BR122023004078B1 - Composição farmacêutica, seu uso e método para fabricar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se refere a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a uma proteína spike de coronavírus e métodos de uso de tais anticorpos e fragmentos para o tratamento ou prevenção de infecções virais (por exemplo, infecções pelo coronavírus).
Description
[001] Dividido do BR112020015534-9, depositado em 25.06.2020.
[002] Uma cópia oficial da listagem de sequências é submetida simultaneamente ao relatório descritivo eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências formatadas em ASCII com um nome de arquivo "10753WO01-Sequence.txt", criado em 25 de junho de 2020 e com um tamanho de 922.462 bytes. A listagem de sequências contida neste documento formatado em ASCII faz parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[003] A presente invenção se refere a anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que se aglutinam especificamente a proteínas da espícula de coronavírus e métodos para tratar ou prevenir infecções por coronavírus com os ditos anticorpos e fragmentos.
[004] Os vírus recentemente identificados, como os coronavírus, podem ser difíceis de tratar porque não são suficientemente caracterizados. O surgimento desses vírus recém-identificados destaca a necessidade do desenvolvimento de novas estratégias antivirais. O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) é um coronavírus recém-emergente que causa uma doença respiratória aguda grave, COVID-19. O SARS-CoV-2 foi identificado pela primeira vez a partir de um surto em Wuhan, China e, em 20 de março de 2020, a Organização Mundial da Saúde registrou 209.839 casos confirmados em 168 países, áreas ou territórios, resultando em 8.778 mortes. As características clínicas do COVID-19 incluem febre, tosse seca e fadiga, e a doença pode causar insuficiência respiratória, resultando em morte.
[005] Até o momento, não houve vacina ou agente terapêutico para prevenir ou tratar a infecção por SARS-CoV-2. Em vista da ameaça contínua à saúde humana, há uma necessidade urgente de terapias antivirais preventivas e terapêuticas para o controle do SARS-CoV-2. Como esse vírus usa sua glicoproteína da espícula para interação com o receptor celular ACE2 e a serina protease TMPRSS2 para entrada em uma célula-alvo, essa proteína da espícula representa um alvo atraente para a terapêutica de anticorpos. Em particular, anticorpos totalmente humanos que se ligam especificamente à proteína da espícula de SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) com alta afinidade e que inibem a infecciosidade do vírus podem ser importantes na prevenção e tratamento do COVID-19.
[006] Existe a necessidade anticorpos terapêuticos antiproteína da espícula de SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) neutralizantes e uso dos mesmos no tratamento ou prevenção de infecção viral. A presente descrição aborda essa necessidade, em parte, pelo fornecimento de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S humanos, como os da Tabela 1, e combinações dos mesmos, incluindo, por exemplo, combinações com outros terapêuticos (por exemplo, agentes anti-inflamatórios, agentes antimaláricos, agentes antivirais ou outros anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno) e métodos de uso dos mesmos para o tratamento de infecções virais.
[007] A presente descrição fornece proteínas neutralizadoras de ligação ao antígeno humano que se ligam especificamente a SARS- CoV-2-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.
[008] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo recombinante isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a uma proteína da espícula de coronavírus (CoV-S), em que o anticorpo tem uma ou mais das seguintes características: (a) se liga ao CoV-S com um EC50 inferior a cerca de 10¬9 M; (b) demonstra um aumento na sobrevivência de um animal infectado por coronavírus após administração ao dito animal infectado por coronavírus, em comparação com um animal comparável infectado por coronavírus sem a dita administração; e/ou (c) compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) contidas em uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência para uma HCVR da Tabela 1; e três CDRs de cadeia leve (CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência a uma LCVR da Tabela 1.
[009] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 de um anticorpo da Tabela 1; e/ou (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um anticorpo da Tabela 1.
[0010] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende: (a) uma região variável de imunoglobulina da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de HCVR da Tabela 1; e/ou (b) uma região variável de imunoglobulina de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de LCVR da Tabela 1.
[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende o CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um único anticorpo da Tabela 1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma imunoglobulina que compreende a HCVR e a LCVR de um único anticorpo da Tabela 1.
[0012] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma proteína de ligação ao antígeno que compete com qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno discutidos acima ou aqui para a ligação ao CoV-S.
[0013] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma proteína de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo que, ou a um epítopo sobreposto em CoV-S, como qualquer um dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno discutidos acima ou aqui.
[0014] Em qualquer uma das várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode ser multiespecífico.
[0015] Em qualquer uma das várias modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno pode compreender uma ou mais dentre as seguintes propriedades: a) inibe o crescimento de um coronavírus; b) liga-se à superfície de um coronavírus; c) limita a disseminação da infecção por coronavírus das células in vitro; e d) protege camundongos geneticamente modificados para expressar a proteína ACE2 ou TMPRSS2 humana da morte e/ou perda de peso causada pela infecção por coronavírus.
[0016] Em qualquer uma das várias modalidades, CoV-S é SARS- CoV-2-S.
[0017] Em um aspecto, a presente descrição fornece um complexo que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como discutido acima ou aqui, ligado a um polipeptídeo de CoV-S. Em algumas modalidades, o CoV-S é SARS-CoV-2-S.
[0018] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para produzir um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como discutido acima ou aqui, que compreende: (a) introduzir em uma célula hospedeira um ou mais polinucleotídeos que codificam o dito anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno; (b) cultivar a célula hospedeira em condições favoráveis à expressão de um ou mais polinucleotídeos; e (c) opcionalmente, isolar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da célula hospedeira e/ou um meio no qual a célula hospedeira é cultivada. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês.
[0019] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que é um produto do método discutido acima.
[0020] Em um aspecto, a presente descrição fornece um polipeptídeo que compreende: (a) CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de um domínio de HCVR de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR estabelecida na Tabela 1; ou (b) CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de um domínio de LCVR de uma cadeia de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos de LCVR apresentada na Tabela 1.
[0021] Em um aspecto, a presente descrição fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo discutido acima.
[0022] Em um aspecto, a presente descrição fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo discutido acima.
[0023] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma célula hospedeira que compreende o anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo ou polinucleotídeo ou vetor de ligação ao antígeno, conforme discutido acima ou aqui.
[0024] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma composição ou kit que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno discutido acima ou aqui em associação com um agente terapêutico adicional.
[0025] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma composição farmacêutica que compreende a proteína de ligação ao antígeno, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno discutido acima ou aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um agente terapêutico adicional. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um fármaco antiviral ou uma vacina. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é selecionado a partir do grupo que consiste em: um agente anti- inflamatório, um agente antimalárico, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TMPRSS2 e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que especificamente liga-se a CoV-S. Em alguns casos, o agente antimalárico é a cloroquina ou a hidroxicloroquina. Em alguns casos, o agente anti-inflamatório é um anticorpo, como sarilumabe, tocilizumabe ou gimsilumabe. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da Tabela 1.
[0026] Em um aspecto, a presente descrição fornece um recipiente ou dispositivo de injeção que compreende a proteína de ligação ao antígeno, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, ou composição como discutido acima ou no presente documento.
[0027] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para tratar ou prevenir a infecção por um coronavírus, em um indivíduo em necessidade do mesmo, que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme discutido acima ou no presente documento. Em algumas modalidades, o coronavírus é selecionado a partir do grupo que consiste em SARS- CoV-2, SARS-CoV e MERS-CoV.
[0028] Em algumas modalidades do método para tratar ou prevenir infecção por um coronavírus, o indivíduo recebe um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em alguns casos, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais são um fármaco antiviral ou uma vacina. Em alguns casos, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais é selecionado a partir do grupo que consiste em: um agente anti- inflamatório, um agente antimalárico, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TMPRSS2 e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CoV-S. Em alguns casos, o agente antimalárico é a cloroquina ou a hidroxicloroquina. Em alguns casos, o agente anti- inflamatório é um anticorpo, como, por exemplo, sarilumabe, tocilizumabe ou gimsilumabe. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que compreende sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da Tabela 1. Outros anticorpos que podem ser usados sozinhos ou em combinação um com o outro ou com um ou mais dos anticorpos divulgados no presente documento para uso no contexto dos métodos da presente descrição incluem, por exemplo, LY- CoV555 (Eli Lilly); 47D11 (Wang et al Nature Communications Article No. 2251); B38, H4, B5 e/ou H2 (Wu et al., 10.1126/science.abc2241 (2020); STI-1499 (Sorrento Therapeutics); VIR-7831 e VIR-7832 (Vir Biotherapeutics).
[0029] Em um aspecto, a presente descrição fornece um método para administrar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno discutido acima ou aqui no corpo de um indivíduo que compreende injetar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno no corpo do indivíduo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno é injetado no corpo do indivíduo por via subcutânea, intravenosa ou intramuscular.
[0030] Em qualquer uma das várias modalidades discutidas acima ou aqui, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma sequência de domínio variável VH3-66 ou Vk1-33.
[0031] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, em que o dito anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e três regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210.
[0032] Em algumas modalidades, a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 204, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 206, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 208, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 212, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 55 e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 214. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210.
[0033] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, em que o dito anticorpo isolado compreende uma região constante de imunoglobulina, três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210.
[0034] Em algumas modalidades, a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 204, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 206, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 208, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 212, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 55 e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 214. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 216 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 218. Em alguns casos, a região constante de imunoglobulina é uma região constante de IgG1. Em alguns casos, o anticorpo isolado é um anticorpo recombinante. Em alguns casos, o anticorpo isolado é multiespecífico.
[0035] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo isolado, como discutido acima ou aqui, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0036] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente terapêutico. Em alguns casos, o segundo agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em: um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TMPRSS2.
[0037] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: HCDR1, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 642; HCDR2, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 499; HCDR3, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 644; LCDR1, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 648; LCDR2, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 650; e LCDR3, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 652. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 654 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 656.
[0038] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, em que o dito anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável da cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e três regiões determinantes da complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646.
[0039] Em algumas modalidades, a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 642, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 499, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 644, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 648, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 650 e o LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 652. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646.
[0040] Em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, em que o dito anticorpo isolado compreende uma região constante de imunoglobulina, três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma região variável de cadeia pesada (HCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma região variável da cadeia leve (LCVR) que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646.
[0041] Em algumas modalidades, a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 642, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 499, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 644, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 648, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 650 e o LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 652. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 640 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 646. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 654 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 656. Em alguns casos, a região constante de imunoglobulina é uma região constante de IgG1. Em alguns casos, o anticorpo isolado é um anticorpo recombinante. Em alguns casos, o anticorpo isolado é multiespecífico.
[0042] Em um aspecto, a presente descrição fornece uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo isolado, como discutido acima ou aqui, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0043] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um segundo agente terapêutico. Em alguns casos, o segundo agente terapêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em: um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832, um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TMPRSS2.
[0044] Em algumas modalidades, o segundo agente terapêutico é um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 832. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas em uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas em uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: HCDR1, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 204; HCDR2, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 206; HCDR3, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 208; LCDR1, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 212; LCDR2, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 55; e LCDR3, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 214. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 202 e uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 210. Em alguns casos, o segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 216 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 218.
[0045] Em várias modalidades, qualquer uma das características ou componentes das modalidades discutidas acima ou no presente documento pode ser combinada e essas combinações estão incluídas no escopo da presente descrição. Qualquer valor específico discutido acima ou aqui pode ser combinado com outro valor relacionado discutido acima ou aqui para recitar uma faixa com os valores representando as extremidades superior e inferior do intervalo, e esses intervalos estão incluídos no escopo da presente descrição.
[0046] A Figura 1 mostra os dados de bloqueio de ELISA para anticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína da espícula de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína da espícula ao seu receptor ACE2.
[0047] A Figura 2 mostra os dados de bloqueio de ELISA para anticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína da espícula de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína da espícula ao seu receptor ACE2.
[0048] A Figura 3 mostra os dados de bloqueio de ELISA para anticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína da espícula de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína da espícula ao seu receptor ACE2.
[0049] A Figura 4 mostra os dados de bloqueio de ELISA para anticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína da espícula de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína da espícula ao seu receptor ACE2.
[0050] A Figura 5 mostra os dados de bloqueio de ELISA para anticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína da espícula de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína da espícula ao seu receptor ACE2.
[0051] A Figura 6 mostra os dados de bloqueio de ELISA para anticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína da espícula de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína da espícula ao seu receptor ACE2.
[0052] A Figura 7 mostra os dados de bloqueio de ELISA para anticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína da espícula de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína da espícula ao seu receptor ACE2.
[0053] A Figura 8 mostra os dados de bloqueio de ELISA para anticorpos anti-SARS-CoV-2-S selecionados contra a proteína da espícula de SARS-CoV-2, impedindo a ligação da proteína da espícula ao seu receptor ACE2.
[0054] A Figura 9A e a Figura 9B exibem frequências do gene V para cadeias Pesadas (eixo X) e Leves (eixo Y) emparelhadas de anticorpos neutralizantes isolados para SARS-CoV-2 para camundongos VelocImmune® (Figura 9A; N = 185) e humanos convalescentes doadores (Figura 9B; N = 68). A tonalidade e o tamanho do círculo correspondem ao número de pares de cadeias pesadas e leves presentes nos repertórios de anticorpos neutralizantes isolados. A neutralização é definida como> 70% com diluição 1:4 de anticorpo (~ 2 μg/mL) no ensaio de neutralização de pseudopartículas de VSV.
[0055] A Figura 10A e a Figura 10B mostram a potência de neutralização. A Figura 10A mostra a potência de neutralização dos mAbs anti-espícula de SARS-CoV-2. Diluições em série de mAbs anti- espícula, controle de isotipo IgG1 e ACE2 dimérico recombinante (hACE2.hFc) foram adicionadas com pVSV-SARS-CoV-2-S-mNeon às células Vero e a expressão do mNeon foi medida 24 horas após a infecção como leitura para infecciosidade de vírus. Os dados são representados graficamente como porcentagem de neutralização em relação ao controle de infecção apenas por vírus. A Figura 10B mostra a potência de neutralização de mAbs anti-espícula individuais e combinações de mAbs contra o vírus SARS-CoV-2-S em células VeroE6.
[0056] A Figura 11 mostra a análise do escopo do epítopo a partir de uma matriz de ensaios de ligação pré-mistura para diferentes mAbs anti-SARS-CoV-2. A divisão do epítopo foi realizada contra nove mAb anti-SARS-CoV-2, como descrito. Havia três fases (I, II e III) para cada gráfico. Na fase I, o mAb anti-SARS-CoV-2 (20 ug/mL) foi carregado na sonda anti-Fc humana. Na fase II, solução de mAb humano bloqueador de IgG1 (100 ug/mL). Na fase III, uma solução do complexo de pré- mistura de 100 nM CoV-2 RBD-MMH de SARS de cada sítio de ligação do mAb 600 nM anti-SARS-CoV-2 fluiu sobre a sonda de captura de mAb.
[0057] A Figura 12 mostra um modelo de superfície 3D para a estrutura do domínio RBD da proteína da espícula que mostra os resultados de mapeamento de epítopo HDX-MS e interface de ACE2. Os resíduos de RBD protegidos por anticorpos anti-espícula de SARS- CoV2 são indicados com sombreamento que representa a extensão da proteção conforme determinado pelos experimentos com HDX-MS. A estrutura RBD é reproduzida a partir do PDB 6M17.
[0058] A Figura 13A e a Figura 13B mostram um complexo de mAb10933 e mAb10987 com o SARS-CoV-2 RBD. A Figura 13A mostra um mapa de 3,9 Â de crio-ME do complexo mAb10933 + RBD + mAb10987, sombreado de acordo com as cadeias no modelo refinado da Figura 13B.RBD, cadeias pesadas e leves de mAb10933 e cadeia pesada e leve de mAb10987 são identificadas.
[0059] A Figura 14 mostra as estatísticas dos dados de crio-ME. As estatísticas de coleta e refinamento de dados são relatadas para a estrutura complexa mAb10987 + mAb10933 + SARS-CoV-2 RBD mostrada na Figura 13A e na Figura 13B.
[0060] Antes de os presentes métodos serem descritos, deve ser entendido que esta invenção não se limitada a métodos particulares e às condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de descrever modalidades particulares apenas, e não se destina a ser limitante, visto que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[0061] Exceto se for definido de outro modo, todos os termos técnicos e específicos usados no presente documento têm o mesmo significado que é comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são descritos agora. Todas as publicações mencionadas no presente documento são incorporadas ao presente documento a título de referência em sua totalidade.
[0062] O termo "coronavírus" ou "CoV" se refere a qualquer vírus da família dos coronavírus, incluindo, mas não está limitado a SARS- CoV-2, MERS-CoV e SARS-CoV. O SARS-CoV-2 se refere ao coronavírus recém-emergido, identificado como a causa de um surto grave que começa em Wuhan, na China, e que está se espalhando rapidamente para outras áreas do mundo. O SARS-CoV-2 também é conhecido como coronavírus 2019-nCoV e Wuhan. O mesmo liga-se através da proteína da espícula viral à enzima de conversão de angiotensina 2 (ACE2) do receptor da célula hospedeira humana. A proteína da espícula também se liga e é clivada pelo TMPRSS2, que ativa a proteína da espícula para a fusão do vírus pela membrana.
[0063] O termo "CoV-S", também chamado de "S" ou "proteína S" se refere à proteína da espícula de um coronavírus e pode se referir a proteínas S específicas, como SARS-CoV-2-S, MERS-CoV S e SARS- CoV S. A proteína da espícula de SARS-CoV-2 é uma glicoproteína de membrana de 1273 aminoácidos tipo I que se agrupa em trímeros que constituem os picos ou peplômeros na superfície da partícula de coronavírus envolvida. A proteína tem duas funções essenciais: ligação de receptor do hospedeiro e fusão da membrana, atribuídas às metades N-terminal (S1) e C-terminal (S2) da proteína S. CoV-S se liga ao seu receptor cognato através de um domínio de ligação de receptor (RBD) presente na subunidade S1. A sequência de aminoácidos da proteína da espícula de SARS-CoV-2 de comprimento total é exemplificada pela sequência de aminoácidos fornecida na SEQ ID NO: 832. O termo "CoV- S" inclui variantes de proteína da proteína da espícula de CoV isolada de diferentes isolados de CoV, bem como proteína da espícula de CoV recombinante ou um fragmento da mesma. O termo também abrange a proteína da espícula de CoV ou um fragmento da mesma acoplado a, por exemplo, um marcador de histidina, Fc de camundongo ou humano, ou uma sequência de sinal como ROR1.
[0064] O termo "infecção por coronavírus" ou "infecção por CoV", conforme usado aqui, se refere à infecção por um coronavírus como SARS-CoV-2, MERS-CoV ou SARS-CoV. O termo inclui infecções do trato respiratório por coronavírus, geralmente no trato respiratório inferior. Os sintomas podem incluir febre alta, tosse seca, falta de ar, pneumonia, sintomas gastrointestinais como diarreia, falência de órgãos (insuficiência renal e disfunção renal), choque séptico e morte em casos graves.
[0065] A presente invenção inclui métodos para tratar ou prevenir uma infecção viral em um indivíduo. O termo "vírus" inclui qualquer vírus cuja infecção no corpo de um indivíduo seja tratável ou evitável pela administração de um anticorpo anti-CoV-S ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, em que a infecciosidade do vírus é pelo menos parcialmente dependente no CoV-S). Em uma modalidade da invenção, um "vírus" é qualquer vírus que expressa a proteína da espícula (por exemplo, CoV-S). O termo "vírus" também inclui um vírus respiratório dependente de CoV-S, que é um vírus que infecta o tecido respiratório de um indivíduo (por exemplo, trato respiratório superior e/ou inferior, traqueia, brônquios, pulmões) e é tratável ou evitável por administração de um anticorpo anti-CoV-S ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o vírus inclui coronavírus, SARS-CoV-2 (coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2), SARS-CoV (coronavírus da síndrome respiratória aguda grave) e MERS-CoV (coronavírus da síndrome respiratória do Oriente Médio (MERS)). Os coronavírus podem incluir os gêneros de alfacoronavírus, betacoronavírus, gamacoronavírus e deltacoronavírus. Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos podem se ligar e/ou neutralizar um alfacoronavírus, um betacoronavírus, um gamacoronavírus e/ou um deltacoronavírus. Em certas modalidades, essa ligação e/ou neutralização pode ser específica para um gênero específico de coronavírus ou para um subgrupo específico de um gênero. "Infecção viral" se refere à invasão e multiplicação de um vírus no corpo de um indivíduo.
[0066] Os vírions de coronavírus são esféricos com diâmetros de aproximadamente 125 nm. A característica mais proeminente dos coronavírus são as projeções de espícula em forma de taco que emanam da superfície do vírion. Essas espículas são uma característica definidora do vírion e dão a eles a aparência de uma coroa solar (solar corona), solicitando o nome de coronavírus. Dentro do envelope do vírion está o nucleocapsídeo. Os coronavírus têm nucleocapsídeos helicoidicamente simétricos, o que é incomum entre os vírus de RNA de sentido positivo, mas muito mais comum para vírus de RNA de sentido negativo. SARS-CoV-2, MERS-CoV e SARS-CoV pertencem à família dos coronavírus. A ligação inicial do vírion à célula hospedeira é iniciada por interações entre a proteína S e seu receptor. Os locais dos domínios de ligação de receptor (RBD) na região S1 de uma proteína S do coronavírus variam dependendo do vírus, com alguns tendo o RBD no terminal C de S1. A interação proteína S/receptor é o principal determinante para um coronavírus infectar uma espécie hospedeira e também governa o tropismo tecidual do vírus. Muitos coronavírus utilizam peptidases como seu receptor celular. Após a ligação do receptor, o vírus deve obter acesso ao citosol da célula hospedeira. Isso é geralmente conseguido por clivagem proteolítica dependente de ácido da proteína S por uma catepsina, TMPRRS2 ou outra protease, seguida pela fusão das membranas virais e celulares.
[0067] A presente invenção fornece proteínas de ligação ao antígeno, tais como anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à proteína da espícula de CoV ou a um fragmento antigênico da mesma.
