ES2939895T3 - Anticuerpos antiglucoproteína espicular del SARS-CoV-2 y fragmentos de unión a antígeno - Google Patents
Anticuerpos antiglucoproteína espicular del SARS-CoV-2 y fragmentos de unión a antígeno Download PDFInfo
- Publication number
- ES2939895T3 ES2939895T3 ES20186667T ES20186667T ES2939895T3 ES 2939895 T3 ES2939895 T3 ES 2939895T3 ES 20186667 T ES20186667 T ES 20186667T ES 20186667 T ES20186667 T ES 20186667T ES 2939895 T3 ES2939895 T3 ES 2939895T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cov
- antigen
- antibody
- binding
- sars
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 383
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 234
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 233
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 233
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 232
- 101710114810 Glycoprotein Proteins 0.000 title description 4
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 title description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 140
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 108
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 claims description 86
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 27
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims description 8
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 108010061994 Coronavirus Spike Glycoprotein Proteins 0.000 abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 64
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 23
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract description 22
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 147
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 119
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 119
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 118
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 85
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 66
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 61
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 55
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 53
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 52
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 50
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 48
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 48
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 45
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 40
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 38
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 36
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 36
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 35
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 34
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 34
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 30
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 28
- 102000053723 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 26
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 26
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical group [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 25
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 20
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 20
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 16
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 16
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 14
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 14
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 101000929928 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 10
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 10
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 10
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 10
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 10
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 9
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 9
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 9
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 9
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 9
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 8
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 8
- -1 antibody Proteins 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 102000048657 human ACE2 Human genes 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 7
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 7
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 6
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 6
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 5
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000034994 death Effects 0.000 description 5
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000005305 interferometry Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 3
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000998953 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 1-2 Proteins 0.000 description 3
- 101001008255 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1D-8 Proteins 0.000 description 3
- 101001047628 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2-29 Proteins 0.000 description 3
- 101001008321 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 2D-26 Proteins 0.000 description 3
- 101001047619 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3-20 Proteins 0.000 description 3
- 101001008263 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 3D-15 Proteins 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 102100036887 Immunoglobulin heavy variable 1-2 Human genes 0.000 description 3
- 102100022964 Immunoglobulin kappa variable 3-20 Human genes 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 208000025370 Middle East respiratory syndrome Diseases 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 3
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 229950009614 gimsilumab Drugs 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 102000049800 human TMPRSS2 Human genes 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 229950006348 sarilumab Drugs 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 2
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 241001461743 Deltacoronavirus Species 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 241000008920 Gammacoronavirus Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101000773743 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme Proteins 0.000 description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 2
- 101100495232 Homo sapiens MS4A1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 2
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 2
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001489174 Ogataea minuta Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 2
- 229940090047 auto-injector Drugs 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 238000013357 binding ELISA Methods 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 2
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229940090046 jet injector Drugs 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000005245 right atrium Anatomy 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000003867 tiredness Effects 0.000 description 2
- 208000016255 tiredness Diseases 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 210000002620 vena cava superior Anatomy 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid;(2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 BEJKOYIMCGMNRB-GRHHLOCNSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KAZMFFUBWJKPDL-UHFFFAOYSA-N 4-(aminomethyl)benzenesulfonyl fluoride Chemical compound NCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 KAZMFFUBWJKPDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000151861 Barnettozyma salicaria Species 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 101100028791 Caenorhabditis elegans pbs-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 206010008469 Chest discomfort Diseases 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 241001674013 Chrysosporium lucknowense Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N Ethane Chemical compound CC OTMSDBZUPAUEDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001247262 Fabales Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241001149959 Fusarium sp. Species 0.000 description 1
- 241000567178 Fusarium venenatum Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 description 1
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100039615 Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Human genes 0.000 description 1
- 206010022005 Influenza viral infections Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000170280 Kluyveromyces sp. Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000017954 Nuclear factor of activated T cells (NFAT) Human genes 0.000 description 1
- 108050007058 Nuclear factor of activated T cells (NFAT) Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 241000489470 Ogataea trehalophila Species 0.000 description 1
- 241000826199 Ogataea wickerhamii Species 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000530350 Phaffomyces opuntiae Species 0.000 description 1
- 241000529953 Phaffomyces thermotolerans Species 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 241000195887 Physcomitrella patens Species 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 101000629313 Severe acute respiratory syndrome coronavirus Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 241000370136 Wickerhamomyces pijperi Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRXKIZXIRHMPFW-UHFFFAOYSA-N [4-[6-[amino(azaniumylidene)methyl]naphthalen-2-yl]oxycarbonylphenyl]-(diaminomethylidene)azanium;methanesulfonate Chemical compound CS([O-])(=O)=O.CS([O-])(=O)=O.C1=CC(N=C([NH3+])N)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C=C(C=C2)C([NH3+])=N)C2=C1 SRXKIZXIRHMPFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N aebsf Chemical compound NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 MGSKVZWGBWPBTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 108010029566 avian influenza A virus hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229960002335 bromhexine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229960000772 camostat Drugs 0.000 description 1
- FSEKIHNIDBATFG-UHFFFAOYSA-N camostat mesylate Chemical compound CS([O-])(=O)=O.C1=CC(CC(=O)OCC(=O)N(C)C)=CC=C1OC(=O)C1=CC=C([NH+]=C(N)N)C=C1 FSEKIHNIDBATFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012866 crystallographic experiment Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- YRSGDLIATOURQO-UHFFFAOYSA-N ethyl 4-acetyl-5-oxohexanoate Chemical compound CCOC(=O)CCC(C(C)=O)C(C)=O YRSGDLIATOURQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000033065 inborn errors of immunity Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 229950009865 nafamostat Drugs 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 208000028529 primary immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 108091011138 protein binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 238000002133 sample digestion Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000003637 steroidlike Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1002—Coronaviridae
- C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
- A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
La presente descripción proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a una proteína de punta de coronavirus y métodos para usar dichos anticuerpos y fragmentos para tratar o prevenir infecciones virales (p. ej., infecciones por coronavirus). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos antiglucoproteína espicular del SARS-CoV-2 y fragmentos de unión a antígeno
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno que se unen de manera específica a proteínas espiculares del coronavirus y a métodos para tratar o prevenir infecciones por coronavirus con dichos anticuerpos y fragmentos.
Antecedentes de la invención
Virus recién identificados, tales como el coronavirus, pueden ser difíciles de tratar porque no están suficientemente caracterizados. La aparición de estos virus recién identificados destaca la necesidad de desarrollar nuevas estrategias antivíricas. El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave de tipo 2 (SARS-CoV-2, del inglés severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) es un coronavirus de reciente aparición que provoca una enfermedad respiratoria aguda grave, la covid-19. El SARS-CoV-2 se identificó por primera vez a partir de un brote en Wuhan, China y, a 20 de marzo de 2020, la Organización Mundial de la Salud había notificado 209.839 casos confirmados en 168 países, áreas o territorios, con el resultado de 8.778 muertes. Las características clínicas de la covid-19 incluyen fiebre, tos seca y cansancio, y la enfermedad puede provocar insuficiencia respiratoria que puede dar lugar a la muerte.
Hasta ahora, no ha habido vacuna o producto terapéutico para prevenir o tratar la infección por SARS-CoV-2. En vista de la continua amenaza para la salud humana, existe una necesidad urgente de terapias antivíricas preventivas y terapéuticas para el control del SARS-CoV-2. Debido a que este virus utiliza su glucoproteína espicular para la interacción con el receptor celular ACE2 y la serina proteasa TMPRSS2 para entrar en una célula diana, esta proteína espicular representa una diana atractiva para la terapia con anticuerpos. En particular, los anticuerpos completamente humanos que se unen de manera específica a la proteína espicular del SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S, del inglés SARS-CoV-2-Spike) con alta afinidad y que inhiben la infectividad del virus podrían ser importantes en la prevención y el tratamiento de la covid-19.
Wang et al. (2020) bioRxiv, "A human monoclonal antibody blocking SARS-CoV-2 infection" divulga un anticuerpo de neutralización cruzada que se dirige a un epítopo común en el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV. Tian et al. (2020), Emerging Microbes & Infections, 9, 382-385 divulga la unión de la proteína espicular del coronavirus de 2019 con un anticuerpo monoclonal humano específico del coronavirus del SARS.
Sumario de la invención
Existe una necesidad de anticuerpos neutralizantes terapéuticos contra la proteína espicular del SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) y su uso para tratar o prevenir la infección vírica. La presente divulgación aborda esta necesidad, en parte, proporcionando anticuerpos humanos anti-SARS-CoV-2-S, tales como los de la tabla 1, y combinaciones de los mismos que incluyen, por ejemplo, combinaciones con otras terapias (por ejemplo, antinflamatorios, antipalúdicos, antivíricos u otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno), y métodos de uso de los mismos para tratar infecciones víricas.
La presente divulgación proporciona proteínas de unión a antígenos humanas neutralizantes que se unen de manera específica a la SARS-CoV-2-S, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo recombinante aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica a una proteína espicular del coronavirus (CoV-S, del inglés coronavirus spike), en donde el anticuerpo tiene una o más de las siguientes características: (a) se une a la CoV-S con una CE50 inferior a aproximadamente 10'9 M; (b) demuestra un aumento en la supervivencia en un animal infectado por coronavirus después de la administración a dicho animal infectado por coronavirus, en comparación con un animal infectado por coronavirus comparable sin dicha administración; y/o (c) comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR, del inglés complementarity determining regions) de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) contenidas dentro de una región variable de cadena pesada (HCVR, del inglés heavy chain variable region) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con una HCVR de la tabla 1; y tres CDR de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3) contenidas dentro de una región variable de cadena ligera (LCVR, del inglés light chain variable region) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia con una LCVR de la tabla 1.
En algunos aspectos de la divulgación, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de un anticuerpo de la tabla 1; y/o (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de un anticuerpo de la tabla 1.
En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de HCVR de la tabla 1; y/o (b) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de LCVR de la tabla 1.
En algunos aspectos, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende la CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de un solo anticuerpo de la tabla 1. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una inmunoglobulina que comprende la HCVR y la LCVR de un solo anticuerpo de la tabla 1.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno que compite con uno cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno comentados anteriormente o en el presente documento para unirse a la CoV-S.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona una proteína de unión a antígeno que se une al mismo epítopo que, o a un epítopo superpuesto en, la CoV-S como uno cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno comentados anteriormente o en el presente documento.
En cualquiera de las diversas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede ser multiespecífico.
En cualquiera de los diversos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una o más de las siguientes propiedades: a) inhibe el crecimiento del coronavirus; b) se une a la superficie de un coronavirus; c) limita la propagación de la infección por coronavirus de las células in vitro; y d) protege a los ratones genomanipulados para expresar la proteína ACE2 o TMPRSS2 humana de la muerte y/o pérdida de peso provocada por la infección por coronavirus.
En cualquiera de los diversos aspectos, la CoV-S es la SARS-CoV-2-S.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un complejo que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se comenta anteriormente o en el presente documento unido a un polipéptido CoV-S. En algunos aspectos, la CoV-S es la SARS-CoV-2-S.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para fabricar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se comenta anteriormente o en el presente documento, que comprende: (a) introducir en una célula hospedadora uno o más polinucleótidos que codifican dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno; (b) cultivar la célula hospedadora en condiciones favorables para la expresión del uno o más polinucleótidos; y (c) opcionalmente, aislar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la célula hospedadora y/o de un medio en el que crece la célula hospedadora. En algunos aspectos, la célula hospedadora es una célula de ovario de hámster chino.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que es un producto del método comentado anteriormente.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un polipéptido que comprende: (a) la CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de un dominio HCVR de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR expuesta en la tabla 1; o (b) la CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de un dominio LCVR de una cadena de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos de LCVR expuesta en la tabla 1.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido comentado anteriormente.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un vector que comprende el polinucleótido comentado anteriormente.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona una célula hospedadora que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o polipéptido o polinucleótido o vector como se ha comentado anteriormente o en el presente documento.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición o kit que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comentado anteriormente o en el presente documento en asociación con un producto terapéutico adicional.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un producto terapéutico adicional. En algunas realizaciones, el producto terapéutico adicional es un fármaco antivírico o una vacuna. En algunas realizaciones, el producto terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en: un
antinflamatorio, un antipalúdico, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica a TMPRSS2 y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica a CoV-S. En algunos casos, el antipalúdico es cloroquina o hidroxicloroquina. En algunos casos, el antinflamatorio es un anticuerpo, tal como sarilumab, tocilizumab o gimsilumab. En algunas realizaciones, el producto terapéutico adicional es un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la tabla 1.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un recipiente o dispositivo de inyección que comprende la proteína de unión a antígeno, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno, o la composición como se cometa anteriormente o en el presente documento.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir la infección por un coronavirus, en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se comenta anteriormente o en el presente documento. En algunos aspectos, el coronavirus se selecciona del grupo que consiste en SARS-CoV-2, SARS-CoV y MERS-CoV.
En algunos aspectos del método para tratar o prevenir la infección por un coronavirus, se administra al sujeto uno o más productos terapéuticos adicionales. En algunos casos, el uno o más productos terapéuticos adicionales es un fármaco antivírico o una vacuna. En algunos casos, el uno o más productos terapéuticos adicionales se seleccionan del grupo que consiste en: un antinflamatorio, un antipalúdico, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica a TMPRSS2 y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica a CoV-S. En algunos casos, el antipalúdico es cloroquina o hidroxicloroquina. En algunos casos, el antinflamatorio es un anticuerpo, tal como, por ejemplo, sarilumab, tocilizumab o gimsilumab. En algunos aspectos, el producto terapéutico adicional es un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende secuencias de HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la tabla 1. Otros anticuerpos que se pueden utilizar solos o en combinación entre sí o con uno o más de los anticuerpos divulgados en el presente documento para su uso en el contexto de los métodos de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, LY-CoV555 (Eli Lilly); 47D11 (Wang et al. Nature Communications Article n.° 2251); B38, H4, B5 y/o H2 (Wu et al., 10.1126/science.abc2241 (2020); STI-1499 (Sorrento Therapeutics); VIR-7831 y VIR-7832 (Vir Biotherapeutics).
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para administrar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comentado anteriormente o en el presente documento en el cuerpo de un sujeto que comprende inyectar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el cuerpo del sujeto. En algunos aspectos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno se inyecta en el cuerpo del sujeto por vía subcutánea, vía intravenosa o vía intramuscular.
En cualquiera de los diversos aspectos comentados anteriormente o en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una secuencia de dominio variable VH3-66 o Vk1-33.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832, en donde dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 202, y tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210.
En algunos aspectos, la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 204, la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 206, la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 208, la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 212, la LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55 y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 214. En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 202. En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210. En una realización de la invención, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 202 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832, en donde dicho anticuerpo aislado comprende una región constante de inmunoglobulina, tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 202 y tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una región variable de cadena
ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210.
En algunos aspectos, la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 204, la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 206, la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 208, la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 212, la LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55 y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 214. En una realización, el anticuerpo aislado comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 202 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 216 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 218. En algunos casos, la región constante de inmunoglobulina es una región constante de IgG1. En algunos casos, el anticuerpo aislado es un anticuerpo recombinante. En algunos casos, el anticuerpo aislado es multiespecífico.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado de la invención, como se comenta anteriormente, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un segundo producto terapéutico. En algunos casos, el segundo producto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832, un antinflamatorio, un antipalúdico y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a TMPRSS2.
En algunas realizaciones, el segundo producto terapéutico es un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832. En algunos casos, el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 640 y tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 646. En algunos casos, el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: HCDR1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 642; HCDR2, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 499; HCDR3, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 644; LCDR1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 648; LCDR2, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 650; y LCDR3, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 652. En algunos casos, el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 640 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 646. En algunos casos, el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 654 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 656.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832, en donde dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 640, y tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 646.
En algunos aspectos, la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 642, la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 499, la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 644, la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 648, la LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 650 y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 652. En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 640. En algunos aspectos, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 646. En una realización de la invención, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 640 y una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 646.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo aislado que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832, en donde dicho anticuerpo aislado comprende una región constante de inmunoglobulina, tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una región variable de cadena pesada (HCVR)
que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 640 y tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 646.
En algunos aspectos, la HCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 642, la HCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 499, la HCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 644, la LCDR1 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 648, la LCDR2 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 650 y la LCDR3 comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 652. En una realización, el anticuerpo aislado comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 640 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 646. En algunas realizaciones, el anticuerpo aislado comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 654 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 656. En algunos casos, la región constante de inmunoglobulina es una región constante de IgG1. En algunos casos, el anticuerpo aislado es un anticuerpo recombinante. En algunos casos, el anticuerpo aislado es multiespecífico.
En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado de la invención, como se comenta anteriormente, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un segundo producto terapéutico. En algunos casos, el segundo producto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832, un antinflamatorio, un antipalúdico y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a TMPRSS2.
En algunas realizaciones, el segundo producto terapéutico es un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832. En algunos casos, el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende tres CDR de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) contenidas en una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 202 y tres CDR de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) contenidas en una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210. En algunos casos, el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: HCDR1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 204; HCDR2, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 206; HCDR3, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 208. LCDR1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 212; LCDR2, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55; y LCDR3, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 214. En algunos casos, el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 202 y una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210. En algunos casos, el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 216 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 218. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
Breve descripción de las figuras
En la figura 1 se muestran los datos de bloqueo de ELISA para anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S seleccionados contra la proteína espicular del SARS-CoV-2, que impiden que la proteína espicular se una a su receptor ACE2. En la figura 2 se muestran los datos de bloqueo de ELISA para anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S seleccionados contra la proteína espicular del SARS-CoV-2, que impiden que la proteína espicular se una a su receptor ACE2. En la figura 3 se muestran los datos de bloqueo de ELISA para anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S seleccionados contra la proteína espicular del SARS-CoV-2, que impiden que la proteína espicular se una a su receptor ACE2. En la figura 4 se muestran los datos de bloqueo de ELISA para anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S seleccionados contra la proteína espicular del SARS-CoV-2, que impiden que la proteína espicular se una a su receptor ACE2. En la figura 5 se muestran los datos de bloqueo de ELISA para anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S seleccionados contra la proteína espicular del SARS-CoV-2, que impiden que la proteína espicular se una a su receptor ACE2. En la figura 6 se muestran los datos de bloqueo de ELISA para anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S seleccionados contra la proteína espicular del SARS-CoV-2, que impiden que la proteína espicular se una a su receptor ACE2. En la figura 7 se muestran los datos de bloqueo de ELISA para anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S seleccionados contra la proteína espicular del SARS-CoV-2, que impiden que la proteína espicular se una a su receptor ACE2. En la figura 8 se muestran los datos de bloqueo de ELISA para anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S seleccionados contra la proteína espicular del SARS-CoV-2, que impiden que la proteína espicular se una a su receptor ACE2. En la figura 9A y en la figura 9B se muestran las frecuencias del gen V para cadenas pesadas (eje de abscisas) y ligeras (eje de ordenadas) emparejadas de anticuerpos neutralizantes aislados contra el SARS-CoV-2 para ratones VelocImmune® (Figura 9A; N = 185) y donantes humanos convalecientes (Figura 9B; N = 68). La sombra y el
tamaño del círculo corresponden al número de pares de cadenas pesadas y ligeras presentes en los repertorios de anticuerpos neutralizantes aislados. La neutralización se define como >70 % con una dilución 1:4 del anticuerpo (~2 |jg/ml) en el ensayo de neutralización de pseudopartículas de VSV.
En la figura 10A y en la figura 10B se muestra la potencia de neutralización. En la figura 10A se muestra la potencia de neutralización de los mAb antiespícula del SARS-CoV-2. Se añadieron diluciones en serie de mAb antiespícula, control de isotipo IgG1 y ACE2 dimérico recombinante (hACE2.hFc) con pVSV-SARS-CoV-2-S-mNeon a células Vero y se midió la expresión de mNeon 24 horas después de la infección como una lectura de la infectividad del virus. Los datos se representan gráficamente como porcentaje de neutralización en relación con el control de la infección solo por virus. En la figura 10B se muestra la potencia de neutralización de los mAb antiespícula individuales y de las combinaciones de mAb contra el virus SARS-CoV-2-S en células VeroE6.
En la figura 11 se muestra el análisis de agrupaciones de epítopos de una matriz de ensayos de unión premezclados para diferentes mAb anti-SARS-CoV-2. La agrupación de epítopos se realizó respecto a nueve mAb anti-SARS-CoV-2 como se describe. Hubo tres fases (I, II y III) para cada gráfico. En la fase I, se cargó mAb anti-SARS-CoV-2 (20 pg/ml) en la sonda anti-Fc humano. En la fase II, solución de mAb de bloqueo IgG1 humano (100 pg/ml). En la fase III, una solución del complejo premezclado SARS CoV-2 RBD-MMH 100 nM de cada sitio de unión de mAb anti-SARS-CoV-2600 nM fluyó sobre la sonda de captura de mAb.
En la figura 12 se muestra un modelo de superficie 3D para la estructura del dominio RBD de la proteína espicular que muestra la interfaz ACE2 y los resultados del mapeo de epítopos HDX-MS. Los restos del RBD protegidos por anticuerpos antiespícula del SARS-CoV2 se indican con sombreado que representa el grado de protección determinado por los experimentos de HDX-MS. La estructura de RBD se reproduce de PDB 6M17.
En la figura 13A y en la figura 13B se muestra un complejo de mAb10933 y mAb10987 con el RBD del SARS-CoV-2. En la figura 13A se muestra un mapa crioEM de 3,9 A del complejo mAb10933 RBD mAb10987, sombreado de acuerdo con las cadenas en el modelo refinado de la figura 13B. Se identifican el RBD, las cadenas pesada y ligera de mAb10933 y la cadena pesada y ligera de mAb10987.
En la figura 14 se muestran las estadísticas de los datos cryoEM. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se indican para la estructura del complejo mAb10987 mAb10933 RBD del SARS-CoV-2 que se muestra en la figura 13A y en la figura 13B.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención. Aunque puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.
El término "coronavirus" o "CoV" se refiere a cualquier virus de la familia de los coronavirus, que incluye, pero sin limitación, el SARS-CoV-2, el MERS-CoV y el SARS-CoV. El SARS-CoV-2 se refiere al coronavirus recién surgido que se identificó como la causa de un brote grave que comenzó en Wuhan, China, y que se está extendiendo rápidamente a otras áreas del mundo. El SARS-CoV-2 también se conoce como 2019-nCoV y coronavirus de Wuhan. Se une a través de la proteína espicular del virus al receptor enzima convertidora de la angiotensina 2 (ACE2, del inglés angiotensin-converting enzyme 2) de la célula hospedadora humana. La proteína espicular también se une y se escinde mediante TMPRSS2, que activa la proteína espicular para la fusión de la membrana del virus.
El término "CoV-S", también llamada "S" o "proteína S" se refiere a la proteína espicular de un coronavirus y puede referirse a proteínas S específicas tales como la SARS-CoV-2-S, MERS-CoV S y SARS-CoV S. La proteína espicular del SARS-CoV-2 es una glucoproteína de membrana de tipo I de 1273 aminoácidos que se ensambla en trímeros que constituyen las espículas o peplómeros en la superficie de la partícula de coronavirus envuelta. La proteína tiene dos funciones esenciales, la unión al receptor del hospedador y la fusión de las membranas, que se atribuyen a las mitades aminoterminal (S1) y carboxiterminal (S2) de la proteína S. La CoV-S se une a su receptor afín a través de un dominio de unión al receptor (RBD, del inglés receptor binding domain) presente en la subunidad S1. La secuencia de aminoácidos de la proteína espicular del SARS-CoV-2 de longitud completa se ejemplifica mediante la secuencia de aminoácidos proporcionada en la SEQ ID NO: 832. El término "CoV-S" incluye variantes de proteínas de la proteína espicular del CoV aisladas de diferentes aislados de CoV, así como la proteína espicular del CoV recombinante o un fragmento de la misma. El término también abarca la proteína espicular del CoV o un fragmento de la misma acoplado a, por ejemplo, un marcador de histidina, un Fc de ratón o humano, o una secuencia de señal tal como ROR1.
La expresión "infección por coronavirus" o "infección por CoV", como se utilizan en el presente documento, se refiere a la infección por un coronavirus tal como el SARS-CoV-2, el MERS-CoV o el SARS-CoV. La expresión incluye infecciones del tracto respiratorio por coronavirus, a menudo en el tracto respiratorio inferior. Los síntomas pueden
incluir fiebre alta, tos seca, dificultad para respirar, neumonía, síntomas gastrointestinales tales como diarrea, insuficiencia orgánica (insuficiencia renal y disfunción renal), choque séptico y muerte en casos graves.
Virus
La presente invención se refiere a métodos para tratar o prevenir una infección vírica en un sujeto. El término "virus" incluye cualquier virus cuya infección en el cuerpo de un sujeto es tratable o prevenible mediante la administración de un anticuerpo anti-CoV-S o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, en donde la infectividad del virus es al menos parcialmente dependiente de la CoV-S). En un aspecto de la divulgación, un "virus" es cualquier virus que exprese proteína espicular (por ejemplo, CoV-S). El término "virus" también incluye un virus respiratorio dependiente de CoV-S que es un virus que infecta el tejido respiratorio de un sujeto (por ejemplo, tracto respiratorio superior y/o inferior, tráquea, bronquios o pulmones) y es tratable o prevenible mediante la administración de un anticuerpo anti-CoV-S o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, el virus incluye el coronavirus, el SARS-CoV-2 (coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave de tipo 2), el SARS-CoV (coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave) y el MERS-CoV (coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS, del inglés Middle East respiratory syndrome)). Los coronavirus pueden incluir los géneros de Alfacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus y Deltacoronavirus. En algunos aspectos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno proporcionados en el presente documento pueden unirse y/o neutralizar un Alfacoronavirus, un Betacoronavirus, un Gammacoronavirus y/o un Deltacoronavirus. En determinados aspectos, esta unión y/o neutralización puede ser específica para un género particular de coronavirus o para un subgrupo particular de un género. "Infección vírica" se refiere a la invasión y multiplicación de un virus en el cuerpo de un sujeto.
Los viriones de coronavirus son esféricos con diámetros de aproximadamente 125 nm. La característica más prominente de los coronavirus son las proyecciones de espículas con forma de maza que emanan de la superficie del virión. Estas espículas son una característica definitoria del virión y les dan la apariencia de una corona solar, inspirando el nombre, coronavirus. Dentro de la envoltura del virión se encuentra la nucleocápside. Los coronavirus tienen nucleocápsides simétricas helicoidalmente, que es poco común entre los virus de ARN de sentido positivo, pero mucho más común para los virus de ARN de sentido negativo. El SARS-CoV-2, el MERS-CoV y el SARS-CoV pertenecen a la familia de los coronavirus. La unión inicial del virión a la célula hospedadora se inicia mediante interacciones entre la proteína S y su receptor. Los sitios de los dominios de unión al receptor (RBD) dentro de la región S1 de una proteína S de coronavirus varían dependiendo del virus, con algunos que tienen los RBD en el extremo carboxiterminal de S1. La interacción proteína-S/receptor es el principal determinante para que un coronavirus infecte a una especie hospedadora y también gobierna el tropismo tisular del virus. Muchos coronavirus utilizan peptidasas como su receptor celular. Después de la unión al receptor, el virus debe acceder al citosol de la célula hospedadora. Esto generalmente se logra mediante la escisión proteolítica dependiente de ácido de la proteína S mediante una catepsina, TMPRRS2 u otra proteasa, seguida de la fusión de las membranas vírica y celular.
Anticuerpos anti-CoV-S y fragmentos de unión a antígeno
La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se define en las reivindicaciones, que se unen de manera específica a la proteína espicular del CoV o a un fragmento antigénico de la misma.
El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (HC, del inglés heavy chain) y dos cadenas ligeras (LC, del inglés light chain) interconectadas mediante enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completo"), así como a multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Los anticuerpos ilustrativos incluyen, por ejemplo, los enumerados en la tabla 1. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "Vh") y una región constante de cadena pesada (comprendida por los dominios Ch1, Ch2 y Ch3). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera ("LCVR o "Vl") y una región constante de cadena ligera (Cl). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, del inglés framework regions). Cada Vh y Vl comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las CDR de cadena pesada también pueden denominarse HCDR o CDR-H y numerarse como se describe anteriormente (por ejemplo, HCDR1, HCDR2 y HCDR3, o CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3). Análogamente, las CDR de cadena ligera pueden denominarse LCDR o CDR-L, y numerarse como LCDR1, LCDR2 y LCDR3, o CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3. En determinados aspectos de la divulgación, las FR del anticuerpo (o del fragmento de unión a antígeno del mismo) son idénticas a las secuencias de la estirpe germinal humana o pueden modificarse de manera natural o artificial. Ejemplos de secuencias de la estirpe germinal humana incluyen, pero sin limitación, VH3-66 y Vk1-33. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-CoV-S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) que comprenden secuencias HCDR y LCDR de la tabla 1 en una región variable de cadena pesada o cadena ligera de VH3-66 o Vk1-33. La presente divulgación proporciona además anticuerpos anti-CoV-S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) que comprenden secuencias HCDR y LCDR de la tabla 1 en una combinación de un cadena ligera seleccionada de IgKV41, IgKV 1-5, IgKV1-9, IgKV1-12, IgKV3-15, IgKV1-16, IgKV1-17, IgKV3-20, IgLV3-21, IgKV2-24, IgKV1-33, IgKV1-39, IgLV1-40, IgLV1-44, IgLV1-51, IgLV3-1, IgKV1-6, IgLV2-8, IgKV3-11, IgLV2-11, IgLV2-14, IgLV2-23 o IgLV6-57 y una cadena pesada seleccionada de IgHV1-69, IgHV3-64, IgHV4-59, IgHV3-53, IgHV3-48, IgHV4-34, IgHV3-33, IgHV3-30, IgHV3-23, IgHV3-20, IgHV1-18, IgHV3-15, IgHV3-11, IgHV3-9, IgHV1-8, IgHV3-7, IgHV2-5, IgHV1-2, IgHV2-70, IgHV3-66, IgHV5-51, IgHV1-46, IgHV4-39, IgHV4-31, IgHV3-30-3, IgHV2-26 o IgHV7-4-1. La presente divulgación proporciona además anticuerpos anti-CoV-S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) que comprenden secuencias HCVR y LCVR de la tabla 1 en una combinación de un cadena ligera seleccionada de IgKV4-1, IgKV 1-5, IgKV1-9, IgKV1-12, IgKV3-15, IgKV1-16, IgKV1-17, IgKV3-20, IgLV3-21, IgKV2-24, IgKV1-33, IgKV1-39, IgLV1-40, IgLV1-44, IgLV1-51, IgLV3-1, IgKV1-6, IgLV2-8, IgKV3-11, IgLV2-11, IgLV2-14, IgLV2-23 o IgLV6-57 y una cadena pesada seleccionada de IgHV1-69, IgHV3-64, IgHV4-59, IgHV3-53, IgHV3-48, IgHV4-34, IgHV3-33, IgHV3-30, IgHV3-23, IgHV3-20, IgHV1-18, IgHV3-15, IgHV3-11, IgHV3-9, IgHV1-8, IgHV3-7, IgHV2-5, IgHV1-2, IgHV2-70, IgHV3-66, IgHV5-51, IgHV1-46, IgHV4-39, IgHV4-31, IgHV3-30-3, IgHV2-26 o IgHV7-4-1.
