312、392和472中所示的胺基酸序列；(c) TXG-0140的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 83、163、243、323、403和483中所示的胺基酸序列；並且 (d) TXG-0154的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 89、169、249、329、409和489中所示的胺基酸序列。
在另一態樣，本文提供特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，並且其中所述抗體或其片段與結合至所述SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）的胺基酸332-337、339-340、343-346、354、356-361、440-441和509的抗體或其抗原結合片段共用表位箱（epitope bin）。
在本公開文本的另一態樣，本文提供特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包括選自SEQ ID NO: 1-3的胺基酸序列的重鏈互補決定區1（HCDR1）；(b) 包括選自SEQ ID NO: 4-6的胺基酸序列的HCDR2；以及 (c) 包括選自SEQ ID NO: 7-9的胺基酸序列的HCDR3。
本公開文本的抗體及其抗原結合片段的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。在一些實施例中，本公開文本的抗體及其抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 1、4和7中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 2、5和8中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 3、6和9中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。
在一態樣，本公開文本的一些實施例提供特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包括選自SEQ ID NO: 10-12的胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（LCDR1）；(b) 包括選自SEQ ID NO: 13-15的胺基酸序列的LCDR2；以及 (c) 包括選自SEQ ID NO: 16-18的胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 10、13和16中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 11、14和17中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 12、15和18中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
在另一態樣，本文提供特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包括選自SEQ ID NO: 1-3的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包括選自SEQ ID NO: 4-6的胺基酸序列的HCDR2；c) 包括選自SEQ ID NO: 7-9的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包括選自SEQ ID NO: 10-12的胺基酸序列的LCDR1；e) 包括選自SEQ ID NO: 13-15的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包括選自SEQ ID NO: 16-18的胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 分別如SEQ ID NO: 1、4和7中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及b) 分別如SEQ ID NO: 10、13和16中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 分別如SEQ ID NO: 2、5和8中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及b) 分別如SEQ ID NO: 11、14和17中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 分別如SEQ ID NO: 3、6和9中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及b) 分別如SEQ ID NO: 12、15和18中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述HCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列至少90%相同。在一些實施例中，所述HCDR1包括選自SEQ ID NO: 1-3和SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述HCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列100%相同。在一些實施例中，所述HCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列至少90%相同。在一些實施例中，所述HCDR2包括選自SEQ ID NO: 4-6和SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述HCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列100%相同。在一些實施例中，所述HCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列至少90%相同。在一些實施例中，所述HCDR3包括選自SEQ ID NO: 7-9和SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述HCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列100%相同。
在一些實施例中，所述LCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列至少90%相同。在一些實施例中，所述LCDR1包括選自SEQ ID NO: 10-12和SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述LCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列100%相同。在一些實施例中，所述LCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列至少90%相同。在一些實施例中，所述LCDR2包括選自SEQ ID NO: 13-15和SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述LCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列100%相同。在一些實施例中，所述LCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列至少90%相同。在一些實施例中，所述LCDR3包括選自SEQ ID NO: 16-18和SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述LCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列100%相同。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包括具有與SEQ ID NO: 43-122的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包括具有與SEQ ID NO: 123-202的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2；(c) 包括具有與SEQ ID NO: 203-282的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包括具有與SEQ ID NO: 283-362的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包括具有與SEQ ID NO: 363-442的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包括具有與SEQ ID NO: 443-522的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含具有與選自SEQ ID NO: 43-45的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包含具有與選自SEQ ID NO: 123-125的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2；c) 包含具有與選自SEQ ID NO: 203-205的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包含具有與選自SEQ ID NO: 283-285的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包含具有與選自SEQ ID NO: 363-365的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包含具有與選自SEQ ID NO: 443-445的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含具有與選自SEQ ID NO: 46-47的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包含具有與選自SEQ ID NO: 126-127的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2；(c) 包含具有與選自SEQ ID NO: 206-207的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包含具有與選自SEQ ID NO: 286-287的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包含具有與選自SEQ ID NO: 366-367的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包含具有與選自SEQ ID NO: 446-447的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含具有與選自SEQ ID NO: 117-120的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包含具有與選自SEQ ID NO: 197-200的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2；(c) 包含具有與選自SEQ ID NO: 277-280的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包含具有與選自SEQ ID NO: 357-360的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包含具有與選自SEQ ID NO: 437-440的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包含具有與選自SEQ ID NO: 517-520的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括具有與選自SEQ ID NO: 523-1162的胺基酸序列的至少90%序列同一性的架構區。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組的HCDR和LCDR：(a) TXG-0021、TXG-0022和TXG-0023；(b) TXG-0027和TXG-0028；或者 (c) TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括表1中抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一個或多個。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括表1中抗體的所有六個HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段還包括相同抗體或抗原結合片段的重鏈架構區HFWR1、HFWR2、HFWR3和HFWR4。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段還包括相同抗體或抗原結合片段的輕鏈架構區LFWR1、LFWR2、LFWR3和LFWR4。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括包含具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的至少90%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區（HCVR）。在一些實施例中，所述HCVR包括具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括包含具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的至少90%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區（LCVR）。在一些實施例中，所述LCVR包括具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包括具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的至少90%序列同一性的胺基酸序列的HCVR；以及b) 包括具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的至少90%序列同一性的胺基酸序列的LCVR。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括：分別與表1中抗體的HCVR和LCVR 90%相同的HCVR和LCVR。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括表1中抗體的HCVR和LCVR。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段選自表1。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段還包括恒定區。在一些實施例中，所述恒定區是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM重鏈恒定區。在一些實施例中，其中所述恒定區是κ型或λ型輕鏈恒定區。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段是人抗體。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是人類化抗體或嵌合抗體。在一些實施例中，所述抗體是單株抗體。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是單鏈抗體片段（scFv）、F(ab)、F(ab')、Fab'-SH、F(ab')2或Fv片段。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與SARS-CoV-2 S蛋白的結構域中的表位的結合親和力。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白的所述結構域位於S1亞基中。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與所述S1亞基的受體結合結構域（RBD）或N末端結構域（NTD）的結合親和力。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括在選自K417、L452、E484、N501和D614的位置處的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括選自K417T、K417N、L452R、E484K、E484Q、N501Y和D614G的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括胺基酸取代K417N、E484K和N501Y。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對CoV-S蛋白的三聚形式的結合親和力。在一些實施例中，SARS-CoV-2的S蛋白的所述亞基是S2亞基。在一些實施例中，所述一個或多個胺基酸取代包括D614G取代。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對CoV-S蛋白的融合前三聚形式的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的穩定的融合前刺突蛋白（例如，S2P穩定的融合前刺突蛋白）的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的非融合前刺突蛋白的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的非S2P穩定的融合前刺突蛋白的結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於500 nM、小於120 nM、小於100 nM、小於50 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於5 nM、小於1 nM或小於1 pM的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於120 nM的結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組的HCDR和LCDR：TXG-0021、TXG-0022、TXG-0023、TXG-0027、TXG-0028、TXG-0043、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0061、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0083、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0090、TXG-0098、TXG-0108、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0130、TXG-0134、TXG-0135、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0150、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0160、TXG-0165、TXG-0169、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0216、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於120 nM的結合親和力並且包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組的HCDR和LCDR：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括HCVR，所述HCVR包括具有與選自以下的抗體的HCVR的至少90%序列同一性的胺基酸序列：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0230。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括LCVR，所述LCVR包括具有與選自以下的抗體的LCVR的至少90%序列同一性的胺基酸序列：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S蛋白、其片段或其多聚形式的亞奈莫耳結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於500 pM、小於100 pM、小於50 pM、小於10 pM或小於5 pM的結合親和力。
在一些實施例中，具有對SARS-CoV-2 S蛋白的亞奈莫耳結合親和力的抗體或抗原結合片段選自TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0072、TXG-0089、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0194和TXG-0217。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對HCOV和/或對選自β、γ、δ和κ的SARS-CoV-2 S變異體的亞奈莫耳結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與野生型SARS-CoV-2 S和β、γ、κ變異體的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0115和TXG-0154。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0140。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式以及β和γ變異體的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0153。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2，並且具有與S1亞基的N末端結構域（NTD）和與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式以及與γ和κ變異體的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0173。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2，並且具有與S1亞基的N末端結構域（NTD）和與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式以及與β、γ和κ變異體的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0174。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段中和至少50%的200倍組織培養感染劑量（200×TCID50）的所述冠狀病毒。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為1 µg/mL或更低、200 ng/mL或更低或者40 ng/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值的範圍為200 ng/mL至1,000 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值的範圍為40 ng/mL至200 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值的範圍為8 ng/mL至40 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為1 µg/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體或其抗原結合片段包括TXG-0153、TXG-0173、TXG-0115、TXG-0140、TXG-0154和TXG-0174。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為200 ng/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0115、TXG-0140和TXG-0154。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為200 ng/mL至1000 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0153、TXG-0173和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50至為100 ng/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0140和TXG-0154。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為40 ng/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0154。
在一些實施例中，所述分離的抗體或其抗原結合片段是重組抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有與SARS-CoV-2 S蛋白的N末端結構域（NTD）的結合親和力並強效中和活SARS-CoV-2。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0072、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0173和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0173和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與來自SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的N末端結構域（NTD）的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0072、TXG-0137和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是TXG-0174。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有主要與SARS-CoV-2 S蛋白的RBD的結合親和力並強效中和活SARS-CoV-2。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0115、TXG-0140、TXG-0153和TXG-0154。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是TXG-0153。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0115、TXG-0140和TXG-0154。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合具有主要與來自SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的RBD的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0140和TXG-0154。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0085、TXG-0112、TXG-0192、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0115、TXG-0136、TXG-0192和TXG-0230。在一些實施例中，這樣的抗體和抗原結合片段具有針對活SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是TXG-0115。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對來自SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0085、TXG-0112、TXG-0173、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0229。在一些實施例中，這樣的抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV-2。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是TXG-0173。在一態樣，本文提供編碼本公開文本的抗體或其抗原結合片段的重組核酸。在一些實施例中，所述核酸包括編碼包含與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的HCVR的核酸序列。在一些實施例中，所述核酸包括具有與選自SEQ ID NO: 1487-1886的核酸序列的至少70%序列同一性的核酸序列。在一些實施例中，所述核酸包括編碼包含與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的LCVR的核酸序列。在一些實施例中，所述核酸包括具有與選自SEQ ID NO: 1887-2286的核酸序列的至少70%序列同一性的核酸序列。在一些實施例中，所述核酸包括具有與選自SEQ ID NO: 1487-1886的核酸序列的至少70%序列同一性的第一核酸序列；以及具有與選自SEQ ID NO: 1887-2286的核酸序列的至少70%序列同一性的第二核酸序列。
在另一態樣，本文提供包括本公開文本的重組核酸的載體。如本文所述的載體的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。在一些實施例中，所述載體是表現載體。在一些實施例中，所述載體是質體載體或病毒載體。
在又另一態樣，本文提供重組細胞，其包括a) 如本文所公開的抗體或抗原結合片段；或者b) 如本文所公開的重組核酸；或者c) 如本文所公開的載體。在一些實施例中，所述重組細胞是原核細胞或真核細胞。在另一態樣，還提供包括如本文所公開的載體的動物。在一些實施例中，本公開文本提供作為非人動物的轉基因動物。在一些實施例中，所述轉基因動物產生如本文所公開的抗體或抗原結合片段。
在另一態樣，本文提供用於產生抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括：使 (i) 如本文所公開的轉基因動物或 (ii) 如本文所公開的重組細胞在使得產生所述抗體或抗原結合片段的條件下生長。在一些實施例中，如本文所述的用於產生抗體或其抗原結合片段的方法還包括從 (i) 所述轉基因動物或 (ii) 重組細胞和/或培養所述重組細胞的培養基分離產生的抗體或抗原結合片段。
在另一態樣，本文提供包括一種或多種如本文所公開的抗體或抗原結合片段以及醫藥上可接受的載劑或稀釋劑的組合物，例如，醫藥組合物。如本文所述的醫藥組合物的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。
在一些實施例中，所述組合物包括：(a) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白（例如與所述全長SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基）的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段；(b) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與SARS-CoV-2 S蛋白的NTD的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段；或者 (c) 具有與NTD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白（例如與所述全長SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基）的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述組合物是無菌組合物。在一些實施例中，所述組合物被配製為疫苗。在一些實施例中，所述組合物還包括佐劑。在一些實施例中，本公開文本的醫藥組合物還包括第二治療劑。在一些實施例中，所述第二治療劑選自：(i) 抗病毒劑、(ii) 抗炎劑、(iii) 特異性結合靶細胞的絲胺酸蛋白酶TMPRSS2的抗體或其抗原結合片段、以及 (iv) 特異性結合至CoV-S蛋白的第二抗體或其抗原結合片段。
在另一態樣，本文提供用於治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況的方法，所述方法包括向所述受試者投予治療有效量（例如，包含治療有效量的組合物）的如本文所述的抗體或抗原結合片段。在相關態樣，本文提供用於減少SARS-Co-2V S蛋白與受試者的細胞的結合和/或減少SARS-CoV-2進入受試者的細胞中的方法，所述方法包括向所述受試者投予治療有效量（例如，包含治療有效量的組合物）的如本文所述的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述方法包括向所述受試者投予包含治療有效量的如本文所述的抗體或抗原結合片段的組合物。在一些實施例中，所述組合物包括：(a) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白（例如與所述全長SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基）的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段；(b) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與SARS-CoV-2 S蛋白的NTD的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段；或者 (c) 具有與NTD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白（例如與所述全長SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基）的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段。
如本文所述的方法的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。在一些實施例中，將所述抗體或抗原結合片段與綴合至治療劑的SARS-Co-2V S蛋白組合投予。在一些實施例中，向所述受試者投予一種或多種其他治療劑。在一些實施例中，所述一種或多種其他治療劑包括抗病毒藥或疫苗。在一些實施例中，所述一種或多種其他治療劑選自：(i) 抗病毒劑、(ii) 抗炎劑、(iii) 特異性結合TMPRSS2的抗體或其抗原結合片段、以及 (iv) 特異性結合至CoV-S蛋白的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，將所述抗體或抗原結合片段皮下、靜脈內和/或肌內投予至所述受試者。
在另一態樣，本文提供用於檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在的方法，所述方法包括使如本文所公開的抗體或抗原結合片段與來自被SARS-CoV-2感染或懷疑被SARS-CoV-2感染的個體的生物樣品接觸。
在又另一態樣，本文提供用於鑒定具有對冠狀病毒刺突蛋白（CoV-S）的結合親和力的抗體的方法，所述方法包括：(a) 使從已經暴露於冠狀病毒的受試者獲得的多個B細胞與多種抗原接觸，其中所述多種抗原包括CoV-S抗原和非CoV-S抗原，並且其中所述抗原中的每一種包括報告寡核苷酸，其中所述接觸提供結合至CoV-S抗原的B細胞；(b) 將結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞分區於多個分區的分區中，其中所述分區提供包括 (i) 結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞和 (ii) 包括共有條碼序列的多個核酸條碼分子的分區；(c) 鑒定由已經結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞產生的至少一種抗體或抗原結合片段的序列；以及d) 評估條碼化的抗體或抗原結合片段與CoV-S蛋白的結合親和力；以及e) 如果所述條碼化的抗體特異性結合至所述CoV-S蛋白，則將分離的抗體抗原結合片段鑒定為具有對所述CoV-S蛋白的結合特異性的抗體。
用於鑒定如本文所述的具有對CoV-S蛋白的結合親和力的抗體的方法的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。在一些實施例中，所述報告寡核苷酸可以包括 (i) 鑒定所述抗原的報告序列和 (ii) 捕獲手柄（handle）序列。在一些實施例中，這樣的報告序列可以用於鑒定與報告寡核苷酸偶聯/結合的靶抗原或片段。在一些實施例中，本公開文本的方法還包括將條碼部分與由所述B細胞產生的抗體或抗原結合片段偶聯以生成條碼化的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述多個核酸條碼分子中的第一核酸條碼分子還包括配置為與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列偶聯的捕獲序列，並且其中所述多個核酸條碼分子中的第二核酸條碼分子還包括配置為與mRNA分析物偶聯的捕獲序列。在一些實施例中，配置為與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列偶聯的所述捕獲序列與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列互補。在其中所述捕獲序列配置為與mRNA分析物偶聯的情況下，其可以包括多聚T序列。在一些實施例中，所述第一核酸條碼分子和所述第二核酸條碼分子各自包括唯一分子識別字（UMI）。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與CoV-S蛋白的結構域上的表位的結合特異性。在一些實施例中，所述CoV-S蛋白的所述結構域位於S1結構域（即，亞基）中。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與所述S1結構域（即，亞基）的RBD或NTD的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對CoV-S蛋白的三聚形式的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對CoV-S蛋白的融合前三聚形式的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的穩定的融合前刺突蛋白（例如，S2P穩定的融合前刺突蛋白）的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的非融合前刺突蛋白的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的非S2P穩定的融合前刺突蛋白的結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於500 nM、小於120 nM、小於100 nM、小於50 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於5 nM、小於1 nM或小於1 pM的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於120 nM的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S蛋白、其片段或其多聚形式的亞奈莫耳結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於500 pM、小於100 pM、小於50 pM、小於10 pM或小於5 pM的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有針對CoV-S蛋白的中和活性。在一些實施例中，所述CoV-S蛋白的所述亞基是S2亞基。
在一些實施例中，所述CoV-S蛋白是SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或MERS-CoV的刺突蛋白。在一些實施例中，所述受試者懷疑被冠狀病毒感染，已經被冠狀病毒感染，已經接種疫苗，或者已經從冠狀病毒感染康復。在一些實施例中，所述受試者是哺乳動物受試者。在一些實施例中，所述哺乳動物受試者是人。
在一些實施例中，所述抗原各自與鑒定所述抗原的螢光標記偶聯。在一些實施例中，用於鑒定如本文所述的具有對CoV-S蛋白的結合親和力的抗體的方法還包括在 (b) 之前分離和/或富集所述多個B細胞。在一些實施例中，所述富集還包括基於對與抗原偶聯的一種或多種螢光標記的檢測來分選結合至CoV-S抗原和/或非CoV-S抗原的B細胞。在一些實施例中，所述CoV-S蛋白與條碼部分偶聯。在一些實施例中，所述方法還包括純化/分離已經被鑒定為具有對所述CoV-S蛋白的結合特異性的抗體或抗原結合片段。
在一態樣，本文提供通過本文所公開的方法鑒定的抗體。
在另一態樣，本文提供鑒定具有對冠狀病毒刺突蛋白（CoV-S）的結合親和力的抗體的套組，所述套組包括：(a) 多種CoV-S抗原和非CoV-S抗原，並且其中所述抗原中的每一種包括包含 (i) 鑒定所述抗原的報告序列和 (ii) 捕獲手柄序列的報告寡核苷酸；以及 (b) 用於進行鑒定如本文所述的具有對CoV-S蛋白的結合親和力的抗體的方法的說明書。
還提供用於以下的套組：(i) 用於產生抗體或其抗原結合片段，(ii) 檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在，或者 (iii) 治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況，所述套組包括其使用說明書以及以下中的一種或多種：(a) 如本文所述的抗體或抗原結合片段；(b) 如本文所公開的重組核酸或載體；以及 (c) 如本文所公開的重組細胞。
在一些實施例中，提供用於以下的套組：(i) 用於產生抗體或其抗原結合片段，(ii) 檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在，或者 (iii) 治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況，所述套組包括其使用說明書和如本文所公開的醫藥組合物。
在一些實施例中，提供用於以下的套組：(i) 用於產生抗體或其抗原結合片段，(ii) 檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在，或者 (iii) 治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況，所述套組包括其使用說明書以及以下中的一種或多種：(a) 如本文所述的抗體或抗原結合片段；(b) 如本文所公開的醫藥組合物；(c) 如本文所公開的重組核酸或載體；以及 (d) 如本文所公開的重組細胞。
前述發明內容僅是說明性的，並不旨在以任何方式進行限制。除了本文描述的說明性實施例和特徵之外，根據附圖、具體實施方式和申請專利範圍，本公開文本的其他態樣、實施例、目的和特徵將變得完全清楚。
相關申請的交叉引用
本申請要求對2021年1月8日提交的美國臨時專利申請序號63/135,504；2021年4月2日提交的63/170,353；2021年8月20日提交的63/235,651；和2021年10月8日提交的63/253,670的優先權。以上引用的申請的公開內容通過引用以其整體（包括任何附圖）明確併入本文。 序列表的併入
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本公開文本大體上尤其涉及用於與病毒感染例如冠狀病毒感染相關的各種健康狀況的診斷和/或治療的組合物、方法、套組和系統。特別地，本公開文本的一些實施例涉及特異性結合至嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段。本公開文本的一些實施例涉及可用於產生這樣的抗體和抗原結合片段的組合物和方法，包括已經被工程化以產生如本文所公開的抗體或其抗原結合片段的重組核酸分子、重組細胞和轉基因動物。本公開文本的一些實施例涉及用於減少SARS-Co-2V S蛋白與受試者的細胞的結合和/或減少SARS-CoV-2進入受試者的細胞中的組合物和方法。本公開文本的一些實施例涉及可用於治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況的組合物和方法。本公開文本的另外的實施例涉及用於有需要的個體中的健康狀況的預防、改善和/或治療的方法、套組和系統。還提供用於鑒定具有對冠狀病毒刺突蛋白（CoV-S）的結合親和力的抗體的組合物和方法。
如下文更詳細地描述，結合S糖蛋白的抗體（包括中和抗體）是針對感染人的冠狀病毒（如SARS-1、SARS-2、MERS以及地區性冠狀病毒229E、NL63、OC43和HKU1）的有效免疫的中心決定簇之一。從SARS-2和其他冠狀病毒感染的人存活者分離的抗體是理想的治療藥因為體細胞超變的自然選擇壓力驅使產生固有地具有低免疫原性的強中和抗體。這樣的抗體的成功分離可以使用其他方法來實現，包括噬菌體展示、人類化小鼠或其他哺乳動物的免疫、結構同源搜索等。然而，從這樣的方法選擇抗體的實際過程可能是令人氣餒的、耗時的並且通常不包括生物學相關資訊。如下文更詳細地說明，本公開文本中描述的方法允許在短時間段內，例如，在一週內，使用“通過定序進行的條碼啟用的抗原映射”（BEAM-seq），從SARS-2的自然感染的人存活者鑒定並分離強效中和抗體。特別地，通過將存活者外周血單個核細胞（PBMC）用以1) 特徵條碼技術相容的DNA寡核苷酸、2) PE或APC螢光團和3) 生物素標記的抗原進行染色並將這些抗原四聚化，本文證實了成功鑒定特異性結合SARS-2的S糖蛋白的抗體，同時排除結合生物素、PE或APC螢光團或無關對照抗原（人血清白蛋白）的抗體的能力。如在實例中所述的實驗中更詳細地討論，所測試的最終抗原是三聚體的四聚體（例如，在每個鏈黴親和素上偶聯的四個三聚體）。另外，本文證實了解釋在其他實驗方法中錯過的抗原結合的生物學協變數的能力，所述生物學協變數包括抗體/B細胞受體本身的表現。此外，本文所述的表位分箱測定（例如，實例14）的結果證實，本公開文本的組合物和方法可以用於具有與冠狀病毒靶標（例如，刺突蛋白）上的不同表位的特異性結合親和力（例如，以變化程度的特異性結合的能力）的抗體的鑒定和表徵。具有對靶蛋白（例如，SARS-2刺突蛋白）上的不同表位的結合親和力的抗體可以有利地用於治療性抗體混合劑或組合療法方案中。例如，具有對SARS-2刺突蛋白的N末端結構域（NTD）的結合親和力的中和抗體可以與具有對相同靶標的受體結合結構域（RTD）的結合親和力的中和抗體有效組合，應為所述兩種抗體不結合在相同表位。
在以下詳細描述中，參考形成本文的一部分的附圖。在圖中，類似的符號通常標識類似的組分，除非上下文另有要求。在詳細描述、附圖和申請專利範圍中描述的說明性供選方案並不意欲具有限制性。可以使用其他供選方案並且可以作出其他改變而不背離本文呈現的主題的精神或範圍。將容易地理解，如本文中大體描述且在圖中說明的態樣可以以眾多種不同的配置進行排列、取代、組合和設計，它們都被明確考慮並且構成本申請的一部分。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語、符號和其他科學術語或用辭旨在具有本申請所屬領域的技術者通常理解的含義。在一些情況下，為了清楚和/或為了便於參考而在本文中定義具有通常理解的含義的術語，並且本文中包含的此類定義不應被解釋為表示與本領域通常理解的實質性差異。本文描述或提及的許多技術和程序是熟習此項技術者良好理解的並且通常由熟習此項技術者使用常規方法加以採用。
除非另有說明，否則本發明的實踐將採用熟習此項技術者熟知的分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學和免疫學的常規技術。這樣的技術充分解釋於文獻中，如Sambrook, J., & Russell, D. W. (2012).Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版).Cold Spring Harbor, 紐約: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001).Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版).Cold Spring Harbor, 紐約: Cold Spring Harbor Laboratory (本文中合稱為“Sambrook”)；Ausubel, F. M. (1987).Current Protocols in Molecular Biology.紐約, 紐約州: Wiley (包括至2014年的增刊)；Bollag, D. M.等人(1996).Protein Methods.紐約, 紐約州: Wiley-Liss；Huang, L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.聖地牙哥: Academic Press；Kaplitt, M. G.等人(1995).Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications.聖地牙哥, 加利福尼亞州: Academic Press; Lefkovits, I. (1997).The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques.聖地牙哥, 加利福尼亞州: Academic Press; Doyle, A.等人(1998).Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology.紐約, 紐約州: Wiley；Mullis, K. B., Ferré, F. & Gibbs, R. (1994).PCR: The Polymerase Chain Reaction.波士頓: Birkhauser Publisher；Greenfield, E. A. (2014).Antibodies: A Laboratory Manual (第2版).紐約, 紐約州: Cold Spring Harbor Laboratory Press；Beaucage, S. L.等人(2000).Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.紐約, 紐約州: Wiley, (包括至2014年的增刊)；以及Makrides, S. C. (2003).Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.阿姆斯特丹, 荷蘭: Elsevier Sciences B.V.，所述文獻的公開內容通過引用併入本文。 定義
除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語、符號和其他科學術語或用辭旨在具有本公開文本所屬領域的技術者通常理解的含義。在一些情況下，為了清楚和/或為了便於參考而在本文中定義具有通常理解的含義的術語，並且本文中包含的此類定義不應被解釋為表示與本領域通常理解的實質性差異。本文描述或提及的許多技術和程序是熟習此項技術者良好理解的並且通常由熟習此項技術者使用常規方法加以採用。
除非上下文另外明確指出，否則單數形式“一個/一種（a）”、“一個/一種（an）”和“所述”包括複數指示物。例如，術語“一種細胞”包括一種或多種細胞，包括其混合物。本文中使用“A和/或B”來包括所有的以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
如本文所用的術語“分析物載體”通常是指源自生物樣品的離散生物學系統。分析物載體可以是或包含生物顆粒。分析物載體例如生物顆粒可以是大分子。分析物載體例如生物顆粒可以是小分子。分析物載體例如生物顆粒可以是病毒，例如，噬菌體。分析物載體例如生物顆粒可以是細胞或細胞衍生物。分析物載體例如生物顆粒可以是細胞器。分析物載體例如生物顆粒可以是來自細胞群的稀有細胞。分析物載體例如生物顆粒可以是任何類型的細胞，包括但不限於原核細胞、真核細胞、細菌、真菌、植物、哺乳動物或其他動物細胞類型、支原體、正常組織細胞、腫瘤細胞或任何其他細胞類型，無論源自單細胞還是多細胞生物。分析物載體例如生物顆粒可以是細胞的成分。分析物載體例如生物顆粒可以是或可以包括DNA、RNA、細胞器、蛋白質或其任何組合。分析物載體例如生物顆粒可以是或可以包括包含細胞或來自細胞（例如，細胞珠）的一種或多種成分的基質（例如，凝膠或聚合物基質），所述成分例如來自細胞的DNA、RNA、細胞器、蛋白質或其任何組合。分析物載體例如生物顆粒可以從受試者的組織獲得。分析物載體例如生物顆粒可以是硬化細胞。這樣的硬化細胞可以包括或可以不包括細胞壁或細胞膜。分析物載體例如生物顆粒可以包括細胞的一種或多種成分，但是可以不包括所述細胞的其他成分。這樣的成分的例子是細胞核或細胞器。細胞可以是活細胞。活細胞可能能夠被培養，例如，在封閉在凝膠或聚合物基質中時被培養，或者在包括凝膠或聚合物基質時被培養。
術語“細胞”、“細胞培養物”、“細胞株”不僅指特定的主題細胞、細胞培養物或細胞株，而且指這種細胞、細胞培養物或細胞株的後代或潛在後代，而不考慮培養中的轉移或傳代次數。應理解，並非所有後代都與親代細胞完全相同。這是因為某些修飾可能由於突變（例如，故意或無意的突變）或環境影響（例如，甲基化或其他表觀遺傳修飾）而在後代中發生，使得後代實際上可能與親本細胞不同，但仍包括在如本文所用的所述術語的範圍內，只要所述後代保留與原始細胞或細胞株相同的功能性即可。
“等效胺基酸殘基”是指能夠替代多肽中的另一個胺基酸殘基而基本上不改變所述多肽的結構和/或功能性的胺基酸殘基。因此，等效胺基酸具有類似的特性，如側鏈的體積、側鏈極性（極性或非極性）、疏水性（疏水或親水）、pH（酸性、中性或鹼性）和碳分子的側鏈組構（芳香族/脂肪族）。因此，“等效胺基酸殘基”可以被視為彼此的“保守胺基酸取代”。
在如本文所應用的術語“等效胺基酸取代”的含義內，一個胺基酸可以被另一個胺基酸取代而基本上不改變多肽的結構和/或功能性。示例性等效或保守胺基酸取代在下文所指示的胺基酸組內：
i) 具有極性側鏈的胺基酸（Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys）；
ii) 具有非極性側鏈的胺基酸（Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met）；
iii) 具有脂肪族側鏈的胺基酸（Gly、Ala、Val、Leu、Ile）；
iv) 具有環狀側鏈的胺基酸（Phe、Tyr、Trp、His、Pro）；
v) 具有芳香族側鏈的胺基酸（Phe、Tyr、Trp）；
vi) 具有酸性側鏈的胺基酸（Asp、Glu）；
vii) 具有鹼性側鏈的胺基酸（Lys、Arg、His）；
viii) 具有醯胺側鏈的胺基酸（Asn、Gln）；
ix) 具有羥基側鏈的胺基酸（Ser、Thr）；
x) 具有含硫側鏈的胺基酸（Cys、Met）；
xi) 中性弱疏水性胺基酸（Pro、Ala、Gly、Ser、Thr）；
xii) 親水性酸性胺基酸（Gin、Asn、Glu、Asp）；以及
xiii) 疏水性胺基酸（Leu、Ile、Val）。
在一些實施例中，使用單點可接受突變（PAM）矩陣來確定等效胺基酸取代。在一些實施例中，使用塊替換矩陣（BLOSUM）來確定等效胺基酸取代。
如本文所，“分離的”抗原結合多肽、抗體或其抗原結合片段、多肽、多核苷酸和載體至少部分不含來自產生它們的細胞或細胞培養物的其他生物學分子。這樣的生物學分子包括核酸、蛋白質、其他抗體或抗原結合片段、脂質、碳水化合物或其他材料，如細胞碎片和生長培養基。分離的抗體或抗原結合片段可以進一步至少部分不含來自宿主細胞或其生長培養基的表現系統組分如生物學分子。通常，術語“分離的”不意圖指代這樣的生物學分子完全不存在或者指代水、緩衝液或鹽或者包括抗體或抗原結合片段的藥物配製品的組分的不存在。
當與細胞、核酸、蛋白質或載體一起使用時，術語“重組的”表明所述細胞、核酸、蛋白質或載體已經通過人干預而改變或產生，如例如已經通過實驗室方法進行修飾或者是實驗室方法的結果。因此，例如，重組蛋白質和核酸包括通過實驗室方法產生的蛋白質和核酸。重組蛋白質可以包括在所述蛋白質的天然（非重組或野生型）形式內未發現的胺基酸殘基，或者可以包括已經被修飾例如被標記的胺基酸殘基。所述術語可以包括對肽、蛋白質或核酸序列的任何修飾。這樣的修飾可以包括以下：對肽、蛋白質或核酸序列的任何化學修飾，包括對一個或多個胺基酸、去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的任何化學修飾；肽或蛋白質中的一個或多個胺基酸的添加、缺失和/或取代；融合蛋白（例如，包含抗體片段的融合蛋白）的產生；以及核酸序列中一個或多個核酸的添加、缺失和/或取代。術語“充足的”在關於細胞使用時並非意圖包括天然存在的細胞，但是涵蓋已經被工程化/修飾以包括或表現在細胞未被工程化/修飾時不會存在於所述細胞中的多肽或核酸的細胞。
如本文所用，“受試者”或“個體”包括動物，如人（例如，人個體）和非人動物。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物，例如，齧齒類動物（例如，小鼠）、非人靈長類動物和其他哺乳動物（如例如，大鼠、小鼠、貓、狗、牛、豬、綿羊、馬、山羊、兔）；以及非哺乳動物，如兩棲動物、爬行動物等。受試者可以是哺乳動物，優選地人或人類化動物，例如，具有人類化VDJC基因座的動物。受試者可以是具有人類化VDJC基因座和目的靶標的敲除的非人動物。受試者可以實際上用於疾病或障礙如病毒感染或癌症的預防和/或治療。受試者可能患有病毒感染，例如，冠狀病毒感染，或者易於患上感染。易於患上感染的受試者或者可能處於患上感染（例如，冠狀病毒）的升高風險的受試者包括由於自身免疫性疾病而具有受損的免疫系統的受試者、接受免疫抑制療法的受試者（例如，在器官移植後）、患有人類免疫缺陷症候群（HIV）或獲得性免疫缺陷症候群（AIDS）的受試者、患有耗盡或破壞白細胞的貧血形式的受試者、接受放射或化療的受試者或者患有炎性障礙的受試者。另外，非常年輕（例如，5歲或更小）或老年（例如，65歲或更老）的受試者具有增加的風險。此外，受試者可能由於靠近疾病的暴發而處於患上病毒感染的風險，例如，受試者居住在人口稠密的城市或者非常靠近已經確認或懷疑感染病毒的受試者，或者由於職業選擇，例如醫院職工、藥物研究人員、疫區旅客或飛行常客。
多肽如免疫球蛋白鏈（例如，VH、VL、HC或LC）的“變異體”是指包含具有與本文所示的參考胺基酸序列至少約70-99.9%（例如，70%、72%、74%、75%、76%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%）序列同一性或相似性的胺基酸序列的多肽。在一些實施例中，在兩種或更多種蛋白質的情況下，如本文所用術語“同一性百分比”是指當在比較窗或指定區域中比較和對比以獲得最大對應性時，在指定區域中相同或具有指定百分比的相同胺基酸（例如，約70%、72%、74%、75%、76%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或更高同一性）的兩個或更多個序列或子序列，如使用具有下文所述的默認參數的BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法或者通過人工比對和目測檢查所測量。參見例如，在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的NCBI萬維網站。類似地，核酸分子的“變異體”是指包含具有與本文所示的參考核酸序列至少約70-99.9%（例如，70%、72%、74%、75%、76%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%）序列同一性或相似性的核酸序列的核酸分子。在一些實施例中，此定義也是指或者可以應用於查詢序列的互補體。此定義包括通過BLAST演算法進行的序列比較，其中所述演算法的參數被選擇以給出在各自參考序列的全長中各自序列之間的最大匹配。在一些實施例中，此定義還包括具有修飾如缺失和/或添加（例如，插入）的序列，以及具有取代的那些序列。這樣的修飾可以以自然或合成方式進行。序列同一性可以在長度為至少約20個胺基酸或核苷酸的區域中或者在長度為10-100個胺基酸或核苷酸的區域中或者在給定序列的整個長度中計算。在一些實施例中，序列同一性可以使用公開的技術和廣泛可用的電腦程式如GCS套裝程式（Devereux等人, Nucleic Acids Res (1984) 12:387）、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul等人, J Mol Biol (1990) 215:403）來計算。在一些實施例中，序列同一性可以使用序列分析軟體以其預設參數來測量，如University of Wisconsin Biotechnology Center（1710 University Avenue，麥迪森，威斯康辛州53705）的Genetics Computer Group的序列分析套裝軟體。可以合適地用於確定胺基酸序列的結構相似性或同一性的另外的方法包括依賴於併入來自Rosetta的結構預測得分的位置特異性結構評分矩陣（P3SM）的那些方法，以及基於長度歸一化編輯距離的那些方法，如先前於Setcliff等人, Cell Host & Microbe 23(6), 2018年5月中所述。
在提供了一系列值時，應理解的是每個中間值，到下限的第十個單位（除非上下文清晰地另外指示），所述範圍的上限與下限之間以及任何其他陳述的或在所述陳述範圍內的中間值均被涵蓋在本公開文本之內。這些更小範圍的上限和下限可獨立地被包括在更小範圍之內，並且也被涵蓋在本公開文本之內，服從於陳述的範圍內的任何明確排除的界限。當陳述的範圍包括一個或兩個界限時，排除那些包括的界限中的任一個或兩個的範圍也包括在本公開文本中。
某些範圍在本文中通過前面帶有術語“約”的數值呈現。本文中使用術語“約”是為了對其後的精確數字以及接近或近似所述術語後的數位的數位提供文字支援。在確定數字是否接近或近似於具體列舉的數字時，接近或近似的未列舉的數字可以是在呈現它的上下文中提供具體列舉的數位的基本等效形式的數位。如果根據上下文原本不清楚近似程度，則“約”意指在提供的值的正負10%以內，或四捨五入到最接近的有效數字，在所有情況下包括所提供的值。在一些實施例中，術語“約”指示指定值 ± 至多10%、至多± 5%或至多± 1%。