[0068] O termo "anticorpo", como aqui utilizado, se refere a moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (HCs) e duas cadeias leves (LCs) interconectadas por ligações dissulfeto (ou seja, "moléculas de anticorpo completas"), bem como a multímeros (por exemplo, IgM) das mesmas. Anticorpos exemplares incluem, por exemplo, os listados na Tabela 1. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada ("HCVR" ou "VH") e uma região constante de cadeia pesada (compreendida pelos domínios CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve ("LCVR ou "VL") e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser subdivididas adicionalmente em regiões de hipervariabilidade, denominadas de regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir de aminoterminação à carboxiterminação na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As CDRs de cadeia pesada também podem ser chamadas de HCDRs ou CDR-Hs e numeradas conforme descrito acima (por exemplo, HCDR1, HCDR2 e HCDR3 ou CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3). Da mesma forma, as CDRs da cadeia leve podem ser chamadas de LCDRs ou CDR-Ls e numeradas LCDR1, LCDR2 e LCDR3 ou CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3. Em determinadas modalidades da invenção, as FR do anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) podem ser idênticas às sequências da linhagem germinativa humana ou são modificadas natural ou artificialmente. Sequências de linha germinativa humanas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, VH3-66 e Vk1-33. Assim, a presente descrição fornece anticorpos anti-CoV-S ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, anticorpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) que compreendem sequências HCDR e LCDR da Tabela 1 dentro de uma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve variável VH3-66 ou Vk1-33. A presente descrição fornece ainda anticorpos anti-CoV-S ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, anticorpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) que compreendem sequências HCDR e LCDR da Tabela 1 dentro de uma combinação de uma cadeia leve selecionada a partir de IgKV4-1, IgKV 1-5, IgKV1-9, IgKV1-12, IgKV3-15, IgKV1-16, IgKV1-17, IgKV3-20, IgLV3-21, IgKV2-24, IgKV1- 33, IgKV1-39, IgLV1-40, IgLV1-44, IgLV1-51, IgLV3-1, IgKV1-6, IgLV2- 8, IgKV3-11, IgLV2-11, IgLV2-14, IgLV2-23 ou IgLV6-57 e um cadeia pesada selecionada a partir de IgHV1-69, IgHV3-64, IgHV4-59, IgHV3- 53, IgHV3-48, IgHV4-34, IgHV3-33, IgHV3-30, IgHV3-23, IgHV3-20, IgHV1-18, IgHV3-15, IgHV3-11, IgHV3-9, IgHV1-8, IgHV3-7, IgHV2-5, IgHV1-2, IgHV2-70, IgHV3-66, IgHV5-51, IgHV1-46, IgHV4-39, IgHV4- 31, IgHV3-30-3, IgHV2-26 ou IgHV7-4-1. A presente descrição fornece ainda anticorpos anti-CoV-S ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, anticorpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) que compreendem sequências HCVR e LCVR da Tabela 1 dentro de uma combinação de uma cadeia leve selecionada a partir de IgKV4-1, IgKV 1-5, IgKV1-9, IgKV1-12, IgKV3-15, IgKV1-16, IgKV1-17, IgKV3-20, IgLV3-21, IgKV2-24, IgKV1- 33, IgKV1-39, IgLV1-40, IgLV1-44, IgLV1-51, IgLV3-1, IgKV1-6, IgLV2- 8, IgKV3-11, IgLV2-11, IgLV2-14, IgLV2-23 ou IgLV6-57 e um cadeia pesada selecionada a partir de IgHV1-69, IgHV3-64, IgHV4-59, IgHV3- 53, IgHV3-48, IgHV4-34, IgHV3-33, IgHV3-30, IgHV3-23, IgHV3-20, IgHV1-18, IgHV3-15, IgHV3-11, IgHV3-9, IgHV1-8, IgHV3-7, IgHV2-5, IgHV1-2, IgHV2-70, IgHV3-66, IgHV5-51, IgHV1-46, IgHV4-39, IgHV4- 31, IgHV3-30-3, IgHV2-26 ou IgHV7-4-1.
[0069] Tipicamente, os domínios variáveis das cadeias de imunoglobulina pesada e leve compreendem três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), localizadas dentro de regiões estruturais (FR) relativamente conservadas. Em geral, do terminal N ao terminal C, os domínios variáveis das cadeias leve e pesada compreendem FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Em uma modalidade da invenção, a atribuição de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Md.; 5a ed.; NIH Publ. 91 a 3.242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1 a 75; Kabat et al. (1977) J. Biol. Chem. 252: 6.609 a 6.616; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 a 917 ou Chothia, et al., (1989) Nature 342: 878 a 883.
[0070] A presente invenção inclui proteínas monoclonais anti-CoV- S de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, bem como composições monoclonais que compreendem uma pluralidade de proteínas de ligação ao antígeno monoclonal isoladas. O termo "anticorpo monoclonal", como aqui utilizado, se refere a uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, as moléculas de anticorpo que compreendem a população são idênticas na sequência de aminoácidos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Uma "pluralidade" desses anticorpos e fragmentos monoclonais em uma composição se refere a uma concentração de anticorpos e fragmentos idênticos (isto é, como discutido acima, na sequência de aminoácidos, exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades) de anticorpos e fragmentos acima do que normalmente ocorreria na natureza, por exemplo, no sangue de um organismo hospedeiro, como um camundongo ou um ser humano.
[0071] Em uma modalidade da invenção, uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, compreende um domínio constante da cadeia pesada, por exemplo, do tipo IgA (por exemplo, IgA1 ou IgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) ou IgM. Em uma modalidade da invenção, uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreende um domínio constante da cadeia leve, por exemplo, do tipo capa ou lambda.
[0072] O termo proteína de ligação ao antígeno "humano", como um anticorpo, como usado aqui, inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana, seja em uma célula humana ou enxertada em uma célula não humana, por exemplo, uma célula de camundongo. Veja, por exemplo, os documentos US8502018, US6596541 ou US5789215. Os mAbs humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese de sítio específico aleatória in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, na CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado no presente documento, não se destina a incluir mAbs nas quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero (por exemplo, camundongo) foram enxertadas em sequências de FR humanas. O termo inclui anticorpos produzidos de maneira recombinante em um mamífero não humano ou em células de um mamífero não humano. O termo não está destinado a incluir anticorpos isolados ou gerados em um indivíduo humano. Ver abaixo.
[0073] A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno quiméricas anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e métodos de uso dos mesmos. Como aqui utilizado, um "anticorpo quimérico" é um anticorpo que tem o domínio variável de um primeiro anticorpo e o domínio constante de um segundo anticorpo, em que o primeiro e o segundo anticorpos são de espécies diferentes. (US4816567; e Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81: 6.851 a 6.855).
[0074] A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno híbridas anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e métodos de uso dos mesmos. Como aqui utilizado, um "anticorpo híbrido" é um anticorpo que tem o domínio variável de um primeiro anticorpo e o domínio constante de um segundo anticorpo, em que o primeiro e o segundo anticorpos são de animais diferentes, ou em que o domínio variável, mas não a região constante, é de um primeiro animal. Por exemplo, um domínio variável pode ser retirado de um anticorpo isolado de um humano e expresso com uma região constante fixa não isolada desse anticorpo. Anticorpos híbridos exemplares são descritos no Exemplo 1, que se refere à região variável produtos de PCR derivados de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve de anticorpo que foram clonados em vetores de expressão contendo uma região constante pesada e uma região constante leve, respectivamente. Os anticorpos híbridos são sintéticos e não ocorrem naturalmente porque as regiões variáveis e constantes que eles contêm não são isoladas de uma única fonte natural.
[0075] O termo proteínas de ligação ao antígeno "recombinante", tais como anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, se refere a tais moléculas criadas, expressadas, isoladas ou obtidas por tecnologias ou métodos conhecidos na técnica, como tecnologia de DNA recombinante que incluem, por exemplo, processamento de DNA e expressão transgênica. O termo se refere a anticorpos expressos em um mamífero não humano (incluindo mamíferos não humanos transgênicos, por exemplo, camundongos transgênicos) ou em um sistema de expressão de células (por exemplo, células CHO) ou um sistema de expressão de células não humanas, ou isolados de uma biblioteca combinatorial de anticorpos humanos recombinantes. Em algumas modalidades, um anticorpo recombinante compartilha uma sequência com um anticorpo isolado de um organismo (por exemplo, um camundongo ou um ser humano), mas foi expresso por meio da tecnologia de DNA recombinante. Tais anticorpos podem ter modificações pós-traducionais (por exemplo, glicosilação) que diferem do anticorpo isolado do organismo.
[0076] As proteínas de ligação ao antígeno recombinante anti-CoV- S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno, aqui divulgados também podem ser produzidos em um sistema de expressão de E. coli/T7. Nesta modalidade, os ácidos nucleicos que codificam as moléculas de imunoglobulina do anticorpo anti-CoV-S da invenção (por exemplo, conforme encontrado na Tabela 1) podem ser inseridos em um plasmídeo baseado em pET e expressos no sistema E. coli/T7. Por exemplo, a presente invenção inclui métodos para expressar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou cadeia de imunoglobulina do mesmo em uma célula hospedeira (por exemplo, célula hospedeira bacteriana como E. coli como BL21 ou BL21DE3) que compreende expressar a polimerase de RNA T7 na célula que também inclui um polinucleotídeo que codifica uma cadeia de imunoglobulina que está operacionalmente ligada a um promotor de T7. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, uma célula hospedeira bacteriana, como E. coli, inclui um polinucleotídeo que codifica o gene da polimerase de RNA T7 operacionalmente ligado a um promotor lac e a expressão da polimerase e da cadeia é induzida pela incubação da célula hospedeira com IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido). Ver documentos US4952496 e US5693489 ou Studier & Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 5 de maio de 1986; 189 (1): 113 a 130.
[0077] Existem vários métodos pelos quais produzir anticorpos recombinantes que são conhecidos na técnica. Um exemplo de um método para produção recombinante de anticorpos é divulgado no documento US4816567.
[0078] A transformação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo mRNA) em uma célula hospedeira. Os métodos para introduzir polinucleotídeos heterólogos nas células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibeno, fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulamento do polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) em lipossomas, tecnologia de nanopartículas lipídicas, injeção biolística e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Além disso, moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas nas células de mamíferos por vetores virais, como lentivírus ou vírus adenoassociado. Os métodos para transformar células são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. nos 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 e 4.959.455. Em algumas modalidades, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente descrição pode ser introduzido a um indivíduo na forma de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA, incluindo mRNA), de modo que as próprias células do indivíduo produzam o anticorpo. A presente descrição fornece ainda modificações nas sequências de nucleotídeos que codificam os anticorpos anti-CoV-S aqui descritos que resultam em maior expressão de anticorpos, maior estabilidade de anticorpos, maior estabilidade de ácidos nucleicos (por exemplo, mRNA) ou maior afinidade ou especificidade dos anticorpos para a proteína da espícula de CoV.
[0079] Assim, a presente invenção inclui métodos recombinantes para produzir uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, ou uma cadeia de imunoglobulina da mesma, compreendendo (i) introduzir um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, incluindo a sequência nucleotídica de qualquer uma ou mais das sequências da Tabela 2) que codificam cadeias leves e/ou pesadas de imunoglobulina, ou CDRs, da proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, da Tabela 1, por exemplo, em que o polinucleotídeo está em um vetor; e/ou integrado a um cromossomo da célula hospedeira e/ou está operacionalmente ligado a um promotor; (ii) cultivar a célula hospedeira (por exemplo, CHO ou Pichia ou Pichia pastoris) sob condições favoráveis à expressão do polinucleotídeo e, (iii) opcionalmente, isolar a proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento) ou cadeia da célula hospedeira e/ou meio em que a célula hospedeira é cultivada. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser integrado a um cromossomo da célula hospedeira através da inserção direcionada com um vetor como o vírus adenoassociado (AAV), por exemplo, após a clivagem do cromossomo usando um sistema de edição de genes (por exemplo, CRISPR (por exemplo, CRISPR -Cas9), TALEN, megaTAL, dedo de zinco ou Argonauta). As inserções direcionadas podem ocorrer, por exemplo, em locais de células hospedeiras, como um local genômico de albumina ou imunoglobulina. Alternativamente, a inserção pode ocorrer em um local aleatório, por exemplo, usando um vetor como o lentivírus. Ao fazer uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno) que compreende mais de uma cadeia de imunoglobulina, por exemplo, um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina, coexpressão das cadeias em uma única célula hospedeira leva à associação das cadeias, por exemplo, na célula ou na superfície celular ou fora da célula se essas cadeias forem secretadas, de modo a formar a proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno). Os métodos incluem aqueles em que apenas uma cadeia pesada de imunoglobulina ou apenas uma cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, qualquer uma das discutidas aqui, incluindo fragmentos maduros e/ou domínios variáveis dos mesmos) é expressa. Tais cadeias são úteis, por exemplo, como intermediárias na expressão de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que inclui essa cadeia. Por exemplo, a presente invenção também inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, como anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que compreendem uma imunoglobulina de cadeia pesada (ou domínio variável da mesma ou que compreende suas CDRs) codificada por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos estabelecida na Tabela 2 e uma imunoglobulina de cadeia leve (ou domínio variável da mesma ou que compreende suas CDRs) codificada por uma sequência de nucleotídeos estabelecida na Tabela 2 que é o produto de tais métodos de produção e, opcionalmente, os métodos de purificação definidos aqui adiante. Por exemplo, em algumas modalidades, o produto do método é uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S que é um anticorpo ou fragmento que compreende uma HCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 1 e uma LCVR que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 1, em que as sequências de HCVR e LCVR são selecionadas a partir de um único anticorpo listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, o produto do método é uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S que é um anticorpo ou fragmento que compreende HCDR1, HCDR2 e HCDR3 que compreendem sequências de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1 e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 que compreendem sequências de aminoácidos estabelecidas na Tabela 1, em que as seis sequências de CDR são selecionadas a partir de um único anticorpo listado na Tabela 1. Em algumas modalidades, o produto do método é uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S que é um anticorpo ou fragmento que compreende uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos HC estabelecida na Tabela 1 e uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos LC estabelecida na Tabela 1.
[0080] Células hospedeiras eucarióticas e procarióticas, incluindo células de mamíferos, podem ser usadas como hospedeiros para expressão de uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na técnica e muitas estão disponíveis junto à American Type Culture Collection (ATCC). Essas células hospedeiras incluem, inter alia, células de ovário de hamster chinês (CHO), células NS0, SP2, células HeLa, células de rim de bebê de hamster (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, células HEK-293 e várias outras linhas celulares. As células hospedeiras de mamíferos incluem células humanas, camundongos, camundongos, cães, macacos, porcos, cabras, bovinos, cavalos e hamster. Outras linhas celulares que podem ser usadas são linhas celulares de insetos (por exemplo, Spodoptera frugiperda ou Trichoplusia ni), células anfíbias, células bacterianas, células vegetais e células fúngicas. As células fúngicas incluem células de levedura e de fungos filamentosos incluindo, por exemplo, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens e Neurospora crassa. A presente invenção inclui uma célula hospedeira isolada (por exemplo, uma célula CHO) que compreende uma proteína de ligação ao antígeno, como as da Tabela 1; ou um polinucleotídeo que codifica esse polipeptídeo do mesmo.
[0081] O termo "liga-se especificamente" se refere às proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, mAbs) que têm uma afinidade de ligação a um antígeno, como uma proteína de CoV-S (por exemplo, SARS-CoV-2-S), expressa como KD, de pelo menos cerca de 10-8 M, medido em tempo real, ensaio de interferometria de biocamada livre de marcador, por exemplo, a 25 °C ou 37 °C, por exemplo, um biossensor Octet® HTX ou por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE™ ou por ELISA de afinidade de solução. A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a uma proteína de CoV-S.
[0082] Os termos "porção de ligação ao antígeno" ou "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo ou proteína de ligação ao antígeno, e similares, como usado no presente documento, incluem qualquer glicoproteína ou polipeptídeo de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente modificado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação ao antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos de dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimo que consistem nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada, como um peptídeo CDR3) ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restringido. Outras moléculas geneticamente modificadas, como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos com domínio excluído, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, como definidos no documento WO08/020079 ou WO09/138519) (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes etc.), imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs) e domínios IgNAR variáveis de tubarão, também são abrangidos pela expressão "fragmento de ligação ao antígeno", conforme usado no presente documento. Em uma modalidade da invenção, o fragmento de ligação ao antígeno compreende três ou mais CDRs de um anticorpo da Tabela 1 (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3; ou CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3).
[0083] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, em uma modalidade da invenção, compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ter de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e pode compreender geralmente pelo menos uma CDR que é adjacente ou em está sintonia com uma ou mais sequências estruturais. Em fragmentos de ligação ao antígeno que possuem um domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados um em relação ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e pode conter dímeros VH - VH, VH - VL ou VL - VL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio de VH ou VL monomérico.
[0084] Em certas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. As configurações exemplificativas não limitantes de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL- CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios varieis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplificativas listadas acima, os domínios variável e constante podem ser ligados diretamente entre si ou podem estar ligados por uma região parcial do ligante ou da dobradiça. Uma região da dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma molécula de polipeptídeo. Ademais, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma dentre as configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente uma com a outra e/ou com um ou mais domínios de VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação (ou ligações) de dissulfeto).
[0085] As proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno) podem ser monoespecíficas ou multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas). As proteínas multiespecíficas de ligação ao antígeno são discutidas aqui mais adiante.
[0086] Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção podem ser conjugados a uma tal porção química ligante ou porção química terapêutica ("imunoconjugado"), como um fármaco antiviral, um segundo anticorpo anti-influenza ou qualquer outra porção química terapêutica útil para tratar uma infecção viral, por exemplo, infecção viral por influenza. Ver abaixo.
[0087] A presente invenção também fornece um complexo que compreende uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, discutido aqui complexado com o polipeptídeo de CoV-S ou um fragmento antigênico do mesmo e/ou com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno secundário do mesmo (por exemplo, anticorpo secundário marcado de forma detectável) que se liga especificamente ao anticorpo ou fragmento anti-CoV-S. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento é in vitro (por exemplo, é imobilizado em um substrato sólido) ou está no corpo de um indivíduo. Em uma modalidade da invenção, o CoV-S é in vitro (por exemplo, é imobilizado em um substrato sólido) ou está na superfície de um vírus ou no corpo de um indivíduo. Anticorpos anti-CoV- S imobilizados e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que são covalentemente ligados a um material da matriz insolúvel (por exemplo, vidro ou polissacarídeo, como agarose ou sefarose, por exemplo, uma esfera ou outra partícula do mesmo) também fazem parte da presente invenção; opcionalmente, em que o anticorpo imobilizado é complexado com CoV-S ou fragmento do mesmo antigênico ou um anticorpo secundário ou fragmento do mesmo.
[0088] As proteínas "isoladas" de ligação ao antígeno, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, polipeptídeos, polinucleotídeos e vetores, estão pelo menos parcialmente livres de outras moléculas biológicas das células ou cultura de células a partir da qual elas são produzidas. Tais moléculas biológicas incluem ácidos nucleicos, proteínas, outros anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, lipídios, carboidratos ou outro material, como detritos celulares e meio de crescimento. Um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado pode ainda estar pelo menos parcialmente livre de componentes do sistema de expressão, como moléculas biológicas de uma célula hospedeira ou do seu meio de crescimento. Geralmente, o termo "isolado" não se refere a uma completa ausência de tais moléculas biológicas ou a uma ausência de água, tampões ou sais ou a componentes de uma formulação farmacêutica que inclui os anticorpos ou fragmentos.
[0089] O termo "epítopo" se refere a um determinante antigênico (por exemplo, um polipeptídeo de CoV-S) que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico de uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, uma região variável de uma molécula de anticorpo, conhecida como parátopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Desse modo, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas de um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. O termo "epítopo" também se refere a um sítio em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem. O mesmo também se refere a uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Os epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epítopos funcionais são geralmente um subconjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Os epítopos podem ser lineares ou conformacionais, isto é, compostos por aminoácidos não lineares. Em determinadas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou grupos sulfonila e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específica.
[0090] Métodos para determinar o epítopo de uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo, incluem análise por varredura de mutações de alanina, análise por blot de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443 a 463), estudos cristalográficos de análise de clivagem de peptídeo e análise por RMN. Adicionalmente, podem ser empregados métodos, tais como excisão de epítopos, extração de epítopo e modificação química de antígenos (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487 a 496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo) (por exemplo, coversina) interage é detectada troca de hidrogênio/deutério por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve marcar com deutério a proteína de interesse, seguido pela ligação da proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo, à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína de CoV-S/proteína de ligação ao antígeno é transferido para água e os prótons trocáveis dentro dos aminoácidos que são protegidos pelo complexo de anticorpos são submetidos à troca reversa de deutério-por-hidrogênio em uma taxa mais lenta que os prótons trocáveis dentro de aminoácidos que não fazem parte da interface. Como resultado, os aminoácidos que fazem parte da interface da proteína/proteína de ligação ao antígeno podem reter deutério e, portanto, podem exibir uma massa relativamente maior em comparação aos aminoácidos não incluídos na interface. Após a dissociação da proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo), a proteína-alvo é submetida à análise de clivagem de protease e espectrometria de massa, revelando, assim, os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Consultar, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252 a 259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A a 265A.
[0091] O termo "compete", conforme usado aqui, se refere a uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno) que se liga a um antígeno (por exemplo, CoV- S) e inibe ou bloqueia a ligação de outra proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) ao antígeno. O termo também inclui a competição entre duas proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos em ambas as orientações, isto é, um primeiro anticorpo que se liga e bloqueia a ligação do segundo anticorpo e vice-versa. Em determinadas modalidades, a primeira proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) e segunda proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) podem se ligar ao mesmo epítopo. Alternativamente, a primeira e a segunda proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos) podem se ligar a epítopos diferentes, porém em sobreposição, de modo que a ligação de um iniba ou bloqueie a ligação do segundo anticorpo, por exemplo, por meio de impedimento estérico. A competição cruzada entre proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos) pode ser medida por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por um ensaio de interferometria de biocamada sem marcação em tempo real. O mapeamento de epítopos (por exemplo, por varredura de alanina ou troca de hidrogênio-deutério (HDX)) pode ser usado para determinar se dois ou mais anticorpos não são concorrentes (por exemplo, em um monômero de domínio de ligação de receptor de proteína da espícula (RBD)), competindo pelo mesmo epítopo, ou competindo, mas com diversos microepítopos (por exemplo, identificados por HDX). Em uma modalidade da invenção, a competição entre uma primeira e segunda proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpo) é determinada medindo a capacidade de uma primeira proteína de ligação ao antígeno anti-CoV- S (por exemplo, anticorpo) imobilizada (não complexada inicialmente com a proteína de CoV-S) para se ligar à proteína solúvel de CoV-S complexada com uma segunda proteína de ligação ao antígeno anti- CoV-S (por exemplo, anticorpo). Uma redução na capacidade da primeira proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpo) de se ligar à proteína de CoV-S complexada, em relação à proteína de CoV-S não complexada, indica que a primeira e a segunda proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpos) competem. O grau de competição pode ser expresso como uma porcentagem da redução na ligação. Essa competição pode ser medida usando um teste de interferometria de biocamada sem marcação, em tempo real, por exemplo, em um biossensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.), ELISA (ensaios de imunoabsorção enzimática) ou SPR (ressonância de plasmon de superfície).