Normalmente, los dominios variables de las cadenas tanto pesada como ligera de inmunoglobulina comprenden tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), localizadas dentro de regiones marco (FR) relativamente conservadas. En general, desde el extremo N al extremo C, los dominios variables de las cadenas tanto ligera como pesada comprenden FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. En un aspecto de la divulgación, la asignación de aminoácidos a cada dominio se ajusta a las definiciones de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5.a ed.; publ. n Ih . N.° 91 3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 o Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883.
La presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S monoclonales, por ejemplo, anticuerpo y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como composiciones monoclonales que comprenden una pluralidad de proteínas de unión a antígeno monoclonales aisladas. La expresión "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, las moléculas de anticuerpo que comprenden la población son idénticas en la secuencia de aminoácidos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Una "pluralidad" de dichos anticuerpos monoclonales y fragmentos en una composición se refiere a una concentración de anticuerpos y fragmentos idénticos (es decir, como se ha indicado anteriormente, en la secuencia de aminoácidos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores) que está por encima de lo que normalmente ocurriría en la naturaleza, por ejemplo, en la sangre de un organismo hospedador tal como un ratón o un ser humano.
En una realización de la invención, una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, es decir, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, comprende una región constante de cadena pesada, por ejemplo, del tipo IgA (por ejemplo, IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) o IgM. En una realización de la invención, una proteína de unión a antígeno, es decir, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, comprende un dominio constante de cadena ligera, por ejemplo, del tipo k o A.
El término proteína de unión a antígeno "humana", tal como un anticuerpo, como se utiliza en el presente documento, incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulinas de la estirpe germinal humana, ya sea en una célula humana o injertada en una célula no humana, por ejemplo, una célula de ratón. Véanse, por ejemplo, los documentos US8502018, US6596541 o US5789215. Los mAb humanos de la invención pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la estirpe germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en las c Dr y, en particular, en la CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, no pretende incluir mAb en los que se hayan injertado secuencias CDR procedentes de la estirpe germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón) en secuencias FR humanas. La expresión incluye anticuerpos producidos de forma recombinante en un mamífero no humano o en células de un mamífero no humano. La expresión no pretende incluir anticuerpos aislados de o generados en un sujeto humano. Véase más adelante.
La presente invención incluye anticuerpos anti-CoV-S quiméricos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y métodos de uso de los mismos. Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que tiene el dominio variable de un primer anticuerpo y el dominio constante de un segundo anticuerpo, donde el primer y el segundo anticuerpo son de diferentes especies. (Documento US4816567; y Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
La presente invención incluye anticuerpos anti-CoV-S híbridos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y métodos de uso de los mismos. Como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo híbrido" es un anticuerpo que tiene el dominio variable de un primer anticuerpo y el dominio constante de un segundo anticuerpo, en donde el primer y el segundo anticuerpo son de diferentes animales, o en donde el dominio variable, pero no la región constante, es de un primer animal. Por ejemplo, se puede tomar un dominio variable de un anticuerpo aislado de un ser humano y expresarlo con una región constante fija no aislada de ese anticuerpo. Los anticuerpos híbridos ilustrativos se
describen en el ejemplo 1, que se refiere a productos de PCR procedentes de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo que se clonaron en vectores de expresión que contienen una región constante pesada y una región constante ligera, respectivamente. Los anticuerpos híbridos son sintéticos y de origen no natural porque las regiones variables y constantes que contienen no están aisladas de una única fuente natural.
La expresión proteínas de unión a antígeno "recombinantes", tales como anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se refiere a tales moléculas creadas, expresadas, aisladas u obtenidas mediante tecnologías o métodos conocidos en la materia como tecnología de ADN recombinante que incluye, por ejemplo, corte y empalme de ADN, y expresión transgénica. La expresión incluye anticuerpos expresados en un mamífero no humano (que incluye mamíferos no humanos transgénicos, por ejemplo, ratones transgénicos), o un sistema de expresión de células (por ejemplo, células CHO), o un sistema de expresión de células no humanas, o aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes. En algunas realizaciones, un anticuerpo recombinante comparte una secuencia con un anticuerpo aislado de un organismo (por ejemplo, un ratón o un ser humano), pero se ha expresado mediante tecnología de a Dn recombinante. Dichos anticuerpos pueden tener modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glucosilación) que difieren del anticuerpo aislado del organismo.
Las proteínas de unión a antígeno recombinantes anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno, divulgadas en el presente documento también pueden producirse en un sistema de expresión E. coli/T7. En este aspecto, los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de inmunoglobulina del anticuerpo anti-CoV-S de la divulgación (por ejemplo, como se encuentra en la tabla 1) pueden insertarse en un plásmido basado en pET y expresarse en el sistema E.coli/T7. Por ejemplo, la presente invención incluye métodos para expresar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una cadena de inmunoglobulina del mismo en una célula hospedadora (por ejemplo, célula hospedadora bacteriana tal como E. coli tal como BL21 o BL21DE3) que comprenden la expresión de la ARN polimerasa de T7 en la célula que también incluye un polinucleótido que codifica una cadena de inmunoglobulina que está unida operativamente a un promotor de T7. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, una célula hospedadora bacteriana, tal como una E. coli, incluye un polinucleótido que codifica el gen de la ARN polimerasa de T7 unido operativamente a un promotor lac y la expresión de la polimerasa y la cadena se inducen mediante la incubación de la célula hospedadora con IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido). Véanse los documentos US4952496 y US5693489 o Studier and Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 5 de mayo de 1986; 189(1): 113-30.
Existen varios métodos conocidos en la materia para producir anticuerpos recombinantes. Un ejemplo de un método de producción recombinante de anticuerpos se divulga en el documento US4816567.
La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para introducir polinucleótidos (por ejemplo, ADN o ARN, incluido el ARNm) en una célula hospedadora. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la materia e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o de los polinucleótidos en liposomas, tecnología de nanopartículas lipídicas, inyección biolística y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamífero mediante vectores víricos tales como lentivirus o virus adenoasociados. Los métodos de transformación de células son bien conocidos en la materia. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 y 4.959.455. En algunos aspectos, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación se puede introducir en un sujeto en forma de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN, incluido ARNm), tal que las propias células del sujeto produzcan el anticuerpo. La presente divulgación proporciona además modificaciones de las secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos anti-CoV-S descritos en el presente documento que dan como resultado una mayor expresión del anticuerpo, mayor estabilidad de los anticuerpos, mayor estabilidad del ácido nucleico (por ejemplo, del ARNm) o mejora de la afinidad o especificidad de los anticuerpos para la proteína espicular del CoV.
Por lo tanto, la presente divulgación incluye métodos recombinantes para fabricar una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, tal como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación, o una cadena de inmunoglobulina de la misma, que comprenden (i) introducir uno o más polinucleótidos (por ejemplo, incluida la secuencia de nucleótidos de una cualquiera o más de las secuencias de la tabla 2) que codifican cadenas de inmunoglobulina ligera y/o pesada, o CDR, de la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, de la tabla 1, por ejemplo, en donde el polinucleótido está en un vector; y/o integrado en un cromosoma de la célula hospedadora y/o está unido operativamente a un promotor; (ii) cultivar la célula hospedadora (por ejemplo, CHO o Pichia o Pichia pastoris) en condiciones favorables para la expresión del polinucleótido y, (iii) opcionalmente, aislar la proteína de unión al antígeno, (por ejemplo, anticuerpo o fragmento) o cadena de la célula hospedadora y/o del medio en el que se cultiva la célula hospedadora. Por ejemplo, un polinucleótido se puede integrar en el cromosoma de una célula hospedadora a través de la inserción dirigida con un vector tal como un virus adenoasociado (AAV, del inglés adenoassociated virus), por ejemplo, después de la escisión del cromosoma utilizando un sistema de edición de genes (por ejemplo, CRISPR (por ejemplo, CRlSPR-Cas9), TALEN, megaTAL, dedo de zinc o Argonaute). Se pueden realizar inserciones dirigidas, por ejemplo, en loci de la célula hospedadora tales como un locus genómico de albúmina o inmunoglobulina. De manera alternativa, la inserción puede ser en un locus aleatorio, por ejemplo, utilizando un vector tal como un lentivirus. Cuando se fabrica una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de
unión a antígeno) que comprende más de una cadena de inmunoglobulina, por ejemplo, un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, la expresión conjunta de las cadenas en una sola célula hospedadora conduce a la asociación de las cadenas, por ejemplo, en la célula o en la superficie celular o fuera de la célula si se secretan dichas cadenas, de manera que se forma la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno). Los métodos incluyen aquellos en donde solamente se expresa una cadena pesada de inmunoglobulina o solamente una cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, cualquiera de los analizadas en el presente documento que incluyen fragmentos y/o dominios variables maduros de los mismos). Dichas cadenas son útiles, por ejemplo, como intermediarios en la expresión de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que incluye dicha cadena. Por ejemplo, la presente divulgación también incluye proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una cadena pesada de inmunoglobulina (o un dominio variable de la misma o que comprende las CDR de la misma) codificada por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en la tabla 2 y una cadena ligera de inmunoglobulina (o dominio variable de la misma o que comprende las CDR de la misma) codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en la tabla 2 que son el producto de dichos métodos de producción y, opcionalmente, los métodos de purificación expuestos en el presente documento. Por ejemplo, en algunos aspectos, el producto del método es una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S que es un anticuerpo o fragmento que comprende una HCVR que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la tabla 1 y una LCVR que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la tabla 1, en donde las secuencias de HCVR y LCVR se seleccionan de un solo anticuerpo enumerado en la tabla 1. En algunos aspectos, el producto del método es una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S que es un anticuerpo o fragmento que comprende las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos expuestas en la tabla 1 y las LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos expuestas en la tabla 1, en donde las seis secuencias de CDR se seleccionan de un solo anticuerpo enumerado en la tabla 1. En algunos aspectos, el producto del método es una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S que es un anticuerpo o fragmento que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de HC expuesta en la tabla 1 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de LC expuesta en la tabla 1.
Las células hospedadoras eucariotas y procariotas, incluidas células de mamífero, pueden utilizarse como hospedadores para la expresión de una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S. Dihas células hospedadoras se conocen bien en la materia y muchas están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, del inglés American Type Culture Collection). Estas células hospedadoras incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NS0, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, células HEK-293 y una variedad de otras estirpes celulares. Las células hospedadoras de mamífero incluyen células humanas, de ratón, de rata, de perro, de mono, de cerdo, de cabra, de bóvido, de caballo y de hámster. Otras estirpes celulares que pueden utilizarse son estirpes celulares de insectos (por ejemplo, Spodoptera frugiperda o Trichoplusia ni), células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Las células fúngicas incluyen células de levaduras y de hongos filamentosos que incluyen, por ejemplo, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens y Neurospora crassa. La presente divulgación incluye una célula hospedadora aislada (por ejemplo, una célula CHO) que comprende una proteína de unión a antígeno, tal como las de la tabla 1; o un polinucleótido que codifica dicho polipéptido del mismo.
La expresión "se une de manera específica" se refiere a aquellas proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, mAb) que tienen afinidad de unión por un antígeno, tal como una proteína CoV-S (por ejemplo, SARS-CoV-2-S), expresada como Kd de al menos aproximadamente 10'8 M, medida mediante un ensayo de interferometría de biocapa sin marcadores en tiempo real, por ejemplo, a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, un biosensor Octet® HTX o mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™, o mediante ELISA de afinidad en solución. La presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno que se unen de manera específica a una proteína CoV-S.
Las expresiones "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o proteína de unión a antígeno y similares, como se utilizan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une de manera específica a un antígeno para formar un complejo. Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, como se define en el documento WO08/020079 o en el documento WO09/138519) (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP, del inglés small modular immunopharmaceuticals) y dominios
IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", tal como se utiliza en el presente documento. En un aspecto de la divulgación, el fragmento de unión a antígeno comprende tres o más CDR de un anticuerpo de la tabla 1 (por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3; o CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3).
En un aspecto de la divulgación, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y en general comprenderá al menos una CDR, que esté adyacente o en marco con una o más secuencias marco conservadas. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. De manera alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones ilustrativas no limitantes de dominios variables y constantes que se pueden encontrar en un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluida cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Asimismo, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante enlace o enlaces disulfuro).
Las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno) pueden ser monoespecíficas o multiespecíficas (por ejemplo, biespecíficas). Las proteínas de unión a antígeno multiespecíficas se analizan adicionalmente en el presente documento.
En realizaciones específicas, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden estar conjugados con una fracción tal como un ligando o una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un fármaco antivírico, un segundo anticuerpo antigripe o cualquier otra fracción terapéutica útil para tratar una infección vírica, por ejemplo, una infección vírica de gripe. Véase más adelante.
La presente divulgación proporciona también un complejo que comprende una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, analizada en el presente documento junto con el polipéptido CoV-S o un fragmento antigénico del mismo y/o con un anticuerpo secundario o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, anticuerpo secundario marcado de forma detectable) que se une de manera específica al anticuerpo o fragmento anti-CoV-S. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo o fragmento está in vitro (por ejemplo, está inmovilizado en un sustrato sólido) o está en el cuerpo de un sujeto. En un aspecto de la divulgación, la CoV-S está in vitro (por ejemplo, está inmovilizada en un sustrato sólido) o está en la superficie de un virus o está en el cuerpo de un sujeto. Los anticuerpos anti-CoV-S inmovilizados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que están unidos covalentemente a un material de matriz insoluble (por ejemplo, vidrio o polisacárido tal como agarosa o sefarosa, por ejemplo, una perla u otra partícula de los mismos) son también parte de la presente divulgación; opcionalmente, en donde el anticuerpo inmovilizado está en forma de complejo con la CoV-S o un fragmento antigénico de la misma o un anticuerpo secundario o fragmento del mismo.
Las proteínas de unión a antígeno "aisladas", anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, polipéptidos, polinucleótidos y vectores, están al menos parcialmente libres de otras moléculas biológicas de las células o del cultivo celular a partir del cual se producen. Dichas moléculas biológicas incluyen ácidos nucleicos, proteínas, otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, lípidos, hidratos de carbono u otros materiales, tales como restos celulares y medio de crecimiento. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno aislado puede estar adicionalmente al menos parcialmente libre de componentes del sistema de expresión tales como moléculas biológicas de una célula hospedadora o del medio de crecimiento de la misma. En general, el término "aislado" no pretende referirse a una ausencia total de dichas moléculas biológicas o a una ausencia de agua, tampones, sales o componentes de una formulación farmacéutica que incluye los anticuerpos o fragmentos.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico (por ejemplo, un polipéptido CoV-S) que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una región variable de una molécula de anticuerpo, conocida como un parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a distintas zonas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. El término "epítopo" se refiere también a un lugar en un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen
aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En determinados aspectos, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinados aspectos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.
Los métodos para determinar el epítopo de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpo o fragmento o polipéptido, incluyen el análisis mutacional de rastreo con alanina, el análisis de hibridación de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), el análisis de escisión de péptidos, estudios cristalográficos y el análisis por RMN. Además, se pueden emplear métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Otro método que puede utilizarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interacciona una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento o polipéptido) (por ejemplo, coversina) es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión de la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpo o fragmento o polipéptido, a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína CoV-S/proteína de unión a antígeno se transfiere al agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo del anticuerpo experimentan un intercambio inverso de deuterio a hidrógeno a una velocidad más lenta que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz proteína/proteína de unión a antígeno pueden retener deuterio y por tanto, muestran una masa relativamente mayor en comparación con los aminoácidos no incluidos en la interfaz. Tras la disociación de la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento o polipéptido), la proteína diana se somete a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa la proteína de unión a antígeno. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.
El término "compite", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a un antígeno (por ejemplo, CoV-S) y que inhibe o bloquea la unión de otra proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) al antígeno. El término también incluye la competencia entre dos proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, en ambas orientaciones, es decir, un primer anticuerpo que se une y bloquea la unión de un segundo anticuerpo y viceversa. En determinados aspectos, la primera proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) y la segunda proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) pueden unirse al mismo epítopo. De manera alternativa, las proteínas de unión a antígeno primera y segunda (por ejemplo, anticuerpos) pueden unirse a diferentes, pero, por ejemplo, epítopos que se solapan, en donde la unión a uno inhibe o bloquea la unión del segundo anticuerpo, por ejemplo, a través de impedimento estérico. La competencia entre proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos) puede medirse por métodos conocidos en la materia, por ejemplo, mediante un ensayo de interferometría de biocapa sin marcadores en tiempo real. El mapeo de epítopos (por ejemplo, a través de la exploración de alanina o el intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX)) se puede utilizar para determinar si dos o más anticuerpos no compiten (por ejemplo, en un monómero del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular), compiten por el mismo epítopo o compiten pero con diversos microepítopos (por ejemplo, identificados a través de HDX). En un aspecto de la divulgación, la competencia entre una primera y una segunda proteína de unión al antígeno anti-CoV-S (por ejemplo, un anticuerpo) se determina mediante la medición de la capacidad de una primera proteína de unión a antígeno anti-CoV-S inmovilizada (por ejemplo, un anticuerpo) (que inicialmente no forma complejos con la proteína CoV-S) para unirse a la proteína CoV-S soluble que forma complejo con una segunda proteína de unión a antígeno anti-CoV-S (por ejemplo, un anticuerpo). Una reducción en la capacidad de la primera proteína de unión a antígeno anti-CoV-S (por ejemplo, anticuerpo) para unirse a la proteína CoV-S en forma de complejo, en relación con la proteína CoV-S que no forma complejo, indica que la primera y la segunda proteína de unión a antígeno anti-CoV-S (por ejemplo, anticuerpos) compiten. El grado de competencia se puede expresar como un porcentaje de la reducción en la unión. Dicha competencia se puede medir con un ensayo de interferometría de biocapa sin marcadores en tiempo real, por ejemplo, en un biosensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.), ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas) o SPR (resonancia de plasmón superficial).
La competencia de unión entre proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S (por ejemplo, anticuerpos monoclonales (mAb)) se puede determinar con un ensayo de interferometría de biocapa sin marcadores en tiempo real en un biosensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Por ejemplo, para determinar la competencia entre dos anticuerpos monoclonales anti-CoV-S, el mAb anti-CoV-S se puede capturar primero en puntas de biosensores Octet revestidas de anticuerpos anti-hFc (Pall ForteBio Corp., n.° 18-5060) sumergiendo las puntas en una solución de mAb anti-CoV-S (denominado posteriormente "mAbl"). Como un control positivo para el bloqueo, las puntas de biosensores capturados por anticuerpos, a continuación, pueden saturarse con un mAb de control de isotipo de bloqueo conocido (denominado posteriormente "mAb de bloqueo") mediante inmersión en una solución de mAb de bloqueo. Para determinar si mAb2 compite con mAbl, las puntas del biosensor se pueden sumergir posteriormente en una solución que forma complejo de manera conjunta de polipéptido CoV-S y un segundo mAb anti-CoV-S (en lo sucesivo denominado "mAb2"), que se ha incubado previamente durante un periodo de tiempo y puede determinarse la unión del mAbl al polipéptido CoV-S. Las puntas de biosensores pueden lavarse en tampón entre cada etapa del
experimento. La respuesta de unión en tiempo real puede controlarse durante el curso del experimento y puede registrarse la respuesta de unión al final de cada etapa.
Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, el ensayo de competencia se lleva a cabo a 25 °C y pH alrededor de 7, por ejemplo, 7,4, por ejemplo, en presencia de tampón, sal, disolvente y una proteína no específica (por ejemplo, albúmina de suero bovino).
Normalmente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención que se modifica de alguna manera conserva la capacidad de unirse de manera específica a CoV-S, por ejemplo, conserva al menos un 10 % de su actividad de unión a CoV-S (cuando se compara con el anticuerpo parental) cuando esa actividad se expresa sobre una base molar. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención conserva al menos un 20 %, un 50 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o el 100 % o más de la afinidad de unión a la CoV-S como el anticuerpo original. También se pretende que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención pueda incluir sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas (denominadas "variantes conservativas o "variantes de función conservada" del anticuerpo) que no alteren sustancialmente su actividad biológica.
Una "variante" de un polipéptido, tal como una cadena de inmunoglobulina (por ejemplo, Vh, Vl, HC, o LC de mAb8021, Vh, Vl, HC o LC de mAb8028, o Vh, Vl, HC o LC de mAb8029), se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente de un 70 a un 99,9 % (por ejemplo, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 %) idéntica o similar a una secuencia de aminoácidos de referencia que se expone en el presente documento (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, 10, 18, 20, 22, 30, 38, 40, 42, 50, 58 o 60); cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias correspondientes en toda la longitud de las secuencias de referencia correspondientes (por ejemplo, umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 3; coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; matriz BLOSUM 62; costes por hueco: existencia 11, extensión 1; ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional).
Una "variante" de un polinucleótido se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente de un 70 a un 99,9 % (por ejemplo, al menos aproximadamente 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o 99,9 %) idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia que se expone en el presente documento ( por ejemplo, la SEQ ID NO: 1, 9, 17, 19, 21, 29, 37, 39, 41, 49, 57 o 59); cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias correspondientes en toda la longitud de las secuencias de referencia correspondientes (por ejemplo, umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 28; coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; puntuaciones de coincidencia/falta de coincidencia: 1, -2; costes por hueco: lineal).
Las proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente divulgación, en un aspecto de la divulgación, incluyen una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene al menos un 70 % (por ejemplo, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o más) de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de HCVR expuestas en la tabla 1; y/o una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene al menos un 70 % (por ejemplo, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o más) de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de LCVR expuestas en la tabla 1. En algunos casos, el anticuerpo conserva las secuencias CDR exactas de la tabla 1. En otras palabras, los cambios se encuentran fuera de las regiones CDR. Los anticuerpos variantes normalmente conservan la especificidad de unión junto con determinadas otras propiedades del anticuerpo candidato inicial.
Además, una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S variante puede incluir un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en el presente documento, excepto por una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) mutaciones tales como, por ejemplo, mutaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas), mutaciones finalizadoras, eliminaciones o inserciones. Por ejemplo, la presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno que incluyen una cadena ligera de una inmunoglobulina variante que comprende una secuencia de aminoácidos de LCVR expuesta en la tabla 1 pero que tiene una o más de dichas mutaciones y/o una cadena pesada de inmunoglobulina variante que comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR expuesta en la tabla 1 pero que tiene una o más de dichas mutaciones. En un aspecto de la divulgación, una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S variante incluye una cadena ligera de inmunoglobulina variante que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 en donde una o más (por ejemplo, 1 o 2 o 3) de tales CDR tiene una o más de tales mutaciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) y/o una cadena pesada de inmunoglobulina variante que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 en donde una o más (por ejemplo, 1 o 2 o 3) de tales CDR tiene una o más de tales mutaciones (por ejemplo, sustituciones conservativas). Las sustituciones pueden ser en una CDR, en una región marco o en una región constante. En determinados casos, los anticuerpos de la divulgación conservan las secuencias CDR exactas de la tabla 1 pero pueden tener las mutaciones descritas anteriormente en el resto de la cadena pesada/ligera de HCVR/LCVR. Los anticuerpos variantes pueden conservar las funciones del anticuerpo candidato inicial (véase más adelante).
La divulgación proporciona además proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S variantes, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una o más CDR variantes (por ejemplo, una cualquiera o más de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y/o CDR-H3) que se exponen en el presente documento con al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 99,9 % de identidad de secuencia o similitud con, por ejemplo, las CDR de cadena pesada y cadena ligera de la tabla 1. Una vez más, dichas variantes pueden conservar la función del anticuerpo candidato inicial (véase más adelante).
Algunos aspectos de la presente divulgación incluyen también proteínas de unión a antígeno variantes, por ejemplo, anticuerpos anti-CoV-S y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden Vh y Vl de inmunoglobulina; o HC y LC, que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un 70 % o más (por ejemplo, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o más) de identidad de secuencia de aminoácidos global o de similitud con las secuencias de aminoácidos de las correspondientes Vh, Vl, HC o LC expuestas de manera específica en el presente documento, pero en donde la CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de dichas inmunoglobulinas no son variantes y comprenden la secuencia de aminoácidos de la CDR expuesta en la tabla 1. Por lo tanto, en dichos aspectos, las CDR dentro de proteínas de unión a antígeno variantes no son, en sí mismas, variantes.
Los anticuerpos anti-CoV-S variantes modificados de manera conservativa y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos también son parte de la presente invención. Una "variante modificada de manera conservativa" o una "sustitución conservativa" se refiere a una variante en donde hay una o más sustituciones de aminoácidos en un polipéptido con otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de la cadena lateral, hidrofobia/hidrofilia, conformación y rigidez de la cadena principal, etc.). Tales cambios se pueden realizar con frecuencia sin alterar de manera significativa la actividad biológica del anticuerpo o fragmento. Los expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4.a Ed.)). Además, las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidades de alterar la actividad biológica de manera significativa.
Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. De manera alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345.
Las variantes de función conservativa de los anticuerpos anti-CoV-S y de los fragmentos de unión a antígeno de los mismos también forman parte de la presente invención. Cualquiera de las variantes de los anticuerpos anti-CoV-S y de los fragmentos de unión a antígeno de los mismos (como se analiza en el presente documento) pueden ser "variantes de función conservativa". Tales variantes de función conservativa pueden, en algunos casos, caracterizarse también como variantes modificadas de forma conservativa. "Variantes de función conservativa", como se utiliza en el presente documento, se refiere a variantes de los anticuerpos anti-CoV-S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en los que uno o más restos de aminoácidos se han cambiado sin alterar significativamente una o más propiedades funcionales del anticuerpo o fragmento. En una realización de la invención, un anticuerpo anti-CoV-S variante de función conservativa o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos variante y presenta una o más de las siguientes propiedades funcionales:
• Inhibe el crecimiento del coronavirus (por ejemplo, del SARS-CoV-2, del SARS-CoV y/o del MERS-CoV) en células que expresan ACE2 y/o TMPRSS2 (por ejemplo, células Calu-3);
• No se une significativamente a células MDCK/Tet-on que no expresan ACE2 y/o TMPRSS2;
• Limita la propagación de la infección por coronavirus (por ejemplo, por SARS-CoV-2, por SARS-CoV y/o por MERS-CoV) de las células, por ejemplo, Calu-3, in vitro; y/o
• Protege a un ratón genomanipulado para expresar la proteína humana TMPRSS2 y/o ACE2 de la muerte provocada por una infección por coronavirus (por ejemplo, por SARS-CoV-2, por SARS-CoV o por MERS-CoV), por ejemplo, en donde se infecta a los ratones con una dosis del virus de otro modo letal, opcionalmente cuando se combina con un segundo producto terapéutico.
• Protege a un ratón genomanipulado para expresar la proteína humana TMPRSS2 y/o ACE2 de la pérdida de peso provocada por la infección por coronavirus (por ejemplo, por SARS-CoV-2, por SARS-CoV o por MERS-CoV), por ejemplo, en donde se infecta a los ratones con una dosis del virus que, de otro modo, provocaría pérdida de peso, opcionalmente cuando se combina con un segundo producto terapéutico.
• En algunas ocasiones, un anticuerpo puede tener las secuencias CDR del anticuerpo candidato inicial y ser un
anticuerpo conservado funcionalmente. Por ejemplo, un anticuerpo de la divulgación puede comprender las seis secuencias CDR del anticuerpo mAb10933 y (i) presentar una potencia de neutralización (CI50) contra pseudopartículas VSV-SARS-CoV-2-S de tipo silvestre en células Vero inferior a 50 pM (por ejemplo, como en el ejemplo 12), (ii) presentar una neutralización relativa de las variantes de VSV-SARS-CoV-2 que codifican la proteína S de al menos un 95 % en comparación con el tipo silvestre (por ejemplo, de las variantes identificadas en la tabla 27 del ejemplo 12), (iii) presentar una potencia de neutralización (CI50) contra variantes de VSV-SARS-CoV-2 que codifican la proteína espicular inferior a 150 pM (por ejemplo, las variantes identificadas en la tabla 28 del ejemplo 12), (iv) presentar una potencia de bloqueo (CI50) inferior a 7,1 pM (por ejemplo, inferior a 7,0 pM, inferior a 6,5 pM, inferior a 6,0 pM, inferior a 5,5 pM, inferior a 5,0 pM, inferior a 4,5 pM o inferior a 4,0 pM) en un ensayo basado en ELISA que mide la capacidad del anticuerpo para bloquear la unión del RBD de la proteína SARS-CoV-2 S a la ACE2 humana (por ejemplo, como en el ejemplo 14), y/o (v) presentar una neutralización del virus SARS-CoV-2 vivo. De manera similar, un anticuerpo puede comprender las seis secuencias CDR del anticuerpo mAb10987 y (i) presentar una potencia de neutralización (CI50) contra pseudopartículas VSV-SARS-CoV-2-S de tipo silvestre en células Vero inferior a 50 pM (por ejemplo, como en el ejemplo 12), (ii) presentar una neutralización relativa de las variantes de VSV-SARS-CoV-2 que codifican la proteína espicular de al menos un 95 % en comparación con el tipo silvestre (por ejemplo, de las variantes identificadas en la tabla 27 del ejemplo 12), (iii) presentar una potencia de neutralización (CI50) contra variantes de VSV-SARS-CoV-2 que codifican la proteína S inferior a 55 pM (por ejemplo, las variantes identificadas en la tabla 28 del ejemplo 12), (iv) presentar una potencia de bloqueo (CI50) inferior a 185 pM (por ejemplo, inferior a 180 pM, inferior a 170 pM, inferior a 160 pM, inferior a 150 pM, inferior a 140 pM, inferior a 130 pM, inferior a 120 pM, inferior a 110 pM, inferior a 100 pM o inferior a 90 pM) en un ensayo basado en ELISA que mide la capacidad del anticuerpo para bloquear la unión del RBD de la proteína SARS-CoV-2 S a la ACE2 humana (por ejemplo, como en el ejemplo 14), y/o (v) presentar una neutralización del virus vivo. Estas propiedades también se aplican a las variantes de los anticuerpos 10933 y 10987.