應瞭解，為明確起見在單獨實施例的上下文中描述的本公開文本的某些特徵也可以在單一實施例中組合提供。相反，為簡潔起見在單一實施例的上下文中描述的本公開文本的各種特徵還可以分開地或以任何合適的子組合提供。屬於本公開文本的實施例的所有組合確切地涵蓋在本公開文本中並且在本文中公開如同每個和每一種組合均單獨地和明確地公開一樣。此外，各種實施例及其要素的所有子組合也確切地涵蓋在本公開文本中並且在本文中公開如同每個和每一種這樣的子組合均單獨地和明確地在本文中公開一樣。 冠狀病毒
冠狀病毒是大型有包膜的正義單鏈RNA病毒家族。它們感染人、其他哺乳動物和鳥類物種，包括家畜和伴侶動物（如狗、貓、雞、牛、豬和鳥），並且因此不僅是對公共健康的挑戰，也是個獸醫和經濟問題。冠狀病毒包括α冠狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒和δ冠狀病毒的屬。α冠狀病毒和β冠狀病毒僅感染哺乳動物物種，而γ冠狀病毒和δ冠狀病毒具有包括鳥類物種在內的更寬的宿主範圍。冠狀病毒引起呼吸、胃腸和神經疾病。臨床實踐中最常見的冠狀病毒是229E、OC43、NL63和HKU1，它們典型地在免疫活性個體中引起普通感冒症狀。人和動物冠狀病毒感染主要導致呼吸和腸道疾病。
人冠狀病毒如HCoV-229E和HCoV-OC43早已得知在群體中循環，並且它們與最近鑒定的HCoV-NL63和HCoV-HKU1一起引起與“普通感冒”症狀相關的季節性且通常輕度的呼吸道感染。與之形成鮮明對比的是，在過去20年中在人群中出現的嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸症候群冠狀病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2具有高致病性。通過感染人的支氣管上皮細胞、肺細胞和上呼吸道細胞，SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2感染可能發展為嚴重的危及生命的呼吸病狀和肺損傷。
冠狀病毒感染的初始步驟涉及冠狀病毒刺突（S）蛋白與細胞進入受體的特異性結合，所述受體已經針對幾種冠狀病毒加以鑒定並且包括人胺肽酶N（APN；HCoV-229E）、血管緊張素轉換酶2（ACE2；HCoV-NL63、SARS-CoV和SARS-CoV-2）以及二肽基肽酶4（DPP4；MERS-CoV）。因此進入受體的表現和組織分佈影響病毒向性和致病性。在細胞內生命週期期間，冠狀病毒表現並複製其基因組RNA以產生摻入新產生的病毒顆粒中的全長拷貝。冠狀病毒具有側接5'和3'非轉譯區的大型RNA基因組，所述非轉譯區含有RNA合成所必需的順式作用的二級RNA結構。在5'端，基因組RNA特徵為兩個大型開放閱讀框（ORF；ORF1a和ORF1b），所述開放閱讀框佔據加帽且多聚腺苷酸化基因組的三分之二。ORF1a和ORF1b編碼15-16個非結構蛋白（nsp），其中15個構成病毒複製和轉錄複合物（RTC），所述複合物尤其包括RNA加工酶和RNA修飾酶以及維持＞ 30 kb冠狀病毒基因組的完整性所需的RNA校對功能。編碼結構蛋白的ORF和編碼輔助蛋白的散佈ORF是從基因組的3'三分之一轉錄的，以形成亞基因組mRNA（sg mRNA）的嵌套集。冠狀病毒輔助蛋白是即使在單獨物種內也展示有限保守性的病毒特有蛋白質的高度可變集，但是主要認為它們促進調節宿主對感染的反應並且是病毒致病性的決定簇。然而，由於缺少與其他冠狀病毒的輔助蛋白或者與其他已知蛋白質的同源性，許多輔助蛋白的分子功能仍然在很大程度上是未知的。
冠狀病毒病毒粒體是球形的，直徑大約125 nm。冠狀病毒的最突出特徵是從病毒粒體的表面發出的棒形刺突突出物。這些刺突是病毒粒體的定義性特徵並且給予它們日冕的外觀，從而導致得名冠狀病毒。在病毒粒體的包膜內是核殼。冠狀病毒具有螺旋對稱的核殼，這在正義RNA病毒中不常見，但是對於負義RNA病毒顯著更常見。SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV屬於冠狀病毒家族。病毒粒體最初附著至宿主細胞是通過S蛋白與其受體之間的相互作用引發的。RBD在冠狀病毒S蛋白的S1區域（通常稱為S1亞基）內的位點根據病毒而變化，一些病毒的RBD位於S1的C末端。S蛋白/受體相互作用是冠狀病毒感染宿主物種的主要決定簇，並且還控制病毒的組織向性。許多冠狀病毒利用肽酶作為它們的細胞受體。在受體結合後，病毒必須隨後到達宿主細胞胞質溶膠。這通常是通過組織蛋白酶、TMPRRS2或另一種蛋白酶對S蛋白的酸依賴性蛋白水解切割來完成，之後病毒與細胞膜融合。關於冠狀病毒生物學、病理生理學、診斷和治療的另外的資訊可以發現於最近V'kovski P.等人（Nature Rev. Microbiol. 2020年10月28日）和Wiersinga WJ等人（JAMA. 2020;324(8):782-793）的評論中。
已經注意到，SARS-CoV和SARS-CoV-2具有類似的結構蛋白，包括刺突（S）、包膜（E）、膜（M）和核殼（N）蛋白。在SARS-CoV中，S蛋白具有最高免疫原性並且含有作為中和抗體的靶標的RBD。所述RBD結合至血管緊張素轉換酶2（ACE2），所述酶起功能受體的作用以介導病毒的細胞進入。RBD-ACE2相互作用具有高親和力並且具有高特異性。儘管SARS-CoV-2和SARS-CoV蛋白共用高度同源性，但是RBD具有相對低程度的同源性。因此，針對SARS-CoV開發的許多靶向RBD的中和抗體無法中和SARS-CoV-2。
冠狀病毒S蛋白是I類融合糖蛋白，其組裝成三聚體並構成帶包膜的冠狀病毒顆粒的表面上的刺突或膜粒。所述蛋白質被分為具有不同功能（即宿主受體結合和膜融合）的兩個部分（區域或亞基），它們歸因於S蛋白的N末端半（S1）和C末端半（S2）。表面暴露的S1包括特異性接合宿主細胞受體的NTD和RBD，從而確定病毒的細胞向性和致病性。跨膜S2結構域含有七肽重複區（例如，七肽重複1（HR1）和七肽重複2（HR2））、中心螺旋（CH）、連接器結構域（CD）、跨膜結構域（TM）和胞質尾（CT）、融合肽（FP），所述融合肽在廣泛構形重排後介導病毒與細胞膜的融合。S2亞基的功能是將病毒與宿主細胞的膜融合。在S1亞基與S2亞基之間的邊界處的切割位點被稱為S1/S2蛋白酶切割位點。對於所有冠狀病毒，宿主蛋白酶在S2'切割位點切割刺突糖蛋白以啟動所述蛋白質，從而允許隨後通過不可逆的構形變化將病毒和宿主細胞的膜融合。CoV-S經由S1亞基中存在的受體結合結構域（RBD）結合至其同源受體血管緊張素轉換酶2（ACE2）。全長SARS-CoV-2刺突蛋白的胺基酸序列通過SEQ ID NO: 1483和圖15A中提供的胺基酸序列來例示。如本文所用術語“CoV-S”包括從不同CoV分離株分離的CoV刺突蛋白的蛋白質變異體以及重組CoV刺突蛋白或其片段。CoV刺突蛋白變異體包括CoV刺突融合蛋白和具有一個或多個取代的CoV刺突蛋白，如通過SEQ ID NO: 1484和圖15B中提供的胺基酸序列所例示。在一些實施例中，CoV刺突蛋白是合成CoV刺突蛋白。 本公開文本的組合物
如下文更詳細地描述，本公開文本的一態樣涉及特異性結合至CoV刺突蛋白或其抗原性片段的抗CoV-S抗原結合多肽，如抗體及其抗原結合片段。在本公開文本的其他相關態樣，還提供編碼如本文所公開的抗體和抗原結合片段的核酸、工程化以產生如本文所公開的抗體和抗原結合片段的重組細胞和轉基因動物、含有如本文所公開的核酸、重組細胞和抗體和抗原結合片段中的一種或多種的醫藥組合物。 抗原結合蛋白
本公開文本的一態樣涉及通過本文所公開的方法鑒定的抗原結合多肽，如抗體及其抗原結合片段，例如，特異性結合至CoV刺突蛋白或其抗原性片段的抗體及其抗原結合片段。
抗體通常被熟習此項技術者理解為是指包括四條多肽鏈（即通過二硫鍵互連的兩條重鏈（HC）和兩條輕鏈（LC））的免疫球蛋白分子（即，“完整抗體分子”），以及其多聚體（例如，IgM）。示例性抗體包括例如表1中列出的那些。每條重鏈包括重鏈可變區（“HCVR”或“VH”）和重鏈恒定區（其由結構域CH1、CH2和CH3構成）。每條輕鏈由輕鏈可變區（“LCVR”或“VL”）和輕鏈恒定區（CL）構成。VH和VL區域可以進一步細分為稱為互補決定區（CDR）的高變性區域，其散佈有稱為架構區（FWR）的更保守區域。每個VH和VL包括三個CDR和四個FWR，從胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3和FWR4。重鏈CDR也可以被稱為HCDR，並且如上所述進行編號（例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3）。同樣，輕鏈CDR可以被稱為LCDR，並且被編號為LCDR1、LCDR2和LCDR3。在本公開文本的一些實施例中，抗體或其抗原結合片段的FWR與人種系序列相同，或者以自然或人工方式進行修飾。因此，本公開文本提供抗CoV-S抗體或其抗原結合片段（例如，抗SARS-CoV-2-S抗體或其抗原結合片段），其在人種系免疫球蛋白序列的可變重鏈或輕鏈區域內包括表1的HCDR和LCDR序列。
在一些實施例中，將胺基酸分配至每個結構域是按照以下的定義：Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat等人；National Institutes of Health，貝塞斯達, 馬里蘭州; 第5版; NIH Publ.編號91-3242 (1991)。抗體CDR的胺基酸序列邊界也可以由熟習此項技術者使用多種編號方案中的任一種來確定，所述編號方案包括以下文獻中所述的那些：Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75；Kabat等人, (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616（“Kabat”編號方案，其匯出CDR定義和僅基於抗體序列資訊的殘基編號方案）；Chothia等人, (1987) J Mol. Biol. 196:901-917，Chothia等人, (1989) Nature 342:878-883，或者Al-Lazikani等人, 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948（“Chothia”編號方案，其定義來自抗體的最早結構的確定CDR）；MacCallum等人, 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745（“Contact”編號方案）；Lefranc等人, Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77（“IMGT”編號方案）；以及Honegge和Plückthun, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70（“AHo”編號方案）。另外或可替代地，抗體CDR的胺基酸序列邊界也可以由熟習此項技術者使用“增強型Chothia”方案來確定，如先前於例如Abhinandan KR和Martin AC, Mol Immunol 2008年8月;45(14):3832-9中所述；或者使用更近的抗體CDR環構形的距離函數聚類方法，其基於方向統計學和使用近鄰傳播的聚類演算法（參見例如，North B.等人 J Mol Biol. 2011年2月18日; 406(2): 228-256）。
在一些實施例中，CDR和FWR區域是使用進化上保守的基序來確定。參見例如，美國申請序號63/163,292，其通過引用以其整體特此併入。 表1：本公開文本的示例性抗原結合多肽，例如，抗體。HCVR(1)和LCVR(1)分別對應於重鏈可變區和輕鏈可變區的序列，不含前導肽序列。HCVR(2)和LCVR(2)分別對應於重鏈可變區和輕鏈可變區的序列，包括前導肽序列。編碼HCVR和LCVR的示例性核酸序列分別列於SEQ ID NO: 1487-1886和1887-2286中。
抗體 克隆型 胺基酸序列識別字(SEQ ID NO)
HCVR (1) HCVR (2) HCDR 1 HCDR 2 HCDR 3 LCVR (1) LCVR (2) LCDR 1 LCDR 2 LCDR 3
TXG-0021 A 1163 1243 43 123 203 1323 1403 283 363 443
TXG-0022 A 1164 1244 44 124 204 1324 1404 284 364 444
TXG-0023 A 1165 1245 45 125 205 1325 1405 285 365 445
TXG-0027 B 1166 1246 46 126 206 1326 1406 286 366 446
TXG-0028 B 1167 1247 47 127 207 1327 1407 287 367 447
TXG-0043    1168 1248 48 128 208 1328 1408 288 368 448
TXG-0049    1169 1249 49 129 209 1329 1409 289 369 449
TXG-0051    1170 1250 50 130 210 1330 1410 290 370 450
TXG-0056    1171 1251 51 131 211 1331 1411 291 371 451
TXG-0061    1172 1252 52 132 212 1332 1412 292 372 452
TXG-0062    1173 1253 53 133 213 1333 1413 293 373 453
TXG-0067    1174 1254 54 134 214 1334 1414 294 374 454
TXG-0068    1175 1255 55 135 215 1335 1415 295 375 455
TXG-0072    1176 1256 56 136 216 1336 1416 296 376 456
TXG-0083    1177 1257 57 137 217 1337 1417 297 377 457
TXG-0085    1178 1258 58 138 218 1338 1418 298 378 458
TXG-0089    1179 1259 59 139 219 1339 1419 299 379 459
TXG-0090    1180 1260 60 140 220 1340 1420 300 380 460
TXG-0092    1181 1261 61 141 221 1341 1421 301 381 461
TXG-0095    1182 1262 62 142 222 1342 1422 302 382 462
TXG-0096    1183 1263 63 143 223 1343 1423 303 383 463
TXG-0098    1184 1264 64 144 224 1344 1424 304 384 464
TXG-0105    1185 1265 65 145 225 1345 1425 305 385 465
TXG-0106    1186 1266 66 146 226 1346 1426 306 386 466
TXG-0108    1187 1267 67 147 227 1347 1427 307 387 467
TXG-0110    1188 1268 68 148 228 1348 1428 308 388 468
TXG-0111    1189 1269 69 149 229 1349 1429 309 389 469
TXG-0112    1190 1270 70 150 230 1350 1430 310 390 470
TXG-0113    1191 1271 71 151 231 1351 1431 311 391 471
TXG-0115    1192 1272 72 152 232 1352 1432 312 392 472
TXG-0118    1193 1273 73 153 233 1353 1433 313 393 473
TXG-0121    1194 1274 74 154 234 1354 1434 314 394 474
TXG-0123    1195 1275 75 155 235 1355 1435 315 395 475
TXG-0124    1196 1276 76 156 236 1356 1436 316 396 476
TXG-0130    1197 1277 77 157 237 1357 1437 317 397 477
TXG-0134    1198 1278 78 158 238 1358 1438 318 398 478
TXG-0135    1199 1279 79 159 239 1359 1439 319 399 479
TXG-0136    1200 1280 80 160 240 1360 1440 320 400 480
TXG-0137    1201 1281 81 161 241 1361 1441 321 401 481
TXG-0138    1202 1282 82 162 242 1362 1442 322 402 482
TXG-0140    1203 1283 83 163 243 1363 1443 323 403 483
TXG-0145    1204 1284 84 164 244 1364 1444 324 404 484
TXG-0147    1205 1285 85 165 245 1365 1445 325 405 485
TXG-0150    1206 1286 86 166 246 1366 1446 326 406 486
TXG-0152    1207 1287 87 167 247 1367 1447 327 407 487
TXG-0153    1208 1288 88 168 248 1368 1448 328 408 488
TXG-0154    1209 1289 89 169 249 1369 1449 329 409 489
TXG-0160    1210 1290 90 170 250 1370 1450 330 410 490
TXG-0165    1211 1291 91 171 251 1371 1451 331 411 491
TXG-0167    1212 1292 92 172 252 1372 1452 332 412 492
TXG-0169    1213 1293 93 173 253 1373 1453 333 413 493
TXG-0171    1214 1294 94 174 254 1374 1454 334 414 494
TXG-0172    1215 1295 95 175 255 1375 1455 335 415 495
TXG-0173    1216 1296 96 176 256 1376 1456 336 416 496
TXG-0174    1217 1297 97 177 257 1377 1457 337 417 497
TXG-0177    1218 1298 98 178 258 1378 1458 338 418 498
TXG-0179    1219 1299 99 179 259 1379 1459 339 419 499
TXG-0182    1220 1300 100 180 260 1380 1460 340 420 500
TXG-0191    1221 1301 101 181 261 1381 1461 341 421 501
TXG-0192    1222 1302 102 182 262 1382 1462 342 422 502
TXG-0194    1223 1303 103 183 263 1383 1463 343 423 503
TXG-0195    1224 1304 104 184 264 1384 1464 344 424 504
TXG-0196    1225 1305 105 185 265 1385 1465 345 425 505
TXG-0205    1226 1306 106 186 266 1386 1466 346 426 506
TXG-0208    1227 1307 107 187 267 1387 1467 347 427 507
TXG-0211    1228 1308 108 188 268 1388 1468 348 428 508
TXG-0212    1229 1309 109 189 269 1389 1469 349 429 509
TXG-0213    1230 1310 110 190 270 1390 1470 350 430 510
TXG-0214    1231 1311 111 191 271 1391 1471 351 431 511
TXG-0215    1232 1312 112 192 272 1392 1472 352 432 512
TXG-0216    1233 1313 113 193 273 1393 1473 353 433 513
TXG-0217    1234 1314 114 194 274 1394 1474 354 434 514
TXG-0218    1235 1315 115 195 275 1395 1475 355 435 515
TXG-0226    1236 1316 116 196 276 1396 1476 356 436 516
TXG-0227 C 1237 1317 117 197 277 1397 1477 357 437 517
TXG-0228 C 1238 1318 118 198 278 1398 1478 358 438 518
TXG-0229 C 1239 1319 119 199 279 1399 1479 359 439 519
TXG-0230 C 1240 1320 120 200 280 1400 1480 360 440 520
TXG-0231    1241 1321 121 201 281 1401 1481 361 441 521
TXG-0237    1242 1322 122 202 282 1402 1482 362 442 522
如本文所用術語抗體或抗原結合多肽的“抗原結合片段”包括特異性結合抗原以形成複合物的任何天然存在的、可酶促獲得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。抗原結合片段的非限制性例子包括：(i) Fab片段；(ii) F(ab')2片段；(iii) Fd片段；(iv) Fv片段；(v) 單鏈Fv（scFv）分子；(vi) dAb片段；以及 (vii) 由模擬抗體高變區（例如，分離的互補決定區（CDR），如CDR3肽）或受限FWR3-CDR3-FWR4肽的胺基酸殘基組成的最小識別單元。其他工程化分子，如結構域特異性抗體、單一結構域抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、微抗體、奈米抗體（例如，單價奈米抗體、二價奈米抗體等）、小型模組免疫藥物（SMIP）和鯊魚可變IgNAR結構域，也涵蓋在如本文所用的表述“抗原結合片段”內。在本公開文本的一些實施例中，抗原結合片段包括表1中抗體的三個或更多個CDR（例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3；或者LCDR1、CDR2和LCDR3）。
在本公開文本的一些實施例中，抗體的抗原結合片段包括至少一個可變結構域。所述可變結構域可以具有任何大小或胺基酸組成，並且通常將包括與一個或多個架構序列相鄰或同框的至少一個CDR。在具有與VL結構域相關的VH結構域的抗原結合片段中，VH和VL結構域可以以任何合適的排列相對於彼此而定位。例如，可變區可以是二聚的並且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。可替代地，抗體的抗原結合片段可以含有單體VH或VL結構域。
在一些實施例中，抗體的抗原結合片段可以含有共價連接至至少一個恒定結構域的至少一個可變結構域。可以在本公開文本的抗體的抗原結合片段內發現的可變結構域和恒定結構域的非限制性示例性組態包括：(i) V H-C H1；(ii) V H-C H2；(iii) V H-C H3；(iv) V H-C H1-C H2；(v) V H-C H1-C H2-C H3；(vi) V H-C H2-C H3；(vii) V H-C L；(viii) V L-C H1；(ix) V L-C H2；(x) V L-C H3；(xi) V L-C H1-C H2；(xii) V L-C H1-C H2-C H3；(xiii) V L-C H2-C H3；以及 (xiv) V L-C L。在可變結構域和恒定結構域的任何組態，包括上文列出的任何示例性組態中，可變結構域和恒定結構域可以彼此直接連接，或者可以通過完整或部分鉸鏈或接頭區域來連接。鉸鏈區可以由至少2個（例如，5、10、15、20、40、60或更多個）胺基酸組成，其導致在單一多肽分子中的相鄰可變結構域和/或恒定結構域之間的柔性或半柔性連接。此外，本公開文本的抗體的抗原結合片段可以包括上文列出的任何可變結構域和恒定結構域組態的同二聚體或異二聚體（或其他多聚體），它們彼此非共價締合和/或與一或多個單體VH或VL結構域非共價締合（例如，通過一個或多個二硫鍵）。抗原結合蛋白（例如，抗體和抗原結合片段）可以具有單特異性或多特異性（例如，雙特異性）。
在本公開文本的一態樣，本文提供特異性結合至嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒2（SARS-CoV-2）的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體選自TXG-0153、TXG-0115、TXG-140和TXG-154，其中：(a) TXG-0153的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 88、168、248、328、408和488中所示的胺基酸序列；(b) TXG-0115的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 72、152、232、312、392和472中所示的胺基酸序列；(c) TXG-0140的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 83、163、243、323、403和483中所示的胺基酸序列；並且 (d) TXG-0154的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 89、169、249、329、409和489中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段來自TXG-0153的所有六個CDR。在一些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段來自TXG-0115的所有六個CDR。在一些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段來自TXG-0140的所有六個CDR。在一些實施例中，所述抗體或其抗原結合片段來自TXG-0154的所有六個CDR。
在另一態樣，本文提供特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中如本文所公開的抗體或其片段與參考抗體競爭結合至SARS-CoV-2刺突蛋白上的相同表位。在一些實施例中，所述參考抗體是選自凱西瑞單抗、伊德維單抗（Imdevimab）、巴馬尼單抗、依替昔單抗、索托維單抗和替科維單抗（Tixagevimab）的FDA批准的抗體。在一些實施例中，如本文所公開的抗體或其片段與索托維單抗競爭結合至SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）中的相同表位。在一些實施例中，SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD中的索托維單抗表位包括SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD的胺基酸殘基332-337、339-340、343-346、354、356-361、440-441和/或509。參見例如，Pinto D.等人 Nature, 第583卷, 第290-295頁 (2020)。在一些實施例中，如本文所公開的抗體或其片段與索托維單抗共用表位箱。在一些實施例中，如本文所公開的抗體或其片段與索托維單抗競爭結合至SARS-CoV-2刺突蛋白的RBD的胺基酸殘基332-337、339-340、343-346、354、356-361、440-441和/或509。
在本公開文本的一態樣，本文提供特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含選自SEQ ID NO: 1-3的胺基酸序列的重鏈互補決定區1（HCDR1）；(b) 包含選自SEQ ID NO: 4-6的胺基酸序列的HCDR2，以及c) 包含選自SEQ ID NO: 7-9的胺基酸序列的HCDR3。
本公開文本的抗體及其抗原結合片段的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。在一些實施例中，本公開文本的抗體及其抗原結合片段包括來自屬於相同克隆型家族（例如，來自選自克隆型家族A、B和C的克隆型家族）的抗體的重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）。因此，在一些實施例中，本公開文本的抗體及其抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 1、4和7中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 2、5和8中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 3、6和9中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。
在一態樣，本公開文本的一些實施例提供特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含選自SEQ ID NO: 10-12的胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（LCDR1）；(b) 包含選自SEQ ID NO: 13-15的胺基酸序列的LCDR2；以及 (c) 包含選自SEQ ID NO: 16-18的胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，本公開文本的抗體及其抗原結合片段包括來自屬於相同克隆型家族（例如，來自選自克隆型家族A、B和C的克隆型家族）的抗體的輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3）。因此，在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 10、13和16中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 11、14和17中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體和抗原結合片段包括分別如SEQ ID NO: 12、15和18中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在另一態樣，本文提供特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含選自SEQ ID NO: 1-3的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包含選自SEQ ID NO: 4-6的胺基酸序列的HCDR2；c) 包含選自SEQ ID NO: 7-9的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包含選自SEQ ID NOS: 10-12的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包含選自SEQ ID NO: 13-15的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包含選自SEQ ID NO: 16-18的胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，本公開文本的抗體及其抗原結合片段包括來自屬於相同克隆型家族（例如，選自克隆型家族A、B和C的克隆型家族）的抗體的 (a) 重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和 (b) 輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3）。因此，在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包含：(a) 分別如SEQ ID NO: 1、4和7中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及b) 分別如SEQ ID NO: 10、13和16中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包含：(a) 分別如SEQ ID NO: 2、5和8中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及b) 分別如SEQ ID NO: 11、14和17中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包含：(a) 分別如SEQ ID NO: 3、6和9中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及b) 分別如SEQ ID NO: 12、15和18中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
本公開文本的抗體及其抗原結合片段的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。在一些實施例中，本公開文本的抗體及其抗原結合片段可以包括包含除了一個或多個（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個）突變（如例如，錯義突變（例如，保守取代）、無義突變、缺失或插入）外示于本文中的胺基酸序列的多肽。例如，本公開文本包括抗原結合多肽，其包括包含表1和序列表中所示但具有一個或多個這樣的突變的LCVR胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈變異體和/或包含表1和序列表中所示但具有一個或多個這樣的突變的HCVR胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈變異體。如下文更詳細地描述，在一些實施例中，本公開文本的抗CoV-S抗體或抗原結合片段可以包括包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白輕鏈變異體，其中一個或多個（例如，1或2或3個）這樣的CDR具有一個或多個這樣的突變（例如，保守取代）；和/或包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白重鏈變異體，其中一個或多個（例如，1或2或3個）這樣的CDR具有一個或多個這樣的突變（例如，保守取代）。這樣的取代可以位於抗體或抗原結合片段的CDR、架構和/或恒定區中。
因此，在一些實施例中，本公開文本的抗體及其抗原結合片段可以包括本文所示的一個或多個變異體CDR（例如，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和/或LCDR3中的任何一個或多個），其具有與例如表1和序列表的重鏈和輕鏈CDR的至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）序列同一性。
在一些實施例中，所述HCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）相同。在一些實施例中，所述HCDR1包括選自SEQ ID NO: 1-3和SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述HCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列100%相同。在一些實施例中，所述HCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）相同。在一些實施例中，所述HCDR2包括選自SEQ ID NO: 4-6和SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述HCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列100%相同。在一些實施例中，所述HCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）相同。在一些實施例中，所述HCDR3包括選自SEQ ID NO: 7-9和SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述HCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列100%相同。
在一些實施例中，所述LCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）相同。在一些實施例中，所述LCDR1包括選自SEQ ID NO: 10-12和SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述LCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列100%相同。在一些實施例中，所述LCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）相同。在一些實施例中，所述LCDR2包括選自SEQ ID NO: 13-15和SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述LCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列100%相同。在一些實施例中，所述LCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）相同。在一些實施例中，所述LCDR3包括選自SEQ ID NO: 16-18和SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。在一些實施例中，所述LCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列100%相同。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含具有與SEQ ID NO: 43-122的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包含具有與SEQ ID NO: 123-202的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2；c) 包含具有與SEQ ID NO: 203-282的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包含具有與SEQ ID NO: 283-362的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包含具有與SEQ ID NO: 363-442的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包含具有與SEQ ID NO: 443-522的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自屬於克隆型家族的抗體的HCDR和LCDR。熟習此項技術者將認識到，在稱抗體包括“獨立選自抗體組”的多個HCDR和/或LCDR時，這可以意指抗體或抗原結合片段的每個HCDR和/或LCDR可以獨立地選自屬於所述抗體組的抗體的HCDR和LCDR。因此，在一些實施例中，如本文所公開的抗體或抗原結合片段可以包括三個HCDR和三個LCDR，其各自可以獨立地選自屬於同一抗體組的不同抗體的HCDR和LCDR。因此，在一些實施例中，如本文所公開的抗體或抗原結合片段可以包括所述組中任一種抗體的三個HCDR和三個LCDR。
本公開文本的一些實施例提供一種抗體或抗原結合片段，其包括三個HCDR和三個LCDR，其各自獨立地選自屬於克隆型家族的抗體的HCDR和LCDR。在一些實施例中，如本文所公開的抗體或抗原結合片段可以包括三個HCDR和三個LCDR，其各自可以獨立地選自屬於同一克隆型家族的不同抗體的HCDR和LCDR。在一些實施例中，如本文所公開的抗體或抗原結合片段可以包括克隆型家族的所選抗體的三個HCDR和三個LCDR。如下文實例6-實例7中更詳細地描述，選擇展現高於截止閾值的與靶抗原的結合親和力的抗體和抗原結合片段用於使用10x Genomics “Enclone”（可在https://bit.ly/enclone獲得）進一步分析，其為開發用於克隆分組以研究適應性免疫系統的計算工具。在此計算工具中，將含有B細胞受體（BCR）和T細胞受體（TCR）RNA序列的10x Genomics Chromium單細胞V(D)J資料作為輸入資料登錄到Enclone中。基於所述輸入，Enclone尋找源自相同祖細胞的細胞並將其組織化為多個組（例如，克隆型家族），並且簡潔地展示每個克隆型以及其突出特徵，包括突變的胺基酸。在一些實施例中，所述抗體屬於克隆型家族A、B和C。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自抗體的以下克隆型家族的HCDR和LCDR：(a) 克隆型家族A：TXG-0021、TXG-0022和TXG-0023；(b) 克隆型家族B：TXG-0027和TXG-0028；或者 (c) 克隆型家族C：TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自屬於克隆型家族A的抗體的HCDR和LCDR。因此，在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含具有與選自SEQ ID NO: 43-45的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包含具有與選自SEQ ID NO: 123-125的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2；(c) 包含具有與選自SEQ ID NO: 203-205的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包含具有與選自SEQ ID NO: 283-285的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包含具有與選自SEQ ID NO: 363-365的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包含具有與選自SEQ ID NO: 443-445的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自屬於克隆型家族B的抗體的HCDR和LCDR。因此，在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含具有與選自SEQ ID NO: 46-47的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包含具有與選自SEQ ID NO: 126-127的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2；(c) 包含具有與選自SEQ ID NO: 206-207的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包含具有與選自SEQ ID NO: 286-287的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包含具有與選自SEQ ID NO: 366-367的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包含具有與選自SEQ ID NO: 446-447的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自屬於克隆型家族C的抗體的HCDR和LCDR。因此，在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含具有與選自SEQ ID NO: 117-120的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1；(b) 包含具有與選自SEQ ID NO: 197-200的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2；(c) 包含具有與選自SEQ ID NO: 277-280的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3；(d) 包含具有與選自SEQ ID NO: 357-360的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1；(e) 包含具有與選自SEQ ID NO: 437-440的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 (f) 包含具有與選自SEQ ID NO: 517-520的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
本文所述的CoV-S抗體和抗原結合片段的胺基酸序列中的變異可能是天然存在的，如剪接變異體或等位基因變異體。另外或可替代地，CoV-S抗體和抗原結合片段的胺基酸序列中的變異可以通過編碼所述抗體的核酸序列中的一個或多個密碼子的取代、缺失或插入來引入，所述取代、缺失或插入導致所述抗體的胺基酸序列的變化。任選地，所述變異可以源自抗體中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸被任何其他胺基酸取代。CoV-S抗體和抗原結合片段的變異體中的胺基酸取代可以是保守的或非保守的。熟習此項技術者將理解，在關於多肽使用時，“非保守取代”是指用具有顯著不同的側鏈特性的胺基酸取代多肽中的胺基酸。非保守取代可以使用所界定組之間而非所界定組內的胺基酸，並且影響 (a) 取代區域中肽骨架的結構（例如，絲胺酸取代甘胺酸），(b) 電荷或疏水性，或者 (c) 側鏈的體積。非限制性示例性非保守取代可以是被鹼性或脂肪族胺基酸取代的酸性胺基酸；被小胺基酸取代的芳香族胺基酸；以及被疏水性胺基酸取代的親水性胺基酸。
保守修飾的變異體抗CoV-S抗體及其抗原結合片段也被考慮作為本公開文本的一部分。“保守修飾的變異體”或“保守取代”是指如下變異體，其中存在具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、骨架構形和剛性等）的其他胺基酸對多肽中胺基酸的一個或多個取代。這樣的變化通常可以在不顯著破壞抗體或片段的生物學活性的情況下進行。熟習此項技術者認識到，通常，多肽的非必需區域中的單一胺基酸取代不會顯著改變生物學活性。另外，結構上或功能上類似的胺基酸的取代不太可能顯著破壞生物學活性。
側鏈具有類似化學特性的胺基酸組的例子包括1) 脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、擷胺酸、白胺酸和異白胺酸；2) 脂肪族羥基側鏈：絲胺酸和蘇胺酸；3) 含醯胺側鏈：天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；4) 芳香族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸；5) 鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸和組胺酸；6) 酸性側鏈：天門冬胺酸和麩胺酸以及7) 含硫側鏈：半胱胺酸和甲硫胺酸。示例性保守胺基酸取代基包括：擷胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-擷胺酸、麩胺酸-天門冬胺酸和天門冬醯胺酸-麩醯胺酸。可替代地，保守替代是在PAM250對數似然矩陣中具有正值的任何變化，如Gonnet等人 (1992) Science 256: 1443 45中所披露。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括具有與選自SEQ ID NO: 523-1162的胺基酸序列的至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）序列同一性的架構區。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含選自SEQ ID NO: 523-602的胺基酸序列的重鏈架構區1（HFWR1）；(b) 包含選自SEQ ID NO: 603-682的胺基酸序列的重鏈架構區2（HFWR2）；(c) 包含選自SEQ ID NO: 683-762的胺基酸序列的重鏈架構區3（HFWR3）；以及 (d) 包含選自SEQ ID NO: 763-842的胺基酸序列的重鏈架構區4（HFWR4）。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含選自SEQ ID NO: 843-922的胺基酸序列的輕鏈架構區1（LFWR1）；(b) 包含選自SEQ ID NO: 923-1002的胺基酸序列的輕鏈架構區2（LFWR2）；(c) 包含選自SEQ ID NO: 1003-1082的胺基酸序列的輕鏈架構區3（LFWR3）；以及 (d) 包含選自SEQ ID NO: 1083-1162的胺基酸序列的輕鏈架構區4（LFWR4）。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括表1中抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段還包括如表2中所示的相同抗體或抗原結合片段的重鏈架構區HFWR1、HFWR2、HFWR3和HFWR4。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段還包括如表2中所示的相同抗體或抗原結合片段的輕鏈架構區LFWR1、LFWR2、LFWR3和LFWR4。 表2：本公開文本的示例性抗體和相應架構區。
抗體    克隆型 胺基酸序列識別字(SEQ ID NO)
HFWR1 HFWR2 HFWR3 HFWR4 LFWR1 LFWR2 LFWR3 LFWR4
TXG-0021 A 523 603 683 763 843 923 1003 1083
TXG-0022 A 524 604 684 764 844 924 1004 1084
TXG-0023 A 525 605 685 765 845 925 1005 1085
TXG-0027 B 526 606 686 766 846 926 1006 1086
TXG-0028 B 527 607 687 767 847 927 1007 1087
TXG-0043 528 608 688 768 848 928 1008 1088
TXG-0049 529 609 689 769 849 929 1009 1089
TXG-0051 530 610 690 770 850 930 1010 1090
TXG-0056 531 611 691 771 851 931 1011 1091
TXG-0061 532 612 692 772 852 932 1012 1092
TXG-0062 533 613 693 773 853 933 1013 1093
TXG-0067 534 614 694 774 854 934 1014 1094
TXG-0068 535 615 695 775 855 935 1015 1095
TXG-0072 536 616 696 776 856 936 1016 1096
TXG-0083 537 617 697 777 857 937 1017 1097
TXG-0085 538 618 698 778 858 938 1018 1098
TXG-0089 539 619 699 779 859 939 1019 1099
TXG-0090 540 620 700 780 860 940 1020 1100
TXG-0092 541 621 701 781 861 941 1021 1101
TXG-0095 542 622 702 782 862 942 1022 1102
TXG-0096 543 623 703 783 863 943 1023 1103
TXG-0098 544 624 704 784 864 944 1024 1104
TXG-0105 545 625 705 785 865 945 1025 1105
TXG-0106 546 626 706 786 866 946 1026 1106
TXG-0108 547 627 707 787 867 947 1027 1107
TXG-0110 548 628 708 788 868 948 1028 1108
TXG-0111 549 629 709 789 869 949 1029 1109
TXG-0112 550 630 710 790 870 950 1030 1110
TXG-0113 551 631 711 791 871 951 1031 1111
TXG-0115 552 632 712 792 872 952 1032 1112
TXG-0118 553 633 713 793 873 953 1033 1113
TXG-0121 554 634 714 794 874 954 1034 1114
TXG-0123 555 635 715 795 875 955 1035 1115
TXG-0124 556 636 716 796 876 956 1036 1116
TXG-0130 557 637 717 797 877 957 1037 1117
TXG-0134 558 638 718 798 878 958 1038 1118
TXG-0135 559 639 719 799 879 959 1039 1119
TXG-0136 560 640 720 800 880 960 1040 1120
TXG-0137 561 641 721 801 881 961 1041 1121
TXG-0138 562 642 722 802 882 962 1042 1122
TXG-0140 563 643 723 803 883 963 1043 1123
TXG-0145 564 644 724 804 884 964 1044 1124
TXG-0147 565 645 725 805 885 965 1045 1125
TXG-0150 566 646 726 806 886 966 1046 1126
TXG-0152 567 647 727 807 887 967 1047 1127
TXG-0153 568 648 728 808 888 968 1048 1128
TXG-0154 569 649 729 809 889 969 1049 1129
TXG-0160 570 650 730 810 890 970 1050 1130
TXG-0165 571 651 731 811 891 971 1051 1131
TXG-0167 572 652 732 812 892 972 1052 1132
TXG-0169 573 653 733 813 893 973 1053 1133
TXG-0171 574 654 734 814 894 974 1054 1134
TXG-0172 575 655 735 815 895 975 1055 1135
TXG-0173 576 656 736 816 896 976 1056 1136
TXG-0174 577 657 737 817 897 977 1057 1137
TXG-0177 578 658 738 818 898 978 1058 1138
TXG-0179 579 659 739 819 899 979 1059 1139
TXG-0182 580 660 740 820 900 980 1060 1140
TXG-0191 581 661 741 821 901 981 1061 1141
TXG-0192 582 662 742 822 902 982 1062 1142
TXG-0194 583 663 743 823 903 983 1063 1143
TXG-0195 584 664 744 824 904 984 1064 1144
TXG-0196 585 665 745 825 905 985 1065 1145
TXG-0205 586 666 746 826 906 986 1066 1146
TXG-0208 587 667 747 827 907 987 1067 1147
TXG-0211 588 668 748 828 908 988 1068 1148
TXG-0212 589 669 749 829 909 989 1069 1149
TXG-0213 590 670 750 830 910 990 1070 1150
TXG-0214 591 671 751 831 911 991 1071 1151
TXG-0215 592 672 752 832 912 992 1072 1152
TXG-0216 593 673 753 833 913 993 1073 1153
TXG-0217 594 674 754 834 914 994 1074 1154
TXG-0218 595 675 755 835 915 995 1075 1155
TXG-0226 596 676 756 836 916 996 1076 1156
TXG-0227 C 597 677 757 837 917 997 1077 1157
TXG-0228 C 598 678 758 838 918 998 1078 1158
TXG-0229 C 599 679 759 839 919 999 1079 1159
TXG-0230 C 600 680 760 840 920 1000 1080 1160
TXG-0231 601 681 761 841 921 1001 1081 1161
TXG-0237 602 682 762 842 922 1002 1082 1162
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括包含具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區（HCVR）。在一些實施例中，所述HCVR包含具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括包含具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區（LCVR）。在一些實施例中，所述LCVR包含具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括：(a) 包含具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）序列同一性的胺基酸序列的HCVR；以及b) 包含具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的至少90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）序列同一性的胺基酸序列的LCVR。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括：分別與表1中抗體的HCVR和LCVR為90%（例如，至少91%、至少92%、至少93%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%）相同的HCVR和LCVR。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括表1中抗體的HCVR和LCVR。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段選自表1。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段還包括恒定區（例如，Fc區）。在一些實施例中，所述恒定區是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM重鏈恒定區。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括類型IgA（例如，IgA1或IgA2）、IgD、IgE、IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）或IgM的恒定區。在一些實施例中，恒定區是IgG恒定區。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段還包括κ型輕鏈恒定區。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段還包括λ型輕鏈恒定區。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包含鉸鏈結構域。在一些實施例中，所述鉸鏈結構域包含穩定性突變。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包含變異體Fc區。變異體Fc區可以包含降低變異體Fc區對FcγR受體的親和力的一個或多個胺基酸修飾。降低變異體Fc區對FcγR受體的親和力的示例性胺基酸修飾包括L234A；L235A；或者L234A和L235A，根據Kabat（EU索引）編號系統。變異體Fc區可以包含增強變異體Fc區的血清半衰期的一個或多個胺基酸修飾。增強變異體Fc區的血清半衰期的示例性胺基酸修飾包括M252Y；M252Y和S254T；M252Y和T256E；M252Y、S254T和T256E；或者K288D和H435K，根據Kabat（EU索引）編號系統。