[0092] A competição de ligação entre proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpos monoclonais (mAbs)) pode ser determinada usando um teste de interferometria de biocamada sem marcação em tempo real em um biossensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Por exemplo, para determinar a competição entre dois anticorpos monoclonais anti-CoV-S, o mAb anti-CoV-S pode ser capturado primeiro nas pontas de biossensores Octet revestidos com anticorpo anti-hFc (Pall ForteBio Corp., número 18-5060) submergindo as pontas em uma solução de mAb anti-CoV-S (posteriormente chamado de "mAb1"). Como controle positivo para o bloqueio, as pontas do biossensor capturadas por anticorpo podem então ser saturadas com um mAb de controle de isotipo de bloqueio conhecido (posteriormente denominado "mAb de bloqueio") mergulhando em uma solução de mAb de bloqueio. Para determinar se o mAb2 compete com o mAb1, as pontas do biossensor podem ser mergulhadas subsequentemente em uma solução cocomplexada do polipeptídeo de CoV-S e em um segundo mAb anti-CoV-S (subsequentemente chamado de "mAb2"), que foi pré-incubado por um período de tempo e a ligação do mAb1 ao polipeptídeo de CoV-S pode ser determinada. As pontas do biossensor podem ser lavadas em tampão entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tempo real pode ser monitorada durante o curso do experimento e a resposta de ligação no final de cada etapa pode ser registrada.
[0093] Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o ensaio de competição é conduzido a 25 °C e pH cerca de 7, por exemplo, 7,4, por exemplo, na presença de tampão, sal, tensoativo e uma proteína não específica (por exemplo, albumina de soro bovino).
[0094] Tipicamente, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção que é modificado de alguma maneira mantém a capacidade de se ligar especificamente ao CoV-S, por exemplo, retém pelo menos 10% de sua atividade de ligação ao CoV-S (quando comparado ao anticorpo parental) quando essa atividade é expressa em uma base molar. Preferencialmente, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% ou mais da afinidade de ligação ao CoV-S como anticorpo parental. Pretende-se também que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção possa incluir substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas (denominadas "variantes conservativas" ou "variantes conservadas em função" do anticorpo) que não alterem substancialmente sua atividade biológica.
[0095] Uma "variante" de um polipeptídeo, como uma cadeia de imunoglobulina (por exemplo, mAb8021 VH, VL, HC ou LC, mAb8028 VH, VL, HC ou LC ou mAb8029 VH, VL, HC, ou LC), se refere a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 70 a 99,9% (por exemplo, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) idêntica ou semelhante a uma sequência de aminoácidos referenciada aqui estabelecida (por exemplo, SEQ ID NO: 2, 10, 18, 20, 22, 30, 38, 40, 42, 50, 58 ou 60); quando a comparação é realizada por um algoritmo BLAST, em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para fornecer a maior correspondência entre as respectivas sequências ao longo de todo o comprimento das respectivas sequências de referência (por exemplo, limiar esperado: 10; tamanho da palavra: 3; correspondências máximas em um intervalo de consulta: 0; matriz BLOSUM 62; custos de gap: existência 11, extensão 1; ajuste da matriz de pontuação composicional condicional).
[0096] Uma "variante" de um polinucleotídeo se refere a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 70 a 99,9% (por exemplo, pelo menos cerca de 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 ou 99,9%) idêntica a uma sequência nucleotídica referenciada aqui estabelecida (por exemplo, SEQ ID NO: 1, 9, 17, 19, 21, 29, 37, 39, 41, 49, 57 ou 59); quando a comparação é realizada por um algoritmo BLAST, em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para fornecer a maior correspondência entre as respectivas sequências ao longo de todo o comprimento das respectivas sequências de referência (por exemplo, limiar esperado: 10; tamanho da palavra: 28; correspondências máximas em um intervalo de consulta: 0; pontuações de correspondência/incompatibilidade: 1, -2; custos de gap: linear).
[0097] As proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, em uma modalidade da invenção, incluem uma região variável de imunoglobulina da cadeia pesada que tem pelo menos 70% (por exemplo, 80%, 85 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) de identidade da sequência de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de HCVR estabelecidas na Tabela 1; e/ou uma região variável de imunoglobulina de cadeia leve com pelo menos 70% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) da identidade da sequência de aminoácidos com as sequências de aminoácidos de LCVR estabelecidas na Tabela 1.
[0098] Além disso, uma proteína de ligação ao antígeno variante anti-CoV-S pode incluir um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida no presente documento, exceto por uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) mutações como, por exemplo, mutações missense (por exemplo, substituições conservativas), mutações não senso, deleções ou inserções. Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno que incluem uma variante de cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos de LCVR apresentada na Tabela 1, mas tendo uma ou mais dessas mutações e/ou uma variante de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR apresentada na Tabela 1, mas com uma ou mais dessas mutações. Em uma modalidade da invenção, uma proteína de ligação ao antígeno variante anti-CoV-S inclui uma variante de cadeia leve de imunoglobulina que compreende CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que uma ou mais (por exemplo, 1 ou 2 ou 3) dessas CDRs tem uma ou mais dessas mutações (por exemplo, substituições conservativas) e/ou uma variante de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que uma ou mais (por exemplo, 1 ou 2 ou 3) dessas CDRs tem uma ou mais dessas mutações (por exemplo, substituições conservativas). As substituições podem estar em uma região CDR, estrutural ou constante.
[0099] A invenção também fornece proteínas variantes de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que compreendem uma ou mais CDRs variantes (por exemplo, qualquer uma ou mais CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3) aqui estabelecidas com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade ou semelhança de sequência, por exemplo, quanto às CDRs de cadeia pesada e cadeia leve da Tabela 1.
[00100] Modalidades da presente invenção também incluem proteínas variantes de ligação ao antígeno, por exemplo, anticorpos anti-CoV-S e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que compreendem imunoglobulina VHs e VLs; ou HCs e LCs, que compreendem uma sequência de aminoácidos com 70% ou mais (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ou mais) de identidade geral da sequência de aminoácidos ou semelhança com as sequências de aminoácidos das correspondentes VHs, VLs, HCs ou LCs especificamente estabelecidas aqui, mas em que CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 dessas imunoglobulinas não são variantes e compreendem a sequência de aminoácidos CDR apresentada na Tabela 1. Assim, em tais modalidades, as CDRs dentro das proteínas de ligação ao antígeno variantes não são, elas próprias, variantes.
[00101] Anticorpos anti-CoV-S variantes modificados de forma conservativa e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos também fazem parte da presente invenção. Uma "variante modificada de forma conservativa" ou uma "substituição conservativa" se refere a uma variante em que há uma ou mais substituições de aminoácidos em um polipeptídeo com outros aminoácidos com características semelhantes (por exemplo, carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação de cadeia principal e rigidez, etc.). Tais mudanças podem frequentemente ser feitas sem interromper significativamente a atividade biológica do anticorpo ou fragmento. Os versados nesta técnica reconhecem que, em geral, substituições únicas de aminoácidos em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4a Ed.)). Além disso, as substituições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente semelhantes têm menos probabilidade de interromper significativamente a atividade biológica.
[00102] Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais de hidroxila alifática: serina e treonina; 3) cadeias laterais que contêm amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato e 7) cadeias laterais que contêm enxofre: cisteína e metionina. Os grupos preferências de substituição de aminoácidos conservadores são: valina- leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alteração que tenha um valor positivo na matriz de probabilidade de PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1.443 a 1.445.
[00103] Variantes conservativas de função dos anticorpos anti-CoV- S e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos também fazem parte da presente invenção. Qualquer uma das variantes dos anticorpos anti-CoV-S e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (como discutido aqui) podem ser "variantes conservativas de função". Tais variantes conservativas de função podem, em alguns casos, também ser caracterizadas como variantes modificadas de forma conservativa. "Variantes conservativas de função", como aqui utilizadas, se refere a variantes dos anticorpos anti-CoV-S ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos foram alterados sem alterar significativamente uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo ou fragmento. Em uma modalidade da invenção, um anticorpo anti-CoV-S variante conservador de função ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção compreende uma sequência variante de aminoácidos e exibe uma ou mais das seguintes propriedades funcionais: • Inibe o crescimento de coronavírus (por exemplo, SARS- CoV-2, SARS-CoV e/ou MERS-CoV) em células que expressam ACE2 e/ou TMPRSS2 (por exemplo, células Calu-3); • Não se liga significativamente a células MDCK/Tet-on que não expressam ACE2 e/ou TMPRSS2; • Limita a propagação da infecção por coronavírus (por exemplo, por SARS-CoV-2, SARS-CoV e/ou MERS-CoV) de células, por exemplo, Calu-3, in vitro; e/ou • Protege um camundongo geneticamente modificado para expressar a proteína TMPRSS2 e/ou ACE2 humana contra a morte causada por infecção por coronavírus (por exemplo, SARS-CoV-2, SARS-CoV ou MERS-CoV), por exemplo, em que os camundongos são infectados por uma dose do vírus que, de outra forma, seria letal, opcionalmente quando combinada com um segundo agente terapêutico. • Protege um camundongo geneticamente modificado para expressar a proteína TMPRSS2 e/ou ACE2 humana da perda de peso causada por infecção por coronavírus (por exemplo, SARS-CoV-2, SARS-CoV ou MERS-CoV), por exemplo, em que os camundongos estão infectados com uma dose do vírus que de outra forma causaria perda de peso, opcionalmente quando combinada com um segundo agente terapêutico.
[00104] Uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S "neutralizante" ou "antagonista", por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, se refere a uma molécula que inibe uma atividade da CoV-S em qualquer grau detectável, por exemplo, inibe a capacidade de CoV-S para se ligar a um receptor como ACE2, para ser clivado por uma protease como TMPRSS2 ou para mediar a entrada viral em uma célula hospedeira ou a reprodução viral em uma célula hospedeira.
[00105] A Tabela 1 se refere a proteínas de ligação ao antígeno, como anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que compreendem a cadeia pesada ou VH (ou uma variante da mesma) e a cadeia leve ou VL (ou uma variante da mesma), conforme estabelecido abaixo; ou que compreendem um VH que compreende as CDRs (CDR-H1 (ou uma variante da mesma), CDR-H2 (ou uma variante da mesma) e CDR-H3 (ou uma variante da mesma)) e um VL que compreende as CDRs (CDR-L1 (ou uma variante da mesma), CDR-L2 (ou uma variante da mesma) e CDR-L3 (ou uma variante da mesma)), por exemplo, em que as cadeias de imunoglobulina, regiões variáveis e/ou CDRs compreendem as sequências de aminoácidos específicas descritas abaixo.
[00106] Os anticorpos aqui descritos também incluem modalidades em que a VH é fundida com uma IgG4 de tipo selvagem (por exemplo, em que o resíduo 108 é S) ou com variantes de IgG4 (por exemplo, em que o resíduo 108 é P).
[00107] Os anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção compreendem cadeias de imunoglobulina, incluindo as sequências de aminoácidos aqui estabelecidas, bem como modificações celulares e in vitro pós-tradução para o anticorpo. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a CoV-S que compreende sequências de aminoácidos de cadeia pesada e/ou leve estabelecidas aqui (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3), bem como anticorpos e fragmentos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são glicosilados, um ou mais resíduos de Asn são desamidados, um ou mais resíduos (por exemplo, Met, Trp e/ou His) são oxidados, o Gln terminal N é piroglutamato (piroE) e/ou a Lisina terminal C está ausente.
[00108] As sequências de aminoácidos e nucleotídeos de anticorpos anti-espícula de SARS-CoV-2 exemplares (SARS-CoV-2-S) são mostradas na Tabela de Sequências Exemplares, abaixo. TABELA DE SEQUÊNCIAS EXEMPLARES
[00109] A presente invenção fornece métodos para administrar uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S da presente invenção, por exemplo, as da Tabela 1, que compreendem a introdução da proteína de ligação ao antígeno no corpo de um indivíduo (por exemplo, um ser humano). Por exemplo, o método compreende perfurar o corpo do indivíduo com uma agulha de uma seringa e injetar a proteína de ligação ao antígeno no corpo do indivíduo, por exemplo, na veia, artéria, tumor, tecido muscular ou subcutâneo do indivíduo.
[00110] A presente invenção fornece um recipiente (por exemplo, um frasco de plástico ou de vidro, por exemplo, com uma tampa ou uma coluna de cromatografia, agulha de orifício oco ou um cilindro de seringa) que compreende uma proteína de ligação ao antígeno anti- CoV-S da presente invenção, por exemplo, as da Tabela 1.
[00111] A presente invenção também fornece um dispositivo de injeção que compreende uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno) que se ligam especificamente ao CoV-S, por exemplo, as da Tabela 1, ou uma composição farmacêutica do mesmo. O dispositivo de injeção pode ser empacotado em um kit. Um dispositivo de injeção é um dispositivo que introduz uma substância no corpo de um indivíduo por uma via parenteral, por exemplo, intramuscular, subcutânea ou intravenosa. Por exemplo, um dispositivo de injeção pode ser uma seringa (por exemplo, pré-cheia com a composição farmacêutica, como um autoinjetor) que, por exemplo, inclui um cilindro ou barril para reter o fluido a ser injetado (por exemplo, que compreende o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo), uma agulha para perfurar a pele e/ou vasos sanguíneos para injeção do fluido; e um êmbolo para empurrar o fluido para fora do cilindro e através do orifício da agulha. Em uma modalidade da invenção, um dispositivo de injeção que compreende uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de uma combinação da presente invenção ou uma composição farmacêutica do mesmo, é um dispositivo de injeção intravenosa (IV). Esse dispositivo pode incluir a proteína de ligação ao antígeno ou uma composição farmacêutica da mesma em uma cânula ou trocarte/agulha que pode ser anexada a um tubo que pode ser anexado a uma bolsa ou reservatório para reter fluido (por exemplo, solução salina) introduzido no corpo do indivíduo através da cânula ou trocarte/agulha. O anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo pode, em uma modalidade da invenção, ser introduzida no dispositivo uma vez que o trocarte e a cânula são inseridos na veia de um indivíduo e o trocarte é removido da cânula inserida. O dispositivo intravenoso pode, por exemplo, ser inserido em uma veia periférica (por exemplo, na mão ou no braço); na veia cava superior ou veia cava inferior, ou dentro do átrio direito do coração (por exemplo, um IV central); ou em uma veia subclávia, jugular interna ou femoral e, por exemplo, avançado em direção ao coração até atingir a veia cava superior ou o átrio direito (por exemplo, uma linha venosa central). Em uma modalidade da invenção, um dispositivo de injeção é um autoinjetor; um injetor de jato ou uma bomba de infusão externa. Um injetor de jato usa um jato estreito de alta pressão de líquido que penetra na epiderme para introduzir o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo no corpo de um indivíduo. Bombas de infusão externas são dispositivos médicos que entregam o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo no corpo de um indivíduo em quantidades controladas. As bombas de infusão externas podem ser alimentadas elétrica ou mecanicamente. Bombas diferentes operam de maneiras diferentes, por exemplo, uma bomba de seringa retém fluido no reservatório de uma seringa e um pistão móvel controla a entrega de fluido, uma bomba elastomérica retém fluido em um reservatório de balão elástico e pressão das paredes elásticas do balão impulsiona a entrega de fluidos. Em uma bomba peristáltica, um conjunto de rolos aperta um tubo flexível, empurrando o fluido para frente. Em uma bomba multicanal, os fluidos podem ser fornecidos a partir de vários reservatórios a várias taxas.
[00112] Os métodos para gerar anticorpos humanos em camundongos transgênicos são conhecidos na técnica. Qualquer um dentre tais métodos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para produzir anticorpos humanos que se ligam especificamente a CoV-S. Um imunógeno que compreende qualquer um dentre os seguintes pode ser usado para gerar anticorpos para CoV- S. Em certas modalidades da invenção, os anticorpos da invenção são obtidos de camundongos imunizados com um CoV-S nativo de comprimento total ou com um vírus vivo atenuado ou inativado ou com DNA que codifica a proteína ou fragmento do mesmo. Alternativamente, a proteína de CoV-S ou um fragmento da mesma pode ser produzida com o uso de técnicas bioquímicas padrão e usada como imunógeno. Em uma modalidade da invenção, o imunógeno é uma proteína de CoV- S produzida de forma recombinante ou um fragmento da mesma. Em certas modalidades da invenção, o imunógeno pode ser uma vacina polipeptídica de CoV-S. Em certas modalidades, uma ou mais injeções de reforço podem ser administradas. Em determinadas modalidades, o imunógeno pode ser um polipeptídeo recombinante de CoV-S expressado em E. coli ou em quaisquer outras células eucarióticas ou de mamífero, como células de ovário de hamster chinês (CHO).
[00113] Com o uso da tecnologia VELOCIMMUNE® (consultar, por exemplo, o documento no U.S. 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ou qualquer outro método conhecido para gerar anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos de alta afinidade para CoV-S são inicialmente isolados, tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. A tecnologia VELOCIMMUNE® envolve a geração de um camundongo transgênico com um genoma que compreende regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanas ligadas de modo operacional aos loci de região constante de camundongo de modo que o camundongo produza um anticorpo que compreende uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo é isolado e ligado de maneira operacional ao DNA que codifica as regiões constantes de cadeia pesada e leve humanas. Em seguida, o DNA é expresso em uma célula com capacidade para expressar o anticorpo totalmente humano.
[00114] De modo geral, um camundongo VELOCIMMUNE® é desafiado com o antígeno de interesse, e as células linfáticas (como células B) são recuperadas dos camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fundidas com uma linhagem celular de mieloma para preparar linhagens celulares de hibridoma imortal, e essas linhagens celulares de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares de hibridoma que produzem anticorpos específicos para o antígeno de interesse. O DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. Tal proteína de anticorpo pode ser produzida em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos de antígeno específico ou os domínios variáveis das cadeias leve e pesada pode ser isolado diretamente dos linfócitos específicos de antígeno.
[00115] Inicialmente, são isolados os anticorpos quiméricos de alta afinidade que têm uma região variável humana e uma região constante de camundongos. De acordo com a seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados para características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo etc. As regiões constantes de camundongos são substituídas por uma região constante humana desejada a fim de gerar o anticorpo totalmente humano da invenção, por exemplo, IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificado. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, a ligação ao antígeno de alta afinidade e as características de especificidade de alvo estão situadas na região variável.
[00116] De acordo com certas modalidades da presente invenção, proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, são fornecidas, que compreendem um domínio Fc que compreende uma ou mais mutações que intensificam ou diminuem a ligação de anticorpo ao receptor de FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação com o pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-CoV-S que compreendem uma mutação na região CH2 ou CH3 do domínio Fc, em que a mutação (ou mutações) aumenta a afinidade do domínio Fc ao FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossomo, em que as faixas de pH são de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Tais mutações podem resultar em um aumento na meia-vida sérica do anticorpo quando administradas a um animal. Exemplos não limitantes de tais modificações de Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, A, W, H, F ou Y [N434A, N434W, N434H, N434F ou N434Y]); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende a modificação de 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação de 428L, 259I (por exemplo, V259I), e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação de 433K (por exemplo, H433K) e 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação de 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação de 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação de 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P). Em ainda outra modalidade, a modificação compreende uma modificação de 265A (por exemplo, D265A) e/ou 297A (por exemplo, N297A).
[00117] Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, que compreendem um domínio Fc que compreende um ou mais pares de grupos de mutação selecionados a partir do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q and M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); 257I e 311I (por exemplo, P257I e Q311I); 257I e 434H (por exemplo, P257I e N434H); 376V e 434H (por exemplo, D376V e N434H); 307A, 380A e 434A (por exemplo, T307A, E380A e N434A); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F).
[00118] Proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que compreendem uma VH e/ou VL como aqui estabelecido que compreendem quaisquer combinações possíveis das mutações do domínio Fc precedentes, são contempladas dentro do âmbito da presente invenção.
[00119] A presente invenção também inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma VH estabelecida no presente documento e uma região constante de cadeia pesada (CH) quimérica, em que a região CH quimérica compreende segmentos derivados das regiões CH de mais de um isótipo de imunoglobulina. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem compreender uma região quimérica CH que compreende parte ou todo o domínio CH2 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou molécula IgG4 humana, combinada com parte ou com todo o domínio CH3 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou de IgG4 humana. De acordo com certas modalidades, os anticorpos da invenção compreendem uma região quimérica CH que contém uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de aminoácidos "de dobradiça superior" (resíduos de aminoácido das posições 216 a 227 de acordo com a numeração EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, uma IgG2 humana ou uma IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior" (resíduos de aminoácidos das posições 228 a 236 de acordo com a numeração EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, uma IgG2 humana ou uma IgG4 humana. De acordo com determinadas modalidades, a região da dobradiça quimérica compreende resíduos de aminoácidos derivados de uma dobradiça superior de IgG1 humana ou de uma dobradiça superior de IgG4 humana e resíduos de aminoácido derivados de uma dobradiça inferior de IgG2 humana. Um anticorpo que compreende uma região quimérica CH, conforme descrito no presente documento, em determinadas modalidades, pode exibir funções efetoras de Fc sem afetar adversamente as propriedades terapêuticas ou farmacocinéticas do anticorpo. (Ver, por exemplo, WO2014/022540).
[00120] A invenção abrange proteínas de ligação ao antígeno anti- CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, conjugados com outra porção química, por exemplo, uma porção química terapêutica (um "imunoconjugado"), como um toxoide ou um medicamento antiviral para tratar a infecção pelo vírus influenza. Em uma modalidade da invenção, um anticorpo ou fragmento anti-CoV-S é conjugado com qualquer um dos outros agentes terapêuticos aqui apresentados. Conforme usado no presente documento, o termo "imunoconjugado" se refere a uma proteína de ligação ao antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, que está ligado química ou biologicamente a um agente radioativo, uma citocina, um interferon, uma porção química alvo ou repórter, uma enzima, um peptídeo ou proteína ou um agente terapêutico. A proteína de ligação ao antígeno pode estar ligada ao agente radioativo, citocina, interferon, porção química alvo ou repórter, enzima, peptídeo ou agente terapêutico em qualquer localização ao longo da molécula desde que possa se ligar ao alvo da mesma (CoV-S). Os exemplos de imunoconjugados incluem conjugados de fármaco-anticorpo e proteínas de fusão anticorpo-toxina. Em uma modalidade da invenção, o agente pode ser um segundo anticorpo diferente que se liga especificamente a CoV-S. O tipo de porção química terapêutica que pode ser conjugada à proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpo ou fragmento) levará em consideração a condição a ser tratada e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Veja, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243 a 256 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), p. 623 a 653 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 1984: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), p. 475 a 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), p. 303 a 316 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119 a 158 (1982).