Una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S "neutralizante" o "antagonista", por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, se refiere a una molécula que inhibe una actividad de la CoV-S en cualquier grado detectable, por ejemplo, inhibe la capacidad de la CoV-S para unirse a un receptor tal como ACE2, para ser escindida por una proteasa tal como TMPRSS2, o para mediar la entrada del virus en una célula hospedadora o la reproducción vírica en una célula hospedadora.
La tabla 1 se refiere a proteínas de unión a antígeno, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden la cadena pesada o Vh (o una variante de la misma) y la cadena ligera o Vl (o una variante de la misma) como se expone más adelante; o que comprenden una Vh que comprende las CDR de la misma (CDR-H1 (o una variante de la misma), CDR-H2 (o una variante de la misma) y CDR-H3 (o una variante de la misma)) y una Vl que comprende las CDR de la misma (CDR-L1 (o una variante de la misma), CDR-L2 (o una variante de la misma) y CDR-L3 (o una variante de la misma)), por ejemplo, en donde las cadenas de inmunoglobulina, las regiones variables y/o las CDR comprenden las secuencias de aminoácidos específicas descritas más adelante.
Los anticuerpos descritos en el presente documento también incluyen realizaciones en donde la Vh se fusiona con una IgG4 de tipo silvestre (por ejemplo, en donde el resto 108 es S) o con variantes de IgG4 (por ejemplo, en donde el resto 108 es P).
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención comprenden cadenas de inmunoglobulina que incluyen las secuencias de aminoácidos de la invención así como modificaciones postraduccionales celulares e in vitro del anticuerpo. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen de manera específica a CoV-S que comprende secuencias de aminoácidos de cadena pesada y/o ligera expuestas en el presente documento (por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y/o CDR-L3), así como anticuerpos y fragmentos en donde uno o más restos de aminoácidos está glucosilado, uno o más restos Asn está desamidado, uno o más restos (por ejemplo, Met, Trp y/o His) está oxidado, la Gln del extremo N es piroglutamato (pyroE) y/o la lisina del extremo C está ausente.
Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de los anticuerpos ilustrativos contra la proteína espicular SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) se muestran en la tabla de secuencias ilustrativas, a continuación.
Tabla de secuencias ilustrativas
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Administración de Anticuerpos
La presente divulgación proporciona métodos para administrar una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S de la presente divulgación, por ejemplo, las de la tabla 1, que comprenden introducir la proteína de unión a antígeno en el cuerpo de un sujeto (por ejemplo, un ser humano). Por ejemplo, el método comprende perforar el cuerpo del sujeto con una aguja de una jeringuilla e inyectar la proteína de unión a antígeno en el cuerpo del sujeto, por ejemplo, en la vena, arteria, tumor, tejido muscular o hipodermis del sujeto.
La presente divulgación proporciona un recipiente (por ejemplo, un vial de plástico o vidrio, por ejemplo, con una tapa o una columna de cromatografía, aguja hueca o un cilindro de jeringuilla) que comprende una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S de la presente divulgación, por ejemplo, las de la tabla 1.
La presente divulgación también proporciona un dispositivo de inyección que comprende una o más proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno) que se une de manera específica a CoV-S, por ejemplo, las de la tabla 1, o una composición farmacéutica de las mismas. El dispositivo de inyección puede envasarse en un kit. Un dispositivo de inyección es un dispositivo que introduce una sustancia en el cuerpo de un sujeto a través de una vía parenteral, por ejemplo, intramuscular, subcutánea o intravenosa. Por ejemplo, un dispositivo de inyección puede ser una jeringa (por ejemplo, precargada con la composición farmacéutica, tal como un autoinyector) que, por ejemplo, incluye un cilindro o barril para contener el líquido que se va a inyectar (por ejemplo, que comprende el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo), una aguja para perforar la piel y/o los vasos sanguíneos para la inyección del líquido; y un émbolo para empujar el líquido fuera del cilindro y a través del orificio de la aguja. En un aspecto de la divulgación, un dispositivo de inyección que comprende una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de una combinación de la presente divulgación o una composición farmacéutica de la misma puede ser un dispositivo de inyección intravenosa (i.v.). Tal dispositivo puede incluir la proteína de unión a antígeno o una composición farmacéutica de la misma en una cánula o trocar/aguja que se puede fijar a un tubo que se puede fijar a una bolsa o depósito para contener líquido (por ejemplo, solución salina) introducido en el cuerpo del sujeto a través de la cánula o trocar/aguja. El anticuerpo o fragmento o
una composición farmacéutica del mismo puede, en un aspecto de la divulgación, introducirse en el dispositivo una vez que el trocar y la cánula se insertan en la vena de un sujeto y el trocar se retira de la cánula insertada. El dispositivo intravenoso puede, por ejemplo, insertarse en una vena periférica (por ejemplo, en la mano o el brazo); la vena cava superior o la vena cava inferior o dentro de la aurícula derecha del corazón (por ejemplo, una vía i.v. central); o en una subclavia, yugular interna o una vena femoral y, por ejemplo, hacerse avanzar hacia el corazón hasta alcanzar la vena cava superior o la aurícula derecha (por ejemplo, una línea venosa central). En un aspecto de la divulgación, un dispositivo de inyección es un autoinyector; un inyector de chorro o una bomba de infusión externa. Un inyector de chorro utiliza un chorro estrecho de líquido a alta presión que penetra en la epidermis para introducir el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en el cuerpo de un sujeto. Las bombas de infusión externas son dispositivos médicos que suministran el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en el cuerpo de sujeto en cantidades controladas. Las bombas de infusión externas pueden accionarse eléctrica o mecánicamente. Las diferentes bombas funcionan de diferentes formas, por ejemplo, una bomba de jeringa contiene líquido en el depósito de una jeringa, y un pistón móvil controla el suministro de líquido, una bomba elastomérica contiene el líquido en un depósito de globo extensible y la presión de las paredes elásticas del globo impulsa el suministro de líquido. En una bomba peristáltica, un juego de rodillos aprieta un tramo de tubo flexible, empujando el líquido hacia adelante. En una bomba multicanal, los líquidos se pueden suministrar desde múltiples depósitos a múltiples velocidades.
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos se conocen en la materia. Cualquier método conocido de este tipo se puede utilizar en el contexto de la presente divulgación para producir anticuerpos humanos que se unan de manera específica a la CoV-S. Se puede utilizar un inmunógeno que comprenda uno cualquiera de los siguientes para generar anticuerpos contra la CoV-S. En determinados aspectos de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación se obtienen de ratones inmunizados con una CoV-S nativa de longitud completa, o con un virus vivo atenuado o inactivado, o con ADN que codifica la proteína o fragmento de la misma. De manera alternativa, la proteína CoV-S o un fragmento de la misma puede producirse utilizando técnicas bioquímicas convencionales y modificarse y utilizarse como un inmunógeno. En un aspecto de la divulgación, el inmunógeno es una proteína CoV-S, o fragmento de la misma, producida de forma recombinante. En determinados aspectos de la divulgación, el inmunógeno puede ser una vacuna contra el polipéptido CoV-S. En determinados aspectos, se pueden administrar una o más inyecciones de refuerzo. En determinados aspectos, el inmunógeno puede ser un polipéptido CoV-S recombinante expresado en E. coli o en cualquier otra célula eucariota o de mamífero tal como células de ovario de hámster chino (CHO).
Cuando se utiliza tecnología VELOCIMMUNE® (véase, por ejemplo, el documento US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra la CoV-S se pueden aislar inicialmente con una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a loci endógenos de región constante de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al a Dn que codifica las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas. A continuación, el ADN se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano.
En general, un ratón VELOCIMMUNE® se expone al antígeno de interés y se recuperan las células linfáticas (tal como linfocitos B) de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una estirpe celular de mieloma para preparar estirpes celulares de hibridoma inmortales y dichas estirpes celulares de hibridoma se detectan de manera sistemática y seleccionan para identificar estirpes celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicho un anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. De manera alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.
Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo totalmente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
Anticuerpos antiproteína espicular del coronavirus que comprenden variantes Fc
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, es decir, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, que comprenden un dominio Fc que comprende
una o más mutaciones, que, por ejemplo, potencian o disminuyen la unión de anticuerpos al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-CoV-S que comprenden una mutación en la región Ch2 o Ch3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por el FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, m 428L) y en 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y una en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P). En otra realización más, la modificación comprende una modificación en 265A (por ejemplo, D265A) y/o en 297A (por ejemplo, N297A).
Por ejemplo, la presente invención incluye proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, es decir, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); 257I y 311I (por ejemplo, P257I y Q311I); 257I y 434H (por ejemplo, P257I y N434H); 376V y 434H (por ejemplo, D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (por ejemplo, T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F).
Las proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una Vh y/o Vl como se expone en el presente documento que comprenden cualesquier posible combinación de las mutaciones del dominio Fc anteriores, se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-CoV-S o fragmentos de unión a antígeno, que comprenden una Vh de la invención y una región constante de cadena pesada (Ch) quimérica, en donde la región Ch quimérica comprende segmentos procedentes de las regiones Ch de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región Ch quimérica que comprende parte o todo el dominio Ch2 procedente de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio Ch3 procedente de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región Ch quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (restos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) procedente de una región bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana, en combinación con una secuencia de "bisagra inferior" (restos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) procedente de una región bisagra de una IgG1 humana, una IgG2 humana o una IgG4 humana. De acuerdo con determinadas realizaciones, la región bisagra quimérica comprende restos de aminoácidos procedentes de una bisagra superior de IgG1 humana o IgG4 humana y restos de aminoácidos procedentes de una bisagra inferior de IgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región Ch quimérica como se describe en el presente documento puede, en determinadas realizaciones, presentar funciones efectoras de Fc modificadas sin afectar negativamente a las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo. (Véase, por ejemplo, el documento WO2014/022540).
Inmunoconjugados
La invención abarca proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, es decir, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, conjugadas con otra fracción, por ejemplo, una fracción terapéutica (un "inmunoconjugado"), tal como un toxoide o un fármaco antivíri
fragmento anti-CoV-S está conjugado con cualquiera de los productos terapéuticos adicionales expuestos en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que está química o biológicamente unido a un agente radiactivo, una citocina, un interferón, una diana o fracción indicadora, una enzima, un péptido o proteína o un producto terapéutico. La proteína de unión a antígeno puede estar unida al agente radiactivo, citocina, interferón, diana o fracción indicadora, enzima, péptido o producto terapéutico en cualquier lugar a lo largo de la molécula siempre que sea capaz de unirse a su diana (CoV-S). Los ejemplos de inmunoconjugados incluyen conjugados de anticuerpo y fármaco, y proteínas de fusión anticuerpo-toxina. En una realización de la invención, el agente puede ser un segundo anticuerpo diferente que se une de manera específica a CoV-S. El tipo de fracción terapéutica que puede conjugarse con el anticuerpo o fragmento anti-CoV-S tendrá en cuenta la afección que se va a tratar y el efecto terapéutico deseado que se va a lograr. Véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of
Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 1984: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Anticuerpos multiespecíficos
La presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como métodos de uso y métodos de fabricación de dichas proteínas de unión a antígeno. La expresión proteínas de unión a antígeno "anti-CoV-S", por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, incluye moléculas multiespecíficas (por ejemplo, biespecíficas o biparatópicas) que incluyen al menos un primer dominio de unión a antígeno que se une de manera específica a CoV-S (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de la tabla 1) y al menos un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno diferente o a un epítopo en CoV-S que es diferente al del primer dominio de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno se seleccionan ambos de los dominios de unión a antígeno de la tabla 1. En un aspecto de la divulgación, el primer y segundo epítopo se solapan. En otro aspecto de la divulgación, el primer y segundo epítopo no se solapan. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, un anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG biespecífico (por ejemplo, IgG1 o IgG4) que incluye un primer dominio de unión a antígeno que se une de manera específica a CoV-S, que incluye la cadena de inmunoglobulina pesada y ligera de un anticuerpo de la tabla 1, y un segundo dominio de unión a antígeno que se une de manera específica a un epítopo diferente de CoV-S. En algunas realizaciones, un anticuerpo IgG biespecífico (por ejemplo, IgG1 o IgG4) incluye un primer dominio de unión a antígeno que se une de manera específica a CoV-S y un segundo dominio de unión que se une a una proteína de la célula hospedadora, por ejemplo, ACE2 o TMPRSS2.
Los anticuerpos de la tabla 1 incluyen moléculas multiespecíficas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, que incluyen las CDR-Hs y CDR-Ls, Vh y Vl, o HC y LC de esos anticuerpos, respectivamente (incluyendo variantes de los mismos como se expone en el presente documento).
En un aspecto de la divulgación, un dominio de unión a antígeno que se une de manera específica a la CoV-S, que puede incluirse en una molécula multiespecífica, comprende:
(1)
(i) una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 expuestas en la tabla 1, y
(ii) una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 expuestas en la tabla 1;
o,
(2)
(i) una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la tabla 1 y
(ii) una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la tabla 1;
o,
(3)
(i) una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la tabla 1 y
(ii) una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la tabla 1.
En una realización de la invención, el anticuerpo o fragmento multiespecífico incluye más de dos especificidades de unión distintas (por ejemplo, una molécula triespecífica), por ejemplo, uno o más dominios de unión a antígeno adicionales que son los mismos o diferentes del primer y/o segundo dominio de unión a antígeno.
En un aspecto de la divulgación, un fragmento de unión a antígeno biespecífico comprende un primer scFv (por ejemplo, que comprende secuencias Vh y Vl de la tabla 1) que tienen especificidad de unión por un primer epítopo (por ejemplo, CoV-S) y un segundo scFv que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo diferente. Por ejemplo, en una realización de la invención, el primer y segundo scFv están unidos con un enlazador, por ejemplo, un enlazador peptídico (por ejemplo, un enlazador GS tal como (GGGGS)n (SEQ ID NO: 834) en donde n es, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). Otros fragmentos de unión a antígeno biespecíficos incluyen un F(ab)2 de un anticuerpo IgG biespecífico que comprende las CDR de cadenas pesada y ligera de la tabla 1 y de otro anticuerpo que se une a
un epítopo diferente.
Métodos terapéuticos
La presente divulgación proporciona métodos para tratar o prevenir una infección vírica (por ejemplo, infección por coronavirus) mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, (por ejemplo, de la tabla 1) a un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que necesite dicho tratamiento o prevención.
La infección por coronavirus se puede tratar o prevenir, en un sujeto, mediante la administración de una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S de la presente invención a un sujeto.
Una dosis eficaz o terapéuticamente eficaz de la proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, de la tabla 1), para tratar o prevenir una infección vírica se refiere a la cantidad del anticuerpo o fragmento suficiente para aliviar uno o más signos y/o síntomas de la infección en el sujeto tratado, ya sea mediante la inducción de la regresión o eliminación de dichos signos y/o síntomas o mediante la inhibición de la progresión de dichos signos y/o síntomas. La cantidad de dosis puede variar dependiendo de la edad y el tamaño del sujeto a recibir la administración, la enfermedad diana, afecciones, la vía de administración y similares. En un aspecto de la divulgación, una dosis eficaz o terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, para tratar o prevenir una infección vírica, por ejemplo, en un sujeto humano adulto, es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 200 mg/kg, por ejemplo, hasta aproximadamente 150 mg/kg. En un aspecto de la divulgación, la dosificación es de hasta aproximadamente 10,8 u 11 gramos (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 gramos). Dependiendo de la gravedad de la infección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En determinados aspectos, la proteína de unión a antígeno de la presente invención puede administrarse en una dosis inicial, seguida de una o más dosis secundarias. En determinados aspectos, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en donde las dosis posteriores están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.
Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero (por ejemplo, rata, ratón, gato, perro, vaca, cerdo, oveja, caballo, cabra o conejo), preferentemente un ser humano, por ejemplo, que necesite prevenir y/o tratar una enfermedad o trastorno tal como una infección vírica o un cáncer. El sujeto puede tener una infección vírica, por ejemplo, una infección de gripe o estar predispuesto a desarrollar una infección. Los sujetos predispuestos a desarrollar una infección o los sujetos que pueden estar en riesgo elevado de contraer una infección (por ejemplo, por el virus de la gripe o por el coronavirus), incluyen sujetos con sistemas inmunitarios comprometidos debido a una enfermedad autoinmunitaria, sujetos que reciben terapia inmunosupresora (por ejemplo, tras un trasplante de órgano), sujetos afectados por el síndrome de inmunodeficiencia humana (VIH) o el síndrome de deficiencia inmune adquirida (SIDA), sujetos con formas de anemia que disminuye o destruye glóbulos blancos de la sangre, sujetos que reciben radiación o quimioterapia, o sujetos afectados por un trastorno inflamatorio. De manera adicional, los sujetos muy jóvenes (por ejemplo, 5 años de edad o más jóvenes) o de edad avanzada (por ejemplo, 65 años de edad o mayores) están en riesgo aumentado. Asimismo, un sujeto puede estar en riesgo de contraer una infección vírica debido a la proximidad de un brote de la enfermedad, por ejemplo, el sujeto reside en una ciudad densamente poblada o muy cerca de sujetos que tienen infecciones confirmadas de un virus o la sospecha de las mismas o cambia de empleo, por ejemplo, un trabajador de hospital, investigador farmacéutico, viajero a un área infectada o pasajero de avión frecuente.
"Tratar" o "que se trata" significa administrar una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, de la tabla 1), a un sujeto que tiene uno o más signos o síntomas de una enfermedad o infección, por ejemplo, infección vírica, para la que la proteína de unión a antígeno es eficaz cuando se administrarse al sujeto en una cantidad o dosis eficaz o terapéuticamente eficaz (como se analiza en el presente documento).
La presente divulgación también abarca la administración profiláctica de una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, de la tabla 1), a un sujeto que está en riesgo de contraer una infección vírica de manera que se previene tal infección. La inmunoprofilaxis pasiva basada en anticuerpos ha demostrado ser una estrategia eficaz para prevenir al sujeto de una infección vírica. Véanse, por ejemplo, Berry et al., Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis. Influenza Res Treat. 2014; 2014:267594. Epub 22 de septiembre de 2014; y Jianqiang et al., Passive immune neutralization strategies for prevention and control of influenza A infections, Immunotherapy. Febrero de 2012; 4(2): 175-186; Prabhu et al., Antivir Ther. 2009;14(7):911-21, Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenza. "Prevenir" o "que previene" significa administrar una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, de la tabla 1), a un sujeto para inhibir la manifestación de una enfermedad o infección (por ejemplo, infección vírica)
en el cuerpo de un sujeto, para la que la proteína de unión a antígeno es eficaz cuando se administrarse al sujeto en una cantidad o dosis eficaz o terapéuticamente eficaz (como se analiza en el presente documento).
En un aspecto de la divulgación, un signo o síntoma de una infección vírica en un sujeto es la supervivencia o proliferación de virus en el cuerpo del sujeto, por ejemplo, según lo determinado por un ensayo de cantidad de virus (por ejemplo, propagación de coronavirus en huevos de pollo embrionados o ensayo de la proteína espicular de coronavirus). En el presente documento se discuten otros signos y síntomas de infección vírica.
Como se ha indicado anteriormente, en algunos aspectos, el sujeto puede ser un animal no humano, y las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno) indicadas en el presente documento pueden utilizarse en un contexto veterinario para tratar y/o prevenir enfermedades en animales no humanos. (por ejemplo, gatos, perros, cerdos, vacas, caballos, cabras, conejos, ovejas y similares).
La presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir una infección vírica (por ejemplo, infección por coronavirus) o para inducir la regresión, eliminación o inhibición de la progresión de al menos un signo o síntoma de la infección vírica, tal como:
fiebre o sensación de fiebre/escalofríos;
tos;
dolor de garganta;
rinorrea o congestión nasal;
estornudos;
dolores muscular o corporales;
dolores de cabeza;
cansancio (fatiga);
vómitos;
diarrea;
infección del tracto respiratorio;
molestias en el pecho;
dificultad para respirar;
bronquitis; y/o
neumonía,
que son un signo o síntoma secundario de infección vírica, en un sujeto que lo necesite (por ejemplo, un ser humano), mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína de unión a antígeno anti-CoV-S (por ejemplo, de la tabla 1) al sujeto, por ejemplo, mediante la inyección de la proteína en el cuerpo del sujeto.
Combinaciones y composiciones farmacéuticas
Para preparar composiciones farmacéuticas de las proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, de la tabla 1), se mezcla la proteína de unión a antígeno con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences y U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y. En una realización de la invención, la composición farmacéutica es estéril. Tales composiciones son parte de la presente invención.
El alcance de la presente divulgación incluye composiciones desecadas, por ejemplo, liofilizadas, que comprenden proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, de la tabla 1) o una composición farmacéutica de las mismas que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable pero que sustancialmente carece de agua.
En un aspecto adicional de la divulgación, un producto terapéutico adicional que se administra a un sujeto en asociación con una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, de la tabla 1), divulgado en el presente documento se administra al sujeto de acuerdo con la Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57.a edición (1 de noviembre de 2002)).
El modo de administración puede variar. Las vías de administración incluyen oral, rectal, transmucosa, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutánea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalación, insuflación, tópica, cutánea, transdérmica o intraarterial.
La presente divulgación proporciona métodos para administrar una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por
ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, de la tabla 1), que comprende introducir la proteína en el cuerpo de un sujeto. Por ejemplo, el método comprende perforar el cuerpo del sujeto con una aguja de una jeringuilla e inyectar la proteína de unión a antígeno en el cuerpo del sujeto, por ejemplo, en la vena, arteria, tumor, tejido muscular o hipodermis del sujeto.
La presente divulgación proporciona un recipiente (por ejemplo, un vial de plástico o vidrio, por ejemplo, con una tapa o una columna de cromatografía, una aguja hueca o un cilindro de jeringuilla) que comprende cualquiera de las proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, de la tabla 1), polipéptidos (por ejemplo, una HC, CL, Vh o Vl de la tabla 1) o polinucleótidos (por ejemplo, de la tabla 2) o vectores expuestos en el presente documento o una composición farmacéutica de los mismos que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto de la presente divulgación, una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación (por ejemplo, de la tabla 1), se administra en asociación con uno o más productos terapéuticos adicionales. Otro producto terapéutico adicional incluye, pero no se limita a: un antinflamatorio, un antipalúdico, un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica a TMPRSS2, y un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une de manera específica a CoV-S. En algunos aspectos, un antipalúdico es la cloroquina o la hidroxicloroquina. En algunos aspectos, un antinflamatorio es un anticuerpo tal como sarilumab, tocilizumab o gimsilumab. En algunos aspectos, el producto terapéutico adicional es un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno divulgado en el presente documento, por ejemplo, de la tabla 1. En determinados aspectos, uno, dos, tres, cuatro o más anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la tabla 1 se pueden administrar en combinación (por ejemplo, simultáneamente o secuencialmente). Las combinaciones particulares de anticuerpos de la tabla 1 se enumeran en la tabla de combinaciones de anticuerpos ilustrativas, a continuación (cada número representa una combinación específica, por ejemplo, mAb10989 y mAb10987 es la combinación 1, mAb10989 y mAb10934 es la combinación 2 y así sucesivamente). En algunos aspectos, se puede seleccionar una combinación de anticuerpos entre los que se unen a diferentes grupos de epítopos. Por ejemplo, determinados anticuerpos descritos en el presente documento pertenecen a grupos de epítopos de la siguiente manera: grupo 1, mAb10987, mAb10922, mAb10936 y mAb10934; grupo 2, mAb10989, mAb10977 y mAb10933; grupo 3, mAb10920; grupo 4, mAb10954, mAb10986 y mAb10964; y grupo 5, mAb10984. Por lo tanto, se puede seleccionar una combinación de dos anticuerpos de, por ejemplo, grupo 1 y grupo 2, grupo 1 y grupo 3, grupo 1 y grupo 4, grupo 1 y grupo 5, grupo 2 y grupo 3, grupo 2 y grupo 4, grupo 2 y grupo 5, grupo 3 y grupo 4, grupo 3 y grupo 5, y grupo 4 y grupo 5. En algunos aspectos, un anticuerpo que se une de manera específica a TMPRSS2 es H1H7017N, como se describe en la publicación de patente internacional n.° WO/2019/147831.
En algunos aspectos, se pueden combinar proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S (por ejemplo, anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) de diferentes donantes humanos. La presente divulgación incluye una composición que comprende dos (o más) anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S o fragmentos de unión a antígeno que comprenden dominios variables de sujetos humanos, en donde los dos (o más) anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno proceden de diferentes sujetos (por ejemplo, dos sujetos humanos diferentes). Se indican las regiones variables de anticuerpos procedentes de linfocitos B humanos, por ejemplo, en los ejemplos 1 y 2 (Tabla 3), que describen que los dominios variables clonados de dichos linfocitos B se combinan con una región constante que no es de esos linfocitos B para producir anticuerpos híbridos. La fuente (donante) de dichas regiones variables de anticuerpos se muestra en la tabla de regiones variables de anticuerpos procedentes de seres humanos ilustrativas, más adelante. En algunos aspectos, una composición puede comprender una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con dominios variables procedentes del donante 1 y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con dominios variables procedentes del donante 2. En algunos aspectos, una composición puede comprender una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con dominios variables procedentes del donante 1 y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con dominios variables procedentes del donante 3. En algunos aspectos, una composición puede comprender una combinación de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con dominios variables procedentes del donante 2 y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo con dominios variables procedentes del donante 3. En algunos aspectos, una composición puede comprender una combinación de mAb10987 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende las CDR, las regiones variables o las secuencias de cadena pesada y ligera que se muestran en la tabla 1) del donante 1 y de mAb10989 (por ejemplo, un anticuerpo que comprende las CDR, las regiones variables o las secuencias de cadena pesada y ligera que se muestran en la tabla 1) del donante 3.
Tabla de regiones variables de anticuerpos procedentes de seres humanos ilustrativas mAb Donante
mAb10954 Donante 3
mAb10955 Donante 3
mAb10956 Donante 3
mAb10957 Donante 3
mAb10964 Donante 1
mAb10965 Donante 2
mAb10966 Donante 3
mAb10967 Donante 3
mAb10970 Donante 1
mAb10971 Donante 1
mAb10977 Donante 1
mAb10984 Donante 1
mAb10985 Donante 1
mAb10986 Donante 1
mAb10987 Donante 1
mAb10988 Donante 3
mAb10989 Donante 3
mAb10969 Donante 1
En algunos aspectos, el producto terapéutico adicional es un fármaco antivírico y/o una vacuna. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "fármaco antivírico" se refiere a cualquier terapia o fármaco antinfeccioso que se utiliza para tratar, prevenir o mejorar una infección vírica en un sujeto. La expresión "fármaco antivírico" incluye, pero no se limita a un antimicrobiano esteroide catiónico, leupeptina, aprotinina, ribavirina o interferón-alfa2b. Los métodos para tratar o prevenir la infección por virus (por ejemplo, coronavirus) en un sujeto que necesita dicho tratamiento o prevención mediante la administración de un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de la tabla 1 en asociación con un producto terapéutico adicional, son parte de la presente divulgación.
Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, el otro producto terapéutico es una vacuna, por ejemplo, una vacuna contra el coronavirus. En un aspecto de la divulgación, una vacuna es una vacuna de virus inactivados/muertos, una vacuna de virus vivos atenuados o una vacuna de subunidades de virus.
Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, el producto terapéutico adicional es:
(mesilato de camostat);
(mesilato de nafamostat);
(clorhidrato de bromhexina (BHH));
(clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminometil)bencenosulfonilo (AEBSF));
(poliamida). Véase Shen et al. Biochimie 142: 1-10 (2017).
En un aspecto de la divulgación, el fármaco antivírico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une de manera específica a un coronavirus, por ejemplo, el SARS-CoV-2, el SARS-CoV o el MERS-CoV. Los ejemplos de anticuerpos anti-CoV-S incluyen, pero no se limita a: H4sH15188P; H1H15188P; H1H15211P; H1H15177P; H4sH15211P; H1H15260P2; H1H15259P2; H1H15203P; H4sH15260P2; H4sH15231P2; H1H15237P2; H1H15208P; H1H15228P2; H1H15233P2; H1H15264P2; H1H15231P2; H1H15253P2; H1H15215P; y H1H15249P2, como se expone en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO/2015/179535, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, en donde el anticuerpo o fragmento comprende una cadena ligera de inmunoglobulina que incluye CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 (por ejemplo, la cadena Vl o ligera de la misma); y una cadena pesada que incluye CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 (por ejemplo, la Vh o cadena pesada de la misma) de cualquiera de los anticuerpos anti-CoV-S anteriores.
En determinado aspecto de la divulgación, el producto terapéutico adicional no es aprotinina, leupeptina, un antimicrobiano esteroideo catiónico, una vacuna de la gripe (por ejemplo, una vacuna de virus enteros muertos, vivos, atenuados o de subunidades) o un anticuerpo contra el virus de la gripe (por ejemplo, un anticuerpo antihemaglutinina).
La expresión "en asociación con" indica que los componentes, una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, junto con otro agente, pueden formularse en una sola composición, por ejemplo, para suministro simultáneo o formularse por separado en dos o más composiciones (por ejemplo, un kit). Cada componente se puede administrar a un sujeto en un momento diferente al momento cuando se administra el otro componente; por ejemplo, cada administración puede darse de manera no simultánea (por ejemplo, por separado o de manera secuencial) a intervalos durante un período de tiempo determinado. Asimismo, los componentes separados pueden administrarse a un sujeto por la misma vía o una diferente (por ejemplo, en donde un anticuerpo anti-CoV-S o fragmento de unión a antígeno del mismo).
Kits
Se proporcionan además kits que comprenden uno o más componentes que incluyen, pero sin limitación, una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se indica en el presente documento (por ejemplo, de la tabla 1), en asociación con uno o más componentes adicionales que incluyen, pero sin limitación, un producto terapéutico adicional, como se indica en el presente documento. La proteína de unión
a antígeno y/o el producto terapéutico adicional se puede formular como una composición única o por separado en dos o más composiciones, por ejemplo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una composición farmacéutica.