在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段是人抗體或抗原結合片段。一般技術者將理解，術語“人”抗體包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體，其位於人細胞中或移植至非人細胞（例如，小鼠細胞）中。本公開文本的人抗體可以包括並非由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基（例如，在體外通過隨機或位點特異性誘變或者在體內通過體細胞突變引入的突變），例如在CDR如CDR3中。然而，如本文所用術語“人抗體”並不意圖包括其中源自另一哺乳動物物種（例如，小鼠）的種系的CDR序列已經被移植至人FWR序列上的抗體。所述術語包括在非人哺乳動物或非人哺乳動物的細胞中重組產生的抗體。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是人類化抗體、嵌合抗體、或雜合抗體或其任一種的抗原結合片段。如本文所用術語“人類化抗體”涵蓋如下抗體，其包含來自非人物種（例如，小鼠）的重鏈和輕鏈可變區序列，但其中VH和/或VL序列的至少一部分已經被改變得更“像人”，即，更類似於人種系可變序列。一種類型的人類化抗體是CDR移植抗體，其中人CDR序列被引入至非人VH和VL序列中以替代相應的非人CDR序列。另一種類型的人類化抗體是FWR移植抗體，其中人FWR序列被引入非人VH和VL序列中以替代相應的非人FWR序列。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段包括含有本公開文本（例如，表1和序列表）中描述的架構和/或CDR的鼠抗體、噬菌體展示抗體或奈米抗體/VHH。如本文所用，術語“嵌合抗體”涵蓋具有來自第一抗體的可變結構域和來自第二抗體的恒定結構域的抗體，其中所述第一和第二抗體來自不同物種。如本文所用，術語“雜合抗體”涵蓋具有來自第一抗體的可變結構域和來自第二抗體的恒定結構域的抗體，其中所述第一和第二抗體來自不同動物，或者其中所述可變結構域而非所述恒定區來自第一動物。例如，可變結構域可以取自從人分離的抗體，並且與並非從該抗體分離的固定恒定區一起表現。雜合抗體是合成的且非天然存在的，因為它們所含的可變區和恒定區不是從單一天然來源分離的。在一些實施例中，本公開文本的雜合抗體包括來自第一抗體的輕鏈和來自第二抗體的重鏈，其中所述第一和第二抗體來自不同物種。在一些實施例中，本公開文本的嵌合抗體包括與本申請中公開的重鏈或重鏈CDR集組合的非人輕鏈。
在一些實施例中，所述抗體是單株抗體。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是工程化抗體或工程化抗體片段。工程化抗體片段的非限制性例子包括單鏈可變片段（scFv）、奈米抗體、雙抗體、三抗體、微抗體、F(ab')2片段、F(ab)片段、VH結構域、VL結構域、單鏈可變片段（scFv）、單一結構域抗體（sdAb）、VNAR結構域和VHH結構域。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段是單鏈抗體片段（scFv）、F(ab)片段、F(ab')片段、Fab'-SH、F(ab')2片段或Fv片段。
在一些實施例中，本文提供包含本公開文本的一種或多種抗原結合片段的重組免疫受體。這樣的重組免疫受體可以免疫識別和/或特異性結合至CoV-S蛋白或其表位。在一些實施例中，CoV-S特異性受體是嵌合抗原受體（CAR）。通常，CAR包括如本文所公開的抗原結合結構域，例如，具有與抗原（例如，CoV-S蛋白）或其表位的結合親和力的抗體的單鏈可變片段（scFv），所述抗原結合結構域與T細胞受體（TCR）的跨膜結構域和細胞內結構域融合。在此情形中，CAR的抗原性特異性可以由特異性結合至抗原或其表位的scFv編碼。CAR及其製備方法是本領域中已知的。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與SARS-CoV-2 S蛋白的亞基中的表位的結合親和力（例如，以變化程度的特異性結合的能力）。熟習此項技術者將理解，術語“表位”是指與抗原結合多肽的特異性抗原結合位點（例如，抗體分子的可變區稱為互補位）相互作用的抗原性決定簇（例如，CoV-S多肽）。單一抗原可以具有超過一個表位。因此，不同抗體可以結合至抗原上的不同區域，並且可以具有不同的生物學作用。術語“表位”還是指抗原上B細胞和/或T細胞對其反應的位點。其還是指抗原中由抗體結合的區域。表位可以定義為結構的或功能的。功能表位通常是結構表位的子集，並且具有直接促進相互作用的親和力的那些殘基。表位可以是線性的或構形的，也就是由非線性胺基酸構成。在某些實施例中，表位可以包括決定簇，即分子的化學活性表面基團（如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基），並且在某些實施例中，可具有特定的三維結構特徵，和/或特定的電荷特徵。
用於確定抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段或多肽）的表位的方法包括丙胺酸掃描突變分析、肽印跡分析、肽切割分析、結晶學研究和NMR分析。另外，可以採用例如表位切除、表位提取和抗原的化學修飾的方法。可以用於鑒定多肽內與抗原結合多肽（例如，抗體或片段或多肽）相互作用的胺基酸的另一種方法是通過質譜法檢測的氫/氘交換。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基中的表位的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與S1亞基的RBD的結合親和力。在一些實施例中，SARS-CoV-2的S蛋白的所述亞基是S2亞基。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與S1亞基的NTD的結合親和力。
在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白可以包括一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括以下脯胺酸取代中的一個或多個：F817P、A892P、A899P、A942P、K986P和V987P。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括以下丙胺酸取代中的一個或多個：R683A和R685A。在一些實施例中，所述一個或多個胺基酸取代包括D614G取代。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白具有SEQ ID NO: 1484中提供的胺基酸序列。在一些實施例中，SARS-CoV-2的S蛋白具有SEQ ID NO: 1485中提供的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括在選自K417、L452、E484、N501和D614的位置處的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括在位置K417處的胺基酸取代。在一些實施例中，所述K417胺基酸取代是保守胺基酸取代。在一些實施例中，在位置K417處的胺基酸取代是K417T或K417N。在一些實施例中，所述K417胺基酸取代是非保守胺基酸取代。在一些實施例中，L452胺基酸取代是保守胺基酸取代。在一些實施例中，在位置L452處的胺基酸取代是L452R。在一些實施例中，所述L452胺基酸取代是非保守胺基酸取代。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括在位置E484處的胺基酸取代。在一些實施例中，所述E484胺基酸取代是保守胺基酸取代。在一些實施例中，所述E484胺基酸取代是非保守胺基酸取代。在一些實施例中，在位置E484處的胺基酸取代是E484K或E484Q。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括在位置N501處的胺基酸取代。在一些實施例中，所述N501胺基酸取代是保守胺基酸取代。在一些實施例中，所述N501胺基酸取代是非保守胺基酸取代。在一些實施例中，在位置N501處的胺基酸取代是N501Y。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括在位置D614處的胺基酸取代。在一些實施例中，所述D614胺基酸取代是保守胺基酸取代。在一些實施例中，所述D614胺基酸取代是非保守胺基酸取代。在一些實施例中，在位置D614處的胺基酸取代是D614G。
在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括選自K417T、K417N、L452R、E484K、E484Q、N501Y和D614G的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括以下胺基酸取代的組合：K417N、E484K和N501Y。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括以下胺基酸取代的組合：K417T、E484K和N501Y。在一些實施例中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包括以下胺基酸取代的組合：L452R和E484Q。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對CoV-S蛋白的三聚形式的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對CoV-S蛋白的融合前三聚形式的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的穩定的融合前刺突蛋白（例如，S2P穩定的融合前刺突蛋白）的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的非融合前刺突蛋白的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚（例如，三聚）形式的非S2P穩定的融合前刺突蛋白的結合親和力。刺突蛋白的融合前和非融合前構形描述於例如以下文獻中：Cai Y.等人 Science 第369卷, 第6511期, 第1586-1592頁, 2020；Xu C.等人 Science Advances, 第7卷, 第1期, 2021年1月；Wrobel AG等人 Nat Comms 11, 5337, 2020；以及Zhang J.等人 Science 2021年3月16日；所述參考文獻都是通過引用以其整體特此併入。
在一些實施例中，本文公開的方法包括評估抗體或抗原結合片段與靶抗原的特異性結合親和力（例如，以變化程度的特異性結合的能力）。在一些實施例中，本文公開的方法任選地包括如果抗體或抗原結合片段特異性結合至CoV-S蛋白，則將所述抗體或抗原結合片段鑒定為具有對所述CoV-S蛋白的結合特異性。通常，結合親和力可以用作兩個分子（例如，抗體或其抗原結合片段與抗原（例如，冠狀病毒S蛋白抗原））之間的非共價相互作用的強度的量度。在一些情形中，結合親和力可以用於描述單價相互作用（內在活性）。兩個分子之間的結合親和力可以通過平衡解離常數（K D）的確定來定量。反過來，可以通過使用例如表面等離子體共振（SPR）方法（Biacore）測量複合物形成和解離的動力學來測定K D。對應于單價複合物的締合和解離的速率常數分別被稱為締合速率常數k a（或k on）和解離速率常數k d（或k off）。K D通過等式K D= k d/k a與k a和k d相關聯。解離常數的值可以通過各種方法直接確定，並且甚至可以通過例如Caceci等人（1984, Byte 9: 340-362）中所述的方法計算複雜混合物的解離常數的值。例如，K D可以使用雙濾膜硝酸纖維素濾膜結合測定（如Wong和Lohman（1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428-5432）所披露的測定）來建立。如下文實例9和實例12中所示，本文所述的抗體和片段的結合親和力也可以使用配備有HC30M晶片的Carterra LSA SPR生物感測器來測定。
用於評價本公開文本的抗體和抗原結合片段針對靶抗原的結合能力（例如，結合親和力和/或特異性）的其他測定包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和流式細胞術分析。所述抗體的結合動力學和結合親和力也可以通過本領域已知的標準測定如表面等離子體共振（SPR）例如通過使用Biacore™系統或KinExA來評估。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段對靶抗原（例如，冠狀病毒S蛋白抗原）的結合親和力可以通過由Frankel等人, Mol. Immunol, 16: 101-106, 1979描述的Scatchard方法來計算。將理解，抗體或抗原結合片段對靶抗原的結合親和力是所述抗體或抗原結合片段與所述靶抗原之間的相互作用的強度，而抗體或抗原結合片段對靶抗原的結合特異性涉及相對於其他抗原與所述靶抗原的親和力。還將理解，“特異性結合”靶抗原（如S蛋白）的抗體或抗原結合片段是結合所述靶抗原但不實質性結合其他抗原的抗原結合片段。在一些實施例中，如果抗體或抗原結合片段不實質性結合其他抗原，但以高親和力，例如，以100 nM或更小（如60 nM或更小，例如，30 nM或更小，如15 nM或更小、或10 nM或更小、或5 nM或更小、或1 nM或更小、或500 pM或更小、或400 pM或更小、或300 pM或更小、或200 pM或更小、或100 pM或更小）的平衡解離常數（K D）結合靶抗原，則所述抗體或抗原結合片段“特異性結合”所述靶抗原。在一些實施例中，特異性結合靶抗原（如CoV-S蛋白（例如，SARS-CoV-2 S蛋白））的本公開文本的抗體或抗原結合片段具有表示為至少約10 -8M的K D的與靶抗原的結合親和力，如通過即時無標記生物層干涉測量術測定（例如在25ºC或37ºC，例如，Octet® HTX生物感測器）或通過表面等離子體共振（例如，BIACORE™）或通過溶液親和力ELISA來測量。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於500 nM，例如，小於400 nM、小於300 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於120 nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於20 nM、小於15 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於5 nM或者小於1 nM的結合親和力和/或結合特異性。
在一些實施例中，抗原結合分子（例如，抗體或抗原結合片段）與CoV-S靶抗原的結合親和力和/或結合特異性是基於與抗原結合分子相關的靶抗原序列讀段和任選地非靶抗原序列讀段和/或唯一分子識別字（UMI）的量/數量通過稱為“通過定序進行的條碼啟用的抗原映射”（BEAM-seq）的過程來確定（參見例如，下文實例6和實例7，以及圖2、圖3和圖4）。抗原序列讀段和/或UMI可以經由共用的分區條碼序列在生物資訊學上與抗原結合分子序列相關。例如，抗原結合分子與CoV-S抗原的結合親和力和/或結合特異性可以基於對與來自一個或多個分區的CoV-S抗原和任選地非靶抗原相關的UMI的量/數量的獨立觀察來確定，其中所述一個或多個分區中的每一個包含表現相同抗原結合分子的細胞。對於其他例子，抗原結合分子與CoV-S抗原的結合親和力和/或結合特異性可以基於對與來自一個或多個分區的抗原相關的UMI的量/數量的獨立觀察來確定，其中所述一個或多個分區中的每一個包含表現屬於相同克隆型組的抗原結合分子的細胞。例如，高（例如，超過40）靶抗原UMI計數可以用於預測高結合親和力。如下文實例中所示，如果抗體與高靶抗原計數和低非靶抗原計數相關，則所述抗體可以被預測為具有對靶CoV-S抗原的特異性結合親和力。
在一些實施例中，所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組中抗體的HCDR和LCDR：TXG-0021、TXG-0022、TXG-0023、TXG-0027、TXG-0028、TXG-0043、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0061、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0083、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0090、TXG-0098、TXG-0108、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0130、TXG-0134、TXG-0135、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0150、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0160、TXG-0165、TXG-0169、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0216、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於500 nM，例如，小於400 nM、小於300 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於120 nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於20 nM、小於15 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於5 nM或者小於1 nM的結合親和力和/或結合特異性。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值低於SARS-CoV-2 S蛋白與其受體ACE2之間的結合親和力（其先前被估計為具有約120 nM的K D值）的結合親和力。因此，在本公開文本的一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於120 nM的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有小於120 nM的K D值並且包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自表5中抗體的HCDR和LCDR。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於120 nM的結合親和力並且包括三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組的HCDR和LCDR：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括HCVR，所述HCVR包括具有與表5中抗體的HCVR的至少90%序列同一性的胺基酸序列。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括HCVR，所述HCVR包括具有與選自以下的抗體的HCVR的至少90%序列同一性（例如，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性）的胺基酸序列：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0230。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括HCVR，所述HCVR包括具有與選自以下的抗體的HCVR的至少100%序列同一性的胺基酸序列：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括LCVR，所述LCVR包括具有與選自以下的抗體的LCVR的至少90%序列同一性（例如，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性）的胺基酸序列：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0230。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段包括LCVR，所述LCVR包括具有與選自以下的抗體的LCVR的至少100%序列同一性的胺基酸序列：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S蛋白、其片段或其多聚形式的亞奈莫耳結合親和力。例如，在本公開文本的一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於500 pM（例如，小於100 pM、小於50 pM、小於10 pM或小於5 pM）的結合親和力。在一些實施例中，具有對SARS-CoV-2 S蛋白的亞奈莫耳結合親和力的抗體或抗原結合片段選自TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0072、TXG-0089、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0194和TXG-0217。熟習此項技術者將認識到，在稱抗體“選自組”時，這可以意指所述抗體包含來自選自所述組的任何一種抗體的所有六個CDR。在一些實施例中，所述抗體可以包含來自選自所述組的任何一種抗體的HCVR和LCVR。在一些實施例中，所述抗體可以是所述組中的任何一種抗體。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對HCOV和/或對選自β、γ、δ和κ的SARS-CoV-2 S變異體的亞奈莫耳結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對HCOV的亞奈莫耳結合親和力。具有這種結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0136。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S β變異體的亞奈莫耳結合親和力。具有這種結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0136、TXG-0145、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0194和TXG-0217。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S γ變異體的亞奈莫耳結合親和力。具有這種結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0136、TXG-0137、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0194和TXG-0217。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S κ變異體的亞奈莫耳結合親和力。具有這種結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0136、TXG-0137、TXG-0145、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0194和TXG-0217。在一些實施例中，這樣的抗體還具有對SARS-CoV-2δ變異體的結合親和力。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式的結合親和力。具有這種結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0115、TXG-0140、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0173和TXG-0174。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與β變異體的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0115、TXG-0153、TXG-0154和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與γ變異體的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0115、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0173和TXG-0174。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與κ變異體的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0115、TXG-0154、TXG-0173和TXG-0174。在一些實施例中，這樣的抗體強效中和活SARS-CoV 2並且具有與δ變異體的結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與S1亞基的N末端結構域的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0173和TXG-0174。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與野生型SARS-CoV-2 S和β、γ、κ變異體的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0115和TXG-0154。在一些實施例中，這樣的抗體還具有對SARS-CoV-2δ變異體的結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0140。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2並且具有與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式以及β和γ變異體的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0153。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2，並且具有與S1亞基的N末端結構域（NTD）和與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式以及與γ和κ變異體的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0173。在一些實施例中，這樣的抗體還具有對SARS-CoV-2δ變異體的結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV 2，並且具有與S1亞基的N末端結構域（NTD）和與野生型SARS-CoV-2 S的三聚形式以及與β、γ和κ變異體的三聚形式的結合親和力。具有這些結合親和力特性的示例性抗體包括TXG-0174。在一些實施例中，這樣的抗體還具有對SARS-CoV-2δ變異體的結合親和力。
在一些實施例中，抗原結合分子（例如，抗體或抗原結合片段）與靶抗原（如S蛋白）的結合親和力和/或結合特異性可以基於與結合至所述抗原的抗原結合分子締合的唯一分子識別字（UMI）的量/數量來確定（參見例如，下文的實例6和表3）。
在一些實施例中，抗原結合分子（例如，抗體或抗原結合片段）與靶抗原（如S蛋白）的結合親和力和/或結合特異性可以基於與抗原結合分子締合的靶抗原和任選地非靶抗原的計數和/或量來確定。這樣的抗原的計數和/或量可以通過偶聯至所述抗原的各自的報告寡核苷酸來促進，其中偶聯至抗原的報告寡核苷酸包含鑒定與其偶聯的抗原的報告條碼序列。
在一些實施例中，抗原結合分子（例如，抗體或抗原結合片段）與靶抗原（如S蛋白）的結合親和力和/或結合特異性可以基於與結合至表現所述抗原結合分子的一種或多種細胞的抗原締合的唯一分子識別字（UMI）的量/數量通過稱為“通過定序進行的條碼啟用的抗原映射”（BEAM-seq）的過程來確定（參見例如，下文的實例7以及圖2、圖3和圖4）。例如，抗原結合分子與靶抗原的結合親和力和/或結合特異性可以基於對兩個或更多個分區中與抗原締合的UMI的量/數量的獨立觀察來確定，其中所述兩個或更多個分區中的每一個包含表現相同抗原結合分子的細胞。
在一些實施例中，本公開文本的抗體和抗原結合片段結合至靶抗原如CoV-S蛋白（例如，SARS-CoV-2 S蛋白），並且與另一抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段）競爭結合至靶抗原。因此，本文還提供與本文（例如，在表1中）公開的抗體競爭結合的抗體或其抗原結合片段。
如本文所用術語“競爭”是指結合至靶抗原並且抑制或阻斷另一抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段）與所述靶抗原的結合的抗體或抗原結合片段。所述術語還包括兩種抗原結合多肽（例如，抗體）在兩個方向上的競爭，即，第一抗體結合並阻斷第二抗體的結合，並且反之亦然。在一些實施例中，第一抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）和第二抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段）可以結合至相同表位。可替代地，第一和第二抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）可以結合至不同但例如重疊的表位，其中一種抗原結合多肽的結合抑制或阻斷第二抗體的結合，例如，經由位阻來抑制或阻斷。抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）之間的競爭可以通過本領域中已知的方法，例如通過即時無標記生物層干涉測量術測定來測量。表位映射（例如，通過丙胺酸掃描或氫-氘交換（HDX））可以用於確定兩種或更多種抗體是非競爭的（例如在刺突蛋白RBD單體上），競爭相同表位，還是競爭不同的微表位（例如，通過HDX鑒定）。在一些實施例中，第一和第二抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段）之間的競爭是通過測量固定的第一抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體）（最初未與CoV-S蛋白複合）結合至與第二抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段）複合的可溶CoV-S蛋白的能力來確定。第一抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段）結合至複合的CoV-S蛋白的能力相對于未複合CoV-S蛋白的下降表明，第一和第二抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段）競爭。競爭程度可以表示為結合降低的百分比。這樣的競爭可以使用即時無標記生物層干涉測量術測定（例如，在Octet RED384生物感測器（Pall ForteBio Corp.）上）、ELISA（酶聯免疫吸附測定）或SPR（表面等離子體共振）來測量。
在一些實施例中，本公開文本的抗體和抗原結合片段具有針對SARS-CoV-2的中和活性（例如，拮抗活性），例如，能夠結合至SARS-CoV-S並中和SARS-CoV-S的活性，如通過體外或體內測定所確定。本公開文本的抗體結合至SARS-CoV-2、阻斷和/或中和SARS-CoV-2的活性的能力可以使用熟習此項技術者已知的任何標準方法來測量，包括結合測定或活性測定，如本文所述。例如，抗SARS-CoV-2抗原結合多肽對SARS-CoV-2的結合親和力和解離常數可以通過表面等離子體共振（SPR）測定來確定。可替代地，使用中和測定來確定含有SARS-CoV-2 S蛋白的病毒樣顆粒的感染力。一般技術者將理解，中和或拮抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）通常是指以任何可檢測程度抑制CoV-S的活性的分子，例如，其抑制或降低CoV-S結合至受體如ACE2、被蛋白酶如TMPRSS2切割或者介導病毒進入宿主細胞中或介導病毒在宿主細胞中繁殖的能力。在一些實施例中，對於病毒中和，本公開文本的抗體和抗原結合片段具有小於150 ng/ml的中和活性IC 50值，如通過先前由Zost等人（Nature, 584:443-449, 2020）描述的定量病灶減少中和測試（FRNT）所確定。在一些實施例中，對於阻斷ACE2，本公開文本的抗體和抗原結合片段具有小於150 ng/ml的阻斷活性IC 50值。在一些實施例中，對於S2P胞外結構域結合，本公開文本的抗體和抗原結合片段具有小於10 ng/ml的阻斷活性IC 50值。在一些實施例中，對於RBD胞外結構域結合，本公開文本的抗體和抗原結合片段具有小於10 ng/ml的阻斷活性IC 50值。在一些實施例中，在12.5 μg/ml或更低的抗體濃度，所述抗體或抗原結合片段中和至少50%的200倍組織培養感染劑量（200×TCID50）的冠狀病毒。此處，TCID50表示在將含有病毒的溶液添加至細胞培養物時，50%的細胞被感染的病毒載量。在一些實施例中，中和抗體在＜ 3.125 μg/ml、＜ .8 μg/ml、＜ .2 μg/ml或＜ .l μg/ml的抗體濃度有效。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為1 µg/mL或更低、200 ng/mL或更低或者40 ng/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值的範圍為200 ng/mL至1,000 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值的範圍為40 ng/mL至200 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值的範圍為8 ng/mL至40 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為1 µg/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體或其抗原結合片段包括TXG-0153、TXG-0173、TXG-0115、TXG-0140、TXG-0154和TXG-0174。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為200 ng/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0115、TXG-0140和TXG-0154。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為200 ng/mL至1000 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0153、TXG-0173和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50至為100 ng/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0140和TXG-0154。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為40 ng/mL至200 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0115和TXG-0140。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有IC 50值為40 ng/mL或更低的針對SARS-CoV-2的中和活性。具有該中和活性特性的示例性抗體包括TXG-0154。
在一些實施例中，抗體或抗原結合片段具有與SARS-CoV-2 S蛋白的N末端結構域（NTD）的結合親和力並強效中和活SARS-CoV-2。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0072、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0173和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0173和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與來自SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的N末端結構域（NTD）的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0072、TXG-0137和TXG-0174。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是TXG-0174。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有主要與SARS-CoV-2 S蛋白的RBD的結合親和力並強效中和活SARS-CoV-2。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0115、TXG-0140、TXG-0153和TXG-0154。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是TXG-0153。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0115、TXG-0140和TXG-0154。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合具有主要與來自SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的RBD的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0140和TXG-0154。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0085、TXG-0112、TXG-0192、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0115、TXG-0136、TXG-0192和TXG-0230。在一些實施例中，這樣的抗體和抗原結合片段具有針對活SARS-CoV-2的中和活性。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是TXG-0115。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對來自SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0085、TXG-0112、TXG-0173、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0229。在一些實施例中，這樣的抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV-2。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段是TXG-0173。
在一些實施例中，如本文所述的分離的抗體或抗原結合片段是重組抗體和抗原結合片段。在一些實施例中，如本文所述的抗體或抗原結合片段是分離的（例如，純化的）抗體和抗原結合片段。如上所述，在關於多肽（例如，抗原結合多肽、抗體和抗原結合片段）時，熟習此項技術者將理解，術語“分離的蛋白質”、“分離的多肽”或“分離的抗體”是如下蛋白質、多肽或抗體，它們依據其衍生的起源或來源：(1) 與在其自然狀態下伴隨其的自然相連的組分不相連，(2) 基本上不含來自相同物種的其他蛋白質，(3) 由來自不同物種的重組細胞表現，或者 (4) 在自然界中不存在。因此，化學合成或在與其天然來源細胞不同的重組細胞系統中生物合成的多肽可以是與其自然相連組分“分離的”。也可以使用一種或多種蛋白質純化技術通過分離或純化使蛋白質基本上不含自然相連組分。
分離的抗體的例子包括已經使用SARS-CoV S蛋白或其部分純化的抗SARS-CoV S蛋白抗體、已經在體外通過雜交瘤或其他重組細胞株合成的抗SARS-CoV S蛋白抗體以及源自轉基因小鼠的人抗SARS-CoV S蛋白抗體。適用于本文公開的抗體和抗原結合片段的純化的純化技術的例子包括親和層析、陰離子交換層析（AEX）、陽離子交換層析（CEX）、羥磷灰石層析、尺寸排阻層析（SEC）、疏水相互作用層析（HIC）、金屬親和層析、混合模式層析（MMC）、離心、滲濾和超濾。
通常，在至少約60至75%的樣品展現單一種類的多肽時，多肽（例如，抗體或抗原結合片段）是“基本上純的”、“基本上同質的”或“基本上純化的”。多肽可以是單體的或多聚的。基本上純的多肽通常包括約50%、60%、70%、80%或90% W/W的蛋白質樣品，更通常地是約95%、96%、97%、98%純的，或者在一些實施例中，是超過99%純的。蛋白質純度或同質性可以由多種本領域中可用的手段來指示，如蛋白質樣品的聚丙烯醯胺凝膠電泳，之後在將凝膠用本領域中可獲得的合適的染色劑染色後將單一多肽條帶視覺化。出於某些目的，通過使用HPLC或本領域中可用於純化的其他手段可以提供更高解析度。因此，在一些實施例中，本公開文本的分離的抗體和抗原結合片段具有大於80%的純度，如例如，大於85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的純度。
在一些實施例中，本文所述的抗SARS-CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）不是以下專利公開CN111620946A、CN111690059A、US10787501和WO 2015179535中描述的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，本文所述的抗SARS-CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）不是以下檔中所述的抗體或抗原結合片段：Jakob Kreye等人, 2020；Seth Zost等人, (Nature Medicine, 2020年7月10日)；Xiaojian Han等人, (BioRxiv, 2020年8月21日)；Tal Noy-Porat等人, (Nature Comm., 2020年8月27日)；Edurne Rujas等人 (BioRxiv, 2020年10月16日), 2020；Renhong Yan等人, (BioRxiv, 2020)；Christoph Kreer等人, (Cell, 2020年8月20日; 第182卷, 第4期, 第843-854頁)；Yunlong Cao等人, (Cell, 7月9日, 第182卷, 第1期, 2020)；以及Thomas Rogers等人, (Science 2020年8月21日: 第369卷, 第6506期, 第956-963頁)。 核酸
在上文討論中，本文所述的抗體及其抗原結合片段可以通過核酸分子的表現來獲得。因此，本公開文本的一態樣涉及編碼本文所述的抗體或其抗原結合片段的重組核酸。這樣的核酸可以編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和/或包含抗體的VH的胺基酸序列（例如，抗體的輕鏈和/或重鏈）。在一些實施例中，本公開文本的重組核酸包括編碼本公開文本的抗體或其抗原結合片段的核酸序列。在一些實施例中，本公開文本的重組核酸可以被配置為含有與異源核酸序列可操作地連接的這些核酸分子的表現盒或載體，所述異源核酸序列如例如允許受體在宿主細胞中的體內表現的調節序列。
本公開文本的核酸分子可以具有任何長度，包括例如，在約1 Kb與約50 Kb之間，例如，在約1.2 Kb與約10 Kb之間、在約2 Kb與約15 Kb之間、在約5 Kb與約20 Kb之間、在約10 Kb與約20 Kb之間、在約5 Kb與約40 Kb之間、在約5 Kb與約30 Kb之間、在約5 Kb與約20 Kb之間或在約10 Kb與約50 Kb之間，例如在約15 Kb至30 Kb之間、在約20 Kb與約50 Kb之間、在約20 Kb與約40 Kb之間、約5 Kb與約25 Kb之間或約30 Kb與約50 Kb之間。
因此，在一些實施例中，本文提供包括編碼本公開文本的抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列的核酸分子。
在一些實施例中，所述核苷酸序列被摻入表現盒或表現載體中。熟習此項技術者將理解，表現盒通常包括遺傳物質的構建體，其含有抗體或其抗原結合片段的編碼序列和足夠的調節資訊以引導編碼序列在體內和/或離體在受體細胞中的適當轉錄和/或轉譯。通常，表現盒可以被插入載體中用於靶向至所需宿主細胞和/或插入個體中。因此，在一些實施例中，本公開文本的表現盒包括本公開文本的抗體或其抗原結合片段的編碼序列，其與表現控制元件如啟動子以及任選地影響所述編碼序列的轉錄或轉譯的其他核酸序列中的任一種或組合可操作地連接。
表現盒可以作為線性或環狀的單鏈或雙鏈的DNA或RNA多核苷酸分子被插入質體、粘粒、病毒、自主複製多核苷酸分子、噬菌體中，所述表現盒源自任何來源，能夠進行基因組整合或自主複製，包括其中一個或多個核酸序列已經以功能上可操作的方式連接，例如，可操作地連接的核酸分子。
在一些實施例中，本公開文本的核酸分子被摻入表現載體中。熟習此項技術者將理解，術語“載體”通常是指設計用於在宿主細胞之間轉移的重組多核苷酸構建體，並且其可以用於將異源DNA轉化（例如，引入）至宿主細胞中的目的。因此，在一些實施例中，載體可以是複製子，如質體、噬菌體或粘粒，可以將另一DNA區段插入其中以導致所插入區段的複製。在一些實施例中，表現載體可以是整合載體。
在一些實施例中，表現載體可以是病毒載體。如熟習此項技術者將瞭解，術語“病毒載體”廣泛用於指代包括典型地促進核酸分子的轉移或整合至細胞的基因組中的病毒來源的核酸元件的核酸分子（例如，轉移質體），或者指代介導核酸轉移的病毒顆粒。病毒顆粒將典型地包括各種病毒組分，並且有時還包括除了一種或多種核酸以外的宿主細胞組分。術語病毒載體可以是指能夠將核酸轉移至細胞中的病毒或病毒顆粒或者是指所轉移的核酸本身。病毒載體和轉移質體含有主要源自病毒的結構性和/或功能性遺傳元件。術語“反轉錄病毒載體”是指含有主要源自反轉錄病毒的結構性和功能性遺傳元件或其部分的病毒載體或質體。術語“慢病毒載體”是指含有包括主要源自慢病毒（為反轉錄病毒的屬）的結構性和功能性遺傳元件或其部分（包括LTR）的病毒載體或質體。
編碼如本文所述的抗體和抗原結合片段的核酸序列可以被優化用於在目的宿主細胞中表現。例如，可以將序列的G-C含量調節至給定細胞宿主的平均水準，如參考宿主細胞中表現的已知基因所計算的。密碼子使用優化的方法是本領域已知的。本文公開的抗體和抗原結合片段的編碼序列內的密碼子選用可以被優化以增強在宿主細胞中的表現，使得編碼序列內約1%、約5%、約10%、約25%、約50%、約75%或高達100%的密碼子已經被優化用於在特定宿主細胞中表現。在一些實施例中，編碼如本文所公開的抗體和抗原結合片段的核酸序列可以被優化用於在人細胞中表現。被優化用於在人細胞中表現的核酸序列的非限制性例子列於SEQ ID NO: 1647-1723和2047-2126中。在一些實施例中，編碼如本文所公開的抗體和抗原結合片段的核酸序列可以被優化用於在倉鼠細胞中表現。被優化用於在倉鼠細胞中表現的核酸序列的非限制性例子列於SEQ ID NO: 1727-1806和2127-2206中。在一些實施例中，編碼如本文所公開的抗體和抗原結合片段的核酸序列可以被優化用於在原核細胞中表現。在一些實施例中，編碼如本文所公開的抗體和抗原結合片段的核酸序列可以被優化用於在大腸桿菌（E. coli）細胞中表現。被優化用於在大腸桿菌細胞中表現的核酸序列的非限制性例子列於SEQ ID NO: 1807-1886和2207-2286中。
本文還提供含有編碼如本文所公開的任何抗體或其抗原結合片段的一種或多種核酸分子的載體、質體或病毒。所述核酸分子可以含于載體內，所述載體能夠引導它們在例如已經被所述載體轉化/轉導的細胞中的表現。用於真核和原核細胞中的合適的載體是本領域中已知的並且可商業購得，或者由熟習此項技術者容易地製備。參見例如，Sambrook, J. & Russell, D. W. (2012).Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版).Cold Spring Harbor, 紐約: Cold Spring Harbor Laboratory and Sambrook, J., & Russel, D. W. (2001).Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版).Cold Spring Harbor, 紐約: Cold Spring Harbor Laboratory (本文中合稱為“Sambrook”)；Ausubel, F. M. (1987).Current Protocols in Molecular Biology.紐約, 紐約州: Wiley (包括至2014年的增刊)；Bollag, D. M.等人(1996).Protein Methods.紐約, 紐約州: Wiley-Liss；Huang, L.等人(2005).Nonviral Vectors for Gene Therapy.聖地牙哥: Academic Press；Kaplitt, M. G.等人(1995).Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications.聖地牙哥, 加利福尼亞州: Academic Press; Lefkovits, I. (1997).The Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques.聖地牙哥, 加利福尼亞州: Academic Press; Doyle, A.等人(1998).Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology.紐約, 紐約州: Wiley；Mullis, K. B., Ferré, F. & Gibbs, R. (1994).PCR: The Polymerase Chain Reaction.波士頓: Birkhauser Publisher；Greenfield, E. A. (2014).Antibodies: A Laboratory Manual (第2版).紐約, 紐約州: Cold Spring Harbor Laboratory Press；Beaucage, S. L.等人(2000).Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.紐約, 紐約州: Wiley, (包括至2014年的增刊)；以及Makrides, S. C. (2003).Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells.阿姆斯特丹, 荷蘭: Elsevier Sciences B.V.，所述參考文獻的公開內容通過引用併入本文。
DNA載體可以通過常規轉化或轉染技術被引入細胞例如真核細胞中。用於轉化或轉染宿主細胞的合適方法可以發現於Sambrook等人（2012，同上）和其他標準分子生物學實驗室手冊中，如磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉染、顯微注射、陽離子脂質介導的轉染、電穿孔、轉導、劃痕負載（scrape loading）、彈道引入、核穿孔、流體力學衝擊和感染。
可以在本公開文本中使用的病毒載體包括例如反轉錄病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體、慢病毒載體、皰疹病毒、猿猴病毒40（SV40）和牛乳頭瘤病毒載體（參見例如，Gluzman (編輯), Eukaryotic Viral Vectors, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 紐約）。
例如，如本文所公開的抗體或其抗原結合片段可以在真核宿主如哺乳動物細胞（例如，COS細胞、NIH 3T3細胞或HeLa細胞）中產生。這些細胞可從多個來源獲得，包括美國典型培養物保藏中心（馬納薩斯，維吉尼亞州）。在選擇表現系統時，唯一重要的是組分彼此相容。熟習此項技術者或一般技術者能夠做出這樣的決定。此外，如果在選擇表現系統時需要指導，熟習此項技術者可以諮詢P. Jones, “Vectors: Cloning Applications”, John Wiley and Sons, 紐約, 紐約州, 2009。
所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或者與天然存在的序列不同但是由於遺傳密碼的簡並性而編碼相同多肽例如抗體的序列。例如，正如多肽變異體可以根據其與參考胺基酸序列的同一性來描述，編碼多肽變異體的核酸分子可以具有與編碼參考胺基酸序列的核酸分子的某種同一性。例如，編碼本公開文本的抗體、其變異體或其抗原片段的核酸分子變異體可以與編碼參考抗體或其抗原片段的核酸至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%，優選地至少75%、至少80%，更優選地至少85%、至少90%，且最優選地至少95%（例如，96%、97%、98%或99%）相同。因此，在一些實施例中，編碼本公開文本的抗體、其變異體或其抗原片段的核酸分子可以與編碼具有序列表中所示胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段的核酸至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%，優選地至少75%、至少80%，更優選地至少85%、至少90%，且最優選地至少95%（例如，96%、97%、98%或99%）相同。
在一些實施例中，所述核酸分子包括編碼具有與本公開文本的抗體或其抗原結合片段的HCVR的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%，優選地至少75%、至少80%，更優選地至少85%、至少90%，且最優選地至少95%（例如，96%、97%、98%或99%）序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列。這樣的核酸序列的非限制性例子列於序列表的SEQ ID NO: 1487-1886中。在一些實施例中，所述核酸分子包括編碼具有與本公開文本的抗體或其抗原結合片段的LCVR的至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%，優選地至少75%、至少80%，更優選地至少85%、至少90%，且最優選地至少95%（例如，96%、97%、98%或99%）序列同一性的胺基酸序列的核苷酸序列。這樣的核酸序列的非限制性例子列於序列表的SEQ ID NO: 1887-2286中。在一些實施例中，所述核酸包括具有與選自SEQ ID NO: 1487-1886的核酸序列的至少70%序列同一性的第一核酸序列；以及具有與選自SEQ ID NO: 1887-2286的核酸序列的至少70%序列同一性的第二核酸序列。
這些核酸分子可以由RNA或DNA（例如，基因組DNA、cDNA，或合成DNA（例如通過基於亞磷醯胺的合成產生的DNA））或這些類型的核酸內的核苷酸的組合或修飾組成。另外，所述核酸分子可以是雙鏈的或單鏈的（例如，有義鏈或反義鏈）。
所述核酸分子並不限於編碼多肽（例如，抗體）的序列；也可以包括位於編碼序列（例如，抗體的編碼序列）上游或下游的一些或全部非編碼序列。分子生物學領域的一般技術者熟悉分離核酸分子的常規程序。在核酸分子是核糖核酸（RNA）的情況下，分子可以例如通過體外轉錄產生。
本公開文本的核酸分子，包括變異體和天然存在的核酸序列，可以使用多種方法來產生，包括例如Sambrook 2012（同上）中描述的那些方法。例如，核酸分子的序列可以使用多種技術相對於衍生出所述核酸分子的天然存在的序列進行修飾，所述技術包括但不限於經典誘變技術和重組DNA技術，例如但不限於定點誘變、對核酸分子進行化學處理以誘導突變、核酸片段的限制性酶切割、核酸片段的連接、核酸序列中所選區域的PCR擴增和/或誘變、重組克隆，以及化學合成，包括寡核苷酸混合物的化學合成和混合組的連接以“構建”核酸分子的混合物，以及其組合。 重組細胞和細胞培養
本公開文本的核酸可以被引入宿主細胞（如例如中國倉鼠卵巢（CHO）細胞）中，以產生含有所述核酸分子的重組細胞。將本公開文本的核酸分子（例如，DNA或RNA，包括mRNA）或載體引入細胞中可以通過熟習此項技術者已知的方法來實現，如例如病毒感染、轉染、綴合、原生質體融合、脂轉染、電穿孔、核轉染、磷酸鈣沈澱、聚乙烯亞胺（PEI）介導的轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質體介導的轉染、粒子槍技術、磷酸鈣沈澱、直接顯微注射、奈米顆粒介導的核酸遞送。例如，用於將異源核酸分子引入哺乳動物細胞中的方法是本領域中已知的並且包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、一種或多種核酸分子在脂質體中的封裝、脂質奈米顆粒技術、生物彈道注射和將DNA直接顯微注射至細胞核中。另外，核酸分子可以通過病毒載體如慢病毒或腺相關病毒被引入哺乳動物細胞中。如下文更詳細地討論，在一些實施例中，本公開文本的抗體或其抗原結合片段可以以核酸形式（例如DNA或RNA，包括mRNA）被引入受試者中，使得所述受試者的自身細胞產生所述抗體。本公開文本還提供對編碼本文所述的抗CoV-S抗體的核苷酸序列的修飾，所述修飾導致增加的抗體表現、增加的抗體穩定性、增加的核酸（例如，mRNA）穩定性或者改進的所述抗體對CoV刺突蛋白的親和力或特異性。
因此，在一些實施例中，核酸分子可以通過本領域中已知的病毒或非病毒遞送載具來遞送。例如，所述核酸分子可以被穩定整合于宿主基因組中，或者可以以附加體複製，或者作為用於暫態表現的微環表現載體存在於重組宿主細胞中。因此，在一些實施例中，所述核酸分子在重組宿主細胞中作為附加單元被維持並複製。在一些實施例中，所述核酸分子穩定整合到重組細胞的基因組中。穩定整合可以使用經典隨機基因組重組技術或者用更精確的技術來實現，如指導RNA引導的CRISPR/Cas基因組編輯，或者使用NgAgo（格氏嗜鹽鹼桿菌（Natronobacterium gregoryi）Argonaute）的DNA指導的核酸內切酶基因組編輯，或者TALEN基因組編輯（轉錄啟動因子樣效應核酸酶）。在一些實施例中，所述核酸分子作為用於暫態表現的微環表現載體存在於重組宿主細胞中。
核酸分子可以被包封在病毒衣殼或脂質奈米顆粒中，或者可以通過本領域已知的病毒或非病毒遞送手段和方法如電穿孔來遞送。例如，將核酸引入細胞中可以通過病毒轉導來實現。在非限制性例子中，腺相關病毒（AAV）被工程化以經由病毒轉導將核酸遞送至靶細胞。已經描述了幾種AAV血清型，並且所有已知的血清型可以感染來自多種不同組織類型的細胞。AAV能夠在體內轉導廣泛的物種和組織，沒有毒性證據，並且它產生相對溫和的先天性和適應性免疫反應。
源自慢病毒的載體系統也可用於通過病毒轉導進行核酸遞送和基因療法。慢病毒載體作為基因遞送載具提供了若干種有吸引力的特性，包括：(i) 通過將載體穩定整合到宿主基因組中進行持續的基因遞送；(ii) 能夠感染分裂細胞和非分裂細胞二者；(iii) 具有廣泛的組織趨性，包括重要的基因和細胞療法靶細胞類型；(iv) 載體轉導後不表現病毒蛋白；(v) 能夠遞送複雜遺傳元件，如多順反子序列或含有內含子的序列；(vi) 具有可能更安全的整合位點特徵；以及 (vii) 為相對容易的用於載體操縱和生產的系統。
在一些實施例中，宿主細胞可以被例如本申請的載體構建體基因工程化（例如，轉導或轉化或轉染），所述載體構建體可以是例如包括與宿主細胞的基因組的一部分同源的核酸序列的病毒載體或用於同源重組的載體，或者可以是用於目的多肽的表現的表現載體。宿主細胞可以是未轉化的細胞或已經用至少一種核酸分子轉染的細胞。
在一些實施例中，所述重組細胞是真核細胞。在一些實施例中，所述細胞在體內。在一些實施例中，所述細胞是離體的。在一些實施例中，所述細胞在體外。用於抗體和抗原結合片段的克隆或表現的合適的宿主細胞包括本文所述的原核或真核細胞。在一些實施例中，重組細胞是原核細胞。在一些實施例中，原核細胞是大腸桿菌細胞。例如，抗體和抗原結合片段可以在細菌中產生，特別是在不需要糖基化和Fc效應功能時。表現後，能以可溶性級分從細菌細胞糊中分離所述抗體，並且可以將其進一步純化。
在一些實施例中，所述重組細胞是真核細胞。用於糖基化抗體的表現的合適的宿主細胞可以源自多細胞生物體（無脊椎動物和脊椎動物）。無脊椎動物細胞的例子包括植物細胞和昆蟲細胞。已經鑒定了可以與昆蟲細胞結合使用的許多杆狀病毒株，特別是用於草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）細胞的轉染。植物細胞培養物也可以用作宿主。這樣的植物培養技術的例子包括用於在轉基因植物中產生抗體的PLANTIBODIES™技術。
脊椎動物細胞也可以用作宿主。就此而言，適於懸浮生長的哺乳動物細胞株可以是有用的。在一些實施例中，所述重組細胞是動物細胞。在一些實施例中，所述動物細胞是脊椎動物的動物細胞或無脊椎動物的動物細胞。在一些實施例中，所述動物細胞是哺乳動物細胞。在一些實施例中，所述動物細胞是人細胞。在一些實施例中，所述動物細胞是非人動物細胞。在一些實施例中，所述細胞是非人靈長類動物細胞。
有用的哺乳動物宿主細胞株的另外的例子是由SV40轉化的猴腎CV1系（COS-7）、人胚腎系（例如，293或293細胞）、幼倉鼠腎細胞（BHK）、小鼠支援細胞（例如，TM4細胞）、猴腎細胞（CV1）、非洲綠猴腎細胞（VERO-76）、人宮頸癌細胞（HELA）、犬腎細胞（MDCK）；水牛鼠肝細胞（BRL 3A）、人肺細胞（W138）、人肝細胞（Hep G2）、小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562）、TRI細胞、MRC 5細胞；以及FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，包括DHFR- CHO細胞，以及骨髓瘤細胞株如Y0、NS0和Sp2/0。在一些實施例中，所述重組細胞選自幼倉鼠腎（BHK）細胞、中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）、非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）、人A549細胞、人宮頸細胞、人CHME5細胞、人PER.C6細胞、NS0鼠骨髓瘤細胞、人表皮樣喉細胞、人成纖維細胞、人HEK-293細胞、人HeLa細胞、人HepG2細胞、人HUH-7細胞、人MRC-5細胞、人肌細胞、小鼠3T3細胞、小鼠結締組織細胞、小鼠肌細胞和兔腎細胞。在一些實施例中，所述重組細胞是畢赤酵母（Pichia pastoris）細胞或釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細胞，二者都還適合用於產生scFv、scFvFc、Fab和F(ab')2。
在另一態樣，本文提供包括至少一種如本文所公開的重組細胞和培養基的細胞培養物。通常，所述培養基可以是適用于培養本文所述細胞的任何培養基。用於轉化多種多樣的上述宿主細胞和物種的技術是本領域已知的並且描述於技術和科學文獻中。因此，包括至少一種如本文公開的重組細胞的細胞培養物也在本申請的範圍內。適用于產生和維持細胞培養物的方法和系統是本領域已知的。
如本文所公開的重組細胞當在適當條件下培養時表現抗體或結合片段，隨後可以從所述培養基（如果宿主細胞將所述抗體或結合片段分泌至培養基中）或直接從產生所述抗體或結合片段的宿主細胞（如果所述抗體或結合片段未被分泌）收集所述抗體或結合片段。
可以使用標準蛋白質純化方法從培養基中回收抗體。適用于本文公開的抗體和抗原結合片段的純化的純化技術的例子包括親和層析、陰離子交換層析（AEX）、陽離子交換層析（CEX）、羥磷灰石層析、尺寸排阻層析（SEC）、疏水相互作用層析（HIC）、金屬親和層析、混合模式層析（MMC）、離心、滲濾和超濾。
此外，本發明的抗體從產生細胞株的表現可以使用多種已知技術來增強。例如，麩醯胺酸合成酶基因表現系統（GS系統）是用於增強在某些條件下的表現的常用方法。由不同細胞株或在轉基因動物中表現的抗體可能會具有彼此不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸分子編碼或者包含本文提供的胺基酸序列的所有抗體是本公開文本的一部分，不考慮所述抗體的糖基化。
在另一態樣，還提供包括如本文所公開的重組核酸或載體的動物。在一些實施例中，本公開文本提供作為非人動物的轉基因動物。在一些實施例中，所述轉基因動物產生如本文所公開的抗體或抗原結合片段。