[00121] A presente invenção inclui proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, bem como métodos de uso dos mesmos e métodos para produzir essas proteínas de ligação ao antígeno. O termo proteínas de ligação ao antígeno "anti-CoV-S", por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, inclui moléculas multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas ou biparatópicas) que incluem pelo menos um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CoV-S (por exemplo, um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo da Tabela 1) e pelo menos um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga a um antígeno diferente ou a um epítopo no CoV-S que é diferente daquele do primeiro domínio de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno são ambos selecionados a partir dos domínios de ligação ao antígeno da Tabela 1. Em uma modalidade da invenção, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem. Em outra modalidade da invenção, o primeiro e o segundo epítopos não se sobrepõem. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, um anticorpo multiespecífico é um anticorpo IgG biespecífico (por exemplo, IgG1 ou IgG4) que inclui um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CoV-S, incluindo a cadeia pesada e leve de imunoglobulina de um anticorpo da Tabela 1 e um segundo domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um epítopo diferente de CoV-S. Em algumas modalidades, um anticorpo IgG biespecífico (por exemplo, IgG1 ou IgG4) inclui um primeiro domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CoV-S e um segundo domínio de ligação que se liga a uma proteína da célula hospedeira, por exemplo, ACE2 ou TMPRSS2.
[00122] Os anticorpos da Tabela 1 incluem moléculas multiespecíficas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno, que incluem CDR-Hs e CDR-Ls, VH e VL ou HC e LC desses anticorpos, respectivamente (incluindo variantes dos mesmos, conforme definido adiante).
[00123] Em uma modalidade da invenção, um domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao CoV-S, que pode ser incluído em uma molécula multiespecífica, compreende: (1) uma sequência de domínio variável da cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 estabelecidas na Tabela 1 e (ii) uma sequência de domínio variável da cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 estabelecidas na Tabela 1; ou (2) (i) uma sequência de domínio variável da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 1, e (ii) uma sequência de domínio variável da cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 1; ou (3) (i) uma sequência de imunoglobulina da cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 1, e (ii) uma sequência de imunoglobulina de cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 1.
[00124] Em uma modalidade da invenção, o anticorpo ou fragmento multiespecífico inclui mais de duas especificidades de ligação diferentes (por exemplo, uma molécula triespecífica), por exemplo, um ou mais domínios adicionais de ligação ao antígeno que são iguais ou diferentes do primeiro e/ou segundo domínio de ligação ao antígeno.
[00125] Em uma modalidade da invenção, um fragmento de ligação ao antígeno biespecífico compreende um primeiro scFv (por exemplo, que compreende as sequências VH e VL da Tabela 1) tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo (por exemplo, CoV- S) e um segundo scFv tendo especificidade de ligação para um segundo epítopo diferente. Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o primeiro e o segundo scFv são amarrados a um ligante, por exemplo, um ligante peptídico (por exemplo, um ligante GS como (GGGGS)n (SEQ ID NO: 834) em que n é, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10). Outros fragmentos de ligação ao antígeno biespecíficos incluem um F(ab)2 de um anticorpo IgG biespecífico que compreende as CDRs das cadeias pesada e leve da Tabela 1 e de outro anticorpo que se liga a um epítopo diferente.
[00126] A presente invenção fornece métodos para o tratamento ou prevenção de infecção viral (por exemplo, infecção por coronavírus) através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, da Tabela 1) a um indivíduo (por exemplo, um ser humano) que precise de tal tratamento ou prevenção.
[00127] A infecção por coronavírus pode ser tratada ou evitada, em um indivíduo, através da administração de uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S da presente invenção a um indivíduo.
[00128] Uma dose eficaz ou terapeuticamente eficaz de proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, da Tabela 1), para tratamento ou prevenção de uma infecção viral se refere à quantidade de anticorpo ou fragmento suficiente para aliviar um ou mais sinais e/ou sintomas da infecção no indivíduo tratado, induzindo a regressão ou eliminação de tais sinais e/ou sintomas ou inibindo a progressão de tais sinais e/ou sintomas. A dose pode variar dependendo da idade e do tamanho de um indivíduo ao qual a mesma será administrada, da doença-alvo, das condições, da via de administração e semelhantes. Em uma modalidade da invenção, uma dose eficaz ou terapeuticamente eficaz de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção, para tratamento ou prevenção de infecção viral, por exemplo, em um indivíduo humano adulto, é de cerca de 0,01 a cerca de 200 mg/kg, por exemplo, até cerca de 150 mg/kg. Em uma modalidade da invenção, a dosagem é de até 10,8 ou 11 gramas (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 gramas). Dependendo da gravidade da infecção, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno da presente invenção pode ser administrada em uma dose inicial, seguida por uma ou mais doses secundárias. Em determinadas modalidades, a dose inicial pode ser seguida da administração de uma segunda ou uma pluralidade de doses subsequentes de anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma quantidade que pode ser aproximadamente a mesma ou inferior àquela da dose inicial, em que as doses subsequentes são separadas por pelo menos 1 dia a 3 dias; pelo menos uma semana, pelo menos 2 semanas; pelo menos 3 semanas; pelo menos 4 semanas; pelo menos 5 semanas; pelo menos 6 semanas; pelo menos 7 semanas; pelo menos 8 semanas; pelo menos 9 semanas; pelo menos 10 semanas; pelo menos 12 semanas; ou pelo menos 14 semanas.
[00129] Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" se refere a um mamífero (por exemplo, rato, camundongo, gato, cachorro, vaca, porco, ovelha, cavalo, cabra, coelho), preferencialmente um ser humano, por exemplo, com necessidade de prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio, como infecção viral ou câncer. O indivíduo pode ter uma infecção viral, por exemplo, uma infecção por influenza, ou estar predisposto a desenvolver uma infecção. Os indivíduos predispostos a desenvolver uma infecção ou indivíduos que podem estar em risco elevado de contrair uma infecção (por exemplo, de coronavírus ou vírus da influenza) incluem indivíduos com sistema imunológico comprometido por causa de doença autoimune, indivíduos que recebem terapia imunossupressora (por exemplo, após transplante de órgão), indivíduos afetados pela síndrome da imunodeficiência humana (HIV) ou síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), indivíduos com formas de anemia que empobrecem ou destroem os glóbulos brancos, indivíduos que recebem radiação ou quimioterapia ou indivíduos afetados por um distúrbio inflamatório. Além disso, indivíduos muito jovens (por exemplo, 5 anos de idade ou menos) ou idosos (por exemplo, 65 anos de idade ou mais) correm maior risco. Além disso, um indivíduo pode estar em risco de contrair uma infecção viral devido à proximidade de um surto da doença, por exemplo, o indivíduo reside em uma cidade densamente povoada ou nas proximidades de indivíduos com infecções confirmadas ou suspeitas de um vírus ou escolha de emprego, por exemplo, trabalhador de hospital, pesquisador farmacêutico, viajante da área infectada ou passageiro frequente.
[00130] "Tratar" ou "que trata" significa administrar uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1), a um indivíduo com um ou mais sinais ou sintomas de uma doença ou infecção, por exemplo, infecção viral, para a qual a proteína de ligação ao antígeno é eficaz quando administrada ao indivíduo em uma quantidade ou dose eficaz ou terapeuticamente eficaz (como discutido aqui).
[00131] A presente invenção também abrange a administração profilática de uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1), a um indivíduo em risco de infecção viral, de modo para prevenir essa infecção. A imunoprofilaxia passiva baseada em anticorpos provou ser uma estratégia eficaz para a prevenção de infecções virais de indivíduos. Veja, por exemplo, Berry et al., Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis. Influenza Res Treat. 2014; 2014:267.594. Epub 22 de setembro de 2014; e Jianqiang et al., Passive immune neutralization strategies for prevention and control of influenza A infections, Immunotherapy. Fevereiro de 2012; 4 (2): 175 a 186; Prabhu et al. Antivir Ther. 2009; 14 (7): 911 a 921, Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenza. "Prevenir" ou "impedir" significa administrar uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1), a um indivíduo para inibir a manifestação de uma doença ou infecção (por exemplo, infecção viral) no corpo de um indivíduo, para o qual a proteína de ligação ao antígeno é eficaz quando administrada ao indivíduo em uma quantidade ou dose eficaz ou terapeuticamente eficaz (como discutido aqui).
[00132] Em uma modalidade da invenção, um sinal ou sintoma de uma infecção viral em um indivíduo é a sobrevivência ou proliferação de vírus no corpo do indivíduo, por exemplo, conforme determinado pelo teste de título viral (por exemplo, propagação de coronavírus em ovos de galinha embrionados ou teste de proteína da espícula de coronavírus). Outros sinais e sintomas de infecção viral são discutidos no presente documento.
[00133] Como observado acima, em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um animal não humano, e as proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno) discutidas aqui podem ser usadas em um contexto veterinário para tratar e/ou prevenir doenças nos animais não humanos (por exemplo, gatos, cães, porcos, vacas, cavalos, cabras, coelhos, ovelhas e similares).
[00134] A presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir a infecção viral (por exemplo, infecção por coronavírus) ou para induzir a regressão ou eliminação ou inibir a progressão de pelo menos um sinal ou sintoma de infecção viral, como: • febre ou sensação de febre/calafrios; • tosse; • dor de garganta; • coriza ou nariz entupido; • espirros; • dores musculares ou corporais; • dores de cabeça; • fadiga (cansaço); • vômito; • diarreia; • infecção do trato respiratório; • desconforto no peito; • falta de ar; • bronquite; e/ou • pneumonia, cujo sinal ou sintoma é secundário à infecção viral, em um indivíduo com necessidade (por exemplo, um ser humano), administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S (por exemplo, da Tabela 1) ao indivíduo, por exemplo, por injeção da proteína no corpo do indivíduo.
[00135] Para preparar composições farmacêuticas das proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, da Tabela 1), a proteína de ligação ao antígeno é misturada com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, et al. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, de Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica é estéril. Tais composições fazem parte da presente invenção.
[00136] O escopo da presente invenção inclui composições dessecadas, por exemplo, liofilizadas, que compreendem proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, da Tabela 1), ou uma composição farmacêutica do mesmo que inclui um veículo farmaceuticamente aceitável, mas carece substancialmente de água.
[00137] Em uma modalidade adicional da invenção, um agente terapêutico adicional que é administrado a um indivíduo em associação com uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, da Tabela 1), divulgado aqui é administrado ao indivíduo de acordo com o Physicians’ Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57a edição (1 de novembro de 2002)).
[00138] O modo de administração pode variar. As vias de administração incluem oral, retal, transmucosa, intestinal, parentérica; intramuscular, subcutânea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular direta, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inalação, insuflação, tópica, cutânea, transdérmica ou intra-arterial.
[00139] A presente invenção fornece métodos para administrar uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (por exemplo, da Tabela 1), compreendendo a introdução da proteína no corpo de um indivíduo. Por exemplo, o método compreende perfurar o corpo do indivíduo com uma agulha de uma seringa e injetar a proteína de ligação ao antígeno no corpo do indivíduo, por exemplo, na veia, artéria, tumor, tecido muscular ou subcutâneo do indivíduo.
[00140] A presente invenção fornece um recipiente (por exemplo, um frasco de plástico ou de vidro, por exemplo, com uma tampa ou uma coluna de cromatografia, agulha de orifício oco ou um cilindro de seringa) que compreende qualquer uma das proteínas de ligação ao antígeno anti- CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (por exemplo, da Tabela 1), polipeptídeos (por exemplo, um HC, LC, VH ou VL da Tabela 1) ou polinucleotídeos (por exemplo, da Tabela 2) ou vetores estabelecidos aqui ou uma composição farmacêutica que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00141] Em uma modalidade da presente descrição, uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1), é administrada em associação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Um outro agente terapêutico inclui, mas não está limitado a: um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico, um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TMPRSS2 e um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a CoV- S. Em algumas modalidades, um agente antimalárico é cloroquina ou hidroxicloroquina. Em algumas modalidades, um agente anti- inflamatório é um anticorpo como sarilumabe, tocilizumabe ou gimsilumabe. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um segundo anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui divulgado, por exemplo, da Tabela 1. Em certas modalidades, um, dois, três, quatro ou mais anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da Tabela 1 podem ser administrados em combinação (por exemplo, de maneira simultânea ou sequencial). Combinações particulares de anticorpos da Tabela 1 estão listadas na Tabela de combinações de anticorpos exemplares abaixo (cada número representa uma combinação específica, por exemplo, mAb10989 e mAb10987 são a Combinação 1, mAb10989 e mAb10934 são a Combinação 2 e assim por diante). Em algumas modalidades, uma combinação de anticorpos pode ser selecionada dentre aqueles que se ligam a diferentes grupos de epítopos. Por exemplo, certos anticorpos aqui descritos pertencem a grupos de epítopos como se segue: Grupo 1, mAb10987, mAb10922, mAb10936 e mAb10934; Grupo 2, mAb10989, mAb10977 e mAb10933; Grupo 3, mAb10920; Grupo 4, mAb10954, mAb10986 e mAb10964; e Grupo 5, mAb10984. Assim, uma combinação de dois anticorpos pode ser selecionada de, por exemplo, Grupo 1 e Grupo 2, Grupo 1 e Grupo 3, Grupo 1 e Grupo 4, Grupo 1 e Grupo 5, Grupo 2 e Grupo 3, Grupo 2 e Grupo 4, Grupo 2 e Grupo 5, Grupo 3 e Grupo 4, Grupo 3 e Grupo 5 e Grupo 4 e Grupo 5. Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga especificamente ao TMPRSS2 é o H1H7017N, conforme descrito na Publicação de Patente Internacional no WO/2019/147831. TABELA DE COMBINAÇÕES DE ANTICORPOS EXEMPLARES
[00142] Em algumas modalidades, proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos) de diferentes doadores humanos podem ser combinadas. A presente invenção inclui uma composição que compreende dois (ou mais) anticorpos anti-SARS-CoV-2-S ou fragmentos de ligação ao antígeno que compreende domínios variáveis de indivíduos humanos, em que os dois (ou mais) anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno são derivados de indivíduos diferentes (por exemplo, dois indivíduos humanos diferentes). As regiões variáveis de anticorpo derivadas de células B humanas são discutidas, por exemplo, nos Exemplos 1 e 2 (Tabela 3), que descreve que domínios variáveis clonados dessas células B são combinados com uma região constante que não é dessas células B para produzir anticorpos híbridos. A fonte (doadora) dessas regiões variáveis de anticorpo é mostrada na Tabela de Regiões Variáveis de Anticorpo Derivado de Homem Exemplares, abaixo. Em algumas modalidades, uma composição pode compreender uma combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 1 e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 2. Em algumas modalidades, uma composição pode compreender uma combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 1 e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 3. Em algumas modalidades, uma composição pode compreender uma combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 2 e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com domínios variáveis derivados do doador 3. Em algumas modalidades, uma composição pode compreender uma combinação de mAb10987 (por exemplo, um anticorpo que compreende as CDRs, as regiões variáveis ou as sequências de cadeia pesada e leve mostradas na Tabela 1) do doador 1 e mAb10989 (por exemplo, um anticorpo que compreende o CDRs, as regiões variáveis ou as sequências de cadeia pesada e leve mostradas na Tabela 1) do Doador 3. TABELA DE REGIÕES VARIÁVEIS DE ANTICORPO DERIVADAS DE HUMANO EXEMPLARES mAb Doador mAb10954 Doador 3 mAb10955 Doador 3 mAb10956 Doador 3 mAb10957 Doador 3 mAb10964 Doador 1 mAb10965 Doador 2 mAb10966 Doador 3 mAb10967 Doador 3 mAb10970 Doador 1 mAb10971 Doador 1 mAb10977 Doador 1 mAb10984 Doador 1 mAb10985 Doador 1 mAb10986 Doador 1 mAb10987 Doador 1 mAb10988 Doador 3 mAb10989 Doador 3 mAb10969 Doador 1
[00143] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional é um fármaco antiviral e/ou uma vacina. Como usado no presente documento, o termo "fármaco antiviral" se refere a qualquer fármaco ou terapia anti-infeccioso usado para tratar, prevenir ou melhorar uma infecção viral em um indivíduo. O termo "fármaco antiviral" inclui, mas não se limita a, um esteroide catiônico antimicrobiano, leupeptina, aprotinina, ribavirina ou interferon alfa2b. Os métodos para tratar ou prevenir a infecção por vírus (por exemplo, coronavírus) em um indivíduo em necessidade do dito tratamento ou prevenção, administrando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da Tabela 1 em associação com um agente terapêutico adicional, fazem parte da presente invenção.
[00144] Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico adicional é uma vacina, por exemplo, uma vacina de coronavírus. Em uma modalidade da invenção, uma vacina é uma vacina de vírus inativado/morto, uma vacina de vírus vivo atenuado ou uma vacina de subunidade de vírus.
[00145] Por exemplo, em uma modalidade da invenção, o agente terapêutico adicional é: (mesilato de nafamostato); (mesilato de camostato); (cloridrato de bromexina (BHH)); cloridrato de fluoreto de (4-(2-aminometil)benzenossulfonila (AEBSF)); (poliamida). Veja Shen et al. Biochimie 142: 1 a 10 (2017).
[00146] Em uma modalidade da invenção, o fármaco antiviral é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente ao coronavírus, por exemplo, SARS-CoV-2, SARS- CoV ou MERS-CoV. Anticorpos anti-CoV-S exemplares incluem, mas não estão limitados a: H4sH15188P; H1H15188P; H1H15211P; H1H15177P; H4sH15211P; H1H15260P2; H1H15259P2; H1H15203P; H4sH15260P2; H4sH15231P2; H1H15237P2; H1H15208P; H1H15228P2; H1H15233P2; H1H15264P2; H1H15231P2; H1H15253P2; H1H15215P; e H1H15249P2, conforme estabelecido na publicação do pedido de patente internacional no WO/2015/179535, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma imunoglobulina de cadeia leve que inclui CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (por exemplo, a VL ou sua cadeia leve); e uma cadeia pesada que inclui CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 (por exemplo, a VH ou sua cadeia pesada) de qualquer um dos anticorpos anti-CoV-S anteriores.
[00147] Em uma certa modalidade da invenção, o agente terapêutico adicional não é aprotinina, leupeptina, um antimicrobiano esteroide catiônico, uma vacina contra influenza (por exemplo, vacina de vírus inteiro morto, vivo, atenuado ou subunidade) ou um anticorpo contra vírus de influenza (por exemplo, um anticorpo anti-hemaglutinina).
[00148] O termo "em associação com" indica que os componentes, uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção, juntamente com outro agente, podem ser formulados em uma única composição, por exemplo, para entrega simultânea, ou formulados separadamente em duas ou mais composições (por exemplo, um kit). Cada componente pode ser administrado a um indivíduo em um momento diferente do que quando o outro componente é administrado; por exemplo, cada administração pode ser administrada não simultaneamente (por exemplo, separadamente ou sequencialmente) em intervalos durante um determinado período de tempo. Além disso, os componentes separados podem ser administrados a um indivíduo por uma via igual ou diferente (por exemplo, em que um anticorpo anti- CoV-S ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo).
[00149] Além disso, são fornecidos kits que compreendem um ou mais componentes que incluem, mas não estão limitados a uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conforme discutido aqui (por exemplo, da Tabela 1), em associação com um ou mais componentes adicionais, incluindo, mas não limitados a um agente terapêutico adicional, como discutido aqui. A proteína de ligação ao antígeno e/ou o agente terapêutico adicional podem ser formulados como uma composição única ou separadamente em duas ou mais composições, por exemplo, com um veículo farmaceuticamente aceitável, em uma composição farmacêutica.
[00150] Em uma modalidade da invenção, o kit inclui uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção (por exemplo, da Tabela 1) ou uma composição farmacêutica em um contentor (por exemplo, em um frasco estéril de vidro ou plástico) e outro agente terapêutico em outro contentor (por exemplo, em um frasco estéril de vidro ou plástico).
[00151] Em outra modalidade, o kit compreende uma combinação da invenção, incluindo uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção (por exemplo, da Tabela 1), ou composição farmacêutica da mesma em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais formulados juntos, opcionalmente, em uma composição farmacêutica, em um único contentor comum.
[00152] Se o kit incluir uma composição farmacêutica para administração parentérica a um indivíduo, o kit poderá incluir um dispositivo (por exemplo, um dispositivo de injeção) para realizar tal administração. Por exemplo, o kit pode incluir uma ou mais agulhas hipodérmicas ou outros dispositivos de injeção, conforme discutido acima, que contêm a proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1).
[00153] O kit pode incluir uma bula que inclui informações sobre as composições farmacêuticas e formas de dosagem no kit. Geralmente, essas informações ajudam pacientes e médicos a usar as composições farmacêuticas e formas de dosagem incluídas de maneira eficaz e segura. Por exemplo, as seguintes informações sobre uma combinação da invenção podem ser fornecidas no folheto informativo: farmacocinética, farmacodinâmica, estudos clínicos, parâmetros de eficácia, indicações e uso, contraindicações, avisos, precauções, reações adversas, superdosagem, dosagem e administração adequadas, como fornecidas, condições adequadas de armazenamento, referências, informações sobre o fabricante/distribuidor e informações sobre patentes.
[00154] As proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção (por exemplo, da Tabela 1), podem ser usadas para detectar e/ou medir CoV-S em uma amostra. Ensaios exemplares para CoV-S podem incluir, por exemplo, contatar uma amostra com uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S da invenção, em que a proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S é marcada com uma molécula de marcador ou repórter detectável ou usada como um ligante de captura para isolar seletivamente CoV-S de amostras. A presença de uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S complexada com CoV-S indica a presença de CoV-S na amostra. Alternativamente, um anticorpo anti-CoV-S não marcado pode ser usado em combinação com um anticorpo secundário que é, em si, identificado de modo detectável. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I; uma unidade fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima tal como fosfatase alcalina, β-galactosidase, peroxidase de rábano ou luciferase. Os ensaios exemplificativos específicos que podem ser usados para detectar ou medir CoV-S em uma amostra incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e separação celular ativada por fluorescência (FACS). Assim, a presente invenção inclui um método para detectar a presença de polipeptídeo de proteína da espícula em uma amostra que compreende o contato da amostra com uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S e a detecção da presença de uma proteína de ligação ao antígeno CoV-S/anti-CoV-S em que a presença do complexo indica a presença de CoV-S.