En un aspecto de la divulgación, el kit incluye una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación (por ejemplo, de la tabla 1) o una composición farmacéutica del mismo en un recipiente (por ejemplo, en un vial de vidrio o plástico estéril) y un producto terapéutico adicional en otro recipiente (por ejemplo, en un vial de vidrio o plástico estéril).
En otra realización, el kit comprende una combinación de la divulgación, que incluye una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la divulgación (por ejemplo, de la tabla 1) o composición farmacéutica del mismo en combinación con uno o más productos terapéuticos adicionales formulados juntos, opcionalmente, en una composición farmacéutica, en un solo recipiente común.
Si el kit incluye una composición farmacéutica para administración parenteral a un sujeto, el kit puede incluir un dispositivo (por ejemplo, un dispositivo de inyección) para realizar tal administración. Por ejemplo, el kit puede incluir una o más agujas hipodérmicas u otros dispositivos de inyección como se indicó anteriormente, que contienen la proteína de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación (por ejemplo, de la tabla 1).
El kit puede incluir un prospecto que incluya información sobre las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación del kit. En general, dicha información ayuda a los pacientes y médicos a usar las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación adjuntas de manera eficaz y segura. Por ejemplo, la siguiente información sobre una combinación de la invención se puede proporcionar en el prospecto: farmacocinética, farmacodinámica, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosis, dosis y administración adecuadas, cómo suministrarlo, condiciones adecuadas de almacenamiento, referencias, información sobre el fabricante/distribuidor e información sobre patentes.
Usos diagnósticos de los anticuerpos
Las proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente divulgación (por ejemplo, de la tabla 1), pueden utilizarse para detectar y/o medir CoV-S en una muestra. Los ensayos ilustrativos para CoV-S pueden incluir, por ejemplo, poner en contacto una muestra con una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S de la divulgación, en donde la proteína de unión a antígeno anti-CoV-S se marca con un marcador detectable o molécula indicadora o se utiliza como un ligando de captura para aislar de manera selectiva la CoV-S de las muestras. La presencia de una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S que forma un complejo con la CoV-S indica la presencia de CoV-S en la muestra. Como alternativa, un anticuerpo anti-CoV-S sin marcar se puede utilizar junto con un anticuerpo secundario que en sí está marcado de manera detectable. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; una fracción fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los análisis ilustrativos específicos que se pueden utilizar para detectar o medir CoV-S en una muestra incluyen ensayos de neutralización, ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA, del inglés enzyme-linked immunosorbent assay), radioinmunoensayo (RIA, de inglés radioimmunoassay) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, del inglés fluorescenceactivated cell sorting). Por lo tanto, la presente divulgación incluye un método para detectar la presencia de un polipéptido de proteína espicular en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S y detectar la presencia de CoV-S/proteína de unión a antígeno anti-CoV-S en donde la presencia del complejo indica la presencia de la CoV-S.
Una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S de la divulgación (por ejemplo, de la tabla 1) puede utilizarse en una transferencia Western o procedimiento de inmunotransferencia de proteínas para detectar la presencia de la CoV-S o un fragmento de la misma en una muestra. Dicho procedimiento forma parte de la presente divulgación e incluye las etapas de, por ejemplo:
(1) proporcionar una membrana u otro sustrato sólido que comprende una muestra para analizar la presencia de la CoV-S, por ejemplo, que incluye opcionalmente la etapa de transferir proteínas de una muestra para analizar la presencia de la CoV-S (por ejemplo, de una separación electroforética PAGE o SDS-PAGE de las proteínas en la muestra) a una membrana u otro sustrato sólido usando un método conocido en la materia (por ejemplo, transferencia semiseca o transferencia en tanque); y poner en contacto la membrana u otro sustrato sólido para analizar la presencia de la CoV-S o un fragmento de la misma con una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S de la divulgación.
Tal membrana puede adoptar la forma, por ejemplo, de una membrana de nitrocelulosa o a base de vinilo (por ejemplo, fluoruro de polivinilideno (PVDF)) a la que se han transferido las proteínas que se van a analizar para determinar la presencia de CoV-S en un gel de PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) no desnaturalizante o en un gel de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) (por ejemplo, después de la separación electroforética en el gel). Antes de poner en contacto la membrana con la proteína de unión a
antígeno anti-CoV-S, opcionalmente se bloquea la membrana, por ejemplo, con leche en polvo desnatada o similar para unir sitios de unión a proteínas inespecíficos en la membrana.
(2) lavar la membrana una o más veces para eliminar la proteína de unión a antígeno anti-CoV-S no unida y otras sustancias no unidas; y
(3) detectar la proteína de unión a antígeno anti-CoV-S unida.
La detección de la proteína de unión a antígeno unida indica que la proteína CoV-S está presente en la membrana o el sustrato y en la muestra. La detección de la proteína de unión a antígeno unida se puede realizar mediante la unión de la proteína de unión a antígeno con un anticuerpo secundario (un anticuerpo antinmunoglobulina) que está marcado de manera detectable y, a continuación, detectar la presencia del marcador del anticuerpo secundario.
Las proteínas de unión a antígeno anti-CoV-S (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, de la tabla 1)) divulgados en el presente documento pueden utilizarse también para inmunohistoquímica. Dicho método forma parte de la presente invención y comprende, por ejemplo,
(1) poner en contacto un tejido para analizar la presencia de la proteína CoV-S con una proteína de unión a antígeno anti-CoV-S de la invención; y
(2) detectar la proteína de unión a antígeno sobre o en el tejido.
Si la proteína de unión a antígeno en sí está marcada de manera detectable, puede detectarse directamente. Como alternativa, la proteína de unión a antígeno puede unirse mediante un anticuerpo secundario marcado de forma detectable en donde después se detecta el marcador.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos familiarizados con la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y utilizar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se ha intentado garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados, la temperatura ambiente es de aproximadamente 25 °C y la presión es o está cerca de la atmosférica.
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos humanos contra la proteína espicular del SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S)
Se generaron anticuerpos humanos contra la proteína espicular del SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-S) en un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica regiones variables de cadena ligera k y pesada de inmunoglobulina humana o regiones variables de cadena ligera A y pesada de inmunoglobulina humana. Cada ratón se inmunizó con un vector que expresaba el dominio de unión al receptor (RBD) de la SARS-CoV-2-S (aminoácidos 1 a 1273 del número de acceso n Cb I (MN908947.3), SEQ ID NO: 832), seguido de un refuerzo con un vector SARS-CoV-2-S o una proteína SARS-CoV-2-S. La respuesta inmunitaria de los anticuerpos se controló mediante un inmunoanálisis específico de SARS-CoV-2-S. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los linfocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar estirpes celulares de hibridoma. Las estirpes celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar estirpes celulares que producían anticuerpos específicos de SARS-CoV-2-S. También se aislaron anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S directamente de linfocitos B positivos para antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7582298, incorporada de manera específica en el presente documento por referencia en su totalidad. Con este método, se obtuvieron anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S totalmente humanos (es decir, anticuerpos que poseían dominios variables humanos y dominios constantes humanos).
Las regiones variables del anticuerpo también se aislaron de muestras de sangre humana. Se recibió sangre completa de pacientes 3 o 4 semanas después de una prueba de PCR positiva confirmada por laboratorio para SARS-CoV-2 y enfermedad covid-19 sintomática. Los glóbulos rojos se lisaron con un tampón de lisis basado en cloruro de amonio (Life Technologies) y los linfocitos B se enriquecieron mediante selección negativa. Los linfocitos B individuales que se unieron a la proteína espicular del SARS-CoV-2 se aislaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los linfocitos B aislados se sembraron en placas de un solo pocillo y se mezclaron con cebadores de PCR específicos de la región variable ligera y pesada de los anticuerpos. Los ADNc para cada linfocito B individual se sintetizaron mediante una reacción de transcriptasa inversa (RT, del inglés reverse transcriptase). A continuación, cada producto de la RT resultante se dividió y transfirió a dos pocillos correspondientes para posteriores PCR de cadena pesada y ligera del anticuerpo. Un conjunto de los productos de la RT resultantes se amplificó primero mediante PCR con un cebador degenerado en 5' específico para la secuencia líder de la región variable pesada del anticuerpo o un cebador degenerado en 5' específico para la secuencia líder de la región variable de cadena ligera del anticuerpo y un cebador en 3' específico para la región constante del anticuerpo, para formar un amplicón. A continuación, los amplicones se amplificaron de nuevo mediante PCR con un cebador degenerado en 5' específico para el marco 1 de la región variable pesada del anticuerpo o un cebador degenerado en 5' específico para el marco 1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo y un cebador en 3' específico para la región constante del
anticuerpo, para generar amplicones para la clonación. Los productos de PCR procedentes de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se clonaron en vectores de expresión que contenían una región constante pesada y una región constante ligera, respectivamente, produciendo así vectores de expresión para anticuerpos híbridos. Los vectores de expresión que expresan pares de cadena ligera y pesada de longitud completa se transfectaron en células CHO para producir proteínas de anticuerpos para la prueba.
Las propiedades biológicas de los anticuerpos ilustrativos generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos que se exponen a continuación.
Ejemplo 2: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la región variable de cadena pesada y ligera En la tabla 1 se muestran los identificadores de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera y las CDR, así como las secuencias de cadena pesada y cadena ligera, de anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S ilustrativos. Los identificadores de secuencia de ácido nucleico correspondientes se establecen en la tabla 2.
Tabla 1: Identificadores de las secuencias de aminoácidos
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Los anticuerpos divulgados en el presente documento tienen regiones variables completamente humanas, pero pueden tener regiones constantes de ratón (por ejemplo, un Fc de IgG1 de ratón o un Fc de IgG2 de ratón (isotipo a o b)) o regiones constantes humanas (por ejemplo, un Fc de IgG1 humana o un Fc de IgG4 humana). Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular se puede convertir en un anticuerpo con un isotipo de Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con un Fc de IgG1 de ratón se puede convertir en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (que incluyen las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos que se muestran en las tablas 1 y 2, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión a antígeno sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio constante.
Las regiones variables de los anticuerpos procedentes de ratones VELOCIMMUNE® y de muestras humanas se secuenciaron mediante Next Generation Sequencing y se identificó el repertorio de pares de cadenas ligeras y pesadas (Figura 10A y figura 10B). La estirpe predominante de anticuerpos VI utilizó VH3-53 emparejado con VK1-9, VK1-33 o VK1-39 mientras que los anticuerpos procedentes de seres humanos utilizaron VH3-66 emparejado con VK1-33 o VH2-70 emparejado con VK1-39. Un análisis posterior de las secuencias superpuestas mostró una fuerte superposición en el repertorio de cadenas k aisladas entre VI y anticuerpos procedentes de seres humanos. Aunque el repertorio de cadenas A no coincidía bien, eso puede deberse a que solo se incluyeron dos ratones A en este ensayo. La longitud promedio de las CDR para la cadena pesada fue similar entre los anticuerpos VI y los procedentes de seres humanos con una longitud promedio de 13 y 14,5 aminoácidos, respectivamente. La longitud promedio de las CDR de k fue la misma para anticuerpos VI y los procedentes de seres humanos en 9 aminoácidos y fue similar para las cadenas A con una longitud promedio de 11,1 y 10,6 aminoácidos, respectivamente. La disponibilidad de anticuerpos de ratón humanizados y procedentes de seres humanos permitió una mayor diversidad de genes V y permitió la identificación posterior de anticuerpos no competitivos.
Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos se obtuvieron de hibridomas generados a partir de ratones VELOCIMMUNE®, mediante el aislamiento directo de linfocitos B de ratones VELOCIMMUNE® positivos para antígeno, o procedentes de regiones variables clonadas a partir de linfocitos B humanos positivos para antígeno. En la tabla 3 se muestra un sumario de estas fuentes.
T abla 3: Fuentes de anticuer os/re ión variable
continuación
(continuación)
Ejemplo 3: Caracterización de sobrenadantes de hibridomas mediante ELISA de unión
Se realizó un ensayo de unión ELISA para identificar los sobrenadantes de anticuerpos que se unieron al dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular del SARS-CoV-2. Una proteína compuesta por el RBD del SARS-CoV-2 (aminoácidos 319 a 541) expresado con un marcador de histidina 6* y dos marcadores de epítopo myc en el extremo C (SARS-CoV-2-S-RBD-mmH; véase también el número de registro de NCBI MN908947.3) se recubrió a 1 |jg/ml en una placa de 96 pocillos en tampón PBS durante la noche a 4 °C. Los sitios de unión no específicos se bloquearon posteriormente con una solución al 0,5 % (p/v) de BSA en PBS. Los sobrenadantes de anticuerpos o los medios solos se diluyeron 1:40 o 1:50 en el tampón de bloqueo BSA al 0,5 %+PSA y se transfirieron a las placas de microtitulación lavadas. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se lavaron los pocillos y se detectó el sobrenadante unido a la placa con anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immunoresearch) o anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immunoresearch). A continuación, las placas se revelaron utilizando una solución de sustrato TMB (BD Biosciences) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se midió la absorbencia a 450 nm en un lector de placas Victor X5.
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S para unirse al dominio de unión al receptor de la SARS-CoV-2-S (SARS-CoV-2-S-RBD), como se ha descrito anteriormente, utilizando un ELISA de unión con la proteína SARS-CoV-2-S-RBD-mmH recubierta en una microplaca. La unión del sobrenadante de anticuerpo puntual individual a la SARS-CoV-2-S-RBD-mmH recubierto en placas de microtitulación de 96 pocillos se detectó con un anticuerpo anti-hFc o anti-mFc conjugado con HRP.
Los resultados de unión de tres ensayos se resumen en la tabla 4. Se indican las señales de unión del SARS-CoV-2 (absorbencia a 450 nm), con los antecedentes de los medios proporcionados como referencia negativa por experimento. Una muestra marcada como IC (no concluyente) tenía una anomalía experimental en la placa y, por lo tanto, se notifica sin valor. Como se muestra en comparación con el control de solo medios, los sobrenadantes analizados mostraron una unión sustancial al SARS-CoV-2-S-RBD.
T l 4: ni n l r n n l mini ^ ni n l r r l r ín i l r l AR - V-2
continuación
Ejemplo 4: Unión de anticuerpos a partículas pseudovíricas que expresan la SARS-CoV-2-S
Para investigar la capacidad de un grupo de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S para unirse a la glucoproteína espicular del SARS-CoV-2, se desarrolló un ensayo de unión in vitro que utiliza partículas pseudovíricas (VLP, del inglés viral-like partióles) que expresan proteínas espiculares del SARS-CoV-2 en una plataforma de detección basada en electroquimioluminiscencia (MSD).
Para expresar de manera transitoria la proteína espicular del SARS-CoV-2 (Número de registro NCBI MN908947.3, aminoácidos 16 a 1211; SEQ ID NO: 833), se pseudotipó el virus de la estomatitis vesicular (VSV, del inglés Vesicular stomatitis virus) que carece de la glucoproteína G (VSV delta G) con la proteína espicular del SARS-CoV-2 (VSV-SARS-CoV-2-S) y se generó en células HEK293T. Como control de unión negativa, se pseudotipó VSV delta G con proteína G del VSV (VSV-G).
Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento. Los dos tipos de VLP descritas anteriormente se diluyeron en PBS, se sembraron en placas de electrodos de carbono de 96 pocillos (MULTI-ARRAY high bind plate, MSD) y se incubaron durante la noche a 4 °C para permitir que se adhiriesen las VLP. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con BSA al 2 % (p/v) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes que contienen anticuerpos producidos a partir de ratones inmunizados con SARS-CoV-2 o sueros humanos infectados, junto con controles de solo medio que se diluyeron 1:10 o 1:20 en tampón BSA al 0,5 % PBS 1*, se añadieron a las partículas unidas a la placa. Después, se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación, después de lo cual, las placas se lavaron con PBS 1 * para eliminar los anticuerpos no unidos utilizando un lavador de placas AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Los anticuerpos unidos a la placa se detectaron con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) o un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados, las placas se desarrollaron con el tampón de lectura (MSD) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante y las señales luminiscentes se registraron con un instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Se capturaron las señales de unión directa (en URL) y se calculó una proporción de VLP que expresan SARS-CoV-2-S con respecto a las VLP irrelevantes.
La capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S para unirse a las VLP que expresan SARS-CoV-2-S en comparación con la unión a las VLP que expresan el VSV irrelevantes se evaluó con un ensayo de inmunounión, como se describe anteriormente. La unión de un solo punto a las VLP inmovilizadas en placas High Bind (MSD) de 96 pocillos se realizó con una dilución de sobrenadante de anticuerpo de 1:10 o 1:20, se unió durante 1 hora y se detectó con anticuerpos anti-IgG humana o anti-IgG de ratón conjugados con SULFO-TAGTM. Las señales de unión de la electroquimioluminiscencia se registraron en un Sector Imager 600 (MSD). Se determinaron los valores en URL para la unión del anticuerpo a las VLP. Las proporciones se calcularon comparando las señales de unión de las VLP que expresan SARS-CoV-2-S con las VLP de control.
Los resultados de unión de tres experimentos se resumen en la tabla 5. Una señal observada de VLP que expresan SARS-CoV-2-S indica unión, mientras que la comparación con las VLP negativas proporciona un contexto relativo. Las muestras de medio solo proporcionan señales de referencia de la unión del anticuerpo secundario a las muestras sin sobrenadante. Los 46 anticuerpos se unieron de manera específica en >4 veces más que las muestras solo de medios (20 a 35 URL) en las VLP que expresan SARS-CoV-2-S, con un intervalo de señales de unión de 85 a 13.600 URL. Las proporciones de las VSV que expresan SARS-CoV-2-S: VSV-VLP (control negativo) variaron de 1,1 a 22,7, y muchas tenían un alto historial en VSV-VLP. La proporción de mAb11002 de 0,9 probablemente se deba a una baja concentración de anticuerpo monoclonal en la muestra del sobrenadante.
Tabla 5 Unión de VLP SARS-CoV-2-S
continuación
Ejemplo 5: Neutralización de anticuerpos de la infectividad por pseudovirus VSV-SARS-CoV-2-S
Para investigar la capacidad de un grupo de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S para neutralizar el SARS-CoV-2, se desarrolló un ensayo de neutralización in vitro con el pseudovirus VSV-SARS-CoV-2-S.
Como se ha descrito anteriormente, los virus del pseudotipo VSV se generaron mediante la transfección transitoria de células 293T con un plásmido que codifica la proteína espicular del SARS-CoV-2. Las células se sembraron en placas de 15 cm a 1,2 * 107 células por placa en medio completo DMEM un día antes de la transfección con 15 pg/placa de ADN de la proteína espicular utilizando 125 pl de Lipofectamine LTX, 30 pl de reactivo PLUS y hasta 3 ml de Opti-Mem. 24 horas después de la transfección, las células se lavaron con 10 ml de PBS, después se infectaron con una MOI de 0,1 virus VSVñG:mNeon en 10 ml Opti-Mem. El virus se incubó en las células durante 1 hora, con suave balanceo cada 10 minutos. Las células se lavaron 3 veces con 10 ml de PBS, después se cubrieron con 20 ml de medio de infección antes de la incubación a 37 °C, CO2 al 5 % durante 24 horas. El sobrenadante se recogió en tubos de centrífuga de 250 ml en hielo, después se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos para sedimentar cualquier desecho celular, se formaron alicuotas en hielo, después se congelaron a -80 °C. La infectividad se analizó en células Vero antes de su uso en ensayos de neutralización. Este material se denominará VSV-SARS-CoV-2-S.
Ensayo de neutralización con VSV-SARS-CoV-2-S
El día 1, las células Vero se sembraron con una confluencia del 80 % en matraces T225. Para sembrar las células, se eliminó el medio de las células, se lavaron con 20 ml de PBS (Gibco: 20012-043) y se añadieron 5 ml de TrypLE y se incubaron durante ~5 minutos a 37 °C hasta que las células se desprendieron. Se añadieron 5 ml de DMEM completo para inactivar la tripsina y se pipetearon hacia arriba y hacia abajo para distribuir las células. Para contar las células resuspendidas, se sembraron 20.000 células Vero en 100 pl de DMEM completo precalentado por pocillo en una microplaca de poliestireno negro de 96 pocillos (Corning: 3904).
El día 2, se descongeló el VSV-SARS-CoV-2-S en hielo y se diluyó 1:1 con medio de infección.
En placas de 96 pocillos con fondo en V, se generó una dilución de cada sobrenadante en 60 pl de medio de infección. Para controles de medios (negativos), se añadieron a los pocillos 60 pl de medio acondicionado diluido. Se añadieron 60 pl de VSV-SARS-CoV-2-S diluido a cada pocillo excepto a los pocillos de control de medios. A esos pocillos se añadieron 60 pl de medio de infección. A continuación, los pseudovirus se incubaron con diluciones de sobrenadante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el medio de las placas con células Vero, se transfirieron 100 pl de mezclas de sobrenadante/pseudovirus a las células y la placa se incubó a 37 °C, CO2 al 5 % durante 24 horas. Las diluciones finales de sobrenadante de 1:4 y 1:20, y para algunas muestras 1:100, se utilizaron para evaluar la neutralización de los pseudovirus VSV-SARS-CoV-2-S.
El día 3, después de 24 horas de incubación, el sobrenadante se eliminó de los pocillos con células y se reemplazó con 100 pl de PBS. A continuación, las placas se leyeron en un citómetro de formación de imágenes SpectraMax i3 con MiniMax.
La capacidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S para neutralizar el virus pseudotipado que expresa el SARS-CoV-2-S basado en VSV se evaluó mediante un ensayo de enfoque de fluorescencia de neutralización. Los resultados de unión de tres ensayos se resumen a continuación. La potencia de neutralización del anticuerpo en cada dilución se representa como un porcentaje en comparación con el control de sobrenadante simulado. Todos los anticuerpos demostraron capacidad de neutralización, y en particular para el conjunto de anticuerpos que se evaluaron 1:100, aquellos que muestran una mayor neutralización pueden representar una capacidad de neutralización más potente.
Tabla 6: Neutralización de VLP
continuación
Ejemplo 6: Caracterización de anticuerpos en un ensayo indirecto de toxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos
La capacidad de los anticuerpos dirigidos a la proteína espicular del SARS-CoV-2 para interactuar con FcyR3a, un
receptor Fc expresado de manera notable en los linfocitos citolíticos naturales (NK, del inglés natural killer) que induce citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, del inglés antibody dependent cell-mediated cytotoxicity), se midió en un bioensayo indirecto con células indicadoras y células diana unidas a anticuerpos. En este ensayo se utilizaron linfocitos T Jurkat que se genomanipularon para expresar el gen indicador luciferasa bajo el control del factor de transcripción NFAT (NFAT-Luc) junto con el receptor de alotipo 176Val FcYR3a humano de alta afinidad. (Jurkat/NFAT-Luc/hFcyR3a 176Val). Las células diana fueron linfocitos T Jurkat genomanipulados que expresan CD20 humano (utilizadas como control positivo con un anticuerpo IgG1 humano dirigido a CD20) y la proteína espicular del SARS-CoV-2 de longitud completa controlada por un promotor inducible por doxiciclina. Las células indicadoras se incubaron con células diana y la interacción de FcyR3a a través del dominio Fc de los anticuerpos IgG1 humanos unidos a las células diana condujo a la activación del factor de transcripción NFAT en las células indicadoras e impulsó la expresión de luciferasa, que después se midió a través de una lectura de luminiscencia.
Los linfocitos T Jurkat se genomanipularon para expresar de manera constitutiva CD20 humano de longitud completa (aminoácidos M1-P297 de número de registro NCBl NP_690605.1), proteína transactivadora Tet3G (clonada con un vector Takara pEF1a-Tet3G, n.° de catálogo 631167), así como una proteína espicular del SARS-CoV-2 de longitud completa inducible por doxiciclina (aminoácidos M1-T1273 del número de registro NCBI YP_009724390.1). Las células Jurkat genomanipuladas/Tet3G/hCD20/que expresan la proteína espicular del SARS-CoV-2 se clasificaron para obtener una elevada expresión de la proteína espicular y posteriormente se mantuvieron en medio de cultivo de RPMI FBS sin Tet al 10 % P/S/G G418500 pg/ml puromicina 1 pg/ml higromicina 250 pg/ml.
Los linfocitos T Jurkat se genomanipularon para expresar de manera estable una construcción indicadora de luciferasa del factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT, del inglés Nuclear Factor of Activated T-cells) junto con el receptor de alotipo 176Val FcyR3a humano de elevada afinidad (aminoácidos M1-K254 de número de registro NCBI P08637 VAR_003960). Las células indicadoras genomanipuladas se mantuvieron en medio de crecimiento RPMI1640 FBS al 10 % P/S/G puromicina 0,5 pg/ml G418500 pg/ml.
36 horas antes del inicio del ensayo ADCC indirecto, se indujeron 5 * 105 células diana/ml en medio de cultivo celular RPMI FBS sin Tet al 10 % P/S/G que contenía doxiciclina 1 pg/ml (Sigma). Un día antes del experimento, las células indicadoras se dividieron a una densidad de 7,5 * 105 células/ml en medio de crecimiento de RPMI 1640 FBS al 10 % P/S/G puromicina 0,5 pg/ml G418500 pg/ml.
En resumen, el día del experimento, las células diana e indicadoras se transfirieron a medios de ensayo (RPMI FBS sin Tet al 10 % P/S/G) y se añadieron en una proporción de 3:2 (3 * 104/células diana pocillo y 2 * 104/células indicadoras pocillo) a placas de microtitulación blancas de 384 pocillos, seguido de la adición de sobrenadante de anticuerpo anti-SARS-CoV-2-S de concentraciones variables. En cada placa se incluyó una muestra de control positivo (anticuerpo CD20 con IgG1 humana) y una muestra de control negativo que no contenía anticuerpos para normalizar las actividades ADCC detectadas de los sobrenadantes de anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S. Las placas se incubaron a 37 °C/CO25 % durante 5 h seguido de la adición de un volumen igual de reactivo ONE-Glo™ (Promega) para lisar las células y detectar la actividad de la luciferasa. La luz emitida se capturó en unidades de luz relativas (URL) en un lector de placas de múltiples marcadores Envision (PerkinElmer), y los datos se analizaron y normalizaron con la siguiente ecuación:
(URL promedio (muestras de prueba) - URL promedio (señal de fondo)) Actividad ADCC (%) = 100 *
(URL promedio (control positivo) - URL promedio (señal de fondo))
La capacidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S para activar los receptores FcYR3a se evaluó en un ensayo ADCC indirecto con Jurkat/NFAT-Luc/FcyR3a 176Val como células indicadoras y Jurkat/hCD20/SARS-CoV-2 espicular como células diana. Cada anticuerpo analizado contenía un dominio IgG1.
La tabla 7 resume los resultados, que muestran la actividad de la luciferasa sin procesar y el % calculado de control positivo. Se observó un intervalo de % de actividad de ADCC que indicaba la activación de FcyR3a por los sobrenadantes de anticuerpos. Todas las muestras demostraron alguna medida de actividad de ADCC indirecta, y 10 de los sobrenadantes de anticuerpos demostraron actividad de ADCC indirecta mejor que la observada en los controles positivos.
Tabla 7: Actividad indirecta de ADCC de sobrenadantes de anticuer os anti-SARS-CoV-2-S.
continuación
Ejemplo 7: Ensayo de especificidad de unión de anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S
Se realizó un ensayo de unión Luminex para determinar la unión de anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S a un grupo de antígenos. Para este ensayo, los antígenos se acoplaron con amina o se capturaron con estreptavidina en microesferas Luminex de la siguiente manera: aproximadamente 10 millones de microesferas MagPlex (Luminex Corp., microesferas MagPlex, n.° de cat. MC10000 y MC12000) se resuspendieron mediante agitación vorticial en 500 |jl de NaPO40,1 M, pH 6,2 (tampón de activación) y a continuación se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las microesferas se protegieron de la luz, ya que son sensibles a la luz. Las microesferas se resuspendieron en 160 j l de tampón de activación y los grupos carboxilato (-COOH) se activaron mediante la adición de 20 j l de 50 mg/ml de N-hidroxisuccinimida (NHS, Thermo Scientific, n.° de cat. 24525) seguido de la adición de 20 j l de 50 mg/ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, ThermoScientific, n.° de cat. 22980) a 25 °C. Después de 10 minutos, el pH de la reacción se redujo a 5,0 con la adición de 600 j l de MES 50 mM, pH 5 (tampón de acoplamiento), y las microesferas se agitaron vorticialmente y se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las microesferas activadas se mezclaron inmediatamente con 500 j l de 25 jg/m l del antígeno proteico o estreptavidina en tampón de acoplamiento y se incubaron durante dos horas a 25 °C. La reacción de acoplamiento se extinguió mediante la adición de 50 j l de T ris-HCl 1 M, pH 8,0 y las microesferas se agitaron vorticialmente, se centrifugaron y se lavaron tres veces con 800 j l de PBS al 0,005 % (Tween 20 al 0,05 %), para eliminar las proteínas no acopladas y otros componentes de la reacción. Las microesferas se resuspendieron en 1 ml de PBS al 2 %, BSA al 0,05 % Na Azida a 10 millones de microesferas/ml. Para la captura de antígenos con estreptavidina, se añadieron 500 j l de proteína biotinilada 12,5 jg/m l en PBS a microesferas acopladas con estreptavidina y se incubaron durante una hora a 25 °C. Las
microesferas se agitaron en vórtice, se centrifugaron y se lavaron tres veces con 800 |jl de PBS, y después se bloquearon con 500 j l de biotina 30 mM (Millipore-Sigma, n.° de cat. B4501) en Tris 0,15 M pH 8,0. Las microesferas se incubaron durante 30 minutos y después se sometieron a agitación vorticial, se centrifugaron y se lavaron tres veces con 800 |jl de PBS. Las microesferas se resuspendieron en 1 ml de PBS al 2 %, BSA al 0,05 % Na Azida a 10 millones de microesferas/ml.