本公開文本的轉基因非人宿主動物是使用本領域中已知的用於將外源核酸引入非人動物的基因組中的標準方法來製備。在一些實施例中，本公開文本的非人動物是小鼠。適合於本公開文本的組合物和方法的其他動物物種包括如下動物：(i) 適合於轉基因作用，並且 (ii) 能夠將免疫球蛋白基因區段重排以產生抗體反應。這樣的物種的例子包括但不限於大鼠、兔、雞、山羊、豬、綿羊和牛。用於製備轉基因非人動物的方式和方法是本領域中已知的。示例性方法包括原核顯微注射、DNA顯微注射、慢病毒載體介導的DNA轉移至早期胚胎中和精子介導的轉基因作用、腺病毒介導的將DNA引入動物精子中（例如，在豬中）、反轉錄病毒載體（例如，鳥類物種）、體細胞核轉移（例如，在山羊中）。轉基因家畜農場動物的製備中的最新技術水準綜述於Niemann, H.等人 (2005) Rev. Sci. Tech. 24:285-298中。
在一些實施例中，所述動物是脊椎動物或無脊椎動物。在一些實施例中，所述動物是哺乳動物受試者。在一些實施例中，所述哺乳動物動物是非人動物。在一些實施例中，本公開文本的轉基因動物可以使用經典隨機基因組重組技術或用更精確的技術來製備，如指導RNA引導的CRISPR/Cas基因組編輯，或者使用NgAgo（格氏嗜鹽鹼桿菌Argonaute）的DNA指導的核酸內切酶基因組編輯，或者TALEN基因組編輯（轉錄啟動因子樣效應核酸酶）。在一些實施例中，本公開文本的轉基因動物可以使用轉基因顯微注射技術來製備，並且不需要使用同源重組技術，且因此被認為比使用同源重組的方法更易於製備和選擇。
在另一態樣，本文提供用於產生抗體或其抗原結合片段的方法，其中所述方法包括在使得產生所述抗體或抗原結合片段的條件下飼養 (i) 如本文所公開的轉基因動物，或者培養 (ii) 如本文所公開的重組細胞。在一些實施例中，所述方法包括在使得在所述轉基因動物中產生所述抗體或抗原結合片段的條件下飼養如本文所公開的轉基因動物。在一些實施例中，所述方法包括在使得在所述重組細胞中產生所述抗體或抗原結合片段的條件下培養如本文所公開的重組細胞。
在一些實施例中，如本文所述的用於產生抗體或其抗原結合片段的方法還包括從 (i) 轉基因動物或 (ii) 重組細胞和/或培養所述重組細胞的培養基分離（例如，純化）所產生的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述哺乳動物動物是非人靈長類動物。因此，通過本文公開的方法產生的抗體或抗原結合片段也在本公開文本的範圍內。
治療性抗體的轉譯後修飾是重要的產物品質屬性，其可以潛在地影響藥物安全性、功效和安全性。在一些實施例中，本公開文本的抗體和抗原結合片段包括具有本文所示的胺基酸序列以及對所述抗體和抗原結合片段的細胞修飾和體外轉譯後修飾的免疫球蛋白鏈。例如，本公開文本包括特異性結合至CoV-S的抗體及其抗原結合片段，其包含本文所示的重鏈和/或輕鏈胺基酸序列（例如，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和/或LCDR3）以及如下抗體和片段：其中一個或多個胺基酸殘基被糖基化，一個或多個Asn殘基被去醯胺，一個或多個殘基（例如，Met、Trp和/或His）被氧化，N末端Gln是焦麩胺酸（pyroE）和/或C末端離胺酸丟失。 醫藥組合物
本公開文本的抗體、抗原結合片段、核酸、重組細胞和/或細胞培養物可以被摻入組合物（包括醫藥組合物）中。在一些實施例中，這樣的組合物以在自然界中未發現的量、組合或形式包括如本文所公開的抗體、抗原結合片段、核酸、重組細胞和/或細胞培養物中的一種或多種。例如，在一些實施例中，本公開文本的組合物包括如本文所公開的抗體、抗原結合片段、核酸、重組細胞中的一種或多種，它們已經被分離（例如，純化）至它們不再呈會被發現是自然的形式的程度。在另一例子中，在一些實施例中，本公開文本的組合物以在自然界中不存在的量包括本公開文本的抗體、抗原結合片段、核酸、重組細胞。在又另一例子中，在一些實施例中，本公開文本的抗體、抗原結合片段、核酸、重組細胞以在自然界中不存在的配製品和/或組合來組合。在一些實施例中，這樣的組合物包括治療或預防有效量的與合適的賦形劑例如醫藥上可接受的載劑混合的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，組合物的足以實現治療或預防效果的有效量的範圍為約0.000001 mg/公斤體重/投予至約10,000 mg/公斤體重/投予。合適地，劑量範圍為約0.0001 mg/公斤體重/投予至約100 mg/公斤體重/投予。
通常，適用于本公開文本的組合物中的醫藥上可接受的載劑包括但不限於意指生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。醫藥上可接受的載劑的非限制性例子是水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及其組合。在一些實施例中，本公開文本的組合物包括組合物中的等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或者氯化鈉。醫藥上可接受的物質的其他例子是增強抗體的貯存壽命或有效性的潤濕劑或少量輔助物質，如潤濕或乳化劑、防腐劑或緩衝液。適用于本公開文本的組合物中的另外的醫藥上可接受的載劑包括但不限於賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑、防腐劑、著色、調味和稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、增量劑、緩衝液、遞送載具、張度劑、共溶劑、潤濕劑、絡合劑、緩衝劑、抗微生物劑和表面活性劑。
在一態樣，本公開文本的抗體、抗原結合片段、核酸、重組細胞和/或細胞培養物可以被摻入適合於多種下游應用的組合物、例如醫藥組合物中。本公開文本的示例性組合物包括醫藥組合物，其通常包括如本文所述的抗體、抗原結合片段、核酸、重組細胞和/或細胞培養物中的一種或多種以及醫藥上可接受的賦形劑，例如載劑或稀釋劑。在一些實施例中，所述組合物是無菌組合物。在一些實施例中，所述組合物是凍幹的、烘乾的或冷凍乾燥的組合物。在一些實施例中，所述組合物被配製為疫苗。在一些實施例中，所述組合物還包括佐劑。
在一些實施例中，所述組合物包括至少一種（例如，至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種）如本文所公開的抗體或抗原結合片段。
如上文所討論，本公開文本的組合物和方法可以用於具有與冠狀病毒靶標（例如，刺突蛋白）上的不同表位的特異性結合親和力（例如，以變化程度的特異性結合的能力）的抗體的鑒定和表徵。具有對靶蛋白（例如，SARS-2刺突蛋白）上的不同表位的結合親和力的抗體可以有利地用於治療性抗體混合劑或組合療法方案中。例如，具有對SARS-2刺突蛋白的N末端結構域（NTD）的結合親和力的中和抗體可以與具有對相同靶標的受體結合結構域（RTD）的結合親和力的中和抗體有效組合，應為所述兩種抗體不結合在相同表位。
在一些實施例中，所述組合物包括 (a) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段，以及 (b) 具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述組合物包括 (a) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段，以及 (b) 具有與SARS-CoV-2 S蛋白的NTD的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述組合物包括 (a) 具有與NTD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段，以及 (b) 具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段。
在一些實施例中，如本文所公開的抗體或抗原結合片段以劑量依賴性方式與另一種抗體或抗原結合片段競爭結合至SARS-CoV-2刺突蛋白上的相同表位。如下文（例如，實例14和表9）更詳細地描述，本公開文本的抗體和抗原結合片段可以歸類於多個表位箱中，其中共用表位箱的抗體是以劑量依賴性方式競爭結合至相同表位的抗體。
在一些實施例中，本公開文本的組合物包括 (a) 屬於實例14中所述的箱1或箱2的第一抗體或抗原結合片段，這兩個箱表示NTD結合抗體，以及 (b) 屬於實例14中所述的箱3、箱4或箱3/4的第二抗體或抗原結合片段，所述箱表示主要靶向RBD的抗體。例如，在一些實施例中，本公開文本的組合物包括 (a) 屬於箱1的第一抗體或抗原結合片段，以及 (b) 屬於箱3、箱4或箱3/4的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，本公開文本的組合物包括 (a) 屬於箱2的第一抗體或抗原結合片段，以及 (b) 屬於箱3、箱4或箱3/4的第二抗體或抗原結合片段。
在一些實施例中，本公開文本的組合物包括第一RBD結合抗體或其抗原結合片段和第二RBD結合抗體或其抗原結合片段，它們具有對刺突蛋白上的不同表位的結合親和力。例如，在一些實施例中，本公開文本的組合物包括 (a) 屬於箱3的第一RBD結合抗體或抗原結合片段（索托維單抗樣抗體），以及 (b) 屬於箱4的第二RBD結合抗體或抗原結合片段。例如，在一些實施例中，本公開文本的組合物包括 (a) 屬於箱3的第一RBD結合抗體或抗原結合片段，以及 (b) 屬於箱3/4的第二RBD結合抗體或抗原結合片段。例如，在一些實施例中，本公開文本的組合物包括 (a) 屬於箱4的第一RBD結合抗體或抗原結合片段，以及 (b) 屬於箱3/4的第二RBD結合抗體或抗原結合片段。
在一些實施例中，本公開文本的組合物包括第一RBD結合抗體或其抗原結合片段和第二RBD結合抗體或其抗原結合片段，它們能夠以部分不同的方式結合刺突蛋白的RBD。
組合療法的另外的實施例。
在一些實施例中，本文所述的醫藥組合物包括 (i) 本文鑒定的具有與SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力的第一抗體（例如，表1中所示的抗體中的任一種），以及 (ii) 先前表徵為具有與SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力的一種或多種抗體（例如，先前表徵的治療性抗體），如FDA批准用於冠狀病毒感染的治療的抗體。先前表徵為具有與SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力的合適的抗體的例子包括但不限於凱西瑞單抗、伊德維單抗、巴馬尼單抗、依替昔單抗和索托維單抗。
在一些實施例中，本文所述的醫藥組合物包括 (i) 本文鑒定的具有與SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力的第一抗體（例如，表1中所示的抗體中的任一種），以及 (ii) 具有對免疫途徑靶標的親和力的一種或多種抗體和/或小分子實體。針對免疫途徑靶標的合適的抗體的非限制性例子包括白介素抗體、IL-1途徑靶抗體和IL-6途徑靶抗體。
IL-1途徑靶抗體：
IL-1途徑靶抗體的非限制性例子包括Ilaris（卡那單抗）（IL-1抑制劑）、IL-1β特異性抗體SK48-E26、47F11和XOMA 052（吉伏組單抗）、IL-1α特異性MABp1。
IL-6途徑靶抗體：
IL-6途徑靶抗體的非限制性例子包括Actemra（托珠單抗）（阻斷IL-6受體）和西魯庫單抗（抗IL-6抗體候選物）。
本文提供的醫藥組合物可以是允許將組合物投予至個體的任何形式。所述組合物可以呈液體形式或者呈凍幹或冷凍乾燥形式，並且可以包括一種或多種凍幹保護劑、賦形劑、表面活性劑、高分子量結構添加劑和/或增量劑。在一些具體實施例中，所述醫藥組合物適用於人類投予。本公開文本的範圍包括包含抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段（例如，表1中的））的烘乾的（例如，冷凍乾燥的）組合物，或者其包括醫藥上可接受的載劑但基本上不含水的醫藥組合物。如本文所用，術語“醫藥上可接受的”意指由聯邦政府或州政府的管理機構批准的或者在美國藥典或其他公認藥典中列出用於動物、且更特別是用於人的。載劑可以是與醫藥組合物一起投予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液體載劑，包括可注射溶液。合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。合適的醫藥載劑的例子描述於E.W. Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。在一些實施例中，所述醫藥組合物被無菌配製用於投予至個體或動物（一些非限制性例子包括人或哺乳動物）。在一些實施例中，所述個體是人。
如本文所用術語“投予（administration）”和“投予（administering）”是指生物活性組合物或配製品通過投予途徑的遞送，所述投予途徑包括但不限於鼻內、透皮、靜脈內、動脈內、肌內、腹膜內、皮下、肌內、口服和局部投予或其組合。所述術語包括但不限於由醫學專業人員進行的投予和自我投予。
在一些實施例中，本公開文本的醫藥組合物被配製成適用於投予至個體的預期途徑。例如，所述醫藥組合物可以被配製以適合於腸胃外、腹膜內、結直腸、腹膜內和腫瘤內投予。在一些實施例中，所述醫藥組合物可以被配製用於口服、直腸、經粘膜、腸、腸胃外；肌內、皮下、真皮內、髓內、鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內、眼內、吸入、吹入、局部、皮膚、透皮或動脈內投予。一般技術者應瞭解配製品應適於投予方式。
例如，適合於注射使用的醫藥組合物包括無菌水性溶液或分散液，以及用於無菌可注射溶液或分散液的臨時製備的無菌粉末。對於靜脈內投予，合適的載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL™（BASF，帕西波尼，新澤西州）或磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）。在一些實施例中，所述組合物應是無菌的並且應是易於注射的程度的流體。其可以在製造和儲存的條件下被穩定，並且可以抵抗微生物如細菌和真菌的污染作用而被保存。所述載劑可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其合適的混合物。可以維持適當的流動性，例如，通過使用諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下通過維持所需細微性以及通過使用表面活性劑例如十二烷基硫酸鈉。防止微生物的作用可以通過各種抗細菌劑和抗真菌劑（例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等）來實現。在許多情形中，所述組合物中通常將包括等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和/或氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的藥劑（例如，單硬脂酸鋁和明膠），可以實現可注射組合物的延長吸收。
無菌可注射溶液可以通過以下方式製備：將活性化合物以所需量併入視需要具有上文所列舉成分中的一種或組合的適當溶劑中，之後過濾滅菌。通常，通過將活性化合物摻入無菌媒劑中來製備分散液，所述無菌媒劑含有鹼性分散介質和來自以上列舉的那些的所需其他成分。
在一些實施例中，本公開文本的醫藥組合物還包括其他治療劑。其他治療劑的非限制性例子包括 (i) 抗病毒劑、(ii) 抗炎劑、(iii) 特異性結合靶細胞的絲胺酸蛋白酶TMPRSS2的抗體或其抗原結合片段、以及 (iv) 特異性結合至CoV-S蛋白的第二抗體或其抗原結合片段。因此，在一些實施例中，本公開文本的醫藥組合物還包括選自以下的其他治療劑：(i) 抗病毒劑、(ii) 抗炎劑、(iii) 特異性結合靶細胞的絲胺酸蛋白酶TMPRSS2的抗體或其抗原結合片段、以及 (iv) 特異性結合至CoV-S蛋白的第二抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，所述其他治療劑是本文（例如，表1）公開的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，表1的一種、兩種、三種、四種或更多種抗體或其抗原結合片段可以組合使用。
在一些實施例中，來自不同人供體的抗體和抗原結合片段可以被組合。例如，本公開文本的一些實施例涉及包含含有來自人受試者的可變結構域的兩種（或更多種）抗體和抗原結合片段的組合物，其中所述兩種（或更多種）抗體或抗原結合片段源自不同受試者（例如，兩個不同的人受試者）。在一些實施例中，源自人B細胞的抗體可變區可以與並非來自那些B細胞的恒定區組合以產生雜合抗體。在一些實施例中，本公開文本的組合物可以包括具有源自一個供體的可變結構域的抗體或其抗原結合片段與具有源自另一供體的可變結構域的抗體或其抗原結合片段的組合。
在一些實施例中，所述一種或多種其他治療劑包括抗病毒藥或疫苗。一般技術者將理解，本公開文本的抗病毒藥可以包括用於治療、預防或改善受試者中的病毒感染的任何抗感染藥物或療法。在一些實施例中，所述抗病毒藥包括但不限於陽離子類固醇抗微生物劑、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶多肽、利巴韋林或干擾素-α2b。用於通過投予與其他治療劑結合的表1的抗體或抗原結合片段來治療或預防需要所述治療或預防的受試者中的病毒（例如，冠狀病毒）感染的方法是本公開文本的一部分。
例如，在本公開文本的一些實施例中，所述其他治療劑是疫苗，例如，冠狀病毒疫苗。在一些實施例中，疫苗是失活/滅活的病毒疫苗、減毒活病毒疫苗或病毒亞單位疫苗。 本公開文本的方法 用於鑒定具有與靶抗原例如冠狀病毒刺突蛋白（CoV-S）的結合親和力的抗體的方法
在下文更詳細的描述中，本公開文本的一態樣涉及用於抗原結合分子例如抗體和抗原結合片段的鑒定和表徵的新型方式和方法。在一些實施例中，這些方法用於通過使用單細胞免疫剖析方法來鑒定源自從已經暴露於冠狀病毒的受試者獲得的B細胞的抗原結合分子，以生成具有對冠狀病毒刺突蛋白（CoV-S）的結合特異性的抗體和抗原結合片段。
本文公開的新型方式和方法有很多優點。例如，如本文所說明，與傳統探索方法相比，本文所公開的工作流在顯著更短的時間框內鑒定更高數量的以更強效力中和靶抗原的抗體命中。通過本文所公開的工作流鑒定的抗體命中可能具有比使用展示方法鑒定的那些更低的可開發性負擔。此外，如本文所說明，通過本文所公開的工作流鑒定的抗體的親和力和功能譜典型地優於或不差於使用更慢且更低通量方法衍生的抗體的那些。因此，如與傳統抗體發現工作流相比，本文所公開的工作流得到更大數量的具有更優特性的抗體。這樣的工作流在面對其中所關注變異體隨時間演化的快速變化疾病景觀時特別有利。
本公開文本的一些實施例涉及用於鑒定相對於非靶抗原具有對靶抗原的特異性結合親和力（例如，以變化程度的特異性結合的能力）的抗體的方法，所述方法包括：(a) 分區包含產生抗原結合分子的生物顆粒和多種抗原的樣品，其中所述多種抗原包括靶抗原和非靶抗原，並且其中所述抗原中的每一種包括報告寡核苷酸，並且其中所述樣品包含結合至靶抗原的至少一種生物顆粒，並且其中所述分區提供包括 (i) 結合至所述靶抗原的所述生物顆粒和 (ii) 包括共有條碼序列的多個核酸條碼分子的分區；(c) 鑒定由所述生物顆粒產生的已經結合至靶抗原的至少一種抗原結合分子的序列；以及d) 評估所述抗原結合分子與所述靶抗原的結合親和力（例如，以變化程度的特異性結合的能力）；以及e) 如果條碼化的抗體特異性結合至靶抗原，則將分離的抗體抗原結合片段鑒定為具有對所述靶抗原的結合特異性的抗體。
本公開文本的一些實施例涉及用於鑒定具有對冠狀病毒刺突蛋白（CoV-S）的結合親和力的抗體的方法，所述方法包括：(a) 使從已經暴露於冠狀病毒的受試者獲得的多個B細胞與多種抗原接觸，其中所述多種抗原包括CoV-S抗原和非CoV-S抗原，並且其中所述抗原中的每一種包括報告寡核苷酸，其中所述接觸提供結合至CoV-S抗原的B細胞；(b) 將結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞分區於多個分區的分區中，其中所述分區提供包括 (i) 結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞和 (ii) 包括共有條碼序列的多個核酸條碼分子的分區；(c) 鑒定由已經結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞產生的至少一種抗體或抗原結合片段的序列；以及d) 評估條碼化的抗體或抗原結合片段與CoV-S蛋白的結合親和力；以及e) 如果所述條碼化的抗體特異性結合至所述CoV-S蛋白，則將分離的抗體抗原結合片段鑒定為具有對所述CoV-S蛋白的結合特異性的抗體。
用於鑒定如本文所述的具有對CoV-S蛋白的結合親和力的抗體的方法的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。在一些實施例中，所述報告寡核苷酸包括 (i) 鑒定所述抗原的報告序列和 (ii) 捕獲手柄序列。在一些實施例中，本公開文本的方法還包括將條碼部分與由所述B細胞產生的抗體或抗原結合片段偶聯以生成條碼化的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述多個核酸條碼分子中的第一核酸條碼分子還包括配置為與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列偶聯的捕獲序列，並且其中所述多個核酸條碼分子中的第二核酸條碼分子還包括配置為與mRNA分析物偶聯的捕獲序列。在一些實施例中，配置為與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列偶聯的所述捕獲序列與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列互補。在一些實施例中，配置為與mRNA分析物偶聯的捕獲序列包括多聚T序列。在一些實施例中，所述第一核酸條碼分子和所述第二核酸條碼分子各自包括唯一分子識別字（UMI）。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與CoV-S蛋白的結構域上的表位的結合特異性。在一些實施例中，所述CoV-S蛋白的所述結構域位於S1結構域（即，亞基）中。在一些實施例中，所述CoV-S蛋白的所述結構域是S2結構域（即，亞基）中。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有與S1亞基的RBD或NTD的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對CoV-S蛋白的三聚形式的結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於500 nM，例如，小於400 nM、小於300 nM、小於200 nM、小於150 nM、小於120 nM、小於100 nM、小於90 nM、小於80 nM、小於70 nM、小於60 nM、小於50 nM、小於40 nM、小於20 nM、小於15 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於5 nM或者小於1 nM的結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值低於SARS-CoV-2 S蛋白與其受體ACE2之間的結合親和力（其先前被估計為具有約120 nM的K D值）的結合親和力。因此，在本公開文本的一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於120 nM的結合親和力。
在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S蛋白、其片段或其多聚形式的亞奈莫耳結合親和力。在一些實施例中，所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於500 pM，例如，小於100 pM、小於50 pM、小於10 pM、小於5 pM、小於1 pM、小於0.5 pM的結合親和力。在一些實施例中，本文提供的抗體或抗原結合片段可以結合至和/或中和α冠狀病毒、β冠狀病毒、γ冠狀病毒和/或δ冠狀病毒的CoV-S蛋白。在某些實施例中，此結合和/或中和可以對特定屬的冠狀病毒或對屬的特定亞組具有特異性。在一些實施例中，所述CoV-S蛋白是SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或MERS-CoV的刺突蛋白。在一些實施例中，所述受試者懷疑被冠狀病毒感染，已經被冠狀病毒感染，已經接種疫苗，或者已經從冠狀病毒感染康復。在一些實施例中，所述受試者是哺乳動物受試者。在一些實施例中，所述哺乳動物受試者是人。
在一些實施例中，所述抗原各自與鑒定所述抗原的螢光標記偶聯。在一些實施例中，用於鑒定如本文所述的具有對CoV-S蛋白的結合親和力的抗體的方法還包括在 (b) 之前分離和/或富集所述多個B細胞。在一些實施例中，所述富集還包括基於對與抗原偶聯的一種或多種螢光標記的檢測對結合至CoV-S抗原和/或非CoV-S抗原的B細胞的分選。在一些實施例中，所述CoV-S蛋白與條碼部分偶聯。
如下文更詳細地討論，細胞分離技術可以用於富集目的細胞的特定群體。可用於分離（例如，分選）一種或多種不同類型的細胞的分離技術的非限制性例子可以包括例如離心、過濾、基於微流體的分選、流式細胞術、螢光啟動細胞分選（FACS）、磁性啟動細胞分選（MACS）、浮力啟動細胞分選（BACS）或任何其他有用方法。
在某些實施例中，本公開文本提供用於將B細胞鑒定為表現具有對CoV-S抗原或非CoV-S抗原的結合親和力的抗體，或者用於鑒定具有對CoV-S抗原或非CoV-S抗原的結合親和力的抗體的方法。在一個實施例中，所述方法包括使多個B細胞與多種抗原接觸。所述多種抗原可以包括彼此不同的至少兩種抗原，例如，第一抗原和第二抗原，其中所述第一抗原是與所述第二抗原不同類型的抗原。例如，所述多種抗原可以包括但不限於 (i) 相同的抗原，(ii) 不同的抗原，(iii) CoV-S抗原和對照抗原（例如，非CoV-S抗原），或者 (iv) 作為不同類型的CoV-S抗原的第一CoV-S抗原和第二CoV-S抗原。在另一實施例中，所述多個B細胞是從已經暴露於冠狀病毒的受試者獲得（或從得自受試者的樣品獲得）。
在另外的實施例中，所述方法還包括將所述多個B細胞分區至多個分區中，所述多個分區可以是乳液中的多個液滴或多個孔。在另一實施例中，所述多個分區中的分區包含來自所述多個B細胞的B細胞，以及包含分區條碼序列的多個核酸條碼分子。在一個實施例中，所述分區中的B細胞包含 (i) 包含具有CoV-S報告序列的CoV-S報告寡核苷酸的表面結合的CoV-S抗原，以及 (ii) 具有包含對照報告序列的對照報告寡核苷酸的表面結合的對照抗原。
在一個另外的實施例中，所述方法還包括使用所述CoV-S報告寡核苷酸、所述對照報告寡核苷酸和所述多個核酸條碼分子在所述分區中生成多個條碼化的核酸分子。在其他實施例中，所述多個條碼化的核酸分子包含含有所述CoV-S報告序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體的第一條碼化的核酸分子。所述多個條碼化的核酸分子還可以包含含有所述對照報告序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體的第二條碼化的核酸分子。
在其他實施例中，所述方法還包括從所述多個B細胞獲得免疫受體資訊。在一個實施例中，所述方法包括使用編碼免疫受體的核酸分子和所述多個核酸條碼分子生成第三條碼化的核酸分子。編碼免疫受體的核酸分子可以是信使核糖核酸（mRNA）分子。在另一實施例中，所述第三條碼化的核酸分子包含來自B細胞的免疫受體核酸序列或其互補體以及分區條碼序列或其互補體。用於免疫受體和/或抗原結合的單細胞分析的合適的方法、組合物、系統和套組披露於US 20180105808A1、US 20180179590A1、US 20190338353A1和US 20190367969A1中。
在另一實施例中，所述方法還包括確定所述第一條碼化的核酸分子和所述第二條碼化的核酸分子的序列以將所述B細胞鑒定為表現具有對所述CoV-S的結合親和力的抗體，或者以鑒定具有對CoV-S抗原或非CoV-S抗原的結合親和力的抗體。在另一實施例中，所述方法還包括確定所述第三條碼化的核酸分子的序列。在一些實施例中，所述方法包括基於對以下的確定將由所述B細胞表現的抗體鑒定為具有對CoV-S抗原或非CoV-S抗原的結合親和力：(a) 包含所述CoV-S報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的序列，和包含所述對照報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的另一序列；以及 (b) 包含所述CoV-S報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的序列、包含所述對照報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的另一序列；以及對應於免疫受體和所述分區條碼序列或其互補體的另外的序列。
在其他實施例中，本公開文本提供用於將B細胞鑒定為表現針對超過一種抗原具有交叉反應性的抗體或者用於鑒定針對超過一種抗原具有交叉反應性的抗體的方法。在一個實施例中，所述方法包括使多個B細胞與多種抗原接觸。所述多種抗原可以包括彼此不同的至少兩種抗原，例如，第一抗原和第二抗原，其中所述第一抗原是與所述第二抗原不同類型的抗原。例如，所述多種抗原可以包括但不限於 (i) 不同的抗原或 (ii) 作為不同類型的抗原（例如，非CoV-S抗原）的第一抗原和第二抗原。所述多種抗原還可以包含對照抗原（例如，與所述第一或第二抗原無關的抗原）。例如，在所述第一和第二抗原是病毒蛋白抗原的情況下，所述對照抗原是非病毒蛋白抗原。在另一實施例中，所述多個B細胞是從已經暴露於病原體（例如，病毒，冠狀病毒）的受試者獲得（或從得自受試者的樣品獲得）。
在另外的實施例中，所述方法還包括將所述多個B細胞分區至多個分區中，所述多個分區可以是乳液中的多個液滴或多個孔。在另一實施例中，所述多個分區中的分區包含來自所述多個B細胞的B細胞，以及包含分區條碼序列的多個核酸條碼分子。在一個實施例中，所述分區中的B細胞包含 (i) 包含具有第一報告序列的第一報告寡核苷酸的第一表面結合的抗原，以及 (ii) 包含具有第二報告序列的第二報告寡核苷酸的第二表面結合的抗原。在一個另外的實施例中，所述分區中的B細胞還包含具有包含對照報告序列的對照報告寡核苷酸的表面結合的對照抗原。
在一個另外的實施例中，所述方法還包括使用所述第一報告寡核苷酸、所述第二報告寡核苷酸和所述多個核酸條碼分子在所述分區中生成多個條碼化的核酸分子。在其他實施例中，所述多個條碼化的核酸分子包含含有所述第一報告序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體的第一條碼化的核酸分子。所述多個條碼化的核酸分子還可以包含含有所述第二報告序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體的第二條碼化的核酸分子。在另一實施例中，所述多個條碼化的核酸分子還可以包含含有所述對照報告序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體的第三條碼化的核酸分子。在其他實施例中，所述方法還包括從所述多個B細胞獲得免疫受體資訊。在一個實施例中，所述方法包括使用編碼免疫受體的核酸分子和所述多個核酸條碼分子生成另外的條碼化的核酸分子。編碼免疫受體的核酸分子可以是信使核糖核酸（mRNA）分子。在另一實施例中，所述另外的條碼化的核酸分子包含來自B細胞的免疫受體核酸序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體。
在另一實施例中，所述方法還包括確定所述第一條碼化的核酸分子和所述第二條碼化的核酸分子的序列以將所述B細胞鑒定為表現針對超過一種抗原具有交叉反應性的抗體，或者以鑒定針對超過一種抗原具有交叉反應性的抗體。在另一實施例中，所述方法還包括確定所述第三條碼化的核酸分子的序列。在一些實施例中，所述方法包括基於以下的確定將由所述B細胞表現的抗體鑒定為針對超過一種抗原具有交叉反應性：包含所述第一報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的序列，以及包含所述第二報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的另一序列。所述確定還可以包括以下的確定：(i) 包含所述對照報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的序列，和/或 (ii) 對應於免疫受體和所述分區條碼序列或其互補體的另外的序列。
在另外的實施例中，所述方法還包括將所述多個B細胞分區至多個分區中，所述多個分區可以是乳液中的多個液滴或多個孔。在另一實施例中，所述多個分區中的分區包含來自所述多個B細胞的B細胞，以及包含分區條碼序列的多個核酸條碼分子。在一個實施例中，所述分區中的B細胞包含 (i) 包含具有第一CoV-S報告序列的第一CoV-S報告寡核苷酸的第一表面結合的CoV-S抗原，以及 (ii) 包含具有第二CoV-S報告序列的第二CoV-S報告寡核苷酸的第二表面結合的CoV-S抗原。在一個另外的實施例中，所述分區中的B細胞還包含具有包含對照報告序列的對照報告寡核苷酸的表面結合的對照抗原。
在一個另外的實施例中，所述方法還包括使用所述第一CoV-S報告寡核苷酸、所述第二CoV-S報告寡核苷酸和所述多個核酸條碼分子在所述分區中生成多個條碼化的核酸分子。在其他實施例中，所述多個條碼化的核酸分子包含含有所述第一CoV-S報告序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體的第一條碼化的核酸分子。所述多個條碼化的核酸分子還可以包含含有所述第二CoV-S報告序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體的第二條碼化的核酸分子。在另一實施例中，所述多個條碼化的核酸分子還可以包含含有所述對照報告序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體的第三條碼化的核酸分子。在其他實施例中，所述方法還包括從所述多個B細胞獲得免疫受體資訊。在一個實施例中，所述方法包括使用編碼免疫受體的核酸分子和所述多個核酸條碼分子生成另外的條碼化的核酸分子。編碼免疫受體的核酸分子可以是信使核糖核酸（mRNA）分子。在另一實施例中，所述另外的條碼化的核酸分子包含來自B細胞的免疫受體核酸序列或其互補體和所述分區條碼序列或其互補體。
在另一實施例中，所述方法還包括確定所述第一條碼化的核酸分子和所述第二條碼化的核酸分子的序列以將所述B細胞鑒定為表現針對超過一種CoV-S抗原具有交叉反應性的抗體，或者以鑒定針對超過一種CoV-S抗原具有交叉反應性的抗體。在另一實施例中，所述方法還包括確定所述第三條碼化的核酸分子的序列。在一些實施例中，所述方法包括基於以下的確定將由所述B細胞表現的抗體鑒定為針對超過一種CoV-S抗原具有交叉反應性：包含所述第一CoV-S報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的序列，以及包含所述第二CoV-S報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的另一序列。所述確定還可以包括以下的確定：(i) 包含所述對照報告序列和所述分區條碼序列或其互補體的序列，和/或 (ii) 對應於免疫受體和所述分區條碼序列或其互補體的另外的序列。
在一些實施例中，所述方法還包括根據BEAM-seq方法確定所述抗原結合分子（例如，抗體或抗原結合片段）與CoV-S抗原的結合親和力和/或結合特異性，例如，如本文進一步描述。
在某些實施例中，基於分區的組合物和方法使用基於液滴的分區（例如，乳液中的液滴）或基於孔的分區。在一個實施例中，所述多個分區是多個液滴（例如，乳液中的多個液滴）或多個孔。在其他實施例中，所述多個核酸條碼分子與支持物偶聯。所述支援物可以是珠，其任選地是凝膠珠。在另一實施例中，所述多個核酸條碼分子經由不穩定部分與支援物偶聯。在其他實施例中，所述多個核酸條碼分子與所述支持物可釋放地偶聯。所述多個核酸條碼分子可以是可在施加刺激後從所述支援物釋放的。在一個實施例中，所述刺激選自熱刺激、酶刺激、光刺激和化學刺激。在另一實施例中，所述刺激的施加導致以下中的一種或多種：(i) 所述多個核酸條碼分子的核酸條碼分子與所述珠之間的連接的切割，以及 (ii) 所述珠的降解以從所述珠釋放所述多個核酸條碼分子的核酸條碼分子。在一個實施例中，所述珠是在所述分區中提供，並且其中所述核酸條碼分子是從所述分區內的所述珠釋放。 用於分區的系統和方法
在一些態樣，如上文已經描述的那些，本文提供的方法包括分區的步驟，或者包括生成條碼化的核酸分子的步驟，或者可以包括另外的一個或多個加工步驟。此描述陳述所述方法的步驟的例子、實施例和特徵以及可用於所述方法中或如可在分區中提供的試劑的例子、實施例和特徵。
在一態樣，本文所述的系統和方法提供將一個或多個顆粒（例如，生物顆粒、生物顆粒的大分子成分、珠、試劑等）區室化、沈積或分區至離散區室或分區中（本文中可互換地稱為分區），其中每個分區維持其自身內容物與其他分區的內容物的分離。
在本文公開的一些實施例中，分區的顆粒是B細胞譜系（例如，漿細胞或記憶B細胞）的被標記細胞，所述細胞在其表面上表現抗原結合分子（例如，免疫受體、抗體或其功能片段）。在其他實例中，分區的顆粒可以是被工程化以表現抗體的被標記細胞。在一些實施例中，B細胞譜系的被標記細胞是表現抗原結合分子（例如，免疫受體、抗體或其功能片段）的B細胞。
如本文所用術語“分區”通常是指可以適合於容納一個或多個細胞、一個或多個種類的特徵或化合物或者進行一種或多種反應的空間或容積。分區可以是物理容器、區室或器皿，如液滴、流動池、反應室、反應區室、管、孔或微孔。在一些實施例中，所述區室或分區包括可在流體流內流動的分區。這些分區可以包括例如具有包圍內部流體中心或核心的外部屏障的微泡，或者，在一些情形中，所述分區可以包括能夠夾帶和/或保留其基質內的材料的多孔基質。在一些態樣，分區包含在非水性連續相（例如，油相）內的水性流體的液滴。多種不同容器描述於例如美國專利申請公開號2014/0155295中。用於在非水性或油連續相中產生穩定液滴的乳液系統詳細描述於例如美國專利申請公開號2010/010511中。
在一些實施例中，本文的分區包括可以適合於容納一個或多個種類或進行一種或多種反應的空間或容積。分區可以是物理區室，如液滴或孔。分區可以是與另一空間或容積分離的空間或容積。液滴可以是與第一相不混溶的第二相（例如，油）中的第一相（例如，水相）。液滴可以是未與第一相相分離的第二相中的第一相，如例如，水相中的膠囊或脂質體。分區可以包括一個或多個其他（內部）分區。在一些情形中，分區可以是虛擬區室，其可以由跨越多個和/或遠端物理區室的索引（例如，索引庫）來定義和標識。例如，物理區室可以包括多個虛擬區室。
在一些實施例中，本文所述的方法和系統提供在至少一種標記劑或報告劑分子已經結合至細胞的細胞表面特徵之後，將來自含有細胞的樣品材料的單獨細胞區室化、沈積或分區至離散的分區中，其中每個分區維持其自身內容物與其他分區的內容物的分離。包括唯一識別碼（例如，UMI）和常見或通用標籤（例如，條碼）的識別字可以預先、隨後或同時被遞送至容納區室化的或分區的細胞的分區，以允許之後將所述單獨細胞的特徵歸屬於一個或多個特定區室。此外，包括唯一識別碼和常見或通用標籤（例如，條碼）的識別字可以與標記劑偶聯並且預先、隨後或同時被遞送至容納區室化的或分區的細胞的分區，以允許之後將所述單獨細胞的特徵歸屬於一個或多個特定區室。包括唯一識別碼和常見或通用標籤（例如，條碼）的識別字可以通過任何合適的機制被遞送（例如在寡核苷酸上）至分區，例如通過將條碼化的寡核苷酸與珠偶聯。在一些實施例中，所述條碼化的寡核苷酸可逆地（例如，可釋放地）與珠偶聯。適合於本公開文本的組合物和方法的珠可以具有不同表面化學和/或物理體積。在一些實施例中，所述珠包括聚合物凝膠。在一些實施例中，所述聚合物凝膠是聚丙烯醯胺。合適的珠的另外的非限制性例子包括微粒、奈米顆粒、珠和微珠。分區可以是乳液中的液滴。分區可以包括一個或多個顆粒。分區可以包括一種或多種類型的顆粒。例如，本公開文本的分區可以包括一種或多種生物顆粒，例如，標記的工程化細胞、B細胞或記憶B細胞和/或其大分子成分。分區可以包括一個或多個凝膠珠。分區可以包括一個或多個細胞珠。分區可以包括單一凝膠珠、單一細胞珠、或者單一細胞珠和單一凝膠珠二者。分區可以包括一種或多種試劑。可替代地，分區可以是未被佔據的。例如，分區無法包含珠。唯一識別碼（如條碼）可以在液滴生成之前、之後或同時被注射至液滴中，如經由珠來注射，如本文其他地方所述。微流體通道網路（例如，在晶片上）可以用於生成如本文所述的分區。也可以在單獨生物顆粒的分區中採用替代性機制，包括多孔膜，經由其將細胞的水性混合物擠出至非水性流體中。
分區可以在流體流內流動。分區可以包括例如具有包圍內部流體中心或核心的外部屏障的微泡。在一些情形中，分區可以包括多孔基質，其能夠在其基質內（例如，經由配置為偶聯至所述基質和所表現的抗體或其抗原結合片段二者的捕獲劑）夾帶和/或保留材料（例如，所表現的抗體或其抗原結合片段）。分區可以是第二相內的第一相的液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的。例如，分區可以是非水性連續相（例如，油相）內的水性流體的液滴。在另一個例子中，分區可以是水相內的非水性流體的液滴。在一些例子中，分區可以以油包水乳液或水包油乳液來提供。多種不同容器描述於例如美國專利申請公開號2014/0155295中。用於在非水性或油連續相中產生穩定液滴的乳液系統描述於例如美國專利申請公開號2010/0105112中。
在一個非限制性例子中，在乳液中的液滴的情形中，將單獨顆粒（例如，標記的工程化細胞）分配至離散的分區中可以通過將顆粒在水性流體中的流動流引入非水性流體的流動流中來完成，使得在兩個流的交匯點處生成液滴。流體特性（例如，流體流速、流體粘度等）、顆粒特性（例如，體積分數、細微性、顆粒濃度等）、微流體架構（例如，通道幾何結構等）以及其他參數可以被調整以控制所得分區的佔據（例如，每個分區中生物顆粒的數量、每個分區中珠的數量等）。例如，可以通過提供一定濃度和/或流速的顆粒的水性流來控制分區佔據。為了生成單一生物顆粒分區，不混溶流體的相對流速可以被選擇，使得分區可以平均在每個分區中含有少於一個生物顆粒，以確保被佔據的那些分區主要是單一佔據的。在一些情形中，多個分區之間的分區可以含有至多一個生物顆粒（例如，珠、DNA、細胞（如標記的工程化細胞、B細胞或記憶B細胞、漿細胞）或者細胞材料）。在一些實施例中，各種參數（例如，流體特性、顆粒特性、微流體架構等）可以被選擇或調整，使得大多數分區被佔據，例如，僅允許少數分區未被佔據。流動和通道架構可以被控制，以確保給定數量的單一佔據的分區、低於某一水準的未被佔據的分區和/或低於某一水準的多重佔據的分區。
在一些實施例中，所述方法還包括在第二多個分區的分區中單獨分區來自多個細胞的一個或多個單細胞。
在一些實施例中，所述第一和第二多個分區中的至少一個包括微孔、流動池、反應室、反應區室或液滴。在一些實施例中，所述第一和第二多個分區中的至少一個包括乳液中的單獨液滴。在一些實施例中，所述第一多個和/或所述第二多個分區的分區具有相同的反應體積。
在乳液中的液滴的情形中，將單獨細胞分配至離散的分區通常可以通過將細胞在水性流體中的流動流引入非水性流體的流動流中來完成，使得在兩個流的交匯點處生成液滴。通過以某個細胞濃度提供水性含細胞流，所得分區的佔據（例如，每個分區中細胞的數量）可以被控制。例如，在需要單細胞分區的情況下，流體的相對流速可以被選擇，使得所述分區平均在每個分區中含有少於一個細胞，以確保被佔據的那些分區主要是單一佔據的。在一些實施例中，流體的相對流速可以被選擇，使得大多數分區被佔據，例如，僅允許少數分區未被佔據。在一些實施例中，流體和通道架構被控制，以確保所需數量的單一佔據的分區、低於某一水準的未被佔據的分區和低於某一水準的多重佔據的分區。
在一些實施例中，可以進行本文所述的方法，使得大多數被佔據的分區在每個被佔據的分區中包括不超過一個細胞。在一些實施例中，進行分區過程使得少於25%、少於20%、少於15%、少於10%、少於5%、少於2%或少於1%的被佔據的分區含有超過一個細胞。在一些實施例中，少於20%的被佔據的分區包括超過一個細胞。在一些實施例中，少於10%的被佔據的分區在每個分區中包括超過一個細胞。在一些實施例中，少於5%的被佔據的分區在每個分區中包括超過一個細胞。在一些實施例中，可期望避免產生過多數量的空分區。例如，從成本的角度和/或效率的角度，可能期望使空分區的數量最小化。儘管這可以通過將足量細胞提供至分區區域中來完成，但是可以任選地使用泊松分佈（Poissonian distribution）來增加包括多個細胞的分區的數量。因此，在本文所述的一些實施例中，進行引導至分區區域中的一個或多個細胞或其他流體的流動使得不超過50%的所生成分區、不超過25%的所生成分區或不超過10%的所生成分區是未被佔據的。此外，在一些態樣，這些流動被控制以呈現單一佔據的分區的非泊松分佈，同時提供更低水準的未被佔據的分區。重申，在一些態樣，可以實現上述範圍的未被佔據的分區，同時仍提供上述任何單一佔據率。例如，在一些實施例中，本文所述的系統和方法的投予產生的所得分區具有的多重佔據率小於25%、小於20%、小於15%、小於10%和在一些實施例中小於5%，同時具有的未被佔據的分區小於50%、小於40%、小於30%、小於20%、小於10%和在一些實施例中小於5%。
儘管上文在提供基本上單一佔據的分區方面進行描述，在一些實施例中，如本文所述的方法包括提供多重佔據的分區，例如，在單一分區內含有包含核酸條碼分子的兩個、三個、四個或更多個細胞和/或微膠囊（例如，珠）。
在一些實施例中，分區內所含的報告寡核苷酸可與所述多個分區的其他分區內所含的報告寡核苷酸相區分。
在一些實施例中，可以期望在給定分區內摻入多種不同的條碼序列，它們附接至所述分區內的單一珠或多個珠。例如，在一些情形中，混合但已知的條碼序列集可以在後續加工中提供更多的鑒定保證，例如，通過提供條碼至給定分區的更強定址或歸屬，作為來自給定分區的輸出的重複或獨立確認。 微流體通道結構
微流體通道網路（例如，在晶片上）可以用於生成如本文所述的分區。也可以在單獨生物顆粒的分區中採用替代性機制，包括多孔膜，經由其將細胞的水性混合物擠出至非水性流體中。
圖5顯示用於分區單獨生物顆粒的微流體通道結構500的例子。通道結構500可以包括在通道交匯點510處連通的通道區段502、504、506和508。在操作中，包括懸浮的生物顆粒（例如，細胞，例如，標記的工程化細胞、B細胞、記憶B細胞或漿細胞）514的第一水性流體512可以沿通道區段502被輸送至交匯點510中，而與水性流體512不混溶的第二流體516從通道區段504和506中的每一個被遞送至交匯點510以產生第一水性流體512的離散液滴518、520，其流動至通道區段508中，並且從交匯點510流動離開。通道區段508可以與其中可以儲存和/或收穫離散液滴的出口儲器流體偶聯。所生成的離散液滴可以包括單獨生物顆粒514（如液滴518）。所生成的離散液滴可以包括超過一個單獨生物顆粒（例如，標記的B細胞，如記憶B細胞，或漿細胞）514（圖5中未顯示）。離散液滴可能不含生物顆粒514（如液滴520）。每個離散的分區可以維持其自身內容物（例如，單獨生物顆粒514）與其他分區的內容物的分離。
第二流體516可以包括油如氟化油，其包括用於穩定所得液滴的含氟表面活性劑，例如，抑制所得液滴518、520的後續聚結。特別有用的分區流體和含氟表面活性劑的例子描述於例如美國專利申請公開號2010/0105112中。
如將瞭解，本文所述的通道區段可以與多種不同流體來源或接收部件中的任一種偶聯，包括儲器、管路、分流管或其他系統的流體部件。如將瞭解，微流體通道結構500可以具有其他幾何結構。例如，微流體通道結構可以具有超過一個通道交匯點。例如，微流體通道結構可以具有在通道交匯點處相遇的各自攜帶顆粒（例如，生物顆粒、細胞珠和/或凝膠珠）的2、3、4或5個通道區段。流體可以經由一個或多個流體流動單元被引導以沿一個或多個通道或儲器流動。流體流動單元可以包含壓縮機（例如，提供正壓）、泵（例如，提供負壓）、致動器等以控制流體的流動。流體也可以或以其他方式通過所施加的壓力差、離心力、電動泵浦、真空、毛細管或重力流動等來控制。
所生成的液滴可以包括兩個液滴子集：(1) 被佔據的液滴518，其含有一個或多個生物顆粒514，例如，標記的工程化細胞、標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞，以及 (2) 未被佔據的液滴520，其不含任何生物顆粒514。被佔據的液滴518可以包括單一佔據的液滴（具有一個生物顆粒，如一個標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）和多重佔據的液滴（具有超過一個生物顆粒，如多個工程化細胞、標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）。如本文其他地方所述，在一些情形中，大多數被佔據的分區可以在每個被佔據的分區中包括不超過一個生物顆粒，例如，標記的工程化細胞、標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞，並且一些所生成的分區可以是未被佔據的（任何生物顆粒，或標記的工程化細胞、標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）。然而，在一些情形中，一些被佔據的分區可以包括超過一個生物顆粒，例如，標記的工程化細胞、標記的B細胞或記憶B細胞。在一些情形中，分區過程可以被控制，使得少於約25%的被佔據的分區含有超過一個生物顆粒，並且在許多情形中，少於約20%的被佔據的分區具有超過一個生物顆粒，而在一些情形中，少於約10%或甚至少於約5%的被佔據的分區在每個分區中包括超過一個生物顆粒。
在一些情形中，可以期望將過多數量的空分區的產生最小化，例如以降低成本和/或提高效率。儘管此最小化可以通過在分區交匯點510處提供足量的生物顆粒（例如，生物顆粒，如標記的工程化細胞、標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞514）來實現，例如以確保至少一個生物顆粒被封裝在分區中，但是泊松分佈可以預期地增加包括多個生物顆粒的分區的數量。因此，在要獲得單一佔據的分區的情況下，至多約95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或更少的所生成的分區可以是未被佔據的。
在一些情形中，一種或多種生物顆粒如標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞（例如，在通道區段502中）或被引導至分區交匯點中的其他流體（例如，在通道區段504、506中）的流動可以被控制，使得在許多情形中，不超過約50%的所生成的分區、不超過約25%的所生成的分區或不超過約10%的所生成的分區是未被佔據的。這些流動可以被控制，以呈現單一佔據的分區的非泊松分佈，同時提供更低水準的未被佔據的分區。上述範圍的未被佔據的分區可以被實現，同時仍提供上述任何單一佔據率。例如，在許多情形中，本文所述的系統和方法的使用可以產生的所得分區具有的多重佔據率小於約25%、小於約20%、小於約15%、小於約10%和在許多情形中小於約5%，同時具有的未被佔據的分區小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%、小於約5%或更少。
如將瞭解，上述佔據率也適用於包括生物顆粒（例如，標記的B細胞或漿細胞）和另外的試劑二者的分區，所述另外的試劑包括但不限於攜帶條碼化的核酸分子（例如，核酸條碼分子或條碼化的寡核苷酸）的微膠囊或珠（例如，凝膠珠）（關於圖5和圖6進行描述）。被佔據的分區（例如，至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的被佔據的分區）可以包括包含條碼化的核酸分子（例如，核酸條碼分子）的微膠囊（例如，珠）和生物顆粒二者。
圖14顯示用於將攜帶條碼的珠遞送至液滴的微流體通道結構1400的例子。通道結構1400可以包括在通道交匯點1410處連通的通道區段1401、1402、1404、1406和1408。在操作中，通道區段1401可以將包括多個珠1414（例如，具有核酸分子，例如，核酸條碼分子或條碼化的寡核苷酸、分子標籤）的水性流體1412沿通道區段1401輸送至交匯點1410中。所述多個珠1414可以來源於珠的懸浮液。例如，通道區段1401可以連接至包含珠1414的水性懸浮液的儲器。通道區段1402可以將包括多個生物顆粒1416的水性流體1412沿通道區段1402輸送至交匯點1410中。所述多個生物顆粒1416可以來源於生物顆粒的懸浮液。例如，通道區段1402可以連接至包含生物顆粒1416的水性懸浮液的儲器。在一些情況下，第一通道區段1401或第二通道區段1402中或兩個區段中的水性流體1412可以包括一種或多種試劑，如下文進一步描述。與水性流體1412（例如，油）不混溶的第二流體1418可以從通道區段1404和1406中的每一個被遞送至交匯點1410。在來自通道區段1401和1402中的每一個的水性流體1412與來自通道區段1404和1406中的每一個的第二流體1418在通道交匯點1410處相遇時，水性流體1412可以在第二流體1418中被分區為離散液滴1420，並沿通道區段1408從交匯點1410流動離開。通道區段1408可以將離散液滴遞送至與通道區段1408流體偶聯的出口儲器，其中可以收穫所述離散液滴。作為替代，通道區段1401和1402可以在交匯點1410上游的另一個交匯點處相遇。在這樣的交匯點處，珠和生物顆粒可以形成混合物，所述混合物沿另一通道被引導至交匯點1410以產生液滴1420。所述混合物可以以交替方式提供珠和生物顆粒，使得例如液滴包含單一珠和單一生物顆粒。
在另一態樣，除了基於液滴的分區以外或作為其替代方案，生物顆粒（例如，細胞）可以被封裝於微膠囊內，所述微膠囊包含其中夾帶一個或多個單獨生物顆粒或小型生物顆粒組的外殼、層或多孔基質。在另一態樣，除了基於液滴的分區以外或作為其替代方案，生物顆粒（例如，細胞）可以被封裝於微粒材料內以形成“細胞珠”。在另一態樣，除了基於液滴的分區以外或作為其替代方案，生物顆粒（例如，細胞）可以被包含於微粒材料內以形成“細胞珠”。
微膠囊或細胞珠可以包括其他試劑。生物顆粒（例如，標記的工程化細胞、B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的封裝可以通過多種過程來進行。這樣的過程可以組合含有生物顆粒的水性流體與聚合前體材料，所述聚合前體材料可能能夠在向所述聚合物前體施加特定刺激後形成凝膠或其他固體或半固體基質。這樣的刺激可以包括例如熱刺激（例如，加熱或冷卻）、光刺激（例如，通過光固化）、化學刺激（例如，通過交聯、前體的聚合引發（例如，通過添加引發劑））、機械刺激或其組合。
包含生物顆粒（例如，標記的工程化細胞、B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的微膠囊的製備（例如，封裝）可以通過多種方法來進行。例如，氣刀液滴或氣溶膠發生器可以用於將前體流體的液滴分配至膠凝溶液中，以形成包括單獨生物顆粒或小型生物顆粒（例如，標記的B細胞或漿細胞）組的微膠囊或細胞珠。同樣，基於膜的封裝系統可以用於生成包含如本文所述的封裝的生物顆粒（例如，B細胞或漿細胞）的細胞珠。本公開文本的微流體系統，如圖5中所示的微流體系統，可以容易地用於封裝如本文所述的生物顆粒（例如，細胞）中。用於封裝生物顆粒（例如，細胞）的示例性方法也進一步描述於美國專利申請公開號US 2015/0376609和PCT公開號WO 2018140966A1中。特別地，並且參考圖5，包含 (i) 生物顆粒（例如，標記的B細胞或漿細胞）514和 (ii) 聚合物前體材料（未顯示）的水性流體512被流動至通道交匯點510中，其中所述水性流體經由非水性流體516的流動被分區為液滴518、520。在封裝方法的情形中，非水性流體516還可以包括引發劑（未顯示）以引起聚合物前體的聚合和/或交聯，以形成包括夾帶的生物顆粒的微膠囊（例如，珠）。聚合物前體/引發劑對的例子包括美國專利申請公開號2014/0378345中所述的那些。
例如，在聚合物前體材料包含線性聚合物材料（如線性聚丙烯醯胺、PEG或其他線性聚合材料）的情形中，啟動劑可以包括交聯劑，或者啟動所形成的液滴內的交聯劑的化學物質。同樣，對於包含可聚合單體的聚合物前體，啟動劑可以包括聚合引發劑。例如，在某些情形中，在聚合物前體包含丙烯醯胺單體與N,N'-雙(丙烯醯基)胱胺（BAC）共聚單體的混合物的情況下，可以在通道區段504和506中的第二流體流516內提供如四乙基亞甲基二胺（TEMED）的藥劑，其可以引發丙烯醯胺和BAC共聚成交聯的聚合物網路或水凝膠。
在第二流體流516與第一流體流512在交匯點510處接觸後，在液滴形成期間，TEMED可以從第二流體516擴散至包含線性聚丙烯醯胺的水性流體512中，這將啟動液滴518、520內的聚丙烯醯胺的交聯，導致形成凝膠（例如，水凝膠）微膠囊或細胞珠，作為夾帶細胞（例如，標記的B細胞或漿細胞）514的固體或半固體珠或顆粒。儘管在聚丙烯醯胺封裝方面進行描述，但是其他“可啟動”封裝組合物也可以用於本文所述的方法和組合物的情況下。例如，藻酸鹽液滴的形成和之後暴露於二價金屬離子（例如，Ca 2+離子）可以用作使用所述過程的封裝過程。同樣，瓊脂糖液滴也可以通過基於溫度的膠凝（例如，在冷卻後等）被轉化為膠囊。
在一些情形中，封裝的生物顆粒可以是可從微膠囊或細胞珠選擇性釋放的，如通過時間流逝或在施加特定刺激後，這會充分降解封裝材料（例如，微膠囊）以允許生物顆粒（例如，標記的B細胞或漿細胞）或其其他內容物從封裝材料被釋放，例如釋放至分區（例如，液滴）中。例如，在上述聚丙烯醯胺聚合物的情形中，聚合物的降解可以通過引入適當還原劑如DTT等以切割交聯聚合物基質的二硫鍵來完成。參見例如，美國專利申請公開號2014/0378345。
生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）可以經歷足以使前體聚合或膠凝的其他條件。足以使前體聚合或膠凝的條件可以包括暴露於加熱、冷卻、電磁輻射和/或光。足以使前體聚合或膠凝的條件可以包括足以使前體聚合或膠凝的任何條件。在聚合或膠凝後，聚合物或凝膠可以在生物顆粒（例如，標記的B細胞或漿細胞）周圍形成。聚合物或凝膠可以對於化學或生化試劑是可擴散滲透的。聚合物或凝膠可以對於生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的大分子成分（例如，分泌的抗體或其抗原結合片段）是不可擴散滲透的。以此方式，聚合物或凝膠可以發揮作用以允許生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）經歷化學或生化操作，同時在空間上將大分子成分限制於由所述聚合物或凝膠界定的液滴的區域。聚合物或凝膠可以包括以下中的一種或多種：二硫化物交聯的聚丙烯醯胺、瓊脂糖、藻酸鹽、聚乙烯醇、聚乙二醇（PEG）-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-硫醇、PEG-迭氮化物、PEG-炔烴、其他丙烯酸酯、殼聚糖、透明質酸、膠原、纖維蛋白、明膠或彈性蛋白。聚合物或凝膠可以包括任何其他聚合物或凝膠。
聚合物或凝膠可以被功能化（例如，與捕獲劑偶聯）以結合至靶向的分析物（例如，分泌的抗體或其抗原結合片段），如核酸、蛋白質、碳水化合物、脂質或其他分析物。聚合物或凝膠可以通過被動機制進行聚合或膠凝。聚合物或凝膠可以在鹼性條件下或在升高溫度下穩定。聚合物或凝膠可以具有與珠的機械特性類似的機械特性。例如，聚合物或凝膠可以具有與珠類似的大小。聚合物或凝膠可以具有與珠的機械強度類似的機械強度（例如，抗拉強度）。聚合物或凝膠可以具有比油低的密度。聚合物或凝膠可以具有與緩衝液的密度大致類似的密度。聚合物或凝膠可以具有可調孔徑。孔徑可以被選擇以例如保留變性的核酸。孔徑可以被選擇以維持對於外源化學物質如氫氧化鈉（NaOH）和/或內源化學物質如抑制劑的可擴散滲透性。聚合物或凝膠可以是生物相容的。聚合物或凝膠可以維持或增強細胞活力。聚合物或凝膠可以是生化相容的。聚合物或凝膠可以以熱、化學、酶和/或光學方式進行聚合和/或解聚。
聚合物可以包括用二硫鍵交聯的聚(丙烯醯胺-共-丙烯酸)。聚合物的製備可以包括兩步式反應。在第一啟動步驟中，聚(丙烯醯胺-共-丙烯酸)可以被暴露於醯化劑以將羧酸轉化為酯。例如，聚(丙烯醯胺-共-丙烯酸)可以被暴露於4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓氯化物（DMTMM）。聚丙烯醯胺-共-丙烯酸可以被暴露於4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鎓的其他鹽。在第二交聯步驟中，第一步驟中形成的酯可以被暴露於二硫化物交聯劑。例如，所述酯可以被暴露於胱胺（2,2'-二硫代雙(乙胺)）。在所述兩個步驟後，生物顆粒可以被通過二硫橋連接在一起的聚丙烯醯胺鏈包圍。以此方式，生物顆粒可以被包圍在凝膠或基質（例如，聚合物基質）內部或者包含所述凝膠或基質，以形成“細胞珠”。細胞珠可以含有生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）或生物顆粒的大分子成分（例如，RNA、DNA、蛋白質、分泌的抗體或其抗原結合片段等）。細胞珠可以包括單細胞或多個細胞，或者所述單細胞或多個細胞的衍生物。例如，在裂解並洗滌細胞後，來自細胞裂解物的抑制性組分可以被洗除，並且大分子成分可以被結合為細胞珠。本文公開的系統和方法可以適用於以下二者：(i) 含有生物顆粒的細胞珠（和/或液滴或其他分區），以及 (ii) 含有生物顆粒的大分子成分的細胞珠（和/或液滴或其他分區）。
封裝的生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）可以提供比基於液滴分區的生物顆粒更易儲存且更便攜的某些潛在優點。此外，在一些情形中，可以期望允許生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）在分析前孵育選定時間段，例如以表徵在存在或不存在不同刺激（例如，細胞介素、抗原等）的情況下這樣的生物顆粒中隨時間發生的變化。在這樣的情形中，封裝可以允許比在乳液液滴中分區更長的孵育，但是在一些情形中，液滴分區的生物顆粒也可以被孵育不同時間段，例如，至少10秒、至少30秒、至少1分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少30分鐘、至少1小時、至少2小時、至少5小時或至少10小時或更長時間。生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的封裝可以構成其他試劑被共分區至其中的生物顆粒的分區。可替代地或另外地，封裝的生物顆粒可以容易地沈積至如上所述的其他分區（例如，液滴）中。 微孔
如本文所述，可以在分區中進行一種或多種過程，所述分區可以是孔。所述孔可以是襯底的多個孔中的孔，如微孔陣列或板的微孔，或者所述孔可以是包含襯底的裝置（例如，微流體裝置）的微孔或微室。所述孔可以是孔陣列或板的孔，或者所述孔可以是裝置（例如，流體裝置）的孔或室。因此，所述孔或微孔可以假定“開放的”組態，其中所述孔或微孔暴露於環境（例如，含有開放的表面）並且在襯底的一個平坦面上是可及的，或者所述孔或微孔可以假定“封閉的”或“密封的”組態，其中所述微孔在襯底的一個平坦面上是不可及的。在一些情況下，所述孔或微孔可以配置為在“開放的”與“封閉的”組態之間切換。例如，“開放的”微孔或微孔集可以使用膜（例如，半透膜）、油（例如，氟化油以覆蓋水溶液）或蓋被“封閉”或“密封”，如本文其他地方所述。所述孔或微孔可以最初以“封閉的”或“密封的”組態來提供，其中它們在沒有外力的情況下在襯底的平坦表面上是不可及的。例如，“封閉的”或“密封的”組態可以包括可被一個或多個移液管吸頭刺穿或穿透的襯底，如密封薄膜或箔。適用於襯底的材料包括但不限於聚酯、聚丙烯、聚乙烯、乙烯樹脂和鋁箔。