[00155] Uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S da invenção (por exemplo, da Tabela 1) pode ser usada em um procedimento de Western blot ou blot de imunoproteína para detectar a presença de CoV-S ou um fragmento do mesmo em uma amostra. Tal procedimento faz parte da presente invenção e inclui as etapas de, por exemplo: (1) fornecer uma membrana ou outro substrato sólido que compreende uma amostra a ser testada para a presença de CoV-S, por exemplo, incluindo opcionalmente a etapa de transferir proteínas de uma amostra a ser testada para a presença de CoV-S (por exemplo, de uma PAGE ou Separação eletroforética das proteínas na amostra por SDS-PAGE) em uma membrana ou outro substrato sólido usando um método conhecido na técnica (por exemplo, blotting semisseco ou blotting de tanque); e contatar a membrana ou outro substrato sólido a ser testado quanto à presença de CoV-S ou um fragmento do mesmo com uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S da invenção.
[00156] Essa membrana pode assumir a forma, por exemplo, de uma membrana à base de nitrocelulose ou vinila (por exemplo, fluoreto de polivinilideno (PVDF)) na qual as proteínas a serem testadas quanto à presença de CoV-S em uma PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida) não desnaturante ou gel SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida de sódio dodecil sulfato) foram transferidos (por exemplo, após separação eletroforética no gel). Antes contatar a membrana com a proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S, a membrana é opcionalmente bloqueada, por exemplo, com leite seco sem gordura ou semelhante, de modo a ligar locais de ligação a proteínas não específicos na membrana. (2) lavar a membrana uma ou mais vezes para remover a proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S não ligada e outras substâncias não ligadas; e (3) detectar a proteína de ligação ao antígeno anti-CoV-S ligada.
[00157] A detecção da proteína de ligação ao antígeno ligada indica que a proteína de CoV-S está presente na membrana ou substrato e na amostra. A detecção da proteína de ligação ao antígeno ligada pode ser ligando a proteína de ligação ao antígeno com um anticorpo secundário (um anticorpo anti-imunoglobulina) que é marcado de forma detectável e, em seguida, detectando a presença do marcador de anticorpo secundário.
[00158] As proteínas de ligação ao antígeno anti-CoV-S (por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, da Tabela 1)) aqui divulgadas também podem ser usadas para imuno- histoquímica. Esse método faz parte da presente invenção e compreende, por exemplo, (1) contatar o tecido a ser testado quanto à presença de proteína de CoV-S com uma proteína de ligação ao antígeno anti-CoV- S da invenção; e (2) detectar a proteína de ligação ao antígeno no ou dentro do tecido.
[00159] Se a própria proteína de ligação ao antígeno for detectável, ela poderá ser detectada diretamente. Alternativamente, a proteína de ligação ao antígeno pode ser ligada por um anticorpo secundário marcado de forma detectável, em que o marcador é então detectado.
[00160] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a fornecer àqueles versados na técnica uma descrição e descrição completas de como produzir e usar os métodos e composições da invenção, e não se destinam a limitar o escopo daquilo que os inventores consideram sua invenção. Foram realizados esforços para assegurar a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), porém, alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. Salvo quanto indicado de outro modo, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura está em graus Centígrados, a temperatura ambiente é de cerca de 25 °C, e a pressão é a pressão atmosférica ou próxima da mesma.
[00161] Anticorpos humanos para a proteína da espícula de SARS- CoV-2 (SARS-CoV-2-S) foram gerados em um camundongo VELOCIMMUNE® compreendendo DNA que codifica regiões variáveis de cadeia pesada e capa de imunoglobulina humana ou regiões variáveis de cadeia leve pesada e lambda de imunoglobulina humana. Cada camundongo foi imunizado com um vetor que expressa o domínio de ligação de receptor SARS-CoV-2-S (RBD) (aminoácidos 1 a 1.273 do número de acesso NCBI (MN908947.3), SEQ ID NO: 832), seguido por um reforço com um vetor de SARS-CoV-2-S ou uma proteína de SARS-CoV-2-S. A resposta imunológica de anticorpo foi monitorada por um imunoensaio específico de SARS-CoV-2-S. Quando uma resposta imune desejada foi alcançada, os linfócitos foram colhidos e fundidos com células de mieloma de camundongos para preservar a sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma. As linhagens celulares de hibridoma foram triadas e selecionadas para identificar linhagens celulares que produzem anticorpos específicos de CSARS- CoV-2-S. Os anticorpos anti-SARS-CoV-2-S também foram isolados diretamente de células B positivas para antígeno sem fusão às células de mieloma, conforme descrito na Patente n° U.S. 7582298, incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Utilizando este método, foram obtidos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S totalmente humanos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos).
[00162] Regiões variáveis de anticorpos também foram isoladas de amostras de sangue humano. O sangue total foi recebido dos pacientes 3 a 4 semanas após um teste positivo de PCR confirmado em laboratório para SARS-CoV-2 e doença sintomática COVID-19. Os glóbulos vermelhos foram lisados usando um tampão de lise à base de cloreto de amônio (Life Technologies) e as células B foram enriquecidas por seleção negativa. As células B únicas que ligam a proteína da espícula do SARS-CoV-2 foram isoladas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS). As células B isoladas foram plaqueadas em um único poço e misturadas com os iniciadores de PCR específicos para região variável leve e pesada de anticorpos. Os cDNAs para cada célula B única foram sintetizados por meio de uma reação de transcriptase reversa (RT). Cada produto de RT resultante foi então dividido e transferido para dois poços correspondentes para subsequentes PCRs de cadeia pesada e leve de anticorpo. Um conjunto dos produtos de RT resultantes foi primeiro amplificado por PCR usando um iniciador degenerado 5 'específico para a sequência líder da região variável pesada de anticorpo ou um iniciador degenerado 5' específico para a sequência líder da região variável da cadeia leve do anticorpo e um iniciador 3 'específico para a região constante do anticorpo, para formar um amplicon. Os amplicons foram então amplificados novamente por PCR usando um iniciador degenerado 5‘ específico para a estrutura 1 da região variável pesada de anticorpo ou um iniciador degenerado 5' específico para a estrutura 1 da região variável da cadeia leve do anticorpo e um iniciador 3‘ específico para a região constante do anticorpo, para gerar amplicons para clonagem. Os produtos de PCR derivados de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo foram clonados em vetores de expressão contendo região constante pesada e região constante leve, respectivamente, produzindo vetores de expressão para anticorpos híbridos. Os vetores de expressão que expressam pares de cadeia pesada e leve de comprimento total foram transfectados em células CHO para produzir proteínas de anticorpo para teste.
[00163] As propriedades biológicas dos anticorpos exemplificativos gerados em conformidade com os métodos desse Exemplo são descritas detalhadamente nos Exemplos apresentados abaixo.
[00164] A Tabela 1 apresenta os identificadores da sequência de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesada e leve e CDRs, bem como as sequências da cadeia pesada e cadeia leve de exemplos de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S. Os identificadores de sequência de ácido nucleico correspondentes são apresentados na Tabela 2. TABELA 1: IDENTIFICADORES DE SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS
TABELA 2: ID ENTIFICADO RES DE SEQU ÊNCIA DE ÁC DOS NUCLEICOS
[00165] Os anticorpos aqui divulgados têm regiões variáveis totalmente humanas, mas podem ter regiões constantes de camundongo (por exemplo, um IgG1 Fc de camundongo ou um IgG2 Fc de camundongo (isotipo a ou b)) ou regiões constantes humanas (por exemplo, um IgG1 Fc humano ou um IgG4 Fc humano). Conforme será observado por uma pessoa de habilidade comum na técnica, um anticorpo que tem um isótipo de Fc particular pode ser convertido em um anticorpo com um isótipo de Fc diferente (por exemplo, um anticorpo com um IgG1 Fc de camundongo pode ser convertido em um anticorpo com IgG4 humano, etc.) porém, de todo modo, os domínios variáveis (incluindo as CDRs) - que são indicados pelo identificadores numéricos mostrados nas Tabelas 1 e 2 - permanecerão os mesmos, e espera-se que as propriedades de ligação ao antígeno sejam idênticas ou substancialmente semelhantes independente da natureza do domínio constante.
[00166] As regiões variáveis dos anticorpos derivados de camundongos VELOCIMMUNE® e de amostras humanas foram sequenciadas por Sequenciamento de Próxima Geração e o repertório para pares de cadeias pesadas e leves foi identificado (Figura 10A e Figura 10B). A linhagem predominante de anticorpos VI utilizou VH3-53 emparelhado com VK1-9, VK1-33 ou VK1-39, enquanto os anticorpos derivados de humanos utilizaram VH3-66 emparelhado com VK1-33 ou VH2-70 emparelhado com VK1-39. Análises adicionais de sequências sobrepostas mostraram forte sobreposição no repertório de cadeias capa isoladas entre anticorpos derivados de humanos e VI. Embora o repertório de cadeias Lambda não tenha se sobreposto bem, isso pode ser devido à inclusão de apenas dois camundongos lambda neste estudo. O comprimento médio de CDR para a cadeia pesada foi semelhante entre os anticorpos derivados de VI e humanos, com um comprimento médio de 13 e 14,5 aminoácidos, respectivamente. O comprimento capa médio da CDR foi o mesmo para os anticorpos derivados de VI e humanos com 9 aminoácidos e foi próximo para as cadeias lambda com um comprimento médio de 11,1 e 10,6 aminoácidos, respectivamente. A disponibilidade de e anticorpos derivados humanos e de camundongo humanizados permitiu uma maior diversidade de genes V e permitiu a identificação posterior de anticorpos não concorrentes.
[00167] Como descrito acima, os anticorpos foram obtidos a partir de hibridomas gerados a partir de camundongos VELOCIMMUNE®, por isolamento direto de células B de camundongo VELOCIMMUNE® positivas para antígeno, ou derivadas de regiões variáveis clonadas a partir de células B humanas positivas para antígeno. Um resumo dessas fontes é mostrado na Tabela 3. TABELA 3: FONTES DE ANTICORPOS/REGIÕES VARIÁVEIS
[00168] Foi realizado um ensaio de ligação de ELISA para identificar sobrenadantes de anticorpos que se ligavam ao domínio de ligação de receptor de proteína da espícula de SARS-CoV-2 (RBD). Uma proteína composta pelo RBD do SARS-CoV-2 (aminoácidos 319-541) expressa com um marcador de histidina 6X e dois marcadores de epítopo myc no terminal C (SARS-CoV-2-S-RBD-mmH; veja também O Número de Acesso NCBI MN908947.3) foi revestida a 1 μg/mL em uma placa de 96 poços em tampão PBS durante a noite a 4 °C. Os sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados com o uso de uma solução a 0,5% (p/v) de BSA em PBS. Os sobrenadantes de anticorpo ou o meio isolado foram diluídos 1:40 ou 1:50 no tampão de bloqueio PSA + 0,5% de BSA e transferidos para as placas de microtitulação lavadas. Após uma hora de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados e o sobrenadante ligado à placa foi detectado com anticorpo IgG de cabra anti-humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson Immunoresearch) ou anticorpo IgG anticamundongo conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (pesquisa imunológica de Jackson). As placas foram então desenvolvidas usando solução de substrato TMB (BD Biosciences) de acordo com a recomendação do fabricante e a absorbância a 450 nm foi medida em um leitor de placas Victor X5.
[00169] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S de se ligar ao domínio de ligação de receptor de SARS-CoV-2-S (SARS-CoV-2-S- RBD) foi avaliada, conforme descrito acima, usando um ELISA de ligação com a proteína SARS-CoV-2-S-RBD-mmH revestida em uma microplaca. O sobrenadante do anticorpo de ponto único que se liga ao SARS-CoV-2-S-RBD-mmH revestido em placas de microtitulação de 96 poços foi detectado com um anticorpo anti-hFc ou anti-mFc conjugado com HRP.
[00170] Os resultados de ligação de três ensaios estão resumidos na Tabela 4. Os sinais de ligação ao SARS-CoV-2 (absorbância de 450 nm) são indicados, com fundo somente de meio fornecido como referência negativa por cada experimento. Uma amostra marcada como IC (Inconclusiva) apresentou uma anomalia experimental na placa e, portanto, é relatada sem um valor. Como mostrado em comparação com o controle apenas do meio, os sobrenadantes testados mostraram ligação substancial ao SARS-CoV-2-S-RBD. TABELA 4: LIGAÇÃO DO SOBRENADANTE AO DOMÍNIO DE LIGAÇÃO DE RECEPTOR DA PROTEÍNA DA ESPÍCULA DE SARS- COV-2
[00171] Para investigar a capacidade de um painel de anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S de se ligar à glicoproteína da espícula de SARS-CoV-2, um ensaio de ligação in vitro utilizando partículas do tipo viral que expressam proteínas da espícula de SARS-CoV-2 (VLPs) em uma plataforma de detecção baseada em eletroquimiluminescência (MSD) foi desenvolvida.
[00172] Para expressar transitoriamente a proteína da espícula de SARS-CoV-2 (número de acesso NCBI MN908947.3, aminoácidos 16 a 1.211; SEQ ID NO: 833), o vírus da estomatite vesicular (VSV) sem glicoproteína G (VSV delta G) foi pseudotipado com proteína da espícula de SARS-CoV-2 (VSV-SARS-CoV-2-S) e gerado nas células HEK293T. Como controle de ligação negativo, o VSV delta G foi pseudotipado com a proteína VSV G (VSV-G).
[00173] Os experimentos foram realizados de acordo com o procedimento a seguir. Os dois tipos de VLPs descritos acima foram diluídos em PBS, semeados em placas de eletrodo de carbono de 96 poços (placa de alta ligação MULTI-ARRAY, MSD) e incubadas durante a noite a 4 °C para permitir que as VLPs aderissem. Os sítios de ligação não específicos foram bloqueados por BSA a 2% (p/v) em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Sobrenadantes contendo anticorpos produzidos a partir de camundongos imunizados a SARS CoV-2 ou soros humanos infectados, juntamente com controles somente de meio que foram diluídos 1:10 ou 1:20 em 1x PBS + tampão BSA a 0,5%, foram adicionados às partículas ligadas à placa. As placas foram então incubadas por 1 hora à temperatura ambiente com agitação, após o que as placas foram lavadas com 1x PBS para remover os anticorpos não ligados usando uma lavadora de placas AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Os anticorpos ligados à placa foram detectados com um anticorpo IgG anti-humano conjugado com SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) ou um anticorpo IgG anticamundongo conjugado com SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) por 1 hora em temperatura ambiente. Após as lavagens, as placas foram desenvolvidas com o Tampão Read (MSD) de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante e os sinais luminescentes foram registrados com um instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Os sinais de ligação direta (em RLU) foram capturados e uma razão entre VLPs que expressam SARS-CoV-2-S e VLP irrelevante foi calculada.
[00174] A capacidade dos anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV- 2-S para se ligar a VLPs que expressam SARS-CoV-2-S em comparação com a ligação a VLPs que expressam VSV irrelevantes foi avaliada usando um ensaio de ligação imunológica, como descrito acima. A ligação de ponto único às VLPs imobilizadas em placas High Bind de 96 poços (MSD) foi realizada com uma diluição de sobrenadante de anticorpo de 1:10 ou 1:20, ligada por 1 hora, e detectada usando anticorpo IgG anti-humano conjugado com SULFO- TAGTM ou IgG anticamundongo. Os sinais de ligação da eletroquimiluminescência foram registrados em um Sector Imager 600 (MSD). Os valores de RLU foram determinados para a ligação do anticorpo às VLPs. As razões foram calculadas comparando os sinais de ligação do VLP que expressam SARS-CoV-2-S para controlar os VLPs.
[00175] Os resultados da ligação de três experimentos estão resumidos na Tabela 5. Um sinal observado a partir de VLPs que expressam SARS-CoV-2-S indica ligação, enquanto a comparação com VLPs negativas fornece um fundo relativo. Amostras isoladas de meio fornecem sinais de linha de base da ligação do anticorpo secundário a amostras sem sobrenadante. Os 46 anticorpos se ligaram especificamente a >4 vezes mais do que as amostras apenas de meio (20 a 35 RLU) nas VLPs que expressam SARS-CoV-2-S, com uma gama de sinais de ligação de 85 a 13.600 RLU. As razões entre VSV que expressam SARS-CoV-2-S:VSV-VLPs (controle negativo) variaram de 1,1 a 22,7, com muitas tendo alto fundo de VSV-VLPs. A razão de mAb11002 de 0,9 é provavelmente devida a uma baixa concentração de anticorpo monoclonal na amostra de sobrenadante. TABELA 5: LIGAÇÃO DE VLP SARS-COV-2-S
[00176] Para investigar a capacidade de um painel de anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S de neutralizar o SARS-CoV-2, foi desenvolvido um ensaio de neutralização in vitro utilizando pseudovírus VSV-SARS-CoV-2-S.
[00177] Como descrito acima, os vírus do pseudotipo VSV foram gerados por transfecção transiente de células 293T com um plasmídeo que codifica para a proteína da espícula de SARS-CoV-2. As células foram semeadas em placas de 15 cm a 1,2x107 células por placa em meio completo DMEM um dia antes da transfecção com 15 μg/DNA de proteína da espícula de placa usando 125 μL de lipofectamina LTX, 30 μL de reagente PLUS e até 3 mL de Opti-Mem. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com 10 mL de PBS e depois infectadas com um MOI de vírus 0,1 VSV ΔG:mNeon em 10 mL de Opti- Mem. O vírus foi incubado nas células por 1 hora, com agitação suave a cada 10 minutos. As células foram lavadas 3 vezes com 10 mL de PBS, depois cobertas com 20 mL de meios de infecção antes de incubação a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 horas. O sobrenadante foi coletado em tubos de centrífuga de 250 mL em gelo, depois centrifugado a 3.000 rpm por 5 minutos para granular quaisquer detritos celulares, aliquotados em gelo, e depois congelados a -80 °C. A infecciosidade foi testada em células Vero antes do uso em ensaios de neutralização. Este material será referido como VSV-SARS-CoV-2-S.
[00178] No dia 1, as células Vero foram semeadas com 80% de confluência em frascos T225. Para células de semeadura, o meio foi removido das células, as células foram lavadas com 20 mL de PBS (Gibco: 20012-043) e 5 mL de TrypLE foram adicionados e incubados por ~ 5 minutos a 37°C até as células se desalojarem. Foram adicionados 5 mL de DMEM completo para inativar a tripsina e pipetados para cima e para baixo para distribuir as células. Para contar as células ressuspensas, foram colocadas 20.000 células Vero em 100 μL de DMEM completo pré-aquecido por poço em uma microplaca de poliestireno preto de 96 poços (Corning: 3904).
[00179] No dia 2, o VSV-SARS-CoV-2-S foi descongelado em gelo e diluído 1:1 com meio de infecção.
[00180] Em uma placa de 96 poços com fundo em V, foi gerada uma diluição de cada sobrenadante em 60 μL de meio de infecção. Para controles de meio (negativos), 60 μL de meio condicionado diluído foram adicionados aos poços. Foram adicionados 60 μL de VSV-SARS-CoV- 2-S diluído a todos os poços, exceto os poços de controle do meio. A esses poços, foram adicionados 60 μL de meio de infecção. Os pseudovírus foram então incubados com diluições sobrenadantes por 30 minutos à temperatura ambiente. O meio foi removido das placas de células Vero, 100 μL de misturas/pseudovírus de sobrenadante foram transferidos para as células, e a placa foi incubada a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 horas. As diluições finais de sobrenadante de 1:4 e 1:20, e para algumas amostras 1:100, foram usadas para avaliar a neutralização dos pseudovírus VSV-SARS-CoV-2-S.
[00181] No dia 3, após a incubação de 24 horas, o sobrenadante foi removido dos poços celulares e substituído por 100 μL de PBS. As placas foram então lidas em um SpectraMax i3 com citômetro de imagem MiniMax.
[00182] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S para neutralizar o vírus pseudotipado com expressão de SARS-CoV-2-S baseado em VSV foi avaliada usando um ensaio de foco de fluorescência de neutralização. Os resultados de ligação de três ensaios estão resumidos abaixo. A potência de neutralização do anticorpo em cada diluição é representada como uma porcentagem em comparação com o controle simulado do sobrenadante. Todos os anticorpos demonstraram capacidade de neutralização, e particularmente para o conjunto de anticorpos avaliados 1:100, aqueles que apresentaram maior neutralização podem representar uma capacidade de neutralização mais potente. TABELA 6: NEUTRALIZAÇÃO DE VLPS
*NT - não testado
[00183] A capacidade dos anticorpos direcionados para a proteína da espícula de SARS-CoV-2 para interagir com FcYR3a, um receptor Fc expresso de forma proeminente em células exterminadoras naturais (NK) que induz citotoxicidade mediada por célula (ADCC) dependente de anticorpo, foi medida em um bioensaio substituto usando células repórteres e células alvo ligadas a anticorpos. Este ensaio utilizou células T Jurkat que foram geneticamente modificadas para expressar o gene repórter luciferase sob o controle do fator de transcrição NFAT (NFAT-Luc) juntamente com o receptor do alótipo humano FcYR3a 176Val de alta afinidade (Jurkat/NFAT-Luc/hFcYR3a 176Val). As células alvo foram geneticamente modificadas por células T Jurkat que expressam CD20 humano (usado como controle positivo com um anticorpo IgG1 humano direcionado a CD20) e a proteína da espícula de SARS-CoV-2 de comprimento total controlada por um promotor indutível por doxiciclina. As células repórteres foram incubadas com células-alvo e o envolvimento de FcYR3a através do domínio Fc dos anticorpos IgG1 humanos ligados às células-alvo levou à ativação do fator de transcrição NFAT nas células repórteres e direcionou a expressão da luciferase que foi então medida através de uma leitura de luminescência.
[00184] As células T Jurkat foram geneticamente modificadas para expressar constitutivamente CD20 humano de comprimento total (aminoácidos M1-P297 do número de acesso NCBI NP_690605.1), proteína transativadora Tet3G (clonada usando um vetor Takara pEF1α- Tet3G, número de catálogo 631167), bem como uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 de comprimento total induzível por doxiciclina (aminoácidos M1-T1273 do número de acesso NCBI YP_009724390.1). As células que expressam a proteína da espícula de Jurkat/Tet3G/hCD20/SARS-CoV2 geneticamente modificada foram classificadas para alta expressão da proteína da espícula e subsequentemente mantidas em RPMI + 10% de FBS livre de Tet + P/S/G + 500 μg/mL de G418 + 1 μg/mL de puromicina + 250 μg/mL de meio de crescimento higromicina.
[00185] As células T Jurkat foram geneticamente modificadas para expressar de maneira estável um construtor repórter da luciferase do Fator Nuclear de Células T Ativadas (NFAT), juntamente com o receptor de alótipo 176Val FcYR3a de a alta afinidade humano (aminoácidos M1- K254 do número de acesso NCBI P08637 VAR_003960). As células repórteres geneticamente modificadas foram mantidas em RPMI1640 + 10% de FBS + P/S/G + 0,5 μg/mL de puromicina + 500 μg/mL de meio de crescimento G418.