Se mezclaron microesferas para las diferentes proteínas y proteínas biotiniladas a 2700 perlas/ml, y se sembraron 75 j l de microesferas por pocillo en una placa de fondo plano ProcartaPlex de 96 pocillos (ThermoFisher, n.° de cat.: EPX-44444-000) y se mezclaron con 25 j l de sobrenadante individual anti-SARS-CoV-2 que contenía anticuerpo. Las muestras y las microesferas se incubaron durante dos horas a 25 °C y después se lavaron dos veces con 200 j l de DPBS con Tween 20 al 0,05 %. Para detectar niveles de anticuerpos unidos a microesferas individuales, se añadieron 100 j l de 2,5 jg/m l de R-Ficoeritrina conjugada con F(ab')2 de cabra anti-K humana (Southern Biotech, n.° de cat.
2063-09) en tampón de bloqueo (para anticuerpos con regiones Fc murinas) o 100 j l de 1,25 jg/m l de R-Ficoeritrina AffiniPure conjugada con fragmento F(ab')2 de cabra Anti-IgG de ratón, fragmento F(ab')2 específico (Jackson Immunoresearch, n.° de cat.: 115-116-072) en tampón de bloqueo (para anticuerpos con regiones Fc humanas), y se incubaron durante 30 minutos a 25 °C. Después de 30 minutos, las muestras se lavaron dos veces con 200 j l de tampón de lavado y se resuspendieron en 150 j l de tampón de lavado. Las placas se leyeron en un Luminex FlexMap 3D® (Luminex Corp.) y Luminex xPonent® versión del programa informático 4.3 (Luminex Corp.). Las proteínas del SARS-CoV-2 utilizadas en el ensayo son las siguientes:
RBD_ (R319-F541).mmh: SEQ ID NO: 829
RBD_ (R319-F541).mFc: SEQ ID NO: 830
RBD_ (R319-F541).hFc): SEQ ID NO: 831
Los resultados de la unión de Luminex se muestran en la tabla 8 y la tabla 9 como intensidades de señal de intensidad de fluorescencia media (IFM). Los resultados muestran que los 46 sobrenadantes de anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S se unieron de manera específica a las proteínas del RBD de la SARS-CoV-2-S. Estos resultados también muestran que cinco de estos anticuerpos reaccionan de forma cruzada con las proteínas del RBD espicular del coronavirus del SARS con una señal de unión superior a 1000 IFM.
Ejemplo 8: Ensayo de diversidad de anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S
Se realizó un ensayo de unión para determinar el perfil de unión de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S. Para este ensayo, los antígenos se acoplaron con amina como se describe en ensayo de unión Luminex anterior. En resumen, aproximadamente 9 millones de microesferas MagPlex para 16 regiones de perlas diferentes (Luminex Corp., Microesferas MagPLex, n.° de cat. MagPLex MC10000 y MC12000) se resuspendieron mediante agitación vorticial en 500 |jl de NaPO40,1 M, pH 6,2 y a continuación se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las microesferas se resuspendieron en 160 j l de tampón de activación y los grupos carboxilato (-COOH) se activaron mediante la adición de 20 j l de 50 mg/ml de N-hidroxisuccinimida (NHS, Thermo Scientific, n.° de cat. 24525) seguido de la adición de 20 j l de 50 mg/ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, ThermoScientific, n.° de cat. 22980) a 25 °C. Después de 10 minutos, el pH de la reacción se redujo a 5,0 con la adición de 600 j l de MES 50 mM, pH 5 (tampón de acoplamiento), y las microesferas se agitaron vorticialmente y se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las microesferas activadas se mezclaron inmediatamente con 500 j l de 20 jg/m l de la proteína espicular del SARS-CoV-2 (RBD)(R319-F541)-mmH en tampón de acoplamiento y se incubaron durante dos horas a 25 °C. La reacción de acoplamiento se extinguió mediante la adición de 50 j l de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y las microesferas se agitaron vorticialmente, se centrifugaron y se lavaron tres veces con 1000 j l de PBS. Las microesferas se resuspendieron en 250 j l de PBS a 9 millones de microesferas/ml.
15 de las 16 regiones de microesferas con proteína acoplada a amina se modificaron para el ensayo Binning de la siguiente manera: las microesferas se lavaron dos veces con PBS al 5 % de DMSO y se disolvieron 500 j l de una sustancia química o enzima según las recomendaciones de fabricación y se añadieron a 10 nM a las microesferas acopladas con amina descritas anteriormente. Posteriormente, se agitó con vórtex y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con rotación. Se lavaron las microesferas 3 veces con PBS al 2 % de BSA. Las microesferas se resuspendieron en 1 ml de PBS a 9 millones de microesferas/ml.
Se mezclaron microesferas modificadas con proteína y sin modificar (intactas) a 2700 perlas/ml, y se sembraron 75 j l de microesferas por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos ProcartaPlex de 96 pocillos (ThermoFisher, n.° de cat.: EPX-44444-000) y se mezclaron con 25 j l de sobrenadante individual que contenía anticuerpo anti-SARS-CoV-2-S. Las muestras y las microesferas se incubaron durante dos horas a 25 °C y después se lavaron dos veces con 200 j l de DPBS con Tween 20 al 0,05 %. Para detectar niveles de anticuerpos unidos a microesferas individuales, se añadieron 100 j l de 2,5 jg/m l de R-Ficoeritrina conjugada con F(ab')2 de cabra anti-K humana (Southern Biotech, n.° de cat. 2063-09) en tampón de bloqueo (para anticuerpos con hFc), o 100 j l de 1,25 jg/m l de R-Ficoeritrina AffiniPure conjugada con fragmento F(ab')2 de cabra anti-IgG de ratón, fragmento F(ab')2 específico (Jackson Immunoresearch, n.° de cat. 115-116-072) en tampón de bloqueo (para anticuerpos con mFc), o 100 j l de 1,25 jg/m l de R-Ficoeritrina anti-His (Biolegend, n.° de cat.: 362603) en tampón de bloqueo (para control ACE-2, R&D n.° de cat.
933-ZN), y se incubaron durante 30 minutos a 25 °C. Después de 30 minutos, las muestras se lavaron dos veces con 200 j l de tampón de lavado y se resuspendieron en 150 j l de tampón de lavado. Las placas se leyeron en FlexMap 3D® (Luminex Corp.) y Luminex xPonent® versión del programa informático 4.3 (Luminex Corp.).
Los resultados de Binning de Luminex se muestran en la tabla 10 como intensidades de señal de intensidad de fluorescencia media (IFM). Para determinar los grupos, los datos se normalizaron a la proteína inalterada (microesferas no modificadas) y se agruparon. Los 46 anticuerpos anti-SARS-CoV-2 se clasificaron en 9 grupos con 2 o más anticuerpos, y 11 anticuerpos se clasificaron como nodos únicos. Los grupos se asignaron basándose en estos resultados del agrupamiento jerárquico y el dendrograma. Estos resultados muestran que los 46 sobrenadantes de anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S tenían diversas características y perfiles de unión, lo que sugiere que la colección de anticuerpos se unió a diferentes epítopos en la proteína espicular del SARS-CoV-2.
Ejemplo
9:
Cinética de unión Biacore de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S
Se determinaron las constantes de disociación de equilibrio (Kd) para diferentes anticuerpos contra la SARS-CoV-2-S de sobrenadantes primarios de células CHOt o de hibridomas utilizando un biosensor Biacore T200/Biacore 8K basado en resonancia de plasmón de superficie en tiempo real. Todos los estudios de unión se realizaron en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, tampón de ejecución a pH 7,4 (HBS-ET) a 25 °C. La superficie del chip sensor Biacore CM5 se derivatizó por primera vez mediante acoplamiento de amina con mAb de ratón específico anti-Fc humano o anticuerpo monoclonal de conejo anti-FcY de ratón (GE, n.° de catálogo BR-1008-38) para capturar anticuerpos anti-SARS-CoV-2. Los estudios de unión se realizaron en un dominio extracelular del RBD del SARS-CoV-2 humano expresado con un marcador myc-myc-hexahistidina carboxiterminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH), un dominio extracelular del RBD del SARS-CoV-2 expresado con una IgG2a de ratón carboxiterminal (SARS-CoV-2 RBD-mFc) o un dominio extracelular del RBD del SARS-CoV-2 expresado con una IgG1 humana carboxiterminal (SARS-CoV-2 RBD-hFc). Se prepararon concentraciones únicas de SARS-CoV-2 RBD-MMH (100 nM), SARS-CoV-2 RBD-mFc (50 nM) o SARS-CoV-2 RBD-hFc (50 nM) en tampón de ejecución HBS-ET, se inyectaron durante 1,5 minutos a un caudal de 30 pl/min mientras se controlaba la disociación de diferentes reactivos RBD del SARS-CoV-2 unidos a anticuerpos durante 2 minutos en tampón de ejecución HBS-ET. Al final de cada ciclo, la superficie de captura del anticuerpo anti-RBD del SARS-CoV-2 se regeneró utilizando una inyección de 10 segundos de ácido fosfórico 20 mM para la superficie del anticuerpo monoclonal de ratón específico anti-Fc humano o una inyección de 40 segundos de glicina 10 mM, HCl, pH 1,5 para el anticuerpo policlonal específico de conejo anti-FcY de ratón. La tasa de asociación (ka) y tasa de disociación (kd) se determinaron mediante el ajuste de los sensogramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el programa informático BiaEvaluation v3.1 o el programa informático Biacore Insight Evaluation v2.0. o el programa informático de ajuste de curvas. La constante de disociación (Kd) en equilibrio de unión y las semividas disociativas (t1^ ) se calcularon a partir de las constantes cinéticas como:
Kd (M) = —, y t / (min) =
D ' ' k a ’
3
' ' 60 x k d
Los parámetros de cinética de unión para diferentes anticuerpos monoclonales contra el SARS-CoV-2 que se unen a diferentes reactivos anti-RBD del SARS-CoV-2 de la invención a 25 °C se muestran en las tablas 11 y 12.
Tabla 11: Cinética de unión de la unión de SARS-CoV-2 RBD-MMH a anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2 a 25 °C
continuación
Tabla 12: Cinética de unión de la unión de SARS-CoV-2 RBD-mFc o SARS-CoV-2 RBD-hFc a anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S a 25 °C
continuación
Ejemplo 10: Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S mediante ELISA de bloqueo
Se desarrolló un ensayo de bloqueo basado en ELISA para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S para bloquear la unión del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular del SARS-CoV-2 a la enzima convertidora de la angiotensina de tipo 2 humana (hACE2).
La proteína del SARS-CoV-2 utilizada en los experimentos estaba compuesta por la porción del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular del SARS-CoV-2 (aminoácidos Arg319 a Phe541) expresada con la porción Fc de la IgG1 humana en el extremo C (SARS-CoV-2 RBD-hFc; véase el número de registro de NCBI MN908947.3). La proteína ACE2 humana utilizada en los experimentos se adquirió de R&D Systems y está compuesta por los aminoácidos glutamina 18 a serina 740 con un marcador de histidina 10* carboxiterminal (hACE2-His; número de registro de NCBI Q9BYF1).
Los experimentos se llevaron a cabo mediante el siguiente procedimiento. Se recubrió un anticuerpo monoclonal anti-Penta-His (Qiagen) a 1 pg/ml en PBS en una placa de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4 °C. El receptor hACE2-His se añadió a 0,2 pg/ml en PBS y se unió durante 2 horas a temperatura ambiente. Los sitios de unión no específica se bloquearon posteriormente con una solución de BSA al 0,5 % (p/v) en PBS. En otras placas de microtitulación, se unió una cantidad constante de 10 pM o 15 pM (como se indica en la tabla 13) de proteína SARS-CoV-2 RBD-hFc con anticuerpos diluidos 1:10 o 1:20 en PBS BSA al 0,5 %. Estos complejos de anticuerpo y proteína, después de una hora de incubación, se transfirieron a la placa de microtitulación recubierta con hACE2-His. Después de 1,5 horas de incubación a TA, se lavaron los pocillos y se detectó la proteína SARS-CoV-2 RBD-hFc unida a la placa con anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson). A continuación, las placas se revelaron utilizando una solución de sustrato TMB (BD Biosciences, n.° de catálogo 555214) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se midió la absorbencia a 450 nm en un lector de placas Victor X5.
El análisis de los datos se realizó mediante el cálculo del % de reducción de la señal de la concentración fija de SARS
CoV-2-S RBD-hFc en presencia del anticuerpo respecto a la ausencia del anticuerpo. En el cálculo, la señal de unión de la muestra del SARS-CoV-2-S RBD-hFc constante sin la presencia del anticuerpo para cada placa se denominó 100 % de unión o 0 % de bloqueo; y la señal de referencia de la muestra de medios solo sin la presencia de SARS-CoV-2 RBD-hFc se denominó como 0 % de unión o 100 % de bloqueo.
La capacidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S para bloquear la unión del SARS-CoV-2-S RBD a la ACE2 humana se evaluó mediante un formato ELISA de bloqueo. Se detectó con un anticuerpo anti-hFc conjugado con HRP el sobrenadante de anticuerpos de prueba de punto único que bloquea 10 pM o 15 pM de SARS-CoV-2-S RBD-hFc que se une a hACE2-His, que se presentaba en anticuerpos anti-His recubiertos en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Los resultados de bloqueo de tres ensayos se resumen en la tabla 13. Se indican la señal de unión de la SARS-CoV-2-S (450 nm) y el % de bloqueo calculado. Se observa un intervalo de bloqueo para las muestras de prueba. Para las muestras donde se indica ND en las columnas 6 y 7, se incluye un valor corregido de la placa en las columnas 4 y 5, ya que los datos eran coherentes con un solo cambio de placa que ocurría para esas muestras. 43 de 46 sobrenadantes de anticuerpos bloquearon más del 50 % de la unión del SARS-CoV-2-S RBD-hFc a la ACE2 humana que recubre la placa, con 16 de ellos bloqueando >90 % de la señal.
Tabla 13: Resultados de ELISA de blo ueo
continuación
Ejemplo 11: Mapeo de epítopos de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S contra glucoproteína espicular mediante espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio
Se realizó espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para determinar los restos de aminoácidos del dominio de unión al receptor de la proteína espicular del SARS-CoV-2 (RBD (aminoácidos R319-F541)) que interactúan con mAb10989, mAb10987, mAb10934, mAb10933, mAb10920, mAb10922, mAb10936, mAb10954, mAb10964, mAb10977, mAb10984 y mAb10986. Se expone una descripción general del método HDX-MS en, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; y Engen y Smith (2001) Anal. Chem.
73:256A-265A.
Los experimentos HDX-MS se realizaron en una plataforma HDX-MS integrada, que consiste en un sistema Leaptec HDX PAL para el marcaje y enfriamiento del deuterio, un Waters Acquity I-Class (Binary Solvent Manager) para la digestión y carga de muestras, un Waters Acquity I-Class (Binary Solvent Manager) para el gradiente analítico y un espectrómetro de masas Thermo Q Exactive HF para la medición de masas de péptidos.
La solución de marcaje se preparó como tampón PBS en D2O en pD 7,0 (tampón de fosfato 10 mM, NaCl 140 mM y KCl 3 mM, equivalente a pH 7,4 a 25 °C). Para el marcaje de deuterio, se incubaron 10 pl de proteína RBD o proteína RBD premezclada con cada uno de los 12 anticuerpos enumerados anteriormente a 20 °C con 90 pl de solución de marcaje D2O para varios puntos temporales, por duplicado. Para mAb10989, mAb10987, mAb10934 y mAb10933, los puntos temporales fueron 0 min (control no deuterado), 5 min y 10 min. Para mAb10920, mAb10922, mAb10936, mAb10954, mAb10964, mAb10977, mAb10984 y mAb10986, los puntos temporales fueron 0 min (control no deuterado) y 10 min. La reacción de deuteración se extinguió mediante la adición de 90 pl de tampón de extinción preenfriado (TCEP-HCl 0,5 M, urea 4 M y ácido fórmico al 0,5 %) a cada muestra para una incubación de 90 segundos a 20 °C. A continuación, las muestras extinguidas se inyectaron en el sistema h Dx PAL Leaptec para la digestión en línea con pepsina/proteasa XIII.
Los péptidos digeridos se atraparon por una columna C18 (2,1 mm * 5 mm, Waters) y se separaron por otra columna C18 (2,1 mm * 50 mm, Waters) a -5 °C con un gradiente de 20 minutos (para mAb10989, mAb10987, mAb10934 y mAb10933) o un gradiente de 10 minutos (para mAb10920, mAb10922, mAb10936, mAb10954, mAb10956, mAb10964, mAb10977 y mAb10984) del 0 % al 90 % de la solución de fase móvil B (solución de fase móvil A: ácido fórmico al 0,5 % y acetonitrilo al 4,5 % en agua, solución fase móvil B: ácido fórmico al 0,5 % en acetonitrilo). Los
péptidos eluidos se analizaron mediante espectrometría de masas Thermo Q Exactive HF en modo LC-MS/MS o LC-MS.
Los datos de LC-MS/MS de la muestra de proteína RBD no deuterada se compararon con una base de datos que incluía secuencias de aminoácidos de la proteína RBD, pepsina, proteasa XIII, y sus secuencias inversas utilizando el motor de búsqueda Byonic (Protein Metrics). Los parámetros de búsqueda se establecieron por defecto mediante digestión enzimática no específica y glucosilación humana como modificación de variable común. A continuación, la lista de péptidos identificados se importó al programa informático HDExaminer (versión 3.1) para calcular la absorción de deuterio (absorción de D) y las diferencias en el porcentaje de absorción de deuterio (A%D) para todas las muestras deuteradas. La diferencia en el porcentaje de absorción de deuterio (A%D) se calculó como sigue.
Diferencia en la absorción de deuterio (AD) = absorción de D (RBD-mAb) - absorción de D (RBD solo)
Diferencia en el porcentaje de absorción de deuterio (A%D) = - M--á-x-i-m--a-- a-b-s-o--r-c-ió--n-- d—e D-- t-e-ó--r-ic-a-- d-e--l- p-é-p--t-id--o x 100
Se identificaron un total de 190 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10989, lo que representa una cobertura de secuencia del 86,06 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 467-513 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 835) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10989.
Se identificaron un total de 187 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10987, lo que representa una cobertura de secuencia del 86,06 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 432-452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10987.
Se identificaron un total de 188 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10934, lo que representa una cobertura de secuencia del 86,06 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 432-452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836), 467-474 (DISTEIYQ) (SEQ ID NO: 837) y 480-513 (CNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 838) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10934.
Se identificaron un total de 188 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10933, lo que representa una cobertura de secuencia del 86,06 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 467-510 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRV) (SEQ Id NO: 839) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10933.
Se identificaron un total de 75 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10920, lo que representa una cobertura de secuencia del 83,27 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 471-486 (EIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 840) y 491-515 (PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 841) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10920.
Se identificaron un total de 86 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10922, lo que representa una cobertura de secuencia del 87,25 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 432-452 (CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10922.
Se identificaron un total de 81 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10936, lo que representa una cobertura de secuencia del 82,07 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 351-360 (YAWNRKRISN) (SEQ ID NO: 842), 432-452
(CVIAWNSNNLDSKVGGNYNYL) (SEQ ID NO: 836), 467-486 (DISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 843) y 491-513 (PLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 844) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10936.
Se identificaron un total de 84 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10954, lo que representa una cobertura de secuencia del 87,25 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 400-422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), 453-486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) y 490-515 (FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 847) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10954.
Se identificaron un total de 109 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10964, lo que representa una cobertura de secuencia del 83,67 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 401-424 (VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYK) (SEQ ID NO: 848) y 471-513 (EIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVL) (SEQ ID NO: 849) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10964.
Se identificaron un total de 78 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10977, lo que representa una cobertura de secuencia del 87,25 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 351-364 (YAWNRKRISNCVAD) (SEQ ID NO: 850) y 471-486 (EIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 840) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10977.
Se identificaron un total de 88 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10984, lo que representa una cobertura de secuencia del 87,25 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 400-422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845) y 453-486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10984.
Se identificaron un total de 84 péptidos a partir del RBD tanto del RBD solo como del RBD unido con muestras de mAb10986, lo que representa una cobertura de secuencia del 87,25 % del RBD. Cualquier péptido que presentara una reducción en la absorción de deuterio del 5 % o más (es decir, un valor de A%D inferior al -5 %, tal como -6 %, -10 %, y así sucesivamente) tras la unión del mAb se definió como significativamente protegido. Los péptidos correspondientes a los aminoácidos 400-422 (FVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYN) (SEQ ID NO: 845), 453-486 (YRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGF) (SEQ ID NO: 846) y 490-515 (FPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSF) (SEQ ID NO: 847) del RBD estaban significativamente protegidos por el mAb10986.
En resumen, la mayoría de los anticuerpos neutralizantes probados entran en contacto con el RBD de una manera que se superpone a los restos del RBD que componen la interfaz ACE2; asimismo, los anticuerpos se pueden agrupar en función de su patrón de contacto con la superficie del RBD, como se muestra en la figura 15. Los datos anteriores también se resumen en las tablas 14 a 25.
Tabla 14: Péptidos del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular con protección i nifi iv r l f rm i n RBD-mA n m r i n n l RBD l
continuación
Tabla 15: Péptidos del RBD de la proteína espicular con protección significativa tras la formación del com le o RBD-mAb10987 en com aración con el RBD solo
Tabla 16: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10934 en com aración con el RBD solo
Tabla 17: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10933 en com aración con el RBD solo
Tabla 18: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10920 en com aración con el RBD solo
Tabla 19: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10922 en com aración con el RBD solo
Tabla 20: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10936 en com aración con el RBD solo
Tabla 21: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10954 en
com aración con el RBD solo
Tabla 22: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10964 en com aración con el RBD solo
Tabla 23: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10977 en com aración con el RBD solo
Tabla 24: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10984 en com aración con el RBD solo
continuación
Tabla 25: Péptidos del RBD con protección significativa tras la formación del complejo RBD-mAb10986 en com aración con el RBD solo
Ejemplo 12: Neutralización de proteínas espiculares de variantes del SARS-CoV-2 y de tipo silvestre
Para probar si los anticuerpos contra la proteína espicular del SARS-CoV-2 pueden neutralizar las variantes del SARS-CoV-2, estos anticuerpos se seleccionaron respecto a un grupo de virus del pseudotipo VSV que expresan proteínas espiculares de tipo silvestre y variantes. Los virus del pseudotipo VSV se generaron mediante la transfección transitoria de células 293T con un plásmido que codifica la proteína espicular del SARS-CoV-2 o el mismo plásmido que contiene variaciones de nucleótidos que codifican variantes conocidas de la secuencia de aminoácidos de la proteína espicular del SARS-CoV-2. Todos los plásmidos se confirmaron mediante secuenciación de Sanger. Las células se sembraron en placas de 15 cm a 1,2 * 107 células por placa en medio completo DMEM (1000 ml de DMEM, Gibco; 100 ml de FBS, Gibco; 10 ml de PSG, Gibco) un día antes de la transfección con 15 pg/placa de ADN espicular con 125 pl de Lipofectamina LTX, 30 pl de reactivo PLUS y hasta 3 ml de Opti-Mem. 24 horas después de la transfección, las células se lavaron con 10 ml de PBS, después se infectaron con una MOI de 0,1 virus VSVAG:mNeon en 10 ml de Opti-Mem. El virus se incubó en las células durante 1 hora, con suave balanceo cada 10 minutos. Las células se lavaron 3 veces con 10 ml de PBS, después se cubrieron con 20 ml de medio de infección (1000 ml de DMEM, Gibco; 10 ml de piruvato de sodio, Gibco; 7 ml de BSA, Sigma; 5 ml de gentamicina, Gibco) antes de la incubación a 37 °C, CO2 al 5 % durante 24 horas. El sobrenadante del pseudovirus se recogió en tubos de centrífuga de 250 ml en hielo, después se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos para sedimentar cualquier desecho celular, se formaron alicuotas en hielo, después se
congelaron a -80 °C. La infectividad se analizó en células Vero antes de su uso en ensayos de neutralización. Este material se denominará VSVñG:mNe°7Pseudovims espicular, o VSVñG:mNeon/Espícula_(mutación variante de aminoácido) (por ejemplo, VSVñG:mNeon/Espícula-H49Y).
El Día 1, se sembraron células Vero al 80 % de confluencia en matraces T225, se lavaron con PBS (Gibco: 20012 043), se añadió TrypLE para separar las células del matraz y se añadió DMEM completo para inactivar la tripsina. Se sembraron 20.000 células Vero en 100 pl de DMEM completo precalentado por pocillo en microplacas de poliestireno negro de 96 pocillos (Corning: 3904). El Día 2, se descongeló en hielo VSV^'^^'Vpseudovirus espicular y se diluyó con medio de infección. Los anticuerpos se diluyeron en una placa de 96 pocillos con fondo en U, generando una dilución de cada anticuerpo en 210 pl de medio de infección a una concentración de ensayo 2*. Se transfirieron 120 pl de anticuerpos diluidos a una placa nueva con fondo en U y se añadieron medio y un anticuerpo de control IgG1 a cada placa. Se añadieron 120 pl de pseudovirus diluido a cada pocillo excepto a los pocillos de control con medio. A esos pocillos, se añadieron 120 pl de medio de infección. Se incubaron los pseudovirus con anticuerpos durante 30 minutos a temperatura ambiente, después se eliminó el medio de las células Vero. Se añadieron 100 pl de la mezcla de anticuerpo/pseudovirus a las células y después se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 24 horas. El día 3, el sobrenadante se eliminó de los pocillos de las células y se reemplazó con 100 pl de PBS. Las placas se leyeron en un citómetro de formación de imágenes SpectraMax i3 con MiniMax.
Además de probar la capacidad de neutralización con el virus VSV-SARS-CoV-2-S no replicante, los anticuerpos también se probaron con el virus SARS-CoV-2. Los anticuerpos monoclonales y las combinaciones de anticuerpos se diluyeron en serie en DMEM (Quality Biological), complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (v/v) (Sigma), penicilina/estreptomicina al 1 % (v/v) (Gemini Bio-products) y L-glutamina al 1 % (v/v) (concentración final 2 mM, Gibco) (medio VeroE6) hasta un volumen final de 250 pl. A continuación, se añadieron 250 pl de medio VeroE6 que contenía SARS-CoV-2 (WA-1) (1000 UFP/ml) a cada dilución de suero y a 250 pl de medio como control sin tratar. Las mezclas de virus y anticuerpos se incubaron durante 60 min a 37 °C. Después de la incubación, las cantidades de virus de las mezclas se determinaron mediante ensayo de placa. Finalmente, los valores de la cantidad de neutralización por reducción de placa al 50 % (PRNT50) (las diluciones de suero en las que la formación de placa se redujo en un 50 % en relación con el control no tratado) se calcularon con una curva logística de 4 parámetros ajustada a los datos de porcentaje de neutralización (GraphPad Software, La Jolla, CA).
La concentración inhibitoria semimáxima (CI50) del anticuerpo monoclonal individual contra el pseudovirus que expresa la proteína espicular (S) del VSV-SARS-CoV-2 que codifica la secuencia de la proteína espicular de Wuhan-Hu-1 (S-ts) (Número de registro del NCBI MN908947.3) se determinó en células Vero (Tabla 26). La mayoría de los anticuerpos mostraron una potencia de neutralización en el intervalo picomolar (pM), presentando algunos una potencia de neutralización en el intervalo nanomolar (nM).
Mientras que ACE2 recombinante fue capaz de mediar en la neutralización de las pseudopartículas espiculares del VSV, como se ha indicado anteriormente, su potencia fue muy inferior a la de los anticuerpos monoclonales, con una disminución de más de 1000 veces en la potencia observada en relación con los mejores mAb neutralizantes (Figura 10A). Además, la potente actividad neutralizante de mAb10987, mAb10989, mAb10933 y mAb10934 se confirmaron en ensayos de neutralización, que incluían la neutralización del SARS-CoV-2 en células VeroE6 (Figura 10B). Todos los ensayos de neutralización generaron una potencia similar en los cuatro mAb (mAb10987, mAb10989, mAb10933 y mAb10934) y ninguna combinación demostró actividad de neutralización sinérgica (Figura 10B).
Tabla 26: Potencia de neutralización del mAb (CI50 (M)) contra la cepa de tipo silvestre de pseudopartículas VSV-SARS-CoV-2-S en células Vero
continuación
Se identificaron variantes de aminoácidos en la proteína espicular (S) de más de 7000 secuencias del SARS-CoV-2 disponibles públicamente, lo que representa aislados que circulan globalmente y clonados en pseudopartículas de VSV. Se realizaron ensayos de neutralización con pseudopartículas que codifican variantes para evaluar el impacto de cada variante en la potencia de neutralización de los anticuerpos monoclonales. En la tabla 27 se ilustra la potencia de neutralización relativa de los anticuerpos monoclonales contra pseudopartículas que codifican variantes en relación con la espícula del SARS-CoV-2 (S-ts) a una concentración única de 5 pg/ml. Se capturó el porcentaje de neutralización en relación con la S-ts para cada anticuerpo individual y variante. Ninguno de los anticuerpos demostró pérdida de potencia de neutralización a la concentración de 5 pg/ml con la excepción del mAb10985 y la variante R408I. Estos datos demuestran una amplia cobertura de neutralización funcional de anticuerpos monoclonales contra variantes espiculares del SARS-CoV-2 que circulan a nivel mundial.
Para cuestionar aún más el impacto de las variantes de la proteína S en la potencia de neutralización de los anticuerpos monoclonales, se ejecutaron curvas de neutralización completas para determinar el valor de la CI50 de los anticuerpos neutralizantes más potentes contra un subconjunto de variantes localizadas dentro del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína S. En la tabla 28 se muestran los valores de neutralización CI50 para cada variante de pseudopartícula. Se puede observar una variabilidad intrínseca de hasta 3 veces entre los ensayos de neutralización de pseudopartículas y no indica un cambio en la potencia de neutralización. Estos datos demuestran que los anticuerpos conservaron su potencia de neutralización respecto a un grupo diverso de variantes del RBD de la proteína S.
Tabla 27. Neutralización relativa de las variantes del VSV-SARS-CoV-2 que codifican la proteína S a una
Tabla 27 cont.
continuación
Tabla 28. Neutralización^ CI50 M de variantes VSV-SARS-CoV-2-S RBD en células Vero
Tabla 28 cont.
Ejemplo 13: Cinética de unión de Biacore de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S purificados La constante de disociación (KD) en equilibrio para diferentes reactivos del RBD del SARS-CoV-2 que se unen a anticuerpos monoclonales (mAb, del inglés monoclonal antibodies) anti-SARS-CoV-2 CHOt purificados se determinó utilizando una resonancia de plasmón superficial en tiempo real basada en un biosensor Biacore T200/Biacore 8K.