在一些實施例中，所述孔可以具有小於1毫升（mL）的容積。例如，所述孔可以配置為容納如下體積：至多1000微升（µL）、至多100 µL、至多10 µL、至多1 µL、至多100奈升（nL）、至多10 nL、至多1 nL、至多100皮升（pL）、至多10（pL）或更小。所述孔可以配置為容納如下體積：約1000 µL、約100 µL、約10 µL、約1 µL、約100 nL、約10 nL、約1 nL、約100 pL、約10 pL等。所述孔可以配置為容納如下體積：至少10 pL、至少100 pL、至少1 nL、至少10 nL、至少100 nL、至少1 µL、至少10 µL、至少100 µL、至少1000 µL或更大。所述孔可以配置為容納在本文列出的體積範圍內的體積，例如，約5 nL至約20 nL、約1 nL至約100 nL、約500 pL至約100 µL等。所述孔可以屬於具有變化容積的多個孔並且可以配置為容納適合於接納本文所述的任何分區體積的體積。
在一些情況下，微孔陣列或板包括單一種類的微孔。在一些情況下，微孔陣列或板包括多種微孔。例如，微孔陣列或板可以在單一微孔陣列或板內包括一種或多種類型的微孔。微孔的類型可以具有不同尺寸（例如，長度、寬度、直徑、深度、橫截面積等）、形狀（例如，圓形、三角形、正方形、矩形、五邊形、六邊形、七邊形、八邊形、九邊形、十邊形等）、縱橫比或其他物理特徵。微孔陣列或板可以包括任何數量的不同類型的微孔。例如，微孔陣列或板可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多種不同類型的微孔。孔可以具有任何尺寸（例如，長度、寬度、直徑、深度、橫截面積、體積等）、形狀（例如，圓形、三角形、正方形、矩形、五邊形、六邊形、七邊形、八邊形、九邊形、十邊形、其他多邊形等）、縱橫比或本文關於任何孔所述的其他物理特徵。
在某些情況下，微孔陣列或板包括不同類型的微孔，其彼此相鄰地位於陣列或板內。例如，具有一個尺寸集的微孔可以位於與具有不同尺寸集的微孔相鄰或接觸。類似地，不同幾何結構的微孔可以置於彼此相鄰或接觸。相鄰的微孔可以配置為容納不同物品；例如，一個微孔可以用於容納細胞、細胞珠或其他樣品（例如，細胞組分、核酸分子、核酸條碼分子等），而相鄰微孔可以用於容納微膠囊、液滴、珠或其他試劑。在一些情形中，相鄰的微孔可以配置為在每個微孔中的物品接觸後合併其中容納的內容物，例如，在施加刺激後，或者自發地進行。
如本文其他地方所述，多個分區可以用於本文所述的系統、組合物和方法中。例如，任何合適的數量的分區（例如，孔或液滴）可以被生成或以其他方式來提供。例如，在使用孔的情形中，至少約1,000個孔、至少約5,000個孔、至少約10,000個孔、至少約50,000個孔、至少約100,000個孔、至少約500,000個孔、至少約1,000,000個孔、至少約5,000,000個孔、至少約10,000,000個孔、至少約50,000,000個孔、至少約100,000,000個孔、至少約500,000,000個孔、至少約1,000,000,000個孔或更多孔可以被生成或以其他方式來提供。此外，所述多個孔可以包括未被佔據的孔（例如，空孔）和被佔據的孔二者。
孔可以包括本文所述的任何試劑或其組合。這些試劑可以包括例如條碼分子、酶、銜接子及其組合。所述試劑可以與置於孔中的樣品（例如，細胞、細胞珠或細胞組分，例如，蛋白質、核酸分子等）物理分離。此物理分離可以通過將所述試劑含于置於孔內的微膠囊或珠內或與所述微膠囊或珠偶聯來完成。所述物理分離也可以通過在將多核苷酸樣品引入孔中之前將所述試劑分配于孔中並將所述試劑與例如可溶解的、可熔化的或可滲透的層重疊來完成。該層可以是例如油、蠟、膜（例如，半透膜）等。所述孔可以在任何點被密封，例如，在微膠囊或珠的添加之後、在所述試劑的添加之後或者在這些組分中的任一種的添加之後。所述孔的密封可以用於多種目的，包括預防珠或載入的試劑從孔逃逸，允許某些試劑的選擇性遞送（例如，通過使用半透膜），用於孔在進一步加工之前或之後的儲存等。
一旦被密封，所述孔可以經歷用於所述孔中的一個細胞（或多個細胞）的進一步加工的條件。例如，孔中的試劑可以允許細胞的進一步加工，例如，細胞裂解，如本文進一步描述。可替代地，包含所述細胞（或多個細胞）的孔（或者例如基於孔的陣列的那些的孔）可以經歷冷凍-解凍循環以加工所述細胞（或多個細胞），例如，細胞裂解。含有所述細胞的孔可以經歷冷凍溫度（例如，0ºC、低於0ºC、-5ºC、-10ºC、-15ºC、-20ºC、-25ºC、-30ºC、-35ºC、-40ºC、-45ºC、-50ºC、-55ºC、-60ºC、-65ºC、-70ºC、-80ºC或-85ºC）。冷凍可以以合適的方式進行，例如，零下冷凍器或乾冰/乙醇浴。在初始冷凍後，包含所述細胞（或多個細胞）的所述孔（或多個孔）可以經歷冷凍-解凍循環以裂解所述細胞（或多個細胞）。在一個實施例中，初始冷凍的孔（或多個孔）被解凍至高於冷凍的溫度（例如，4ºC或更高、8ºC或更高、12ºC或更高、16ºC或更高、20ºC或更高、室溫或者25ºC或更高）。在另一實施例中，所述冷凍進行小於10分鐘（例如，5分鐘或7分鐘），之後在室溫下解凍小於10分鐘（例如，5分鐘或7分鐘）。此冷凍-解凍循環可以被重複多次，例如，2、3、4或更多次，以獲得所述孔（或多個孔）中所述細胞（或多個細胞）的裂解。在一個實施例中，冷凍、解凍和/或冷凍/解凍循環是在不存在裂解緩衝液的情況下進行。與冷凍-解凍循環相關的另外的公開內容提供於WO 2019165181A1中，所述申請通過引用以其整體併入本文。
孔可以包括游離試劑和/或封裝在微膠囊、珠或液滴中或以其他方式與其偶聯或締合的試劑。在一些實施例中，本公開文本的中描述的任何試劑可以被封裝於液滴或珠中或以其他方式與其偶聯，所述液滴或珠具有適合於樣品加工反應的任何化學物質、顆粒和元素，包括生物分子，例如但不限於核酸分子和蛋白質。例如，用於DNA定序的樣品製備反應中使用的珠或液滴可以包括以下試劑中的一種或多種：酶、限制性酶（例如，多種切割劑）、連接酶、聚合酶、螢光團、寡核苷酸條碼、銜接子、緩衝液、核苷酸（例如，dNTP、ddNTP）等。
試劑的另外的例子包括但不限於：緩衝液、酸性溶液、鹼性溶液、溫度敏感酶、pH敏感酶、光敏酶、金屬、金屬離子、氯化鎂、氯化鈉、錳、水性緩衝液、溫和緩衝液、離子型緩衝液、抑制劑、酶、蛋白質、多核苷酸、抗體、糖類、脂質、油、鹽、離子、洗滌劑、離子型洗滌劑、非離子型洗滌劑、寡核苷酸、核苷酸、去氧核糖核苷酸三磷酸（dNTP）、二去氧核糖核苷酸三磷酸（ddNTP）、DNA、RNA、肽多核苷酸、互補DNA（cDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）、單鏈DNA（ssDNA）、質體DNA、粘粒DNA、染色體DNA、基因組DNA、病毒DNA、細菌DNA、mtDNA（線粒體DNA）、mRNA、rRNA、tRNA、nRNA、siRNA、snRNA、snoRNA、scaRNA、微RNA、dsRNA、核酶、核糖開關（riboswitch）和病毒RNA、聚合酶、連接酶、限制性酶、蛋白酶、核酸酶、蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、螯合劑、還原劑、氧化劑、螢光團、探針、發色團、染料、有機物、乳化劑、表面活性劑、穩定劑、聚合物、水、小分子、藥物、放射性分子、防腐劑、抗生素、適配體和藥物化合物。如本文所述，孔中的一種或多種試劑可以用於進行一種或多種反應，包括但不限於：細胞裂解、細胞固定、透化、核酸反應（例如，核酸延伸反應）、擴增、反轉錄、轉座酶反應（例如，標籤化）等。
本文公開的孔可以作為套組的一部分來提供。例如，套組可以包括使用說明、微孔陣列或裝置以及試劑（例如，珠）。套組可以包括用於進行本文所述過程（例如，核酸反應、核酸分子的條碼化、樣品加工（例如，用於細胞裂解、固定和/或透化））的任何有用試劑。
在一些情形中，孔包括包含具有類似屬性的試劑組的微膠囊、珠或液滴，所述試劑組例如酶組、礦物組、寡核苷酸組、不同條碼分子的混合物、相同條碼分子的混合物。在其他情形中，微膠囊、珠或液滴包括試劑的異質性混合物。在一些情形中，試劑的異質性混合物可以包括進行反應所需的所有組分。在一些情形中，這樣的混合物可以包括進行反應所需的所有組分，進行反應所需的1、2、3、4、5或更多種組分除外。在一些情形中，這樣的另外的組分含於不同微膠囊、液滴或珠內或以其他方式與其偶聯，或者含於系統磁碟分割（例如，微孔）內的溶液內。
根據本公開文本的一些實施例的微孔陣列的非限制性例子示意性地呈現於圖9中。在此例子中，所述陣列可以含於襯底900內。襯底900包括多個孔902。孔902可以具有任何大小或形狀，並且孔之間的間隔、每個襯底中孔的數量以及襯底900上孔的密度可以被修改，根據具體應用而定。在一個這樣的示例性應用中，可以包括細胞或細胞組分（例如，核酸分子）的樣品分子906與可以包括與其偶聯的核酸條碼分子的珠904共分區。孔902可以使用重力或其他載入技術（例如，離心、液體處理器、聲學載入, 光電子學等）進行載入。在一些情況下，孔902中的至少一個含有單一樣品分子906（例如，細胞）和單一珠904。
試劑可以被依序或同時載入至孔中。在一些情形中，試劑在特定操作之前或之後被引入裝置。在一些情形中，試劑（在某些情況下，其可以以微膠囊、液滴或珠來提供）被依序引入，使得不同反應或操作在不同步驟中進行。試劑（或者微膠囊、液滴或珠）也可以在穿插有反應或操作步驟的操作中被載入。例如，包括用於片段化多核苷酸的試劑（例如，限制性酶）和/或其他酶（例如，轉座酶、連接酶、聚合酶等）的微膠囊、液滴或珠可以被載入至孔或多個孔中，之後載入包括用於將核酸條碼分子附接至樣品核酸分子的試劑的微膠囊、液滴或珠。試劑可以與樣品（例如，細胞或細胞組分（例如，細胞器、蛋白質、核酸分子、碳水化合物、脂質等））同時或依序提供。因此，孔的使用在進行多步式操作或反應時可以是有用的。
圖10示意性地顯示用於加工樣品內的核酸分子的工作流的例子。可以提供包括多個微孔1002的襯底1000。可以包括細胞、細胞珠、細胞組分或分析物（例如，蛋白質和/或核酸分子）的樣品1006可以在多個微孔1002中與包括核酸條碼分子的多個珠1004共分區。在分區過程期間，樣品1006可以在所述分區內被加工。例如，在活細胞的情形中，細胞可以經歷足以裂解細胞並釋放其中所含的分析物的條件。在過程1020中，珠1004可以被進一步加工。舉例來說，過程1020a和1020b示意性地說明不同工作流，根據珠1004的特性而定。
在1020a中，珠包括附接至其的核酸條碼分子，並且樣品核酸分子（例如，RNA、DNA）可以例如經由連接的雜交附接至核酸條碼分子。這樣的附接可以發生在所述珠上。在過程1030中，來自多個孔1002的珠1004可以被收集和合併。可以在過程1040中進行進一步加工。例如，可以進行一種或多種核酸反應，如反轉錄、核酸延伸、擴增、連接、轉座等。在一些情況下，銜接子序列被連接至核酸分子或其衍生物，如本文其他地方所述。例如，定序引子序列可以被附加至核酸分子的每一端。在過程1050中，可以進行進一步表徵如定序以生成定序讀段。所述定序讀段可以產生關於單獨細胞或細胞群的資訊，所述資訊可以例如在圖中以視覺方式或圖形方式來表示。
在1020b中，珠包括可釋放地附接至其的核酸條碼分子，如下文所述。所述珠可以降解或以其他方式將核酸條碼分子釋放至孔1002中；所述核酸條碼分子然後可以用於條碼化孔1002內的核酸分子。進一步加工可以在分區內部或分區外部進行。例如，可以進行一種或多種核酸反應，如反轉錄、核酸延伸、擴增、連接、轉座等。在一些情況下，銜接子序列被連接至核酸分子或其衍生物，如本文其他地方所述。例如，定序引子序列可以被附加至核酸分子的每一端。在過程1050中，可以進行進一步表徵如定序以生成定序讀段。所述定序讀段可以產生關於單獨細胞或細胞群的資訊，所述資訊可以例如在圖中以視覺方式或圖形方式來表示。
如本文其他地方所述，核酸條碼分子和其他試劑可以含於微膠囊、珠或液滴內。這些微膠囊、珠或液滴可以在載入細胞之前、之後或同時被載入至分區（例如，微孔）中，使得每個細胞與不同的微膠囊、珠或液滴接觸。這種技術可以用於將唯一的核酸條碼分子附接至從每個細胞獲得的核酸分子。可替代地或另外地，樣品核酸分子可以被附接至支援物。例如，分區（例如，微孔）可以包括具有與其偶聯的多個核酸條碼分子的珠。樣品核酸分子或其衍生物可以偶聯或附接至附接在支援物上的核酸條碼分子。然後所得條碼化的核酸分子可以從分區被去除，並且在一些情況下，被合併和定序。在這樣的情形中，核酸條碼序列可以用於跟蹤樣品核酸分子的起源。例如，具有相同條碼的多核苷酸可以被確定為源自相同的細胞或分區，而具有不同條碼的多核苷酸可以被確定為源自不同的細胞或分區。
樣品或試劑可以使用多種方法被載入于孔或微孔中。例如，樣品（例如，細胞、細胞珠或細胞組分）或試劑（如本文所述）可以使用外力（例如，重力、電動力、磁力）或使用將樣品或試劑驅動至孔中的機制（例如，通過壓力驅動的流動、離心、光電子學、聲學載入、電動泵浦、真空、毛細管流等）被載入至孔或微孔中。在某些情形中，流體作業系統可以用於將樣品或試劑載入至孔中。樣品或試劑的載入可以遵循泊松分佈或非泊松分佈，例如，超泊松分佈或亞泊松分佈。微孔的幾何結構、孔間間隔、密度和大小可以被修改以適應有用的樣品或試劑分佈；例如，微孔的大小和間隔可以被調整，使得樣品或試劑可以以超泊松方式分佈。
在一個非限制性例子中，微孔陣列或板包括微孔對，其中每對微孔配置為容納液滴（例如，包括單細胞）和單一珠（如本文所述的那些，在一些情況下，其也可以被封裝於液滴中）。液滴和珠（或者含有珠的液滴）可以被同時或依序載入，並且液滴和珠可以被合併，例如，在液滴與珠接觸後，或者在施加刺激（例如，外力、攪拌、熱、光、磁力或電動力等）後。在一些情形中，液滴和珠的載入是超泊松的。在微孔對的其他例子中，孔配置為容納包括不同試劑和/或樣品的兩個液滴，所述液滴在接觸後或在施加刺激後合併。在這樣的情況下，所述對中一個微孔的液滴可以包括可以與所述對中另一微孔的液滴中的藥劑反應的試劑。例如，一個液滴可以包括配置為釋放位於相鄰微孔中的另一液滴中所含珠的核酸條碼分子的試劑。在液滴合併後，核酸條碼分子可以被從珠釋放至分區（例如，微孔或相接觸的微孔對）中，並且可以進行進一步加工（例如，條碼化、核酸反應等）。在完整或活細胞被載入于微孔中的情形中，一個液滴可以包括用於在液滴合併後裂解細胞的裂解試劑。
在一些實施例中，微膠囊、液滴或珠可以被分區至孔中。液滴可以在載入至孔中之前被選擇或經歷預加工。例如，液滴可以包括細胞，並且僅某些液滴（如含有單細胞（或至少一個細胞）的那些）可以被選擇用於孔的載入。這樣的預選擇過程可以用於單細胞的有效載入，如以獲得非泊松分佈，或者以在孔中進一步分區之前針對所選特徵預填充細胞。另外，所述技術可以用於在微孔的載入之前或期間獲得或防止細胞雙聯體或多聯體形成。
在一些實施例中，孔可以包括附接至其的核酸條碼分子。核酸條碼分子可以附接至孔（例如，孔壁）的表面。核酸條碼分子可以被附接至已經分區至孔中的液滴或珠。一個孔的核酸條碼分子（例如，分區條碼序列）可以與另一孔的核酸條碼分子不同，從而可以允許鑒定單一分區或孔內所含的內容物。在一些實施例中，核酸條碼分子可以包括可以鑒定孔的空間座標的空間條碼序列，如在孔陣列或孔板內。在一些實施例中，核酸條碼分子可以包括用於單獨分子標識的唯一分子識別字。在一些情況下，核酸條碼分子可以配置為附接至或捕獲來自分佈于孔中的樣品或細胞或在所述樣品或細胞內的核酸分子。例如，核酸條碼分子可以包括可以用於捕獲或雜交至來自樣品或在所述樣品內的核酸分子（例如，RNA、DNA）的捕獲序列。在一些實施例中，核酸條碼分子可以是可從微孔釋放的。在一些情況下，核酸條碼分子可以是可從珠或液滴釋放的。例如，核酸條碼分子可以包括可以在施加刺激（例如，光刺激、磁性刺激、化學刺激、生物學刺激）後被切割的化學交聯劑。可以雜交至或配置為雜交至樣品核酸分子的所釋放的核酸條碼分子可以被收集和合併用於進一步加工，所述進一步加工可以包括核酸加工（例如，擴增、延伸、反轉錄等）和/或表徵（例如，定序）。在一些情況下，附接至孔中的珠的核酸條碼分子可以被雜交至樣品核酸分子，並且具有與其雜交的樣品核酸分子的珠可以被收集和合併用於進一步加工，所述進一步加工可以包括核酸加工（例如，擴增、延伸、反轉錄等）和/或表徵（例如，定序）。在這樣的情形中，唯一分區條碼序列可以用於鑒定核酸分子所來源的細胞或分區。
可以進行孔內樣品的表徵。在非限制性例子中，這樣的表徵可以包括樣品（例如，細胞、細胞珠或細胞組分）或其衍生物的成像。表徵技術如顯微術或成像可以用於測量固定的空間位置中的樣品譜。例如，在任選地用珠分區細胞時，每個微孔和其中所含內容物的成像可以提供關於以下的有用資訊：細胞雙聯體形成（例如，頻率、空間位置等）、細胞-珠對效率、細胞活力、細胞大小、細胞形態學、生物標記（例如，表面標記、其中的螢光標記分子等）的表現水準、細胞或珠載入率、細胞-珠對的數量等。在一些情況下，成像可以用於表徵孔中的活細胞，包括但不限於：動態活細胞跟蹤、細胞間相互作用（在兩個或更多個細胞被共分區時）、細胞增殖等。可替代地或另外地，成像可以用於表徵孔中的擴增產物的量。
在操作中，孔可以用樣品和試劑同時或依序載入。在載入細胞或細胞珠時，孔可以經歷洗滌，例如，以從孔、微孔陣列或板去除過多細胞。類似地，可以進行洗滌以從孔、微孔陣列或板去除過多珠或其他試劑。在使用活細胞的情況下，可以在單獨分區中裂解細胞以釋放細胞內組分或細胞分析物。可替代地，細胞可以在單獨分區中進行固定或透化。細胞內組分或細胞分析物可以偶聯至支援物，例如，在微孔的表面上、在固體支援物（例如，珠）上，或者它們可以被收集用於進一步下游加工。例如，在細胞裂解後，細胞內組分或細胞分析物可以被轉移至單獨液滴或其他分區用於條碼化。可替代地或另外地，細胞內組分或細胞分析物（例如，核酸分子）可以偶聯至包括核酸條碼分子的珠；隨後，所述珠可以被收集和進一步加工，例如，經歷核酸反應（如反轉錄、擴增或延伸），並且其上的核酸分子可以被進一步表徵，例如通過定序來表徵。可替代地或另外地，細胞內組分或細胞分析物可以在孔中被條碼化（例如，使用包括可釋放的核酸條碼分子的珠或者在包括核酸條碼分子的微孔的表面上）。條碼化的核酸分子或分析物可以在孔中被進一步加工，或者條碼化的核酸分子或分析物可以從單獨分區被收集並在分區外部經歷進一步加工。進一步加工可以包括核酸加工（例如，進行擴增、延伸）或表徵（例如，擴增的分子的螢光監測、定序）。在任何方便的、合適的和/或有用的步驟，孔（或微孔陣列或板）可以被密封（例如，使用油、膜、蠟等），從而使得能夠儲存測定或選擇性引入另外的試劑。 珠
在本公開文本的一些實施例中，分區可以包括一個或多個唯一識別碼，如條碼（例如，多個條碼核酸分子，本文中也稱為核酸條碼分子，其可以是例如多個分區條碼序列）。條碼可以被預先、隨後或同時遞送至容納區室化的或分區的生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的分區。例如，條碼可以在液滴生成之前、之後或同時被注射至液滴。在一些實施例中，將條碼遞送至特定分區允許隨後將單獨生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的特徵歸屬於所述特定分區。條碼可以例如在核酸分子（例如，條碼化的寡核苷酸、核酸條碼分子）上經由任何合適的機制被遞送至分區。在一些實施例中，條碼化的核酸分子例如核酸條碼分子可以經由微膠囊被遞送至分區。在一些情況下，微膠囊可以包括珠。下文更詳細地描述珠。
在一些實施例中，條碼（例如，條碼化的核酸分子、核酸條碼分子）可以首先與微膠囊締合，然後從微膠囊釋放。在一些實施例中，條碼化的核酸分子例如核酸條碼分子的釋放可以是被動的（例如，通過擴散出微膠囊）。另外或可替代地，從微膠囊釋放可以在施加刺激後發生，其允許條碼化的核酸分子從微膠囊解離或釋放。這樣的刺激可以破壞微膠囊、將條碼化的核酸分子偶聯至微膠囊或偶聯於微膠囊內的相互作用，或者二者。這樣的刺激可以包括例如熱刺激、光刺激、化學刺激（例如，pH的變化或還原劑的使用）、機械刺激、輻射刺激；生物學刺激（例如，酶）或其任何組合。用於將攜帶條碼的珠分區至液滴中的方法和系統提供於美國專利公開號2019/0367997和2019/0064173以及國際公開號WO 2020167862和WO 2020176882中。
有益地，分區生物顆粒和攜帶條碼的珠的離散液滴可以有效地允許將條碼歸屬於分區內生物顆粒的大分子成分。分區的內容物可以與其他分區的內容物保持分離。
在操作中，條碼化的寡核苷酸可以被釋放（例如，在分區中），如本文其他地方所述。可替代地，結合至珠（例如，凝膠珠）的核酸分子可以用於雜交和捕獲珠的固相上的分析物（例如，一種或多種類型的分析物）。
在一些例子中，珠、生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）和液滴可以沿通道（例如，微流體裝置的通道）流動，在一些情形中以基本上規律的流動概況（例如，以規律的流速）流動。這樣的規律的流動概況可以允許液滴包括單一珠和單一生物顆粒。這樣的規律的流動概況可以允許液滴具有大於5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的佔據（例如，具有珠和生物顆粒的液滴）。這樣的規律的流動概況和可以用於提供這樣的規律的流動概況的裝置提供於例如美國專利公開號2015/0292988中。
珠可以是多孔的、無孔的、固體的、半固體的、半流體的、流體的和/或其組合。在一些情況下，珠可以是可溶解的、可破壞的和/或可降解的。可降解的珠以及用於降解珠的方法描述於PCT公開號WO 2014210353中，其通過引用以其整體特此併入。在一些情形中，刺激（例如，PCT公開號WO 2014210353和美國專利申請公開號2015/0376609中所述的刺激，所述申請通過引用以其整體特此併入）的任何組合可以觸發珠的降解。例如，pH的變化可以使得化學劑（例如，DTT）能夠成為有效的還原劑。
在一些情形中，珠不能是可降解的。在一些情形中，珠可以是凝膠珠。凝膠珠可以是水凝膠珠。凝膠珠可以從分子前體（如聚合或單體種類）形成。半固體珠可以是脂質體珠。固體珠可以包括金屬，包括氧化鐵、金和銀。在一些情形中，珠可以是二氧化矽珠。在一些情形中，珠可以是剛性的。在其他情形中，珠可以是柔性的和/或可壓縮的。
珠可以具有任何合適的形狀。珠形狀的例子包括但不限於球形、非球形、橢圓形、長方形、無定形、圓形、圓柱形及其變異體。
珠可以具有均勻大小或異質性大小。在一些情形中，珠的直徑可以是至少約10奈米（nm）、100 nm、500 nm、1微米（µm）、5µm、10µm、20µm、30µm、40µm、50µm、60µm、70µm、80µm、90µm、100µm、250µm、500µm、1mm或更大。在一些情形中，珠可以具有如下直徑：小於約10 nm、100 nm、500 nm、1µm、5µm、10µm、20µm、30µm、40µm、50µm、60µm、70µm、80µm、90µm、100µm、250µm、500µm、1mm或更小。在一些情形中，珠可以具有在如下範圍內的直徑：約40-75µm、30-75µm、20-75µm、40-85µm、40-95µm、20-100µm、10-100µm、1-100µm、20-250µm或20-500µm。
在某些態樣，珠可以作為具有相對單分散大小分佈的珠群體或多個珠來提供。在可能期望在分區內提供相對一致的量的試劑的情況下，維持相對一致的珠特徵如尺寸可以有助於整體的一致性。在一些實施例中，本文所述的珠可以具有如下大小分佈：其橫截面尺寸的變化係數小於50%、小於40%、小於30%、小於20%、且在一些情形中小於15%、小於10%、小於5%或更小。
珠可以包括天然和/或合成材料。例如，珠可以包括天然聚合物、合成聚合物或者天然和合成聚合物二者。參見例如，PCT公開號WO 2014210353，其通過引用以其整體特此併入。珠還可以從除了聚合物以外的材料形成，包括脂質、膠束、陶瓷、玻璃-陶瓷、材料複合物、金屬、其他無機材料和其他材料。
在一些實施例中，珠可以包括聚合前體（例如，單體、寡聚物、線性聚合物）、核酸分子（例如，核酸條碼分子或條碼化的寡核苷酸）、引子和其他實體之間的共價鍵或離子鍵。在一些實施例中，共價鍵可以是碳-碳鍵、硫醚鍵或碳-雜原子鍵。
在一些實施例中，珠可以包括acrydite部分，其在某些態樣可以用於將一種或多種核酸分子（例如，條碼序列、條碼化的核酸分子、核酸條碼分子、條碼化的寡核苷酸、引子或其他寡核苷酸）附加至珠。Acrydite部分以及其在將核酸分子附接至珠中的用途描述於PCT公開號WO 2014210353中，其通過引用以其整體特此併入。
例如，聚合以形成珠的前體（例如，單體、交聯劑）可以包括acrydite部分，使得在生成珠時，所述珠還包括acrydite部分。acrydite部分可以被附接至核酸分子（例如，寡核苷酸，如核酸條碼分子），所述核酸分子可以包括引發序列（例如，用於擴增靶核酸的引子、隨機引子、用於信使RNA的引子序列）和/或一個或多個條碼序列。一個或多個條碼序列可以包括對於偶聯至給定珠的所有核酸分子（例如，偶聯至給定珠的核酸條碼分子）相同的序列和/或在偶聯至給定珠的所有核酸分子（例如，偶聯至給定珠的核酸條碼分子）中不同的序列。核酸分子可以被摻入珠中。
在一些實施例中，核酸分子（例如，核酸條碼分子）可以包括功能序列，例如，用於下游定序方法，例如，用於附接至定序流動池的功能序列，如例如用於Illumina®定序的P5序列。在一些情形中，核酸條碼分子或其衍生物（例如，從核酸條碼分子生成的寡核苷酸或多核苷酸）可以包括另一功能序列，如例如，用於附接至用於Illumina定序的定序流動池的P7序列。在一些情形中，核酸條碼分子可以包括條碼序列。在一些情形中，引子還可以包括唯一分子識別字（UMI）。在一些情形中，引子可以包括用於Illumina定序的R1引子序列。在一些實施例中，核酸條碼分子可以包括用於與其他定序平臺的相容性的銜接子。核酸定序方法的非限制性例子包括Maxam-Gilbert定序和鏈終止方法、從頭定序方法（包括鳥槍法定序和橋式PCR）、下一代方法（包括Polony定序、454 焦磷酸定序、Illumina定序、SOLiD™定序、Ion Torrent半導體定序、HeliScope單分子定序和SMRT®定序）。
用於對核酸進行定序的方法的其他例子包括但不限於DNA雜交方法、限制性酶消化方法、Sanger定序方法、連接方法和微陣列方法。可以使用的定序方法的另外的例子包括靶向定序、單分子即時定序、外顯子定序、基於電子顯微術的定序、面板定序、電晶體介導的定序、直接定序、隨機鳥槍法定序、Sanger雙去氧終止定序、全基因組定序、通過雜交進行的定序、焦磷酸定序、毛細管電泳、凝膠電泳、雙重定序、循環定序、單鹼基延伸定序、固相定序、高通量定序、大規模平行簽名定序、在較低變性溫度下共擴增-PCR（COLD-PCR）、通過可逆染料終止劑進行的定序、成對末端定序、近末端定序（near-term sequencing）、核酸外切酶定序、通過連接進行的定序、短讀段定序、單分子定序、合成定序、即時定序、反終止子定序、奈米孔定序、Solexa基因組分析儀定序、MS-PET定序及其任何組合。
因此，用於核酸定序的眾多種不同的方法、系統和技術（包括下一代定序（NGS）方法）可以用於確定編碼由分區的單細胞產生的抗體的核酸序列。通常，定序可以使用以下方式來進行：核酸擴增、聚合酶鏈式反應（PCR）（例如，數位PCR和液滴數位PCR（ddPCR）、定量PCR、即時PCR、多重PCR、基於PCR的單重方法、乳液PCR）和/或等溫擴增。在一些實施例中，核酸條碼分子可以包括用於與長讀段定序平臺如PacBio SMRT-seq平臺和奈米孔定序的相容性的銜接子。
在一些實施例中，核酸分子（例如，核酸條碼分子）或其衍生物（例如，從核酸條碼分子生成的寡核苷酸或多核苷酸）可以包括另一功能序列，如例如，用於附接至用於Illumina定序的定序流動池的P7序列。在一些情形中，核酸條碼分子可以包括條碼序列。在一些情形中，核酸條碼分子或引子還可以包括唯一分子識別字（UMI）。在一些情形中，引子可以包括用於Illumina定序的R1引子序列。在一些實施例中，核酸條碼分子或引子可以包括用於Illumina定序的R2引子序列。這樣的核酸分子（例如，寡核苷酸、多核苷酸等）及其用途（如可以與本公開文本的組合物、裝置、方法和系統一起使用）的例子提供於美國專利公開號2014/0378345和2015/0376609中。
圖7說明攜帶條碼的珠的例子。核酸分子（例如，核酸條碼分子、條碼化的核酸分子）702如寡核苷酸可以通過可釋放連接706如例如二硫化物接頭偶聯至珠704。相同的珠704可以偶聯（例如，經由可釋放連接）至一個或多個其他核酸分子（例如，其他核酸條碼分子）718、720。核酸分子702可以是或包括條碼。如本文其他地方所述，條碼的結構可以包括多個序列元件。核酸分子702可以包括可以用於後續加工的功能序列708。例如，功能序列708可以包括定序儀特異性流動池附接序列（例如，用於Illumina®定序系統的P5序列）和定序引子序列（例如，用於Illumina®定序系統的R1引子）中的一個或多個。核酸分子702可以包括用於條碼化樣品（例如，DNA、RNA、蛋白質等）中的條碼序列710。在一些情形中，條碼序列710可以具有珠特異性，使得條碼序列710為偶聯至同一珠704的所有核酸分子（例如，包括核酸分子702）所共有。可替代地或另外地，條碼序列710可以具有分區特異性，使得條碼序列710為偶聯至分區至同一分區中的一個或多個珠的所有核酸分子所共有。核酸分子702可以包括特異性引發序列712，如mRNA特異性引發序列（例如，多聚T序列）、靶向引發序列和/或隨機引發序列。核酸分子702可以包括錨定序列714以確保，特異性引發序列712在（例如，mRNA的）序列末端處雜交。例如，錨定序列714可以包括隨機短核苷酸序列，如1聚體、2聚體、3聚體或更長的序列，這可以確保多聚T區段更有可能在mRNA的多聚A尾的序列末端處雜交。
核酸分子702可以包括唯一分子標識序列716（例如，唯一分子識別字（UMI））。在一些情形中，唯一分子標識序列716可以包括約5至約8個核苷酸。可替代地，唯一分子標識序列716可以包含小於約5個或超過約8個核苷酸。唯一分子標識序列716可以是在偶聯至單一珠（例如，珠 704）的單獨核酸分子（例如，702、718、720等）中變化的唯一序列。在一些情形中，唯一分子標識序列716可以是隨機序列（例如，如隨機N聚體序列）。例如，UMI可以提供所捕獲的起始mRNA分子的唯一識別碼，以允許對初始表現的RNA的數量進行定量。如將瞭解，儘管圖7顯示偶聯至珠704的表面的三個核酸分子702、718、720，單獨珠可以偶聯至任何數量的單獨核酸分子，例如，一個至數十個至數十萬個、百萬個或甚至數十億個單獨核酸分子。單獨核酸分子的各自的條碼可以包括偶聯至同一珠的不同單獨核酸分子之間的共有序列區段或相對共有序列區段（例如，708、710、712等）以及可變或唯一序列區段（例如，716）二者。
在操作中，生物顆粒（例如，細胞、DNA、RNA等）可以與帶有條碼的珠704一起共分區。條碼化核酸分子702、718、720可以從分區中的珠704釋放。舉例來說，在分析樣品RNA的情況下，一個所釋放核酸分子（例如，702）的多聚T區段（例如，712）可以與mRNA分子的多聚A尾雜交。反轉錄可以得到mRNA的cDNA轉錄物，但是所述轉錄物包括核酸分子702的序列區段708、710、716中的每一個。因為核酸條碼分子702包括錨定序列714，其將更有可能與mRNA的多聚A尾的序列末端雜交並在該處引發反轉錄。在任何給定分區內，單獨mRNA分子的所有cDNA轉錄物可以包括共有條碼序列區段710。然而，從給定分區內的不同mRNA分子製備的轉錄物可以在唯一分子標識序列712區段（例如，UMI區段）處有所不同。有益地，即使在給定分區的內容物的任何後續擴增後，不同UMI的數量可以指示源自給定分區、並因此源自生物顆粒（例如，細胞）的mRNA的量。如上所述，轉錄物可以被擴增、清理和定序，以鑒定mRNA的cDNA轉錄物的序列，以及對條碼區段和UMI區段進行定序。儘管描述了多聚T引子序列，但其他靶向或隨機引發序列也可以用於引發反轉錄反應。同樣，儘管被描述為將條碼化的寡核苷酸釋放至分區中，但是在一些情形中，結合至珠（例如，凝膠珠）的核酸條碼分子可以用於雜交和捕獲所述珠的固相上的mRNA，例如，以有助於將RNA與其他細胞內容物分離。在這樣的情形中，可以在分區中或在分區外部（例如，批量）進行進一步加工。例如，珠上的RNA分子可以經歷反轉錄或其他核酸加工，另外的銜接子序列可以被添加至條碼化的核酸分子，或者可以進行其他核酸反應（例如，擴增、核酸延伸）。珠或其產物（例如，條碼化的核酸分子）可以從分區被收集，和/或合併在一起並且隨後經歷清理和進一步表徵（例如，定序）。
本文所述的操作可以在任何有用的或合適的步驟進行。例如，包括核酸條碼分子的珠可以在將樣品引入分區中之前、期間或之後被引入分區（例如，孔或液滴）中。樣品的核酸分子可以經歷條碼化，其可以在珠上進行（在核酸分子保持偶聯至珠的情形中）或者在將核酸條碼分子釋放至分區中之後進行。在來自樣品的核酸分子保持附接至珠的情形中，來自各個分區的珠可以被收集、合併並經歷進一步加工（例如，反轉錄、銜接子附接、擴增、清理和/或定序）。在其他情況下，所述加工可以在分區中進行。例如，足以用於條碼化、銜接子附接、反轉錄或其他核酸加工操作的條件可以在分區中被提供並且在清理和定序之前進行。
在一些情況下，珠可以包括配置為結合至相應捕獲序列或結合序列的捕獲序列或結合序列。在一些情況下，珠可以包括配置為結合至不同的各自相應的捕獲序列或結合序列的多個不同的捕獲序列或結合序列。例如，珠可以包括各自配置為結合至第一相應捕獲序列的一個或多個捕獲序列的第一子集、各自配置為結合至第二相應捕獲序列的一個或多個捕獲序列的第二子集、各自配置為結合至第三相應捕獲序列的一個或多個捕獲序列的第三子集等。珠可以包括任何數量的不同捕獲序列。在一些情況下，珠可以包括配置為分別結合至不同的各自的捕獲序列或結合序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個不同捕獲序列或結合序列。可替代地或另外地，珠可以包括配置為結合至不同的各自的捕獲序列或結合序列的至多約10、9、8、7、6、5、4、3或2個不同捕獲序列或結合序列。在一些情況下，不同捕獲序列或結合序列可以配置為促進對相同類型的分析物的分析。在一些情況下，不同捕獲序列或結合序列可以配置為促進對不同類型的分析物（使用同一珠）的分析。捕獲序列可以設計為附接至相應捕獲序列。有益地，這樣的相應捕獲序列可以被引入生物顆粒（例如，細胞、細胞珠等）中或以其他方式在所述生物顆粒中被誘導，用於以各種形式（例如，包括相應捕獲序列的條碼化的抗體、包括相應捕獲序列的條碼化的MHC dextramer、包括相應捕獲序列的條碼化的指導RNA分子等）進行不同測定，使得相應捕獲序列隨後可以與與珠締合的捕獲序列相互作用。在一些情況下，偶聯至珠（或其他支援物）的捕獲序列可以配置為附接至接頭分子如夾板分子，其中所述接頭分子配置為經由所述接頭分子將珠（或其他支持物）偶聯至其他分子，如偶聯至一種或多種分析物或一種或多種其他接頭分子。
圖8說明根據本公開文本的一些實施例的攜帶條碼的珠的非限制性例子。核酸條碼分子805如寡核苷酸可以通過可釋放連接806如例如二硫化物接頭偶聯至珠804。核酸條碼分子805可以包括第一捕獲序列860。同一珠804可以偶聯（例如，經由可釋放連接）至包括其他捕獲序列的一個或多個其他核酸分子803、807。核酸條碼分子805可以是或包括條碼序列。如本文其他地方所述，條碼序列的結構可以包括多個序列元件，如功能序列808（例如，流動池附接序列、定序引子序列等）、條碼序列810（例如，與珠共有的珠特異性序列、與分區共有的分區特異性序列等）以及唯一分子識別字812（例如，附接至珠的不同分子內的唯一序列）或其部分序列。捕獲序列860可以配置為附接至相應捕獲序列865（例如，捕獲手柄）。在一些情況下，相應捕獲序列865可以偶聯至可以作為分析物或中間載體的另一分子。例如，如圖8中所說明，相應捕獲序列865被偶聯至包括靶序列864的指導RNA分子862，其中靶序列864配置為附接至分析物。附接至珠804的另一寡核苷酸分子807包括第二捕獲序列880，其配置為附接至第二相應捕獲序列（例如，捕獲手柄）885。如在圖8中所說明，第二相應捕獲序列885被偶聯至抗體882。在一些情形中，抗體882可以具有與分析物（例如，表面蛋白）的結合特異性。可替代地，抗體882無法具有結合特異性。附接至珠804的另一寡核苷酸分子803包括第三捕獲序列870，其配置為附接至第三相應捕獲序列875。如圖8中所說明，第三相應捕獲序列（例如，捕獲手柄）875被偶聯至分子872。分子872可以配置為或可以未被配置為靶向分析物。其他寡核苷酸分子803、807可以包括關於寡核苷酸分子805所述的其他序列（例如，功能序列、條碼序列、UMI等）。儘管在圖8中說明包括每個捕獲序列的單一寡核苷酸分子，將瞭解，對於每個捕獲序列，珠可以包括各自包括捕獲序列的一個或多個寡核苷酸分子的組。例如，珠可以包括任何數量的一個或多個不同捕獲序列的組。可替代地或另外地，珠808可以包括其他捕獲序列。可替代地或另外地，珠808可以包括更少類型的捕獲序列（例如，兩個捕獲序列）。可替代地或另外地，珠808可以包括包含引發序列（如特異性引發序列，如mRNA特異性引發序列（例如，多聚T序列）、靶向引發序列和/或隨機引發序列）的一個或多個寡核苷酸分子，例如，以促進對基因表現的測定。
條碼化的序列的生成描述于本文中，參見例如圖7。
被注射至或以其他方式引入分區中的珠可以包括可釋放地、可切割地或可逆地附接的條碼（例如，分區條碼序列）。被注射至或以其他方式引入分區中的珠可以包括可啟動條碼。被注射至或以其他方式引入分區中的珠可以是可降解的、可破壞的或可溶解的珠。
條碼（例如，核酸條碼分子或條碼化的寡核苷酸）可以被可釋放地、可切割地或可逆地附接至珠，使得條碼可以通過切割含有條碼的核酸分子與珠之間的連接而被釋放或可釋放，或者通過基底珠本身的降解而被釋放，從而允許條碼被其他試劑到達或可到達，或者兩種情況兼而有之。在非限制性例子中，切割可以通過以下來實現：二硫鍵的還原、限制性酶的使用、光啟動切割或經由其他類型的刺激（例如，化學、熱、pH、酶等）和/或反應的切割，如本文其他地方所述。可釋放條碼有時可以被稱為是可啟動的，因為它們一旦被釋放就可用於反應。因此，例如，可啟動條碼可以通過從珠（或本文所述的其他合適的類型的分區）釋放條碼來啟動。在所述方法和系統的情況下，還設想其他可啟動的配置。
如從上文公開文本將瞭解，珠的降解可以是指結合的（例如，配製為偶聯至分泌的抗體或其抗原結合片段的捕獲劑）或夾帶的種類（例如，標記的B細胞，例如，記憶B細胞或漿細胞，或分泌的抗體或其抗原結合片段）從珠解離，同時伴隨和不伴隨物理珠本身的結構降解。例如，珠的降解可以涉及可切割連接經由本文其他地方所述的一個或多個種類和/或方法的切割。在另一例子中，夾帶的種類可以經由由於例如改變化學環境所致的滲透壓差而從珠被釋放。參見例如，PCT公開號WO 2014210353，其通過引用以其整體特此併入。
可降解的珠可以被引入分區（如乳液的液滴或孔）中，使得所述珠在所述分區內降解，並且任何相關的種類（例如，寡核苷酸）當施加適當刺激時在所述液滴內被釋放。游離種類（例如，寡核苷酸、核酸分子、核酸條碼分子）可以與分區中所含的其他試劑相互作用。參見例如，PCT公開號WO 2014210353，其通過引用以其整體特此併入。
任何合適數量的分子標籤分子（例如，引子、條碼化的寡核苷酸）可以與珠締合，使得在從珠釋放後，所述分子標籤分子（例如，引子，例如，條碼化的寡核苷酸）以預定濃度存在於分區中。這樣的預定濃度可以被選擇以促進用於在分區內生成定序文庫的某些反應（例如，擴增）。在一些情形中，引子的預定濃度可以通過產生帶有核酸條碼分子（例如，寡核苷酸，例如，核酸條碼分子）的珠的過程來限制。
在一些情形中，珠可以用一種或多種試劑非共價載入。珠可以通過例如以下方式來非共價載入：使珠經歷足以使珠溶脹的條件，允許試劑有足夠時間擴散至珠的內部中，以及使珠經歷足以使珠去溶脹的條件。珠的溶脹可以例如通過以下方式來完成：將珠置於熱力學有利的溶劑中，使珠經歷更高或更低的溫度，使珠經歷更高或更低的離子濃度，和/或使珠經歷電場。珠的溶脹可以通過各種溶脹方法來完成。珠的去溶脹可以例如通過以下方式來完成：將珠轉移於熱力學不利的溶劑中，使珠經歷更低或高的溫度，使珠經歷更低或更高的離子濃度，和/或去除電場。珠的去溶脹可以通過各種去溶脹方法來完成。轉移珠可以引起珠中的孔縮小。然後所述縮小可能妨礙珠內的試劑擴散出珠的內部。所述妨礙可能是由於試劑與珠的內部之間的空間相互作用所致。所述轉移可以以微流體方式來完成。例如，所述轉移可以通過將珠從一種共流動溶劑流移動至不同的共流動溶劑流來實現。珠的可溶脹性和/或孔徑可以通過改變珠的聚合物組成來調整。
在一些情形中，連接至前體的acrydite部分、連接至前體的另一種類或前體本身可以包括不穩定鍵，如化學敏感鍵、熱敏鍵或光敏鍵，例如，二硫鍵、UV敏感鍵等。一旦包括不穩定鍵的acrydite部分或其他部分被摻入珠中了，所述珠也可以包括所述不穩定鍵。不穩定鍵可以例如用於將種類（例如，條碼、引子等）可逆地連接（例如，共價連接）至珠。在一些情形中，熱不穩定鍵可以包括基於核酸雜交的附接，例如，在寡核苷酸與附接至珠的互補序列雜交的情況下，使得雜合體的熱熔從珠或微膠囊釋放所述寡核苷酸（例如，含有條碼的序列）。
將多種類型的不穩定鍵添加至凝膠珠可以導致生成能夠對變化的刺激做出反應的珠。每種類型的不穩定鍵可以對相關刺激（例如，化學刺激、光、溫度、酶等）敏感，使得經由每種不穩定鍵附接至珠的種類的釋放可以通過施加適當刺激來控制。這樣的功能性可以用於種類從凝膠珠的受控釋放。在一些情形中，包括不穩定鍵的另一種類可以在凝膠珠形成後經由例如如上所述凝膠珠的啟動的官能團被連接至凝膠珠。如將理解，可釋放地、可切割地或可逆地附接至本文所述珠的條碼包括通過條碼分子與珠之間的連接的切割而被釋放或可釋放的條碼，或者通過基底珠本身的降解而被釋放的條碼，從而允許條碼被其他試劑到達或可到達，或者兩種情況兼而有之。
如本文所述的可釋放的條碼有時可以稱為是可啟動的，因為它們一旦被釋放就可用於反應。因此，例如，可啟動條碼可以通過從珠（或本文所述的其他合適的類型的分區）釋放條碼來啟動。在所述方法和系統的情況下，還設想其他可啟動的配置。
除了熱可切割鍵、二硫鍵和UV敏感鍵以外，可以偶聯至前體或珠的不穩定鍵的其他非限制性例子包括酯鍵（例如，可用酸、鹼或羥胺切割）、鄰二醇鍵（例如，可經由高碘酸鈉切割）、Diels-Alder鍵（例如，可經由熱切割）、碸鍵（例如，可經由鹼切割）、甲矽烷基醚鍵（例如，可經由酸切割）、糖苷鍵（例如，可經由澱粉酶切割）、肽鍵（例如，可經由蛋白酶切割）或磷酸二酯鍵（例如，可經由核酸酶（例如，DNA酶）切割）。鍵可以是可經由其他核酸分子靶向酶如限制性酶（例如，限制性核酸內切酶）切割的，如下文進一步描述。
種類可以在珠生成期間（例如，在前體聚合期間）被封裝於珠（例如，捕獲劑）中。這樣的種類可以參與或可以不參與聚合。這樣的種類可以進入聚合反應混合物，使得在珠形成後所生成的珠包括所述種類。在一些情形中，這樣的種類可以在形成後被添加至凝膠珠。這樣的種類可以包括例如核酸分子（例如，寡核苷酸，例如，核酸條碼分子）、用於核酸擴增反應的試劑（例如，引子、聚合酶、dNTP、輔因子（例如，離子型輔因子、緩衝液）（包括本文所述的那些）、用於酶反應的試劑（例如，酶、輔因子、底物、緩衝液）、用於核酸修飾反應如聚合、連接或消化的試劑和/或用於一個或多個定序平臺（例如，用於Illumina®的Nextera®）的範本製備（例如，標籤化）的試劑。這樣的種類可以包括本文所述的一種或多種酶，包括但不限於聚合酶、反轉錄酶、限制性酶（例如，核酸內切酶）、轉座酶、連接酶、蛋白酶K、DNA酶等。這樣的種類可以包括本文其他地方所述的一種或多種試劑（例如，裂解劑、抑制劑、失活劑、螯合劑、刺激）。這樣的種類的捕獲可以通過以下來控制：在前體聚合期間生成的聚合物網路密度、凝膠珠內離子電荷的控制（例如，經由連接至聚合種類的離子種類）或通過其他種類的釋放。封裝的種類可以在珠降解後和/或通過施加能夠將種類從珠釋放的刺激而從珠被釋放。可替代地或另外地，種類可以在分區形成期間或之後被分區於分區（例如，液滴）中。這樣的種類可以包括但不限於上文所提及的也可以封裝於珠中的種類。
儘管上文中圖5和圖6已經根據提供基本上單一佔據的分區進行描述，但是在某些情形中，可以期望提供多重佔據的分區，例如，在單一分區內含有包括條碼化的核酸分子（例如，核酸條碼分子（例如，寡核苷酸））的兩個、三個、四個或更多個細胞和/或微膠囊（例如，珠）（例如，本文其他地方所述的多組學（multiomics）方法）。因此，如上所述，含有生物顆粒和/或珠的流體和分區流體的流動特徵可以被控制以提供這樣的多重佔據的分區。特別地，流動參數可以被控制以在大於約50%、大於約75%並且在一些情形中大於約80%、90%、95%或更高的分區提供給定佔據率。
在一些情形中，另外的微膠囊或珠可以用於將另外的試劑遞送至分區。在這樣的情形中，將不同珠引入共同通道或液滴生成交匯點中，從不同的珠來源（例如，含有不同的締合試劑）經由不同的通道入口引入這樣的共同通道或液滴生成交匯點（例如，交匯點210）中可能是有利的。在這樣的情形中，不同珠進入通道或交匯點中的流動和頻率可以被控制以提供來自每種來源的微膠囊或珠的某個比率，同時確保進入具有給定數量的生物顆粒的分區中的這樣的珠的給定配對或組合（例如，每個分區中一個生物顆粒和一個珠）。
本文所述的分區可以包括小體積，例如，小於約10微升（μL）、5μL、1μL、10奈升（nL）、5 nL、1 nL、900皮升（pL）、800 pL、700 pL、600 pL、500 pL、400pL、300 pL、200 pL、100pL、50 pL、20 pL、10 pL、1 pL、500奈升（nL）、100 nL、50 nL或更小。
例如，在基於液滴的分區的情形中，液滴可以具有如下總體積：小於約1000 pL、900 pL、800 pL、700 pL、600 pL、500 pL、400pL、300 pL、200 pL、100pL、50 pL、20 pL、10 pL、1 pL或更小。在與微膠囊共分區的情況下，將瞭解，分區內的樣品流體體積（例如，包括共分區的生物顆粒和/或珠）可以是上述體積的小於約90%，上述體積的小於約80%、小於約70%、小於約60%、小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%或小於約10%。
如本文其他地方所述，分區種類可以生成多個分區的群體。在這樣的情形中，可以生成或以其他方式提供任何合適數量的分區。例如，可以生成或以其他方式提供至少約1,000個分區、至少約5,000個分區、至少約10,000個分區、至少約50,000個分區、至少約100,000個分區、至少約500,000個分區、至少約1,000,000個分區、至少約5,000,000個分區、至少約10,000,000個分區、至少約50,000,000個分區、至少約100,000,000個分區、至少約500,000,000個分區、至少約1,000,000,000個分區或更多分區。此外，多個分區可以包括未被佔據的分區（例如，空分區）和被佔據的分區二者。 試劑
根據某些態樣，生物顆粒可以與裂解試劑一起被分區，以在分區內釋放生物顆粒的內容物。參見例如，美國專利公開2018/0216162（現美國專利10,428,326）、美國專利公開2019/0100632（現美國專利10,590,244）和美國專利公開2019/0233878。生物顆粒（例如，細胞、細胞珠、細胞核、細胞器等）可以與核酸條碼分子一起被分區，並且生物顆粒的或源自生物顆粒的核酸分子（例如，mRNA、cDNA、gDNA等）可以被條碼化，如本文其他地方所述。在一些實施例中，生物顆粒與攜帶條碼的珠（例如，凝膠珠）共分區，並且生物顆粒的或源自生物顆粒的核酸分子被條碼化，如本文其他地方所述。在這樣的情形中，裂解劑可以將生物顆粒引入分區交匯點/液滴生成區域（例如，交匯點210）中（如經由在通道交匯點上游的另外的一個或多個通道）的同時或緊接在所述引入之前與生物顆粒懸浮液接觸。根據其他態樣，另外地或可替代地，生物顆粒可以與其他試劑一起被分區，如下文將進一步描述。
有益地，在裂解試劑和生物顆粒被共分區時，裂解試劑可以促進生物顆粒的內容物在分區內的釋放。在分區中釋放的內容物可以與其他分區的內容物保持分離。
如將瞭解，本文所述的通道區段可以與多種不同流體來源或接收部件中的任一種偶聯，包括儲器、管路、分流管或其他系統的流體部件。如將瞭解，微流體通道結構可以具有其他幾何結構和/或組態。例如，微流體通道結構可以具有兩個以上的通道交匯點。例如，微流體通道結構可以具有在通道交匯點相遇的2個、3個、4個、5個或更多個通道區段，每個通道區段攜帶相同或不同類型的珠、試劑和/或生物顆粒。每個通道區段中的流體流動可以被控制以控制將不同元素分區至液滴中。流體可以經由一個或多個流體流動單元被引導沿一個或多個通道或儲器流動。流體流動單元可以包括壓縮機（例如，提供正壓）、泵（例如，提供負壓）、致動器等以控制流體的流動。流體也可以或以其他方式通過所施加的壓力差、離心力、電動泵浦、真空、毛細管或重力流動等來控制。
裂解劑的例子包括生物活性試劑，如用於不同細胞類型（例如，革蘭式陽性或陰性細菌、植物、酵母、哺乳動物等）的裂解的裂解酶，如溶菌酶、無色肽酶、溶葡萄球菌酶、labiase、kitalase、lyticase和可從例如Sigma-Aldrich, Inc.（聖路易斯，密蘇里州）獲得的各種其他裂解酶以及其他市售裂解酶。其他裂解劑可以另外地或可替代地與生物顆粒共分區，以引起生物顆粒的內容物釋放至分區中。例如，在一些情形中，基於表面活性劑的裂解溶液可以用於裂解細胞（例如，標記的工程化細胞、B細胞、記憶B細胞或漿細胞），但是這些對於基於乳液的系統可能不太合意，所述系統中表面活性劑可能干擾穩定乳液。在一些情形中，裂解溶液可以包括非離子型表面活性劑，如例如，Triton X-100和Tween 20。在一些情形中，裂解溶液可以包括離子型表面活性劑，如例如，十二烷基肌胺酸鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）。電穿孔、熱學、聲學或機械細胞破壞也可以用於某些情形中，例如，非基於乳液的分區如生物顆粒的封裝，其可以補充或代替液滴分區，其中封裝的任何孔徑足夠小以在細胞破壞後保留給定大小的核酸片段。
可替代地或者除了與上述生物顆粒（例如，標記的工程化細胞、B細胞、記憶B細胞或漿細胞）共分區的裂解劑以外，其他試劑也可以與生物顆粒共分區，所述其他試劑包括例如DNA酶和RNA酶失活劑或抑制劑（如蛋白酶K）、螯合劑（如EDTA）以及用於去除或以其他方式降低不同細胞裂解物組分對核酸的後續加工的負面活性或影響的其他試劑。另外，在封裝的生物顆粒（例如，標記的工程化細胞、B細胞、記憶B細胞或漿細胞，或者包含標記的工程化細胞、B細胞或漿細胞的細胞珠）的情形中，生物顆粒可以被暴露於適當刺激以從共分區的微膠囊或細胞珠釋放生物顆粒或其內容物。例如，在一些情形中，化學刺激可以與封裝的生物顆粒一起共分區以允許封裝材料或微膠囊的降解以及將細胞或其內容物釋放至更大分區中。在一些情形中，此刺激可以與本文其他地方所述用於從其各自的微膠囊（例如，珠）釋放核酸分子（例如，核酸條碼分子或寡核苷酸，例如，條碼化的寡核苷酸）的刺激相同。在替代性態樣，這種刺激可以是不同的且不重疊的刺激，以允許封裝的生物顆粒在與將核酸分子（例如，核酸條碼分子或條碼化的寡核苷酸）釋放至同一分區中不同的時間被釋放至分區中。
另外的試劑也可以與生物顆粒（例如，標記的工程化細胞、B細胞、記憶B細胞或漿細胞）共分區，所述另外的試劑如用於片段化生物顆粒的DNA的核酸內切酶、DNA聚合酶以及用於擴增生物顆粒的核酸片段並將條碼分子標籤附接至擴增的片段的dNTP。其他酶可以被共分區，所述其他酶包括但不限於聚合酶、轉座酶、連接酶、蛋白酶K、DNA酶等。另外的試劑還可以包括反轉錄酶，包括具有末端轉移酶活性的酶、引子和寡核苷酸以及可以用於範本轉換的轉換寡核苷酸（本文中也稱為“轉換寡核苷酸”或“範本轉換寡核苷酸”）。在一些情形中，範本轉換可以用於增加cDNA的長度。在一些情形中，範本轉換可以用於將預定核酸序列附加至cDNA。在範本轉換的例子中，cDNA可以從範本例如細胞mRNA的反轉錄生成，其中具有末端轉移酶活性的反轉錄酶可以以範本無關的方式將另外的核苷酸（例如，多聚C）添加至cDNA。轉換寡核苷酸可以包括與另外的核苷酸互補的序列，例如多聚G。cDNA上的另外的核苷酸（例如，多聚C）可以與轉換寡核苷酸上的另外的核苷酸（例如，多聚G）雜交，借此轉換寡核苷酸可以由反轉錄酶用作範本以進一步延伸cDNA。範本轉換寡核苷酸可以包括雜交區和範本區。範本轉換寡核苷酸進一步描述於PCT公開號WO 2018119447中，其通過引用以其整體特此併入。
一旦細胞（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的內容物被釋放至其各自的分區中，其中所含的大分子組分（例如，生物顆粒的大分子成分，如RNA、DNA、蛋白質或分泌的抗體或其抗原結合片段）可以在所述分區內被進一步加工。根據本文所述的方法和系統，單獨生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的大分子組分內容物可以提供有唯一識別碼，使得在那些大分子組分的表徵後，它們可以被歸屬為源自相同的一個或多個生物顆粒。將特徵歸屬於單獨生物顆粒或生物顆粒組的能力是通過將唯一識別碼特異性分配至單獨生物顆粒或生物顆粒組來提供。唯一識別碼（例如，呈核酸條碼形式）可以被分配至單獨生物顆粒或生物顆粒的群體或者與其締合，以用唯一識別碼為生物顆粒的大分子組分（以及因此，其特徵）加標籤或標記。然後，這些唯一識別碼可以用於將生物顆粒的組分和特徵歸屬於單獨生物顆粒或生物顆粒組。
在一些態樣，這是通過將單獨生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）或生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）組與唯一識別碼（如上文所述）共分區來進行（參考圖5和圖6）。在一些態樣，唯一識別碼是以包括核酸條碼序列的核酸分子（例如，寡核苷酸）的形式來提供，所述核酸條碼序列可以附接至單獨生物顆粒的核酸內容物或生物顆粒的其他組分以及特別是那些核酸的片段，或者以其他方式與其締合。核酸分子被分區，使得如在給定分區中的核酸分子之間，其中所含的核酸條碼序列是相同的，但是如在不同分區之間，核酸分子可以並且確實具有不同的條碼序列，或者至少在給定分析中在所有分區中表現大量不同的條碼序列。在一些態樣，僅一個核酸條碼序列可以與給定分區締合，但是在一些情形中，可以存在兩個或更多個不同的條碼序列。
核酸條碼序列在核酸分子（例如，寡核苷酸）的序列內可以包括約6至約20或更多個核苷酸。核酸條碼序列可包括約6至約20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個核苷酸。在一些情形中，條碼序列的長度可以為約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個核苷酸或更長。在一些情形中，條碼序列的長度可以為至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個核苷酸或更長。在一些情形中，條碼序列的長度可以為至多6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個核苷酸或更短。這些核苷酸可以是完全連續的，即，在相鄰核苷酸的單一延伸段中，或者它們可以被分為相隔一個或多個核苷酸的兩個或更多個單獨子序列。在一些情形中，分離的條碼子序列的長度可以為約4至約16個核苷酸。在一些情形中，條碼子序列可以為約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個核苷酸或更長。在一些情形中，條碼子序列可以為至少約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個核苷酸或更長。在一些情形中，條碼子序列可以為至多約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個核苷酸或更短。
共分區的核酸分子還可以包括用於來自共分區的生物顆粒（例如，標記的B細胞、記憶B細胞或漿細胞）的核酸的加工的其他功能序列。這些序列包括例如用於擴增來自分區內的單獨生物顆粒的基因組DNA同時附接相關條碼序列的靶向的或隨機的/通用的擴增引子序列、定序引子或引子識別位點、雜交或探定序列（例如，用於鑒定序列的存在或用於拉下條碼化的核酸）或者多種其他潛在功能序列中的任一種。還可以採用共分區寡核苷酸的其他機制，包括例如兩個或更多個液滴的聚結，其中一個液滴含有寡核苷酸，或者將寡核苷酸微分配至分區（例如，微流體系統內的液滴）中。
在一個例子中，提供微膠囊，如珠，其各自包括大量可釋放地附接至珠的上述條碼化的核酸分子（例如，條碼化的寡核苷酸），其中附接至特定珠的所有核酸分子將包括相同的核酸序列，但是其中在所用珠的群體中表現大量不同的條碼序列。在一些實施例中，水凝膠珠（例如，包括聚丙烯醯胺聚合物基質）用作用於核酸分子進入分區中的固體支援物和遞送載具，因為它們能夠攜帶大量核酸分子，並且可以配置為在暴露於特定刺激後釋放那些核酸分子，如本文其他地方所述。在一些情形中，珠的群體提供多樣的條碼序列文庫，其包括至少約1,000個不同的條碼序列、至少約5,000個不同的條碼序列、至少約10,000個不同的條碼序列、至少約50,000個不同的條碼序列、至少約100,000個不同的條碼序列、至少約1,000,000個不同的條碼序列、至少約5,000,000個不同的條碼序列、或至少約10,000,000個不同的條碼序列、或更多。另外，每個珠可以提供有大量附接的核酸（例如，寡核苷酸）分子。特別地，單獨珠上包括條碼序列的核酸分子的分子數量可以是至少約1,000個核酸分子、至少約5,000個核酸分子、至少約10,000個核酸分子、至少約50,000個核酸分子、至少約100,000個核酸分子、至少約500,000個核酸、至少約1,000,000個核酸分子、至少約5,000,000個核酸分子、至少約10,000,000個核酸分子、至少約50,000,000個核酸分子、至少約100,000,000個核酸分子、至少約250,000,000個核酸分子、以及在一些情形中至少約十億個核酸分子、或更多。給定珠的核酸分子可以包括相同的（或共同的）序列、不同的序列或二者的組合。給定珠的核酸分子可以包括核酸分子的多個組。給定組的核酸分子可以包括相同的條碼序列。相同的條碼序列可以與另一組中核酸分子的條碼序列不同。
此外，當珠的群體被分區時，所得分區的群體還可以包括多樣的條碼文庫，所述文庫包括至少約1,000個不同的條碼序列、至少約5,000個不同的條碼序列、至少約10,000個不同的條碼序列、至少約50,000個不同的條碼序列、至少約100,000個不同的條碼序列、至少約1,000,000個不同的條碼序列、至少約5,000,000個不同的條碼序列、或至少約10,000,000個不同的條碼序列。另外，群體中的每個分區可以包括至少約1,000個核酸分子、至少約5,000個核酸分子、至少約10,000個核酸分子、至少約50,000個核酸分子、至少約100,000個核酸分子、至少約500,000個核酸分子、至少約1,000,000個核酸分子、至少約5,000,000個核酸分子、至少約10,000,000個核酸分子、至少約50,000,000個核酸分子、至少約100,000,000個核酸分子、至少約250,000,000個核酸分子以及在一些情形中至少約十億個核酸分子。
在一些情形中，可以期望在給定分區內摻入多種不同的條碼，它們附接至所述分區內的單一珠或多個珠。例如，在一些情形中，混合但已知組的條碼序列可以在後續加工中提供更多的鑒定保證，例如，通過提供條碼至給定分區的更強定址或歸屬，作為來自給定分區的輸出的重複或獨立確認。
核酸分子（例如，寡核苷酸）是可在將特定刺激施加至珠後從珠釋放的。在一些情形中，所述刺激可以是光刺激，例如，通過光不穩定連接的切割，其釋放所述核酸分子。在其他情形中，可以使用熱刺激，其中珠環境的溫度的升高將導致連接的切割或核酸分子從珠的其他釋放。在仍其他情形中，可以使用化學刺激，其切割核酸分子與珠的連接，或者以其他方式導致從珠釋放核酸分子。在一個情形中，這樣的組合物包括上述用於生物顆粒的封裝的聚丙烯醯胺基質，並且可以通過暴露於還原劑如DTT而被降解用於附接的核酸條碼分子的釋放。 用於受控分區的系統和方法
在一些態樣，提供用於受控分區的系統和方法。液滴大小可以通過調整通道架構（例如，微流體通道架構）中的某些幾何特徵來控制。例如，通道的擴張角、寬度和/或長度可以被調整以控制液滴大小。圖6顯示用於將珠受控分區至離散液滴中的微流體通道結構的例子。通道結構600可以包括在通道交匯點606（或交叉點）處與儲器604連通的通道區段602。儲器604可以是室。對如本文所用的“儲器”的任何提及也可以是指“室”。在操作中，包括懸浮珠612的水性流體608可以沿通道區段602被輸送至交匯點606中以與儲器604中與水性流體608不混溶的第二流體610相遇，以產生流動至儲器604中的水性流體608的液滴616、618。在水性流體608與第二流體610相遇的交匯點606處，可以基於諸如以下的因素形成液滴：在交匯點606處的流體動力、兩個流體608、610的流速、流體特性以及通道結構600的某些幾何參數（例如，w、h 0、α等）。通過將水性流體608從通道區段602連續注射通過交匯點606，可以在儲器604中收集多個液滴。所生成的離散液滴可以包括珠（例如，如在被佔據的液滴616中）。可替代地，所生成的離散液滴可以包括超過一個珠。可替代地，所生成的離散液滴無法包括任何珠（例如，如在未被佔據的液滴618中）。在一些情況下，所生成的離散液滴可以含有一個或多個生物顆粒，如本文其他地方所述。在一些情況下，所生成的離散液滴可以包括一種或多種試劑，如本文其他地方所述。
在一些情況下，水性流體608可以具有基本均勻的珠612的濃度或頻率。珠612可以從單獨通道（圖6中未顯示）被引入通道區段602中。珠612在通道區段602中的頻率可以通過控制珠612被引入通道區段602中的頻率和/或通道區段602和單獨通道中流體的相對流速來控制。在一些情況下，珠可以從多個不同的通道被引入通道區段602中，並且可以相應地控制頻率。
在一些情況下，通道區段602中的水性流體608可以包括生物顆粒（例如，參考圖5所述）。在一些情況下，水性流體608可以具有基本均勻的生物顆粒的濃度或頻率。關於珠，生物顆粒（例如，標記的B工程化細胞、記憶B細胞或漿細胞）可以從單獨通道被引入通道區段602中。生物顆粒在通道區段602中的水性流體608中的頻率或濃度可以通過控制生物顆粒被引入通道區段602中的頻率和/或通道區段602和單獨通道中的流體的相對流速來控制。在一些情況下，生物顆粒可以從多個不同的通道被引入通道區段602中，並且可以相應地控制頻率。在一些情況下，第一單獨通道可以引入珠，並且第二單獨通道可以將生物顆粒引入通道區段202中。引入珠的第一單獨通道可以位於引入生物顆粒的第二單獨通道的上游或下游。
第二流體610可以包括油，如氟化油，所述油包括用於穩定所得液滴、例如抑制所得液滴的後續聚結的含氟表面活性劑。
在一些情況下，第二流體610無法經歷和/或被引導至進入或離開儲器604的任何流動。例如，第二流體610可以在儲器604中是基本上靜止的。在一些情況下，第二流體610可以經歷在儲器604內、但是並非進入或離開儲器604的流動，如通過將壓力施加至儲器604和/或如受到水性流體608在交匯點606處的進入流動的影響。可替代地，第二流體610可以經歷和/或被引導至進入或離開儲器604的流動。例如，儲器604可以是將第二流體610從上游引導至下游的通道，從而輸送所生成的液滴。
在交匯點606處或附近的通道結構600可以具有至少部分決定通過通道結構600形成的液滴的大小的某些幾何特徵。通道區段602可以在交匯點606處或附近具有高度h 0和寬度w。舉例來說，通道區段602可以包括矩形橫截面，其導致儲器604具有更寬的橫截面（如寬度或直徑）。可替代地，通道區段602的橫截面可以是其他形狀，如圓形、梯形、多邊形或任何其他形狀。在交匯點606處或附近的儲器604的頂壁和底壁可以以擴張角α傾斜。擴張角α允許舌部（水性流體608中在交匯點606處離開通道區段602並在液滴形成之前進入儲器604的部分）增加深度，並有助於減小中間形成的液滴的曲率。液滴大小可以隨擴張角增加而降低。所得液滴半徑R d可以通過上文所提及的h 0、w和α的幾何參數的以下等式來預測：
Figure 02_image001
用於受控分區的系統和方法進一步描述於WO 2019040637中，其通過引用以其整體特此併入。
本文所述的方法和系統可以用於顯著提高單細胞應用和/或接受基於液滴的輸入的其他應用的效率。
可以進行的後續操作可以包括擴增產物的生成、純化（例如，通過固相可逆固定（SPRI））、進一步加工（例如，剪切、功能序列的連接和後續擴增（例如，通過PCR））。這些操作可以批量（例如，在分區外部）進行。在分區是乳液中的液滴的情形中，乳液可以被破壞，並且可以合併液滴的內容物用於另外的操作。可以與帶有條碼的珠共分區的另外的試劑可以包括用於阻斷核糖體RNA（rRNA）的寡核苷酸和用於消化來自細胞的基因組DNA的核酸酶。可替代地，可以在另外的加工操作期間應用rRNA去除劑。通過這樣的方法生成的構建體的組態可有助於最小化（或避免）對定序期間的多聚T序列和/或多核苷酸序列的5'端序列的定序。擴增產物（例如，第一擴增產物和/或第二擴增產物）可以經歷用於序列分析的定序。在一些情形中，擴增可以使用部分髮卡擴增定序（PHASE）方法來進行。
多種應用需要對生物顆粒群體內不同生物顆粒或生物體類型的存在和定量的評價，包括例如微生物組分析和表徵、環境測試、食品安全性測試、流行病學分析（例如在追蹤污染中）等。
包括與條碼分子締合的條碼珠（例如，凝膠珠）和封裝細胞成分如細胞核酸的珠（例如，細胞珠）的分區可以用於成分分析中，如在美國專利公開號2018/0216162中所述。 樣品和細胞加工