[00186] 36 horas antes do início do ensaio ADCC substituto, 5 x 105 células alvo/mL foram induzidas em meio RPMI + 10% de FBS livre de Tet + meios de cultura celular P/S/G contendo 1 ug/mL de doxiciclina (Sigma). Um dia antes do experimento, as células repórter foram divididas para uma densidade de 7,5 x 10 5 células/mL em RPMI 1640 + FBS 10% + P/S/G + 0,5 ug/mL de puromicina + 500 ug/mL de meio de crescimento G418.
[00187] Resumidamente, no dia do experimento, as células alvo e repórter foram transferidas para o meio de ensaio (RPMI + 10% de FET livre de Tet + P/S/G) e adicionadas na razão de 3:2 (3 x 104/poço de células-alvo e 2 x 104/poço de células repórter) para placas de microtitulação de 384 poços brancas, seguido pela adição de sobrenadante de anticorpo anti-SARS-CoV-2-S de concentrações variadas. Uma amostra de controle positivo (anticorpo CD20 com IgG1 humana) e uma amostra de controle negativo contendo nenhum anticorpo foram incluídas em cada placa para normalizar as atividades ADCC detectadas dos sobrenadantes de anticorpos anti-SARS-CoV-2- S. As placas foram incubadas a 37 °C/5% de CO2 durante 5 h, seguido pela adição de um volume igual de UM-Glo™ (Promega) de reagente para lisar as células e detectar a atividade da luciferase. A luz emitida foi capturada em Unidades de Luz Relativa (RLU) em um leitor de placas de múltiplas marcações, Envision (PerkinElmer), e os dados foram analisados e normalizados usando a seguinte equação: Atividade ADCC (%) = 100 x (Média em RLU (amostras de teste) - Média em RLU (sinal de fundo)) (Média em RLU (controle positivo) - Média em RLU (sinal de fundo))
[00188] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S para ativar receptores FCY R3a foi avaliada em um ensaio de ADCC substituto usando Jurkat/NFAT-Luc/FcyR3a 176Val) como células repórteres e espículas de Jurkat/hCD20/SARS-CoV2 como células- alvo. Cada anticorpo testado continha um domínio IgG1.
[00189] A Tabela 7 resume os resultados, mostrando a atividade bruta da luciferase e a % calculada de controle positivo. Foi observada uma faixa de % de atividade do ADCC, indicando ativação de FcyR3a pelos sobrenadantes de anticorpos. Todas as amostras demonstraram alguma medida da atividade de ADCC substituto e 10 dos sobrenadantes de anticorpos demonstraram a atividade de ADCC substituto melhor do que a observada nos controles positivos. TABELA 7: ATIVIDADE DE ADCC SUBSTITUTO DOS SOBRENADANTES DE ANTICORPOS ANTI-SARS-COV-2-S.
[00190] Foi realizado um ensaio de ligação Luminex para determinar a ligação de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S a um painel de antígenos. Para este ensaio, os antígenos foram acoplados a amina ou capturados por estreptavidina nas microesferas Luminex da seguinte forma: aproximadamente 10 milhões de microesferas MagPlex (Luminex Corp., MagPlex Microspheres, número Cat. MC10000 e MC12000), foram ressuspensas por vórtice em 500 μL de 0,1 M de NaPO4, pH 6,2 (tampão de ativação) e em seguida centrifugadas para remover o sobrenadante. As microesferas foram protegidas da luz, pois são sensíveis à luz. As microesferas foram ressuspensas em 160 μL de tampão de ativação e os grupos carboxilato (-COOH) foram ativados pela adição de 20 μL de 50 mg/mL de N-hidroxissuccinimida (NHS, Thermo Scientific, número Cat. 24525) seguido pela adição de 20 μL de 1-etil-3-[3- dimetilaminopropil]carbodi-imida a 50 mg/mL (EDC, ThermoScientific, número Cat. 22980) a 25°C. Após 10 minutos, o pH da reação foi reduzido para 5,0 com a adição de 600 μL de MES 50 mM, pH 5 (tampão de acoplamento) e as microesferas foram agitadas em vórtice e centrifugadas para remover o sobrenadante. As microesferas ativadas foram imediatamente misturadas com 500 μL de 25 μg/mL do antígeno proteico ou Streptavidina em tampão de acoplamento e incubadas por duas horas a 25°C. A reação de acoplamento foi extinta pela adição de 50 μL de 1 M de Tris-HCl, pH 8,0 e as microesferas foram agitadas em vórtice, centrifugadas e lavadas três vezes com 800 μL de PBS 0,005% (Tween20 0,05%), para remover proteínas desacopladas e outros componentes de reação. As microesferas foram ressuspensas em 1 mL de PBS 2% e BSA 0,05% e Na Azida a 10 milhões de microesferas/mL. Para captura de antígenos de estreptavidina, 500 μL de 12,5 μg/mL de proteína biotinilada em PBS foram adicionados às microesferas acopladas a estreptavidina e incubadas por uma hora a 25°C. As microesferas foram submetidas a vórtice, centrifugadas e lavadas três vezes com 800 μL de PBS e depois bloqueadas usando 500 μL de biotina a 30 mM (Millipore-Sigma, número Cat. B4501) em Tris 0,15 M, pH 8,0. As microesferas foram incubadas por 30 minutos, depois submetidas a vórtice, centrifugadas e lavadas três vezes com 800 μL de PBS. As microesferas foram ressuspensas em 1 mL de PBS 2% e BSA 0,05% e Na Azida a 10 milhões de microesferas/mL.
[00191] As microesferas para as diferentes proteínas e proteínas biotiniladas foram misturadas a 2.700 esferas/mL, e 75 μL de microesferas foram semeados por poço em uma placa de fundo plano ProcartaPlex de 96 poços (ThermoFisher, número Cat. EPX-44444- 000) e misturados com 25 μL de anticorpo individual contendo o sobrenadante anti-SARS-CoV-2. As amostras e microesferas foram incubadas por duas horas a 25oC e depois lavadas duas vezes com 200 μL de DPBS com Tween 20 a 0,05%. Para detectar os níveis de anticorpos ligados a microesferas individuais, 100 μL de capa anti- humano de cabra F(ab')2 conjugados com R-fitoeritrina (2,5' g) (Southern Biotech, número Cat 2063-09) em tampão de bloqueio (para anticorpos com regiões de Fc murino) ou 100 μL de 1,25 μg/mL de IgG anticamundongo de cabra de Fragmento R-Ficoeritrina AffiniPure F(ab')2, específico de fragmento F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, número Cat. 115-116-072) no tampão de bloqueio (para anticorpos com regiões Fc humanas), foram adicionados e incubados por 30 minutos a 25°C. Após 30 minutos, as amostras foram lavadas duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem e ressuspensas em 150 μL de tampão de lavagem. As placas foram lidas em um Luminex FlexMap 3D ® (Luminex Corp.) e Luminex xPonent ® versão de software 4.3 (Luminex Corp.). As proteínas SARS-CoV-2 usadas no ensaio são as seguintes: RBD_ (R319-F541).mmh: SEQ ID NO: 829 RBD_ (R319-F541).mFc: SEQ ID NO: 830 RBD_ (R319-F541).hFc): SEQ ID NO: 831
[00192] Os resultados da ligação Luminex são mostrados na Tabela 8 e na Tabela 9 como intensidades de sinal de intensidade mediana de fluorescência (MFI). Os resultados mostram que os 46 sobrenadantes de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S se ligam especificamente às proteínas RBD SARS-CoV-2-S. Esses resultados também mostram que cinco desses anticorpos reagem de maneira cruzada com proteínas da espícula RBD de coronavírus SARS com sinal de ligação maior que 1.000 MFI. TABELA 8: SINAL DE LIGAÇÃO (MFI) DAS PROTEÍNAS DA ESPÍCULA RBD DE SARS-COV-2, ESPÍCULA S1 DE SARS-COV-2, RBD DE SARS, ESPÍCULA S1 DE SARS, ESPÍCULA DE MERS E RIKE DE MERS E RBD DE MERS A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2 (COM HFC) TABELA 8 (CONTINUAÇÃO) TABELA 9: SINAL DE LIGAÇÃO (MFI) DE SARS-COV-2 RBD, ESPÍCULA S1 DE SARS-COV-2, SARS RBD, SARS ESPÍCULA S1, PROTEÍNAS DA ESPÍCULA DE MERS E MERS RBD A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2-S (COM MFC) TABELA 9 (CONTINUAÇÃO)
[00193] Foi realizado um ensaio de ligação para determinar o perfil de ligação dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S. Para este ensaio, os antígenos foram acoplados à amina como descrito para o ensaio de ligação de Luminex acima. Resumidamente, aproximadamente 9 milhões de microesferas MagPlex para 16 regiões diferentes de esferas (Luminex Corp., MagPLex Microspheres, número Cat. MagPLex MC10000 e MC12000), foram ressuspensos por vórtice em 500 μL de 0,1 M NaPO4, pH 6,2 e em seguida centrifugados para remover o sobrenadante. As microesferas foram ressuspensas em 160 μL de tampão de ativação e os grupos carboxilato (-COOH) foram ativados pela adição de 20 μL de 50 mg/mL de N-hidroxissuccinimida (NHS, Thermo Scientific, número Cat 24525), seguida pela adição de 20 μL de 50 mg/mL de 1-etil-3- [3- dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, ThermoScientific, número Cat 22980) a 25 °C. Após 10 minutos, o pH da reação foi reduzido para 5,0 com a adição de 600 μL de MES a 50 mM, pH 5 (tampão de acoplamento) e as microesferas foram agitadas em vórtice e centrifugadas para remover o sobrenadante. As microesferas ativadas foram imediatamente misturadas com 500 μL de 20 μg/mL de Proteína da espícula de SARS-CoV-2 (RBD) (R319-F541) -mmH em tampão de acoplamento e incubadas por duas horas a 25oC. A reação de acoplamento foi extinta pela adição de 50 μL de 1 M de Tris-HCl, pH 8,0 e as microesferas foram agitadas em vórtice, centrifugadas e lavadas três vezes com 1.000 μL de PBS. As microesferas foram ressuspensas em 250 μL de PBS a 9 milhões de microesferas/mL.
[00194] 15 das 16 regiões de microesfera com proteína acoplada a amina foram modificadas para o ensaio de binning da seguinte forma: as microesferas foram lavadas duas vezes com PBS 5% DMSO e 500 μL de um produto químico ou enzima foram dissolvidos por recomendações de fabricação e adicionados a 10 nM às microesferas acopladas a amina descritas acima. Este foi subsequentemente submetido a vórtice e incubado durante 2 horas à temperatura ambiente com rotação. Lave as microesferas 3 vezes com PBS 2% BSA. As microesferas foram ressuspensas em 1 mL de PBS a 9 milhões de microesferas/mL.
[00195] As microesferas modificadas e não modificadas por proteínas (intactas) foram misturadas a 2.700 esferas/mL e 75 μL de microesferas foram semeadas por poço em uma placa de 96 poços ProcartaPlex de 96 poços (ThermoFisher, número Cat. EPX-44444-000) e misturado com 25 μL de anticorpo individual anti-SARS-CoV-2-S contendo sobrenadante. As amostras e microesferas foram incubadas por duas horas a 25 °C e depois lavadas duas vezes com 200 μL de DPBS com Tween 20 a 0,05%. Para detectar os níveis de anticorpos ligados a microesferas individuais, 100 μL de capa anti-humano de cabra F(ab')2 conjugados com R-fitoeritrina (2,5' g) (Southern Biotech, número Cat 2063-09) em tampão de bloqueio (para anticorpos com hFc) ou 100 μL de 1,25 μg/mL de IgG anticamundongo de cabra de Fragmento R-Ficoeritrina AffiniPure F(ab')2, específico de fragmento F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, número Cat. 115-116-072) em tampão de bloqueio (para anticorpos com mFc), ou 100 μL de 1,25 μg/mL de R-Ficoeritrina Anti-His (Biolegend, Cat. No: 362603) no tampão de bloqueio (para controle ACE-2, P&D, número de ref. 933-ZN), foram adicionados e incubados por 30 minutos a 25°C. Após 30 minutos, as amostras foram lavadas duas vezes com 200 μL de tampão de lavagem e ressuspensas em 150 μL de tampão de lavagem. As placas foram lidas em FlexMap 3D® (Luminex Corp.) e Luminex xPonent® versão de software 4.3 (Luminex Corp.).
[00196] Os resultados dos resultados de binning Luminex são mostrados na Tabela 10 como intensidades de sinal de intensidade mediana de fluorescência (MFI). Para determinar grupos, os dados foram normalizados para a proteína intacta (microesferas não modificadas) e agrupados. Os 46 anticorpos anti-SARS-CoV-2 foram classificados em 9 grupos com 2 ou mais anticorpos e 11 anticorpos foram classificados como nós únicos. Os grupos foram atribuídos com base nesses resultados do agrupamento hierárquico e do dendrograma. Estes resultados mostram que os 46 sobrenadantes de anticorpos anti-SARS-CoV-2-S tinham características e perfis de ligação diversos, sugerindo que a coleção de anticorpos se liga a diferentes epítopos na proteína da espícula de SARS- CoV-2. TABELA 10: SINAL DE LIGAÇÃO (MFI) E ATRIBUIÇÃO DE GRUPO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2-S AO SARS- COV-2-S RBD.MMH (NÃO MODIFICADO E MODIFICADO QUIMICAMENTE OU ENZIMATICAMENTE) TABELA 10 (CONTINUAÇÃO)
[00197] Constantes de dissociação de equilíbrio (KD) para diferentes anticorpos de SARS-CoV-2-S a partir de sobrenadantes de células primárias CHOt ou a partir de hibridomas foram determinados utilizando um biossensor BIAcore T200/Biacore 8K com base em ressonância de plasmon de superfície em tempo real. Todos os estudos de ligação foram realizados em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e tensoativo Tween-20 a 0,05% v/v, pH 7,4 (HBS-ET), tampão de corrida a 25 °C. A superfície do chip do sensor Biacore CM5 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com mAb específico de Fc de camundongo anti- humano ou anticorpo monoclonal FCY de coelho anticamundongo (GE, número de catálogo BR-1008-38) para capturar anticorpos anti-SARS- CoV-2. Foram realizados estudos de ligação em um domínio extracelular SARS-CoV-2 RBD humano expresso com um marcador myc-myc- hexahistidina C-terminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH), domínio extracelular SARS-CoV-2 RBD expresso com um domínio extracelular SARS-CoV-2 RBD ou IgG2a de camundongo (SARS-CoV-2 RBD-mFc) C-terminal expresso com uma IgG1 humana C-terminal (SARS-CoV-2 RBD-hFc). Concentrações únicas de SARS-CoV-2 RBD-MMH, (100 nM); SARS-CoV- 2 RBD-mFc (50 nM) ou SARS-CoV-2 RBD-hFc (50 nM), preparado em tampão de corrida HBS-ET, foram injetados por 1,5 minutos a uma taxa de fluxo de 30 μL/min enquanto a dissociação de diferentes reagentes SARS- CoV-2 RBD ligados a anticorpos foram monitorados por 2 minutos em tampão de corrida HBS-ET. No final de cada ciclo, a superfície de captura de anticorpo SARS-CoV-2 RBD foi regenerada usando uma injeção de 10 segundos de ácido fosfórico a 20 mM para a superfície de anticorpo monoclonal específico para Fc anti-humano de camundongo ou uma injeção de 40 segundos de glicina, HCl 10 mM, pH 1,5 ao anticorpo policlonal específico para FCY de coelho anticamundongo. A velocidade de associação (ka) e velocidade de dissociação (kd) foram determinados através do ajuste de sensogramas de tempo real de ligação a um modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa utilizando software BIAevaluation v3.1 ou Biacore Insight Evaluation v2.0 ou software de ajuste de curvas. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e meias-vidas dissociativas (t^) foram calculadas a partir das constantes de taxa de cinética como:
[00198] Os parâmetros de cinética de ligação para diferentes anticorpos monoclonais de SARS-CoV-2 que se ligam a diferentes reagentes anti-SARS-CoV-2 RBD da invenção a 25 °C são mostrados nas Tabelas 11 e 12. TABELA 11: CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGAÇÃO DE SARS-COV-2 RBD-MMH A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2 A 25 °C
TABELA 12: CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGAÇÃO DE SARS-COV-2 RBD-MFC OU SARS-COV-2 RBD-HFC A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-COV-2-S A 25 °C
*: Valor estimado com base no limite de medição da constante de taxa dissociativa e da meia-vida dissociativa nas condições experimentais.
[00199] Um ensaio de bloqueio baseado em ELISA foi desenvolvido para determinar a capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV2-S para bloquear a ligação do domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína da espícula de SARS-CoV-2 à enzima 2 de conversão de angiotensina humana (hACE2).
[00200] A proteína SARS-CoV-2 usada nos experimentos foi composta pela porção do domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína da espícula de SARS-CoV-2 (aminoácidos Arg319 a Phe541) expressa com a porção Fc da IgG1 humana no c-terminus (SARS-CoV-2 RBD-hFc; ver número de acesso NCBI MN908947.3). A proteína ACE2 humana usada nos experimentos foi comprada de R&D systems e é composta pelos aminoácidos glutamina 18 à serina 740 com um marcador c-terminal 10XHistidina (hACE2-His; número de acesso NCBI Q9BYF1).
[00201] Os experimentos foram realizados usando o procedimento a seguir. Um anticorpo monoclonal anti-Penta-His (Qiagen) foi revestido a 1 μg/mL em PBS em uma placa de microtitulação de 96 poços durante a noite a 4 °C. O receptor hACE2-His foi adicionado a 0,2 μg/mL em PBS e ligado durante 2 horas à temperatura ambiente. Os sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados com o uso de uma solução a 0,5% (p/v) de BSA em PBS. Em outras placas de microtitulação, uma quantidade constante de 10 pM ou 15 pM (como indicado na Tabela 13) da proteína SARS-CoV-2 RBD-hFc foi ligada com anticorpos diluídos 1:10 ou 1:20 em PBS + BSA a 0,5%. Estes complexos anticorpo-proteína, após uma incubação de uma hora, foram transferidos para a placa de microtitulação revestida com hACE2-His. Após 1,5 hora de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados e a proteína SARS-CoV-2 RBD-hFc ligada à placa foi detectada com anticorpo IgG de cabra anti- humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson). As placas foram então desenvolvidas usando a solução de substrato TMB (BD Biosciences, número de catálogo 555214) de acordo com a recomendação do fabricante e a absorbância a 450 nm foi medida em um leitor de placas Victor X5.
[00202] A análise dos dados foi realizada calculando a % de redução do sinal da concentração fixa de SARS-CoV-2-S RBD-hFc na presença do anticorpo vs na ausência do anticorpo. No cálculo, o sinal de ligação da amostra do SARS-CoV-2-S RBD-hFc constante sem a presença do anticorpo para cada placa foi referido como 100% de ligação ou 0% de bloqueio; e o sinal de linha de base da amostra de mídia apenas sem a presença de SARS-CoV-2 RBD-hFc foi referido como 0% de ligação ou 100% de bloqueio.
[00203] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S para bloquear a ligação de SARS-CoV-2-S RBD à ACE2 humana foi avaliada utilizando um formato ELISA de bloqueio. O bloqueio do sobrenadante do anticorpo de teste de ponto único da ligação de 10 pM ou 15 pM de SARS-CoV-2-S RBD-hFc ao hACE2-His, que foi apresentado no anticorpo anti-His revestido em placas de microtitulação de 96 poços, foi detectado com um anticorpo anti-hFc conjugado a HRP.
[00204] Os resultados do bloqueio de três ensaios estão resumidos na Tabela 13. O sinal de ligação SARS-CoV-2-S (450 nm) e a % de bloqueio calculado G são indicados. Uma faixa de bloqueio é observada para as amostras de teste. Para amostras em que um NA é indicado nas colunas 6 e 7, um valor corrigido por placa é incluído nas colunas 4 e 5, pois os dados eram consistentes com uma única troca de placa ocorrendo para essas amostras. 43 de 46 sobrenadantes de anticorpos bloquearam mais de 50% da ligação de SARS-CoV-2-S RBD-hFc ao ACE2 humano revestido em placa, com 16 deles bloqueando > 90% do sinal. TABELA 13: RESULTADOS DE ELISA DE BLOQUEIO
[00205] A espectrometria de massa de troca hidrogênio-deutério (HDX-MS) foi realizada para determinar os resíduos de aminoácidos do domínio de ligação de receptor (RBD (aminoácidos R319-F541)) de proteína da espícula de SARS-CoV-2 que interagem com mAb10989, mAb10987, mAb10934, mAb10933, mAb10920, mAb10922, mAb10936, mAb10954, mAb10964, mAb10977, mAb10984 e mAb10986. Uma descrição geral do método de troca de H/D é apresentada em Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252 a 259; e Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A a 265A.
[00206] Os experimentos HDX-MS foram realizados em uma plataforma HDX-MS integrada, consistindo em um sistema Leaptec HDX PAL para marcação e resfriamento de deutério, uma Waters Acquity I-Class (Binary Solvent Manager) para digestão e carregamento de amostras, uma Waters Acquity I-Class (Binary Solvent Manager) para o gradiente analítico e um espectrômetro de massa Thermo Q Exactive HF para medição de massa de peptídeos.
[00207] A solução de marcação foi preparada como tampão de PBS em D2O a pD 7,0 (tampão de 10 mM de fosfato, 140 mM de NaCl, e 3 mM de KCl, equivalente a pH 7,4 a 25 °C). Para a marcação de deutério, 10 μL de proteína RBD ou proteína RBD pré-misturada com cada um dos 12 anticorpos acima listados foram incubados a 20 °C com 90 μL de solução de marcação D2O para vários pontos de tempo, em duplicado. Para mAb10989, mAb10987, mAb10934 e mAb10933, os pontos de tempo foram de 0 min (controle não deuterado), 5 min e 10 min. Para mAb10920, mAb10922, mAb10936, mAb10954, mAb10964, mAb10977, mAb10984 e mAb10986, os pontos de tempo foram de 0 min (controle não deuterado) e 10 min. A reação de deuteração foi extinta pela adição de 90 mL de tampão de resfriamento pré-resfriado (0,5 M TCEP-HCl, 4 M de ureia e 0,5% de ácido fórmico) a cada amostra para uma incubação de 90 segundos a 20 °C. As amostras extintas foram então injetadas no sistema Leaptec HDX PAL para digestão em linha com pepsina/protease XIII. Os peptídeos digeridos foram capturados por uma coluna C18 (2,1 mm x 5 mm, Waters) e separados por outra coluna C18 (2,1 mm x 50 mm, Waters) a -5 °C com um gradiente de 20 minutos (para mAb10989, mAb10987, mAb10934 e mAb10933) ou um gradiente de 10 minutos (para mAb10920, mAb10922, mAb10936, mAb10954, mAb10956, mAb10964, mAb10977 e mAb10984) de 0% a 90% da solução da fase móvel B (solução da fase móvel A: 0,5% de ácido fórmico e 4,5% de acetonitrila em água, solução móvel da fase B: 0,5% de ácido fórmico em acetonitrila). Os peptídeos eluídos foram analisados por uma espectrometria de massa de Thermo Q Exactive HF no modo LC-MS/MS ou LC-MS.