Todos los estudios de unión se realizaron en HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, tampón de ejecución a pH 7,4 (HBS-ET) a 25 °C y 37 °C. La superficie del chip sensor Biacore CM5 se derivatizó primero mediante acoplamiento de amina con mAb de ratón específico anti-Fc humano (Regeneron, mAb2567) para capturar mAb anti-SARS-CoV-2. Los estudios de unión se realizaron en el dominio extracelular del RBD del SARS-CoV-2 humano expresado con un myc-myc-hexahistidina carboxiterminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH) y en el dominio extracelular del RBD del SARS-CoV-2 expresado con un IgG2a de ratón carboxiterminal (SARS-CoV-2 RBD-mFc). El uso de estos reactivos permitió probar la capacidad de los anticuerpos para unirse a péptidos RBD monoméricos y diméricos, respectivamente.
Se inyectaron diferentes concentraciones de hSARS-CoV-2 RBD-MMH, (90 nM a 3,33 nM, dilución de 3 veces) y SARS-CoV-2 RBD-mFc (30 nM a 1,11 nM, dilución de 3 veces) preparadas en tampón de ejecución HBS-ET durante 3 minutos a un caudal de 50 pl/min mientras se controlaba la disociación del mAb unido a diferentes reactivos de RBD del SARS-CoV-2 durante 6 a 10 minutos en tampón de ejecución HBS-ET. Al final de cada ciclo, la superficie de captura del mAb anti-RBD del SARS-CoV-2 se regeneró utilizando una inyección de 12 segundos de ácido fosfórico 20 mM para la superficie del mAb de ratón específico anti-Fc humano. La tasa de asociación ( k a ) y tasa de disociación ( k d ) se determinaron mediante el ajuste de los sensogramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el programa informático BiaEvaluation v3.1 o el programa informático Biacore Insight Evaluation v2.0. o el programa informático de ajuste de curvas. La constante de disociación (KD) en equilibrio de unión y las semividas disociativas (t1^ ) se calcularon a partir de las constantes cinéticas como:
Los parámetros de cinética de unión para diferentes mAb contra el SARS-CoV-2 que se unen a diferentes reactivos anti-RBD del SARS-CoV-2 de la invención a 25 °C y 37 °C se muestran en las tablas 29 a 32, respectivamente.
Tabla 29: Parámetros de cinética de unión de la unión del SARS-CoV-2 RBD-MMH a anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S a 25 °C.
continuación
Tabla 30: Parámetros de cinética de unión de la unión del SARS-CoV-2 RBD-MMH a anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S a 37 °C.
continuación
Tabla 31: Parámetros de cinética de unión de la unión del SARS-CoV-2 RBD-mFc a anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S a 25 °C.
continuación
Tabla 32: Parámetros de cinética de unión de la unión del SARS-CoV-2 RBD-mFc a anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S a 37 °C
continuación
Ejemplo 14: Los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 bloquean la unión de RBD a hACE2 como se determina por ELISA
Se utilizó un ensayo de bloqueo basado en ELISA para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 para bloquear la unión del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular del SARS-CoV-2 a su receptor, la enzima convertidora de angiotensina de tipo 2 humana (hACE2).
La proteína del SARS-CoV-2 utilizada en este ensayo estaba compuesta por la porción del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular del SARS-CoV-2 (aminoácidos Arg319-Phe541) expresada con la porción Fc de la IgG1 humana en el extremo C (SARS-CoV-2 RBD-hFc) La proteína ACE2 humana utilizada en los experimentos se adquirió de R&D Systems y estaba compuesta por los aminoácidos Gln18-Ser740 con un marcador de histidina 10* carboxiterminal (hACE2-His; n.° de registro del NCBI Q9BYF1).
Los experimentos se llevaron a cabo usando el siguiente procedimiento. Se recubrió un anticuerpo monoclonal anti-Penta-His (Qiagen) a 1 |jg/ml en PBS en una placa de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4 °C. El receptor hACE2-His se añadió a 0,2 pg/ml en PBS y se unió durante dos horas a temperatura ambiente (TA). Los sitios de unión no específica se bloquearon posteriormente con una solución de BSA al 0,5 % (p/v) en PBS. En otras placas de microtitulación, se unió una cantidad constante de proteína SARS-CoV-2 RBD-hFc 100 pM con anticuerpos anti-SARS-CoV-2 y un control de isotipo de anticuerpo IgG1 en diluciones de 0,0008 nM a 50 nM en PBS BSA al 0,5 %. Después de una hora de incubación, las soluciones de la mezcla se transfirieron a la placa de microvaloración recubierta con hACE2-His. Después de 1,5 horas de incubación a TA, se lavaron los pocillos y se detectó el SARS-CoV-2 unido a la placa con anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson). A continuación, las placas se revelaron utilizando una solución de sustrato TMB (BD Biosciences, n.° 555214) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y se midió la absorbencia a 450 nm en un lector de placas Victor X5.
El análisis de los datos de unión usó un modelo de dosis-respuesta sigmoideo dentro del programa informático Prism™ (GraphPad). El valor de la CI50 calculada, definida como la concentración de anticuerpo necesaria para bloquear el 50 % de la unión de SARS-CoV-2 RBD-hFc a hACE2-His que recubre la placa, se usó como indicador de la potencia de bloqueo. El porcentaje de bloqueo se definió en función de la señal de unión con corrección de fondo observada en la concentración de anticuerpo más elevada analizada con esta fórmula e indicada para todos los anticuerpos analizados:
% de bloqueo = 100 -( [Señal experimental (concentración de Ab más alta) - Señal de fondo (tamPón)1 ><100)
[Señal máxima (hEGF.mFc solo) - Señal de fondo (tampón)]
Los anticuerpos que bloquearon la unión en un 50 % o menos en la concentración más alta analizada se clasificaron como no bloqueadores y no se informaron los valores de CI50 para esos anticuerpos.
La capacidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 para bloquear la unión del RBD del SARS-CoV-2 a la ACE2 humana se evaluó mediante un ELISA de bloqueo. En este ensayo, se valoró SARS-CoV-2 RBD-hFc 100 pM con una amplia gama de concentraciones del anticuerpo anti-SARS-CoV-2-S y se evaluó la inhibición de la presencia del anticuerpo en la unión del RBD a hACE2-His. El RBD-hFc unido a la placa se detectó con un anticuerpo anti-hFc conjugado con HRP.
Las CI50 de bloqueo y el bloqueo máximo en las concentraciones más altas probadas de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S se resumen en la tabla 33 y las curvas de bloqueo se muestran en las figuras 1 a 8. De los 46 anticuerpos analizados, 44 mostraron bloqueo dependiente de la concentración del anticuerpo de la unión de RBD.hFc a hACE-2. Los valores de la CI50 variaron de 41 pM a 4,5 nM y el bloqueo máximo varió del 55 % a aproximadamente el 100 % en la concentración de anticuerpo más alta probada. Dos anticuerpos de los 46 analizados no mostraron actividades de bloqueo en las condiciones del ensayo. El anticuerpo de control de isotipo irrelevante no mostró actividad de bloqueo, como cabía esperar.
Tabla 33: Potencia de bloqueo de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2 en la unión de RBD-hFc espicular a ACE-2 humana inmovilizada
(continuación)
(continuación)
Ejemplo 15: Competencia cruzada entre mAb10987, mAb10989, mAb10933 y mAb10934
mAb10987, mAb10989, mAb10933 y mAb10934 se examinaron en ensayos de unión de competencia cruzada (Figura 11), identificando varios pares de mAb no competitivos con potencia de neutralización picomolar que potencialmente podrían combinarse para formar mezclas de anticuerpos, por ejemplo, mAb10987 y mAb0933.
El agrupamiento de epítopos de los mAb anti-SARS-CoV-2-S se realizó en un formato de sándwich premezclado que implicaba mAb competitivos entre sí en una forma combinatoria por pares para unirse a la proteína SARS-CoV-2 RBD-m Mh usando un instrumento de interferometría de biocapa ForteBio Octet HTX (Molecular Devices ForteBio LLC, Fremont, CA) con tampón de ejecución de HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05 % (v/v), pH 7,4, BSA 1 mg/ml. Los ensayos se realizaron a 30 °C con agitación continua a 1000 rpm. Después de obtener un valor inicial en el tampón de ejecución, se capturaron 20 pg/ml de mAb anti-COVID19 en puntas de biosensor de anti-Fc humano (AHC) durante 300 s. Para bloquear los sitios de unión insaturados libres restantes en las puntas del biosensor AHC, todos los sensores se expusieron durante 240 s a una solución de bloqueo que contenía 100 pg/ml de IgG1 irrelevante. Siguiendo este proceso, los biosensores se sumergieron en pocillos que contenían una solución premezclada de proteína SARS CoV-2 RBD-MMH 100 nM y de sitio de unión de mAb anti-COVID19 600 nM de un segundo mAb durante 300 s. Se registró la respuesta de unión en cada etapa y se normalizó la señal específica restando el control que compite con el mAb autobloqueante del conjunto de datos. El análisis de datos se realizó con el programa informático Octet Data Analysis HT 10.0 usando Epitope Binning.
La comparación de los ensayos de unión de competencia cruzada con los resultados de HDX-MS descritos anteriormente proporciona información estructural sobre el mecanismo por el cual los pares de anticuerpos que no compiten pueden unirse simultáneamente al RBD y, por lo tanto, pueden ser socios ideales para una mezcla de anticuerpos terapéuticos. mAb10987 y mAb10933 representan dicho par de anticuerpos. mAb10933 se dirige a la región de bucle similar a la espícula en un borde de la interfaz de ACE2. Dentro de esa región, los restos que muestran la protección HDX más significativa por mAb10933 miran hacia arriba, lo que sugiere que la región Fab del mAb10933 se une al RBD desde la dirección superior, donde el mAb10933 tendrá colisiones significativas con ACE2. Para evitar la competencia con mAb10933, mAb10987 solo se une a las regiones protegidas definidas por HDX desde el frente o el lado inferior izquierdo (en la vista frontal de mAb10987 en la figura 12). Esto es coherente con los datos de neutralización descritos anteriormente, ya que mAb10987 lo orientaría en una posición que tiene una elevada probabilidad de interferir con ACE2.
Ejemplo 16: Determinación de la estructura de la proteína espicular unida a anticuerpos
Para comprender mejor la unión de mAb10933 y mAb10987 al RBD de la proteína espicular, se realizó un análisis estructural mediante microscopía crioelectrónica (cryoEM). Los fragmentos Fab del mAb10933 y del mAb10987 se aislaron utilizando el kit FabAL.ACTICA (Genovis). Se mezclaron 600 pg de Fab del mAb10933 y 600 pg de Fab del mAb10987 con 300 pg del RBD del SARS-CoV-2-S y se incubaron en hielo durante ~1 hora, después se inyectaron en una columna de filtración de gel de aumento Superdex 200 equilibrada con T ris 50 mM pH 7,5 y NaCl 150 mM. Las fracciones máximas que contenían el complejo Fab del mAb10933 - Fab del mAb10987 - RBD se recogieron y se concentraron utilizando un filtro centrífugo MWCO de 10 kDa. Para la preparación de rejillas cryoEM, la muestra de proteína se diluyó a 1,5 mg/ml y se añadió anfipol PMAL-C8 al 0,15 %. Se depositaron 3,5 pl de proteína en una rejilla UltrAufoil recién limpiada con plasma (1,2/1,3, malla 300). El exceso de solución se eliminó utilizando papel de filtro y se sumergió congelada en etano líquido utilizando un Vitrobot Mark IV. La rejilla cryoEM se transfirió a un Titan Krios (Thermo Fisher) equipado con un detector K3 (Gatan). Las películas se recogieron con EPU (Thermo Fisher) con un aumento de 105.000*, que corresponde a un tamaño de píxel de 0,85 A. Se utilizó una tasa de dosificación de 15 electrones por píxel por segundo y cada película fue de 2 segundos, lo que corresponde a una dosis total de ~40 electrones por Á2.
Todo el procesamiento de datos cryoEM se llevó a cabo con cryoSPARC v2.14.2. Se alinearon 2.821 películas
mediante la corrección de movimiento de parches y la estimación de CTF de parches. Se seleccionaron 2.197 micrografías alineadas para su posterior procesamiento sobre la base de valores de desenfoque estimados y resoluciones de ajuste CTF. Un conjunto inicial de partículas seleccionadas con el selector de manchas se sometió a clasificación 2D para generar plantillas para la selección de plantillas. 989.553 partículas seleccionadas mediante la selección de plantillas se sometieron a varias rondas de clasificación 2D para eliminar los Fab no unidos y las partículas que contenían un complejo incompleto. La reconstrucción del Ab inicial con tres clases generó una única clase que contenía 61.707 partículas que correspondían al complejo Fab del mAb10933 - Fab del mAb10987 - RBD. El procesamiento heterogéneo de las partículas de esta clase seguido de un procesamiento no uniforme dio como resultado un mapa de resolución de 3,9 A (FSC=0,143) que contenía 48.140 partículas que se utilizó para la construcción del modelo. En este mapa, los modelos del RBD (tomados del código PDB 6M17) y los dos Fab (tomados de estructuras de anticuerpos anteriores, excepto la cadena ligera A del mAb10987 que procedía del código PDB 5U15), se colocaron manualmente. A continuación, estos modelos se reconstruyeron manualmente usando Coot y se refinaron en el espacio real contra el mapa usando Phenix.
Confirmando los datos arriba descritos, crioEM de una sola partícula del complejo del RBD de la espícula del SARS-CoV-2 unido a fragmentos Fab de mAb10933 y mAb10987 muestra que los dos anticuerpos en esta mezcla pueden unirse de manera simultánea a distintas regiones del RBD (Figura 13A, figura 13B y figura 14). Un mapa reconstruido en 3D del complejo con una resolución nominal de 3,9 A muestra que ambos fragmentos Fab se unen a diferentes epítopos en el RBD, lo confirma que son anticuerpos no competitivos. mAb10933 se une en la parte superior del RBD, superponiendo ampliamente el sitio de unión para ACE2. Por otro lado, el epítopo para el mAb10987 se encuentra en el lado del RBD, muy lejos del epítopo del mAb10933, y tiene poca o ninguna superposición con el sitio de unión para ACE2.
Ejemplo 17: Competencia cruzada entre mAb anti-SARS-CoV-2-S
La competencia de unión entre los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-SARS-CoV-2-S se determinó utilizando un ensayo de interferometría de biocapa sin marcador (BLI) en tiempo real en la plataforma de biosensores Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Todo el experimento se realizó a 25 °C en tampón HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, BSA 1 mg/ml, a pH 7,4 (HBS-EBT) con la placa agitando a una velocidad de 1000 rpm. Para evaluar si dos mAb fueron capaces de competir entre sí para unirse a sus respectivos epítopos en el dominio extracelular RBD de la SARS-CoV-2-S expresado con una myc-myc-hexahistidina carboxiterminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH), primero se capturaron ~0,51 nm de SARS-CoV-2-S RBD-MMH con puntas de biosensor Octet recubiertas de anticuerpos anti-Penta-His (Fortebio Inc, n.° 18-5122) sumergiendo las puntas de biosensor durante 1 minuto en pocillos que contenían una solución 10 pg/ml de SARS-CoV-2-S RBD-MMH. El SARS-CoV-2-S RBD-MMH capturado por las puntas del biosensor se saturaron a continuación con un primer anticuerpo monoclonal anti- SARS-CoV-2-S (posteriormente denominado mAb-1) sumergiéndolo en pocillos que contenían una solución de mAb-1 50 pg/ml durante 5 minutos. Las puntas del biosensor se sumergieron posteriormente en pocillos que contenían una solución a 50 pg/ml de un segundo anticuerpo monoclonal anti- SARS-CoV-2-S (posteriormente denominado mAb-2) durante 5 minutos. Las puntas del biosensor se lavaron en tampón HBS-ETB entre cada etapa del experimento. La respuesta de unión en tiempo real se controló durante todo el transcurso del experimento y se registró la respuesta de unión al final de cada etapa. Se comparó la respuesta de unión del mAb-2 a SARS-CoV-2-RBD-MMH formando complejo previamente con el mAb-1 y se determinó el comportamiento competitivo/no competitivo de distintos anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2 como se muestra en la tabla 34.
Tabla 34: Com etencia cruzada entre anticuer os anti-SARS-CoV-2-S
continuación
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Ejemplo 18: Sensibilidad al pH de los anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S que se unen a los reactivos monoméricos SARS-CoV-2-S RBD medidos a 37 °C
Las constantes de velocidad de disociación (kd) para diferentes anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S en tampones de pH 7,4, pH 6,0 y pH 5,0 se determinaron utilizando un biosensor Biacore T200 basado en resonancia de plasmón superficial (SPR) en tiempo real. Todos los estudios de unión se realizaron a 37 °C utilizando tres tampones de ejecución, (i) PbS, tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, pH 7,4 (PBS-T-pH 7,4) (ii) PBS, tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, pH 6,0 (PBS-T-pH 6,0) y (iii) PBS, tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, pH 5,0 (PBS-T-pH 5,0). La superficie del chip sensor Biacore CM5 se derivatizó primero mediante acoplamiento de amina con un mAb específico de ratón anti-Fc humano (Regeneron) para capturar anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S. Los estudios de unión se realizaron en el dominio extracelular RBD de la SARS-CoV-2-S humano expresado con una myc-mychexahistidina carboxiterminal (SARS-CoV-2 RBD-MMH). Se inyectaron concentraciones únicas de SARS-CoV-2-S RBD-MMH (90 nM) preparadas en tampón PBS-T-pH 7,4 a un caudal de 25 pl/min durante 3 minutos seguido de la disociación del SARS-CoV-2-S RBD-MMH unido en los tampones de ejecución PBS-T-pH 7,4, PBS-T-pH 6,0 o PBS-T-pH 5,0 durante 5 minutos.
Las constantes de velocidad de disociación (kd) en cuatro tampones de ejecución de pH se determinaron mediante el ajuste de los sensogramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. La semivida disociativa (t1^ ) se calculó a partir de los valores de k d como:
t / (min) =
l n ( 2 )
60 x k d
La
k d
y los valores t1^ para la unión de SARS-CoV-2-S RBD-MMH a diferentes anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S en PBS-T-pH 7,4 seguido de disociación en PBS-T-pH 7,4 y PBS-T-pH 6,0 a 37 °C se muestran en la tabla 35. La
k d
y los valores t1^ para la unión de SARS-CoV-2-S
R B D - M M h
a diferentes anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S en PBS-T-pH 7,4 seguido de disociación en PBS-T-pH 7,4 y PBS-T-pH 5,0 a 37 °C se muestran en la tabla 36. La comparación de la semivida disociativa (t1^ ) de SARS-CoV-2
R b D - M m H
en tampones de pH 7,4, pH 6,0 y pH 5,0.
Ejemplo 19: Anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S que se unen a partículas similares a virus
Para investigar la capacidad de un grupo de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2 para unirse a la glucoproteína espicular del SARS-CoV-2, se desarrolló un ensayo de unión
in v itro
que utiliza el virus de la estomatitis vesicular (VSV) pseudotipado con la proteína espicular del SARS-CoV-2 en una plataforma de detección basada en electroquimioluminiscencia (MSD).
Se generaron partículas pseudovíricas (VLP) del virus de la estomatitis vesicular (VSV) pseudotipadas a partir de células HEK293T para expresar de manera transitoria la proteína espicular del SARS-CoV-2 (número de registro MN908947.3, aminoácidos 16 a 1211). También se generaron VLP que expresan VSV únicamente como control de unión negativo.
Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento. Las VLP de las dos fuentes descritas anteriormente se diluyeron en PBS, se sembraron en placas de electrodos de carbono de 96 pocillos (MULTI-ARRAY high bind plate, MSD) y se incubaron durante la noche a 4 °C para permitir que se adhirieran las VLP. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con BSA al 2 % (p/v) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. A las partículas unidas a la placa, se añadieron por duplicado anticuerpos anti-SARS-CoV-2 y un control de IgG1 humana no unida, diluidos en PBS BSA al 0,5 % en un intervalo de concentraciones de 0,0008 nM a 50 nM y tampón sin anticuerpo, y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. A continuación, se lavaron las placas con PBS 1* para retirar los anticuerpos no unidos utilizando un lavador de placas AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Los anticuerpos unidos a la placa se detectaron con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados, las placas se desarrollaron con el tampón de lectura (MSD) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante y las señales luminiscentes se registraron con un instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Las señales de unión directa (en URL) se capturaron para las VLP que expresan el SARS-CoV-2 y las VLP solo para VSV.
La capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S para unirse a VLP que expresan SARS-CoV-2-S en comparación con la unión a VLP que expresan VSV irrelevantes se evaluó mediante un ensayo de inmunounión. La unión a las VLP inmovilizadas en placas High Bind (MSD) de 96 pocillos se realizó con una serie de diluciones de anticuerpos y los anticuerpos unidos se detectaron con anti-IgG humana conjugada con SULFO-TAGTM. Las señales de unión de la electroquimioluminiscencia se registraron en un Sector Imager 600 (MSD). Se determinaron los valores en URL para la unión del anticuerpo a las VLP. Todos los anticuerpos mostraron una unión dependiente de la concentración y las proporciones de unión en las VLP que expresan SARS-CoV-2-S frente a las que solo expresan VSV se analizaron a 5,5 nM y 0,20 nM.
Los resultados de unión de los mAb anti-SARS-CoV-2-S en las dos concentraciones a las VLP de VSV/Espícula y VSV solo se resumen en la tabla 37. De 46 anticuerpos probados, 44 anticuerpos se unieron de manera específica a VSV/Espícula con una relación a VSV de 3 o superior en cualquier concentración. A 0,2 nM de anticuerpo, la relación de VSV/Espícula respecto a VSV varió de 3 a 56, y a 5 nM la relación varió de 3 a 303. Aunque dos anticuerpos (mAb10998 y mAb11002) mostraron una unión débil a las VLP de VSV/Espícula, con proporciones inferiores a 3 frente a las VLP de VSV, las señales a 5 nM fueron más elevadas en VSV/Espícula que en VSV. Un anticuerpo de isotipo IgG1 irrelevante mostró una unión mínima, como cabía esperar.
Tabla 37: Especificidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S que se unen a las VLP de VSV que expresan roteínas es iculares res ecto a VSV mediante electro uimioluminiscencia
continuación
Ejemplo 20: Anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S que se unen a células que expresan proteínas espiculares Para investigar la capacidad de un grupo de anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2-S para unirse a células que
expresan SARS-CoV-2-S, se desarrolló un ensayo de unión
in v itro
que utiliza células que expresan SARS-CoV-2-S en una plataforma de detección basada en electroquimioluminiscencia (MSD).
Se genomanipularon células inducibles Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3G para expresar de manera transitoria la proteína espicular del SARS-CoV-2 (Número de registro MN908947.3, aminoácidos 16 a 1211, Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-On 3G Inducible COVID-19 Spike Protein High Sorted) y citometría de flujo ordenada para la selección de una expresión elevada de la proteína del SARS-CoV-2. Las Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-3G parentales también se incluyeron en los experimentos como control de unión negativa.
Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el siguiente procedimiento. Las células de las dos estirpes descritas anteriormente se indujeron con 1 pg/ml de doxiciclina a 37 °C durante 36 horas antes de la recogida, se centrifugaron, se lavaron con p Bs , después se diluyeron en PBS, se sembraron en placas de electrodos de carbono de 96 pocillos (MULTI-ARRAY high bind plate, MSD) y se incubaron durante la noche a 4 °C para permitir que se adhirieran las células. Los sitios de unión no específicos se bloquearon con BSA al 2 % (p/v) en PBS durante una hora a temperatura ambiente. A las células unidas a la placa, se añadieron por duplicado anticuerpos anti-SARS-CoV-2 y un control de IgG1 humana no unida, diluidos en PBS BSA al 0,5 % en un intervalo de concentraciones de 0,0008 nM a 50 nM y tampón sin anticuerpo, y las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con agitación. A continuación, se lavaron las placas con PBS 1* para retirar los anticuerpos no unidos utilizando un lavador de placas AquaMax2000 (MDS Analytical Technologies). Los anticuerpos unidos a la placa se detectaron con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con SULFO-TAGTM (Jackson Immunoresearch) durante una hora a temperatura ambiente. Después de los lavados, las placas se desarrollaron con el tampón de lectura (MSD) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante y las señales luminiscentes se registraron con un instrumento SECTOR Imager 600 (Meso Scale Development). Las señales de unión directa (en URL) se capturaron para las células que expresan SARS-CoV-2-S y una estirpe celular de control negativo.
La capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-SARS-CoV-2 para unirse a las células que expresan la proteína espicular del SARS-CoV-2 en comparación con la unión a las células parentales se evaluó mediante un ensayo de inmunounión. La unión a las células inmovilizadas en placas High Bind (MSD) de 96 pocillos se realizó con una serie de diluciones de anticuerpos y los anticuerpos unidos se detectaron con anti-IgG humana conjugada con SULFO-TAGTM. Las señales de unión de la electroquimioluminiscencia se registraron en un Sector Imager 600 (MSD). Todos los anticuerpos mostraron una unión dependiente de la concentración y se analizó la relación entre la unión de las células que expresan la espícula y las células parentales a la concentración de 5,5 nM y 0,20 nM.
Los resultados de la unión de los mAb anti-SARS-CoV-2-S en las dos concentraciones a las células Jurkat parentales y que expresan la proteína espicular se resumen en la tabla 38. De los 46 anticuerpos analizados, 44 anticuerpos se unieron de manera específica a las células Jurkat/Espícula (células Jurkat/Tet3G/hCD20/Tet-On 3G Inducible SARS-CoV-2 Spike Protein High Sorted) con una proporción con respecto a las células parentales de 4 o más en cualquiera de las concentraciones. A 0,2 nM, las proporciones de las señales de unión en las células Jurkat/Espícula con respecto a las células parentales variaron de 4 a 36, y a 5 nM la proporción varió de 4 a 63. Aunque los dos anticuerpos (mAb10998 y mAb11002) mostraron una unión débil a las células Jurkat/Espícula con una proporción de unión respecto a las células parentales inferior a 4, a 5 nM las señales de unión fueron mayores en Jurkat/Espícula que en las células parentales. Un anticuerpo de isotipo IgG1 irrelevante mostró una unión mínima, como cabía esperar.