樣品可以源自任何有用的來源，包括任何受試者，如人受試者。樣品可以包括來自一種或多種不同來源、如一個或多個不同受試者的材料（例如，一個或多個細胞）。可以獲得多個樣品用於如本文所述的分析，如來自單一受試者的多個樣品（例如，以相同或不同方式從相同或不同身體位置獲得和/或在相同或不同時間（例如，相隔數秒、數分鐘、數小時、數天、數週、數月或數年）獲得的多個樣品），或者來自不同受試者的多個樣品。例如，第一樣品可以在第一時間從受試者獲得，並且第二樣品可以在所述第一時間之後的第二時間從所述受試者獲得。第一時間可以在受試者經歷治療方案或程序（例如，以解決疾病或病症）之前，並且第二時間可以在受試者經歷治療方案或程序期間或之後。在另一例子中，第一樣品可以從受試者的第一身體位置或系統獲得（例如，使用第一收集技術），並且第二樣品可以從所述受試者的第二身體位置或系統獲得（例如，使用第二收集技術），所述第二身體位置或系統可以與第一身體位置或系統不同。在另一例子中，多個樣品可以在同一時間從相同或不同的身體位置從受試者獲得。不同的樣品，如從同一受試者的不同身體位置、在不同時間、從多個不同受試者和/或使用不同的收集技術收集的不同樣品，可以經歷相同或不同的加工（例如，如本文所述）。例如，第一樣品可以經歷第一加工方案，並且第二樣品可以經歷第二加工方案。
樣品可以是生物樣品，如細胞樣品（例如，如本文所述）。樣品可以包括一種或多種生物顆粒，如一種或多種細胞和/或細胞成分，如一個或多個細胞核。例如，樣品可以包括多種細胞和/或細胞成分。樣品的組分（例如，細胞或細胞成分，如細胞核）可以具有單一類型或多個不同類型。例如，樣品的細胞可以包括一個或多個不同類型的血細胞。
生物樣品可以包括具有不同尺寸和特徵的多種細胞。在一些情形中，生物樣品的加工，如細胞分離和分選（例如，如本文所述），可以通過耗盡具有某些特徵和尺寸的細胞和/或分離具有某些特徵和尺寸的細胞來影響樣品中包括的尺寸分佈和細胞特徵。
在用於分析的製備中（例如，如本文所述），樣品可以經歷一個或多個過程，包括但不限於過濾、選擇性沈澱、純化、離心、透化、分離、攪拌、加熱和/或其他過程。例如，樣品可以被過濾以去除污染物或其他材料。在一個例子中，過濾過程可以包括微流體的使用（例如，以分離不同大小、類型、電荷或其他特徵的生物顆粒）。
在一個例子中，包括一個或多個細胞的樣品可以被加工以將所述一個或多個細胞與樣品中的其他材料分離（例如，使用離心和/或另一過程）。在一些情形中，樣品的細胞和/或細胞成分可以被加工以分離和/或分選細胞和/或細胞成分的組，例如以分離和/或分選不同類型的細胞和/或細胞成分。細胞分離的例子包括但不限於將白細胞或免疫細胞與其他血細胞和組分分離、將循環腫瘤細胞從血液分離以及將細菌與身體細胞和/或環境物質分離。分離過程可以包括陽性選擇過程（例如，靶向目的細胞類型以供保留用於後續下游分析，如通過使用靶向目的細胞類型的表面標記的單株抗體）、陰性選擇過程（例如，去除一種或多種細胞類型並保留一種或多種其他目的細胞類型）和/或耗盡過程（例如，從樣品去除單一細胞類型，如從外周血單個核細胞去除紅細胞）。
一種或多種不同類型的細胞的分離可以包括例如離心、過濾、基於微流體的分選、流式細胞術、螢光啟動細胞分選（FACS）、磁性啟動細胞分選（MACS）、浮力啟動細胞分選（BACS）或任何其他有用方法。例如，流式細胞術方法可以用於基於諸如以下的參數來檢測細胞和/或細胞成分：大小、形態或蛋白質表現。基於流式細胞術的細胞分選可以包括將樣品注射至鞘液中，其將樣品的細胞和/或細胞成分每次一個地運送至測量區中。在測量區中，光源如雷射器可以詢問細胞和/或細胞成分，並且散射光和/或螢光可以被檢測並被轉化為數位信號。噴嘴系統（例如，振動噴嘴系統）可以用於生成包括單獨細胞和/或細胞成分的液滴（例如，水性液滴）。包括目的細胞和/或細胞成分（例如，如通過光學檢測所確定）的液滴可以用電荷來標記（例如，使用帶電荷的環），所述電荷可以用於將這樣的液滴與包括其他細胞和/或細胞成分的液滴分離。例如，FACS可以包括用螢光標記（例如，使用內部和/或外部生物標記）來標記細胞和/或細胞成分。然後，細胞和/或細胞成分可以逐個被測量和鑒定，並且基於標記的發射的螢光或其不存在進行分選。MACS可以使用微米級或奈米級磁性顆粒結合至細胞和/或細胞成分（例如，經由與細胞表面標記的抗體相互作用）以促進目的細胞和/或細胞成分與樣品的其他組分的磁性分離（例如，使用基於柱的分析）。BACS可以使用用針對目的靶細胞的抗體標記的微泡（例如，玻璃微泡）。偶聯至微泡的細胞和/或細胞組分可以漂浮至溶液的表面，從而將靶細胞和/或細胞組分與樣品的其他組分分離。細胞分離技術可以用於富集目的細胞的群體（例如，在分區之前，如本文所述）。例如，包括包含給定類型的多個細胞的多個細胞的樣品可以經歷陽性分離過程。給定類型的多個細胞可以用螢光標記（例如，基於表現的細胞表面標記或另一標記）並且經歷FACS過程以將這些細胞與所述多個細胞中的其他細胞分離。然後所選細胞可以經歷後續基於分區的分析（例如，如本文所述）或其他下游分析。螢光標記可以在這樣的分析之前被去除或者可以被保留。螢光標記可以包括鑒定特徵，如核酸條碼序列和/或唯一分子識別字。
在另一例子中，包括包含給定類型的第一多個細胞的第一多個細胞的第一樣品（例如，表現特定標記或標記組合的免疫細胞）和包括包含給定類型的第二多個細胞的第二多個細胞的第二樣品可以經歷陽性分離過程。第一和第二樣品可以從相同或不同受試者、以相同或不同的類型、從相同或不同的身體位置或系統、使用相同或不同的收集技術來收集。例如，第一樣品可以來自第一受試者，並且第二樣品可以來自與所述第一受試者不同的第二受試者。第一樣品的第一多個細胞可以被提供配置為標記給定類型的第一多個細胞的第一多個螢光標記。第二樣品的第二多個細胞可以被提供配置為標記給定類型的第二多個細胞的第二多個螢光標記。第一多個螢光標記可以包括第一鑒定特徵，如第一條碼，而第二多個螢光標記可以包括與所述第一鑒定特徵不同的第二鑒定特徵，如第二條碼。第一多個螢光標記和第二多個螢光標記可以在用相同的激發源（例如，光源，如雷射器）激發後以相同的強度且在相同的波長範圍內發螢光。第一和第二樣品然後可以被組合並經歷FACS過程，以基於標記給定類型的第一多個細胞的第一多個螢光標記和標記給定類型的第二多個細胞的第二多個螢光標記將給定類型的細胞與其他細胞分離。可替代地，第一和第二樣品可以經歷單獨的FACS過程，並且然後來自第一樣品的給定類型的陽性選擇的細胞和來自第二樣品的給定類型的陽性選擇的細胞可以被組合用於後續分析。不同螢光標記的編碼的鑒定特徵可以用於鑒定源自第一樣品的細胞和源自第二樣品的細胞。例如，第一和第二鑒定特徵可以配置為與核酸條碼分子（例如，如本文所述）相互作用（例如，在分區中，如本文所述），以生成可使用例如核酸定序檢測的條碼化的核酸產物。 多重化方法
在本公開文本的一些實施例中，本文所述的方法的步驟 (a) 和 (b) 是以多重形式來進行。例如，在一些實施例中，本文公開的方法的步驟 (a) 可以包括在多個分區的另外的分區中單獨地分區多個細胞的另外的單細胞（例如，B細胞），並且步驟 (b) 還可以包括確定編碼由另外的細胞（例如，B細胞）產生的抗體或其抗原結合片段的核酸序列的全部或一部分。
因此，在一些實施例中，本公開文本提供用於多重化以及以其他方式增加用於分析的樣品的通量的方法和系統。例如，單一或集成過程工作流可以允許更多或多種分析物的加工、鑒定和/或分析、更多或多種類型的分析物和/或更多或多種類型的分析物表徵。例如，在本文所述的方法和系統中，能夠結合至或以其他方式偶聯至一種或多種細胞或細胞特徵的一種或多種標記劑可以用於表徵細胞和/或細胞特徵。在一些情況下，細胞特徵包括細胞表面特徵。細胞表面特徵可以包括但不限於受體、抗原或抗原片段（例如，結合至位於細胞表面上的抗原結合分子的抗原或抗原片段）、表面蛋白、跨膜蛋白、分化蛋白簇、蛋白質通道、蛋白質泵、載體蛋白、磷脂、糖蛋白、糖脂、細胞間相互作用蛋白複合物、抗原呈遞複合物、主要組織相容複合物、T細胞受體、B細胞受體、嵌合抗原受體、間隙連接、黏著連接或其任何組合。在一些情況下，細胞特徵可以包括細胞內分析物，如蛋白質、蛋白質修飾（例如，磷酸化狀態或其他轉譯後修飾）、核蛋白、核膜蛋白或其任何組合。標記劑可以包括但不限於蛋白質、肽、抗體（或其表位結合片段）、抗原、抗原片段、親脂部分（如膽固醇）、細胞表面受體結合分子、受體配體、小分子、雙特異性抗體、B細胞受體接合器、pro-body、適配體、單抗體（monobody）、affimer、Darpin和蛋白質支架或其任何組合。標記劑可以包括（例如，附接至）指示與結合基團結合的細胞表面特徵的報告寡核苷酸。例如，報告寡核苷酸可以包括允許鑒定標記劑的條碼序列。例如，對一種類型的細胞特徵（例如，第一細胞表面特徵）具有特異性的標記劑可以具有與其偶聯的第一報告寡核苷酸，而對不同細胞特徵（例如，第二細胞表面特徵）具有特異性的標記劑可以具有與其偶聯的不同報告寡核苷酸。對於示例性標記劑、報告寡核苷酸和使用方法的描述，參見例如，美國專利10,550,429；美國專利公開20190177800；以及美國專利公開20190367969。
在特定例子中，可以提供潛在細胞特徵標記劑的庫，其中各自的細胞特徵標記劑與核酸報告分子締合，使得不同報告寡核苷酸序列與能夠結合至特定細胞特徵的每種標記劑締合。在其他態樣，所述庫的不同成員可以通過不同寡核苷酸序列標記的存在來表徵。例如，能夠結合至第一蛋白的抗體可以具有與其締合的第一報告寡核苷酸序列，而能夠結合至第二蛋白的抗體（其可以是相同抗體）可以具有不同的（或另外的，如果是相同抗體）與其締合的一個或多個報告寡核苷酸序列。一個或多個特定寡核苷酸序列的存在可以指示特定抗體或可以被所述特定抗體識別或結合的細胞特徵的存在。
能夠結合至或以其他方式偶聯至一個或多個細胞的標記劑可以用於表徵如屬於特定細胞組的細胞。例如，標記劑可以用於標記細胞樣品，例如，以提供樣品指標。對於其他例子，標記劑可以用於標記屬於特定實驗條件的細胞組。以此方式，細胞組可以被標記為與另一細胞組不同。在一個例子中，第一細胞組可以源自第一樣品，並且第二細胞組可以源自第二樣品。標記劑可以允許第一組和第二組具有不同標記劑（或與標記劑締合的報告寡核苷酸）。這可以例如促進多重化，其中第一組的細胞和第二組的細胞可以單獨標記，然後合併在一起用於下游分析。標記的下游檢測可以指示分析物為屬於特定組。
例如，報告寡核苷酸可以被連接至抗體或其表位結合片段，並且標記細胞可以包括使抗體連接的條碼分子或表位結合片段連接的條碼分子經歷適合於使抗體結合至細胞表面上存在的分子的條件。抗體或其表位結合片段與表面上存在的分子之間的結合親和力可以在所需範圍內，以確保抗體或其表位結合片段保持結合至分子。例如，結合親和力可以在所需範圍內以確保抗體或其表位結合片段在各個樣品加工步驟（如分區和/或核酸擴增或延伸）期間保持結合至分子。抗體或其表位結合片段與其結合的分子之間的解離常數（Kd）可以為小於約100 μM、90 μM、80 μM、70 μM、60 μM、50 μM、40 μM、30 μM、20 μM、10 μM、9 μM、8 μM、7 μM、6 μM、5 μM、4 μM、3 μM、2 μM、1 μM、900 nM、800 nM、700 nM、600 nM、500 nM、400 nM、300 nM、200 nM、100 nM、90 nM、80 nM、70 nM、60 nM、50 nM、40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、900 pM、800 pM、700 pM、600 pM、500 pM、400 pM、300 pM、200 pM、100 pM、90 pM、80 pM、70 pM、60 pM、50 pM、40 pM、30 pM、20 pM、10 pM、9 pM、8 pM、7 pM、6 pM、5 pM、4 pM、3 pM、2 pM或1 pM。例如，解離常數可以小於約10 μM。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段具有所需解離速率常數（koff），使得抗體或其抗原結合片段在各個樣品加工步驟期間保持結合至靶抗原或抗原片段。
在另一例子中，報告寡核苷酸可以偶聯至細胞穿膜肽（CPP），並且標記細胞可以包括將CPP偶聯的報告寡核苷酸遞送至生物顆粒中。標記生物顆粒可以包括通過細胞穿膜肽將CPP綴合的寡核苷酸遞送至細胞和/或細胞珠中。可以用於本文提供的方法中的CPP可以包括至少一個非功能半胱胺酸殘基，所述殘基可以是游離的或被衍生以形成與寡核苷酸的二硫連接，所述寡核苷酸已經針對這樣的連接進行修飾。可以用於本文的實施例中的CPP的非限制性例子包括穿透素、轉運肽、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS和MAP。可用于本文提供的方法中的細胞穿膜肽可以具有針對細胞群中至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的細胞誘導細胞穿透的能力。CPP可以是富精胺酸肽轉運蛋白。CPP可以是穿透素或Tat肽。在另一例子中，報告寡核苷酸可以偶聯至螢光團或染料，並且標記細胞可以包括使螢光團連接的條碼分子經歷適合於使螢光團結合至細胞表面的條件。在一些情況下，螢光團可以與脂質雙層強相互作用，並且標記細胞可以包括使螢光團連接的條碼分子經歷使得螢光團結合至細胞的膜或插入細胞的膜中的條件。在一些情形中，螢光團是水溶性的有機螢光團。在一些情況下，螢光團是Alexa 532馬來醯亞胺、四甲基羅丹明-5-馬來醯亞胺（TMR馬來醯亞胺）、BODIPY-TMR馬來醯亞胺、磺基-Cy3馬來醯亞胺、Alexa 546羧酸/琥珀醯亞胺基酯、Atto 550馬來醯亞胺、Cy3羧酸/琥珀醯亞胺基酯、Cy3B羧酸/琥珀醯亞胺基酯、Atto 565生物素、磺基羅丹明B、Alexa 594馬來醯亞胺、Texas Red馬來醯亞胺、Alexa 633馬來醯亞胺、Abberior STAR 635P迭氮化物、Atto 647N馬來醯亞胺、Atto 647 SE或磺基-Cy5馬來醯亞胺。對於有機螢光團的描述，參見例如，Hughes L D,等人 PLoS One. 2014年2月4日; 9(2):e87649。
報告寡核苷酸可以偶聯至親脂分子，並且標記細胞可以包括通過親脂分子將核酸條碼分子遞送至細胞的膜或核膜。親脂分子可以與脂質膜如細胞膜和核膜締合和/或插入其中。在一些情形中，所述插入可以是可逆的。在一些情形中，親脂分子與細胞膜或核膜之間的締合可以使得所述膜在後續加工（例如，分區、細胞透化、擴增、合併等）期間保留親脂分子（例如，及其相關組分，如核酸條碼分子）。報告核苷酸可以進入細胞內空間和/或細胞核中。在一些實施例中，偶聯至親脂分子的報告寡核苷酸將經由親脂分子保持與脂質膜締合和/或插入脂質膜中（如本文所述），直至發生細胞裂解，例如，在分區內部。偶聯至報告寡核苷酸的親脂分子的示例性實施例描述於PCT/US2018/064600中。
報告寡核苷酸可以是核酸分子的一部分，其包括任何數量的功能序列，如本文其他地方所述，如靶標捕獲序列、隨機引子序列等，並且偶聯至作為或源自分析物的另一核酸分子。
在分區之前，所述細胞可以與標記劑的庫一起孵育，所述標記劑可以是針對不同細胞特徵（例如，受體、蛋白質等）的大組的標記劑，並且其包括其相關報告寡核苷酸。未結合的標記劑可以從細胞被洗滌，然後所述細胞可以與如本文其他地方所述的分區特異性條碼寡核苷酸（例如，附接至支持物，如珠或凝膠珠）一起共分區（例如，至液滴或孔中）。因此，分區可以包括一個或多個細胞，以及結合的標記劑及其已知的相關報告寡核苷酸。
在其他情況下，例如，為了促進樣品多重化，對特定細胞特徵具有特異性的標記劑可以具有偶聯至第一報告寡核苷酸的第一多個標記劑（例如，抗體或親脂部分）和偶聯至第二報告寡核苷酸的第二多個標記劑。例如，第一多個標記劑和第二多個標記劑可以與不同細胞、細胞群或樣品相互作用，從而允許特定報告寡核苷酸指示特定細胞群（或細胞或樣品）和細胞特徵。以此方式，不同的樣品或組可以被獨立加工，隨後合併在一起用於合併分析（例如，如本文其他地方所述的基於分區的條碼化）。參見例如，美國專利公開20190323088。
在一些實施例中，為了促進樣品多重化，單獨樣品可以用脂質標籤如膽固醇修飾的寡核苷酸（CMO，參見例如，圖11）、抗鈣通道抗體或抗ACTB抗體來染色。抗鈣通道抗體的非限制性例子包括抗KCNN4抗體、抗BK通道β3抗體、抗a1B鈣通道抗體和抗CACNA1A抗體。適合於本公開文本的方法的抗ACTB抗體的例子包括但不限於mAbGEa、ACTN05、AC-15、15G5A11/E2、BA3R和HHF35。
如本文其他地方所述，標記劑的庫可以與特定細胞特徵相關，以及用於將分析物鑒定為源自特定細胞群或樣品。細胞群可以與多個庫一起孵育，使得一個或多個細胞包括多種標記劑。例如，細胞可以包括與其偶聯的親脂標記劑和抗體。親脂標記劑可以表明細胞是特定細胞樣品的成員，而抗體可以表明細胞包括特定分析物。以此方式，報告寡核苷酸和標記劑可以允許進行多分析物、多重化分析。
在一些情況下，這些報告寡核苷酸可以包括允許鑒定與報告寡核苷酸偶聯的標記劑的核酸條碼序列。使用寡核苷酸作為報告物可以提供以下優點：能夠生成在序列方面的顯著多樣性，同時還可容易地附接至大多數生物分子例如抗體等，以及易於被檢測，例如，使用定序或陣列技術。
報告寡核苷酸與標記劑的附接（偶聯）可以通過多種直接或間接、共價或非共價締合或附接中的任一種來實現。例如，報告寡核苷酸可以共價附接至標記劑（如蛋白質，例如，抗原或抗原片段、抗體或抗體片段）的一部分，例如，經由接頭，使用化學綴合技術（例如，可從Innova Biosciences獲得的Lightning-Link®抗體標記套組），以及其他非共價附接機制，例如，使用生物素化抗體（或生物素化抗原，或生物素化抗原片段）和寡核苷酸（或偶聯至寡核苷酸的包括一個或多個生物素化接頭的珠）和抗生物素蛋白、呈單體或多聚形式的鏈黴親和素接頭（例如，四聚形式的鏈黴親和素）。熟習此項技術者將認識到，鏈黴親和素單體涵蓋具有1個生物素結合位點的鏈黴親和素分子，而鏈黴親和素多聚體涵蓋具有超過1個生物素結合位點的鏈黴親和素分子。例如，鏈黴親和素四聚體具有4個生物素結合位點。然而，熟習此項技術者還將認識到，在鏈黴親和素四聚體中，4個鏈黴親和素不一定複合在一起。抗體和寡核苷酸生物素化技術是可用的。參見例如，Fang等人, “Fluoride-Cleavable Biotinylation Phosphoramidite for 5′-end-Labelling and Affinity Purification of Synthetic Oligonucleotides”, Nucleic Acids Res. 2003年1月15日; 31(2):708-715。同樣，蛋白質和肽生物素化技術已經被開發並且可易於獲得。參見例如，美國專利號6,265,552。此外，點擊反應化學可以用於將報告寡核苷酸偶聯至標記劑，如用於點擊化學的5'迭氮化物寡核苷酸和炔烴-NHS、用於HyNic-4B化學的4'-胺基寡核苷酸、甲基四嗪-PEG5-NHS酯反應、TCO-PEG4-NHS酯反應、應變促進的炔烴-迭氮化物環加成（SPAAC）等。市售套組如來自Thunderlink和Abcam的那些以及本領域中常用的技術可以視情況用於將報告寡核苷酸偶聯至標記劑。在另一例子中，標記劑被間接（例如，通過雜交）偶聯至包括鑒定標記劑的條碼序列的報告寡核苷酸。例如，標記劑可以被直接偶聯（例如，共價偶聯）至包括與報告寡核苷酸的序列雜交的序列的雜交寡核苷酸。雜交寡核苷酸與報告寡核苷酸的雜交將標記劑偶聯至報告寡核苷酸。在一些實施例中，報告寡核苷酸是可從標記劑釋放的，如在施加刺激後。例如，報告寡核苷酸可以經由不穩定鍵（例如，化學不穩定、光不穩定、熱不穩定等）被附接至標記劑，如本文其他地方針對從支持物釋放分子所大體描述。在一些情況下，本文所述的報告寡核苷酸可以包括可以用於後續加工中的一個或多個功能序列，如銜接子序列、唯一分子識別字（UMI）序列、定序儀專用流動池附接序列（如P5、P7或者部分P5或P7序列）、引子或引子結合序列、定序引子或引子結合序列（如R1、R2或者部分R1或R2序列）。
在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為單體存在。在一些情形中，標記劑是作為多聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為二聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為三聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為四聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為五聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為六聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為七聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為八聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為九聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為十聚體存在。在一些情形中，標記劑（例如，抗原、抗原片段、抗體、抗體片段）是作為10+聚體存在。
在一些情形中，標記劑可以包括報告寡核苷酸和標記。標記可以是螢光團、放射性同位素、能夠進行比色反應的分子、磁性顆粒或能夠檢測的任何其他合適的分子或化合物。標記可以直接或間接被綴合至標記劑（或報告寡核苷酸）（例如，標記可以被綴合至可以結合至標記劑或報告寡核苷酸的分子）。在一些情形中，標記被綴合至與報告寡核苷酸的序列互補的寡核苷酸，並且寡核苷酸可以被允許與報告寡核苷酸雜交。
圖11描述包括附接至其的報告寡核苷酸（1140）的示例性標記劑（1110、1120、1130）。標記劑1110（例如，任何本文所述的標記劑）被附接（直接地，例如，共價附接，或間接地）至報告寡核苷酸1140。報告寡核苷酸1140可以包括鑒定標記劑1110的條碼序列1142。報告寡核苷酸1240還可以包括可以用於後續加工中的一個或多個功能序列1143，如銜接子序列、唯一分子識別字（UMI）序列、定序儀專用流動池附接序列（如P5、P7或者部分P5或P7序列）、引子或引子結合序列或者定序引子或引子結合序列（如R1、R2或者部分R1或R2序列）。
參考圖11，在一些情況下，綴合至標記劑（例如，1110、1120、1130）的報告寡核苷酸1140包括功能序列1141、鑒定標記劑（例如，1110、1120、1130）的報告條碼序列1142和報告捕獲手柄1143。報告捕獲手柄序列1143可以配置為雜交至互補序列，如核酸條碼分子上存在的互補序列（未顯示），如本文其他地方（例如，圖7、圖8、圖12和圖13）所述的那些。在一些情況下，核酸條碼分子被附接至支持物（例如，珠，如凝膠珠），如本文其他地方所述的那些。例如，核酸條碼分子1190可以經由可釋放連接（例如，包括不穩定鍵）（如本文其他地方（例如，圖7、圖8、圖12和圖13）所述的那些）被附接至支持物。在一些情況下，報告寡核苷酸1140包括一個或多個另外的功能序列，如上文所述的那些。
在一些情況下，標記劑1110是包括報告寡核苷酸1140的蛋白質或多肽（例如，抗原或預期抗原）。報告寡核苷酸1140包括鑒定多肽1110並且可以用於推知分析物（例如，多肽1110的結合配偶體（即，多肽1110可以結合的分子或化合物））的存在的報告條碼序列1142。在一些情況下，標記劑1110是包括報告寡核苷酸1140的親脂部分（例如，膽固醇），其中所述親脂部分被選擇使得標記劑1110整合至細胞或核的膜中。報告寡核苷酸1140包括鑒定親脂部分1110的報告條碼序列1142，其在一些情況下用於對細胞（例如，細胞組、細胞樣品等）加標籤，並且可以用於如本文其他地方所述的多重分析。在一些情況下，標記劑是包括報告寡核苷酸1140的抗體1120（或其表位結合片段）。報告寡核苷酸1140包括鑒定抗體1120並且可以用於推知例如抗體1120的靶標（即，抗體1120結合的分子或化合物）的存在的報告條碼序列1142。在其他實施例中，標記劑1130包括MHC分子1131，其包括肽1132和鑒定肽1132的報告寡核苷酸1140。在一些情況下，MHC分子被偶聯至支持物1133。在一些情況下，支援物1133可以是多肽如鏈黴親和素，或多糖如葡聚糖。在一些情況下，報告寡核苷酸1140可以以任何合適的方式被直接或間接偶聯至MHC標記劑1130。例如，報告寡核苷酸1140可以被偶聯至MHC分子1131、支援物1133或肽1132。在一些實施例中，標記劑1130包括多個MHC分子（例如是MHC多聚體，其可以偶聯至支援物（例如，1133））。可以與本文所公開的組合物、方法和系統一起使用的I類和/或II類MHC多聚體存在許多可能的組態，例如，MHC四聚體、MHC五聚體（經由捲曲螺旋結構域組裝的MHC，例如，Pro5® MHC I類五聚體（ProImmune, Ltd.））、MHC八聚體、MHC十二聚體、MHC修飾的葡聚糖分子（例如，MHC Dextramer®（Immudex））等。對於示例性標記劑（包括基於抗體和MHC的標記劑）、報告寡核苷酸和使用方法的描述，參見例如，美國專利10,550,429和美國專利公開20190367969。
附接至支持物（例如，珠）的示例性條碼分子顯示于圖12中。在一些實施例中，對多種分析物（例如，RNA和使用本文所述的標記劑的一種或多種分析物）的分析可以包括如圖12中大體描繪的核酸條碼分子。在一些實施例中，核酸條碼分子1210和1220經由如本文其他地方所述的可釋放連接1240（例如，包括不穩定鍵）被附接至支持物1230。核酸條碼分子1210可以包括功能序列1211、條碼序列1212和捕獲序列1213。核酸條碼分子1220可以包括銜接子序列1221、條碼序列1212和銜接子序列1223，其中銜接子序列1223包括與銜接子序列1213不同的序列。在一些情況下，銜接子1211和銜接子1221包括相同序列。在一些情況下，銜接子1211和銜接子1221包括不同序列。儘管顯示支援物1230包括核酸條碼分子1210和1220，但在本文中考慮任何合適數量的條碼分子，包括共有條碼序列1212。例如，在一些實施例中，支持物1230還包括核酸條碼分子1250。核酸條碼分1350可以包括銜接子序列1251、條碼序列1212和銜接子序列1253，其中銜接子序列1253包括與銜接子序列1313和1223不同的序列。在一些情況下，核酸條碼分子（例如，1210、1220、1250）包括一個或多個另外的功能序列，如UMI或本文所述的其他序列。核酸條碼分子1210、1220或1250可以與如本文其他地方所述的分析物相互作用，例如，如圖13A-圖13C中所描繪。
參考圖13A，在細胞被標記劑標記的情況下，捕獲序列1323可以與報告寡核苷酸的銜接子序列互補。細胞可以與一個或多個報告寡核苷酸1320綴合的標記劑1310（例如，多肽，如抗原、抗體或本文其他地方所述的其他多肽）接觸。在一些情形中，細胞可以在條碼化之前被進一步加工。例如，這樣的加工步驟可以包括一個或多個洗滌和/或細胞分選步驟。在一些情況下，與綴合至報告寡核苷酸1320和包括核酸條碼分子1390的支持物1330（例如，珠，如凝膠珠）的標記劑1310結合的細胞被分區至多個分區（例如，液滴乳液的液滴或微孔陣列的孔）中的分區中。在一些情況下，所述分區包括至多結合至標記劑1310的單細胞。在一些情況下，綴合至標記劑1310（例如，多肽，如抗原、抗體、pMHC分子如MHC多聚體等）的報告寡核苷酸1320包括第一銜接子序列1311（例如，引子序列）、鑒定標記劑1310（例如，多肽，如抗原、抗體或者pMHC分子或複合物的肽）的條碼序列1312和捕獲手柄序列1313。捕獲手柄序列1313可以配置為雜交至互補序列，如核酸條碼分子1390（例如，分區特異性條碼分子）上存在的捕獲序列1323。在一些情況下，報告寡核苷酸1320包括一個或多個另外的功能序列，如本文其他地方所述的那些。
條碼化的核酸分子可以從圖13A-圖13C中所述的構建體被生成（例如，經由核酸反應，如核酸延伸、反轉錄或連接）。例如，捕獲手柄序列1313然後可以雜交至互補捕獲序列1323以生成（例如，經由核酸反應，如核酸延伸或連接）包括細胞條碼（例如，共有條碼或分區特異性條碼）序列1322（或其反向互補體）和報告條碼序列1312（或其反向互補體）的條碼化的核酸分子。在一些實施例中，核酸條碼分子1390（例如，分區特異性條碼分子）還包括UMI。條碼化的核酸分子然後可以如本文其他地方所述任選地被加工，例如，以擴增所述分子和/或將定序平臺專用序列附加至所述片段。參見例如，美國專利公開2018/0105808。條碼化的核酸分子或從其生成的衍生物然後可以在合適的定序平臺上進行定序。
在一些情況下，可以進行對多種分析物（例如，使用本文所述標記劑的核酸和一種或多種分析物）的分析。例如，工作流可以包括如圖13A-圖13C中的任一者大體描繪的工作流或用於單獨分析物的工作流的組合，如本文其他地方所述。例如，通過使用如圖13A-圖13C中大體描繪的工作流的組合，可以分析多種分析物。
在一些情況下，對分析物（例如核酸、多肽、碳水化合物、脂質等）的分析包括如圖13A中大體描繪的工作流。核酸條碼分子1390可以與一種或多種分析物一起共分區。在一些情況下，核酸條碼分子1390被附接至支持物1330（例如，珠，如凝膠珠），如本文其他地方所述的那些。例如，核酸條碼分子1390可以經由可釋放連接1340（例如，包括不穩定鍵）被附接至支持物1330，如本文其他地方所述的那些。核酸條碼分子1390可以包括功能序列1321並且任選地包括其他另外的序列，例如，條碼序列1322（例如，共有條碼、分區特異性條碼或本文其他地方所述的其他功能序列）和/或UMI序列。核酸條碼分子1390可以包括可能與另一核酸序列互補的捕獲序列1323，使得其可以與特定序列雜交。
例如，捕獲序列1323可以包括多聚T序列並且可以用於雜交至mRNA。參考圖13C，在一些實施例中，核酸條碼分子1390包括與來自細胞的RNA分子1360的序列互補的捕獲序列1323。在一些情況下，捕獲序列1323包括對RNA分子具有特異性的序列。捕獲序列1323可以包括已知或靶向序列或隨機序列。在一些情況下，可以進行核酸延伸反應，從而生成條碼化的核酸產物，其包括捕獲序列1323、功能序列1321、UMI和/或條碼序列1322、任何其他功能序列以及對應于RNA分子1360的序列。
在另一例子中，捕獲序列1323可以與單鏈突出端或已經附加至分析物的銜接子序列互補。例如，參考圖13B，在一些實施例中，引子1350包括與來自生物顆粒的核酸分子1360（如編碼BCR序列的RNA）的序列互補的序列。在一些情況下，引子1350包括與RNA分子1360不互補的一個或多個序列1351。序列1351可以是如本文其他地方所述的功能序列，例如，銜接子序列、定序引子序列或促進偶聯至定序儀的流動池的序列。在一些情況下，引子1350包括多聚T序列。在一些情況下，引子1350包括與RNA分子中的靶序列互補的序列。在一些情況下，引子1350包括與免疫分子的區域（如BCR序列的恒定區）互補的序列。引子1350與核酸分子1360雜交並生成互補分子1370。例如，互補分子1370可以是在反轉錄反應中生成的cDNA。在一些情況下，另外的序列可以被附加至互補分子1370。例如，反轉錄酶可以被選擇使得幾個未範本化的鹼基1380（例如，多聚C序列）被附加至cDNA。在另一例子中，末端轉移酶也可以用於附加另外的序列。核酸條碼分子1390包括與未範本化的鹼基互補的序列1324，並且反轉錄酶進行範本轉換反應至核酸條碼分子1390上，以生成包括細胞（例如，分區特異性）條碼序列1322（或其反向互補體）和互補分子1370（或其部分）的序列的條碼化的核酸分子。在一些情況下，捕獲序列1323包括與免疫分子的區域（如BCR序列的恒定區）互補的序列。捕獲序列1323被雜交至核酸分子1360並且生成互補分子1370。例如，互補分子1370可以在反轉錄反應中生成，所述反轉錄反應生成包括細胞條碼（例如，共有條碼或分區特異性條碼）序列1322（或其反向互補體）和互補分子1370（或其部分）的序列的條碼化的核酸分子。適合於條碼化從mRNA轉錄物（包括編碼免疫細胞受體的V(D)J區域的那些）生成的cDNA的另外的方法和組合物和/或包括範本轉換寡核苷酸的條碼化方法和組合物描述於國際專利申請WO 2018/075693、美國專利公開號2018/0105808、2015年6月26日提交到美國專利公開號2015/0376609和美國專利公開號2019/0367969中。
在一些實施例中，通過鑒定與單獨樣品相關的突變譜以及將來自單一生物顆粒的序列資料基於其突變譜映射至其來源，來自多個樣品（例如，多個受試者）的生物顆粒（例如，細胞、細胞核）可以被合併、定序和去多重化。參見例如，Xu J.等人, Genome Biology 第20卷, 290 (2019)；Huang Y.等人, Genome Biology 第20卷, 273 (2019)；以及Heaton等人, Nature Methods 第17卷, 第615-620頁(2020)，所述文獻通過引用以其整體特此併入。
基因表現資料可以反映潛在基因組和突變和其中的結構變異體。因此，所捕獲和定序的RNA分子中固有的變異可以用於從頭鑒定基因型，或用於將分子分配至作為已知先驗的基因型。在一些實施例中，由於單體型狀態（包括人白細胞抗原基因座（HLA）、免疫受體基因座（例如，BCR）和基因組的其他高度多態性區域的連鎖不平衡）而存在的等位基因變異也可以用於去多重化。所表現的B細胞受體可以用於推知來自無關個體的種系等位基因，所述資訊可以用於去多重化。 用於檢測SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的方法
如上文所討論，本公開文本的一態樣涉及用於檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在的方法，所述方法包括使如本文所公開的抗體或抗原結合片段與來自被SARS-CoV-2感染或懷疑被SARS-CoV-2感染的個體的生物樣品接觸。例如，本公開文本的抗SARS-CoV-2 S抗體和抗原結合片段可以用於檢測和/或測量樣品中的SARS-CoV，例如，用於診斷目的。
在一些實施例中，所述方法包括 (i) 使如本文所公開的抗體或抗原結合片段與來自被SARS-CoV-2感染或懷疑被SARS-CoV-2感染的個體的生物樣品接觸，(ii) 檢測抗體或抗原結合片段與生物樣品中存在的SARS-CoV-2 S蛋白之間的抗原-抗體複合物的形成。所述抗原-抗體複合物的形成可以通過本領域中已知的一種或多種技術來檢測，如放射免疫測定（RIA）、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、免疫螢光測定（IFA）、斑點印跡或蛋白質印跡。在一些實施例中，抗原-抗體複合物的形成可以通過ELISA、斑點印跡或蛋白質印跡來檢測。
例如，本公開文本（例如，表1）的抗CoV-S抗原結合多肽，例如，抗體或其抗原結合片段，可以用於檢測和/或測量樣品中的CoV-S。用於CoV-S的示例性測定包括但不限於使生物樣品與本公開文本的抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或其抗原結合片段）接觸，其中所述抗CoV-S抗原結合多肽被可檢測標記或報告分子標記或者用作捕獲配體以從生物樣品選擇性分離CoV-S。與CoV-S複合的抗CoV-S抗原結合多肽的存在指示樣品中CoV-S的存在。可替代地，未標記的抗CoV-S抗體可以與本身被可檢測地標記的二抗組合使用。可檢測標記或報告分子可以是放射性同位素，如 3H、 14C、 32P、 35S或 125I；螢光或化學發光部分，如異硫氰酸螢光素或羅丹明；或者酶，如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶或螢光素酶。可以用於檢測或測量樣品中的CoV-S的特定示例性測定包括中和測定、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、放射免疫測定（MA）和螢光啟動細胞分選（FACS）。因此，本公開文本包括用於檢測樣品中刺突蛋白多肽的存在的方法，所述方法包括使所述樣品與抗CoV-S抗原結合多肽接觸和檢測CoV-S/抗CoV-S抗原結合多肽的存在，其中所述複合物的存在指示CoV-S的存在。
原則上，關於適用于本文所述的方法中的生物樣品的類型沒有特別限制。例如，可以合適地用於根據本公開文本的SARS-CoV診斷測定中的樣品包括可從受試者獲得的任何組織或流體樣品，其在正常或病理性條件下含有可檢測量的SARS-CoV刺突蛋白或其片段。在一些實施例中，生物樣品包括痰、支氣管肺泡灌洗、胸腔積液、組織、全血、血清、血漿、頰刮拭物、唾液、腦脊液、尿、糞便、循環腫瘤細胞、循環核酸、骨髓或其任何組合。在一些實施例中，生物樣品包括細胞或組織。例如，生物樣品可以是組織樣品，如活檢物、空芯針穿刺活檢物、針抽吸物或細針抽吸物。在一些實施例中，生物樣品可以是流體樣品，如血樣、尿樣或唾液樣品。在一些實施例中，生物樣品可以是皮膚樣品。在一些實施例中，生物樣品可以是頰拭子。在一些實施例中，生物樣品包括全血和血液組分。
通常，測量從健康受試者（例如，未患與SARS-CoV相關的疾病的受試者）獲得的特定樣品中SARS-CoV刺突蛋白的水準以初步建立SARS-CoV的基線或標準水準。然後可以將MERS-CoV的此基線水準與在懷疑患有SARS-CoV相關病症或與這樣的病症相關的症狀的個體獲得的樣品中測量的SARS-CoV的水準進行比較。
對SARS-CoV刺突蛋白具有特異性的抗體和抗原結合片段可以不含另外的標記或部分，或者它們可以含有N末端或C末端標記或部分。在一些實施例中，所述標記或部分是生物素。在結合測定中，標記（如果存在）的位置可以決定肽相對於所述肽結合於其上的表面的定向。例如，如果表面被抗生物素蛋白塗布，含有N末端生物素的肽將被定向使得所述肽的C末端部分將處於所述表面的遠端。 治療方法
如上文所討論，本公開文本的一態樣涉及用於通過將包含治療有效量的抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）（例如，表1中的）投予至需要這樣的治療或預防的受試者來治療或預防病毒感染（例如，降低病毒感染如冠狀病毒感染的可能性）的方法。在相關態樣，本公開文本的一些實施例涉及用於減少SARS-Co-2V S蛋白與受試者的細胞的結合和/或減少SARS-CoV-2進入受試者的細胞中的方法，所述方法包括向所述受試者投予包含治療有效量的如本文所公開的抗體或抗原結合片段的組合物。在一些實施例中，所述組合物包括至少一種（例如，至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種）如本文所公開的抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，所述組合物包括 (a) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白（例如與所述全長SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基）的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段；(b) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與SARS-CoV-2 S蛋白的NTD的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段；或者 (c) 具有與NTD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白（例如與所述全長SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基）的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段。
本公開文本的治療方法涉及將本公開文本（例如，表1）的抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）投予至患有疾病或感染（例如，病毒感染）的一種或多種體征或症狀的受試者，所述抗原結合多肽在以有效或治療有效量或劑量投予至受試者時對於所述體征或症狀是有效的。抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）（例如，表1的）用於治療或預防病毒感染的有效或治療有效劑量是指所述抗體或片段足以減輕所治療受試者中的感染的一種或多種體征和/或症狀的量，通過誘導這樣的體征和/或症狀的消退或消除或者通過抑制這樣的體征和/或症狀的進展來實現。與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況和症狀包括呼吸道感染，通常在下呼吸道中。因此，本公開文本的一些實施例涉及用於減少與冠狀病毒感染相關的一種或多種體征或症狀的方法，所述體征或症狀例如高燒、乾咳、呼吸短促、肺炎、胃腸道症狀如腹瀉、器官衰竭（腎衰和腎功能不全）、膿毒症休克和嚴重情形中的死亡。在一些實施例中，受試者中冠狀病毒感染的體征或症狀是病毒在受試者體內的存活或增殖，例如，如通過病毒滴度測定（例如，含胚雞蛋中的冠狀病毒繁殖或冠狀病毒刺突蛋白測定）所確定。病毒感染的其他體征和症狀包括但不限於發熱或感覺發熱/發冷、咳嗽、咽喉痛、流鼻涕或鼻塞、打噴嚏、肌肉或身體疼痛、頭痛、疲勞（疲倦）、嘔吐、腹瀉、呼吸道感染、胸痹、呼吸短促、支氣管炎和肺炎。
本公開文本還涵蓋將抗CoV-S抗原結合多肽（例如，本公開文本的（例如，表1的）抗體或其抗原結合片段）預防性地投予至處於病毒感染的風險中的受試者，以防止這樣的感染（例如，降低病毒感染的可能性）。基於抗體的被動免疫預防已被證實是用於防止受試者患上病毒感染的有效策略。本公開文本的預防方法涉及將包含本公開文本的（例如，表1的）抗CoV-S抗原結合多肽（例如，抗體或抗原結合片段）的組合物投予至受試者以抑制疾病或感染（例如，病毒感染）在受試者體內的表現，所述抗原結合多肽在以有效或治療有效量或劑量投予至受試者時對所述疾病或感染是有效的。
劑量的量可以根據要被投予的受試者的年齡和體型、靶疾病、狀況、投予途徑等而變化。在一些實施例中，本公開文本的抗體或其抗原結合片段例如在成人受試者中用於治療或預防病毒感染的有效或治療有效劑量為約0.01至約200 mg/kg，例如，最高約100 mg/kg、約125 mg/kg、約150 mg/kg或約175 mg/kg。在一些實施例中，所述劑量為最高約10.8或11克（例如，約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10或約11克）。根據感染的嚴重程度，所述治療的頻率和持續時間可以被調整。在一些實施例中，本公開文本的抗體或抗原結合片段可以以初始劑量被投予，之後投予一個或多個第二劑量。在一些實施例中，在初始劑量後可以以可以與初始劑量的量大致相同或小於初始劑量的量的量投予第二劑量或多個後續劑量的抗體或其抗原結合片段，其中所述後續劑量相隔至少1天至3天；至少一週、至少2週；至少3週；至少4週；至少5週；至少6週；至少7週；至少8週；至少9週；至少10週；至少12週；或者至少14週。
在一些實施例中，與尚未被投予所述組合物的受試者相比，所投予的組合物將冠狀病毒感染的可能性降低至少50%，例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
在一些實施例中，與尚未被投予所述組合物的受試者相比，所投予的組合物將SARS-Co-2V S蛋白與受試者細胞的結合降低和/或將SARS-CoV-2進入受試者細胞中減少至少50%，例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
在相關態樣，本公開文本的一些實施例涉及用於降低SARS-Co-2V S蛋白與受試者細胞的結合和/或減少SARS-CoV-2進入受試者細胞中的方法，所述方法包括向所述受試者投予包含治療有效量的如本文所公開的抗體或抗原結合片段的組合物。
如本文所述的方法的非限制性示例性實施例可以包括以下特徵中的一種或多種。在一些實施例中，將所述抗體或抗原結合片段與綴合至本公開文本的治療劑的SARS-Co-2V S蛋白組合投予。在一些實施例中，向所述受試者投予一種或多種其他治療劑。
在一些實施例中，所述一種或多種其他治療劑選自：(i) 抗病毒劑、(ii) 抗炎劑、(iii) 特異性結合TMPRSS2的抗體或其抗原結合片段、以及 (iv) 特異性結合至CoV-S蛋白的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，所述其他治療劑是本文（例如，表1）公開的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，表1的一種、兩種、三種、四種或更多種抗體或其抗原結合片段可以組合（例如，同時或依序）投予。
在一些實施例中，所述一種或多種其他治療劑包括抗病毒藥或疫苗。一般技術者將理解，本公開文本的抗病毒藥可以包括用於治療、預防或改善受試者中的病毒感染的任何抗感染藥物或療法。在一些實施例中，所述抗病毒藥包括但不限於陽離子類固醇抗微生物劑、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶多肽、利巴韋林或干擾素-α2b。用於通過投予與其他治療劑結合的表1的抗體或抗原結合片段來治療或預防需要所述治療或預防的受試者中的病毒（例如，冠狀病毒）感染的方法是本公開文本的一部分。
例如，在本公開文本的一些實施例中，所述其他治療劑是疫苗，例如，冠狀病毒疫苗。在一些實施例中，疫苗是失活/滅活的病毒疫苗、減毒活病毒疫苗或病毒亞單位疫苗。
在一些實施例中，治療組合物被配製為與其預期的投予途徑相容。例如，本公開文本的抗體和抗原結合片段可以以口服方式或通過吸入來給予，但是它們更有可能將通過腸胃外途徑來投予。腸胃外投予途徑的例子包括例如靜脈內、真皮內、皮下、透皮（局部）和經粘膜投予。在一些實施例中，將所述抗體或抗原結合片段皮下、靜脈內和/或肌內投予至所述受試者。
用於腸胃外應用的溶液或懸浮液可以包括以下組分：無菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、不揮發油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）；緩衝液，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調節張力的試劑，如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或鹼來調節，如磷酸二氫鈉和/或磷酸氫二鈉、鹽酸或氫氧化鈉（例如，調節至約7.2-7.8，例如7.5的pH）。可以將腸胃外製劑封裝在由玻璃或塑膠製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
本公開文本的這樣的主題抗體和抗原結合片段的劑量、毒性和治療功效可以在細胞培養物或實驗動物中通過標準醫藥程序來確定，例如，用於確定LD50（對50%的群體致死的劑量）和ED 50（在50%的群體中治療有效的劑量）。毒性效應與治療效果之間的劑量比率是治療指數，並且其可以被表示為比率LD 50/ED 50。展現高治療指數的化合物通常是合適的。儘管可以使用展現毒性副作用的化合物，但是應謹慎設計將這樣的化合物靶向至受影響組織部位的遞送系統，以使對未感染細胞的潛在損傷降至最低，並且由此減小副作用。
例如，從細胞培養測定和動物研究獲得的資料可以用於配製用於人的劑量範圍。此類化合物的劑量通常處於包括ED 50而具有很小或沒有毒性的循環濃度範圍內。劑量可以根據所採用的劑型和所利用的給予途徑而在這個範圍內變化。對於在本公開文本的方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以首先根據細胞培養測定估計。可以在動物模型中配製劑量以實現包括如在細胞培養物中確定的IC 50（例如，測試化合物的實現對症狀的半最大抑制的濃度）的循環血漿濃度範圍。這樣的資訊可以用於更準確地確定在人中的有用劑量。可以例如通過高效液相層析測量血漿中的水準。 組合療法
如上文所討論，根據一些特定例子，本公開文本的方法包括向受試者投予與如本文所公開的抗CoV-S蛋白抗體或抗原結合片段組合的一種或多種另外的療法。
與一種或多種另外的療法“組合”投予包括同時（並行）和以任何順序連續投予。因此，所述另外的療法可以在包含本公開文本的抗CoV-S蛋白抗體或抗原結合片段的醫藥組合物之前、之後或同時投予。“與……組合”投予還包括抗CoV-S抗體或抗原結合片段和第二療法的連續或同時投予。
例如，當含有本公開文本的抗CoV-S抗體或抗原結合片段的醫藥組合物“在先”投予時，另外的療法可以在含有抗CoV-S抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物之後投予持續約72小時、約60小時或約48小時。在之後約36小時、約24小時、約12小時、約10小時、約8小時、約6小時、約4小時、約2小時、約1小時、約30分鐘、約15分鐘或約10分鐘。當含有抗CoV-S抗體或抗原結合片段的醫藥組合物“在後”投予時，另外的療法可以在之前投予持續約10分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時。
組合療法可以包括本公開文本的抗CoV-S抗體或抗原結合片段和可以有利地與本公開文本的抗CoV-S抗體或抗原結合片段組合的任何另外的治療劑。
例如，第二或第三治療劑可以用於説明減小肺中的病毒載量，如抗病毒劑（例如，利巴韋林）。抗體也可以與如上所述的其他療法組合使用，包括對CoV具有特異性的疫苗、對CoV具有特異性的二抗、抗病毒劑、抗炎劑、特異性結合靶細胞的絲胺酸蛋白酶TMPRSS2的抗體以及特異性結合至CoV-S蛋白的另外的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，第二和/或第三治療劑包括由FDA批准用於治療冠狀病毒感染的抗體，如例如，凱西瑞單抗、伊德維單抗、巴馬尼單抗、依替昔單抗和索托維單抗。因此，在一些實施例中，第二和第三治療劑獨立地選自凱西瑞單抗、伊德維單抗、巴馬尼單抗、依替昔單抗和索托維單抗。在一些實施例中，第二和/或第三治療劑包括具有對免疫途徑靶標的親和力的抗體和/或小分子實體。用於免疫途徑靶標的合適的抗體的非限制性例子公開于本文中。
在一些實施例中，第一治療劑是屬於實例14中所述的箱1或箱2的第一抗體或抗原結合片段，並且第二治療劑是屬於實例14中所述的箱3、箱4或箱3/4的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，第一治療劑是屬於實例14中所述的箱1的第一抗體或抗原結合片段，並且第二治療劑是屬於實例14中所述的箱3、箱4或箱3/4的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，第一治療劑是屬於實例14中所述的箱2的第一抗體或抗原結合片段，並且第二治療劑是屬於實例14中所述的箱3、箱4或箱3/4的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，第一治療劑是屬於實例14中所述的箱3的第一抗體或抗原結合片段，並且第二治療劑是屬於實例14中所述的箱4的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，第一治療劑是屬於實例14中所述的箱3的第一抗體或抗原結合片段，並且第二治療劑是屬於實例14中所述的箱3/4的第二抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，第一治療劑是屬於實例14中所述的箱4的第一抗體或抗原結合片段，並且第二治療劑是屬於實例14中所述的箱3/4的第二抗體或抗原結合片段。
如上所述，在本公開文本的一些實施例中，受試者可以是非人動物，並且本文所討論的抗原結合多肽（例如，抗體和抗原結合片段）可以用於獸醫情況下以治療和/或預防非人動物（例如，貓、狗、豬、牛、馬、山羊、兔、綿羊等）中與冠狀病毒相關的疾病。 套組
本文還提供用於本文所述的方法的實踐的套組。在一些實施例中，本文提供用於鑒定具有對CoV-S的結合親和力的抗體和抗原結合片段的套組。這樣的套組可以包括：(a) 多種CoV-S抗原和非CoV-S抗原，並且其中所述抗原各自包含含有 (i) 鑒定所述抗原的報告序列和 (ii) 捕獲手柄序列的報告寡核苷酸；以及 (b) 用於進行鑒定如本文所述的具有對CoV-S的結合親和力的抗體或抗原結合片段的方法的說明書。
在本公開文本的一些實施例中，還提供用於以下的套組：(i) 用於產生抗體或其抗原結合片段，(ii) 檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在，或者 (iii) 治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況。套組可以包括其使用說明書以及如本文所描述和提供的抗體或其抗原結合片段、重組核酸、重組細胞和醫藥組合物中的一種或多種。例如，本公開文本的一些實施例提供包括一種或多種本文所述的抗體和/或其抗原結合片段以及使用說明書的套組。在一些實施例中，本文提供包括一種或多種如本文所述的重組核酸、重組細胞和醫藥組合物以及其使用說明書的套組。
在一些實施例中，套組的組分可以在單獨容器中。在一些其他實施例中，套組的組分可以組合在單一容器中。因此，在本公開文本的一些實施例中，套組包括在一個容器中（例如，在無菌玻璃或塑膠小瓶、層析柱、空心針或注射器筒中）的抗CoV-S抗原結合多肽（例如，如本文所公開（例如，表1的）的抗體或其抗原結合片段）或其醫藥組合物以及在另一容器中（例如，在無菌玻璃或塑膠小瓶、層析柱、空心針或注射器筒中）的其他治療劑。
在另一實施例中，套組包括包含抗CoV-S抗原結合多肽（例如，如本文所公開的（例如，表1的）抗體或其抗原結合片段）或其醫藥組合物的本文所述組合物與一種或多種其他治療劑的組合，其任選地在醫藥組合物中、在單一共用容器中配製在一起。
如果套組包括用於腸胃外投予至受試者的醫藥組合物，則所述套組可以包括用於進行這樣的投予的裝置（例如，注射裝置或導管）。例如，套組可以包括含有抗CoV-S抗原結合多肽（例如，本公開文本的（例如，表1的）抗體或其抗原結合片段）的一個或多個皮下針頭或如上文所討論的其他注射裝置。
在一些實施例中，套組還可以包括用於使用套組的組分來實踐本文所述的方法的說明書。例如，套組可以包括包含關於套組中的醫藥組合物和劑型的資訊的藥品說明書。通常，這樣的資訊説明患者和醫師有效且安全地使用封裝的醫藥組合物和劑型。例如，關於本公開文本的組合的以下資訊可以在藥品說明書中提供：藥代動力學、藥效學、臨床研究、功效參數、適應症和用法、禁忌證、警告、注意事項、不良反應、過量用藥、適當的劑量和投予、如何供應、適當的儲存條件、參考文獻、製造商/經銷商資訊以及智慧財產權資訊。
用於實踐所述方法的說明書通常記錄在合適的記錄介質上。例如，說明書可以印刷在襯底如紙或塑膠等上。說明書可以作為藥品說明書存在於套組中，存在於套組的容器或其元件的標記（例如，與包裝或分包裝相連）中等。說明書可以作為存在於合適的電腦可讀存儲介質例如CD-ROM、軟碟、快閃記憶體驅動器等上的電子存儲資料檔案而存在。在一些情況下，實際說明書不存在於套組中，但是可以提供用於從遠端來源（例如，通過互聯網）獲得說明書的手段。該實施例的例子是包括網址的套組，在所述網址中可以查看說明書和/或可以從所述網址下載說明書。與說明書一樣，這種用於獲得說明書的手段可以被記錄在合適的襯底上。
本公開文本中所提到的所有出版物和專利申請都通過引用併入本文，併入程度如同明確且單獨地指示每個單獨出版物或專利申請通過引用併入一般。
不承認本文引用的任何參考文獻構成現有技術。參考文獻的討論內容陳述了其作者所主張的觀點，並且本申請人保留對所引用檔的準確性和針對性提出質疑的權利。應清楚地理解，儘管本文中提及許多資訊源，包括科學期刊文章、專利檔和教科書；但是該提及並不意味著承認這些檔中的任何檔構成了本領域中公知常識的一部分。
本文給出的一般方法的討論僅旨在用於說明目的。在審閱本公開文本之後，其他替代方法和替代方案對於熟習此項技術者而言將是清楚的，並且將被包括在本申請的精神和範圍內。
在以下實例中進一步詳細公開了另外的實施例，所述實例僅以說明方式提供，而並非旨在以任何方式限制本公開文本或申請專利範圍的範圍。 實例 實例1 生物樣品
樣品採購：下文實例中所述的實驗是用從被SARS-2自然感染的恢復期人存活者收集的外周血單個核細胞（PBMC）來進行。具體而言，供體531 PBMC購自Cellero（約112m/小瓶產品，目錄號1146-4785JY20）並用於這些試驗中。
樣品背景/時間線：在第0天，供體經由鼻咽拭子測試為陽性，同時呈現無症狀/症狀前。無需住院。在第23天，供體針對SARS-2測試為陰性。在第104天進行血漿和血漿去除術樣品收集。供體針對巨細胞病毒（一種普遍存在的人皰疹病毒）也呈血清陽性。 實例2 B細胞的富集
一小瓶冷凍的PBMC在水浴中被解凍1-2 min，然後被轉移至8-10 mL的PBS中的10%胎牛血清（FBS）中，並且以350g離心5 min。細胞沈澱通過每次洗滌重懸於PBS中的0.04%牛血清白蛋白（BSA）中和在RT以350g離心5 min而洗滌三次，最終沈澱在5 mL總體積中被重懸至約20百萬個細胞/mL的濃度（總計約100百萬個細胞）。使用B細胞分離套組II（人；MACS™ Miltenyi）根據製造商的說明書富集B細胞，並且大約50百萬個細胞被施加至設計用於細胞的陽性選擇的兩個LS柱中的每一個。流出物被濃縮和製備用於細胞標記。 實例3 抗原採購、製備和綴合
生物素化抗原源自如下供應商：
1) 生物素化三聚化S（SARS-2）源自ACRO Biosystems，目錄號SPN-C82E9-25（https://www.acrobiosystems.com/P3345-Biotinylated-SARS-CoV-2-S-protein-HisAvitag™-Superstable-trimer-%28MALS-verified%29.html）。此蛋白質在C末端攜帶多聚組胺酸標籤，之後是Avi標籤。此產品的生物素化是使用Avitag™技術來進行。簡言之，Avitag中的單一離胺酸殘基被生物素進行酶標記。
2) 生物素化三聚化S D614G（SARS-2），來自ACRO Biosystems，目錄號SPN-C82E3-25（https://www.acrobiosystems.com/P3431-Biotinylated-SARS-CoV-2-S-protein-%28D614G%29-HisAvitag™-Super-stable-trimer-%28MALS-verified%29.html）。此蛋白質含有D614G突變，所述突變已經在來自世界範圍的SARS-CoV-2病毒中變得越來越常見。此蛋白質還在C末端攜帶多聚組胺酸標籤，之後是Avi標籤。此產品的生物素化是使用Avitag™技術來進行。簡言之，Avitag中的單一離胺酸殘基被生物素進行酶標記。
3) 生物素化人血清白蛋白（HSA）HSA-H82E3，來自Sapphire（https://sapphireusa.com/product.jsp?q=ns%3ANS0000368507）
生物素化抗原各自根據製造商的說明書來溶解。在每種情形中，將其解凍並在室溫下溶解於無菌去離子水中30-60分鐘，並不時溫和攪拌，以實現100微克/mL（對於HSA）或200微克/mL（對於兩種三聚化S抗原）的終濃度。
溶解的抗原各自與由BioLegend供應的以下TotalSeqC試劑中的一種綴合，例如，以允許形成與所述TotalSeqC試劑的複合物（或與其結合），所述TotalSeqC試劑各自含有由供應商供應的唯一條碼化的DNA寡核苷酸，如下：
1) TotalSeq-C0951 PE鏈黴親和素被綴合至生物素化三聚化S糖蛋白（SARS-2）。
2) TotalSeq-C0952 PE鏈黴親和素被綴合至生物素化人血清白蛋白。
3) TotalSeq-C0956 APC鏈黴親和素被綴合至生物素化三聚化S D614G糖蛋白（SARS-2）。
4) TotalSeq-C0957 APC鏈黴親和素與生物素化人血清白蛋白。
簡言之，每種TotalSeq-C條碼化的鏈黴親和素PE或APC試劑被稀釋至0.1 mg/mL，然後基於0.5 μg PE-SA的固定量，與生物素化抗原以抗原對鏈黴親和素的5X莫耳過量混合。在4 oC，每20分鐘，五分之一的鏈黴親和素-寡聚PE或APC綴合物被添加至抗原。然後對於20 μL的總探針體積，用5 μl 4mM生物素（Pierce，Thermo Fisher）終止反應，持續30分鐘。然後最終綴合抗原探針（鏈黴親和素-抗原複合物）以1:50的稀釋度直接用於細胞標記。 實例4 細胞標記
此實例描述被進行以用多種條碼化的抗體和綴合的抗原對B細胞染色的實驗。在這些實驗中，大約4.4百萬個富集的B細胞被首先重懸於標記緩衝液（PBS中的1% BSA）中，並在冰上使用人TruStain FcX（BioLegend）進行Fc阻斷持續10分鐘。
接下來，細胞被用抗體、抗原和染料的以下混合劑染色：CD19 PE-Cy7（克隆SJ25C1，BD Pharmingen），用於通過使用螢光啟動細胞分選（FACS）辨別CD19+細胞。
用於10x單細胞免疫剖析的條碼化的抗體，其包括以下TotalSeq-C寡聚條碼化的抗體：
- TotalSeq-C0389抗人CD38。
- TotalSeq-C0154抗人CD27。
- TotalSeq-C0189抗人CD24。
- TotalSeq-C0384抗人IgD。
- TotalSeq-C0100抗人CD20。
- TotalSeq-C0050抗人CD19（克隆HIB19，以區分其與流動克隆）。
- TotalSeq-C0049抗人CD3E。
- TotalSeq-C0045抗人CD4。
- TotalSeq-C0046抗人CD8A。
- TotalSeq-C0051抗人CD14。
- TotalSeq-C0083抗人CD16。
- TotalSeq-C0090小鼠IgG1 K同種型對照。
- TotalSeq-C0091小鼠IgG2a K同種型對照。
- TotalSeq-C0092小鼠IgG2b K同種型對照。
最終綴合的抗原：
- TotalSeq-C0951 PE三聚化S（SARS-2）。
- TotalSeq-C0952 PE人血清白蛋白。
- TotalSeq-C0956 APC三聚化S D614G（SARS-2）。
- TotalSeq-C0957 APC人血清白蛋白。
- 用於活/死細胞區別的7AAD。
細胞在標記緩衝液（PBS中的1% BSA）中在暗中在冰上被染色30分鐘，然後細胞用2 mL冷標記緩衝液以350*g持續5分鐘在4 oC被洗滌3次，重懸于冷標記緩衝液中並在冰上在暗中以1:200添加活/死細胞區別劑7AAD持續10分鐘，然後用標記緩衝液以350*g持續5分鐘在4 oC再洗滌一次，然後重懸於標記緩衝液中並載入至使用70 microM分選晶片的Sony MA900細胞分選儀上。 實例5 經由FACS進行的抗原特異性富集
細胞首先針對作為單一活（7AAD 陰性）和PE-Cy7-CD19+進行門控，然後基於以下四個標準之一針對其PE和/或APC狀態直接被分選至主混合物和水中：
1) PE+，表示三聚化S（SARS-2）抗原+和/或HSA+對照抗原細胞（圖1中的門Q1；2,430個細胞）；
2) APC+，表示三聚化S D614G（SARS-2）抗原和/或HSA對照抗原細胞（圖1中的門Q3；728個細胞）；
3) 雙重PE+和APC+，表示三聚化S（SARS-2）抗原+、三聚化S D614G（SARS-2）抗原+和/或HSA對照抗原陽性細胞的組合（圖1中的門Q2；828個細胞）；
4) PE和APC陰性細胞，表示未結合SARS-2抗原或對照HSA抗原的細胞（圖1中的門Q4；5,000個細胞）。
在圖1中，Y軸表示PE（表示三聚化S（SARS-2）抗原+和/或HSA+對照抗原細胞）信號。X軸表示APC三聚化S（SARS-2）D614G抗原+和/或HSA+對照抗原細胞。與每個門名稱相鄰的數字表示對於該門，親本群體（單一活CD19+細胞）的事件的分數。FACS資料用FlowJo進行分析。
用另外的水調整所得體積以匹配推薦的體積，並匹配使用10× 5'V2單細胞免疫剖析套組的載入。FACS資料是使用FlowJo進行分析。使用10× 5'V2單細胞免疫剖析套組根據製造商的說明書來構建標準基因表現、V(D)J和條碼化的抗原文庫。在這方面的另外的資訊可以參見“support.10xgenomics.com/permalink/getting-started-immune-profiling-feature-barcoding”。 實例6 定序分析
將從上文實例6中所述的實驗得到的文庫在NovaSeq 3上使用NovaSeq S4 200個循環2020 v1.5套組進行定序，使用對於基因表現、條碼化的抗原或Ig文庫分別靶向每個細胞20,000、30,000或6000個讀段的讀段28、10、10和90個循環進行靶向。序列分析（本文中進一步描述，參見例如，實例7）鑒定總計239種抗體。80種示例性抗體與三聚化野生型SARS-CoV-2刺突蛋白（SEQ ID NO: 1484）和具有D614G取代的SARS-CoV-2刺突蛋白變異體（SEQ ID NO: 1485）的結合親和力總結於下表3中。在這些實驗中，抗原結合分子（例如，抗體）與靶抗原（野生型S蛋白或其變異體）的結合親和力是基於與結合至靶抗原的每種抗原結合分子締合的唯一分子識別字（UMI）的量/數量來確定。通常，更高的靶抗原UMI計數用作更高結合親和力的預測因子。在發現抗體為“螢光團反應性”或“生物素反應性”時，則將其歸類為非特異性抗體，即使其具有非零靶抗原UMI計數。如下表3中所示，所有鑒定的抗體展示高靶抗原計數和低非靶抗原計數。因此，它們被預測具有對靶抗原的特異性結合親和力並且可與非特異性結合物相區分。 表3：80種示例性抗體的結合親和力。下表中展示的整數值表示每種單獨中靶（on-target）（野生型S或D416G突變體（突變體S））和脫靶（off-target）（人血清白蛋白對照/HSA 1、人血清白蛋白對照/HSA 2）抗原的抗原UMI計數。
抗體 同種型/ 亞類 輕 鏈 野生型 S 突變體 S 總計 S HSA 1 HSA 2 HSA （總計）
TXG-0021 IGHM IGKC 64 112 176 0 1 1
TXG-0022 IGHM IGKC 65 83 148 0 1 1
TXG-0023 IGHM IGKC 68 193 261 0 0 0
TXG-0027 IGHG2 IGKC 134 122 256 0 2 2
TXG-0028 IGHG1 IGKC 69 43 112 0 1 1
TXG-0043 IGHM IGLC3 76 95 171 0 0 0
TXG-0049 IGHM IGKC 209 53 262 0 0 0
TXG-0051 IGHM IGKC 125 226 351 0 3 3
TXG-0056 IGHM IGLC2 203 93 296 0 0 0
TXG-0061 IGHM IGLC1 119 178 297 0 0 0
TXG-0062 IGHG1 IGKC 169 83 252 1 0 1
TXG-0067 IGHG2 IGKC 58 173 231 0 0 0
TXG-0068 IGHG1 IGKC 274 147 421 1 0 1
TXG-0072 IGHG1 IGKC 80 41 121 0 0 0
TXG-0083 IGHM IGLC3 179 240 419 2 4 6
TXG-0085 IGHM IGLC1 107 71 178 0 0 0
TXG-0089 IGHG1 IGLC1 170 49 219 0 1 1
TXG-0090 IGHM IGLC1 185 167 352 0 0 0
TXG-0092 IGHM IGLC2 60 103 163 0 3 3
TXG-0095 IGHM IGLC3 68 167 235 0 0 0
TXG-0096 IGHM IGLC1 163 414 577 0 1 1
TXG-0098 IGHM IGKC 323 40 363 0 0 0
TXG-0105 IGHM IGLC3 62 55 117 1 2 3
TXG-0106 IGHM IGKC 103 120 223 1 1 2
TXG-0108 IGHG2 IGKC 52 88 140 0 0 0
TXG-0110 IGHM IGLC2 40 210 250 0 0 0
TXG-0111 IGHM IGLC1 68 183 251 0 2 2
TXG-0112 IGHM IGKC 76 131 207 0 0 0
TXG-0113 IGHM IGKC 77 120 197 0 0 0
TXG-0115 IGHM IGKC 683 322 1005 13 8 21
TXG-0118 IGHM IGKC 137 98 235 0 0 0
TXG-0121 IGHD IGLC1 237 60 297 0 0 0
TXG-0123 IGHM IGKC 98 116 214 0 2 2
TXG-0124 IGHM IGKC 229 155 384 0 0 0
TXG-0130 IGHM IGLC2 151 285 436 0 3 3
TXG-0134 IGHM IGLC3 69 340 409 0 0 0
TXG-0135 IGHM IGLC2 266 253 519 0 1 1
TXG-0136 IGHM IGLC3 188 138 326 2 0 2
TXG-0137 IGHG1 IGLC3 172 132 304 0 1 1
TXG-0138 IGHM IGLC1 65 253 318 0 0 0
TXG-0140 IGHM IGKC 163 222 385 1 1 2
TXG-0145 IGHM IGKC 48 160 208 3 36 39
TXG-0147 IGHD IGKC 466 241 707 2 0 2
TXG-0150 IGHM IGKC 187 151 338 0 0 0
TXG-0152 IGHM IGKC 55 207 262 0 0 0
TXG-0153 IGHD IGKC 63 47 110 0 0 0
TXG-0154 IGHM IGKC 124 120 244 3 0 3
TXG-0160 IGHM IGKC 60 381 441 0 0 0
TXG-0165 IGHM IGLC2 446 261 707 0 0 0
TXG-0167 IGHM IGKC 40 287 327 0 0 0
TXG-0169 IGHM IGKC 133 185 318 0 0 0
TXG-0171 IGHM IGKC 130 64 194 0 0 0
TXG-0172 IGHM IGKC 48 112 160 0 0 0
TXG-0173 IGHG1 IGLC3 102 107 209 1 1 2
TXG-0174 IGHM IGKC 40 322 362 0 0 0
TXG-0177 IGHM IGKC 40 149 189 0 1 1
TXG-0179 IGHM IGLC2 105 194 299 0 0 0
TXG-0182 IGHG1 IGLC2 175 64 239 0 1 1
TXG-0191 IGHM IGLC2 45 238 283 0 0 0
TXG-0192 IGHM IGKC 43 142 185 1 4 5
TXG-0194 IGHG1 IGLC3 90 56 146 2 1 3
TXG-0195 IGHM IGKC 205 348 553 0 3 3
TXG-0196 IGHM IGKC 96 149 245 0 2 2
TXG-0205 IGHM IGLC3 77 100 177 0 0 0
TXG-0208 IGHM IGKC 61 166 227 6 34 40
TXG-0211 IGHG1 IGKC 175 111 286 0 0 0
TXG-0212 IGHM IGKC 71 190 261 0 1 1
TXG-0213 IGHM IGKC 136 154 290 1 0 1
TXG-0214 IGHM IGKC 91 146 237 0 0 0
TXG-0215 IGHM IGKC 494 297 791 1 3 4
TXG-0216 IGHM IGKC 197 66 263 0 0 0
TXG-0217 IGHG1 IGKC 504 308 812 2 0 2
TXG-0218 IGHG1 IGKC 76 42 118 1 0 1
TXG-0226 IGHM IGKC 158 64 222 0 0 0
TXG-0227 IGHM IGLC2 100 137 237 0 0 0
TXG-0228 IGHM IGLC2 59 161 220 0 0 0
TXG-0229 IGHM IGLC2 9 141 150 0 1 1
TXG-0230 IGHM IGLC2 44 153 197 0 1 1
TXG-0231 IGHG3 IGKC 71 188 259 0 1 1
TXG-0237 IGHM IGKC 71 336 407 0 0 0
實例7 統計分析
具有大於40 UMI的最大刺突抗原計數的結合抗體（如上文表3中所總結）被選擇用於使用10x Genomics “Enclone”（可在https://bit.ly/enclone獲得）進行進一步分析，其為開發用於克隆分組以研究適應性免疫系統的計算工具。在此計算工具中，將含有B細胞受體（BCR）和T細胞受體（TCR）RNA序列的10x Genomics Chromium單細胞V(D)J資料作為輸入資料提供至Enclone。基於所述輸入，Enclone尋找源自相同祖細胞的細胞並將其組織化為多個組（例如，克隆型家族），並且簡潔地展示每個克隆型以及其突出特徵，包括突變的胺基酸。資料集中的抗體經由稱為“通過定序進行的條碼啟用的抗原映射”（BEAM-seq）的過程被歸類為3個類別，如下文所列：
類別1.（例如，螢光團反應性）：如果抗原混合物包括連接至不同螢光團的靶抗原和非靶抗原，並且對於連接至螢光團1而非螢光團2的靶抗原和非靶抗原檢測到計數，其表明抗體結合至螢光團而非靶抗原，則所述抗體被歸類為此類別。在此特定實例中，如果對於僅一種刺突蛋白和用相同螢光團標記的相應白蛋白檢測到計數，則抗體被歸類為此類別。
類別2.（例如，生物素反應性、鏈黴親和素反應性或多反應性）：如果抗原混合物包括連接至不同螢光團的靶抗原和非靶抗原，並且對於連接至兩種螢光團的靶抗原和非靶抗原檢測到計數，其表明抗體不結合抗原而是結合至試劑的核心組分（例如，鏈黴親和素、生物素）或具有多反應性（例如，黏性和非特異性），則所述抗體被歸類為此類別。在此特定實例中，如果對於兩種刺突蛋白（三聚化野生型S和三聚化S D614G）和兩種白蛋白（PE-HSA和APC-HSA）檢測到計數，則抗體被歸類為此類別（例如，被歸類為生物素反應性、鏈黴親和素反應性或多反應性）。
類別3.（例如，候選SARS-2反應性抗體）：如果對於靶抗原檢測到計數但是對於非靶抗原不存在或水準較低，其表明抗體特異性結合靶抗原並且具有對靶抗原的親和力，則所述抗體被歸類為此類別。在此特定實例中，如果對於一種或兩種刺突蛋白的計數相對於白蛋白顯著更高，則抗體被歸類為此類別（例如，被歸類為候選SARS-2反應性抗體）；大多數抗體結合野生型刺突蛋白和常見群體變異體D614G。類別3抗體公開于本文中（參見例如，表1、表3）。
在對於真正的抗原結合細胞存在顯著富集的資料集中，抗原結合分子（例如，抗體或抗原結合片段）與靶抗原（如S蛋白）的結合親和力是基於與結合至每種細胞的抗原締合的唯一分子識別字（UMI）的量/數量來確定。BEAM得分是近似正態分佈的，隨著靶抗原結合相對於表現的抗體和對照抗原增加而指數性增加，與HCDR3連接區的生成概率相關，例如，遵循體細胞超變（SHM）與增加親和力的已知大體關係，並且還揭示根據文獻種類轉換增加預測的相對親和力（圖2和圖3）。在含有更多子抗體的子譜系內，BEAM得分通常也高於狹窄子譜系（代表性例子顯示於圖4中）。 實例8 抗體合成、克隆、表現和純化
抗SARS-CoV-2抗體的可變重鏈和輕鏈結構域被重格式化為IgG1，並且利用Twist Bioscience eCommerce門被合成和克隆至哺乳動物表現載體pTwist CMV BG WPRE Neo中。輕鏈可變結構域相應地被重格式化為κ和λ架構。克隆基因是作為準備好用於在人胚腎（HEK）Expi293細胞（Thermo Scientific）中暫態轉染的純化的質體DNA被遞送。具有1.2 ml體積的培養物生長至四天，使用蛋白A樹脂（PhyNexus）在Hamilton Microlab STAR平臺上收穫並純化至43 mM檸檬酸鹽，148 mM HEPES（pH 6）中。 實例9 對結合親和力的進一步表徵
此實例描述進行以進一步表徵本文所述的選定抗體的結合親和力的實驗的結果。
基於抗原UMI計數譜具有高預測結合親和力的抗體被選擇用於進一步篩選和分析。
隨後，通過使用配備有HC30M晶片的Carterra LSA SPR生物感測器在25ºC在HBS-TE（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% Tween-20）中對所選抗體進行表面等離子體共振（SPR）分析。抗體在乙酸鈉緩衝液（pH 4.5）中被稀釋至5 µg/ml，並且通過EDC/NHS啟動被胺偶聯至感測器晶片，之後進行乙醇胺HCl淬滅。漸增濃度的配體在含有0.5 mg/ml BSA的HBSTE（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% Tween-20）中流經感測器晶片，其具有5分鐘締合和15分鐘解離。在每個注射循環後，用IgG洗脫緩衝液（Thermo）的2x 30秒注射使表面再生。來自Acro Biosystems的以下抗原和目錄號用於在指定濃度範圍的系列分析：
(1) SARS-CoV-2 S蛋白，His標籤，超穩定三聚體（MALS & NS-EM驗證的），SPN-C52H9；0 - 100 nM。
(2) SARS-CoV-2 S蛋白（D614G），His標籤，超穩定三聚體（MALS驗證的），SPN-C52H3；0 - 100 nM。
(3) SARS-CoV-2（COVID-19）S蛋白RBD（三重突變體K417N、E484K、N501Y），His標籤（MALS驗證的），SPD-C52Hp；0 - 500 nM。
(4) SARS-CoV-2（COVID-19）S1蛋白NTD，His標籤，S1D-C52H6；0 - 500 nM。
(5) SARS-CoV-2（COVID-19）S2蛋白，His標籤，S2N-C52H5；0 - 500 nM。
(6) MERS S1蛋白，His標籤，S1N-M52H5；0 - 500 nM。
(7) HCoV-HKU1（分離株N5）S1蛋白，His標籤，SIN-V52H6；0 - 500 nM。
使用Carterra's Kinetics Tool軟體對跡線進行分析和擬合，擬合至1:1受體-配體結合模型。
下表4提供示例性抗體於以下抗原的結合親和力的總結：(1) 三聚化野生型SARS-CoV-2 S蛋白（SEQ ID NO: 1483）、(2) 具有D614G取代的SARS-CoV-2 S蛋白變異體（SEQ ID NO: 1484）。對於比較分析，此研究中還包括先前報導的結合SARS-CoV-2 S蛋白的以下四種FDA批准的治療性抗體：(1) 伊德維單抗（REGN-COV2）、(2) 巴馬尼單抗（Eli Lilly/AbCellera）、(3) 依替昔單抗（Eli Lilly/AbCellera）以及索托維單抗（Vir/GlaxoSmithKline）。觀察到，此研究中測試的大多數抗體可以以皮莫耳和奈莫耳範圍結合至野生型S蛋白和D614G突變體二者。引人注目地，發現本文所述的幾種抗體具有與FDA批准的抗體或後期臨床開發中的抗體一樣高或更高的結合親和力。還參見，圖16A-圖16B。 表4：三種示例性抗體的結合親和力。
抗體 野生型S Kon 野生型S Koff 野生型S KD 突變體S Kon 突變體S Koff 突變體S KD
CTRL-0002 234593.3 1.52E-05 6.40E-11 241121.8 1.40E-05 5.81E-11
CTRL-0003 203917.6 0.00001 5.00E-11 188858.9 0.00001 5.31E-11
TXG-0022 51918.45 0.000254 4.58E-09 24667.42 0.000396 1.33E-06
TXG-0023 71109.3857 0.00032530 5.09E-09 301302.1993 0.00073614 4.39E-09
TXG-0027 58232.7168 0.00021064 4.50E-09 77934.37599 0.000406092 6.33E-09
生成UpSet圖（參見例如，圖23），其中基於兩輪SPR結合親和力資料將抗體分箱至抗原箱中。對於要置於箱中的抗體，需要來自實例9和實例12中所述SPR實驗中的至少一個的在所有抗原濃度下的可檢測動力學擬合，或者正交中和資料。圖23中所述的結果說明，本公開文本中所述的BEAM-seq過程允許快速鑒定具有針對幾種冠狀病毒S抗原的寬且穩健的結合親和力的許多抗體，所述抗原包括幾種所關注的變異體（VoC），例如，β、γ和κ，以及HKU1（其是不同的冠狀病毒）。
引人注目地，發現幾種抗體是泛冠狀病毒抗體，其識別S1亞基中的保守表位並且以高親和力結合至新型人冠狀病毒株HCoV-HKU1的S1亞基（參見例如，表5的TXG-0085、TXG-0112、TXG-0136、TXG-0150、TXG-0192、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230）。觀察到，在此實驗中測試的幾種抗體可以以低至中奈莫耳範圍結合至人冠狀病毒株HCoV-HKU1。因此，不受任何具體理論束縛，這些抗體在與RBD結合、NTD結合或非S1結合治療性抗體組合的針對SARS-CoV-2和其他冠狀病毒的治療組合中可以特別有用。
另外，如表5中所示，發現幾種抗體（例如，TXG-0072、TXG-0137、TXG-0173、TXG-0174和TXG-0230）以高親和力結合SARS-CoV-2 S蛋白的N末端結構域。因此，這些抗體在與RBD結合和非S1結合治療性抗體的針對SARS-2的治療組合中可以特別有用。 表5：十三（13）種示例性抗體與SARS-CoV-2 S蛋白的N末端結構域或HCoV-HKU1的S1亞基的結合親和力。ND：未確定。
抗體 NTD CoV-2 S Kon NTD CoV-2 S Koff NTD CoV-2 S KD HCoV-HKU1 Kon HCoV-HKU1 Koff HCoV-HKU1 KD
TXG-0072 50798.68 0.000922 1.81E-08 ND ND ND
TXG-0085 ND ND ND 113390.6 0.00037552 3.31E-09
TXG-0112 ND ND ND 44045.58 0.00051411 1.17E-08
TXG-0136 ND ND ND 14774.41 0.00012629 8.55E-09
TXG-0137 42923.26 0.001742 4.06E-08 ND ND ND
TXG-0150 ND ND ND 152567.3 0.00138289 9.06E-09
TXG-0173 28801.3 0.00078 2.71E-08 ND ND ND
TXG-0174 52925.25 0.002852 5.39E-08 ND ND ND
TXG-0192 ND ND ND 30640.36 0.00061101 1.99E-08
TXG-0227 ND ND ND 395483 0.0004037 1.02E-09
TXG-0228 ND ND ND 262421.1 0.00072991 2.78E-09
TXG-0229 ND ND ND 179675.9 0.00055067 3.06E-09
TXG-0230 35459.9 0.00081 2.29E-08 222367.6 0.00035694 1.61E-09
實例10 對具有所需動力學譜的抗體的鑒定
使用SPR結合曲線進行進一步分析以鑒定具有特別低的K off常數的抗體。如圖17A-圖17D和下表6中所示，觀察到抗體可被分層為兩個主要種類：最佳結合動力學和次最佳結合動力學。例如，發現可以鑒定具有明顯更長的半衰期的抗體具有低於4e-4的K off，且另外的亞類的抗體具有特別長的半衰期和低於1e-4的K off（參見例如，表6和圖17A-圖17D）。表6中報告的抗體半衰期值和平均壽命值分別是通過使用式ln(2)/K off和式1/Koff來計算。
較少量抗體由於其較高的K off常數而具有次最佳結合動力學，其產生不太理想的K D，即使鑒於其可接受的K on常數（參見例如，表6和圖17A-圖17D）。對於比較分析，依替昔單抗和索托維單抗也包括在此研究中。 表6：兩種示例性抗體的半衰期。CTRL-0007：依替昔單抗。CTRL-0008：索托維單抗。
抗體 野生型S 半衰期 突變體S 半衰期 三重突變體RBD 半衰期
CTRL-0007 1077.612314 1983.80432 0.0162237
CTRL-0008 23901.62692 693147.181 1217.0555
TXG-0023 2130.774019 941.596952   
TXG-0027 3290.625279 1706.87229   
實例11 抗體的功能表征
為了進一步表徵上文實例1-10中所述的抗體和抗原結合片段，使用表現ACE2的GFP+受體細胞和呈雙重螢光形式的融合前D614G刺突蛋白的劑量競爭進行配體阻斷測定，其中被競爭的抗原呈四聚形式。在這些實驗中，可以生成每種mAb的相對K D值。
另外，為了確定本公開文本的抗體和抗原結合片段是否具有針對SARS-CoV-2的中和活性（例如，拮抗活性），例如，能夠結合至SARS-CoV-S並中和SARS-CoV-S的活性，使用這些mAb以劑量依賴性方式進行另外的活病毒或假病毒中和測定以生成中和活性的IC 50。在一些實驗中，每種抗體的中和活性IC 50值可以在先前由Zost等人（Nature, 584:443-449, 2020）所述的定量病灶減少中和測試（FRNT）中被確定。在一些實驗中，中和測定用於確定含有SARS-CoV-2 S蛋白的病毒樣顆粒的感染力。在這些實驗中，中和或拮抗CoV-S抗體或抗原結合片段可以基於其以任何可檢測的程度抑制CoV-S的活性的能力來鑒定，所述抑制能力例如抑制或降低CoV-S蛋白結合至受體如ACE2、被蛋白酶如TMPRSS2切割或介導病毒進入宿主細胞中或介導病毒在宿主細胞中繁殖的能力。 實例12 另外的表面等離子體共振（SPR）分析
此實例描述進行以進一步表徵本文所述的選定抗體的結合親和力的另一輪實驗的結果。
在實例6中鑒定的新一批全部239種抗體是根據實例8中所述的方法來合成、克隆、表現並純化。
第二SPR實驗是在相同的實驗設定（流速、抗原濃度、偶聯方法、緩衝液等）下以每種抗體的一組測量（與作為第一SPR實驗的部分完成的一式三份測量相比）來進行。三聚形式的SARS-CoV-2武漢進入株（WT）、β、γ和κ融合前刺突、SARS-CoV-2 NTD、HcoV-HKU1刺突三聚體和人血清白蛋白用作抗原以評估每種抗體的親和力和反應性。這些實驗中使用的抗原購自ACROBiosystems（帶His標籤的野生型SARS-CoV-2：目錄號SPN-C52H9；帶His標籤的SARS-CoV-2 γ變異體：目錄號SPN-C52Hg；帶His標籤的SARS-CoV-2 κ變異體：目錄號SPN-C52Hr；帶His標籤的SARS-CoV-2 β變異體：目錄號SPN-C52Hk；帶His標籤的SARS-CoV-2 NTD：目錄號SPN-C52H6；以及帶His標籤的HcoV-HKU1（分離株N5）刺突三聚體：目錄號SPN-C52H5）。另外，帶His標籤的人血清白蛋白（HSA）也購自ACROBiosystems（目錄號HSA-H5220）。在β、γ和κ變異體中鑒定的突變如下。
β變異體：L18F、D80A、D215G、242-244del、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V。
γ變異體：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I和V1176F。
κ變異體：T95I、G142D、E154K、L452R、E484Q、D614G、P681R和Q1071H。
應注意，δ和κ變異體共用兩個突變E484Q和L452R。它們是在印度的第二波COVID-19中被鑒定，並且已經被報導共用顯著相似性，大概是由於它們來自同一譜系的事實所致。
如下表7中所示，觀察到本文所述的幾種抗體顯示與各種目的刺突變體（VoC）（例如，β、γ和κ變異體）的高結合親和力。對於比較分析，此研究中還包括幾種對照抗體（表示為CTRL），其先前已經被描述為具有對SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力。觀察到，此實驗中測試的幾種抗體可以以低至中奈莫耳範圍結合至一種或多種刺突變體。另外，發現幾種抗體以與FDA批准的抗體或後期臨床開發中的抗體一樣高或更高的結合親和力結合β、γ和/或κ變異體。 表7：示例性抗體與β、γ和κ刺突變體的結合親和力。總計53種對照抗體（CTRL）包括在這些實驗中，包括：CTRL-0004：凱西瑞單抗；CTRL-0005：伊德維單抗；CTRL-0006：巴馬尼單抗；CTRL-0007：依替昔單抗；CTRL-0008：索托維單抗；以及CTRL-0009：替科維單抗；ND：未確定。
抗體 WT S Kon WT S Koff WT S KD β Kon β Koff β KD γ Kon γ Koff γ KD κ Kon κ Koff κ KD
CTRL-0003 168409.4 4.06E-05 2.41E-10 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
CTRL-0004 780111.1 0.00001 1.28E-11 719344.14 0.00001 1.39E-11 690920.7 0.00001 1.45E-11 787567.5 0.00001 1.27E-11
CTRL-0005 425853.7 0.00001 2.35E-11 685071.11 0.00001 1.46E-11 397093.6 0.00001 2.52E-11 277653.7 0.00001 3.60E-11
CTRL-0006 376757.3 0.00001 2.65E-11 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
CTRL-0007 280361.6 0.00001 3.57E-11 ND ND ND 145069.5 0.000151 1.04E-09 288148 0.00001 3.47E-11
CTRL-0008 69055.65 2.41E-05 3.49E-10 67282.657 0.00001 1.49E-10 73180.24 0.00001 1.37E-10 114028.4 0.00001 8.77E-11
CTRL-0009 245014.7 0.00001 4.08E-11 396880.9 0.00001 2.52E-11 434878.3 0.00001 2.30E-11 534970.6 0.00001 1.87E-11
CTRL-0010 124581.1 2.67E-05 2.15E-10 ND ND ND ND ND ND 174586.4 3.26E-05 1.87E-10
CTRL-0011 67315.18 0.000244 3.63E-09 92570.575 0.001055 1.14E-08 70861.33 0.00043 6.07E-09 138522.4 0.000144 1.04E-09
CTRL-0012 85130.28 5.00E-05 5.87E-10 ND ND ND ND ND ND 148498 4.80E-05 3.23E-10
CTRL-0013 41993.52 0.00001 2.38E-10 ND ND ND 2367.705 0.00063 2.66E-07 96040.55 0.00001 1.04E-10
CTRL-0014 318910.3 0.00001 3.14E-11 505162.26 0.00001 1.98E-11 430070.9 0.00001 2.33E-11 152031.7 0.000291 1.91E-09
CTRL-0015 16584 0.000274 1.65E-08 1509465.2 0.108929 7.22E-08 ND ND ND 81269.48 6.01E-05 7.39E-10
CTRL-0016 58990.59 0.00001 1.70E-10 109857.57 0.000112 1.02E-09 107226 4.30E-05 4.01E-10 85218.62 0.00001 1.17E-10
CTRL-0017 185065.6 0.000355 1.92E-09 249966.16 0.000549 2.20E-09 ND ND ND ND ND ND
CTRL-0018 26750.32 0.00001 3.74E-10 69658.331 0.00001 1.44E-10 16313.45 1.38E-05 8.49E-10 28622.92 0.00001 3.49E-10
CTRL-0021 24080.72 2.11E-05 8.78E-10 130877.47 0.00001 7.64E-11 95747.46 0.00001 1.04E-10 150071.6 0.00001 6.66E-11
CTRL-0023 74396 0.000217 2.91E-09 154813.09 0.000251 1.62E-09 97270.21 0.000279 2.87E-09 ND ND ND
CTRL-0024 2444.646 0.000404 1.65E-07 ND ND ND ND ND ND 28055.16 0.000381 1.36E-08
CTRL-0025 340585.7 7.92E-05 2.32E-10 201331.02 0.000131 6.50E-10 152226.8 0.000151 9.95E-10 362152.7 0.000163 4.49E-10
CTRL-0026 139713 2.86E-05 2.05E-10 71329.098 0.000387 5.42E-09 48055.96 0.000413 8.59E-09 88296.64 0.000271 3.07E-09
CTRL-0027 162664.2 0.00001 6.15E-11 254775.18 0.00001 3.93E-11 247821.6 0.00001 4.04E-11 213373 0.00001 4.69E-11
CTRL-0029 229485.4 4.46E-05 1.94E-10 282036.78 9.58E-05 3.40E-10 216032.8 0.000116 5.39E-10 49049.53 0.000289 5.90E-09
CTRL-0030 1007982 0.000482 4.78E-10 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
CTRL-0031 333733.6 6.26E-05 1.88E-10 446901.56 0.000108 2.42E-10 336627.9 0.000126 3.74E-10 177884.6 0.000313 1.76E-09
CTRL-0033 248246.4 0.000525 2.11E-09 ND ND ND 937.1916 0.034496 3.68E-05 ND ND ND
CTRL-0034 130018.6 0.000161 1.24E-09 ND ND ND 109741.9 0.0004 3.65E-09 ND ND ND
CTRL-0035 47590.2 0.00001 2.10E-10 93172.211 0.00001 1.07E-10 59823.52 1.08E-05 1.81E-10 155822.9 0.00001 6.42E-11
CTRL-0036 1011.121 4.36E-05 4.31E-08 35379.486 0.00001 2.83E-10 20646.69 1.16E-05 5.61E-10 40592.63 0.00001 2.46E-10
CTRL-0037 283158.2 0.00001 3.53E-11 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
CTRL-0038 567188.5 0.00001 1.76E-11 ND ND ND ND ND ND 531520.8 0.00001 1.88E-11
CTRL-0039 193867.8 0.00001 5.16E-11 ND ND ND 56494.62 0.00001 1.77E-10 75415.87 6.61E-05 8.76E-10
CTRL-0040 99948.55 0.00001 1.00E-10 140309.43 0.000102 7.27E-10 133195.6 4.47E-05 3.35E-10 123189.8 0.00001 8.12E-11
CTRL-0041 32453.98 0.00001 3.08E-10 ND ND ND ND ND ND 40336.31 0.00001 2.48E-10
CTRL-0042 84356.91 0.001413 1.68E-08 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
CTRL-0043 730049.9 0.000105 1.44E-10 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
CTRL-0044 21110.2 0.00001 4.74E-10 54202.792 0.00001 1.84E-10 42983.85 0.00001 2.33E-10 72048.22 0.00001 1.39E-10
CTRL-0045 32822.46 3.71E-05 1.13E-09 56505.976 0.00001 1.77E-10 45808.39 0.00001 2.18E-10 46026.79 0.00001 2.17E-10
CTRL-0047 376730.5 0.00001 2.65E-11 ND ND ND 282873.4 0.00001 3.54E-11 62120.06 0.000253 4.07E-09
CTRL-0048 50725.55 0.000112 2.20E-09 ND ND ND 1996.237 0.000345 1.73E-07 ND ND ND
CTRL-0049 3423.314 0.000347 1.01E-07 325430.35 0.001889 5.80E-09 ND ND ND 45569.02 0.000896 1.97E-08
CTRL-0050 1481.382 0.000169 1.14E-07 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
CTRL-0051 118529.8 0.000293 2.47E-09 119245.9 0.00041 3.44E-09 112418.1 0.000333 2.96E-09 ND ND ND
CTRL-0052 62024.63 0.000275 4.43E-09 47570.381 0.000266 5.59E-09 31967.12 0.000281 8.80E-09 68971.82 0.000175 2.53E-09
CTRL-0053 66049.93 0.00001 1.51E-10 134546.23 0.00001 7.43E-11 12480.41 2.83E-05 2.27E-09 30835.73 0.00001 3.24E-10
TXG-0021 58100.29 0.000702 1.21E-08 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0022 95715.25 0.000646 6.75E-09 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0023 79151.66 0.00068 8.60E-09 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0028 73336.76 0.00001 1.36E-10 61553.691 0.00001 1.62E-10 53305.57 1.89E-05 3.55E-10 101888.7 1.14E-05 1.12E-10
TXG-0043 46272.5 0.000909 1.96E-08 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0049 605073.2 0.000255 4.22E-10 707120.25 0.000266 3.76E-10 354608.6 0.000295 8.32E-10 617948.2 0.000257 4.17E-10
TXG-0056 43657.02 3.33E-05 7.63E-10 125266.38 2.36E-05 1.88E-10 87445.7 2.53E-05 2.90E-10 147660.6 1.28E-05 8.68E-11
TXG-0061 568.3356 0.000317 5.57E-07 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0062 127966.5 0.000258 2.01E-09 201366.54 0.000432 2.15E-09 80988.93 0.000343 4.24E-09 160426.5 0.000245 1.53E-09
TXG-0068 36358.13 0.000267 7.34E-09 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0072 439023.9 0.00001 2.28E-11 714987.96 0.00001 1.40E-11 339308.3 0.00001 2.95E-11 525369.5 0.00001 1.90E-11
TXG-0083 14963.77 0.000274 1.83E-08 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0085 68192.78 0.000202 2.96E-09 136432.82 0.00018 1.32E-09 125920.7 0.000168 1.33E-09 128548.2 0.000163 1.27E-09
TXG-0089 23025.67 0.00001 4.34E-10 90765.184 0.00001 1.10E-10 62170.62 0.00001 1.61E-10 110682.7 0.00001 9.03E-11
TXG-0090 14304.99 0.000637 4.45E-08 ND ND ND 50639.94 0.000538 1.06E-08 ND ND ND
TXG-0098 45479.55 0.000451 9.91E-09 156161.31 0.001161 7.44E-09 59219.84 0.000274 4.62E-09 84258.24 0.000453 5.38E-09
TXG-0108 7137.826 0.000673 9.44E-08 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0112 127820.9 0.000301 2.36E-09 116705.79 0.000263 2.26E-09 90439.66 0.000283 3.13E-09 96823.37 0.00027 2.79E-09
TXG-0113 378507.6 0.000329 8.70E-10 238956.57 0.000271 1.13E-09 135330.3 0.000257 1.90E-09         
TXG-0115 359101.7 0.00001 2.78E-11 193203.06 0.00001 5.18E-11 183929.5 0.00001 5.44E-11 76798.2 0.00024 3.13E-09
TXG-0118 186182.1 5.39E-05 2.90E-10 3555099.3 0.120698 3.40E-08 86031.43 0.000123 1.43E-09         
TXG-0121 50095.27 4.86E-05 9.71E-10 149969.91 6.04E-05 4.03E-10 125607 4.55E-05 3.62E-10 146735.4 3.61E-05 2.46E-10
TXG-0130 30258.51 0.000313 1.04E-08 62803.913 0.000696 1.11E-08 41002.01 0.000788 1.92E-08 2584671 0.23204 8.98E-08
TXG-0134 52433.55 0.304358 5.80E-06 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0135 112.3224 0.001522 1.35E-05 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0136 377048.4 1.06E-05 2.82E-11 87341.721 9.26E-05 1.06E-09 253753.3 2.06E-05 8.13E-11 163180.8 9.28E-05 5.69E-10
TXG-0137 283697.2 0.00001 3.52E-11 ND ND ND 232924.9 0.00001 4.29E-11 197884.9 4.12E-05 2.08E-10
TXG-0138 407304.2 2.73E-05 6.70E-11 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0140 651253.3 0.00001 1.54E-11 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0145 225233.6 0.000144 6.38E-10 590759.33 8.39E-05 1.42E-10 542988.3 8.02E-05 1.48E-10 337358.1 0.000117 3.46E-10
TXG-0147 238663.5 6.16E-05 2.58E-10 ND ND ND 88796.62 0.000117 1.32E-09 ND ND ND
TXG-0150 60764.85 0.000664 1.09E-08 98465.38 0.000629 6.39E-09 75256.03 0.000731 9.71E-09 0 0 0
TXG-0152 109199.8 0.000167 1.53E-09 129609.28 0.00031 2.39E-09 86740.52 0.000425 4.90E-09 110851.1 0.000224 2.02E-09
TXG-0153 158305.9 0.00001 6.32E-11 60474.363 0.00001 1.65E-10 29520.91 1.17E-05 3.98E-10 27280.92 1.16E-05 4.27E-10
TXG-0154 592654.8 0.00001 1.69E-11 342939.44 0.00001 2.92E-11 369045.5 0.00001 2.71E-11 534843 0.00001 1.87E-11
TXG-0160 3329.524 0.000224 6.71E-08 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0165 311736.5 6.64E-05 2.13E-10 ND ND ND 232695.1 9.94E-05 4.27E-10 25656.77 0.000315 1.23E-08
TXG-0169 23442.35 0.000256 1.09E-08 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0172 ND ND ND 56504.38 0.002193 3.88E-08 2511.992 0.001847 7.35E-07 2861.962 0.001611 5.63E-07
TXG-0173 204634.4 0.00001 4.89E-11 ND ND ND 176123.9 0.00001 5.68E-11 192552.8 4.75E-05 2.47E-10
TXG-0174 653825.2 0.00001 1.53E-11 115353.74 0.000175 1.52E-09 610358.5 0.00001 1.64E-11 523343.2 4.67E-05 8.93E-11
TXG-0177 ND ND ND ND ND ND 25409.73 0.000759 2.99E-08 21365.33 0.000908 4.25E-08
TXG-0182 130174.1 3.09E-05 2.37E-10 208806.99 0.00001 4.79E-11 147034.4 1.55E-05 1.05E-10 31943.81 0.000278 8.71E-09
TXG-0191 ND ND ND ND ND ND 10000 0.0001 1E-08 ND ND ND
TXG-0192 179267.8 0.000496 2.77E-09 158967.97 0.000402 2.53E-09 91208.85 0.000454 4.97E-09 128520.8 0.000592 4.60E-09
TXG-0194 41416.06 0.00001 2.41E-10 79040.582 0.00001 1.27E-10 64843.99 0.00001 1.54E-10 69322.61 0.00001 1.44E-10
TXG-0195 54371.07 0.000198 3.65E-09 ND ND ND ND ND ND 55172.56 0.000268 4.85E-09
TXG-0211 66441.78 0.000153 2.30E-09 6761664.9 0.299506 4.43E-08 67428.52 0.000169 2.51E-09 93950.11 0.000186 1.98E-09
TXG-0213 143359.5 0.000336 2.34E-09 156924.95 0.00034 2.16E-09 71268.46 0.000339 4.76E-09 123788.4 0.000287 2.32E-09
TXG-0215 71708.02 0.000228 3.18E-09 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0216 43747.18 0.000995 2.27E-08 ND ND ND ND ND ND 276945.1 0.000857 3.09E-09
TXG-0217 54611.04 0.00001 1.83E-10 71577.605 0.000227 3.17E-09 55140.78 0.000188 3.42E-09 168458.3 3.96E-05 2.35E-10
TXG-0218 105456.4 0.000138 1.30E-09 74037.374 0.000351 4.75E-09 ND ND ND ND ND ND
TXG-0226 148097.7 0.00032 2.16E-09 ND ND ND ND ND ND ND ND ND
TXG-0227 175242.9 0.000306 1.75E-09 279594.3 0.000341 1.22E-09 203744.8 0.000338 1.66E-09 198083.4 0.000312 1.57E-09
TXG-0228 147000.5 0.000338 2.30E-09 147785.36 0.000368 2.49E-09 150894.1 0.000337 2.23E-09 144708 0.000316 2.18E-09
TXG-0229 51842.91 0.000564 1.09E-08 135511.09 0.000352 2.60E-09 129558.1 0.000355 2.74E-09 121189.8 0.000344 2.84E-09
TXG-0230 93451.94 0.000182 1.94E-09 282891.09 0.00014 4.96E-10 291515.6 0.000147 5.04E-10 247672.2 0.000158 6.37E-10
實例13 中和測定
除了已知的SARS-2和其他病毒結合的49種對照抗體以外，篩選在上文實例6中鑒定的所有239種抗體。用SARS-CoV-2 B.1譜系的臨床分離株（MEX-BC2/2020）進行測定。此病毒攜帶在刺突蛋白中D614G突變（完整序列可以GISAID/EpiCoV資料庫ID：EPI_ISL_747242獲得）。所述篩選是在Vero E6細胞中用微量中和測定來進行，所述微量中和測定利用對病毒誘導的致細胞病變效應（CPE）的預防。所有抗體（即，測試項目）是以變化濃度來提供（0.06至0.23mg/mL），並且它們被儲存在4ºC直至使用。所述篩選是在十天中進行的十個不同實驗中進行，每個實驗平行評估大約30種Ab的活性。所有板都包括陽性對照，即來自也已經接受第一劑量的Pfizer/BioNTech mRNA疫苗（BNT162b2）的恢復期患者的血漿。血漿是在疫苗接種後21天收集的。
對於此篩選，Vero E6細胞用於評價抗體測試專案針對有複製能力的SARS-CoV-2病毒的中和活性。抗體在被添加至細胞之前首先與病毒一起在37ºC預孵育1小時。在Ab/病毒樣品的預孵育後，用混合物激發Vero E6細胞。在添加至細胞後，抗體存在于細胞培養物中持續感染的持續時間（96小時），在此時間進行“中性紅”吸收測定以確定病毒誘導的CPE的程度。對CPE的預防用作替代標記以確定測試專案針對SARS-CoV-2的中和活性。
使用始於1,000ng/mL的五倍稀釋方案以一式兩份測試抗體的八種稀釋物用於中和測定。來自中和測定的代表性原始資料顯示於圖19和圖20中。在可能時，展示中和活性的抗體的IC 50值是使用GraphPad Prism軟體來確定。在每個板上使用單線態資料點（貫穿1:20480的8個兩倍稀釋物）評估血漿對照。對照抗體和抗體測試專案的代表性中和曲線（IC 50）顯示於圖21和圖22中。 基於CPE的中和測定的資料分析
首先計算在僅媒劑存在下在受感染細胞中觀察到的在540nm的平均吸光度（A540），然後將其從所有樣品減去，以確定對病毒誘導的CPE的抑制。然後在減去在受感染細胞中觀察到的吸光度信號之後，將資料點針對在未感染細胞中觀察到的平均A540信號（“類比”）歸一化。
在基於CPE的中性紅中和測定中，未感染細胞保持存活並且以高於非活細胞的水準吸收染料。在不存在抗體的情況下，病毒誘導的CPE在受感染細胞中導致細胞死亡，並降低A540信號（此值等於0%中和）。相比之下，與中和抗體一起孵育預防病毒誘導的CPE並且導致與在未感染細胞中觀察到的吸光度水準類似的吸光度水準。受感染細胞中細胞活力的完全恢復表示對病毒的100%中和。每個板以一式三份（A-C行和F-H行）或一式兩份（D行和E行）評估3種抗體。然而，資料分析避開了位於A行和H行中的樣品以使“邊緣效應”最小化。因此，以一式兩份評價所有抗體。未感染細胞和受感染細胞在不存在抗體的情況下使用各自的六個重復資料點進行分析。對照中和血漿是以單線態資料點（1:160或1:320至1:20480）運行。
在選擇資料用於分析之前，在QC步驟期間分析每個板。QC包括針對大於2.5的信背比值，以及低於20的未感染中的CV百分比（CV ＜ 20%）。所有板都通過了QC並且不需要進行重複。在一些情況下，被鑒定為離群值的資料點可能已經被去除，或者它們被未使用的額外行的另外的資料點交換（後者僅用於A-C或F-H中的抗體）。然而，很少需要這些行動，並且篩選的總體變異極佳且在本文所述的中和研究中典型地所見的範圍內。 活SARS-CoV-2測定中的對照抑制劑和品質控制
在每個板上進行用於感染力測定的品質控制以確定：i) 信背比（S/B）值；ii) 由具有針對SARS-CoV-2的中和活性的血漿進行的抑制，以及；iii) 測定的變異，如通過所有數據點的變異係數（C.V.）所測量。所有對照如針對測定所預期來發揮作用，並且變異在供應商實驗室中所見的典型範圍內。
每個板中所有C.V.（所有一式兩份資料點的）平均值低於10%（10個板的平均CV為7.1%，而在每個板上重複六次的未感染對照（“模擬”）的變異低於5%（平均值3.2%）（參見例如，表8）。對於十個代表性板，通過將未感染細胞中的平均信號（A540nm）除以受感染細胞中的平均信號（僅媒劑）來估算的中和測定的信背比（S/B）是4.1倍。在將未感染細胞中的信號與“無細胞”背景孔中的信號相比較時，測定的S/B比大於10（資料未顯示）。每個板的S/B值和變異可在伴隨的excel文件總結中獲得。
為了評價288種Ab針對SARS-CoV-2的中和活性，使用在病毒刺突蛋白中攜帶D614G突變的臨床分離株（MEX- BC2/2020）。此分離株的完整序列可在GISAID/EpiCoV資料庫以識別字EPI_ISL_747242獲得。
基於CPE的中和測定是通過在存在或不存在抗體的情況下感染Vero E6細胞來進行。在4天的感染後，細胞的感染導致顯著致細胞病變效應和細胞死亡。在此篩選中，在抗體存在下病毒CPE的降低用作替代標記以確定所測試專案的中和活性。
Vero E6細胞被維持在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中，本文中稱為DMEM10。在細胞接種後二十四小時，測試樣品被提交至在不同板中使用含有2% FBS的DMEM（DMEM2）的連續稀釋。然後，將在DMEM2中稀釋的病毒或僅DMEM2與抗體測試項目在37ºC在加濕孵育器中一起孵育1小時。在孵育後，從細胞去除培養基，然後用SARS-CoV-2/抗體預孵育混合物激發細胞。預先滴定病毒接種物的量以導致被具有針對SARS-CoV-2的已知中和活性的抗體抑制的線性反應。含有病毒接種物的細胞培養基在病毒吸附後未被去除，並且抗體和病毒被維持在所述培養基中持續測定的持續時間（96小時）。在此階段後，用中性紅（NR）吸收測定來監測細胞活力的程度。
在3天的感染後，在顯微鏡下定期監測病毒誘導的CPE，並且在4天后，將細胞用中性紅染色以監測細胞活力。活細胞在其溶酶體中摻入中性紅。中性紅的吸收依賴於活細胞維持溶酶體內部pH低於細胞質的能力，此過程需要ATP。在溶酶體內部，染料變得帶電荷並且被保留。在與中性紅（0.017%）一起孵育3 h後，洗除額外的染料，並且通過將細胞與含有50%乙醇和1%乙酸的溶液一起孵育15分鐘來從溶酶體萃取中性紅。中性紅的量是通過在讀板器中測量在540nm的吸光度來估算。用於確定抗體測試項目的抗SARS-CoV-2活性所遵循的通用程序總結於圖18中。
在這些實驗中，使用始於1 μg/mL的五倍連續稀釋物以一式兩份評價抗體。對照包括未感染細胞（“模擬感染的”）以及僅用媒劑處理的受感染細胞。一些細胞用源自恢復期患者的陽性對照血漿進行處理，所述患者也被投予第一劑量的Pfizer/BioNTech mRNA疫苗（BNT162b2）。血漿是在疫苗注射後21天收集的。 結果
在針對SARS-CoV-2（譜系B.1，攜帶D614G突變）測試的抗體中，所有抗體針對大約40%展示可測量的中和活性。展示可測量的中和活性的示例性抗體包括TXG-0049、TXG-0051、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0098、TXG-0108、TXG-0115、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0140、TXG-0147、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0208、TXG-0213和TXG-0226。下表8提供六（6）種示例性抗體的中和活性的總結，如通過活SARS-CoV-2測定中的IC 50所確定。 表8：示例性抗體的中和活性，如在針對SARS-CoV-2（譜系B.1，攜帶D614G突變）的測試中所確定。
抗體 IC 50
CTRL-0003 13887
CTRL-0003 13887
CTRL-0004 17.7
CTRL-0005 9.7
CTRL-0006 19.4
CTRL-0007 496.5
CTRL-0008 103.6
CTRL-0009 35
CTRL-0010 2460
CTRL-0011 2270
CTRL-0012 630,000
CTRL-0013 666
CTRL-0014 640.8
CTRL-0015 712
CTRL-0016 624.2
CTRL-0021 639,000
CTRL-0026 769.1
CTRL-0027 222.7
CTRL-0028 82034
CTRL-0033 1245
CTRL-0034 561.5
CTRL-0037 1508
CTRL-0038 23.8
CTRL-0039 60.4
CTRL-0040 281.8
CTRL-0041 87,000
CTRL-0043 42069
CTRL-0046 888.9
CTRL-0047 22168
CTRL-0048 798.2
TXG-0115 159
TXG-0140 40.2
TXG-0153 709.9
TXG-0154 21.9
TXG-0173 363
TXG-0174 696.5
不包括29中對照抗體，至少兩（2）個命中展示IC 50值低於100 ng/mL，包括TXG-140（40 ng/mL）和TXG-154（22 ng/mL）。
IC 50值從一位數ng/mL（9 ng/mL）至大約1.0 μg/mL變化。對於所測試的一些Ab，無法生成精確IC 50值。未能以所測試的任何濃度中和病毒的抗體被給予大於1 μg/mL（＞ 1 μg/mL）的IC 50值。抗體的中和效力的總結也顯示於圖26中。
在這些實驗中，在每個板上運行陽性血漿對照（CS478 pi_vac_pf1，Pfizer疫苗的血漿）以確定板內和日間變異。所有板的平均NT50值和標準差為2,183 ± 551（CV = 25.2%），且在同一天評價板時變異較低。值得注意的是，血漿對照的NT50值是用劑量-反應曲線使用單線態資料點（如與一式兩份相比）來生成，並且可以在這些對照中觀察到變異增加。
另外，生成被鑒定為具有針對活SARS-COV-2的中和活性的抗體的UpSet圖（參見例如，圖24），其中將所述抗體分箱至抗原箱中，如圖23中所述。該圖中所述的資料說明，本公開文本中所述的BEAM-seq過程允許快速鑒定具有針對幾種所關注的SARS-CoV-2 S變異體（VoC）的寬且穩健的中和活性的許多抗體，所述變異體例如β、γ和κ，以及HKU1（其是不同的冠狀病毒）。
另外，也生成從本文所述的BEAM-seq工作流檢索到的強效（IC50 ＜= 1000 ng / ml）中和抗體的UpSet圖（參見例如，圖25A和圖25B）。圖25A是選自實例6中鑒定的239種抗體的強效中和抗體的Upset圖。圖25B是選自表3中抗體的強效中和抗體的Upset圖。在這些UpSet圖中，行表示這些中和抗體與來自所關注的主要SARS-CoV-2變異體的融合前刺突三聚體、和地區性HKU1冠狀病毒刺突蛋白以及SARS-CoV-2 N末端結構域的結合。還觀察到，在這些實驗中鑒定的抗體在其VH、VL和同種型/亞類方面具有多樣性（參見表3）。發現這些抗體使用18種不同的VH基因和46種獨特的VH : VL配對。總而言之，在這些圖中描述的資料說明，本公開文本中所述的BEAM-seq過程允許快速鑒定具有針對幾種所關注的SARS-CoV-2 S變異體（VoC）的強效且寬的中和活性的許多抗體。 實例14 表位分箱測定
此實例描述進行以評估本文所述的選定抗體的結合特徵的實驗的結果。 方法學
1) 抗原：
a) 來自SARS-CoV-2 USA-WA1/2020分離株的融合前三聚化刺突蛋白，ACRO Biosystems。
b) 來自SARS-CoV-2δ變異體的融合前三聚化刺突蛋白，ACRO Biosystems。
c) SARS-CoV-2 NTD，ACRO Biosystems。
2) 表面等離子體共振（SPR）技術：
a) 競爭/夾心法。
b) 雙向/預混合物。
使用備有HC30M晶片的Carterra LSA SPR生物感測器配在25ºC在HBS-TE（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05% Tween-20）中以預混合物形式進行表位分箱實驗。首先，抗體通過EDC/NHS啟動被胺偶聯至感測器晶片，之後進行乙醇胺HCl淬滅。抗體和SARS-CoV-2融合前穩定的S三聚體被組合並在含有0.5 mg/ml BSA的HBS-TE中分別以120 nM和7.5 nM孵育1小時。此構成相對於S三聚體抗原的5莫耳過量，從而解釋每個分子的三（3）個結合位點。每個預混合物樣品被注射至固定的抗體上以確定阻斷、部分阻斷或非阻斷活性。在注射之間用Pierce IgG洗脫緩衝液（Thermo Fisher Scientific）使感測器晶片再生。
使用Carterra’s Epitope Tool軟體分析資料。簡言之，阻斷分配是相對於針對僅S三聚體的結合反應（歸一化為1）來確定；給出小於0.5的結合反應的預混合物被確定為阻斷的，0.5-0.7的結合反應是中間阻斷的，並且高於0.7的結合反應是不阻斷的。生成表示競爭結果的熱圖，其中紅色、黃色和綠色細胞分別表示阻斷的、中間的和未阻斷的分析物/配體對。本文所述的示例性抗體的結合特徵的總結呈現於圖27-圖28和下表9中。 表9：示例性抗體的表位分箱，如通過使用SPR競爭測定和雙向測定在針對來自SARS-CoV-2 USA-WA1/2020分離株（WA1）和/或SARS-CoV-2δ變異體（δ）的融合前三聚化刺突蛋白的測試中所確定。這些實驗中包括多種對照抗體（CTRL），包括：CTRL-0004：凱西瑞單抗；CTRL-0005（伊德維單抗）、CTRL-0006：巴馬尼單抗；CTRL-0007：（依替昔單抗）、CTRL-0008：索托維單抗；以及CTRL-0009：替科維單抗。NA：不適用。其他：能夠與表8的同一欄中鑒定的任何其他箱中的抗體結合至不同表位的抗體。
抗體 WA1 WA1 (雙向的) Δ Δ (雙向的)
CTRL-0004 4 4 4 4*
CTRL-0005 箱3/4 箱3/4 箱3/4 箱3/4
CTRL-0006 箱3/4 NA 其他 NA
CTRL-0007 4 4 4 4*
CTRL-0008 3 3 3 NA
CTRL-0009 4 4 4 4*
CTRL-0034 Other NA 5 NA
CTRL-0038 箱3/4 箱3/4 箱3/4 箱3/4
CTRL-0039 箱3/4 NA 5 NA
TXG-0072 2 NA 箱1/2 NA
TXG-0085 其他 NA 其他 NA
TXG-0112 其他 NA 其他 NA
TXG-0115 箱3/4 箱3/4 5 NA
TXG-0136 1 1 5 NA
TXG-0137 1 1 2 2
TXG-0140 箱3/4 箱3/4 箱3/4 NA
TXG-0153 3 3 箱2/3 箱2/3
TXG-0154 箱3/4 箱3/4 箱3/4 箱3/4
TXG-0173 1 NA 其他 NA
TXG-0174 1 1 2 2
TXG-0192 其他 NA 5 NA
TXG-0227 其他 NA 其他 其他
TXG-0228 其他 NA 其他 其他
TXG-0229 其他 NA 其他 其他
TXG-0230 其他 NA 5 5
資料解釋
在這些實驗中，共用表位箱的抗體是以劑量依賴性方式競爭結合至相同表位的抗體。
如上文表中所示和下文進一步描述，所發現的抗體分組至五個重要的表位箱中。此外，多種所發現的抗體分組至所述五個重要箱以外的獨特箱中。 A. NTD靶向抗體
如表9中所示，這些表位分箱實驗中測試的五（5）種抗體分組至WA1三聚體箱1或2中。這些可能表示靶向來自SARS-CoV-2 USA-WA1/2020分離株（WA1）的刺突蛋白的NTD的抗體，這是基於表明分組至箱1和2中的抗體展現對SARS-CoV-2 S蛋白的N末端結構域（NTD）的高（nM）親和力的SPR資料以及所述抗體不與WA1三聚體箱3、4或3/4中的抗體（其包括已經顯示靶向RBD表位的FDA授權的抗體）競爭結合的觀察。發現所有這5種抗體都展示可測量的中和活性，如通過活SARS-CoV-2測定中的IC 50所確定。靶向WA1分離株的NTD並且在活SARS-CoV-2測定中具有可測量的中和活性的抗體的例子包括TXG-0072、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0173和TXG-0174。靶向WA1分離株的NTD並強效中和活SARS-CoV-2的抗體的例子包括XG-0173和TXG-0174。
如表9中所示，這些表位分箱實驗中測試的三（3）種抗體分組至δ三聚體箱2或箱1/2中。這些可能表示靶向來自SARS-CoV-2δ變異體的刺突蛋白的NTD的抗體，這是基於表明分組至這些箱中的抗體展現對SARS-CoV-2 S蛋白的N末端結構域（NTD）的高（nM）親和力的SPR資料以及所述抗體不與δ三聚體箱3、4或3/4（其包括已經顯示靶向RBD表位的FDA授權的抗體）中的抗體競爭結合的觀察。發現所有這3種抗體都展示可測量的中和活性，如通過活SARS-CoV-2測定中的IC 50所確定。靶向WA1分離株的NTD並且在活SARS-CoV-2中具有可測量的中和活性的抗體的例子包括TXG-0072、TXG-0137和TXG-0174。靶向WA1分離株的NTD並強效中和活SARS-CoV-2的抗體的例子包括TXG-0174。
B. RBD靶向抗體
如表9中所示，這些表位分箱實驗中測試的四（4）種抗體分組至WA1三聚體箱3或箱3/4中。這些可能表示主要靶向來自SARS-CoV-2 USA-WA1/2020分離株（WA1）的刺突蛋白的RBD的抗體，這是基於所述抗體與已經顯示靶向RBD表位的FDA授權的抗體競爭結合的觀察。發現所有這4種抗體都展示可測量的中和活性，如通過活SARS-CoV-2測定中的IC 50所確定。主要靶向WA1分離株的RBD並強效中和活SARS-CoV-2的抗體的例子包括TXG-0115、TXG-0140、TXG-0153和TXG-0154。
如表9中所示，在這些表位分箱實驗中測試的一（1）種抗體與CTRL-0008（索托維單抗）一起分組至WA1三聚體箱3中。這種抗體可能表示靶向至少部分區別於被箱3/4靶向的那些表位的WA1 RBD表位（例如，區別于被除了索托維單抗以外測試的FDA批准的抗體靶向的那些表位的RBD表位）的抗體。發現這種抗體（TXG-0153）展示可測量的中和活性，如通過活SARS-CoV-2測定中的IC 50所確定。這種抗體（TXG-0153）也是在WA1三聚體箱3中並且強效中和活SARS-CoV-2的抗體的例子。
如表9中所示，在這些表位分箱實驗中測試的三（3）種抗體與CTRL-0005（伊德維單抗）和CTRL-0006（巴馬尼單抗）一起分組至WA1三聚體箱3/4中。這些可能表示靶向至少部分區別於被箱3靶向的那些表位的WA1 RBD表位的抗體。發現所有這3種抗體都展示強效中和活性，如通過活SARS-CoV-2測定中的IC50所確定。在WA1三聚體箱4中並且強效中和活SARS-CoV-2的抗體的例子包括TXG-0115、TXG-0140和TXG-0154。
在這些表位分箱實驗中測試的兩（2）種抗體與CTRL-0005（伊德維單抗）一起分組至δ三聚體箱3/4中。這些可能表示主要靶向來自SARS-CoV-2δ變異體的刺突蛋白的RBD的抗體，這是基於所述抗體與已經顯示靶向RBD表位的FDA授權的抗體競爭結合的觀察。發現這兩種抗體（TXG-0140和TXG-0154）強效中和活SARS-CoV-2，如通過活SARS-CoV-2測定中的IC 50所確定。主要靶向SARS-CoV-2 δ變異體的RBD並強效中和活SARS-CoV-2的抗體的例子包括TXG-0140和TXG-0154。
C. 其他表位
在這些表位分箱實驗中測試的七（7）種抗體分組至WA1三聚體箱“其他”中。這些可能表示靶向區別於被任何其他WA1三聚體箱靶向的表位的表位的抗體。這些類別中的示例性抗體包括TXG-0085、TXG-0112、TXG-0192、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
在這些表位分箱實驗中測試的四（4）種抗體分組至δ三聚體箱5中。這些可能表示靶向不同於其他分箱組（例如，不同於任何測試的FDA批准的抗體）的δ變異體表位的抗體。這個類別中的示例性抗體包括：TXG-0115、TXG-0136、TXG-0192和TXG-0230。在這些抗體中，一種抗體展示可測量的中和活性，如通過活SARS-CoV-2測定所確定。這種抗體（TXG-0115）是在δ三聚體箱5中的可以中和活SARS-CoV-2的抗體的例子。
在這些表位分箱實驗中測試的六（6）種抗體與CTRL-0006（巴馬尼單抗）一起分組至δ三聚體箱“其他”中。這些可能表示靶向區別於被任何其他δ三聚體箱靶向的表位的表位的抗體。這些類別中的示例性抗體包括TXG-0085、TXG-0112、TXG-0173、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0229。在這六種抗體中，一種抗體（TXG-0173）展現針對活SARS-CoV-2的強效中和活性。
分組至不同表位箱中的抗體可以有利地用於治療性抗體混合劑或組合療法方案中。例如，來自箱A的中和抗體可以由此與來自箱B的中和抗體有效組合，因為所述兩種抗體不結合在同一位置。可以有利地用於組合療法或抗體混合劑中的這樣的互補箱的例子包括：
NTD和RBD靶向組合： a.  抗體1：來自箱1或箱2的抗體，所述兩個箱表示NTD結合抗體 b.  抗體2：來自箱3、4或3/4的抗體，所述箱表示主要靶向RBD的抗體
RBD區別性靶向組合： a.  抗體1：來自箱3的抗體（索托維單抗樣抗體） b.  抗體2：來自箱4的抗體
RBD部分區別性靶向組合： a.  抗體1：來自箱3或4的抗體 b.  抗體2：來自箱3/4的抗體，所述抗體與來自箱3或4的抗體部分競爭
儘管已經公開了本公開文本的特定替代方案，但是應理解，各種修改和組合是可能的並且涵蓋於所附申請專利範圍的真實精神和範圍內。因此，無意限制于本文呈現的確切摘要和公開文本。
無
圖1顯示通過使用螢光啟動細胞分選（FACS）技術進行的B細胞的抗原特異性富集的示例性方案。在這些實驗中，將細胞首先針對作為單一活（7AAD 陰性）和PE-Cy7-CD19+進行門控，然後針對其PE和/或APC狀態直接分選至主混合物和水中。在此圖中，Y軸表示PE信號（三聚化SARS-2糖蛋白S抗原+和/或HSA+對照抗原結合細胞）。X軸表示APC信號（融合前三聚化SARS-2 S糖蛋白D614G抗原+和/或HSA+對照抗原結合細胞）。與每個門名稱相鄰的數字表示對於該門，事件相對於親本群體（單一活CD19+細胞）的分數。 圖2示意性地說明，本文所述的新評分系統允許確定相對K D值，繼而有助於對具有良好動態範圍的結合抗體的鑒定。 圖3A-圖3B示意性地描繪進行以說明本文所述的新評分系統允許用資料集選擇高親和力抗體的代表性分析的結果。在此分析中，BEAM得分是近似正態分佈的，隨著靶抗原結合相對於表現的抗體和對照抗原增加而指數性增加，與HCDR3連接區的生成概率相關，例如，遵循體細胞超變（SHM）與增加親和力的已知大體關係，並且還揭示根據文獻種類轉換增加預測的相對親和力。 圖4示意性地總結基於相對K D進行以說明克隆型富集的代表性分析的結果。發現BEAM得分在含有更多子抗體的子譜系內也通常高於狹窄的子譜系。 圖5顯示根據本公開文本的一些實施例用於分區單獨生物顆粒的示例性微流體通道結構。 圖6顯示用於將珠受控分區至離散液滴中的示例性微流體通道結構。 圖7顯示示例性攜帶條碼的珠。 圖8說明攜帶條碼的珠的另一例子。 圖9示意性地說明微孔陣列的例子。 圖10示意性地說明用於加工核酸分子的工作流的例子。 圖11示意性地說明標記劑的例子。 圖12描繪攜帶條碼的珠的例子。 圖13A、圖13B和圖13C示意性地描繪用於加工核酸分子的工作流的例子。 圖14顯示用於將攜帶條碼的珠遞送至液滴的示例性微流體通道結構。 圖15A和圖15B描繪野生型SARS-CoV刺突蛋白（圖15A）和變異體SARS-CoV刺突蛋白（圖15B）的胺基酸序列。各種突變已經被引入並且通過突變胺基酸上方的初始胺基酸來指示。這些突變分為3個類別：1) 脯胺酸穩定/S2P突變（F817P、A892P、A899P、A942P、K986P、V987P），2) 丙胺酸穩定突變（R683A、R685A），以及3) 病毒變異體突變（D614G）。序列中的星號指示用於產生下文實例中所述實驗中使用的抗原的序列的起點和終點。抗原的C末端（在第2個星號結束）與T4三聚化結構域和His標籤融合。 圖16A-圖16B示意性地總結進行以評價本公開文本的示例性抗體與以下抗原的結合親和力的代表性SPR分析的結果：(1) 三聚化野生型SARS-CoV-2 S蛋白（圖16A）、(2) 具有D614G取代的SARS-CoV-2 S蛋白變異體（圖16B）。 圖17A描繪具有相同KD值10 nM和變化的kon和koff速率的假設抗體的結合動力學。虛線和實線曲線描繪由於結合穩定性而具有高治療潛力的抗體的最佳結合動力學，而點劃線和粗實線曲線描繪次最佳結合動力學。 圖17B描繪示例性TXG抗體和FDA批准的或後期臨床開發階段刺突抗體的結合動力學（來自每種抗體的資料以一式三份顯示）。具有最佳結合動力學的抗體在圖17A中被描繪為具有星號（*）的框。具有次最佳結合動力學的抗體在圖17A中被描繪為具有實心圓形（●）的框。用作陽性對照的FDA批准的或後期臨床開發階段刺突抗體被描繪為具有實心三角形（▲）的框。 圖17C描繪給定TXG抗體對融合前三聚刺突的Koff與其結合動力學之間的關係。此處顯示Koff是出於簡潔的目的，因為受體-配體對的半衰期和平均壽命動力學是由相互作用的Koff而非Kon或Koff與Kon的比率（KD）來決定。顯示上述每個動力學譜的箱形圖並顯示於圖17C中。二十七（27）種抗體被顯示為具有1e-05的Koff速率，表明它們已經超過來自SPR資料的檢測下限，並因此具有比所提供的資料中報告的那些更低的估計KD值。 圖17D描繪給定TBS-抗體對融合前三聚刺突的Koff與Kon之間的關係，依照動力學譜進行顏色編碼。 圖18示意性地描繪用於確定本文所述的各種抗體的抗SARS-CoV-2活性的活病毒中和測定的通用程序。 圖19描繪來自圖18中所述的中和測定的代表性原始資料。CTRL-0004：凱西瑞單抗（Casirivimab）；CTRL-0006：巴馬尼單抗（Bamlanivimab）；CTRL-0007：依替昔單抗（Etesevimab）；CTRL-0008：索托維單抗（Sotrovimab）；CS478 pi_vac_pf1，Pfizer疫苗的陽性血漿對照。 圖20描繪來自圖18中所述的中和測定的代表性中和百分比。CTRL-0004：凱西瑞單抗；CTRL-0006：巴馬尼單抗；CTRL-0007：依替昔單抗；CTRL-0008：索托維單抗；CS478 pi_vac_pf1，Pfizer疫苗的陽性血漿對照。 圖21示意性地描繪四種FDA批准的抗體或後期臨床開發中的抗體（對照）的代表性中和曲線（ID 50）。CTRL-0004：凱西瑞單抗；CTRL-0006：巴馬尼單抗；CTRL-0007：依替昔單抗；CTRL-0008：索托維單抗；CS478 pi_vac_pf1，Pfizer疫苗的陽性血漿對照。 圖22示意性地描繪根據本公開文本的一些實施例的六種示例性抗體的代表性中和曲線（ID50）。 圖23示意性地描繪UpSet圖，其中基於兩輪SPR結合親和力資料將抗體分箱至抗原箱中。對於要置於箱中的抗體，需要來自實例9和實例12中所述SPR實驗中的至少一個的在所有抗原濃度下的可檢測動力學擬合，或者正交中和資料。 圖24示意性地描繪被鑒定為具有針對活SARS-COV-2的中和活性的抗體的UpSet圖，其中將抗體分箱至抗原箱中，如圖23中所述。 圖25A和圖25B描繪在此BEAM-seq工作流中檢索到的強效（IC50 ＜= 1000 ng / ml）中和抗體的UpSet圖。圖25A是選自實例6中鑒定的239種抗體的強效中和抗體的Upset圖。圖25B是選自表3中抗體的強效中和抗體的Upset圖。在這些圖中，行表示這些中和抗體與來自所關注的主要SARS-CoV-2變異體的融合前刺突三聚體、和地區性HKU1冠狀病毒刺突蛋白以及SARS-CoV-2 N末端結構域的結合。 圖26示意性地總結如在針對SARS-CoV-2的測試中確定的抗體的中和效力（也參見表8）。 圖27是總結實例14中所述的表位分箱測定的結果的熱圖，其中針對與特定靶抗原（即，來自SARS-CoV-2 USA-WA1/2020分離株的融合前三聚化刺突蛋白）的結合以成對和組合方式針對彼此測試抗體。 圖28是總結實例14中所述的表位分箱測定的結果的熱圖，其中針對與來自SARS-CoV-2δ變異體的刺突蛋白的結合以成對和組合方式針對彼此測試抗體。
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無。

Claims (184)

  1. 一種特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體選自TXG-0153、TXG-0115、TXG-140和TXG-154，其中： a.  TXG-0153的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 88、168、248、328、408和488中所示的胺基酸序列； b.  TXG-0115的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 72、152、232、312、392和472中所示的胺基酸序列； c.  TXG-0140的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 83、163、243、323、403和483中所示的胺基酸序列；並且 d.  TXG-0154的重鏈CDR 1、2和3（HCDR1、HCDR2、HCDR3）和輕鏈CDR 1、2和3（LCDR1、LCDR2、LCDR3）分別具有如SEQ ID NO: 89、169、249、329、409和489中所示的胺基酸序列。
  2. 一種特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，並且其中所述抗體或其片段與結合至所述SARS-CoV-2刺突蛋白的受體結合結構域（RBD）的胺基酸332-337、339-340、343-346、354、356-361、440-441和509的抗體或其抗原結合片段共用表位箱。
  3. 一種特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  包含選自SEQ ID NO: 1-3的胺基酸序列的重鏈互補決定區1（HCDR1）； b)  包含選自SEQ ID NO: 4-6的胺基酸序列的HCDR2；以及 c)  包含選自SEQ ID NO: 7-9的胺基酸序列的HCDR3。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO: 1、4和7中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。
  5. 如請求項1至3中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO: 2、5和8中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至3中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO: 3、6和9中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列。
  7. 一種特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  包含選自SEQ ID NO: 10-12的胺基酸序列的輕鏈互補決定區1（LCDR1）； b)  包含選自SEQ ID NO: 13-15的胺基酸序列的LCDR2；以及 c)  包含選自SEQ ID NO: 16-18的胺基酸序列的LCDR3。
  8. 如請求項7所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO: 10、13和16中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
  9. 如請求項8所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO: 11、14和17中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
  10. 如請求項8所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO: 12、15和18中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
  11. 一種特異性結合至SARS-CoV-2的刺突（S）蛋白的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  包含選自SEQ ID NO: 1-3的胺基酸序列的HCDR1； b)  包含選自SEQ ID NO: 4-6的胺基酸序列的HCDR2； c)  包含選自SEQ ID NO: 7-9的胺基酸序列的HCDR3； d)  包含選自SEQ ID NO: 10-12的胺基酸序列的LCDR1； e)  包含選自SEQ ID NO: 13-15的胺基酸序列的LCDR2；以及 f)  包含選自SEQ ID NO: 16-18的胺基酸序列的LCDR3。
  12. 如請求項11所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  分別如SEQ ID NO: 1、4和7中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及 b)  分別如SEQ ID NO: 10、13和16中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
  13. 如請求項11所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  分別如SEQ ID NO: 2、5和8中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及 b)  分別如SEQ ID NO: 11、14和17中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
  14. 如請求項11所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  分別如SEQ ID NO: 3、6和9中所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的胺基酸序列；以及 b)  分別如SEQ ID NO: 12、15和18中所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列至少90%相同。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR1包含選自SEQ ID NO: 1-3和SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。
  17. 如請求項15所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列100%相同。
  18. 如請求項1至17中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列至少90%相同。
  19. 如請求項1至18中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR2包含選自SEQ ID NO: 4-6和SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。
  20. 如請求項18所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列100%相同。
  21. 如請求項1至20中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列至少90%相同。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR3包含選自SEQ ID NO: 7-9和SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。
  23. 如請求項21所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列100%相同。
  24. 如請求項1至23中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列至少90%相同。
  25. 如請求項1至24中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR1包含選自SEQ ID NO: 10-12和SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。
  26. 如請求項24所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR1胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列100%相同。
  27. 如請求項1至26中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列至少90%相同。
  28. 如請求項1至27中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR2包含選自SEQ ID NO: 13-15和SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個或三個胺基酸由不同胺基酸取代。
  29. 如請求項25所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR2胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列100%相同。
  30. 如請求項1至29中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列至少90%相同。
  31. 如請求項1至30中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR3包含選自SEQ ID NO: 13-15和SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列，並且進一步其中所述胺基酸序列中的一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸由不同胺基酸取代。
  32. 如請求項30所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCDR3胺基酸序列與選自SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列100%相同。
  33. 如請求項1至32中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  包含具有與選自SEQ ID NO: 43-122的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1； b)  包含具有與選自SEQ ID NO: 123-202的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2； c)  包含具有與選自SEQ ID NO: 203-282的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3； d)  包含具有與選自SEQ ID NO: 283-362的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1； e)  包含具有與選自SEQ ID NO: 363-442的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 f)  包含具有與選自SEQ ID NO: 443-522的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
  34. 如請求項33所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  包含具有與選自SEQ ID NO: 43-45的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1； b)  包含具有與選自SEQ ID NO: 123-125的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2； c)  包含具有與選自SEQ ID NO: 203-205的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3； d)  包含具有與選自SEQ ID NO: 283-285的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1； e)  包含具有與選自SEQ ID NO: 363-365的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 f)  包含具有與選自SEQ ID NO: 443-445的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
  35. 如請求項33所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  包含具有與選自SEQ ID NO: 46-47的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1； b)  包含具有與選自SEQ ID NO: 126-127的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2； c)  包含具有與選自SEQ ID NO: 206-207的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3； d)  包含具有與選自SEQ ID NO: 286-287的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1； e)  包含具有與選自SEQ ID NO: 366-367的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 f)  包含具有與選自SEQ ID NO: 446-447的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
  36. 如請求項33所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  包含具有與選自SEQ ID NO: 117-120的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR1； b)  包含具有與選自SEQ ID NO: 197-200的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR2； c)  包含具有與選自SEQ ID NO: 277-280的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的HCDR3； d)  包含具有與選自SEQ ID NO: 357-360的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR1； e)  包含具有與選自SEQ ID NO: 437-440的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR2；以及 f)  包含具有與選自SEQ ID NO: 517-520的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列的LCDR3。
  37. 如請求項1至33中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含具有與選自SEQ ID NO: 523-1162的胺基酸序列的至少90%序列同一性的架構區。
  38. 如請求項1至34中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組的HCDR和LCDR： a)  TXG-0021、TXG-0022和TXG-0023； b)  TXG-0027和TXG-0028；或者 c)  TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
  39. 如請求項1至38中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： (a) 包含選自SEQ ID NO: 523-602的胺基酸序列的重鏈架構區1（HFWR1）； (b) 包含選自SEQ ID NO: 603-682的胺基酸序列的重鏈架構區2（HFWR2）； (c) 包含選自SEQ ID NO: 683-762的胺基酸序列的重鏈架構區3（HFWR3）；以及 (d) 包含選自SEQ ID NO: 763-842的胺基酸序列的重鏈架構區4（HFWR4）。
  40. 如請求項1至39中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中
  41. 如請求項1至40中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含表1中抗體的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  42. 如請求項41所述的抗體或抗原結合片段，其還包含相同抗體或抗原結合片段的重鏈架構區HFWR1、HFWR2、HFWR3和HFWR4。
  43. 如請求項39至42中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其還包含相同抗體或抗原結合片段的輕鏈架構區LFWR1、LFWR2、LFWR3和LFWR4。
  44. 如請求項1至43中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含含有具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的至少90%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區（HCVR）。
  45. 如請求項44所述的抗體或抗原結合片段，其中所述HCVR包含具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列。
  46. 如請求項1至45中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含含有具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的至少90%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區（LCVR）。
  47. 如請求項46所述的抗體或抗原結合片段，其中所述LCVR包含具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的100%序列同一性的胺基酸序列。
  48. 如請求項1至47中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含： a)  包含具有與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列的至少90%序列同一性的胺基酸序列的HCVR；以及 b)  包含具有與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列的至少90%序列同一性的胺基酸序列的LCVR。
  49. 如請求項1至48中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含分別與表1中抗體的HCVR和LCVR 90%相同的HCVR和LCVR。
  50. 如請求項1至48中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含表1中抗體的HCVR和LCVR。
  51. 如請求項1至50中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自表1。
  52. 如請求項1至51中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其還包含恒定區。
  53. 如請求項52所述的抗體或抗原結合片段，其中所述恒定區是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM重鏈恒定區。
  54. 如請求項52所述的抗體或抗原結合片段，其中所述恒定區是κ型或λ型輕鏈恒定區。
  55. 如請求項1至54中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體是人抗體。
  56. 如請求項1至54中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體是人類化抗體或嵌合抗體。
  57. 如請求項1至56中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體是單株抗體。
  58. 如請求項1至57中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其為單鏈抗體片段（scFv）、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab') 2或Fv片段。
  59. 如請求項1至58中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有與所述SARS-CoV-2 S蛋白的亞基中的表位的結合親和力。
  60. 如請求項59所述的抗體或抗原結合片段，其中SARS-CoV-2的S蛋白的所述亞基是S1亞基。
  61. 如請求項60所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有與所述S1亞基的受體結合結構域（RBD）或N末端結構域（NTD）的結合親和力。
  62. 如請求項59所述的抗體或抗原結合片段，其中SARS-CoV-2的S蛋白的所述亞基是S2亞基。
  63. 如請求項1至62中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述SARS-CoV-2 S蛋白包含一個或多個胺基酸取代。
  64. 如請求項63所述的抗體或抗原結合片段，其中所述SARS-CoV-2 S蛋白包含在選自K417、L452、K417、E484、E484、N501和D614的位置處的一個或多個胺基酸取代。
  65. 如請求項64所述的抗體或抗原結合片段，其中所述SARS-CoV-2 S蛋白包含選自K417T、K417N、L452R、E484K、E484Q、N501Y和D614G的一個或多個胺基酸取代。
  66. 如請求項65所述的抗體或抗原結合片段，其中所述SARS-CoV-2 S蛋白包含胺基酸取代K417N、E484K和N501Y。
  67. 如請求項64至66中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述SARS-CoV-2 S蛋白包含D614G取代。
  68. 如請求項1至67中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對所述SARS-CoV-S蛋白的三聚形式的結合親和力。
  69. 如請求項1至67中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對所述SARS-CoV-S蛋白的融合前三聚形式的結合親和力。
  70. 如請求項1至67中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚形式的穩定的融合前刺突蛋白的結合親和力。
  71. 如請求項1至67中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚形式的非融合前刺突蛋白的結合親和力。
  72. 如請求項1至67中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚形式的非S2P穩定的融合前刺突蛋白的結合親和力。
  73. 如請求項59至72中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於500 nM、小於120 nM、小於100 nM、小於50 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於5 nM、小於1 nM或小於1 pM的結合親和力。
  74. 如請求項73所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於120 nM的結合親和力。
  75. 如請求項74所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組的HCDR和LCDR：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0230。
  76. 如請求項74至75中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組的HCDR和LCDR：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0230。
  77. 如請求項74至76中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含三個重鏈CDR（HCDR1、HCDR2和HCDR3）和三個輕鏈CDR（LCDR1、LCDR2和LCDR3），其中所述重鏈CDR和所述輕鏈CDR獨立地選自以下抗體組的HCDR和LCDR：TXG-0022、TXG-0023、TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0062、TXG-0068、TXG-0072、TXG-0085、TXG-0089、TXG-0098、TXG-0112、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0152、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0192、TXG-0194、TXG-0195、TXG-0211、TXG-0213、TXG-0215、TXG-0217、TXG-0218、TXG-0226、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0230。
  78. 如請求項73至77中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S蛋白、其片段或其多聚形式的亞奈莫耳結合親和力。
  79. 如請求項78所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於500 pM、小於100 pM、小於50 pM、小於10 pM或小於5 pM的結合親和力。
  80. 如請求項78所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0028、TXG-0049、TXG-0056、TXG-0072、TXG-0089、TXG-0113、TXG-0115、TXG-0118、TXG-0121、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0138、TXG-0140、TXG-0145、TXG-0147、TXG-0153、TXG-0154、TXG-0165、TXG-0173、TXG-0174、TXG-0182、TXG-0194和TXG-0217。
  81. 如請求項1至80中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對HCOV和/或對選自β、γ、δ和κ的SARS-CoV-2 S變異體的亞奈莫耳結合親和力。
  82. 如請求項1至81中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段還具有與所述S1亞基的所述N末端結構域（NTD）的結合親和力。
  83. 如請求項81所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0115和TXG-0154。
  84. 如請求項81所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0140。
  85. 如請求項81所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0153。
  86. 如請求項81所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0173。
  87. 如請求項81所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0174。
  88. 如請求項1至87中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段，其中所述抗體具有針對SARS-CoV-2的中和活性。
  89. 如請求項88所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段中和至少50%的200倍組織培養感染劑量（200×TCID50）的所述冠狀病毒。
  90. 如請求項88至89中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體具有IC 50值低於1 µg/mL、低於200 ng/mL或低於40 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。
  91. 如請求項90所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體具有IC 50值的範圍為200 ng/mL至1,000 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。
  92. 如請求項90所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體具有IC 50值的範圍為40 ng/mL至200 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。
  93. 如請求項90所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體具有IC 50值的範圍為8 ng/mL至40 ng/mL的針對SARS-CoV-2的中和活性。
  94. 如請求項91所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0153、TXG-0173和TXG-0174。
  95. 如請求項92所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0115和TXG-0140。
  96. 如請求項90所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0140和TXG-0154。
  97. 如請求項93所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0154。
  98. 如請求項1至97中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述分離的抗體或其抗原結合片段是重組抗體或其抗原結合片段。
  99. 如請求項88所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有與SARS-CoV-2 S蛋白的N末端結構域（NTD）的結合親和力並強效中和活SARS-CoV-2。
  100. 如請求項99所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0072、TXG-0136、TXG-0137、TXG-0173和TXG-0174。
  101. 如請求項100所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0173和TXG-0174。
  102. 如請求項99所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有與來自SARS-CoV-2δ變異體的S蛋白的N末端結構域（NTD）的結合親和力。
  103. 如請求項102所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0072、TXG-0137和TXG-0174。
  104. 如請求項103所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0174。
  105. 如請求項88所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有主要與SARS-CoV-2 S蛋白的RBD的結合親和力並強效中和活SARS-CoV-2。
  106. 如請求項105所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0115、TXG-0140、TXG-0153和TXG-0154。
  107. 如請求項105所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0153。
  108. 如請求項105所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0115、TXG-0140和TXG-0154。
  109. 如請求項105所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合具有主要與來自SARS-CoV-2δ變異體的S蛋白的RBD的結合親和力。
  110. 如請求項109所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段選自TXG-0140和TXG-0154。
  111. 如請求項88至110中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0085、TXG-0112、TXG-0192、TXG-0227、TXG-0228、TXG-0229和TXG-0230。
  112. 如請求項88至111中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0115、TXG-0136、TXG-0192和TXG-0230。
  113. 如請求項112所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有針對活SARS-CoV-2的中和活性。
  114. 如請求項113所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0115。
  115. 如請求項88至114中任一項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段具有對來自SARS-CoV-2 δ變異體的S蛋白的結合親和力並且選自TXG-0085、TXG-0112、TXG-0173、TXG-0227、TXG-0228和TXG-0229。
  116. 如請求項115所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段強效中和活SARS-CoV-2。
  117. 如請求項116所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段是TXG-0173。
  118. 一種重組核酸，其編碼如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
  119. 如請求項118所述的重組核酸，其中所述核酸包含編碼包含與選自SEQ ID NO: 1163-1322的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的HCVR的核酸序列。
  120. 如請求項119所述的重組核酸，其中核酸包含具有與選自SEQ ID NO: 1487-1886的核酸序列的至少70%序列同一性的核酸序列。
  121. 如請求項118所述的重組核酸，其中所述核酸包含編碼包含與選自SEQ ID NO: 1323-1482的胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的LCVR的核酸序列。
  122. 如請求項121所述的重組核酸，其中所述核酸包含具有與選自SEQ ID NO: 1887-2286的核酸序列的至少70%序列同一性的核酸序列。
  123. 如請求項118至122中任一項所述的重組核酸，其中所述核酸包含 具有與選自SEQ ID NO: 1487-1886的核酸序列的至少70%序列同一性的第一核酸序列；以及 具有與選自SEQ ID NO: 1887-2286的核酸序列的至少70%序列同一性的第二核酸序列。
  124. 一種載體，其包含如請求項118至123中任一項所述的重組核酸。
  125. 如請求項124所述的載體，其中所述載體是表現載體。
  126. 如請求項124至125中任一項所述的載體，其中所述載體是質體載體或病毒載體。
  127. 一種重組細胞，其包含： a) 如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段；或者 b) 如請求項118至123中任一項所述的重組核酸；或者 c) 如請求項124至126中任一項所述的載體。
  128. 如請求項127所述的重組細胞，其中所述重組細胞是原核細胞或真核細胞。
  129. 一種轉基因動物，其包含如請求項124至126中任一項所述的載體。
  130. 如請求項129所述的轉基因動物，其中所述轉基因動物是非人動物。
  131. 如請求項129至130中任一項所述的轉基因動物，其中所述轉基因動物產生如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
  132. 一種用於產生抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括在使得產生所述抗體或抗原結合片段的條件下 (i) 飼養如請求項129至131中任一項所述的轉基因動物，或者 (ii) 培養如請求項127-128中任一項所述的重組細胞。
  133. 如請求項132所述的方法，所述方法還包括從 (i) 所述轉基因動物或 (ii) 所述重組細胞和/或培養所述重組細胞的培養基分離產生的抗體或抗原結合片段。
  134. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段和醫藥上可接受的載劑或稀釋劑。
  135. 如請求項134所述的醫藥組合物，其包含： a) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白（例如，與所述全長SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基）的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段； b) 具有與RBD的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與SARS-CoV-2 S蛋白的NTD的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段；或者 c) 具有與NTD的的結合親和力的第一抗體或抗原結合片段和具有與全長SARS-CoV-2 S蛋白（例如，與所述全長SARS-CoV-2 S蛋白的S1亞基）的結合親和力的第二抗體或抗原結合片段。
  136. 如請求項134至135中任一項所述的醫藥組合物，其中所述組合物是無菌組合物。
  137. 如請求項134至135中任一項所述的醫藥組合物，其中所述組合物被配製為疫苗。
  138. 如請求項134至137中任一項所述的醫藥組合物，其中所述組合物還包含佐劑。
  139. 如請求項134所述的醫藥組合物，其還包含第二治療劑。
  140. 如請求項139所述的醫藥組合物，其中所述第二治療劑選自：(i) 抗病毒劑、(ii) 抗炎劑、(iii) 特異性結合靶細胞的絲胺酸蛋白酶TMPRSS2的抗體或其抗原結合片段、以及 (iv) 特異性結合至CoV-S蛋白的第二抗體或其抗原結合片段。
  141. 一種用於治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況的方法，所述方法包括向所述受試者投予包含治療有效量的如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段的組合物。
  142. 一種用於減少SARS-Co-2V S蛋白與受試者的細胞的結合和/或減少SARS-CoV-2進入受試者的細胞中的方法，所述方法包括向所述受試者投予包含治療有效量的如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段的組合物。
  143. 如請求項141至142中任一項所述的方法，其中將所述抗體或抗原結合片段與綴合至治療劑的SARS-Co-2V S蛋白組合投予。
  144. 如請求項141至143中任一項所述的方法，其中向所述受試者投予一種或多種其他治療劑。
  145. 如請求項144所述的方法，其中所述一種或多種其他治療劑包含抗病毒藥或疫苗。
  146. 如請求項144所述的方法，其中所述一種或多種其他治療劑選自：(i) 抗病毒劑、(ii) 抗炎劑、(iii) 特異性結合TMPRSS2的抗體或其抗原結合片段、以及 (iv) 特異性結合至CoV-S蛋白的抗體或其抗原結合片段。
  147. 如請求項141至146中任一項所述的方法，其中將所述抗體或抗原結合片段皮下、靜脈內和/或肌內投予至所述受試者。
  148. 一種用於檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在的方法，所述方法包括使如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段與來自被SARS-CoV-2感染或懷疑被SARS-CoV-2感染的個體的生物樣品接觸。
  149. 一種用於鑒定具有對冠狀病毒刺突蛋白（CoV-S）的結合親和力的抗體的方法，所述方法包括： a) 使從已經暴露於冠狀病毒的受試者獲得的多個B細胞與多種抗原接觸，其中所述多種抗原包括CoV-S抗原和非CoV-S抗原，並且其中所述抗原各自包含報告寡核苷酸，其中所述接觸提供結合至CoV-S抗原的B細胞； b) 將結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞分區於多個分區的分區中，其中所述分區提供包含 (i) 結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞和 (ii) 包含共有條碼序列的多個核酸條碼分子的分區； c) 鑒定由已經結合至所述CoV-S抗原的所述B細胞產生的至少一種抗體或抗原結合片段的序列；以及 d) 評估所述抗體或抗原結合片段與CoV-S蛋白的結合親和力；以及 e) 如果所述抗體或抗原結合片段特異性結合至所述CoV-S蛋白，則將所述抗體或抗原結合片段鑒定為具有對所述CoV-S蛋白的結合特異性。
  150. 如請求項149所述的方法，其中所述報告寡核苷酸包含 (i) 鑒定所述抗原的報告序列和 (ii) 捕獲手柄序列。
  151. 如請求項149至150中任一項所述的方法，所述方法還包括將條碼部分與由所述B細胞產生的抗體或抗原結合片段偶聯以生成條碼化的抗體或抗原結合片段。
  152. 如請求項149至151中任一項所述的方法，其中所述多個核酸條碼分子中的第一核酸條碼分子還包含配置為與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列偶聯的捕獲序列，並且其中所述多個核酸條碼分子中的第二核酸條碼分子還包含配置為與mRNA分析物偶聯的捕獲序列。
  153. 如請求項152所述的方法，其中配置為與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列偶聯的所述捕獲序列與所述報告寡核苷酸的捕獲手柄序列互補。
  154. 如請求項152所述的方法，其中配置為與mRNA分析物偶聯的所述捕獲序列包含多聚T序列。
  155. 如請求項149至154中任一項所述的方法，其中所述第一核酸條碼分子和所述第二核酸條碼分子各自包含唯一分子識別字（UMI）。
  156. 如請求項149至155中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有與所述CoV-S蛋白的亞基上的表位的結合特異性。
  157. 如請求項156所述的方法，其中所述CoV-S蛋白的所述亞基是S1亞基。
  158. 如請求項156所述的方法，其中所述CoV-S蛋白的所述結構域是S2結構域。
  159. 如請求項157所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有與所述S1亞基的RBD或NTD的結合親和力。
  160. 如請求項149至159中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有對所述CoV-S蛋白的三聚形式的結合親和力。
  161. 如請求項149至159中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有對所述CoV-S蛋白的融合前三聚形式的結合親和力。
  162. 如請求項149至159中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚形式的穩定的融合前刺突蛋白的結合親和力。
  163. 如請求項149至159中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚形式的非融合前刺突蛋白的結合親和力。
  164. 如請求項149至159中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有對呈單體或多聚形式的非S2P穩定的融合前刺突蛋白的結合親和力。
  165. 如請求項149至164中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於500 nM、小於120 nM、小於100 nM、小於50 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於5 nM、小於1 nM或小於1 pM的結合親和力。
  166. 如請求項165所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有平衡解離常數（K D）值小於120 nM的結合親和力。
  167. 如請求項165至166中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有對CoV-S蛋白、其片段或其多聚形式的亞奈莫耳結合親和力。
  168. 如請求項167所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有K D值小於500 pM、小於100 pM、小於50 pM、小於10 pM或小於5 pM的結合親和力。
  169. 如請求項165至168中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段具有針對CoV-S蛋白的中和活性。
  170. 如請求項149至169中任一項所述的方法，其中所述CoV-S蛋白是SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或MERS-CoV的刺突蛋白。
  171. 如請求項149至170中任一項所述的方法，其中所述受試者懷疑被冠狀病毒感染，已經被冠狀病毒感染，已經接種疫苗，或者已經從冠狀病毒感染康復。
  172. 如請求項149至171中任一項所述的方法，其中所述受試者是哺乳動物受試者。
  173. 如請求項172所述的方法，其中所述哺乳動物受試者是人。
  174. 如請求項149至173中任一項所述的方法，其中所述抗原各自與鑒定所述抗原的螢光標記偶聯。
  175. 如請求項149至174中任一項所述的方法，所述方法還包括在 (b) 之前分離和/或富集所述多個單一B細胞。
  176. 如請求項175所述的方法，其中所述富集還包括基於對與所述抗原偶聯的一種或多種螢光標記的檢測來分選結合至所述CoV-S抗原和/或非CoV-S抗原的B細胞。
  177. 如請求項149至176中任一項所述的方法，其中所述CoV-S蛋白與條碼部分偶聯。
  178. 如請求項149至177中任一項所述的方法，所述方法還包括純化/分離已經被鑒定為具有對所述CoV-S蛋白的結合特異性的抗體或抗原結合片段。
  179. 如請求項149至178中任一項所述的方法，其中評估所述條碼化的抗體與所述CoV-S蛋白的結合親和力包括：
  180. 一種分離的抗體，其通過如請求項149至179中任一項所述的方法鑒定。
  181. 一種用於鑒定具有對冠狀病毒刺突蛋白（CoV-S）的結合親和力的抗體或抗原結合片段的套組，所述套組包含： (a) 多種CoV-S抗原和非CoV-S抗原，並且其中所述抗原各自包含含有 (i) 鑒定所述抗原的報告序列和 (ii) 捕獲手柄序列的報告寡核苷酸；以及 (b) 用於進行如請求項148至179中任一項所述的方法的說明書。
  182. 一種用於以下的套組：(i) 用於產生抗體或其抗原結合片段，(ii) 檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在，或者 (iii) 治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況，所述套組包含其使用說明書以及以下中的一種或多種： a) 如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段； b) 如請求項118至123中任一項所述的重組核酸；或者如請求項124-126中任一項所述的載體；以及 c) 如請求項127-128中任一項所述的重組細胞。
  183. 一種用於以下的套組：(i) 用於產生抗體或其抗原結合片段，(ii) 檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在，或者 (iii) 治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況，所述套組包含其使用說明書和如請求項134至140中任一項所述的醫藥組合物。
  184. 一種用於以下的套組：(i) 用於產生抗體或其抗原結合片段，(ii) 檢測生物樣品中SARS-CoV-2 S蛋白和/或SARS-CoV-2的存在，或者 (iii) 治療、預防或改善受試者中與SARS-CoV-2感染相關的健康狀況，所述套組包含其使用說明書以及以下中的一種或多種： a) 如請求項1至117中任一項所述的抗體或抗原結合片段； b) 如請求項134至140中任一項所述的醫藥組合物； c) 如請求項118至123中任一項所述的重組核酸；或者如請求項124-126中任一項所述的載體；以及 d) 如請求項127-128中任一項所述的重組細胞。
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JP6694877B2 (ja) * 2014-09-23 2020-05-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 抗ｉｌ−２５抗体およびその使用
EP3529270A2 (en) * 2016-10-21 2019-08-28 Adimab, LLC Anti-respiratory syncytial virus antibodies, and methods of their generation and use
SG11202103404PA (en) * 2020-04-02 2021-04-29 Regeneron Pharma Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments

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