[00208] Os dados de LC-MS/MS da amostra de proteína RBD não deuterada foram pesquisados em um banco de dados incluindo sequências de aminoácidos da proteína RBD, pepsina, protease XIII e suas sequências reversas usando o mecanismo de pesquisa Byonic (Protein Metrics). Os parâmetros de pesquisa foram definidos como padrão usando digestão enzimática inespecífica e glicosilação humana como modificação comum de variável. A lista de peptídeos identificados foi importada para o software HDExaminer (versão 3.1) para calcular a captação de deutério (captação de D) e as diferenças na porcentagem de captação de deutério (Δ%D) para todas as amostras deuteradas. A diferença na porcentagem de absorção de deutério (Δ%D) foi calculada da seguinte forma. Diferença na captação de deutério (ΔD) = Captação de D (RBD-mAb) - captação de D (apenas RBD)
[00209] Um total de 190 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10989, representando 86,06% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 467 a 513 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 835) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10989.
[00210] Um total de 187 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10987, representando 86,06% de cobertura de sequência de RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, - 10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes a aminoácidos 432 a 452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10987.
[00211] Um total de 188 peptídeos do RBD foram identificados tanto no RBD sozinho quanto no RBD em complexo com amostras de mAb10934, representando 86,06% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, - 10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 432 a 452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836), 467 a 474 (DISTEIYQ) (SEQ ID NO: 837) e 480 a 513 (CNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 838): do RBD foram significativamente protegidos por mAb10934.
[00212] Um total de 188 peptídeos do RBD foi identificado tanto no RBD sozinho quanto no RBD em complexo com amostras de mAb10933, representando 86,06% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 467 a 510 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV) (SEQ ID NO: 839) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10933.
[00213] Um total de 75 peptídeos do RBD foram identificados a partir do RBD isolado e do RBD em complexo com amostras de mAb10920, representando 83,27% de cobertura da sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 471 a 486 (EIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 840) e 491 a 515 (PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 841) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10920.
[00214] Um total de 86 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10922, representando 87,25% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 432 a 452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10922.
[00215] Um total de 81 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10936, representando 82,07% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 351 a 360 (YAWNRKRISN) (SEQ ID NO: 842), 432 a 452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836), 467 a 486 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 843) e 491 a 513 (PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 844) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10936.
[00216] Um total de 84 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10954, representando 87,25% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 400 a 422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), 453 a 486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) e 490a 515 (FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 847) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10954.
[00217] Um total de 109 peptídeos do RBD foram identificados tanto no RBD sozinho quanto no RBD em complexo com amostras de mAb10964, representando 83,67% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 401 a 424 (VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYK) (SEQ ID NO: 848) e 471 a 513 (EIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 849) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10964.
[00218] Um total de 78 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10977, representando 87,25% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 351 a 364 (YAWNRKRISNCVAD) (SEQ ID NO: 850) e 471 a 486 (EIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 840) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10977.
[00219] Um total de 88 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10984, representando 87,25% de cobertura de sequência de RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Os peptídeos correspondentes aos aminoácidos 400 a 422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845) e 453 a 486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10984.
[00220] Um total de 84 peptídeos do RBD foram identificados a partir de RBD sozinho e RBD em complexo com amostras de mAb10986, representando 87,25% de cobertura de sequência do RBD. Qualquer peptídeo que exibisse uma redução na captação de deutério de 5% ou mais (ou seja, um valor de Δ%D inferior a -5%, como -6%, -10% e assim por diante) na ligação do mAb foi definido como significativamente protegido. Peptídeos correspondentes aos aminoácidos 400 a 422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), 453 a 486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) e 490 a 515 (FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 847) do RBD foram significativamente protegidos por mAb10986.
[00221] Em suma, a maioria dos anticorpos neutralizantes testados contata o RBD de uma maneira que se sobrepõe aos resíduos RBD que compõem a interface ACE2; além disso, os anticorpos podem ser agrupados com base em seu padrão de contato com a superfície do RBD, conforme mostrado na Figura 15. Os dados acima também estão resumidos nas Tabelas 14 a 25. TABELA 14: PEPTÍDEOS DE DOMÍNIO DE LIGAÇÃO DE RECEPTOR (RBD) DE PROTEÍNA DA ESPÍCULA COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO RBD-MAB EM COMPARAÇÃO COM O RBD ISOLADO TABELA 15: PEPTÍDEOS DA PROTEÍNA DA ESPÍCULA RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10987 EM COMPARAÇÃO A RBD ISOLADO TABELA 16: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10934 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO
TABELA 17: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10933 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO
TABELA 18: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIG NIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10920 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO TABELA 19: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10922 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO TABELA 20: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10936 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO
TABELA 21: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10954 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO TABELA 22: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10964 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO TABELA 23: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10977 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO TABELA 24: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10984 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO TABELA 25: PEPTÍDEOS RBD COM PROTEÇÃO SIGNIFICATIVA APÓS A FORMAÇÃO DO COMPLEXO RBD-MAB10986 EM COMPARAÇÃO COM RBD SOZINHO
[00222] Para testar se os anticorpos anti-espícula de SARS-CoV-2 podem neutralizar as variantes SARS-CoV-2, esses anticorpos foram rastreados contra um painel de vírus pseudotipos VSV que expressam proteínas da espícula de tipo selvagem e variante. Os vírus do pseudotipo VSV foram gerados por transfecção transitória de células 293T com um plasmídeo contento o código da proteína da espícula de SARS-CoV-2 ou o mesmo plasmídeo contendo variações de nucleotídeo que codificam variantes conhecidas da sequência de aminoácidos da proteína da espícula de SARS-CoV-2. Todos os plasmídeos foram confirmados por sequenciamento de Sanger. As células foram semeadas em placas de 15 cm a 1,2x107 células por placa em DMEM Complete Media (1.000 mL de DMEM, Gibco; 100 mL de FBS, Gibco; 10 mL de PSG, Gibco) um dia antes da transfecção com 15 μg/placa de DNA de espícula usando 125 μL de lipofectamina LTX, 30 μL de reagente PLUS e até 3 mL de Opti-Mem. 24 horas após a transfecção, as células foram lavadas com 10 mL de PBS, depois infectadas com um MOI de 0,1 de vírus VSVΔG:mNeon em 10 mL de Opti- Mem. O vírus foi incubado nas células por 1 hora, com agitação suave a cada 10 minutos. As células foram lavadas 3 vezes com 10 mL de PBS e depois cobertas com 20 mL de meio de infecção (1.000 mL de DMEM, Gibco; 10 mL de piruvato de sódio, Gibco; 7 mL de BSA, Sigma; 5 mL de gentamicina, Gibco) antes da incubação a 37 °C, 5% de CO2 por 24 horas. O sobrenadante do pseudovírus foi coletado em tubos de centrífuga de 250 mL em gelo, depois centrifugado a 3.000 rpm por 5 minutos para granular quaisquer detritos celulares, aliquotados em gelo, e depois congelados a -80 °C. A infecciosidade foi testada em células Vero antes do uso em ensaios de neutralização. Este material será referido como pseudovírus VSVΔG:mNeon/espicula ou vsvΔG:mNeon/ espícula_ (mutação de aminoácido variante) (por exemplo, VSVΔG:mNeon/ espícula_H49Y).
[00223] No dia 1, as células Vero foram semeadas até 80% de confluência em frascos T225, as células foram lavadas com PBS (Gibco: 20012-043), o TrypLE foi adicionado para destacar as células do frasco e o DMEM completo foi adicionado para inativar a tripsina. Plaquearam-se 20.000 células Vero em 100 μL de DMEM completo pré-aquecido por poço em microplaca de 96 poços de poliestireno preto (Corning: 3904). No dia 2, o pseudovírus VSVΔG:mNeon/ espícula foi descongelado em gelo e diluído com meio de infecção. Os anticorpos foram diluídos em uma placa de 96 poços de fundo em U, gerando uma diluição de cada anticorpo em 210 μL de meio de infecção na concentração de ensaio 2X. 120 μL de anticorpos diluídos foram transferidos para uma placa de fundo em U fresca e meio e um anticorpo de controle IgG1 foram adicionados a cada placa. 120 μL de pseudovírus diluído foi adicionado a todos os poços, exceto os poços de controle de meio. Para esses poços, 120 μL de meios de infecção foi adicionado. Pseudovírus com anticorpos foram incubados por 30 minutos em temperatura ambiente, então o meio foi removido das células Vero. 100 μL de mistura anticorpo/pseudovírus foram adicionados às células, e, em seguida, incubados a 37°C, 5% de CO2 durante 24 horas. No dia 3, o sobrenadante foi removido dos poços celulares e substituído por 100 μL de PBS. As placas foram lidas em um SpectraMax i3 com citômetro de imagem MiniMax.
[00224] Além de testar a capacidade de neutralização com o vírus VSV-SARS-CoV-2-S não replicante, os anticorpos também foram testados com o vírus SARS-CoV-2. Anticorpos monoclonais e combinações de anticorpos foram diluídos em série em DMEM (Quality Biological), suplementado com soro fetal bovino inativado por calor (Sigma) a 10% (v/v), penicilina/estreptomicina a 1% (v/v) (penicilina/estreptomicina) (Gemini Bio-products) e 1% (v/v) de L- glutamina (concentração final de 2 mM, Gibco) (meio VeroE6) até um volume final de 250 μL. Em seguida, 250 mL de meio VeroE6 contendo SARS-CoV-2 (WA-1) (1.000 PFU/mL) foram adicionados a cada diluição de soro e 250 mL de meio como controle não tratado. As misturas vírus- anticorpo foram incubadas por 60 min a 37°C. Após a incubação, os títulos de vírus das misturas foram determinados por ensaio em placa. Finalmente, os valores de 50% do título de neutralização de redução de placa (PRNT50) (as diluições séricas nas quais a formação de placa foi reduzida em 50% em relação à do controle não tratado) foram calculados usando uma curva logística de 4 parâmetros, ajustada aos dados percentuais de neutralização (GraphPad Software, La Jolla, CA).
[00225] A metade da concentração inibitória máxima (IC50) de anticorpo monoclonal individual contra pseudovírus que expressa a proteína (S) de espícula de VSV-SARS-CoV-2 que codifica a sequência Wuhan-Hu-1 (Número de acesso NCBIMN908947.3) da proteína da espícula (S-wt) foi determinada em células Vero (Tabela 26). A maioria dos anticorpos apresentou potência de neutralização na faixa picomolar (pM), com alguns exibindo potência de neutralização na faixa nanomolar (nM).
[00226] Embora o ACE2 recombinante tenha sido capaz de mediar a neutralização das pseudopartículas de espícula de VSV, conforme relatado anteriormente, sua potência era muito inferior à dos anticorpos monoclonais, com uma diminuição de mais de 1.000 vezes a potência observada em relação aos melhores mAbs neutralizantes (Figura 10A) Além disso, a potente atividade neutralizante de mAb10987, mAb10989, mAb10933 e mAb10934 foi confirmada em ensaios de neutralização, incluindo a neutralização de SARS-CoV-2 em células VeroE6 (Figura 10B). Todos os ensaios de neutralização geraram potência semelhante nos quatro mAbs (mAb10987, mAb10989, mAb10933 e mAb10934) e nenhuma combinação demonstrou atividade de neutralização sinérgica (Figura 10B). TABELA 26: POTÊNCIA DE NEUTRALIZAÇÃO DO MAB (IC50 (M)) CONTRA A CEPA DO TIPO SELVAGEM DAS PSEUDOPARTÍCULAS DE VSV-SARS-COV-2-S EM CÉLULAS VERO
[00227] As variantes de aminoácidos na proteína da espícula (S) foram identificadas em mais de 7.000 sequências SARS-CoV-2 disponíveis ao público, representando isolados em circulação global, e clonadas em pseudopartículas de VSV. Foram realizados ensaios de neutralização com pseudopartículas que codificam variantes, para avaliar o impacto de cada variante na potência de neutralização dos anticorpos monoclonais. A Tabela 27 ilustra a potência relativa de neutralização de anticorpos monoclonais contra pseudopartículas que codificam variantes em relação a espícula de SARS-CoV-2 (S-wt) a uma concentração única de 5 μg/mL. A percentagem de neutralização em relação a S-wt foi capturada para cada anticorpo e variante individual. Nenhum dos anticorpos demonstrou perda de potência de neutralização na concentração de 5 μg/mL, com exceção do mAb10985 e da variante R408I. Esses dados demonstram ampla cobertura de neutralização funcional de anticorpos monoclonais contra variantes de espícula de SARS-CoV-2 em circulação global.
[00228] Para interrogar ainda mais o impacto das variantes da proteína S na potência de neutralização dos anticorpos monoclonais, foram executadas curvas de neutralização completas para determinar o valor de IC50 dos anticorpos neutralizantes mais potentes contra um subconjunto de variantes localizadas no domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína S. A Tabela 28 mostra os valores de neutralização de IC50 para cada pseudopartícula variante. Pode ser observada variabilidade intrínseca de até 3 vezes entre os ensaios de neutralização de pseudopartículas e a mesma não indica uma alteração na potência de neutralização. Estes dados demonstram que os anticorpos mantiveram sua potência de neutralização contra um painel diverso de variantes de proteína S RBD. TABELA 27 NEUTRALIZAÇÃO RELATIVA DE VARIANTES DE VSV- SARS-COV-2 QUE CODIFICAM PROTEÍNA S NA CONCENTRAÇÃO DE 5 MG/ML DE ANTICORPO EM CÉLULAS VERO
TABELA 27 (CON TINUAÇÃO)
TABELA 28. IC50 (M) DE N EUTRALIZAÇÃO DAS VARIANTES DE VSV-SARS-CoV-2-S RBD EM CÉLULAS VERO TABELA 28 (CONTINUAÇÃO)
[00229] Constante de equilíbrio de dissociação (KD) para diferentes reagentes SARS-CoV-2 RBD que se ligam a anticorpos monoclonais (mAbs) CHOt anti-SARS-CoV-2 purificados foram determinadas usando um biossensor Biacore T200/Biacore 8K à base de ressonância de plasmon de superfície de tempo real. Todos os estudos de ligação foram realizados em HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e tensoativo Tween-20 a 0,05% v/v, pH 7,4 (HBS-ET) em tampão de corrida a 25 °C e 37 °C. A superfície do chip do sensor Biacore CM5 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com mAb específico para Fc anti-humano de camundongo (Regeneron, mAb2567) para capturar anti-SARS-CoV- 2bmAbs. Estudos de ligação foram realizados no domínio extracelular humano SARS-CoV-2 RBD expresso com um domínio C-terminal myc- myc-hexahistidina (SARS-CoV-2 RBD-MMH) e domínio extracelular SARS-CoV-2 RBD expresso com um IgG2a C-terminal de camundongo (SARS-CoV-2 RBD-mFc). A utilização destes reagentes permitiu testar a capacidade dos anticorpos de se ligarem a peptídeos RBD monoméricos e diméricos, respectivamente.
[00230] Diferentes concentrações de hSARS-CoV-2 RBD-MMH (90 nM - 3,33 nM, diluição de 3 vezes) e SARS-CoV-2 RBD-mFc (diluição de 3 vezes 30 nM a 1,11 nM) preparadas em tampão de corrida HBS-ET, foram injetados por 3 minutos a uma taxa de fluxo de 50 μL/min enquanto a dissociação de mAb ligou diferentes reagentes SARS-CoV-2 RBD foi monitorada por 6 a 10 minutos em tampão de corrida HBS-ET. No final de cada ciclo, a superfície de captura de mAb SARS-CoV-2 RBD foi regenerada usando injeção de 12 s de ácido fosfórico 20 mM para a superfície de mAb específico para Fc anti-humano de camundongo. A velocidade de associação (ka) e velocidade de dissociação (kd) foram determinados através do ajuste de sensogramas de tempo real de ligação a um modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa utilizando software BIAevaluation v3.1 ou Biacore Insight Evaluation v2.0 ou software de ajuste de curvas. As constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e meias vidas dissociativas (t^) foram calculadas a partir das constantes de taxa de cinética como:
[00231] Parâmetros de cinética de ligação para diferentes mAbs de SARS-CoV-2 que se ligam a diferentes reagentes anti-SARS-CoV-2 RBD da invenção a 25 °C e 37 °C são mostrados nas Tabelas 29 a 32, respectivamente. TABELA 29: PARÂMETROS DE CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGAÇÃO DE SARS-CoV-2 RBD-MMH A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI- SARS-CoV-2-S A 25 °C. TABELA 30: PARÂMETROS DE CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGAÇÃO DE SARS-CoV-2 RBD-MMH A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI- SARS-CoV-2-S A 37 °C. TABELA 31: PARÂMETROS DE CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGAÇÃO DE SARS-CoV-2 RBD-mFc A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI- SARS-CoV-2-S A 25 °C. TABELA 32: PARÂMETROS DE CINÉTICA DE LIGAÇÃO DA LIGAÇÃO DE SARS-CoV-2 RBD-mFc A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI- SARS-CoV-2-S A 37 °C
[00232] Um ensaio de bloqueio baseado em ELISA foi usado para determinar a capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2 para bloquear a ligação do domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína da espícula de SARS-CoV-2 ao seu receptor, enzima de conversão de angiotensina humana 2 (hACE2).
[00233] A proteína SARS-CoV-2 utilizada neste ensaio foi composta pela porção do domínio de ligação de receptor (RBD) da proteína da espícula de SARS-CoV-2 (aminoácidos Arg319-Phe541) expressa com a porção Fc da IgG1 humana c-terminal (SARS-CoV-2 RBD-hFc). A proteína ACE2 humana usada nos experimentos foi adquirida da R&D Systems e era composta pelos aminoácidos Gln18-Ser740 com um marcador 10X- Histidina C-terminal (hACE2-His; Número de Acesso NCBI Q9BYF1).
[00234] Os experimentos foram realizados usando o procedimento a seguir. Um anticorpo monoclonal anti-Penta-His (Qiagen) foi revestido a 1 μg/mL em PBS em uma placa de microtitulação de 96 poços durante a noite a 4 °C. O receptor hACE2-His foi adicionado a 0,2 μg/mL em PBS e ligado durante duas horas à temperatura ambiente (RT). Os sítios de ligação não específicos foram subsequentemente bloqueados com o uso de uma solução a 0,5% (p/v) de BSA em PBS. Em outras placas de microtitulação, uma quantidade constante de 100 pM de proteína SARS- CoV-2 RBD-hFc foi ligada a anticorpos anti-SARS-CoV-2 e um controle de anticorpo isotipo IgG1 em diluições de 0,0008 nM a 50 nM em PBS + 0,5% de BSA. Após uma hora de incubação, as soluções da mistura foram transferidas para o hACE2-His revestido com placa de microtitulação. Após 1,5 horas de incubação à temperatura ambiente, os poços foram lavados e o SARS-COV2 ligado à placa foi detectado com anticorpo IgG de cabra anti-humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson). As placas foram então desenvolvidas usando solução de substrato TMB (BD Biosciences, número 555214) de acordo com a recomendação do fabricante e a absorbância a 450 nm foi medida em um leitor de placas Victor X5.
[00235] Os dados de ligação foram analisados usando um modelo sigmoidal de dose-resposta no software Prism™ (GraphPad). O valor calculado de IC50, definido como a concentração de anticorpo necessária para bloquear 50% da ligação de SARS-CoV-2 RBD-hFc ao hACE2-His revestido à placa, foi usado como um indicador de potência de bloqueio. O percentual de bloqueio foi definido com base no sinal de ligação corrigido de fundo observado na maior concentração de anticorpos testada usando esta fórmula e relatado para todos os anticorpos testados:
[00236] Os anticorpos que bloquearam a ligação menor ou igual a 50% na concentração mais alta testada foram classificados como não bloqueadores e os valores de IC50 não foram relatados para esses anticorpos.
[00237] A capacidade dos anticorpos anti-SARS-CoV-2 para bloquear a ligação do SARS-CoV-2 RBD à ACE2 humana foi avaliada usando um ELISA de bloqueio. Neste ensaio, 100 pM de SARS-CoV-2 RBD-hFc foi titulado com uma ampla faixa de concentrações do anticorpo anti-SARS-CoV-2-S e a inibição da presença do anticorpo na ligação de RBD à hACE2-His foram avaliados. O RBD-hFc ligado à placa foi detectado com um anticorpo anti-hFc conjugado com HRP.
[00238] Os IC50s de bloqueio e o bloqueio máximo nas concentrações mais altas testadas dos anticorpos anti-SARS-CoV-2-S estão resumidos na Tabela 33 e as curvas de bloqueio mostradas nas Figuras 1 a 8. Dos 46 anticorpos testados, 44 exibiram bloqueio dependente da concentração de anticorpos da ligação de RBD.hFc a hACE-2. Os valores de IC50 variaram de 41 pM a 4,5 nM e o bloqueio máximo variando de 55% a cerca de 100% na maior concentração de anticorpos testada. Dois dos 46 anticorpos testados não mostraram atividades de bloqueio nas condições do ensaio. O anticorpo irrelevante de controle de isótipo não mostrou atividade bloqueadora, como esperado. TABELA 33: POTÊNCIA DE BLOQUEIO DE ANTICORPOS ANTI-SAR- CoV-2 NA LIGAÇÃO DE ESPÍCULA RBD-hFc À ACE-2 HUMANA IMOBILIZADA
[00239] mAb10987, mAb10989, mAb10933 e mAb10934 foram examinados em ensaios de ligação de competição cruzada (Figura 11), identificando vários pares de mAbs não concorrentes com potência de neutralização picomolar que potencialmente poderiam ser combinados para formar coquetéis de anticorpos, por exemplo, mAb10987 e mAb0933.