Tabla 38: Especificidad de los anticuerpos anti-SARS-CoV-2-S que se unen a las células Jurkat que expresan la
continuación
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832, en donde dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 202 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 210.2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende:(a) una región constante de inmunoglobulina;(b) una región constante de IgG1; o(c) una región constante de IgG1 humana.3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 216. 4. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 218. 5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno:(a) es multiespecífico; y/o(b) es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno recombinante.6. Una composición farmacéutica, que comprende:i) el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; yii) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.7. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a una proteína espicular del SARS-CoV-2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 832, en donde dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 640 y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 646.8. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 7, que comprende:(a) una región constante de inmunoglobulina;(b) una región constante de IgG1; o(c) una región constante de IgG1 humana.9. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 654.10. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 656.11. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno:(a) es multiespecífico; y/o(b) es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno recombinante.12. Una composición farmacéutica, que comprende:i) el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11; yii) un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202063004312P | 2020-04-02 | 2020-04-02 | |
US202063014687P | 2020-04-23 | 2020-04-23 | |
US202063025949P | 2020-05-15 | 2020-05-15 | |
US202063034865P | 2020-06-04 | 2020-06-04 | |
PCT/US2020/039707 WO2021045836A1 (en) | 2020-04-02 | 2020-06-25 | Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
US16/912,678 US10787501B1 (en) | 2020-04-02 | 2020-06-25 | Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2939895T3 true ES2939895T3 (es) | 2023-04-27 |
Family
ID=72614999
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES20186667T Active ES2939895T3 (es) | 2020-04-02 | 2020-07-20 | Anticuerpos antiglucoproteína espicular del SARS-CoV-2 y fragmentos de unión a antígeno |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US10787501B1 (es) |
EP (2) | EP4209507A1 (es) |
JP (3) | JP7116256B1 (es) |
KR (1) | KR20210134300A (es) |
CN (1) | CN113766928A (es) |
AU (1) | AU2020340881A1 (es) |
CA (2) | CA3192925A1 (es) |
CL (2) | CL2021000997A1 (es) |
CO (1) | CO2021005072A2 (es) |
CR (1) | CR20220552A (es) |
DK (1) | DK3889177T3 (es) |
ES (1) | ES2939895T3 (es) |
FI (1) | FI3889177T3 (es) |
HR (1) | HRP20230338T1 (es) |
HU (1) | HUE061425T2 (es) |
IL (1) | IL282060A (es) |
LT (1) | LT3889177T (es) |
MA (1) | MA54405B1 (es) |
MX (1) | MX2021004130A (es) |
MY (1) | MY197648A (es) |
PE (1) | PE20221893A1 (es) |
PH (1) | PH12021550793A1 (es) |
PL (1) | PL3889177T3 (es) |
PT (1) | PT3889177T (es) |
RS (1) | RS64105B1 (es) |
SG (1) | SG11202103404PA (es) |
SI (1) | SI3889177T1 (es) |
TW (2) | TWI785350B (es) |
WO (1) | WO2021045836A1 (es) |
Families Citing this family (183)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL292464A (en) | 2019-11-12 | 2022-06-01 | Regeneron Pharma | Methods and systems for identifying, classifying and/or ranking genetic sequences |
JP2023510289A (ja) * | 2020-01-09 | 2023-03-13 | ザ ユニバーシティー オブ クイーンズランド | ワクチン送達のための自己組織化自己アジュバント系 |
HUE062777T2 (hu) * | 2020-02-26 | 2023-12-28 | Vir Biotechnology Inc | SARS-CoV-2 elleni antitestek |
AU2021230334A1 (en) * | 2020-03-05 | 2022-09-29 | New York Blood Center, Inc. | Immunogenic compositions against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 |
US11365239B2 (en) * | 2020-03-20 | 2022-06-21 | Tsb Therapeutics (Beijing) Co., Ltd. | Anti-SARS-COV-2 antibodies and uses thereof |
WO2021190980A1 (en) * | 2020-03-22 | 2021-09-30 | Quadrucept Bio Limited | Multimers for viral strain evolution |
WO2021194985A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Centivax, Inc. | Anti-sars-cov-2 antibodies derived from 6nb6 |
WO2021194886A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Centivax, Inc. | Anti-sars-cov-2 antibodies derived from 3bgf |
WO2021194891A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Centivax, Inc. | Anti-sars-cov-2 antibodies derived from cr3022 |
WO2021194965A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Centivax, Inc. | Superhuman anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof |
WO2021194896A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Centivax, Inc. | Anti-sars-cov-2 antibodies derived from 2ghw |
WO2021194951A1 (en) * | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Centivax, Inc. | Anti-sars-cov-2 antibodies derived from 2dd8 |
CN111349150B (zh) * | 2020-03-24 | 2021-02-09 | 北京中科微盾生物科技有限责任公司 | 一种抑制新型冠状病毒的多肽及其用途 |
SG11202103404PA (en) * | 2020-04-02 | 2021-04-29 | Regeneron Pharma | Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
WO2021198999A1 (en) * | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Axon Neuroscience Se | Epitope-based vaccines for treatment of coronavirus associated diseases |
WO2021205022A1 (en) * | 2020-04-09 | 2021-10-14 | Valneva Austria Gmbh | Improved methods of producing a lipidated protein |
US20210331150A1 (en) * | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Kevin D. Fialko | Sars-cov-2 susceptibility detection |
WO2021218947A1 (zh) * | 2020-04-28 | 2021-11-04 | 北京大学 | 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用 |
WO2021221136A1 (ja) * | 2020-05-01 | 2021-11-04 | 花王株式会社 | 抗SARS-CoV-2抗体 |
EP4146272A1 (en) * | 2020-05-06 | 2023-03-15 | International AIDS Vaccine Initiative, Inc. | Covid-19 antibodies and uses thereof |
US20230168249A1 (en) * | 2020-05-06 | 2023-06-01 | Academia Sinica | Recombinant antibodies, kits comprising the same, and uses thereof |
WO2021222988A1 (en) * | 2020-05-07 | 2021-11-11 | Griffith University | Cell entry-modulating agents and uses therefor |
BR112022022558A2 (pt) | 2020-05-08 | 2022-12-13 | Academia Sinica | Polipeptídeo de hemaglutinina (ha) do vírus influenza quimérico, composição imunogênica, método de imunização de um indivíduo contra o vírus influenza ou prevenção de uma doença do vírus influenza, polinucleotídeo recombinante, vetor e célula hospedeira |
WO2021231659A1 (en) * | 2020-05-12 | 2021-11-18 | Sapphire Biotech, Inc. | Neutralizing antibody testing and treatment |
IL298194A (en) | 2020-05-26 | 2023-01-01 | Regeneron Pharma | Antibodies against sars-cov2-spike glycoprotein and antigen-binding fragments |
KR20230019166A (ko) | 2020-06-03 | 2023-02-07 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 항-SARS-CoV-2 스파이크 당단백질 항체를 이용한 SARS-CoV-2 감염 및 COVID-19 치료 또는 예방 방법 |
EP4176262A1 (en) | 2020-07-02 | 2023-05-10 | King Abdullah University Of Science And Technology | Nanobody functionalized electrochemical transistors and methods of making and using thereof |
US11740240B2 (en) * | 2020-07-20 | 2023-08-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Immunoassay for SARS-CoV-2 neutralizing antibodies and materials therefor |
WO2022027037A1 (en) | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Single Cell Technology, Inc. | Anti-sars corona virus-2 spike protein antibodies |
WO2022026592A2 (en) | 2020-07-28 | 2022-02-03 | Celltas Bio, Inc. | Antibody molecules to coronavirus and uses thereof |
CN111978378B (zh) * | 2020-08-10 | 2022-02-01 | 武汉大学 | SARS-CoV-2抗原多肽及其应用 |
EP4206224A1 (en) * | 2020-08-26 | 2023-07-05 | National University Corporation Kumamoto University | Human antibody or antigen-binding fragment thereof against coronavirus spike protein |
EP4211158A1 (en) * | 2020-09-14 | 2023-07-19 | Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd. | Neutralizing antibodies against sars-cov-2 |
WO2022054068A1 (en) * | 2020-09-14 | 2022-03-17 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Antibodies for the prevention, treatment and detection of coronavirus infection |
WO2022060916A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Regenxbio Inc. | Vectorized antibodies for anti-viral therapy |
TWI796597B (zh) * | 2020-09-21 | 2023-03-21 | 長庚大學 | 使用紫蘇之經水萃取的產物來對抗冠狀病毒感染的方法 |
CN116023478A (zh) * | 2020-09-30 | 2023-04-28 | 上海市公共卫生临床中心 | 冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段 |
CN116419971A (zh) * | 2020-09-30 | 2023-07-11 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 抗SARS-CoV-2刺突蛋白膜外区的单克隆抗体及其应用 |
WO2022068844A1 (en) * | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | Neutralizing antibody against sars-cov-2 |
EP4221749A1 (en) * | 2020-09-30 | 2023-08-09 | The Research Foundation for The State University of New York | Particle based formulations of sars-cov-2 receptor binding domain |
CN112159469B (zh) * | 2020-09-30 | 2022-08-02 | 上海市公共卫生临床中心 | 冠状病毒的抗体或其抗原结合片段 |
CN112125973B (zh) * | 2020-09-30 | 2022-02-01 | 上海市公共卫生临床中心 | 冠状病毒的特异性抗体或其抗原结合片段 |
KR20230061462A (ko) * | 2020-10-02 | 2023-05-08 | 일라이 릴리 앤드 캄파니 | 단백질 정제 공정에서의 숙주 세포 단백질 함량의 감소 방법 |
WO2022075921A1 (en) * | 2020-10-08 | 2022-04-14 | Hummingbird Bioscience Holdings Limited | Sars-cov-2 spike protein antigen-binding molecules |
WO2022079606A1 (en) * | 2020-10-12 | 2022-04-21 | Icosagen Cell Factory Oü | Sars cov-2 neutralizing antibodies |
CN112251414A (zh) * | 2020-10-12 | 2021-01-22 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种杂交瘤细胞株、其制备方法和应用 |
CN112194711A (zh) * | 2020-10-15 | 2021-01-08 | 深圳市疾病预防控制中心(深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所) | 一种新型冠状病毒s蛋白的b细胞线性抗原表位、抗体、鉴定方法及应用 |
EP4229081A1 (en) * | 2020-10-15 | 2023-08-23 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Antibody specific for sars-cov-2 receptor binding domain and therapeutic methods |
AU2021362007A1 (en) | 2020-10-16 | 2023-06-22 | Invisishield Technologies Ltd. | Compositions for preventing or treating viral and other microbial infections |
WO2022084817A1 (en) * | 2020-10-19 | 2022-04-28 | Lay Sciences Inc. | Protein drugs for prevention and treatment of covid-19 |
US20230390383A1 (en) * | 2020-10-20 | 2023-12-07 | Duke University | Replication incompetent influenza vaccine platform for foreign protein delivery |
GB202016650D0 (en) * | 2020-10-20 | 2020-12-02 | Primer Design Ltd | Kit and method |
US20230398204A1 (en) * | 2020-10-21 | 2023-12-14 | La Jolla Institute For Immunology | Coronavirus Spike Glycoprotein With Improved Expression and Stability |
EP4232470A1 (en) * | 2020-10-23 | 2023-08-30 | Atreca, Inc. | Antibodies to coronavirus sars-cov-2 |
KR20220054080A (ko) * | 2020-10-23 | 2022-05-02 | 주식회사 와이바이오로직스 | SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 |
CN112409488B (zh) * | 2020-10-23 | 2022-07-01 | 中国科学院上海药物研究所 | 针对多种冠状病毒的单克隆抗体及应用 |
WO2022093745A1 (en) * | 2020-10-26 | 2022-05-05 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Single domain antibodies targeting sars coronavirus spike protein and uses thereof |
US20240018191A1 (en) * | 2020-10-27 | 2024-01-18 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Chimeric coronavirus s protein compositions and methods of use |
CN112358533B (zh) * | 2020-10-30 | 2023-07-14 | 上海泽润生物科技有限公司 | 重组刺突蛋白及其制备方法和用途 |
US11453705B2 (en) | 2020-10-30 | 2022-09-27 | Achelois Biopharma, Inc. | Multivalent particles compositions and methods of use |
CA3200263A1 (en) * | 2020-10-30 | 2022-05-05 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Anti-sars-cov-2 antigen antibodies and related compositions and methods |
US11739137B2 (en) * | 2020-10-30 | 2023-08-29 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Single domain antibodies to SARS-CoV-2 nucleocapsid protein |
US11872279B2 (en) | 2020-10-30 | 2024-01-16 | Massachusetts Institute Of Technology | SARS-CoV-2 antigens and uses thereof |
WO2022094622A1 (en) * | 2020-11-02 | 2022-05-05 | The University Of Chicago | Polypeptides for detection and treatment of sars-cov-2 |
CN112098660B (zh) * | 2020-11-03 | 2021-02-09 | 北京百普赛斯生物科技股份有限公司 | 新型冠状病毒中和性抗体检测试剂盒 |
IL302645A (en) * | 2020-11-03 | 2023-07-01 | The Wistrar Inst Of Anatomy And Biology | DNA-encoded nanoparticles and methods for using them as a vaccine for the 2019 coronavirus disease (Covid-19) |
AR123997A1 (es) * | 2020-11-04 | 2023-02-01 | Univ Rockefeller | ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES CONTRA EL SARS-CoV-2 |
TW202233233A (zh) * | 2020-11-06 | 2022-09-01 | 醣基生醫股份有限公司 | 包含抗原和其醣工程化抗體之免疫組合物 |
US20230417748A1 (en) * | 2020-11-06 | 2023-12-28 | Green Cross Corporation | Coronavirus Spike Protein-Specific Antibody and Use Thereof |
WO2022095045A1 (zh) * | 2020-11-09 | 2022-05-12 | 上海济煜医药科技有限公司 | SARS-CoV-2抗体及其应用 |
WO2022101839A1 (en) * | 2020-11-12 | 2022-05-19 | Cadila Healthcare Limited | Anti-sars-cov-2 monoclonal antibodies and cocktail thereof |
WO2022102744A1 (ja) * | 2020-11-13 | 2022-05-19 | 株式会社ハカレル | SARS-CoV-2のスパイクタンパク質に対する抗体 |
CN112625136B (zh) * | 2020-11-18 | 2022-02-11 | 三优生物医药(上海)有限公司 | 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途 |
CA3200885A1 (en) * | 2020-11-23 | 2022-05-27 | Genentech, Inc. | Methods for modulating host cell surface interactions with sars-cov-2 |
CN112409479B (zh) * | 2020-11-23 | 2022-04-26 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-121及其应用 |
CN112439058A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-03-05 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 基于外泌体为载体的重组新型冠状病毒纳米疫苗方法 |
WO2022115558A1 (en) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | Deciphera Pharmaceuticals, Llc | Morpholino derivatives as vsp34 inhibitors for use in the treatment of a viral infection |
CA3199988A1 (en) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | Daniel L. Flynn | Pyridylpyridone derivatives as vsp34 inhibitors for use in the treatment of a viral infection |
CN112442120A (zh) * | 2020-11-25 | 2021-03-05 | 苏州大学 | 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体 |
WO2022115562A1 (en) * | 2020-11-25 | 2022-06-02 | Deciphera Pharmaceuticals, Llc | Morpholino derivatives as vsp34 inhibitors for use in the treatment of a viral infection |
WO2022112392A1 (en) | 2020-11-26 | 2022-06-02 | Memo Therapeutics Ag | Anti-sars-cov-2 antibody molecules |
EP4256080A1 (en) | 2020-12-03 | 2023-10-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of identifying subjects having an increased risk of developing a coronavirus infection and treatment thereof |
US20240044896A1 (en) * | 2020-12-09 | 2024-02-08 | The University Of Chicago | Methods and systems for detection and analysis of angiotensin binding antibodies |
US20240035035A1 (en) * | 2020-12-09 | 2024-02-01 | Yale University | Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections |
WO2022122788A1 (en) * | 2020-12-09 | 2022-06-16 | Institute For Research In Biomedicine | Multispecific antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 |
US11693011B2 (en) | 2020-12-14 | 2023-07-04 | Inbios International, Inc. | Neutralizing antibody immunoassays |
WO2022132887A1 (en) * | 2020-12-15 | 2022-06-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Human monoclonal antibodies targeting the sars-cov-2 spike protein |
WO2022132904A1 (en) * | 2020-12-17 | 2022-06-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2 |
WO2022139680A1 (en) * | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Sars-cov-2 binding molecules and uses thereof |
US20240043506A1 (en) * | 2020-12-23 | 2024-02-08 | Garvan Institute Of Medical Research | Sars-cov-2 antibodies |
CN112794884B (zh) * | 2020-12-28 | 2022-02-18 | 中国科学院微生物研究所 | 新型冠状病毒蛋白、制备方法及中和抗体检测试剂盒 |
CN112326973B (zh) * | 2020-12-31 | 2021-03-23 | 北京金沃夫生物工程科技有限公司 | 一种用于检测新型冠状病毒抗体的试剂盒及其应用 |
WO2022147290A1 (en) * | 2020-12-31 | 2022-07-07 | The Broad Institute, Inc. | Cross-neutralizing sars-cov2 antibodies |
WO2022150809A1 (en) * | 2021-01-05 | 2022-07-14 | Immunome, Inc. | Antibody cocktail against sars-cov-2 spike protein |
WO2022150660A1 (en) * | 2021-01-08 | 2022-07-14 | 10X Genomics, Inc. | Antigen-binding polypeptides specific for coronaviruses and uses thereof |
WO2022159834A1 (en) * | 2021-01-22 | 2022-07-28 | La Jolla Institute For Immunology | Chimeric anti-coronavirus spike protein antibodies |
WO2022158497A1 (ja) * | 2021-01-22 | 2022-07-28 | 株式会社mAbProtein | SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する抗体 |
WO2022162587A1 (en) * | 2021-01-27 | 2022-08-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) | Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection |
CN113264998B (zh) * | 2021-01-28 | 2023-02-28 | 四川大学华西医院 | 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用 |
CN117440966A (zh) * | 2021-01-28 | 2024-01-23 | 塔勒姆治疗有限责任公司 | 抗SARS-CoV-2刺突糖蛋白抗体及其治疗用途 |
CN115109151A (zh) * | 2021-01-31 | 2022-09-27 | 中南大学湘雅医院 | 新型冠状病毒单克隆抗体xy6及其应用 |
RU2771288C1 (ru) * | 2021-02-02 | 2022-04-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 |
WO2022167816A2 (en) * | 2021-02-04 | 2022-08-11 | Oxford University Innovation Limited | Antibodies |
US20240117011A1 (en) * | 2021-02-09 | 2024-04-11 | The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antibodies targeting the spike protein of coronaviruses |
EP4291212A1 (en) | 2021-02-15 | 2023-12-20 | LivingMed Biotech S.R.L. | Genetically clostridium modifiedstrains expressing recombinant antigens and uses thereof |
EP4297786A1 (en) * | 2021-02-23 | 2024-01-03 | Pandion Operations, Inc. | Pd-1 antibodies, polypeptides and uses thereof |
WO2022182662A1 (en) | 2021-02-23 | 2022-09-01 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for mapping antigen-binding molecule affinity to antigen regions of interest |
CN113009153B (zh) * | 2021-02-25 | 2023-12-15 | 山东莱博生物科技有限公司 | 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用 |
CN112679605B (zh) * | 2021-03-15 | 2021-07-09 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用 |
WO2022197720A2 (en) * | 2021-03-15 | 2022-09-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Compositions and methods for treating coronavirus infection |
EP4063384A1 (en) * | 2021-03-23 | 2022-09-28 | Ceinge Biotecnologie Avanzate SCarl | Human neutralizing antigen specific proteins for spike-rbd of sars-cov-2 |
CN113092776A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-07-09 | 苏州携创生物技术有限公司 | 一种SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒 |
WO2022204713A2 (en) * | 2021-03-26 | 2022-09-29 | Atreca, Inc. | Antibodies to sars-cov-2 |
WO2022210830A1 (ja) * | 2021-03-30 | 2022-10-06 | 国立大学法人 富山大学 | 抗SARS-CoV-2抗体 |
KR20220136945A (ko) * | 2021-04-01 | 2022-10-11 | (주)셀트리온 | 사스-코로나바이러스-2 스파이크 단백질의 에피토프에 결합하는 사스-코로나바이러스-2 중화 결합 분자 |
EP4321178A1 (en) * | 2021-04-05 | 2024-02-14 | Lg Chem, Ltd. | Vaccine composition against coronavirus |
EP4324848A1 (en) * | 2021-04-16 | 2024-02-21 | Korea University Research and Business Foundation | Human antibody targeting covid-19 virus |
AR125373A1 (es) * | 2021-04-19 | 2023-07-12 | Bharat Serums & Vaccines Ltd | ANTICUERPOS POLICLONALES CONTRA SARS-CoV-2 Y SUS APLICACIONES |
WO2022226079A1 (en) * | 2021-04-20 | 2022-10-27 | Inbios International, Inc. | Neutralizing antibodies against sars-cov-2 |
EP4326320A1 (en) * | 2021-04-20 | 2024-02-28 | D4 Labs, Llc | Adjuvanted vaccine composition and methods |
KR102426782B1 (ko) * | 2021-04-27 | 2022-07-28 | 국민대학교산학협력단 | SARS-CoV-2 RBD 항원 특이적 항체를 포함하는 진단용 조성물 또는 키트 |
WO2022231320A1 (ko) * | 2021-04-27 | 2022-11-03 | 국민대학교산학협력단 | Sars-cov-2 s 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 |
WO2022232255A2 (en) * | 2021-04-28 | 2022-11-03 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Antibodies for the treatment and prevention of covid-19 and emerging variants |
WO2022235678A1 (en) * | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Ohio State Innovation Foundation | Human anti-coronavirus peptide vaccines and methods of their use |
WO2022235960A1 (en) * | 2021-05-06 | 2022-11-10 | Sorrento Therapeutics, Inc. | Neutralizing antibodies that bind variant sars-cov-2 spike proteins |
CN112981011B (zh) * | 2021-05-12 | 2021-08-17 | 广东凯普生物科技股份有限公司 | 一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用 |
WO2022241057A1 (en) * | 2021-05-12 | 2022-11-17 | Applied Biomedical Science Institute | Binding polypeptides against sars cov-2 and uses thereof |
EP4089112A1 (en) * | 2021-05-14 | 2022-11-16 | Ustav organicke chemie a biochemie AV CR, v.v.i. | Antibody binding to rbd of spike protein of sars-cov-2 and a method for quantifying protective antibodies against sars-cov-2 |
GB202107057D0 (en) | 2021-05-18 | 2021-06-30 | Univ York | Glycosylation method |
WO2022251403A1 (en) * | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Sars-cov-2 antibodies and uses thereof |
CN113354733B (zh) | 2021-06-04 | 2022-02-18 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗SARS-CoV-2流行突变株的单克隆抗体20D8 |
CN113416245A (zh) * | 2021-06-15 | 2021-09-21 | 北京华大蛋白质研发中心有限公司 | 一种可结合SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的中和抗体及其应用 |
WO2022263638A1 (en) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) | Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection |
US20230002478A1 (en) * | 2021-06-22 | 2023-01-05 | Twist Bioscience Corporation | Methods and compositions relating to covid antibody epitopes |
WO2022271258A1 (en) * | 2021-06-25 | 2022-12-29 | La Jolla Institute For Immunology | Chimeric anti-sars-cov2 nucleoprotein antibodies |
CN113584223B (zh) * | 2021-06-28 | 2024-01-12 | 中国人民解放军疾病预防控制中心 | 基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法 |
WO2023275538A1 (en) * | 2021-06-28 | 2023-01-05 | Diosynvax Ltd | Beta-coronavirus vaccines |
WO2023283134A1 (en) | 2021-07-05 | 2023-01-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Utilization of antibodies to shape antibody responses to an antigen |
WO2023285620A2 (en) * | 2021-07-14 | 2023-01-19 | Alchemab Therapeutics Ltd. | Compositions and methods for targeting viral proteins |
US20230125469A1 (en) * | 2021-07-14 | 2023-04-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-SARS-CoV-2-Spike Glycoprotein Antibodies and Antigen-Binding Fragments |
CN113621651A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-11-09 | 南昌五元生物科技有限公司 | 一种基于s-tet蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型及其制备方法 |
WO2023002944A1 (ja) * | 2021-07-19 | 2023-01-26 | 公立大学法人福島県立医科大学 | 新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)およびSARSコロナウイルス(SARS-CoV)に結合する抗体 |
GB202110391D0 (en) | 2021-07-19 | 2021-09-01 | Tissue Click Ltd | A detection kit and methods of detection of infectious agents |
AU2022313322A1 (en) * | 2021-07-23 | 2024-02-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Characterization of potent and broadly neutralizing monoclonal antibodies against sars-cov-2, its variants, and related coronaviruses and methods of use |
US11724077B2 (en) * | 2021-07-28 | 2023-08-15 | Subhash Dhawan | Therapeutic swabs for treating upper respiratory infections |
WO2023008463A1 (ja) * | 2021-07-28 | 2023-02-02 | 株式会社イーベック | SARS-CoV-2野生株および変異株に対する中和ヒト抗体およびその抗原結合性断片 |
WO2023004477A1 (en) * | 2021-07-30 | 2023-02-02 | The University Of Melbourne | Neutralising antibodies and uses thereof |
CN113512113A (zh) * | 2021-08-03 | 2021-10-19 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体及应用 |
WO2023015229A2 (en) * | 2021-08-04 | 2023-02-09 | The Regents Of The University Of California | Sars-cov-2 virus-like particles |
US20230192818A1 (en) * | 2021-08-17 | 2023-06-22 | Twist Bioscience Corporation | Sars-cov-2 antibodies and related compositions and methods of use |
WO2023026207A1 (en) * | 2021-08-25 | 2023-03-02 | Translational Health Science And Technology Institute | Potently neutralizing novel human monoclonal antibodies against sars-cov-2 (covid-19) |
WO2023035016A1 (en) * | 2021-09-03 | 2023-03-09 | The Uab Research Foundation | Human neutralizing antibodies against sars-cov-2 spike s2 domain and uses thereof |
KR20230038626A (ko) * | 2021-09-06 | 2023-03-21 | 국민대학교산학협력단 | SARS-CoV-2에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 |
WO2023048656A2 (en) * | 2021-09-24 | 2023-03-30 | Chulalongkorn University | Human monoclonal antibodies against the receptor-binding domain of sars-cov-2 spike protein |
TW202334429A (zh) * | 2021-10-01 | 2023-09-01 | 中央研究院 | Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途 |
WO2023064717A2 (en) * | 2021-10-08 | 2023-04-20 | Augmenta Bioworks, Inc. | Antibodies for sars-cov-2 and uses thereof |
WO2023064435A2 (en) * | 2021-10-15 | 2023-04-20 | The Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods relating to sars-cov-2 neutralizing antibodies |
WO2023070029A1 (en) * | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | DNA ORIGAMI SUBUNIT VACCINE FOR PREVENTION OF SARS-CoV-2 VARIANT INFECTION |
WO2023081434A2 (en) * | 2021-11-07 | 2023-05-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating or preventing sars-cov-2 infections and covid-19 with anti-sars-cov-2 spike glycoprotein antibodies |
WO2023084055A1 (en) * | 2021-11-12 | 2023-05-19 | Rq Biotechnology Limited | Compositions |
WO2023091920A1 (en) * | 2021-11-16 | 2023-05-25 | The University Of Chicago | Polypeptides for detection and treatment of coronavirus infection |
WO2023099688A1 (en) * | 2021-12-01 | 2023-06-08 | Universität Zu Köln | Neutralizing antibodies against sars-related coronavirus |
EP4190810A1 (en) * | 2021-12-01 | 2023-06-07 | Universität zu Köln | Neutralizing antibodies against sars-related coronavirus |
CN113862286B (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-04 | 艾棣维欣(苏州)生物制药有限公司 | 编码sars-cov-2病毒c.37突变株抗原的dna分子、dna疫苗及应用 |
WO2023104904A2 (en) * | 2021-12-08 | 2023-06-15 | Genclis | The sars-cov-2 and variants use two independent cell receptors to replicate |
CN116802496A (zh) * | 2021-12-14 | 2023-09-22 | 杭州安旭生物科技股份有限公司 | 一种可结合SARS-CoV-2病毒的中和抗体及其应用 |
WO2023113094A1 (ko) * | 2021-12-16 | 2023-06-22 | 주식회사 씨티씨백 | 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물 |
WO2023122535A2 (en) * | 2021-12-20 | 2023-06-29 | DNARx | Nucleic acid expression using subcutaneous administration |
US20230279080A1 (en) * | 2021-12-27 | 2023-09-07 | Academia Sinica | Antibody specific to spike protein of sars-cov-2 and uses thereof |
WO2023137443A1 (en) | 2022-01-14 | 2023-07-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Verrucarin a derivatives and antibody drug conjugates thereof |
TW202346329A (zh) * | 2022-01-26 | 2023-12-01 | 中央研究院 | 冠狀病毒之特異性抗體及其用途 |
WO2023145859A1 (ja) * | 2022-01-28 | 2023-08-03 | 株式会社イーベック | 変異株交差性を有する抗SARS-CoV-2ヒト中和抗体およびその抗原結合性断片 |
WO2023152188A1 (en) * | 2022-02-11 | 2023-08-17 | Attana Ab | Analytical method |
WO2023156187A1 (en) * | 2022-02-16 | 2023-08-24 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | High affinity antibodies against the sars-cov-2 receptor binding domain |
TW202342510A (zh) * | 2022-02-18 | 2023-11-01 | 英商Rq生物科技有限公司 | 抗體 |
CN114231497B (zh) * | 2022-02-24 | 2022-05-20 | 广州伯尼兹生物科技有限公司 | 一株表达SARS-CoV-2 S1蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系及中和活性抗体 |
WO2023178182A1 (en) | 2022-03-16 | 2023-09-21 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for detection and treatment of coronavirus infection |
WO2023190851A1 (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | 公立大学法人福島県立医科大学 | 新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)に結合する抗体 |
WO2023190852A1 (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-05 | 公立大学法人福島県立医科大学 | 新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)に結合する抗体 |
CN115287265B (zh) * | 2022-07-12 | 2023-05-23 | 四川大学华西医院 | 多能活性制剂诱发恒河猴抵抗新冠突变体的免疫防治模型 |
EP4335870A1 (en) * | 2022-09-06 | 2024-03-13 | NantCell, Inc. | Peptide therapeutics against sars-cov-2 spike protein |
EP4349860A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-10 | Fundació Institut Hospital Del Mar D'Investigacions Mèdiques (IMIM) | Anti-sars-cov-2 antibodies |
WO2024077288A1 (en) * | 2022-10-07 | 2024-04-11 | Medigen Vaccine Biologics Corporation | Immunogenic compositions against the omicron variant of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) |
Family Cites Families (203)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4740461A (en) | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
US5693489A (en) | 1984-03-30 | 1997-12-02 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
US4952496A (en) | 1984-03-30 | 1990-08-28 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
US4959455A (en) | 1986-07-14 | 1990-09-25 | Genetics Institute, Inc. | Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions |
US4912040A (en) | 1986-11-14 | 1990-03-27 | Genetics Institute, Inc. | Eucaryotic expression system |
AU2515992A (en) | 1991-08-20 | 1993-03-16 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US7750123B2 (en) * | 2003-11-25 | 2010-07-06 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against SARS-CoV and methods of use thereof |
US7629443B2 (en) * | 2004-06-02 | 2009-12-08 | New York Blood Center, Inc. | Neutralizing monoclonal antibodies against severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus |
MX2008014804A (es) | 2006-06-02 | 2009-01-27 | Regeneron Pharma | Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano. |
US8629244B2 (en) | 2006-08-18 | 2014-01-14 | Ablynx N.V. | Interleukin-6 receptor binding polypeptides |
JP6034023B2 (ja) | 2008-05-16 | 2016-11-30 | アブリンクス エン.ヴェー. | Cxcr4及び他のgpcrに指向性を有するアミノ酸配列及びそれを含む化合物 |
US20150203591A1 (en) | 2012-08-02 | 2015-07-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mutivalent antigen-binding proteins |
WO2015143335A1 (en) * | 2014-03-20 | 2015-09-24 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for chimeric coronavirus spike proteins |
JO3701B1 (ar) | 2014-05-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي |
KR102369014B1 (ko) | 2016-08-16 | 2022-03-02 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 혼합물로부터 개별 항체들을 정량하는 방법 |
LT3638698T (lt) | 2018-01-26 | 2021-04-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Antikūnai prieš tmprss2 ir antigeną surišantys fragmentai |
CN114096560A (zh) | 2019-07-03 | 2022-02-25 | 默克专利股份公司 | 糖型纯化 |
US20220273718A1 (en) | 2019-08-02 | 2022-09-01 | University Of Virginia Patent Foundation | Bispecific antibody targeting of t regulatory cells for treatment of inflammatory conditions |
CA3152009A1 (en) | 2019-08-22 | 2021-02-25 | Cidara Therapeutics, Inc. | Variant fc domains and uses thereof |
EP3795163A1 (en) | 2019-09-23 | 2021-03-24 | The Ceutics Company GesmbH | A topical plant extract formulation comprising urtica dioica and vitamin a |
US20210093709A1 (en) | 2019-09-27 | 2021-04-01 | George Mason University | Use of shrek proteins for inactivating viral infectivity and to produce live-attenuated vaccines against viruses |
CN111748571B (zh) | 2019-10-11 | 2022-05-03 | 浙江禾霖生物科技有限公司 | 一种将枯草芽孢杆菌工程化为生产纳米抗体的多功能稳定平台的方法 |
IL292464A (en) | 2019-11-12 | 2022-06-01 | Regeneron Pharma | Methods and systems for identifying, classifying and/or ranking genetic sequences |
WO2021148884A1 (en) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | Tychan Pte. Ltd. | Anti-wuhan coronavirus antibodies |
NL2030835B1 (en) * | 2020-01-24 | 2022-12-29 | Aim Immunotech Inc | Methods, compositions, and vaccinces for treating a virus infection |
CN113201068A (zh) | 2020-02-03 | 2021-08-03 | 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 | 基因重组抗2019-nCoV和其它冠状病毒IgY及其小分子抗体以及应用 |
IL295310A (en) | 2020-02-11 | 2022-10-01 | Univ Vanderbilt | Human monoclonal antibodies to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (sars-cov-2) |
CN113248579B (zh) | 2020-02-12 | 2022-10-18 | 重庆医科大学 | 新型冠状病毒(2019-ncov)抗原表位、抗体及其应用 |
CN111303254A (zh) | 2020-02-20 | 2020-06-19 | 北京新创生物工程有限公司 | 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原检测试剂盒 |
DE202020105116U1 (de) | 2020-02-20 | 2020-10-06 | Charité - Universitätsmedizin Berlin | Reagenzien und Verwendungen zur Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion |
US20210260201A1 (en) | 2020-02-21 | 2021-08-26 | Physis Biotechnologies, Llc | Extracellular vesicles for the treatment and prevention of infections and other diseases |
WO2021168483A2 (en) * | 2020-02-21 | 2021-08-26 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Treatment of human coronavirus infections using alpha-glucosidase glycoprotein processing inhibitors |
CN113292650B (zh) | 2020-02-24 | 2022-08-12 | 中国科学院微生物研究所 | 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 |
CN113292649B (zh) | 2020-02-24 | 2022-08-12 | 中国科学院微生物研究所 | 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 |
CN111333704B (zh) | 2020-02-24 | 2021-01-12 | 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 | 新型冠状病毒covid-19疫苗、制备方法及其应用 |
CA3172878A1 (en) | 2020-02-25 | 2021-09-02 | Ligandal, Inc. | Identification of biomimetic viral peptides and uses thereof |
HUE062777T2 (hu) | 2020-02-26 | 2023-12-28 | Vir Biotechnology Inc | SARS-CoV-2 elleni antitestek |
CN113307865B (zh) | 2020-02-26 | 2022-12-13 | 复旦大学 | 新型冠状病毒的全人源单域抗体及应用 |
EP3885361A1 (en) | 2020-02-27 | 2021-09-29 | Macrofarm Srl | Monoclonal-type synthetic antibodies obtained by molecular imprinting and their use for the treatment and preventive medicine of covid-19 |
CN113354731A (zh) | 2020-03-02 | 2021-09-07 | 中国科学院微生物研究所 | 冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用 |
CN111333722A (zh) | 2020-03-03 | 2020-06-26 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | SARS-CoV-2抑制剂及其应用 |
WO2021178637A1 (en) | 2020-03-05 | 2021-09-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | IMMUNOGENIC AND VACCINE COMPOSITIONS AGAINST SARS-CoV-2 |
CN111285933A (zh) | 2020-03-09 | 2020-06-16 | 四川省人民医院 | 一种新型冠状病毒抗原胶体金诊断试剂盒 |
CN116096742A (zh) | 2020-03-09 | 2023-05-09 | 雅伯希勒拉生物公司 | 抗冠状病毒抗体及使用方法 |
US20210277093A1 (en) | 2020-03-09 | 2021-09-09 | Adma Biologics, Inc. | Immunotherapeutic compositions and methods of production for coronavirus |
CN111420048B (zh) | 2020-03-11 | 2023-09-19 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗basigin人源化抗体用于制备治疗新型冠状病毒肺炎药物的应用 |
WO2021183790A1 (en) | 2020-03-12 | 2021-09-16 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Method for treatment of covid-19-associated conditions |
US10822379B1 (en) | 2020-03-12 | 2020-11-03 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Molecules that bind to SARS-CoV-2 |
GB202003632D0 (en) | 2020-03-12 | 2020-04-29 | Harbour Antibodies Bv | SARS-Cov-2 (SARS2, COVID-19) antibodies |
CN112557645B (zh) | 2020-03-13 | 2022-03-08 | 珠海碳云智能科技有限公司 | 抗原表位多肽的筛选方法及装置 |
CN111592594B (zh) | 2020-03-13 | 2022-05-10 | 北京大学 | 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用 |
CN114163523B (zh) | 2020-03-17 | 2023-07-18 | 北京凯因科技股份有限公司 | 一种针对新型冠状病毒的单域抗体及其应用 |
CN111088283B (zh) * | 2020-03-20 | 2020-06-23 | 苏州奥特铭医药科技有限公司 | mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗 |
CN111303280B (zh) | 2020-03-22 | 2022-01-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用 |
WO2021190980A1 (en) | 2020-03-22 | 2021-09-30 | Quadrucept Bio Limited | Multimers for viral strain evolution |
KR102205028B1 (ko) | 2020-03-22 | 2021-01-20 | (주)셀트리온 | 사스-코로나바이러스-2에 중화 활성을 갖는 결합 분자 |
US11021531B1 (en) | 2020-03-23 | 2021-06-01 | Centivax, Inc. | Anti-SARS-Cov-2 antibodies derived from 2GHW |
US11021532B1 (en) | 2020-03-23 | 2021-06-01 | Centivax, Inc. | Superhuman anti-SARS-CoV-2 antibodies and uses thereof |
US11028150B1 (en) | 2020-03-23 | 2021-06-08 | Centivax, Inc. | Anti-SARS-CoV-2 antibodies derived from 2DD8 |
US11028167B1 (en) | 2020-03-23 | 2021-06-08 | Centivax, Inc. | Anti-SARS-Cov-2 antibodies derived from 3bgf |
CN111690058B (zh) | 2020-03-30 | 2021-02-05 | 三优生物医药(上海)有限公司 | 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途 |
CN111423508A (zh) | 2020-03-31 | 2020-07-17 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种分离的抗病毒感染的SARS-CoV-2蛋白结合分子 |
CN111848750B (zh) | 2020-03-31 | 2023-09-12 | 浙江聚康生物工程有限公司 | 一种快速富集和检测2019-nCoV的方法及试剂盒 |
SG11202103404PA (en) | 2020-04-02 | 2021-04-29 | Regeneron Pharma | Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments |
CA3174212A1 (en) * | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Blis Technologies Limited | Antiviral treatment comprising blis containing probiotic products |
WO2021203053A1 (en) | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Vir Biotechnology, Inc. | Immunotherapy targeting a conserved region in sars coronaviruses |
CN111499765B (zh) | 2020-04-08 | 2022-04-08 | 四川携光生物技术有限公司 | 一种冠状病毒融合蛋白及其制备方法与应用 |
CN111440229B (zh) | 2020-04-13 | 2021-08-03 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 新型冠状病毒t细胞表位及其应用 |
CN111647053A (zh) | 2020-04-16 | 2020-09-11 | 军事科学院军事医学研究院生命组学研究所 | 多肽及其在新型冠状病毒检测、抗体或疫苗筛选中的应用 |
CN111592595B (zh) | 2020-04-27 | 2021-02-19 | 南京医科大学 | 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性抗体及其应用 |
CN111647076B (zh) | 2020-04-27 | 2021-02-26 | 南京医科大学 | 抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用 |
US11634477B2 (en) | 2020-04-28 | 2023-04-25 | The Rockefeller University | Neutralizing anti-SARS-CoV-2 antibodies and methods of use thereof |
CN111471105A (zh) | 2020-05-05 | 2020-07-31 | 广西医科大学 | 新冠病毒银治疗性中和抗体制备及应用 |
JP2023525039A (ja) | 2020-05-08 | 2023-06-14 | ヴィア・バイオテクノロジー・インコーポレイテッド | Sars-cov-2に対する抗体 |
CN111620946B (zh) | 2020-05-09 | 2020-12-22 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 分离的新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合部分 |
CN111518773B (zh) | 2020-05-09 | 2023-01-03 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 一种抗新型冠状病毒s蛋白的car-t细胞、制备方法及其应用 |
CN111662379B (zh) | 2020-05-09 | 2021-03-02 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 抗新型冠状病毒的抗体、制备方法和应用 |
CN111620945B (zh) | 2020-05-09 | 2021-01-15 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其衍生体 |
CN112010966B (zh) | 2020-05-15 | 2021-03-19 | 潍坊医学院 | 一种针对新冠病毒棘突蛋白非rbd区的单克隆抗体及其应用 |
JP2023528235A (ja) | 2020-05-17 | 2023-07-04 | アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド | SARS-CoV-2抗体、並びにこれを選択及び使用する方法 |
CN111607003B (zh) | 2020-05-21 | 2022-08-23 | 上海百英生物科技有限公司 | 一种SARS-CoV-2 N/S1(RBD)重组蛋白及制备方法和应用 |
CN111560399B (zh) | 2020-05-22 | 2021-07-06 | 苏州君盟生物医药科技有限公司 | 细胞大规模瞬时转染方法 |
CN111574614A (zh) | 2020-05-23 | 2020-08-25 | 湖南源品细胞生物科技有限公司 | 一种tcr富集克隆型及其获取方法与应用 |
IL298194A (en) | 2020-05-26 | 2023-01-01 | Regeneron Pharma | Antibodies against sars-cov2-spike glycoprotein and antigen-binding fragments |
CN111748032B (zh) | 2020-05-27 | 2021-03-16 | 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) | 抗新型冠状病毒的抗体和使用该抗体的免疫检测 |
TW202210504A (zh) | 2020-05-29 | 2022-03-16 | 德國科隆大學 | 對抗sars相關冠狀病毒之中和抗體 |
WO2021245184A1 (en) | 2020-06-02 | 2021-12-09 | Neurimmune Ag | HUMAN ANTIBODIES AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS-2 (SARS-CoV-2) |
CN111647077B (zh) | 2020-06-02 | 2021-02-09 | 深圳市因诺赛生物科技有限公司 | 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用 |
KR20230019166A (ko) | 2020-06-03 | 2023-02-07 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 항-SARS-CoV-2 스파이크 당단백질 항체를 이용한 SARS-CoV-2 감염 및 COVID-19 치료 또는 예방 방법 |
CN113336846B (zh) | 2020-06-04 | 2023-11-10 | 山东宽和正生物医药有限公司 | 针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体E11 |
WO2021249547A1 (en) | 2020-06-12 | 2021-12-16 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Anti-coronavirus antibodies and uses thereof |
CN113151184B (zh) | 2020-06-15 | 2023-03-21 | 上海市公共卫生临床中心 | 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法 |
CN111499692B (zh) | 2020-06-16 | 2020-12-04 | 国家纳米科学中心 | 靶向新型冠状病毒covid-19的多肽及其应用 |
CN111825762A (zh) | 2020-06-17 | 2020-10-27 | 武汉华美生物工程有限公司 | 抗sars-cov-2病毒s蛋白rbd结构域的纳米抗体及其用途 |
CN111848751B (zh) | 2020-06-18 | 2023-09-29 | 河南省生物工程技术研究中心 | 一种新冠病毒s蛋白优势抗原表位肽及其用途 |
CN111690059B (zh) | 2020-06-19 | 2022-03-08 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1D7 |
CN111732654B (zh) | 2020-06-19 | 2021-05-25 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1E10 |
CN111718411B (zh) | 2020-06-19 | 2022-03-08 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1F2 |
CN112521494B (zh) | 2020-06-19 | 2021-06-25 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体2B11 |
US11020474B1 (en) | 2020-06-25 | 2021-06-01 | Abclonal Science, Inc. | Producing recombinant SARS-CoV-2 spike protein in a pre-fusion state |
CN111714621B (zh) | 2020-06-29 | 2021-04-27 | 中国科学院昆明动物研究所 | 转铁蛋白、转铁蛋白受体及其抗体在制备抗SARS-CoV-2病毒的药物中的应用 |
CN111732655B (zh) | 2020-07-01 | 2021-10-22 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 靶向RBD的高中和活性抗SARS-CoV-2全人源单克隆抗体及应用 |
CN111848789B (zh) | 2020-07-02 | 2022-04-22 | 武汉华美生物工程有限公司 | 抗sars-cov-2病毒s蛋白的单链抗体及其用途 |
CN111732664B (zh) | 2020-07-06 | 2020-12-01 | 北京金智准科技有限公司 | 一种新型冠状病毒重组蛋白、兔-人嵌合抗体、其制备方法及应用 |
CN111690060A (zh) | 2020-07-06 | 2020-09-22 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 能够特异性识别RBD蛋白的IgA抗体以及试剂盒 |
CN111978377B (zh) | 2020-07-09 | 2022-05-31 | 苏州和锐生物科技有限公司 | Covid-19抗原、制备方法和应用 |
CN113072640A (zh) | 2020-07-16 | 2021-07-06 | 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 | 抗突变SARS-CoV-2多结合位点IgY及其制备以及抗体组合疗法和应用 |
CN112500480B (zh) | 2020-07-17 | 2022-04-01 | 上海洛启生物医药技术有限公司 | 针对新型冠状病毒的纳米抗体及其应用 |
CN111978399B (zh) | 2020-07-20 | 2022-05-20 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 特异性结合sars-cov-2抗原蛋白的抗体及其用途 |
CN111995672B (zh) | 2020-07-20 | 2022-05-20 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 冠状病毒sars-cov-2 s蛋白特异性抗体及其用途 |
CN112010963B (zh) | 2020-07-20 | 2022-05-20 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | Sars-cov-2抗体及其用途 |
CN112210004B (zh) | 2020-07-20 | 2021-06-29 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 冠状病毒病covid-19检测抗体及其用途 |
CN112010962B (zh) | 2020-07-20 | 2022-05-20 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 用于检测covid-19的抗体及其医学用途 |
CN111978396B (zh) | 2020-07-20 | 2022-05-20 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 特异性结合sars-cov-2 np蛋白的抗体及其用途 |
CN111978398B (zh) | 2020-07-20 | 2022-05-20 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 针对冠状病毒sars-cov-2的抗体及其医学用途 |
CN111978395B (zh) | 2020-07-20 | 2022-06-10 | 四川大学 | 抗新型冠状病毒rbd结构域抗原的单克隆抗体 |
CN111978397B (zh) | 2020-07-20 | 2022-05-20 | 江苏集萃医学免疫技术研究所有限公司 | 特异性结合sars-cov-2 s蛋白的抗体及其用途 |
CN111825771A (zh) | 2020-07-23 | 2020-10-27 | 白涛 | 一种抗病毒抗细菌生物导弹 |
CN112062859B (zh) | 2020-07-24 | 2022-08-09 | 沣潮医药科技(上海)有限公司 | 用于病原体清除的嵌合抗原受体及其应用 |
CN111793129B (zh) | 2020-07-28 | 2021-09-24 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段 |
CN112094340B (zh) | 2020-07-31 | 2023-06-20 | 王跃驹 | 植物作为宿主在表达新型冠状病毒肺炎中和抗体b38抗体和/或h4抗体中的应用 |
CN112300274B (zh) | 2020-08-10 | 2022-05-31 | 苏州方科生物科技有限公司 | 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途 |
CN111875701A (zh) | 2020-08-14 | 2020-11-03 | 江苏中慧元通生物科技有限公司 | 一种SARS-CoV-2病毒的单链抗体及用途 |
CN111925439A (zh) | 2020-08-19 | 2020-11-13 | 重庆医科大学 | 快速筛选新冠病毒rbd特异性全人源中和性单克隆抗体方法 |
CN111925442B (zh) | 2020-08-19 | 2022-10-11 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN111925444B (zh) | 2020-08-19 | 2022-10-11 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN111925441B (zh) | 2020-08-19 | 2022-10-04 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN111909261B (zh) | 2020-08-19 | 2022-10-04 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN111909262B (zh) | 2020-08-19 | 2022-10-04 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN115477698A (zh) | 2020-08-19 | 2022-12-16 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN114920832B (zh) | 2020-08-19 | 2023-10-13 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN111944026B (zh) | 2020-08-19 | 2023-10-20 | 重庆医科大学 | 一种新冠病毒rbd特异性单克隆抗体的线性抗原表位和应用 |
CN111909260B (zh) | 2020-08-19 | 2022-06-21 | 重庆医科大学 | 新冠病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN115925898A (zh) | 2020-08-19 | 2023-04-07 | 重庆医科大学 | 新型冠状病毒rbd特异性单克隆抗体和应用 |
CN112062838B (zh) | 2020-08-25 | 2021-03-23 | 南京医科大学 | 一种抗新型冠状病毒SARS-Cov-2的中和性单域抗体及其应用 |
CN112010964A (zh) | 2020-09-02 | 2020-12-01 | 安第斯抗体生物技术衡水有限公司 | 一种新冠病毒羊驼抗体及其制备方法和应用 |
CN111995674B (zh) | 2020-09-03 | 2022-02-11 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用 |
KR102229225B1 (ko) | 2020-09-04 | 2021-03-19 | (주)셀트리온 | 사스-코로나바이러스-2 표면의 스파이크 단백질에 결합하는 사스-코로나바이러스 감염증의 진단용 결합 분자 |
CN112010967B (zh) | 2020-09-07 | 2021-03-23 | 康维众和(中山)生物药业有限公司 | 新型冠状病毒SARS-Cov-2中和毒性的纳米抗体及其制备方法与应用 |
CN112076316B (zh) | 2020-09-21 | 2022-10-11 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种双抗体组合物及在制备covid-19治疗药物中的应用 |
CN112062840A (zh) | 2020-09-22 | 2020-12-11 | 石河子大学 | 一种基于新型冠状病毒s蛋白的纳米抗体及其应用 |
CN112175071A (zh) | 2020-09-22 | 2021-01-05 | 通用生物系统(安徽)有限公司 | 一种新型冠状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备方法 |
CN112062839A (zh) | 2020-09-22 | 2020-12-11 | 石河子大学 | 一种基于新型冠状病毒s蛋白s1亚基的纳米抗体及其应用 |
CN114437206B (zh) | 2020-09-23 | 2023-05-16 | 深圳市因诺赛生物科技有限公司 | 新型冠状病毒(sars-cov-2)刺突蛋白结合分子及其应用 |
CN112094342B (zh) | 2020-09-25 | 2022-05-13 | 中国科学技术大学 | 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体 |
CN112094343B (zh) | 2020-09-25 | 2022-05-13 | 中国科学技术大学 | 与SARS-CoV-2 RBD结合的羊驼源纳米抗体 |
CN112094327A (zh) | 2020-09-25 | 2020-12-18 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 基于新型冠状病毒rbd-sd1蛋白的截短体及其应用 |
CN112094326B (zh) | 2020-09-25 | 2023-06-02 | 河南省生物工程技术研究中心 | 一种新冠病毒抗原及其应用 |
CN112159469B (zh) | 2020-09-30 | 2022-08-02 | 上海市公共卫生临床中心 | 冠状病毒的抗体或其抗原结合片段 |
CN116023478A (zh) | 2020-09-30 | 2023-04-28 | 上海市公共卫生临床中心 | 冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段 |
CN112125973B (zh) | 2020-09-30 | 2022-02-01 | 上海市公共卫生临床中心 | 冠状病毒的特异性抗体或其抗原结合片段 |
CN112251414A (zh) | 2020-10-12 | 2021-01-22 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 一种杂交瘤细胞株、其制备方法和应用 |
CN112194711A (zh) | 2020-10-15 | 2021-01-08 | 深圳市疾病预防控制中心(深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所) | 一种新型冠状病毒s蛋白的b细胞线性抗原表位、抗体、鉴定方法及应用 |
CN112409488B (zh) | 2020-10-23 | 2022-07-01 | 中国科学院上海药物研究所 | 针对多种冠状病毒的单克隆抗体及应用 |
GB202017058D0 (en) | 2020-10-27 | 2020-12-09 | Kymab Ltd | Antibodies and uses thereof |
CN112225806B (zh) | 2020-11-13 | 2021-04-13 | 李亚峰 | 一种人源抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的中和活性单克隆抗体 |
CN112625136B (zh) | 2020-11-18 | 2022-02-11 | 三优生物医药(上海)有限公司 | 针对冠状病毒具有中和活性的双特异性抗体及其用途 |
RU2744274C1 (ru) | 2020-11-20 | 2021-03-04 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Моноклональное антитело к RBD фрагменту в составе S белка вируса SARS-CoV-2 |
CN112341541B (zh) | 2020-11-23 | 2022-05-06 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-163及其应用 |
CN112409479B (zh) | 2020-11-23 | 2022-04-26 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-121及其应用 |
CN112430265B (zh) | 2020-11-23 | 2022-04-12 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 人源抗新冠病毒中和性抗体nCoV-61及其应用 |
CN112522203B (zh) | 2020-11-23 | 2023-08-11 | 中山大学附属第五医院 | 表达嵌合抗原受体的细胞囊泡及其制备方法和应用 |
CN112442120A (zh) | 2020-11-25 | 2021-03-05 | 苏州大学 | 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体 |
CN112574299B (zh) | 2020-11-25 | 2023-03-21 | 苏州方科生物科技有限公司 | 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途 |
KR102233689B1 (ko) | 2020-11-26 | 2021-03-30 | 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단 | SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 이용 |
CN112500481B (zh) | 2020-11-29 | 2021-08-20 | 山西省人民医院 | 一种人源抗新型冠状病毒的中和活性单克隆抗体 |
CN112574300B (zh) | 2020-12-02 | 2022-03-08 | 深圳先进技术研究院 | 抗sar-cov-2全人源单克隆抗体及其制法与应用 |
CN112661841B (zh) | 2020-12-04 | 2022-10-14 | 广州市第八人民医院 | 一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17-2及其应用 |
CN112626089B (zh) | 2020-12-08 | 2022-03-11 | 杭州百凌生物科技有限公司 | 一种SARS-CoV-2病毒S蛋白受体结合区域编码基因、抗体及应用 |
CN112538111B (zh) | 2020-12-09 | 2022-04-29 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 新冠病毒单链抗体及质控品和制备方法 |
CN112485455B (zh) | 2020-12-09 | 2022-11-01 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 新冠病毒抗体质控品及其制备方法 |
CN112250763B (zh) | 2020-12-21 | 2021-03-26 | 三优生物医药(上海)有限公司 | 靶向SARS-CoV-2冠状病毒的抗体及其诊断和检测用途 |
CN112724247A (zh) | 2020-12-25 | 2021-04-30 | 江苏中方基因生物医学科技有限公司 | 一种SARS-CoV-2冠状病毒IgA抗体及其在ELISA检测试剂盒中的应用 |
CN112626030A (zh) | 2020-12-31 | 2021-04-09 | 深圳市第二人民医院 | 外泌体表面展示棘突蛋白Spike的纳米抗体用于中和新冠病毒的生产方法 |
CN112341542B (zh) | 2021-01-08 | 2021-05-14 | 清华大学 | 一种3-羟基丁酰化修饰蛋白质药物及其制备方法和应用 |
CN112625125B (zh) | 2021-01-18 | 2021-12-14 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一株中和新型冠状病毒感染的单抗 |
CN112390879B (zh) | 2021-01-21 | 2021-04-02 | 上海科技大学 | 靶向SARS-CoV-2的抗体及其制备方法和应用 |
WO2022162587A1 (en) | 2021-01-27 | 2022-08-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) | Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection |
CN113264998B (zh) | 2021-01-28 | 2023-02-28 | 四川大学华西医院 | 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用 |
CN113150129B (zh) | 2021-01-28 | 2023-02-28 | 四川大学华西医院 | 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S2蛋白的单链抗体及其应用 |
CN112724248A (zh) | 2021-01-28 | 2021-04-30 | 南京拓峰生物科技有限公司 | 可结合SARS-CoV-2的纳米抗体及其应用 |
CN112521496B (zh) | 2021-01-29 | 2022-09-06 | 中国人民解放军空军军医大学 | 特异性结合SARS-CoV-2 Spike RBD的单克隆抗体及其应用 |
CN115109151A (zh) | 2021-01-31 | 2022-09-27 | 中南大学湘雅医院 | 新型冠状病毒单克隆抗体xy6及其应用 |
CN112552399B (zh) | 2021-02-24 | 2021-07-20 | 恒翼生物医药科技(上海)有限公司 | 抗sars-cov-2中和抗体 |
CN113150132B (zh) | 2021-03-11 | 2022-05-31 | 苏州携创生物技术有限公司 | 一种抗SARS-CoV-2重组抗体及其应用 |
CN112794899B (zh) | 2021-03-16 | 2021-09-24 | 易康生物(苏州)有限公司 | 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆中和抗体及其应用 |
CN112794898B (zh) | 2021-03-16 | 2021-08-03 | 易康生物(苏州)有限公司 | 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其应用 |
CN112980885B (zh) | 2021-03-18 | 2022-04-15 | 恒翼生物医药科技(上海)有限公司 | 抗sars-cov-2中和抗体的表达载体 |
CN113045647B (zh) | 2021-03-22 | 2022-04-26 | 南京传奇生物科技有限公司 | 新冠病毒SARS-CoV-2的中和性抗体及其应用 |
CN113150135B (zh) | 2021-04-14 | 2022-09-20 | 中山大学 | 抗新型冠状病毒受体结合区域中和抗体及其应用 |
CN113173995B (zh) | 2021-04-30 | 2022-09-23 | 上海市公共卫生临床中心 | 一种结合冠状病毒的双特异性抗体 |
CN113234149B (zh) | 2021-05-19 | 2023-06-16 | 武汉菲沙基因组医学有限公司 | 全人源的新冠IgA单链抗体及其应用 |
CN113234150A (zh) | 2021-05-19 | 2021-08-10 | 武汉菲沙基因组医学有限公司 | 全人源的新冠IgG1单链抗体及其应用 |
CN113234148A (zh) | 2021-05-19 | 2021-08-10 | 武汉菲沙基因组医学有限公司 | 全人源的新冠IgK单链抗体及其应用 |
CN113185609A (zh) | 2021-05-19 | 2021-07-30 | 武汉菲沙基因组医学有限公司 | 全人源的新冠IgG2单链抗体及其应用 |
CN113214389A (zh) | 2021-05-19 | 2021-08-06 | 武汉菲沙基因组医学有限公司 | 全人源的新冠IgL单链抗体及其应用 |
CN113215106B (zh) | 2021-05-20 | 2022-04-01 | 广东省公共卫生研究院 | 杂交瘤细胞、抗SARS-CoV-2的单克隆抗体及其应用 |
CN113354733B (zh) | 2021-06-04 | 2022-02-18 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗SARS-CoV-2流行突变株的单克隆抗体20D8 |
CN113234151B (zh) | 2021-06-08 | 2022-02-15 | 皖南医学院第一附属医院(皖南医学院弋矶山医院) | 一种基于靶向SARS-CoV2病毒S蛋白的三聚体纳米抗体的CAR-NK的研制 |
CN113248581A (zh) | 2021-06-15 | 2021-08-13 | 江西浩然生物制药有限公司 | 用于产生新冠病毒中和抗体的新冠s抗原及其制备方法 |
-
2020
- 2020-06-25 SG SG11202103404PA patent/SG11202103404PA/en unknown
- 2020-06-25 US US16/912,678 patent/US10787501B1/en active Active
- 2020-06-25 WO PCT/US2020/039707 patent/WO2021045836A1/en active Application Filing
- 2020-06-25 PE PE2022002139A patent/PE20221893A1/es unknown
- 2020-06-25 CR CR20220552A patent/CR20220552A/es unknown
- 2020-06-25 JP JP2021518800A patent/JP7116256B1/ja active Active
- 2020-06-25 MX MX2021004130A patent/MX2021004130A/es unknown
- 2020-06-25 CN CN202080005771.3A patent/CN113766928A/zh active Pending
- 2020-06-25 MY MYPI2021002018A patent/MY197648A/en unknown
- 2020-06-25 CA CA3192925A patent/CA3192925A1/en active Pending
- 2020-06-25 AU AU2020340881A patent/AU2020340881A1/en active Pending
- 2020-06-25 CA CA3115553A patent/CA3115553C/en active Active
- 2020-06-25 KR KR1020217013280A patent/KR20210134300A/ko not_active Application Discontinuation
- 2020-07-02 TW TW109122352A patent/TWI785350B/zh active
- 2020-07-02 TW TW111141974A patent/TW202308686A/zh unknown
- 2020-07-20 MA MA54405A patent/MA54405B1/fr unknown
- 2020-07-20 SI SI202030145T patent/SI3889177T1/sl unknown
- 2020-07-20 EP EP22210926.6A patent/EP4209507A1/en active Pending
- 2020-07-20 PL PL20186667.0T patent/PL3889177T3/pl unknown
- 2020-07-20 PT PT201866670T patent/PT3889177T/pt unknown
- 2020-07-20 EP EP20186667.0A patent/EP3889177B1/en active Active
- 2020-07-20 LT LTEP20186667.0T patent/LT3889177T/lt unknown
- 2020-07-20 FI FIEP20186667.0T patent/FI3889177T3/fi active
- 2020-07-20 RS RS20230266A patent/RS64105B1/sr unknown
- 2020-07-20 DK DK20186667.0T patent/DK3889177T3/da active
- 2020-07-20 HU HUE20186667A patent/HUE061425T2/hu unknown
- 2020-07-20 HR HRP20230338TT patent/HRP20230338T1/hr unknown
- 2020-07-20 ES ES20186667T patent/ES2939895T3/es active Active
- 2020-08-18 US US16/996,297 patent/US10975139B1/en active Active
- 2020-09-15 US US17/021,286 patent/US10954289B1/en active Active
-
2021
- 2021-03-19 US US17/207,524 patent/US11732030B2/en active Active
- 2021-04-05 IL IL282060A patent/IL282060A/en unknown
- 2021-04-11 PH PH12021550793A patent/PH12021550793A1/en unknown
- 2021-04-20 CL CL2021000997A patent/CL2021000997A1/es unknown
- 2021-04-21 CO CONC2021/0005072A patent/CO2021005072A2/es unknown
-
2022
- 2022-07-27 JP JP2022119389A patent/JP7411029B2/ja active Active
-
2023
- 2023-03-13 CL CL2023000705A patent/CL2023000705A1/es unknown
- 2023-06-29 US US18/216,118 patent/US20230348569A1/en active Pending
- 2023-12-21 JP JP2023215497A patent/JP2024038003A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2939895T3 (es) | Anticuerpos antiglucoproteína espicular del SARS-CoV-2 y fragmentos de unión a antígeno | |
ES2864529T3 (es) | Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno anti-TMPRSS2 | |
JP2019055996A (ja) | インフルエンザ赤血球凝集素に対するヒト抗体 | |
US20240043504A1 (en) | Anti-SARS-CoV-2-Spike Glycoprotein Antibodies and Antigen-Binding Fragments | |
JP2023060018A (ja) | インフルエンザヘマグルチニンに対するヒト抗体 | |
BR122023004078B1 (pt) | Composição farmacêutica, seu uso e método para fabricar um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo | |
BR112020015534B1 (pt) | Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seu método de fabricação, seus usos, bem como composição farmacêutica | |
WO2022187626A1 (en) | Anti-sars-cov-2-variant-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments | |
US20230125469A1 (en) | Anti-SARS-CoV-2-Spike Glycoprotein Antibodies and Antigen-Binding Fragments |