[00240] O binning epitópico dos mAbs anti-SARS-CoV-2-S foi conduzido em um formato sanduíche pré-mistura envolvendo mAbs concorrentes uns contra os outros de maneira combinatória aos pares para ligação à proteína SARS-CoV-2 RBD-MMH usando um Instrumento de interferometria de biocamada ForteBio Octet HTX (Molecular Devices ForteBio LLC, Fremont, CA) com tampão de corrida de HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 a 0,05% (v/v), pH 7,4, BSA a 1 mg/mL. Os ensaios foram realizados a 30 °C com agitação contínua a 1.000 rpm. Após a obtenção de uma linha de base inicial no tampão de corrida, 20 μg/mL de mAbs anti-COVID19 foram capturados nas pontas do biossensor anti-Fc (AHC) humano por 300 s. Para bloquear os locais de ligação não saturados livres restantes nas pontas do biossensor AHC, todos os sensores foram expostos por 240 s ao poço de solução de bloqueio contendo 100 μg/mL de IgG1 irrelevante. Após este processo, os biossensores foram imersos em poços contendo solução pré-mistura de 100 nM de proteína SARS CoV-2 RBD-MMH e 600 nM de sítio de ligação a mAb anti-COVID19 de um segundo mAbs por 300 s. A resposta de ligação em cada etapa foi registrada e o sinal específico foi normalizado subtraindo o controle competitivo do mAb autobloqueador do conjunto de dados. A análise dos dados foi realizada com o software Octet Data Analysis HT 10.0, utilizando o Epitope Binning.
[00241] A comparação dos ensaios de ligação de competição cruzada com os resultados de HDX-MS descritos acima fornece informações estruturais sobre o mecanismo pelo qual pares de anticorpos não concorrentes podem se ligar simultaneamente ao RBD e, portanto, podem ser parceiros ideais para um coquetel de anticorpos terapêuticos. O mAb10987 e o mAb10933 representam esse par de anticorpos. O mAb10933 tem como alvo a região de alça tipo espícula em uma extremidade da interface ACE2. Dentro dessa região, os resíduos que mostram a proteção HDX mais significativa pelo mAb10933 estão voltados para cima, sugerindo que a região Fab do mAb10933 se liga ao RBD a partir da direção superior, onde o mAb10933 terá colisões significativas com o ACE2. Para evitar a competição com o mAb10933, o mAb10987 se liga apenas às regiões protegidas definidas por HDX do lado frontal ou inferior esquerdo (na vista frontal do mAb10987 na Figura 12). Isso é consistente com os dados de neutralização descritos acima, pois o mAb10987 o orientaria em uma posição com alta probabilidade de interferir com a ACE2.
[00242] Para entender melhor a ligação de mAb10933 e mAb10987 à proteína da espícula RBD, a análise estrutural foi realizada por criomicroscopia eletrônica (crio-ME). Os fragmentos Fab de mAb10933 e mAb10987 foram isolados usando o kit FabALACTICA (Genovis). 600 μg do mAbl 0933 Fab e 600 μg do mAb10987 Fab foram misturados com 300 μg de SARS-CoV-2-S RBD e incubados em gelo por ~ 1 hora e depois injetados em uma coluna de filtração em gel de aumento Superdex 200 equilibrada para 50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM. As frações de pico que contêm o complexo mAb10933 Fab - mAb10987 Fab - RBD foram coletadas e concentradas usando um filtro centrífugo de 10 kDa MWCO. Para a preparação da grade cryoEM, a amostra de proteína foi diluída para 1,5 mg/mL e foi adicionado 0,15% de anfipol de PMAL-C8. Foram depositados 3,5 μL de proteína em uma grelha UltrAufoil limpa com plasma recente (1,2/1,3, malha 300). A solução em excesso foi removida por blot com papel de filtro e mergulhada em etano líquido usando uma Vitrobot Mark IV. A grade de crio-ME foi transferida para um Titan Krios (Thermo Fisher) equipado com um detector K3 (Gatan). Os filmes foram coletados usando EPU (Thermo Fisher) com ampliação de 105.000x, correspondendo a um tamanho de pixel de 0,85 Â. Foi utilizada uma taxa de dose de 15 elétrons por pixel por segundo e cada filme foi de 2 segundos, correspondendo a uma dose total de ~ 40 elétrons por Â2.
[00243] Todo o processamento dos dados de crio-ME foi realizado usando o cryoSPARC v2.14.2. 2.821 filmes foram alinhados usando correção de movimento de patch e estimativa de patch CTF. 2.197 micrografias alinhadas foram selecionadas para processamento adicional com base nos valores estimados de desfocagem e nas resoluções de ajuste do CTF. Um conjunto inicial de partículas colhidas usando o seletor de blob foi submetido à classificação 2D para gerar modelos para a seleção de modelos. 989.553 partículas colhidas por coleta de modelos foram submetidas a várias rodadas de classificação 2D para remover fabs não ligadas e partículas contendo um complexo incompleto. A reconstrução ab initio com três classes gerou uma única classe contendo 61.707 partículas que correspondiam ao complexo mAb10933 Fab - mAb10987 Fab - RBD. O refinamento heterogêneo das partículas desta classe, seguido de um refinamento não uniforme, resultou em um mapa de resolução de 3,9 Â (FSC = 0,143) contendo 48.140 partículas que foram usadas para a construção do modelo. Neste mapa, modelos de RBD (retirados do código PDB 6M17) e os dois Fabs (retirados de estruturas de anticorpos anteriores, exceto a cadeia leve lambda de mAb10987 que veio do PDB código 5U15), foram colocados manualmente. Esses modelos foram reconstruídos manualmente usando Coot e o espaço real refinado no mapa usando Phenix.
[00244] Confirmando os dados acima descritos, a crio-ME de partícula única do complexo de espícula de SARS-CoV-2 RBD ligado a fragmentos Fab de mAb10933 e mAb10987 mostra que os dois anticorpos neste coquetel podem se ligar simultaneamente a regiões distintas do RBD (Figura 13A, Figura 13B e Figura 14). Um mapa reconstruído em 3D do complexo com resolução nominal de 3,9Â mostra que os dois fragmentos Fab se ligam em diferentes epítopos no RBD, confirmando que são anticorpos não concorrentes. O mAb10933 se liga na parte superior do RBD, sobrepondo extensivamente o sítio de ligação da ACE2. Por outro lado, o epítopo do mAb10987 está localizado no lado do RBD, bem longe do epítopo do mAb10933, e tem pouca ou nenhuma sobreposição com o local de ligação ao ACE2.
[00245] A competição de ligação entre os anticorpos monoclonais (mAbs) anti-SARS-CoV-2-S foi determinada usando um ensaio de interferometria de camada biológica (BLI) sem marcador em tempo real na plataforma de biossensor Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Todo o experimento foi realizado a 25 °C em 10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA e 0,05% v/v de tensoativo Tween-20, 1 mg/mL de BSA, pH de 7,4 (HBS-EBT), com a placa agitando a uma velocidade de 1.000 rpm. Para avaliar se dois mAbs foram capazes de competir entre si pela ligação a seus respectivos epítopos no domínio extracelular SARS-CoV-2-S RBD expresso com um myc-myc-hexahistidina C- terminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH), ~ 0,51 nm de SARS-CoV-2-S RBD- MMH foram capturados pela primeira vez nas pontas de biossensores Octet revestidos com anticorpo anti-Penta-His (Fortebio Inc, número 18¬5122) submergindo as pontas de biossensores por 1 minuto em poços contendo uma solução de 10 μg/mL de SARS-CoV-2-S RBD-MMH. As pontas do biossensor capturado por SARS-CoV-2-S RBD-MMH foram então saturadas com um primeiro anticorpo monoclonal anti-SARS- CoV-2-S (posteriormente dito como mAb-1) mergulhando em poços contendo 50 μg/mL de solução mAb-1 por 5 minutos. As pontas do biossensor foram posteriormente mergulhadas em poços contendo 50 μg/mL de solução de um segundo anticorpo monoclonal anti-SARS- CoV-2 (subsequentemente dito como mAb-2) por 5 minutos. As pontas do biossensor foram lavadas em tampão HBS-ETB entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tempo real foi monitorada durante todo o curso do experimento e a resposta de ligação no final de cada etapa foi registrada. A resposta da ligação do mAb-2 ao SARS- CoV-2 RBD-MMH pré-complexado com o mAb-1 foi comparada e o comportamento competitivo/não competitivo de diferentes anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2 foi determinado como mostrado na Tabela 34. TABELA 34: COMPETIÇÃO CRUZADA ENTRE ANTICORPOS ANTI- SARS-CoV-2-S
[00246] As constantes da taxa de dissociação (kd) para diferentes anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S em tampões de pH 7,4, pH 6,0 e pH 5,0 foram determinadas usando um biossensor Biacore T200 baseado em ressonância de plasmon de superfície (SPR) em tempo real. Todos os estudos de ligação foram realizados a 37°C, usando três tampões de corrida, (i) PBS, 0,05% v/v de tensoativo Tween-20, pH7,4 (PBS-T-pH7,4) (ii) PBS, 0,05% v/v de tensoativo Tween-20, pH6,0 (PBS- T-pH6,0) e (iii) PBS, 0,05% v/v de tensoativo Tween-20, pH5,0 (PBS-T- pH5,0). A superfície do chip do sensor Biacore CM5 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com um mAb específico para Fc anti-humano de camundongo (Regeneron) para capturar anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S. Foram realizados estudos de ligação no domínio extracelular humano do SARS-CoV-2-S RBD expresso com uma myc-myc-hexahistidina C-terminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH), concentrações únicas de SARS-CoV-2-S RBD- MMH (90 nM) preparadas no tampão PBS-T-pH 7,4 foram injetadas a uma taxa de fluxo de 25 μL/min por 3 minutos, seguido pela dissociação do SARS-CoV-2- S RBD-MMH ligado em tampões de corrida PBS-T-pH 7,4, PBS-T-pH 6,0 ou PBS-T PBS-T-pH 5,0 por 5 minutos.
[00247] As constantes da taxa de dissociação (kd) em quatro tampões de pH foram determinadas ajustando os diagramas dos sensores de ligação em tempo real a um modelo de ligação 1:1 usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. A meia-vida dissociativa (t½) foi calculada a partir dos valores de kd como:
[00248] Os valores kd e t1/2 para ligação a SARS-CoV-2-S RBD-MMH para diferentes anticorpos monoclonais de anti-SARS-CoV-2-S em PBS-T-pH 7,4, seguida por dissociação em PBS-T-pH 7,4 e PBS -T-pH 6,0 a 37 °C, são mostrados na Tabela 35. Os valores kd e t1^ para ligação a SARS-CoV-2-S RBD-MMH para diferentes anticorpos monoclonais de anti-SARS-CoV-2-S em PBS-T-pH 7,4, seguida por dissociação em PBS-T-pH 7,4 e PBS -T-pH 5,0 a 37 °C, são mostrados na Tabela 36. A comparação da meia-vida dissociativa (t1^) de SARS- CoV-2 RBD-MMH em tampões de pH 7,4, pH 6,0 e pH 5,0. TABELA 35: LIGAÇÃO DE SARS-CoV-2-S RBD-MMH A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-CoV-2-S EM TAMPÃO PBS-T-pH 7,4 E DISSOCIAÇÃO EM TAMPÃO PBS-T-pH 7,4 E pH 6,0 A 37 °C.
TABELA 36: LIGAÇÃO DE SARS-CoV-2-S RBD-MMH A ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-SARS-CoV-2 EM TAMPÃO PBS-T-pH 7,4 E DISSOCIAÇÃO EM PBS-T-pH 7,4 E pH 5,0 A 37 °C.
[00249] Para investigar a capacidade de um painel de anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2 para se ligar à glicoproteína da espícula de SARS-CoV-2, foi desenvolvido um ensaio de ligação in vitro utilizando o vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipado com a proteína da espícula de SARS-CoV-2 em uma plataforma de detecção baseada em eletroquimioluminescência (MSD).
[00250] Partículas semelhantes a vírus (VLPs) do vírus da estomatite vesicular (VSV) pseudotipadas foram geradas a partir de células HEK293T para expressar transitoriamente a proteína da espícula de SARS-CoV-2 (número de acesso MN908947.3, aminoácidos 16 a 1.211). VLPs que expressam apenas VSV também foram geradas como um controle de ligação negativo.
[00251] Os experimentos foram realizados de acordo com o procedimento a seguir. As VLPs das duas fontes descritas acima foram diluídos em PBS, semeados nas placas de eletrodo de carbono de 96 poços (placa de alta ligação MULTI-ARRAY, MSD) e incubadas durante a noite a 4 °C para permitir que as VLPs aderissem. Os sítios de ligação não específicos foram bloqueados por BSA a 2% (p/v) em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Às partículas ligadas à placa, foram adicionados anticorpos anti-SARS-CoV-2 e um controle IgG1 humano não ligado, diluído em PBS + BSA a 0,5% em uma faixa de concentrações de 0,0008 nM a 50 nM e tampão sem anticorpo em duplicata e as placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com agitação. As placas, então, foram lavadas com 1X PBS para remover os anticorpos não ligados com o uso de um lavador de placa AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). Os anticorpos ligados à placa foram detectados com um anticorpo IgG anti- humano conjugado com SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) por 1 hora à temperatura ambiente. Após as lavagens, as placas foram desenvolvidas com o Tampão Read (MSD) de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante e os sinais luminescentes foram registrados com um instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Os sinais de ligação direta (em RLU) foram capturados para VLPs que expressam SARS-CoV-2 e VLP apenas de VSV.
[00252] A capacidade dos anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV- 2-S para se ligarem a VLPs que expressam SARS-CoV-2-S em comparação com a ligação a VLPs que expressam VSV irrelevantes foi avaliada usando um ensaio de ligação imunológica. A ligação às VLPs imobilizadas em placas High Bind de 96 poços (MSD) foi realizada com uma série de diluições de anticorpos e os anticorpos ligados foram detectados usando IgG anti-humana conjugada com SULFO-TAGTM. Os sinais de ligação da eletroquimiluminescência foram registrados em um Sector Imager 600 (MSD). Os valores de RLU foram determinados para a ligação do anticorpo às VLPs. Todos os anticorpos exibiram uma ligação dependente da concentração e as razões de ligação entre VSV apenas e VLPs que expressam SARS-CoV-2-S foram analisadas a 5,5 nM e 0,20 nM.
[00253] Os resultados de ligação de mAbs anti-SARS-CoV-2-S nas duas concentrações para VLPs de VSV/espícula e somente VSV estão resumidos na Tabela 37. Dos 46 anticorpos testados, 44 anticorpos se ligaram especificamente ao VSV/espícula com uma razão de VSV de 3 ou superior em qualquer concentração. No anticorpo a 0,2 nM, a razão entre VSV/espícula e VSV variou de 3 a 56, e a 5 nM, a razão variou de 3 a 303. Embora dois anticorpos (mAb10998 e mAb11002) exibissem fraca ligação às VLPs VSV/espícula, com razões inferiores a 3 às VLPs VSV, os sinais a 5 nM eram mais altos nas VSV/espícula do que nas VSV. Um anticorpo irrelevante do isotipo IgG1 mostrou uma ligação mínima, como esperado. TABELA 37: ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI- SARS-CoV-2-S A VLPS DE VSV QUE EXPRESSAM PROTEÍNAS DA ESPÍCULA, CONTRA VSV, POR ELETROQUIMILUMINESCÊNCIA
[00254] Para investigar a capacidade de um painel de anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2-S de se ligar a células que expressam SARS-CoV-2-S, um ensaio de ligação in vitro utilizando células que expressam SARS-CoV-2-S em uma plataforma de detecção baseada em eletroquimiluminescência (MSD) foi desenvolvida.
[00255] As células induzíveis Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3G foram geneticamente modificadas para expressar transitoriamente a proteína da espícula de SARS-CoV-2 (número de acesso MN908947.3, aminoácidos 16 a 1.211, Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-On 3G Inducible COVID-19 Spike Protein High Sorted) e citometria de fluxo classificou para seleção de alta expressão da proteína SARS-CoV-2. Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3G parentais também foram incluídos nos experimentos como um controle de ligação negativo.
[00256] Os experimentos foram realizados de acordo com o procedimento a seguir. As células das duas linhas descritas acima foram induzidas com 1 μg/mL de doxiciclina a 37 °C por 36 horas antes da colheita, centrifugadas, lavadas com PBS e depois diluídas em PBS, semeadas nas placas de eletrodos de carbono de 96 poços (MULTI¬ARRAY placa de alta ligação, MSD) e incubada durante a noite a 4 °C para permitir a adesão das células. Os sítios de ligação não específicos foram bloqueados por BSA a 2% (p/v) em PBS durante uma hora à temperatura ambiente. Às células ligadas à placa, foram adicionados anticorpos anti-SARS-CoV-2 e um controle IgG1 humano não ligado, diluído em PBS + BSA a 0,5% em uma faixa de concentrações de 0,0008 nM a 50 nM e tampão sem anticorpo em duplicata e as placas foram incubadas por uma hora em temperatura ambiente com agitação. As placas, então, foram lavadas com 1X PBS para remover os anticorpos não ligados com o uso de um lavador de placa AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA). Os anticorpos ligados à placa foram detectados com um anticorpo IgG anti-humano conjugado com SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) por uma hora à temperatura ambiente. Após as lavagens, as placas foram desenvolvidas com o Tampão Read (MSD) de acordo com o procedimento recomendado pelo fabricante e os sinais luminescentes foram registrados com um instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Os sinais de ligação direta (em RLU) foram capturados para células que expressam SARS-CoV-2-S e uma linha celular de controle negativo.
[00257] A capacidade dos anticorpos monoclonais anti-SARS-CoV-2 de se ligarem às células que expressam a proteína da espícula de SARS-CoV-2 em comparação com a ligação às células parenterais foi avaliada usando um ensaio de ligação imunológica. A ligação às células imobilizadas em placas de ligação alta de 96 poços (MSD) foi realizada com uma série de diluições de anticorpos e os anticorpos ligados foram detectados usando IgG anti-humano conjugada com SULFO-TAGTM. Os sinais de ligação da eletroquimiluminescência foram registrados em um Sector Imager 600 (MSD). Todos os anticorpos exibiram uma ligação dependente da concentração e a razão da ligação entre as células que expressam espícula e as células parentais foi analisada nas concentrações de 5,5 nM e 0,20 nM.
[00258] Os resultados de ligação dos mAbs anti-SARS-CoV-2-S, nas duas concentrações para células Jurkat que expressam a proteína da espícula e parenterais, estão resumidos na Tabela 38. Dos 46 anticorpos testados, 44 anticorpos se ligaram especificamente às células Jurkat/espícula (Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-On 3G Inducible SARS-CoV-2 Spike Protein High Sorted cells) com uma razão para as células parentais de 4 ou mais em qualquer concentração. A 0,2 nM, as razões dos sinais de ligação entre as células Jurkat/espícula e as células parentais variavam de 4 a 36 e, a 5 nM, a razão variava de 4 a 63. Embora os dois anticorpos (mAb10998 e mAb11002) exibissem fraca ligação a células Jurkat/espícula com razão de ligação às células parentais inferior a 4, a 5 nM os sinais de ligação eram mais altos em Jurkat/espícula do que nas células parentais. Um anticorpo irrelevante do isotipo IgG1 mostrou uma ligação mínima, como esperado. TABELA 38: ESPECIFICIDADE DA LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI- SARS-CoV-2-S A CÉLULAS JURKAT QUE EXPRESSAM PROTEÍNAS DA ESPÍCULA VERSUS CÉLULAS PARENTAIS POR ELETROQUIMILUMINESCÊNCIA
[00259] Todas as referências aqui citadas são incorporadas porreferência na mesma extensão que se cada publicação, entrada no banco de dados (por exemplo, sequências Genbank ou entradas GeneID), pedido de patente ou patente individual, fosse específica e individualmente indicado como incorporado por referência. Esta declaração de incorporação por referência destina-se, por parte dos Depositantes, a se relacionarem com cada publicação, entrada em banco de dados (por exemplo, sequências Genbank ou entradas GeneID), pedido de patente ou patente individual identificado, mesmo que essa citação não esteja imediatamente adjacente a uma declaração dedicada de incorporação por referência. A inclusão de declarações de incorporação dedicadas por referência, se houver, dentro do relatório descritivo não enfraquece de maneira alguma essa declaração geral de incorporação por referência. A citação das referências aqui contidas não se destina a admitir que a referência é pertinente ao estado da técnica, nem constitui qualquer admissão quanto ao conteúdo ou data dessas publicações ou documentos.
Claims (17)
1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 832, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o referido anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 642, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:499, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 644, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 648, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 650 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 652.
2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 640 e/ou uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 646.
3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo isolado compreende uma região constante de imunoglobulina, preferencialmente em que o referido anticorpo isolado compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 654 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 656.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida região constante de imunoglobulina é uma região constante de IgG1.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo isolado é um anticorpo recombinante.
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo isolado é multiespecífico.
7. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo agente terapêutico.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o segundo agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em: um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 832, um agente anti-inflamatório, um agente antimalárico e um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à TMPRSS2, preferencialmente em que o segundo agente terapêutico é um segundo anticorpo, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 832.
9. Método para fabricar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga a uma proteína da espícula de SARS-CoV-2 que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 832, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir em uma célula hospedeira um ou mais polinucleotídeos que codificam o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições favoráveis à expressão de um ou mais polinucleotídeos; e (c) opcionalmente, isolar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da célula hospedeira e/ou um meio no qual a célula hospedeira é cultivada, em que o referido anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3), em que HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 642, HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:499, HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 644, LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 648, LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 650 e LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 652.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 640 e/ou uma LCVR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 646.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região constante de imunoglobulina, preferencialmente em que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 654 e uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 656.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a referida região constante de imunoglobulina é uma região constante de IgG1.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo recombinante.
14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo isolado é multiespecífico.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster Chinês.
16. Uso da composição farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para preparar um medicamento ou kit para tratar ou prevenir infecção por SARS-CoV-2.
17. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno compreende uma sequência de domínio variável VH3-66 ou Vk1-33.
Applications Claiming Priority (10)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202063004312P | 2020-04-02 | 2020-04-02 | |
US63/004,312 | 2020-04-02 | ||
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US63/014,687 | 2020-04-23 | ||
US202063025949P | 2020-05-15 | 2020-05-15 | |
US63/025,949 | 2020-05-15 | ||
US202063034865P | 2020-06-04 | 2020-06-04 | |
US63/034,865 | 2020-06-04 | ||
PCT/US2020/039707 WO2021045836A1 (en) | 2020-04-02 | 2020-06-25 | Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
BR112020015534-9A BR112020015534B1 (pt) | 2020-04-02 | 2020-06-25 | Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seu método de fabricação, seus usos, bem como composição farmacêutica |
Publications (1)
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Family Applications (1)
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BR122023004078-3A BR122023004078B1 (pt) | 2020-04-02 | 2020-06-25 | Composição farmacêutica, seu uso e método para fabricar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
BR (1) | BR122023004078B1 (pt) |
-
2020
- 2020-06-25 BR BR122023004078-3A patent/BR122023004078B1/pt active IP Right Grant
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 25/06/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |