JP6034023B2 - Cxcr4及び他のgpcrに指向性を有するアミノ酸配列及びそれを含む化合物 - Google Patents
Cxcr4及び他のgpcrに指向性を有するアミノ酸配列及びそれを含む化合物 Download PDFInfo
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Description
A群のGPCR
ムスカリン性M1受容体
アドレナリン受容体
ヒスタミン受容体
5−HT GPCR
カンナビノイド受容体
A群ホルモンタンパク質GPCR
ケモカイン
ガラニン
メラノコルチン
神経ペプチドY受容体
ニューロテンシン受容体
オピオイド
ソマトスタチン
バソプレシン様受容体
プロスタノイド受容体
B群のGPCR
ACTH放出因子受容体(モジュレータ)
C群のGPCR
GABA B受容体(アゴニスト)
代謝型グルタミン酸受容体
102M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1〜107M−1s−1(105M−1s−1〜107M−1s−1等)のkon速度でGPCRと結合するようなもの、及び/又は
1s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−2s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−3s−1〜10−6s−1(10−4s−1〜10−6s−1等)のkoff速度でGPCRと結合するようなものであるのが好ましい。
102M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1〜107M−1s−1(105M−1s−1〜107M−1s−1等)のkon速度で(本明細書で記載のように)GPCRの細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ、又はこれに由来するペプチドと結合するようなもの、及び/又は
1s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−2s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−3s−1〜10−6s−1(10−4s−1〜10−6s−1等)のkoff速度で(本明細書で記載のように)GPCRの細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ、又はこれに由来するペプチドと結合するようなものであるのが好ましい。
a)所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)に対する免疫応答が誘起されるように、ラクダ科動物に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)を含む好適な抗原、又はこれに由来する若しくはこれに基づく好適なペプチドを好適に免疫付与する工程。抗原は、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)に対する免疫応答を誘起することが可能な任意の好適な抗原;例えば例示的でありこれに限定されないが、生きた状態で、かつ天然立体構造における表面上で所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を過剰発現する全細胞;この細胞壁断片若しくはこのような細胞に由来する任意の他の好適な調製物;その表面上に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を有する小胞;所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)を含む、GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7のサブユニット若しくはサブユニットの断片;又は所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)(のアミノ酸配列)を含む及び/又はこれに基づく合成若しくは半合成のペプチド;より好ましくは生きた状態で、かつ天然立体構造における表面上で所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を過剰発現する全細胞(例えばHEK293)であり得る。
b)上記GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7を過剰発現する異なる(免疫付与に使用したもの以外の)幾つかの細胞型の細胞膜調製物を使用して、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)との結合に関して選択する工程。これは、表面上で重鎖抗体を発現する細胞(例えば好適に免疫付与したラクダ科動物から得られたB細胞)のセット、コレクション若しくはライブラリから選択すると共に、1回目の選択で例えばCHO等の第1型の細胞、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用すること、例えば1回目の選択で例えばCHO等の第1型の細胞、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用することによってVHH配列若しくはナノボディ配列の(ナイーブ(naive)又は免疫)ライブラリから選択すること、又は例えば1回目の選択で例えばCHO等の第1型の細胞、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用することによってVHH配列若しくはナノボディ配列をコードする核酸配列の(ナイーブ又は免疫)ライブラリから選択することにより実施することができ、これらは全てそれ自体が既知の方法で実施してもよい。
c)任意で洗浄剤を用いずにPBS等のバッファーで穏やかに洗浄する工程。この方法はさらに任意でそれ自体が既知の他の好適な工程、例えば例示的でありこれに限定されないが、親和性成熟工程、所望のアミノ酸配列を発現する工程、所望の抗原(この場合、GPCR)との結合及び/又はこれに対する活性に関してスクリーニングする工程、所望のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を決定する工程、(例えば本明細書でさらに記載のように)1つ又は複数のヒト化置換を導入する工程、好適な多価及び/又は多重特異性フォーマットでフォーマットする工程、所望の生物学的及び/又は生理学的特性に関してスクリーニングする(即ち本明細書で記載されるような好適なアッセイを使用する)工程、及び/又は1つ又は複数のこのような工程の任意の好適な組合せを1つ又は複数任意の好適な順番で含んでいてもよい。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表し、1つ又は複数の特徴的な残基は本明細書にさらに規定されるようなものである)を有するアミノ酸配列として定義することができる。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を表し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を表し、フレームワーク配列は本明細書にさらに規定されるようなものである)を有するアミノ酸配列であり得る。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有するアミノ酸配列であり得る;ここで
i)好ましくは、カバットナンバリング(Kabat numbering)による11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位のアミノ酸残基の1つ又は複数は、以下の表A−3で言及する特徴的な残基から選択され、
ii)上記アミノ酸配列は、配列番号1〜配列番号22のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにCDR配列を形成するアミノ酸残基(配列番号1〜配列番号22の配列においてXで示す)は無視する。
i)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238及び配列番号239のアミノ酸配列の少なくとも1つとの80%のアミノ酸同一性を有し(ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにCDR配列を形成するアミノ酸残基は無視する)(またこれに関しては、表A−1を参照し、この図は配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238及び配列番号239のナノボディのフレームワーク1配列(配列番号126〜配列番号141)、フレームワーク2配列(配列番号158〜配列番号173)、フレームワーク3配列(配列番号190〜配列番号205)及びフレームワーク4配列(配列番号222〜配列番号237)を列挙する)(フレームワーク1配列の1位〜4位及び27位〜30位のアミノ酸残基に関しては、以下で為されるコメントも参照する。したがって、アミノ酸同一性の程度を決定するためにこれらのアミノ酸残基は無視するのが好ましい)、また
ii)好ましくはカバットナンバリングによる11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位のアミノ酸残基の1つ又は複数が、以下の表A−3で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディである。
i)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238及び配列番号239のアミノ酸配列の1つのヒト化変異体であり、及び/又は
ii)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238及び配列番号239のアミノ酸配列の少なくとも1つと80%のアミノ酸同一性を有し(ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにCDR配列を形成するアミノ酸残基は無視する)、また
i)好ましくはカバットナンバリングによる11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位のアミノ酸残基の1つ又は複数が、以下の表A−3で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディである。
a)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;
d)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;
g)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;又は
それらの任意の好適な組合せ。
i)b)及び/又はc)によるこのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するa)によるアミノ酸配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)b)及び/又はc)によるアミノ酸配列は、対応するa)によるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)b)及び/又はc)によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってa)によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
i)e)及び/又はf)によるこのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するd)によるアミノ酸配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)e)及び/又はf)によるアミノ酸配列は、対応するd)によるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)e)及び/又はf)によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってd)によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
i)h)及び/又はi)によるこのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するg)によるアミノ酸配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)h)及び/又はi)によるアミノ酸配列は、対応するg)によるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)h)及び/又はi)によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってg)によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
i)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
ii)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;及び
iii)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;又は
それらの任意の好適な組合せ。
a)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;
d)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;
g)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列。
i)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
ii)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;及び
iii)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列。
a)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から選択され;
アミノ酸残基の第2のストレッチが、
d)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され;
アミノ酸残基の第3のストレッチが、
g)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、アミノ酸配列に関する。
a)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び/又は
CDR2が、
d)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び/又は
CDR3が、
g)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるようなものであるのが好ましい。
a)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
CDR2が、
d)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
CDR3が、
g)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるようなもの、又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片であるのが好ましい。
a)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;
d)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;
g)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;又は
それらの任意の好適な組合せ。
i)b)及び/又はc)によるこのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するa)によるアミノ酸配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)b)及び/又はc)によるアミノ酸配列は、対応するa)によるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)b)及び/又はc)によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってa)によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
i)e)及び/又はf)によるこのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するd)によるアミノ酸配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)e)及び/又はf)によるアミノ酸配列は、対応するd)によるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)e)及び/又はf)によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってd)によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
i)h)及び/又はi)によるこのようなアミノ酸配列において任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するg)によるアミノ酸配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)h)及び/又はi)によるアミノ酸配列は、対応するg)によるアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)h)及び/又はi)によるアミノ酸配列は、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってg)によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であり得る。
a)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;及び
c)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;又は
それらの任意の好適な組合せ。
a)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;
d)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列;
g)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列。
a)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;及び
c)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列。
a)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され;
アミノ酸残基の第2のストレッチが、
d)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され;
アミノ酸残基の第3のストレッチが、
g)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、アミノ酸配列に関する。
a)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び/又は
CDR2が、
d)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び/又は
CDR3が、
g)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるようなものであるのが好ましい。
a)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
CDR2が、
d)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
CDR3が、
g)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるようなもの、又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片であるのが好ましい。
a)アミノ酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
b)GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対する親和性を有するアミノ酸配列に関して、アミノ酸配列の上記のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
c)GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対する親和性を有するアミノ酸配列(複数可)を単離する工程とを含み得る。
a)アミノ酸配列を発現する細胞のコレクション又は試料を準備する工程と、
b)GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対する親和性を有するアミノ酸配列を発現する細胞に関して上記細胞のコレクション又は試料をスクリーニングする工程と、
c)(i)上記アミノ酸配列を単離する工程、又は(ii)上記アミノ酸配列をコードする核酸配列を上記細胞から単離した後、上記アミノ酸配列を発現する工程のいずれかとを少なくとも含む。
a)アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
b)GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対する親和性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に関して、上記の核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
c)上記核酸配列を単離した後、上記アミノ酸配列を発現する工程とを少なくとも含み得る。
視覚:オプシンは、電磁放射を細胞シグナルに転換するために光異性化反応を使用する。例えばロドプシンはこの目的のために、11−シス−レチナールのオール−トランス−レチナールへの変換を使用する。
嗅覚:嗅上皮の受容体はオドラント(嗅覚受容体)及びフェロモン(鋤鼻受容体)と結合する。
行動及び気分の調節:哺乳動物の脳における受容体はセロトニン、ドーパミン、GABA及びグルタミン酸を含む幾つかの異なる神経伝達物質と結合する。
免疫系活性及び炎症の調節:ケモカイン受容体は免疫系の細胞間の細胞間伝達を媒介するリガンドと結合し、ヒスタミン受容体等の受容体は炎症性メディエータと結合すると共に、炎症反応において標的細胞型と係合する(engage)。
自律神経系の伝播:交感神経系及び副交感神経系の両方がGPCR経路によって調節される。これらの系は血圧、心拍数及び消化過程等の身体の多くの自動機能の制御に関与している。
現在市販されているか又は臨床開発中である医薬品(小分子又は生物製剤)に対する既知の標的であるGPCR(例えば本明細書で言及されるもの);
黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)(ゴナドトロピン放出ホルモン、GnRHとしても知られる)受容体、MIムスカリン性受容体及びD2−アドレナリン受容体;
オピオイド受容体、エンドセリン受容体、アンジオテンシン受容体、神経ペプチドY受容体及びセロトニンK受容体;
Gq/1 I Gタンパク質と共役する(即ち会合する)GPCR、例えばLHRH(=GnRH)、アセチルコリン(m1亜型、m3亜型及びm5亜型)、MIムスカリン、アデノシン1、CC−アドレナリン(alA、alB及びalC亜型)、アンジオテンシン(AT I A亜型)、ボンベシン(BB I亜型及びB132亜型)、ブラジキニン(132亜型)、C5a、コレシストキニン(CCKa亜型及びCCKb亜型)、エンドセリン(Eta亜型及びEtb亜型)、グルタミン酸(mGlu1亜型、mGlu5亜型)、5HT(2A亜型、B亜型及びC亜型)、ヒスタミン(H I亜型)、ニューロテンシン、ニューロキニン(NK2亜型、NK3亜型)、オキシトシン、チロトロピン放出ホルモン(TRIJ)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、トロンボキサンA2及びバソプレシン(V I a亜型)の受容体;
Gs Gタンパク質と共役するGPCR、例えば以下の受容体:P2−アドレナリン、心臓のP−アドレナリン、ヒスタミン(H2亜型)、チロトロピン、成長ホルモン放出因子、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、5HT4、卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、GLP−1、グルカゴン、ドーマミン(domamine)5(D5)、ドーパミンI(DI)、カルシトシン、アデノシン2p(A2p)、バソプレシン2、血管作動性腸管ポリペプチド及び副甲状腺ホルモンの受容体;
Gi Gタンパク質と共役するGPCR、例えば以下の受容体:5HT(I A亜型、I B亜型、I D亜型及びI F亜型)、mグルタミンR(2亜型、3亜型)、ドーパミン4(D4)、ドーパミン−2(D2)カンナビノイド、アデノシン3(A3)、ソマトスタチン(4亜型、3亜型)、t−オピオイド、6−オピオイド、K−オピオイド、神経ペプチドY(1亜型、2亜型)の受容体;
米国特許出願公開第2002/0106739号で言及されるGPCR;
Lundstrom et al., J. Struct. Funct. Genomics, 2006Nov 22(Epub ahead of print)の表1で列挙されるGPCR;
いわゆる「オーファン」受容体であるGPCR、即ち他のGPCRと構造的に類似しているが、天然リガンドが依然として知られていないGPCR;
表Cで言及されるGPCR;
表Dで言及されるGPCR。
a)特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は、当業者にとって明らかな、当該技術分野における通常の意味を有する。例えば標準的なハンドブック(例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)、F.Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York(1987)、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,(1985)、Old et al., "Principles of GeneManipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition,University of California Press, Berkeley, CA(1981)、Roitt et al., "Immunology"(6th.Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh(2001)、Roitt et al., Roitt's EssentialImmunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK(2001)、及びJaneway et al.,"Immunobiology"(6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York(2005))、並びに本明細書で言及される包括的な背景技術を参照する。
単一ドメインだけが、高い親和性及び高い選択性で抗原と結合することが要求されるので、2つの分離ドメインを存在させる必要もなく、これらの2つのドメインが正しい空間的立体構造及び立体構造で存在することを(即ち特別に設計されたリンカー(scFv等)の使用によって)確認する必要もない。
VHHドメイン及びナノボディは単一遺伝子から発現することができ、翻訳後フォールディング又は修飾の必要はない。
VHHドメイン及びナノボディは、(本明細書でさらに考察されるように)容易に多価及び多重特異性のフォーマットに遺伝子操作することができる。
VHHドメイン及びナノボディは、高溶解性であり、凝集しにくい(Ward et al., Nature, Vol. 341, 1989, p. 544で記載されるマウス由来の「dAb」等)。
VHHドメイン及びナノボディは、熱、pH、プロテアーゼ及び他の変性剤又は条件に対する安定性が高い(例えばEwert et al(同上)を参照されたい)。
VHHドメイン及びナノボディは、製造で要求される規模であっても調製するのが容易であり、かつ比較的安価である。例えば、VHHドメイン、ナノボディ、及びこれを含有するタンパク質/ポリペプチドは、微生物発酵を使用して(例えば以下でさらに記載されるように)製造することができ、哺乳動物の発現系(例えば従来の抗体断片)を使用する必要がない。
VHHドメイン及びナノボディは、従来の四本鎖抗体及びその抗原結合断片に比べて比較的小さい(約15kDa、即ち従来のIgGの10分の1)ため、このような従来の四本鎖抗体及びその抗原結合断片よりも高い組織(充実性腫瘍及び他の高密度組織を含むが、これらに限定されない)への浸透性を示す。
VHHドメイン及びナノボディは、(特に従来のVHドメインに比べてCDR3ループが伸長するため)いわゆるキャビティ結合性を示すことができ、したがって従来の四本鎖抗体及びその抗原結合断片には接近することができない標的及びエピトープに接近することもできる。例えば、VHHドメイン及びナノボディは酵素を阻害することができることが分かっている(例えば国際公開第97/49805号、Transue et al., Proteins 1998 Sep 1; 32(4): 515-22、Lauwereys et al., EMBO J. 1998 Jul1; 17(13): 3512-20を参照されたい)。
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性のフォーマット(例えば以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかでのGPCRに対する親和性及び/又は結合活性の増大、
例えばインバースアンタゴニストをアンタゴニストと共役させる、アンタゴニストでフォーマットさせることによるインバースアンタゴニスト作用を増大させる能力等の特別な特性に関する潜在性の増大(実験部を参照されたい)、
多価フォーマット(例えば二価フォーマット)でフォーマットするのにより良好な適合性、
多重特異性フォーマット(例えば以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)でフォーマットするのにより良好な適合性、
「ヒト化」置換(本明細書中で規定)に対する適合性又は感受性の改善;一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性のフォーマット(例えば以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかでの免疫原性の低下、
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性のフォーマット(例えば以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかでの安定性の増大、
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性のフォーマット(例えば以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかでのGPCRに対する特異性の増大、
異なる種由来のGPCRとの交差反応性の低減又は所望の場合には増大、及び/又は
一価フォーマット、多価フォーマット(例えば二価フォーマット)及び/又は多重特異性のフォーマット(例えば以下で記載の多重特異性のフォーマットの1つ)のいずれかでの薬学的用途(予防的用途及び/又は治療的用途を含む)及び/又は診断的用途(画像化目的への使用を含むが、これに限定されない)に望ましい、1つ又は複数の他の特性の改善の1つ又は複数が含まれる。
ナノボディが、10−5モル/L〜10−12モル/L以下、及び好ましくは10−7モル/L〜10−12モル/L以下、及びより好ましくは10−8モル/L〜10−12モル/Lの解離定数(KD)で(即ち105L/モル〜1012L/モル以上、及び好ましくは107L/モル〜1012L/モル以上、及びより好ましくは108L/モル〜1012L/モルの結合定数(KA)で)GPCRと結合し得るようなもの、及び/又は
ナノボディが、102M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1〜107M−1s−1(105M−1s−1〜107M−1s−1等)のkon速度でGPCRと結合し得るようなもの、及び/又は
ナノボディが、1s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−2s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−3s−1〜10−6s−1(10−4s−1〜10−6s−1等)のkoff速度でGPCRと結合し得るようなものである。
CDR1が、
a)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び/又は
CDR2が、
d)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、及び/又は
CDR3が、
g)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるか、又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片である、ナノボディに関する。
CDR1が、
a)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列;
b)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
c)配列番号142〜配列番号157、より好ましくは配列番号142、配列番号143のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
CDR2が、
d)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列;
e)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
f)配列番号174〜配列番号189、より好ましくは配列番号174、配列番号175のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
CDR3が、
g)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列;
h)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列;
i)配列番号206〜配列番号221、より好ましくは配列番号206、配列番号207のアミノ酸配列の少なくとも1つとの、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるようなもの、又はこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片である、ナノボディに関する。
i)b)及び/又はc)によるこのようなCDRにおいて任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するa)によるCDRと比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)b)及び/又はc)によるCDRは、対応するa)によるCDRと比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)b)及び/又はc)によるCDRは、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってa)によるCDRから誘導されるCDRであり得る。
i)e)及び/又はf)によるこのようなCDRにおいて任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するd)によるCDRと比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)e)及び/又はf)によるCDRは、対応するd)によるCDRと比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)e)及び/又はf)によるCDRは、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってd)によるCDRから誘導されるCDRであり得る。
i)h)及び/又はi)によるこのようなCDRにおいて任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応するg)によるCDRと比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)h)及び/又はi)によるCDRは、対応するg)によるCDRと比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)h)及び/又はi)によるCDRは、それ自体が既知の1つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってg)によるCDRから誘導されるCDRであり得る。
i)このようなCDRにおいて任意のアミノ酸置換は、(本明細書で規定されるように)対応する表A−1で言及されるCDR配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)任意のこのようなCDR配列は、対応する表A−1で言及されるCDR配列と比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく;及び/又は
iii)任意のこのようなCDR配列は、特に対応する表A−1で言及されるCDR配列から、それ自体が既知の親和性成熟技法によって誘導されるCDRである。
(1)表A−1で言及されるCDR1配列の1つとの80%を超える配列同一性を有するCDR1配列;同じ組合せに属する、表A−1で言及されるCDR2配列との、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するCDR2配列;及び同じ組合せに属する、表A−1で言及されるCDR3配列との80%を超える配列同一性を有するCDR3配列;又は(2)CDR1配列、表A−1で挙げられるCDR2、及び表A−1で挙げられるCDR3配列(ここでCDR2配列とCDR3配列とは異なる組合せに属し得る)。
(1)表A−1で言及されるCDR1配列の1つとの80%を超える配列同一性を有するCDR1配列;同じ組合せに属する、表A−1で挙げられるCDR2配列;及び異なる組合せに属する、表A−1で言及されるCDR3配列;又は(2)表A−1で言及されるCDR1配列;同じ組合せに属する、表A−1で言及されるCDR2配列との、3つ、2つ若しくは1つのアミノ酸差異を有するCDR2配列;及び同じ若しくは異なる組合せに属する、表A−1で挙げられるCDR3配列との80%を超える配列同一性を有するCDR3配列。
10−5モル/L〜10−12モル/L以下、及び好ましくは10−7モル/L〜10−12モル/L以下、及びより好ましくは10−8モル/L〜10−12モル/Lの解離定数(KD)で(即ち105L/モル〜1012L/モル以上、及び好ましくは107L/モル〜1012L/モル以上、及びより好ましくは108L/モル〜1012L/モルの結合定数(KA)で)GPCRと結合するようなもの、及び/又は
102M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1〜107M−1s−1(105M−1s−1〜107M−1s−1等)のkon速度でGPCRと結合するようなもの、及び/又は
1s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日である略不可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−2s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−3s−1〜10−6s−1(10−4s−1〜10−6s−1等)のkoff速度でGPCRと結合するようなものであるのが好ましい。
a)ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
b)GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対する親和性を有するナノボディ配列に関して、上記のナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
c)GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対する親和性を有するアミノ酸配列(複数可)を単離する工程とを含む。
a)免疫グロブリン配列を発現するラクダ科動物種由来の細胞のコレクション又は試料を準備する工程と、
b)(i)GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を発現する細胞、(ii)重鎖抗体を発現する細胞に関して上記細胞のコレクション又は試料をスクリーニングする工程であって、GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対して親和性を有する重鎖抗体を発現する細胞を少なくとも1つ提供するように、本質的に単一のスクリーニング工程として、又は2つの別々のスクリーニング工程として任意の好適な順番で下位工程(i)及び(ii)を実施することができる、スクリーニングする工程と、
c)(i)上記重鎖抗体に存在するVHH配列を上記細胞から単離する工程、又は(ii)上記重鎖抗体に存在するVHH配列をコードする核酸配列を上記細胞から単離した後、上記VHHドメインを発現する工程のいずれかとを少なくとも含む。
a.所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)に対する免疫応答が誘起されるように、ラクダ科動物に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)を含む好適な抗原、又はこれに由来する若しくはこれに基づく好適なペプチドを好適に免疫付与する工程。抗原は、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)に対する免疫応答を誘起することが可能な任意の好適な抗原;例えば例示的でありこれに限定されないが、生きた状態で、かつその天然立体構造における表面上で所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を過剰発現する全細胞;この細胞壁断片若しくはこのような細胞に由来する任意の他の好適な調製物;その表面上に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を有する小胞;所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)を含む、GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7のサブユニット若しくはサブユニットの断片;又は所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)(のアミノ酸配列)を含む及び/又はこれに基づく合成若しくは半合成のペプチド;より好ましくは生きた状態で、かつその天然立体構造における表面上で所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を過剰発現する全細胞(例えばHEK293)であり得る。
b.上記GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7を過剰発現する異なる(免疫付与に使用したもの以外の)幾つかの細胞型の細胞膜調製物を使用して、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)との結合に関して選択する工程。これは例えば、表面上で重鎖抗体を発現する細胞(例えば好適に免疫付与したラクダ科動物から得られたB細胞)のセット、コレクション若しくはライブラリから選択すると共に、例えば1回目の選択で例えばCHO等の第1の細胞型、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用すること、例えば1回目の選択で例えばCHO等の第1の細胞型、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用することによってVHH配列若しくはナノボディ配列の(ナイーブ又は免疫)ライブラリから選択すること、又は例えば1回目の選択で例えばCHO等の第1の細胞型、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用することによってVHH配列若しくはナノボディ配列をコードする核酸配列の(ナイーブ又は免疫)ライブラリから選択することにより実施することができ、これらは全てそれ自体が既知の方法で実施してもよい。
c.任意で洗浄剤を用いずにPBS等のバッファーで穏やかに洗浄する工程。この方法はさらに任意でそれ自体が既知の他の好適な工程、例えば例示的でありこれに限定されないが、親和性成熟工程、所望のアミノ酸配列を発現する工程、所望の抗原(この場合、GPCR)との結合及び/又はこれに対する活性に関してスクリーニングする工程、所望のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を決定する工程、(例えば本明細書でさらに記載のように)1つ又は複数のヒト化置換を導入する工程、好適な多価及び/又は多重特異性フォーマットでフォーマットする工程、所望の生物学的及び/又は生理学的特性に関してスクリーニングする(即ち本明細書で記載されるような好適なアッセイを使用する)工程、及び/又は1つ又は複数のこのような工程の任意の好適な組合せを1つ又は複数任意の好適な順番で含んでいてもよい。
a.所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)に対する免疫応答が誘起されるように、ラクダ科動物に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)を含む好適な抗原、又はこれに由来する若しくはこれに基づく好適なペプチドを好適に免疫付与する工程。抗原は、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)に対する免疫応答を誘起することが可能な任意の好適な抗原;例えば例示的でありこれに限定されないが、生きた状態で、かつその天然立体構造における表面上で所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を過剰発現する全細胞;この細胞壁断片若しくはこのような細胞に由来する任意の他の好適な調製物;その表面上に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を有する小胞;膜貫通タンパク質、特に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)を含む、(少なくとも本願が出願された時点で)他の「in vitro」系では天然立体構造を再現することができない多重膜貫通タンパク質のサブユニット若しくはサブユニットの断片;又は所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ(複数可)(のアミノ酸配列)を含む及び/又はこれに基づく合成若しくは半合成のペプチド;より好ましくは生きた状態で、かつその天然立体構造における表面上で所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を過剰発現する全細胞(例えばHEK293)であり得る。
b.上記膜貫通タンパク質、特に(少なくとも本願が出願された時点で)他の「in vitro」系では天然立体構造を再現することができない多重膜貫通タンパク質を過剰発現する異なる(免疫付与に使用したもの以外の)幾つかの細胞型の細胞膜調製物を使用して、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)との結合に関して選択する工程。これは例えば、表面上で重鎖抗体を発現する細胞(例えば好適に免疫付与したラクダ科動物から得られたB細胞)のセット、コレクション若しくはライブラリから選択すると共に、例えば1回目の選択で例えばCHO等の第1の細胞型、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用すること、例えば1回目の選択で例えばCHO等の第1の細胞型、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用することによってVHH配列若しくはナノボディ配列の(ナイーブ又は免疫)ライブラリから選択すること、又は例えば1回目の選択で例えばCHO等の第1の細胞型、及び例えば2回目の選択で例えばCOS−7細胞等の第2の細胞型の細胞膜調製物を使用することによってVHH配列若しくはナノボディ配列をコードする核酸配列の(ナイーブ又は免疫)ライブラリから選択することにより実施することができ、これらは全てそれ自体が既知の方法で実施してもよい。
c.任意で洗浄剤を用いずにPBS等のバッファーで穏やかに洗浄する工程。この方法はさらに任意でそれ自体が既知の他の好適な工程、例えば例示的でありこれに限定されないが、親和性成熟工程、所望のアミノ酸配列を発現する工程、所望の抗原(この場合、膜貫通タンパク質)との結合及び/又はこれに対する活性に関してスクリーニングする工程、所望のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を決定する工程、(例えば本明細書でさらに記載のように)1つ又は複数のヒト化置換を導入する工程、好適な多価及び/又は多重特異性フォーマットでフォーマットする工程、所望の生物学的及び/又は生理学的特性に関してスクリーニングする(即ち本明細書で記載されるような好適なアッセイを使用する)工程、及び/又は1つ又は複数のこのような工程の任意の好適な組合せを1つ又は複数任意の好適な順番で含んでいてもよい。
a)重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
b)GPCRと結合することができる、及び/又はGPCRに対する親和性を有する重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列に関して、上記核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
c)上記核酸配列を単離し、その後それぞれ上記重鎖抗体に存在するVHH配列を発現するか、又は上記ナノボディ配列を発現する、単離する工程とを少なくとも含み得る。
a)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から構成されるアミノ酸配列(カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQである)、及び/又は
b)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から構成されるアミノ酸配列(カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、(本明細書に規定の)荷電アミノ酸又はシステイン残基であり、44位のアミノ酸残基はEであるのが好ましい)、及び/又は
c)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から構成されるアミノ酸配列(カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択される)を含む、ポリペプチドと定義することができる。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有し得る;ここで
a)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであり、及び/又は
b)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸又はシステインであり、カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基はEであるのが好ましく、及び/又は
c)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
a)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から構成されるアミノ酸配列(カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQである)、及び/又は
b)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から構成されるアミノ酸配列(カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基はEであり、カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRである)、及び/又は
c)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から構成されるアミノ酸配列(カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択される)を含む、ポリペプチドと定義することができる。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有し得る;ここで
a)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであり、及び/又は
b)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基はEであり、カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRであり、及び/又は
c)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有し得る;ここで
a)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであり、及び/又は
b)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基はEであり、カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRであり、及び/又は
c)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はP、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
a−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、A、G、E、D、G、Q、R、S、Lから成る群から選択され、好ましくはG、E若しくはQから成る群から選択され、
a−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、L、R若しくはCから成る群から選択され、好ましくはL若しくはRから成る群から選択され、
a−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、W、R若しくはSから成る群から選択され、好ましくはW若しくはRであり、最も好ましくはWであり、
a−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであるか、又は
b−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、E及びQから成る群から選択され、
b−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRであり、
b−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、W、R及びSから成る群から選択され、好ましくはWであり、
b−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQであるか、又は
c−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、A、G、E、D、Q、R、S及びLから成る群から選択され、好ましくはG、E及びQから成る群から選択され、
c−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、L、R及びCから成る群から選択され、好ましくはL及びRから成る群から選択され、
c−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、P、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
c−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQであり、かつ
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有し得る;ここで
a−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、A、G、E、D、G、Q、R、S、Lから成る群から選択され、好ましくはG、E若しくはQから成る群から選択され、
a−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、L、R若しくはCから成る群から選択され、好ましくはL若しくはRから成る群から選択され、
a−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、W、R若しくはSから成る群から選択され、好ましくはW若しくはRであり、最も好ましくはWであり、
a−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQであり、かつ
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有し得る;ここで
b−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、E及びQから成る群から選択され、
b−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基はRであり、
b−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、W、R及びSから成る群から選択され、好ましくはWであり、
b−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQであり、かつ
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有し得る;ここで
c−1)カバットナンバリングによる44位のアミノ酸残基は、A、G、E、D、Q、R、S及びLから成る群から選択され、好ましくはG、E及びQから成る群から選択され、
c−2)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、L、R及びCから成る群から選択され、好ましくはL及びRから成る群から選択され、
c−3)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、P、R及びSから成る群から選択され、特にR及びSから成る群から選択され、
c−4)カバットナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ及びLから成る群から選択され、好ましくはQであり、かつ
d)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
i)カバットナンバリングによる44位〜47位のアミノ酸残基は、配列GLEW(又は本明細書に記載のGLEW様配列)を形成し、108位のアミノ酸残基はQであるか、又は
ii)カバットナンバリングによる43位〜46位のアミノ酸残基は、配列KERE又は配列KQRE(又は記載されるようなKERE様配列)を形成し、108位のアミノ酸残基はQ又はLであり、好ましくはQである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有し得る;ここで
i)カバットナンバリングによる44位〜47位のアミノ酸残基は、配列GLEW(又は本明細書に記載のGLEW様配列)を形成し、108位のアミノ酸残基はQであり、かつ
ii)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有し得る;ここで
i)カバットナンバリングによる43位〜46位のアミノ酸残基は、配列KERE又は配列KQRE(又はKERE様配列)を形成し、108位のアミノ酸残基はQ又はLであり、好ましくはQであり、かつ
ii)CDR1、CDR2及びCDR3は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものである。
i)「GLEW群」:カバットナンバリングによる44位〜47位にアミノ酸配列GLEW、及びカバットナンバリングによる108位にQを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、37位にVを有し、103位にW、P、R又はSを有することができ、好ましくは103位にWを有する。GLEW群は、以下の表A−3で言及されるもののような幾つかのGLEW様配列も含む。
ii)「KERE群」:カバットナンバリングによる43位〜46位にアミノ酸配列KERE又はKQRE(又は別のKERE様配列)、及びカバットナンバリングによる108位にQ又はLを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、37位にF、及び47位にL又はFを有し、103位にW、P、R又はSを有することができ、好ましくは103位にWを有する。
iii)「103P、R、S群」:103位にP、R又はSを有するナノボディ。これらのナノボディは、カバットナンバリングによる44位〜47位にアミノ酸配列GLEW、又はカバットナンバリングによる43位〜46位にアミノ酸配列KERE又はアミノ酸配列KQREのいずれかを有することができ(後者は、(KERE群に関して規定のように)37位のF、及び47位のL又はFと組合せるのが最も好ましい)、カバットナンバリングによる108位にQ又はLを有することができ、Qを有するのが好ましい。
これらの組合せのヒト化に関しては、明細書を参照する。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有するアミノ酸配列として規定することができ、ここで
i)カバットナンバリングによる11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位のアミノ酸残基の1つ又は複数が、表A−3で言及される特徴的な残基から選択され、
ii)CDR1、CDR2及びCDR3が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
(ここで、FR1〜FR4はそれぞれフレームワーク領域1〜フレームワーク領域4を指し、CDR1〜CDR3はそれぞれ相補性決定領域1〜相補性決定領域3を指す)を有するアミノ酸配列である可能性があり、ここで
i)カバットナンバリングによる11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位の(好ましくは)アミノ酸残基の1つ又は複数が、表A−3で言及される特徴的な残基から選択され(VHH配列が特徴的な残基を1つ又は複数含有すること、並びに部分ヒト化ナノボディが通常及び好ましくは[依然として]特徴的な残基を1つ又は複数含有すること[しかしながら、本発明に応じて好適であれば、1つ又は複数の他のアミノ酸残基ではなく、全ての特徴的な残基がヒト化した部分ヒト化ナノボディを提供することも本発明の範囲内である]、並びに本発明に応じて好適であれば、完全ヒト化ナノボディにおいて特徴的な残基の位置の全てのアミノ酸残基がヒトVH3配列で発生するアミノ酸残基であることが理解される。本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかなように、このようなVHH配列、少なくとも1つの特徴的な残基を有するこのような部分ヒト化ナノボディ、特徴的な残基を有しないこのような部分ヒト化ナノボディ及びこのような完全ヒト化ナノボディは全て、本発明の態様を形成する)、
ii)上記アミノ酸配列が、配列番号1〜配列番号22のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有し(アミノ酸同一性の程度を求めるために、CDR配列を形成するアミノ酸残基(配列番号1〜配列番号22の配列においてXで示す)は無視する)、
iii)CDR1、CDR2及びCDR3が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
CDRはXXXXで示す
FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4
を有するアミノ酸配列である可能性があり、ここで
i)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸(本明細書中に規定)又はシステイン残基であり、44位のアミノ酸残基は好ましくはEであり、
ii)FR1は、以下のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
i)カバットナンバリングによる45位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸(本明細書中に規定)又はシステイン残基であり、44位のアミノ酸残基は好ましくはEであり、
ii)FR1は、カバットナンバリングによる5位〜26位で、以下のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
iv)CDR1、CDR2及びCDR3が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
i)好ましくは、GLEW群のナノボディが非ヒト化ナノボディである場合、108位のアミノ酸残基はQであり、
ii)FR1は、以下のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
i)好ましくは、GLEW群のナノボディが非ヒト化ナノボディである場合、108位のアミノ酸残基はQであり、
ii)FR1は、カバットナンバリングによる5位〜26位で、以下のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
iv)CDR1、CDR2及びCDR3が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
i)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はWではなく、
ii)好ましくは、カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、P、R又はSであり、より好ましくはRであり、
iii)FR1は、以下のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
i)カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基はWではなく、
ii)好ましくは、カバットナンバリングによる103位のアミノ酸残基は、P、R又はSであり、より好ましくはRであり、
iii)FR1は、カバットナンバリングによる5位〜26位で、以下のアミノ酸配列の少なくとも1つとの少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列であり、
v)CDR1、CDR2及びCDR3が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の1つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
i)任意のアミノ酸置換(本明細書で規定のようにヒト化置換でない場合)は、(本明細書で規定されるように)対応する配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238及び配列番号239のアミノ酸配列のアミノ酸配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく;及び/又は
ii)そのアミノ酸配列は、対応する配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238及び配列番号239のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換だけ、又はそうでなければ好ましくはわずか5つ、好ましくはわずか3つ、より好ましくは1つ若しくは2つだけのアミノ酸欠失若しくは挿入を含有するのが好ましく;及び/又は
iii)CDRは、親和性成熟によって、例えば対応する配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238及び配列番号239のアミノ酸配列のCDRから誘導されるCDRであり得る。
10−5モル/L〜10−12モル/L以下、好ましくは10−7モル/L〜10−12モル/L以下、より好ましくは10−8モル/L〜10−12モル/Lの解離定数(KD)で(即ち、105L/モル〜1012L/モル以上、好ましくは107L/モル〜1012L/モル以上、より好ましくは108L/モル〜1012L/モルの結合定数(KA)で)GPCRに結合するようなものであり、及び/又は
102M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1〜107M−1s−1(105M−1s−1〜107M−1s−1等)のkon速度でGPCRに結合するようなものであり、及び/又は
1s−1(t1/2=0.69s)〜10−6s−1(t1/2が数日のほぼ非可逆的な複合体の場合)、好ましくは10−2s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−3s−1〜10−6s−1(10−4s−1〜10−6s−1等)のkoff速度でGPCRに結合するようなものである。
じてN結合型又はO結合型のグリコシル化を含む。
例えば、異種宿主細胞又は異種宿主生物において発現した結果得られるN末端Met残基を含み得る。
合成の際に宿主細胞からのナノボディの分泌を導く、シグナル配列又はリーダー配列を形成してもよい。好適な分泌リーダーペプチドは当業者にとって明らかであり、本明細書中にさらに記載される通りであり得る。通常、本発明は最も広範な意味では、限定されるものではないが、このようなリーダー配列は、ナノボディのN末端に連結されるであろう。
ナノボディを、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに指向性を有し、及び/又はこれらに侵入させるか若しくは入り込ませ、及び/又はナノボディを、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入させるか若しくはこれらに対して横断させる、配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであろう。幾つかの非限定的な例は、国際公開第03/026700号、並びにTemsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001)、Temsamani and Vidal, Drug Discov.Today, 9, 1012 (004)及びRousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001)に記載されている小ペプチドベクター(「Pep−トランスベクター」)、並びにZhaoet al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003)によって記載されている膜輸送体配列である。抗体断片の細胞内標的化のためのC末端アミノ酸配列及びN末端アミノ酸配列は、例えば、Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004)によって記載されている。細胞内標的化の他の好適な技法は、以下に記述されるような、本発明のナノボディを含むいわゆる「細胞内抗体(intrabodies)」の発現及び/又は使用を伴う。
「標識」、例えば、上記の配列又は残基を対象とする親和性技法等を用いてナノボディの精製を可能にするか又は容易にする、アミノ酸配列又は残基を形成し得る。その後、(例えば、化学的又は酵素学的な切断によって)上記の配列又は残基を除去して、ナノボディ配列をもたらし得る(この目的のために、標識は任意で、切断可能なリンカー配列を介してナノボディ配列に連結されてもよく、又は切断可能なモチーフを含有していてもよい)。このような残基の好ましいが非限定的な幾つかの例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びmyc標識(例えば国際公開第06/12282号の配列番号31を参照)である。
官能基の結合のために官能化し及び/又は部位として機能することができる1つ又は複数のアミノ酸残基であり得る。好適なアミノ酸残基及び官能基は当業者にとって明らかであり、本発明のナノボディの誘導体について本明細書中に記述されたアミノ酸残基及び官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
i)好適な宿主細胞又は宿主生物(本明細書中では「本発明の宿主」とも呼ぶ)において、又は本発明の上記アミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸(本明細書中では「本発明の核酸」とも呼ぶ)の適切な別の発現系において、発現する工程と、場合によってはその後、
ii)このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び/又は精製する工程とを含む。
i)本発明の上記宿主が少なくとも1つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び/又はポリペプチドを発現及び/又は産生するような条件下で、本発明の宿主を培養及び/又は維持する工程と、場合によってはその後、
ii)このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び/又は精製する工程とを含み得る。
i)ii)と作用可能に結合した少なくとも1つの本発明の核酸と、
ii)プロモーター、及び場合によっては好適なターミネーター等の、1つ又は複数の調節要素と、場合によってはさらに
iii)それ自体が既知の遺伝子構築物の1つ又は複数のさらなる要素とを含み、ここで、「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「作用可能に結合した」という用語は、当該技術分野における(本明細書中に詳述するような)通常の意味を有しており、遺伝子構築物中に存在する上記「さらなる要素」とは、例えば、3’−又は5’−UTR配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー/レポーター遺伝子、及び/又は形質転換若しくは組込み(の効率)を促進又は増大させ得る要素であってもよい。このような遺伝子構築物に好適なこれら及び他の要素は当業者にとって明らかであり、例えば、使用する構築物の種類、目的とする宿主細胞又は宿主生物、対象となる本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法(例えば、構成的発現、一時的発現、又は誘導性発現等を介するもの)、及び/又は使用する形質転換法に応じて決定することができる。例えば、抗体及び抗体断片((単一)ドメイン抗体及びScFv断片が挙げられるが、これらに限定されない)の発現及び産生のための、それ自体が既知の制御配列、プロモーター、及びターミネーターを、ほぼ同様の方法で使用してもよい。
大腸菌の菌株、ミラビリス変形菌(Proteusmirabilis)等のプロテウス属の菌株、蛍光菌(Pseudomonas fluorescens)等のシュードモナス属の菌株等のグラム陰性菌株、及び、枯草菌(Bacillus subtilis)又はブレビス菌(Bacillus brevis)等のバチルス属の菌株、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)等のストレプトミセス属の菌株、スタフィロコッカス・カルノサス(Staphylococcus carnosus)等のスタフィロコッカス属の菌株、及び乳酸連鎖球菌(Lactococcus lactis)等のラクトコッカス属の菌株等のグラム陽性菌株が挙げられるがこれらに限定されない細菌株、
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)等のトリコデルマ属の種、アカパンカビ(Neurospora crassa)等のニューロスポラ属の種、ソルダリア・マクロスポラ(Sordariamacrospora)等のソルダリア属の種、アスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)又はショウユコウジカビ(Aspergillus sojae)等のアスペルギルス属の種、又は別の糸状菌(filamentousfungi)由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない真菌細胞、
出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)等のサッカロミセス属の種、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等のシゾサッカロミセス属の種、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)又はピキア・メタノリカ(Pichiamethanolica)等のピキア属の種、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)等のハンセヌラ属の種、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)等のクルイベロミセス属の種、アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)等のアークスラ属の種、ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowialipolytica)等のヤロウィア属の種由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない酵母細胞、
アフリカツメガエル卵母細胞等の両生類細胞又は細胞株、
シロイチモンジヨトウSF9及びSf21細胞を含むがこれらに限定されない鱗翅目に由来する細胞/細胞株、又はシュナイダー細胞及びKc細胞等のショウジョウバエに由来する細胞/細胞株等の昆虫に由来する細胞又は細胞株、
タバコ植物等の植物又は植物細胞、及び/又は
CHO細胞、BHK細胞(BHK−21細胞等)、及びHeLa細胞、COS細胞(COS−7細胞等)、及びPER.C6細胞等のヒト細胞又は細胞株が挙げられるがこれらに限定されない、ヒトに由来する細胞又は細胞株、哺乳動物に由来する細胞又は細胞株等の哺乳動物細胞又は細胞株、及び、
抗体及び抗体断片((単一)ドメイン抗体及びScFv断片が挙げられるがこれらに限定されない)を発現及び産生するそれ自体が既知の他の全ての宿主又は宿主細胞であってもよく、これらは当業者に明らかであろう。上記で引用した包括的な背景技術及び、例えば、国際公開第94/29457号、国際公開第96/34103号、国際公開第99/42077号、Frenken et al.(1998)(同上)、Riechmann and Muyldermans (1999)(同上)、van der Linden (2000)(同上)、Thomassen et al.(2002)(同上)、Joosten et al.(2003)(同上)、Joosten et al.(2005)(同上)及び本明細書中にさらに引用した文献を参照する。
大腸菌における発現のための:lacプロモーター(及び、lacUV5プロモーター等のこれらの誘導体);アラビノースプロモーター;λファージの左側(PL)及び右側(PR)プロモーター;trpオペロンのプロモーター;ハイブリッドlac/trpプロモーター(tac及びtrc);T7−プロモーター(より具体的にはT7−ファージ遺伝子10のプロモーター);及び他のT−ファージプロモーター;Tn10テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター;外来制御オペレーター配列の1つ又は複数のコピーを含む上記プロモーターの組換え変異体;
出芽酵母における発現のための:ADH1(アルコールデヒドロゲナーゼ1)、ENO(エノラーゼ)、CYC1(チトクロームc異性化酵素1)、GAPDH(グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ)、PGK1(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、PYK1(ピルビン酸キナーゼ)の構成的プロモーター;GAL1、GAL10、GAL7(ガラクトース代謝酵素)、ADH2(アルコールデヒドロゲナーゼ2)、PHO5(酸ホスファターゼ)、CUP1(銅メタロチオネイン)の制御的プロモーター;CaMV(カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター)の異種プロモーター;
ピキア・パストリスにおける発現のための:AOX1プロモーター(アルコールオキシダーゼI);
哺乳動物細胞における発現のための:ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)前初期エンハンサー/プロモーター;プロモーターがTetリプレッサーによって制御可能なように2個のテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス(hCMV)前初期プロモーター変異体;単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(TK)プロモーター;ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列(RSV LTR)エンハンサー/プロモーター;ヒト、チンパンジー、マウス、又はラット由来の伸長因子1α(hEF−1α)プロモーター;SV40初期プロモーター;HIV−1の長末端反復配列プロモーター;βアクチンプロモーターが挙げられる。
哺乳動物細胞における発現のためのベクター:pMAMneo(Clontech)、pcDNA3(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO−pSV2−neo(ATCC 37593)、pBPV−1(8−2)(ATCC 37110)、pdBPV−MMTneo(342−12)(ATCC 37224)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pRSVneo(ATCC 37198)、pSV2−dhfr(ATCC 37146)、pUCTag(ATCC 37460)及びlZD35(ATCC 37565)、並びにアデノウイルスに基づくもの等のウイルスに基づく発現系;
細菌細胞における発現のためのベクター:pETベクター(Novagen)及びpQEベクター(Qiagen);
酵母又は他の真菌細胞における発現のためのベクター:pYES2(Invitrogen)及びピキア発現ベクター(Invitrogen);
昆虫細胞における発現のためのベクター:pBlueBacII(Invitrogen)及び他のバキュロウイルスベクター;
植物又は植物細胞における発現のためのベクター:例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス、アグロバクテリウムの好適な菌株又はTi−プラスミドに基づくベクターが挙げられる。
大腸菌等の細菌細胞における使用のための:PelB、Bla、OmpA、OmpC、OmpF、OmpT、StII、PhoA、PhoE、MalE、Lpp、LamB等;TATシグナルペプチド、ヘモリシンC末端分泌シグナル;
酵母における使用のための:α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ(pho1)、インベルターゼ(Suc)等;
哺乳動物細胞における使用のための:標的タンパク質が真核細胞由来である場合には、固有シグナル、マウスIg κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド等が挙げられる。
実施例1:CXCR4ナノボディの生成:
方法:
細胞培養及びトランスフェクション
HEK293T細胞を、37℃で、加湿雰囲気(5%CO2、95%空気)において、2mM L−グルタミン、50IU/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン及び10%(v/v)ウシ胎児血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中に維持した。ジャーカット細胞を、加湿雰囲気(5%CO2、95%空気)において、2mM L−グルタミン、50IU/mlのペニシリン、50μg/mlのストレプトマイシン及び10%(v/v)ウシ胎児血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)とハムF12培地との1:1混合物中で培養した。
125Iによるナノボディの放射性標識化を、ヨードゲン法(Pierce,Rockford,IL)を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。125I−標識ナノボディを、Sephadex G−25ゲル濾過カラム(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を用いて遊離ヨウ素から分離した(>99%)。ヨウ素取り込み及び特異的活性を、トリクロロ酢酸によるタンパク質の沈殿によって調整した。myo−[2−3H]−イノシトール(10Ci/mmol〜20Ci/mmol)及び[125I]−標識CXCL12(2200Ci/mmol)は、PerkinElmer Life and Analytical Sciences(Boston,MA)から入手した。
CXCR3又はCXCR4を一時的に発現するHEK293T細胞から膜を、トランスフェクションの48時間後に以下のように調製した。1mM EDTAを含有する氷冷PBSを用いて細胞を洗浄し、細胞培養皿から掻き取った。掻き取った細胞を、4℃で10分間、1500×gでペレット化した。ペレットを洗浄した後、氷冷膜バッファー(15mM Tris(pH7.5)、1mM EGTA、0.3mM EDTA及び2mM MgCl2)中に再懸濁した。細胞懸濁液を、テフロン(登録商標)−ガラスホモジナイザー及びローターを用いて、1200rpmで10ストロークしてホモジナイズし、さらに液体窒素を用いる3回の凍結融解サイクルに供した。膜を4℃、40000gで25分間の遠心分離によって分離した。膜ペレットを洗浄し、氷冷Tris−スクロースバッファー(20mM Tris(pH7.4)及び250mM スクロース)中に再懸濁し、液体窒素中で凍結した。総タンパク質量をブラッドフォードアッセイ(Bio-Rad)を用いて求めた。
pcDNA3.1−CXCR4及びpcDNA1−HA−mGαqi5(Verzijl et al, 2008(同上)を参照されたい)によるトランスフェクションの24時間後、250000個の細胞を、24ウェルプレート中に播種し、1μCiのmyo−[2−3H]−イノシトールを添加した、イノシトールを含まない最小必須培地を用いて一晩標識した。翌日、細胞を1回洗浄して、取り込まれなかったmyo−[2−3H]−イノシトールを除去した。アンタゴニスト実験においては、細胞をアッセイ培地(20mM HEPES、140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO4、1mM CaCl2、10mMグルコース及び0.05%(w/v)ウシ血清アルブミン、pH7.4)中で、37℃で1時間試験化合物と共にプレインキュベートし、その後37℃でさらに2時間、LiCl(10mM)及びCXCL12(30nM)で刺激した。アゴニスト実験においては、細胞をアッセイバッファー中、37℃で2時間、試験化合物及びLiCl(10mM)で直接刺激した。刺激培地を吸引し、10mM氷冷ギ酸を添加することによって刺激を停止した。蓄積したイノシトールリン酸を、陽イオン交換クロマトグラフィによって単離し、液体シンチレーションによってカウントした。
HEK239T細胞を、pCRE/β−ガラクトシダーゼ(Chen W, Shields TS, Stork PJS, Cone RD (1995) Anal Biochem 226:349-354)、及び指定の受容体をコードするプラスミド(pcDEF3又はpcDNA3.1)でトランスフェクトした。1ウェル当たり40000個のトランスフェクト細胞を、96ウェルプレート中に播種し、10%ウシ胎児血清を添加したDMEM中で培養した。培地をトランスフェクションの32時間後に、0.5%ウシ血清アルブミン及び指定のリガンドを添加した無血清DMEMと交換した。リガンドインキュベーションの16時間後、培地を除去し、細胞を100μlのアッセイバッファー(100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)、4mM 2−ニトロフェノール−β−D−ピラノシド、0.5%Triton X−100、2mM MgSO4、0.1mM MnCl2及び40mM β−メルカプトエタノール)中に溶解し、室温でインキュベートした。フォルスコリン(3μM)対照のOD420値が0.4〜0.6に達した場合、β−ガラクトシダーゼ活性を、アッセイバッファーとのインキュベーション後、PowerwaveX340プレートリーダー(Bio-Tek Instruments Inc.,Winooski,VT)を用いた420nmでの吸光の測定によって求めた。
ジャーカット3D細胞の走化性反応を、ChemoTx(商標)プレート(Receptor Technologies Ltd.,Oxon,UK)(上部細胞含有コンパートメントと下部化学誘引物質含有コンパートメントとが、ポリビニルピロリドンフリーのポリカーボネートフィルター(孔径5μm)によって隔てられている)を用いて評価した。細胞を回収し、洗浄して、0.5%ウシ血清アルブミンを含有するRPMI中に再懸濁した後、25μl容量の1ウェル当たり150000個の細胞を、走化性チャンバーの上部コンパートメントに投入した。膜を通って移動する細胞を刺激するために、指定の濃度のCXCL12及び/又は試験化合物を31μlの最終容量で、下部コンパートメントに投入した(アゴニスト実験)。アンタゴニスト性の特性化については、AMD3100又は試験化合物を、下部CXCL12(300pM)含有コンパートメントに投入し、上部コンパートメントの細胞と共にさらにプレインキュベートした。走化性チャンバーを37℃、100%湿度、5%CO2で4時間インキュベートした。下部コンパートメントの各々に移動する細胞の数を、カルセインAMとのインキュベーション、及び1ウェル当たり0個〜50000個のジャーカット3D細胞による較正に続く、535nmでの蛍光測定によって求めた。
CXCR4使用(X4)HIV−1分子クローンNL4.3は、National Institutes of Health NIAID AIDS Reagent program(Bethesda,MD)から入手し、CCR5使用(R5)HIV−1株BaLは、Medical Research Council AIDS reagent project(Herts,UK)から入手した。二重指向性(R5/X4)HIV−1 HE株は当初、ルーベン大学病院(University Hospital in Leuven)の患者から単離され、MT−4細胞中で日常的に培養されている(Pauwels R, Andries K, Desmyter J, Schols D, Kukla MJ, Breslin HJ,Raeymaeckers A, Van Gelder J, Woestenborghs R, Heykants J. Potent and selectiveinhibition of HIV-1 replication in vitro by a novel series of TIBO derivatives.Nature 1990; 343:470-474)。MT−4細胞を96ウェルプレート上に、U87細胞を24ウェルプレート上に播種した。試験化合物をHIV−1と共に種々の濃度で添加し、プレートを37℃で10%CO2中に維持した。ウイルスによって誘導される細胞変性効果を、ウイルス感染細胞培養物の毎日の微視的評価によってモニタリングした。感染後4日〜5日目に、陽性対照(即ち、未処理HIV感染細胞)において強い細胞変性効果が観察され、細胞生存率を、CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution細胞増殖アッセイ(Promega,Madison,WI)を用いて、テトラゾリウム化合物MTSのin situ還元によって評価した。次いで、96ウェルプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いて、490nmで分光光度法によって吸光度を測定し、4つの細胞対照複製物(replicates)(ウイルス及び薬物を含まない細胞)並びに4つのウイルス対照ウェル(薬物を含まないウイルス感染細胞)と比較した。50%阻害濃度(IC50、即ち、HIV誘導性細胞死を50%阻害する薬物濃度)を、各々の化合物について用量応答曲線から算出した。各々の化合物のCC50又は50%細胞毒性濃度を、上記のMTS法によって測定されるように、薬剤に曝露された非感染細胞の生存率の低下から求めた。
データは、n回の独立実験からの平均±標準誤差として提示する。濃度応答曲線(E/[A]曲線)を、逐次最小二乗法(GraphPad Prism 4.0;GraphPad Software,San Diego,CA)を用いてヒルの式に当てはめ、最大阻害効果(Imax)、50%効果濃度(EC50)又は50%阻害濃度(IC50)を得た。競合結合親和性及び機能的アンタゴニスト親和性(pKi)を、チェン−プルソフ式:pKi=IC50/(1+[アゴニスト]/EC50)(Cheng & Prusoff, 1973)を用いて算出した。任意で、アンタゴニスト親和性を、式:pKB=−log[アンタゴニスト]+log(CR−1)(式中、CRはアンタゴニストの存在下及び非存在下でのアゴニストEC50の比率を表す)に基づき、Arunlakshana and Schild(1959)の方法を用いてpKB値として表した。
異名:CXCR−4/ストロマ細胞由来因子1受容体(SDF−1受容体)/フーシン/白血球由来7回膜貫通ドメイン受容体(LESTR)/LCR1/FB22/NPYRL/HM89/CD184抗原
マカク95%、ブタ92%、イヌ93%、ウサギ91%、マウス88%、ニワトリ80%
免疫付与のために、ヒトCXCR4を一時的に発現するHEK293細胞(ヒト胎児腎臓)を「抗原」として使用した。
製造業者の取扱説明書に従ってフィコール・ハイパークを使用して、末梢血単核細胞を血液試料から調製した。次に、全RNAをこれらの細胞及びリンパ節弓(bow)細胞から抽出し、RT−PCRの出発材料として使用し、ナノボディをコードする遺伝子断片を増幅した。これらの断片をファージミドベクターpAX50にクローニングした。ファージを標準的な方法に従って調製し(例えば本明細書中で言及された従来技術及び出願人によって提出された出願を参照されたい)、さらなる使用(ファージライブラリ217及び218の作製)のために4℃で保存した。
CXCR4を認識するナノボディを同定するために、ファージライブラリ(217、218)をファージディスプレイ選択において使用した。
CHO−CXCR4はヒトCXCR4で一時的にトランスフェクトしたCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞の膜であり、COS7−CXCR4はヒトCXCR4で一時的にトランスフェクトしたCOS7(サル細胞)細胞の膜であり、R1は1回目の選択であり、R2は2回目の選択であり、対抗選択とは、CHO膜(CXCR4を発現しない)の存在下で選択を行ったことを意味し、リガンドはCXCL12/SDF1(100ulのPBS中3ug)であり、アンタゴニストはAMD3100(50uM)であり、抗体は12G5(100ulのPBS中5ug)である。
非特異的トリプシン溶出の代替手段は、化合物の結合部位に結合するファージの溶出(競合)に、特異的CXCR4結合化合物を使用することである。この場合、2.5ugの膜調製物を4℃で一晩、100ulのPBS中で塗布し、溶出を過剰の:
CXCR4に対する天然リガンドであるCXCL12/SDF1(100ulのPBS中3ug)、
既知の化学的アンタゴニストであるAMD3100(50uM)(Sigma Aldrich製)、
既知の中和抗体である12G5(100ulのPBS中5ug)(R&D System製)によって室温で30分間行った。
ナノボディの結合特異性を求めるために、15ulの産生したファージをファージELISA結合アッセイにおいて試験した。
180個のクローンを分析し、それらのペリプラズム画分をCXCR4競合結合アッセイを用いてスクリーニングした。CXCR4を一時的に発現するHEK293T細胞に由来する膜を用いた一次スクリーニングにおいては、クローンのおよそ13%が、CXCR4への結合について放射性標識化内因性CXCR4リガンド[125I]−CXCL12と競合し、少なくとも30%の特異的[125I]−CXCL12結合の阻害をもたらすことが見出された(図3)。合計して(A total amount of)5つのクローン(およそ3%)が、特異的[125I]−CXCL12結合を強く(70%超)阻害する。CXCR4とは異なる膜タンパク質に指向性を有するナノボディを発現する対照ファージについては阻害は観察されなかった。一次スクリーニングでヒットしたものを全て、二次スクリーニングで確認し(図3b)、それによりCXCL12を置換するナノボディを産生するクローンのVHHコードDNAをシークエンシングした。シークエンシング分析によって、[125I]−CXCL12を強く(2つのプール)又は部分的に(5つのプール)置換する、同一の又は非常に良く似たクローンの7つのプールが得られる(表B−2)。これらのプールを代表するナノボディ、即ち237A6、237D1、237D2、237G7、238C5、238D2及び238D4を精製し、さらに薬理学的に分析した。
精製の後、237A6、237D1、237D2、237G7、238C5、238D2及び238D4についての受容体結合特性を、一時的にCXCR4を発現するHEK293T細胞に由来する細胞膜上で調査した。ナノボディ238D2及び238D4は、特異的に結合した[125I]−CXCL12の全てを完全に置換し、CXCR4に対して低ナノモル範囲の親和性を示す(表2)。他の全てのナノボディは、0.5μMという最も高い試験濃度であっても、[125I]−CXCL12を置換することはできなかった(237A6、237D1、237D2、237G7及び238C5)(図4A;表B−3)。
[125I]−CXCL12を置換するナノボディクローンのスクリーニング及びシークエンシング。結合効率は、CXCR4を一時的に発現するHEK293T細胞に由来する膜上で、[125I]−CXCL12との競合結合によって求めた。
一価ナノボディ及びCXCR4参照リガンドについての[125I]−CXCL12、[125I]−238D2及び[125I]−238D4の受容体親和性(pKi)及び最大置換度。実験は、CXCR4を一時的に発現するHEK293T細胞に由来する膜上で行った。データは平均±標準誤差として示す。実験の回数はnとして示す。
ナノボディ238D2及び238D4を機能的に特性化する目的で、CXCR4及びGαqi5をコードするcDNAで一時的に同時トランスフェクトしたHEK293T細胞において、Gタンパク質シグナル伝達を活性化するか、又はCXCL12誘導性Gタンパク質シグナル伝達を阻害するそれらの能力を測定した。このアッセイは、5つのC末端アミノ酸がGαi由来のものに置き換わったGαq骨格を含有する、キメラGαqi5タンパク質の使用に基づく。このキメラGタンパク質は、GαiサブユニットのようにCXCR4によって活性化されるが、シグナルをGαqタンパク質のように変換する(Coward, P., et al., Chimeric G Proteins Allow a High-ThroughputSignaling Assay of G1-Coupled Receptors, Analytical Biochemistry (1999) 270: 242-248)。このため、Gαqi5の活性化は、蓄積したイノシトールリン酸の測定によって定量化することができる。CXCL12は、イノシトールリン酸蓄積を7.89±0.21というpEC50(n=4)で刺激した。ナノボディ238D2又は238D4については、アゴニスト活性は100nMの濃度に至るまで観察されなかった。しかしながら、238D2及び238D4は、イノシトールリン酸のCXCL12誘導性蓄積を濃度依存的に完全に阻害した(図5A)。
ヒトCXCR4に指向性を有するナノボディに対するものと同じ手法。特に、該方法は、少なくとも以下の工程:
a)ヒトCXCR7を過剰発現する全生細胞(例えば、HEK293)による免疫付与、
b)異なる細胞型(例えば、免疫付与に対してはHEK293、1回目の選択に対してはヒトCXCR7について富化したCHO膜、2回目の選択に対してはヒトCXCR7について富化したCOS7膜)を用いた免疫付与及び選択、
c)任意で、穏やかな緩衝剤、例えばPBS(洗浄剤を含まない)を用いた洗浄を使用する。
実施例3.1:単回偽ウイルス中和アッセイ
James M. Binley,1, TerriWrin,2 Bette Korber,3 Michael B. Zwick,1 MengWang,1 Colombe Chappey,2 Gabriela Stiegler,4Renate Kunert,4 Susan Zolla-Pazner,5 Hermann Katinger,4Christos J. Petropoulos,2 and Dennis R. Burton ComprehensiveCross-Clade Neutralization Analysis of a Panel of Anti-Human ImmunodeficiencyVirus Type 1 Monoclonal Antibodies Journal of Virology, December 2004, p.13232-13252, Vol. 78, No. 23を参照する。
Steyaert et al., 2007. Inhibition of replication of primary HIV-1isolates in huPBL-NOD/Scid mice by antibodies from HIV-1 infected patients.Antiviral Res. 2007 Aug;75(2):129-38. Epub 2007 Mar 6を参照する。高感度GHOST細胞ベースアッセイ(Donnerset al., 2003)を用いて、ヒト血漿及び精製免疫グロブリンを中和活性についてスクリーニングする。これらの細胞をヒト骨肉種細胞から誘導し、HIVコレセプター(CCR5又はCXCR4)の1つであるヒトCD4をコードする遺伝子、及びHIV−2 LTRプロモーターの制御下の緑色蛍光タンパク質でトランスフェクトする。感染細胞数をFACSによって測定する。血漿試料は20倍に希釈し、精製IgGは500ug/mlの濃度まで希釈する。中和アッセイのフォーマットは24/24/48であり、ここで24/x/xは抗体及びウイルスをプレインキュベートする期間(時間)であり、x/24/xは細胞をこれらの混合物に曝露する期間(時間)であり、x/x/48はウイルス接種の開始からFACS分析までの期間(時間)である。中和率は100−[(試験した試料の感染細胞数/血清陰性対照の感染細胞数)×100]として算出する。
Beirnaert et al., 2000を参照する。ウイルス中和アッセイを以前に記載されるように[Nyambi et al., 1996](幾らか変更して)行う。簡潔に述べると、ウイルス感染PBMCの培養上清(50 TCID50/ウェル)及び熱不活性化血清(56℃で30分間)の2倍段階希釈物(1/10〜1/1280)を96ウェルトレイ中で混合し、5%CO2雰囲気において37℃で1時間インキュベートする。各実験において、HIV(−)血清を試料血清と同じ条件でアッセイして、陰性対照とする。続いて、7.5×104/ウェルのPHA刺激した、IL−2を維持するPBMCを添加する。2時間のインキュベーションの後、細胞を3回洗浄し、20U/mlのIL−2、15%FCS、0.03%L−グルタミン、2mg/mlのポリブレン、5mg/mlのヒドロコルチゾン及び抗生物質を添加したRPMI 1640培地中でインキュベートする。中和実験毎に、ウイルスを再度滴定し、種々のドナーPBMCにおけるウイルスストックの感染性を比較する。ウイルス力価が投入ウイルス力価と3倍超異なる場合、中和実験は無効であると見なす。グループM及びグループOに属するHIV−1の抗原を捕捉する非商業的抗原捕捉ELISAを用いて、ウイルス複製を7日後に評価する[Beirnaert et al., 1998, Identification and characterization of serafrom HIV-infected individuals with broad cross-neutralizing activity againstgroup M (env clade A-H) andgroup O primary HIV-1 isolates. J Med Virol. 2000 Sep;62(1): 14-24]。50%阻害量(ID50)は、抗原捕捉アッセイにおいて、陰性血清対照に比べて吸光度値の50%の低下をもたらした最も高い血清希釈率の逆数であると定義される。1/10未満の血清中和力価を陰性であると見なす。血清は二連でアッセイし、試験は少なくとも3回行う。
実施例3.4.1:Hu−PBL(NOD/SCID)
Gauduin, M. C., Parren, P.W., Weir, R., Barbas, C. F., Burton, D.R., Koup,R.A.,1997. Passive immunization with a human monoclonal antibody protectshu-PBL-SCID mice against challenge by primary isolates of HIV-1. Nat. Med. 3,1389-1393, Steyaert et al., 2007を参照する。
抗体点滴、膣内抗原投与並びに血液及び粘膜採取のために、マカクにケタミンHClで軽度麻酔をかける。SHIV89.9PD抗原投与ストックをアカゲザルPBMC中で培養し、滴定する。抗体をウイルス抗原投与の24時間前に静脈内点滴する。ウイルスストックの5倍希釈物(600 TCID50)1mlを、1ml容シリンジを用いてマカクの膣管にゆっくりと導入することによって膣内SHIV抗原投与を行う。マカクを抗原投与後少なくとも15分間腹臥位に保つ。膣内抗原投与の30日前、マカクに30mgの酢酸メドロキシプロゲステロン(デポプロベラ;Upjohn,Kalamazoo,Michigan)を筋内注射によって与えてもよい。プロゲステロン処理したマカクの最近の滴定実験によって、サルが10〜50動物感染量のSHIV89.6PDに曝露されていることが実証された。膣内抗原投与後、サルを臨床的に、日常的な血液学測定、リンパ球サブセット測定及び血液化学測定によって追跡調査する。ウイルス同時培養及びウイルスDNAのPCRのための鼠径リンパ節生検を、ウイルス抗原投与の3週間後に全てのサルに対して行う。
実施例4.1:二価ナノボディの生成
機能的阻害プロファイルを工学(engineering)によって改善するために、238D2及び238D4に基づく一連の二価ナノボディを作製した(表B−5)。
異なるサイズの反復GGGGS配列を有するアミノ酸リンカーを用いた、238D2と238D2との組換え連結及び238D4と238D4との組換え連結は、CXCR4に対する親和性をそれぞれ14倍及び4.4倍増大させる(表B−6、表B−6)。見掛けの親和性の有意な増大が、238D2を238D4に連結した場合にも観察された。得られたヘテロ二価ナノボディ238D2−20GS−238D4の場合、CXCR4に対する親和性が、それぞれの一価対応物238D2及び238D4から27倍及び17倍増大した。15アミノ酸と20アミノ酸との間でのリンカーサイズの変更は、受容体親和性に関するいかなる影響も示さない。しかしながら、238D2を不活性ナノボディ238B10又は低親和性ナノボディ238C5に連結することによって、受容体親和性は増大しないばかりか、低下した。これらの結果は、リンカー自体が受容体親和性を増大させる可能性を排除するものである。さらに、238D2と238D4との結合における競合(図4B、図4C)、及び238D2と238D4との等モル量の(equi-molar)混合による[125I]−CXCL12置換効力の増大の欠如は、同じ受容体分子に対するアロステリック結合による正の共同的効果に相反するものである。
化合物238D2−15GS−238D4及び化合物238D2−20GS−238D4の最大阻害(Imax)及び機能的阻害効力(pKi又はpIC50)。データは平均±標準誤差として示す。実験の回数はnとして示す。
膜結合実験では、12G5は125I−CXCL12の50%しか置換しないようである。このため、本発明者らは12G5がCXCR4機能を効果的に阻害するかを試験することに興味を持った。
12G5を、hCXCR4/Gαqi5に対する完全曲線(full curve)(n=2)及び単一点(10nM)として試験した。細胞は30nM CXCL12で刺激した。
1日目に、HEK293T細胞を2000000細胞/皿の密度でプレーティングした。2日目に、これらの細胞をPEI方法を用いて、2.5μgのCXCR4 DNA及び2.5μgのGαqi5でトランスフェクトした。翌日、細胞をポリ−L−リシンコーティング24ウェルプレートにプレーティングし(500μl/ウェル)、4時間〜6時間後にイノシトールを含まない培地において2μCi/mlの3H−イノシトールで標識化した。4日目に、細胞をRosenkildeバッファー中、37℃で2時間、ナノボディ12G5又は1μM AMD3100のいずれかで前刺激した。この前刺激の後、30nM CXCL12(又は基礎(basal)シグナル伝達用のバッファー)及び10mM LiClの両方を各ウェルに添加し(最終濃度)、その後、37℃で2時間の最後のインキュベーションを行った。この最後のインキュベーションの後、刺激培地を吸引し、10mM ギ酸を添加することによって反応を停止した(図9)。
実施例5.1:CXCR4特異的ナノボディは、CXCR4の構成的活性化突然変異体のニュートラルアンタゴニスト又はインバースアンタゴニストとして働く
CXCR4特異的一価ナノボディ238D2及び238D4、並びにそれらの二価融合産物L3及びL8を、構成的活性化CXCR4突然変異体N119A(A群GPCRのBallesteros Weinstein(Ballestros-Weinstein)ナンバリングにおいてN3.35Aと等価である)に関して調査した。N119の突然変異体は以前、Peiper及び共同研究者らによって、構成的活性化突然変異体(CAM)について、酵母レポーター遺伝子アッセイを用いて、CXCR4ランダム突然変異誘発ライブラリから選択された唯一の突然変異体であるとして同定されている(Zhang W.B., Navenot J.M., Haribabu B., Tamamura H., Hiramatu K.,Omagari A., Pei G., Manfredi J. P., Fujii N., Broach J. R., Peiper S. C. (2002). A point mutation that confersconstitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and thatAMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J. Biol. Chem. 277:24515-24521.)。他のA群GPCRに対する多数のCAM、及びCXCR4に対するさらなるCAMを生成するさらなる試み(Berchiche et al., 2007)にも関わらず、CXCR4のN119突然変異体は、依然としてこの受容体に対する唯一の既知のCAMである。調査した一価ナノボディ238D2及び238D4の両方が、CXCR4(N119A)に結合可能であった。それらの結合親和性は、野生型受容体に比べて幾らか低かった。低い親和性のために、2μMという最も高いナノボディ試験濃度であっても水平状態に達しなかった(図10)。
膜の調製及び[125I]−CXCL12(40pM)を用いた競合結合実験を、野生型CXCR4に関して上述したように行った(上記参照)。
・免疫不全症
・WHIM症候群:疣贅、低ガンマグロブリン血症、感染症及び先天性好中球減少症(Myelokathexis)症候群
・癌:
・造血癌:CLL、AML、ALL、MM、非ホジキンリンパ腫
・固形腫瘍:乳癌、肺癌、脳腫瘍等
・腫瘍の間質性化学療法抵抗性(Stromal chemoresistance)
・白血病及び他の癌
・幹細胞動員
・腫瘍細胞生存及び薬物耐性をもたらす接着性間質相互作用の阻害
・組織部位からの腫瘍細胞の動員、及び腫瘍細胞を従来の療法に対してより感受性(accessible)にすること
・腫瘍細胞の移動及び播種(転移)の遮断
・パラクリン成長及び生存シグナルの遮断
・SDF−1の血管新生促進(pro-angiogenesis)効果の遮断
・炎症性疾患
・RA、喘息、肺線維症、SLE
・損傷組織(心臓、脳)への幹細胞動員
・神経炎症性疾患
・MS、脳卒中、HIV関連認知症
・感染性疾患
・HIV/AIDS、西ナイルウイルス脳炎
アセチルコリン受容体(アゴニスト)、
ムスカリン性受容体(アゴニスト)、
ムスカリン性M1受容体(アゴニスト)、
ムスカリン性M2受容体(アゴニスト)、
ムスカリン性M3受容体(アゴニスト)、
ムスカリン性M4受容体(アゴニスト)、
ムスカリン性M5受容体(アゴニスト)、
ムスカリン性受容体(パーシャルアゴニスト)、
アドレナリン受容体(アゴニスト)、
αアドレナリン受容体(アゴニスト)、
α1アドレナリン受容体(アゴニスト)、
α1Aアドレナリン受容体(アゴニスト)、
α1Bアドレナリン受容体(アゴニスト)、
α1Dアドレナリン受容体(アゴニスト)、
α2アドレナリン受容体(アゴニスト)、
α2Aアドレナリン受容体(アゴニスト)、
α2Bアドレナリン受容体(アゴニスト)、
α2Cアドレナリン受容体(アゴニスト)、
α2アドレナリン受容体(パーシャルアゴニスト)、
α3アドレナリン受容体(アゴニスト)、
βアドレナリン受容体(アゴニスト)、
β1アドレナリン受容体(アゴニスト)、
β2アドレナリン受容体(アゴニスト)、
β3アドレナリン受容体(アゴニスト)、
ドーパミン受容体(アゴニスト)、
ドーパミンD5受容体(アゴニスト)、
ドーパミンD1受容体(アゴニスト)、
ドーパミンD2受容体(アゴニスト)、
ドーパミンD3受容体(アゴニスト)、
ドーパミンD4受容体(アゴニスト)、
ヒスタミン受容体(アゴニスト)、
ヒスタミンH1受容体(アゴニスト)、
ヒスタミンH2受容体(アゴニスト)、
ヒスタミンH3受容体(アゴニスト)、
ヒスタミンH4受容体(アゴニスト)、
5−HT GPCR(アゴニスト)、
5−HT 1(アゴニスト)、
5−HT 2(アゴニスト)、
5−HT 4(アゴニスト)、
5−HT 5a(アゴニスト)、
5−HT 5b(アゴニスト)、
5−HT 6(アゴニスト)、
5−HT 7(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−1(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−2(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−3(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−4(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−5(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−6(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−7(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−8(アゴニスト)、
微量アミン関連受容体−9(アゴニスト)、
アペリン受容体(アゴニスト)、
カンナビノイド受容体(アゴニスト)、
カンナビノイドCB1受容体(アゴニスト)、
カンナビノイドCB2受容体(アゴニスト)、
リゾスフィンゴ脂質受容体(アゴニスト)、
スフィンゴシン−1−リン酸受容体−1(アゴニスト)、
リゾホスファチジン酸−1受容体(アゴニスト)、
スフィンゴシン−1−リン酸受容体−3(アゴニスト)、
リゾホスファチジン酸−2受容体(アゴニスト)、
スフィンゴシン−1−リン酸受容体−2(アゴニスト)、
スフィンゴシン−1−リン酸受容体−4(アゴニスト)、
リゾホスファチジン酸−3受容体(アゴニスト)、
スフィンゴシン−1−リン酸受容体−5(アゴニスト)、
A群ホルモンタンパク質GPCR(アゴニスト)、
FSH(アゴニスト)、
黄体形成ホルモン受容体(アゴニスト)、
TSH(アゴニスト)、
ロイコトリエン(アゴニスト)、
ロイコトリエンBLT受容体(アゴニスト)、
システイニルロイコトリエン受容体(アゴニスト)、
メラトニン(アゴニスト)、
メラトニンMT1(アゴニスト)、
メラトニンMT2(アゴニスト)、
メラトニンMT3(アゴニスト)、
A群ヌクレオチド様GPCR(アゴニスト)、
アデノシン受容体(アゴニスト)、
P2Y受容体(アゴニスト)、
A群オーファンGPCR(アゴニスト)、
グレリン(アゴニスト)、
A群ペプチドGPCR(アゴニスト)、
アンジオテンシン受容体(アゴニスト)、
アンジオテンシンI受容体(アゴニスト)、
アンジオテンシンII受容体(アゴニスト)、
ボンベシン受容体(アゴニスト)、
ボンベシンBB1受容体(アゴニスト)、
ボンベシンBB2受容体(アゴニスト)、
ボンベシンbb3受容体(アゴニスト)、
ガストリン放出ペプチドリガンド、
ニューロメディンBリガンド、
ニューロメディンCリガンド、
ブラジキニン受容体(アゴニスト)、
ブラジキニンB1受容体(アゴニスト)、
ブラジキニンB2受容体(アゴニスト)、
C3a受容体(アゴニスト)、
C5a(アゴニスト)、
CCK受容体(アゴニスト)、
CCK 1受容体(アゴニスト)、
CCK 2受容体(アゴニスト)、
ガストリン(アゴニスト)、
ケモカイン(アゴニスト)、
CCケモカイン受容体(アゴニスト)、
CCR1ケモカイン(アゴニスト)、
CCR2ケモカイン(アゴニスト)、
CCR3ケモカイン(アゴニスト)、
CCR4ケモカイン(アゴニスト)、
CCR5ケモカイン(アゴニスト)、
CCR6ケモカイン(アゴニスト)、
CCR7ケモカイン(アゴニスト)、
CCR8ケモカイン(アゴニスト)、
CCR9ケモカイン(アゴニスト)、
CCR10ケモカイン(アゴニスト)、
CCR11ケモカイン(アゴニスト)、
CX3Cケモカイン受容体(アゴニスト)、
CX3CR1ケモカイン(アゴニスト)、
XCR1ケモカイン(アゴニスト)、
CXCケモカイン受容体(アゴニスト)、
CXCR1ケモカイン(アゴニスト)、
CXCR3ケモカイン(アゴニスト)、
CXCR4ケモカイン(アゴニスト)、
CXCR5ケモカイン(アゴニスト)、
アドレノメデュリン受容体(アゴニスト)、
エンドセリン(アゴニスト)、
エンドセリンET−A(アゴニスト)、
エンドセリンET−B(アゴニスト)、
ガラニン(アゴニスト)、
ガラニンGAL1(アゴニスト)、
ガラニンGAL2(アゴニスト)、
ガラニンGAL3(アゴニスト)、
IL−9(アゴニスト)、
KiSS−1受容体(アゴニスト)、
メラニン凝集ホルモン(アゴニスト)、
MCH受容体−1(アゴニスト)、
MCH受容体−2(アゴニスト)、
メラノコルチン(アゴニスト)、
メラノコルチンMC1(アゴニスト)、
ACTH受容体(アゴニスト)、
メラノコルチンMC3(アゴニスト)、
メラノコルチンMC4(アゴニスト)、
メラノコルチンMC5(アゴニスト)、
NK(アゴニスト)、
NK1(アゴニスト)、
NK2(アゴニスト)、
NK3(アゴニスト)、薬物:1
神経ペプチドY受容体(アゴニスト)、
神経ペプチドY1受容体(アゴニスト)、
神経ペプチドY2受容体(アゴニスト)、
神経ペプチドY4受容体(アゴニスト)、
神経ペプチドY5受容体(アゴニスト)、
神経ペプチドY6受容体(アゴニスト)、
ニューロテンシン受容体(アゴニスト)、
ニューロテンシンNTS1(アゴニスト)、
ニューロテンシンNTS2(アゴニスト)、
オレキシン及び神経ペプチドFF受容体(アゴニスト)、
オレキシン(アゴニスト)、
オピオイド(アゴニスト)、
δオピオイド(アゴニスト)、
κオピオイド(アゴニスト)、
μオピオイド(アゴニスト)、
ORL1受容体(アゴニスト)、
オピオイド(パーシャルアゴニスト)、
σオピオイド(アゴニスト)、
オレキシン及び神経ペプチドFF受容体(アゴニスト)、
神経ペプチドFF受容体(アゴニスト)、
神経ペプチドFF1受容体(アゴニスト)、
神経ペプチドFF2受容体(アゴニスト)、
オレキシン(アゴニスト)、
オレキシン−1(アゴニスト)、
オレキシン−2(アゴニスト)、
プロテアーゼ活性化受容体(アゴニスト)、
プロテアーゼ活性化受容体−1(アゴニスト)、
プロテアーゼ活性化受容体−2(アゴニスト)、
プロテアーゼ活性化受容体−3(アゴニスト)、
プロテアーゼ活性化受容体−4(アゴニスト)、
プロキネチシン受容体(アゴニスト)、
プロキネチシン受容体−1(アゴニスト)、
プロキネチシン受容体−2(アゴニスト)、
ソマトスタチン(アゴニスト)、
ソマトスタチン1(アゴニスト)、
ソマトスタチン2(アゴニスト)、
ソマトスタチン3(アゴニスト)、
ソマトスタチン4(アゴニスト)、
ソマトスタチン5(アゴニスト)、
ウロテンシンII(アゴニスト)、
バソプレシン様受容体(アゴニスト)、
オキシトシン(アゴニスト)、
バソプレシン(アゴニスト)、
バソプレシンV1(アゴニスト)、
バソプレシンV2(アゴニスト)、
プロスタノイド受容体(アゴニスト)、
DPプロスタノイド(アゴニスト)、
PGD2(アゴニスト)、
EP1プロスタノイド(アゴニスト)、
PGE2(アゴニスト)、
EP2プロスタノイド(アゴニスト)、
PGE2(アゴニスト)、
EP3プロスタノイド(アゴニスト)、
PGE2(アゴニスト)、
EP4プロスタノイド(アゴニスト)、
PGE2(アゴニスト)、
FPプロスタノイド(アゴニスト)、
PGF2α(アゴニスト)、
IPプロスタノイド(アゴニスト)、
プロスタサイクリン(アゴニスト)、
プロスタノイド受容体(パーシャルアゴニスト)、
TPプロスタノイド(アゴニスト)、
トロンボキサンA2(アゴニスト)、
コハク酸受容体1(アゴニスト)、
TRH(アゴニスト)、
TRH1(アゴニスト)、
TRH2(アゴニスト)、
1型鋤鼻受容体(アゴニスト)、
1型鋤鼻受容体−1(アゴニスト)、
1型鋤鼻受容体−2(アゴニスト)、
1型鋤鼻受容体−3(アゴニスト)、
1型鋤鼻受容体−4(アゴニスト)、
1型鋤鼻受容体−5(アゴニスト)、
アペリン受容体(モジュレータ)、
カンナビノイド受容体(モジュレータ)、
ケモカイン受容体様1(モジュレータ)、
リゾスフィンゴ脂質受容体(モジュレータ)、
A群ホルモンタンパク質GPCR(モジュレータ)、
ロイコトリエン受容体(モジュレータ)、
メラトニン受容体(モジュレータ)、
A群ヌクレオチド様GPCR(モジュレータ)、
A群オーファンGPCR(モジュレータ)、
PAF受容体(モジュレータ)、
A群ペプチドGPCR(モジュレータ)、
プロスタノイド受容体(モジュレータ)、
コハク酸受容体1(モジュレータ)、
TRH受容体(モジュレータ)、
1型鋤鼻受容体(モジュレータ)
Gタンパク質共役受容体−3(モジュレータ)、
Gタンパク質共役受容体−3(アゴニスト)、
Gタンパク質共役受容体−3(アンタゴニスト)、
Gタンパク質共役受容体−6(モジュレータ)、
Gタンパク質共役受容体−6(アゴニスト)、
Gタンパク質共役受容体−6(アンタゴニスト)、
Gタンパク質共役受容体−12(モジュレータ)、
Gタンパク質共役受容体−12(アゴニスト)、
Gタンパク質共役受容体−12(アンタゴニスト)、
Gタンパク質共役受容体−14(モジュレータ)、
Gタンパク質共役受容体−14(アゴニスト)、
Gタンパク質共役受容体−14(アンタゴニスト)、
B群GPCR(アゴニスト)、
CRF−1受容体(アゴニスト)、
CRF−2受容体(アゴニスト)、
カルシトニン受容体(モジュレータ)、
カルシトニン(アゴニスト)、
カルシトニン(アンタゴニスト)、
ACTH放出因子受容体(モジュレータ)、
CRF−1受容体(モジュレータ)、
CRF−1受容体(アゴニスト)、
CRF−1受容体(アンタゴニスト)、
CRF−2受容体(モジュレータ)、
CRF−2受容体(アゴニスト)、
CRF−2受容体(アンタゴニスト)、
ACTH放出因子(アゴニスト)、
CRF−1受容体(アゴニスト)、
CRF−2受容体(アゴニスト)、
ACTH放出因子(アンタゴニスト)、
CRF−1受容体(アンタゴニスト)、
CRF−2受容体(アンタゴニスト)、
グルカゴン様ペプチド受容体(モジュレータ)、
グルカゴン様ペプチド1受容体(モジュレータ)、
グルカゴン様ペプチド2受容体(モジュレータ)、
グルカゴン様ペプチド(アゴニスト)、
グルカゴン様ペプチド(アンタゴニスト)、
グルカゴン受容体(モジュレータ)、
グルカゴン(アゴニスト)、
グルカゴン(アンタゴニスト)、
GHRH受容体(モジュレータ)、
GHRH(アゴニスト)、
成長ホルモン放出因子(アンタゴニスト)、
I型PACAP受容体(モジュレータ)、
I型PACAP受容体(アゴニスト)、
I型PACAP受容体(アンタゴニスト)
PTH受容体(モジュレータ)、
PTH−1受容体(モジュレータ)
PTH−2受容体(モジュレータ)
PTH(アゴニスト)、
PTH(アンタゴニスト)、
セクレチン受容体(モジュレータ)、
セクレチン(アゴニスト)、
セクレチン(アンタゴニスト)、
VIP受容体(モジュレータ)、
VIP−1受容体(モジュレータ)、
VIP−2受容体(モジュレータ)、
VIP(アゴニスト)、
VIP(アンタゴニスト)、
C群GPCR(モジュレータ)、
C群GPCR(アゴニスト)、
GABA B受容体(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体1(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体2(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体3(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体4(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体5(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体6(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体7(アゴニスト)、
代謝型グルタミン酸受容体8(アゴニスト)
1.GPCRに指向性を有する、及び/又はGPCRと特異的に結合すると共に、上記GPCRに対してアンタゴニスト性を有する、好ましくはアンタゴニスト性だけを有する、即ちアゴニスト性を有しない、アミノ酸配列、例えば単一可変ドメイン。
2.GPCRに指向性を有する、及び/又はGPCRと特異的に結合すると共に、上記GPCRに対してアンタゴニスト性又はインバースアゴニスト性、好ましくはインバースアゴニスト性を有する、アミノ酸配列、例えば単一可変ドメイン。
3.GPCRに指向性を有する、及び/又はGPCRと特異的に結合すると共に、上記GPCRに対してインバースアゴニスト性を有する、好ましくは例えばIP蓄積によって測定される活性を、基礎活性の90%以上、好ましくは基礎活性の80%以上、より好ましくは基礎活性の70%以上、さらにより好ましくは基礎活性の60%以上、最も好ましくは基礎活性の50%以上に低減することができる、アミノ酸配列、例えば単一可変ドメイン。
4.GPCRに指向性を有する、及び/又はa)GPCRと特異的に結合すると共に、b)上記GPCRのリガンド依存性の活性化を完全に阻害するアミノ酸配列、例えば単一可変ドメインであって、該リガンドが100nM以下、より好ましくは30nM以下の濃度で存在する、アミノ酸配列、例えば単一可変ドメイン。
5.GPCRに指向性を有する、及び/又はa)GPCRと特異的に結合すると共に、b)上記GPCRのリガンド依存性の活性化を完全に阻害すると共に、c)上記GPCRの活性化を与えないアミノ酸配列、例えば単一可変ドメインであって、該リガンドが100nM以下、より好ましくは30nM以下の濃度で存在する、アミノ酸配列、例えば単一可変ドメイン。
6.b)i.ラクダ科動物に、生きた状態で、かつ天然立体構造における表面上で上記GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7の所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を過剰発現する全細胞を免疫付与する工程と、
ii.上記GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7を過剰発現する異なる(免疫付与に使用したもの以外の)細胞型の細胞膜調製物を使用して、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)との結合に関して選択する工程と、
iii.任意で洗浄剤を用いずにPBS等のバッファーで穏やかに洗浄する工程とを少なくとも含む方法によって得ることができる、上記の態様のいずれかに記載のアミノ酸配列、例えば単一可変ドメイン。
7.ラクダ科動物がラマである、態様6に記載のアミノ酸配列。
8.選択を2回行い、2つの異なる細胞型の細胞膜調製物を使用する、態様6又は7に記載のアミノ酸配列。
9.本質的に単離形態である、態様1〜8のいずれかに記載のアミノ酸配列。
10.被験体に投与するためのものであり、上記被験体において自然発生しない、態様1〜9のいずれかに記載のアミノ酸配列。
11.10−5モル/L〜10−12モル/L以下、好ましくは10−7モル/L〜10−12モル/L以下、より好ましくは10−8モル/L〜10−12モル/Lの解離定数(KD)でGPCRと特異的に結合することができる、態様1〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列。
12.102M−1s−1〜約107M−1s−1、好ましくは103M−1s−1〜107M−1s−1、より好ましくは104M−1s−1〜107M−1s−1(105M−1s−1〜107M−1s−1等)の結合速度(kon速度)でGPCRと特異的に結合することができる、態様1〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列。
13.1s−1〜10−6s−1、好ましくは10−2s−1〜10−6s−1、より好ましくは10−3s−1〜10−6s−1(10−4s−1〜10−6s−1等)の解離速度(koff速度)でGPCRと特異的に結合することができる、態様1〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列。
14.500nM未満、好ましくは200nM未満、より好ましくは10nM未満(500pM未満等)の親和性でGPCRと特異的に結合することができる、態様1〜10のいずれかに記載のアミノ酸配列。
15.天然アミノ酸配列(任意の好適な種由来)又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列である、態様1〜14のいずれかに記載のアミノ酸配列。
16.免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能である、態様1〜15のいずれかに記載のアミノ酸配列。
17.4つのフレームワーク領域(それぞれ、FR1〜FR4)と、3つの相補性決定領域(それぞれ、CDR1〜CDR3)とから本質的に成る、態様1〜16のいずれかに記載のアミノ酸配列。
18.免疫グロブリン配列である、態様1〜17のいずれかに記載のアミノ酸配列。
19.天然免疫グロブリン配列(任意の好適な種由来)又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、態様1〜18のいずれかに記載のアミノ酸配列。
20.ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟等の技法によって得られた免疫グロブリン配列である、態様1〜19のいずれかに記載のアミノ酸配列。
21.軽鎖可変ドメイン配列(例えばVL配列)又は重鎖可変ドメイン配列(例えばVH配列)から本質的に成る、態様1〜20のいずれかに記載のアミノ酸配列。
22.従来の四本鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的に成るか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的に成る、態様1〜21のいずれかに記載のアミノ酸配列。
23.ドメイン抗体(又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列)、単一ドメイン抗体(又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列)、「dAb」(又はdAbとしての使用に好適なアミノ酸配列)、又はナノボディ(商標)(VHH配列を含むが、これに限定されない)から本質的に成る、態様1〜22のいずれかに記載のアミノ酸配列。
24.ナノボディ(商標)から本質的に成る、態様1〜23のいずれかに記載のアミノ酸配列。
25.配列番号1〜配列番号22のアミノ酸配列の少なくとも1つとの80%のアミノ酸同一性を有するナノボディ(商標)から本質的に成り、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにCDR配列を形成するアミノ酸残基は無視し、好ましくは、カバットナンバリングによる11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位のアミノ酸残基の1つ又は複数は、表A−3で言及する特徴的な残基から選択される、態様1〜24のいずれかに記載のアミノ酸配列。
26.配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239のアミノ酸配列の少なくとも1つとの80%のアミノ酸同一性を有するナノボディ(商標)から本質的に成り、ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにCDR配列を形成するアミノ酸残基は無視し、好ましくは、カバットナンバリングによる11位、37位、44位、45位、47位、83位、84位、103位、104位及び108位のアミノ酸残基の1つ又は複数は、表A−3で言及する特徴的な残基から選択される、態様1〜24のいずれかに記載のアミノ酸配列。
27.ヒト化ナノボディ(商標)から本質的に成る、態様1〜26のいずれかに記載のアミノ酸配列。
28.GPCRとの結合のための少なくとも1つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のためのさらなる結合部位を1つ又は複数含有する、態様1〜27のいずれかに記載のアミノ酸配列。
29.CXCR4の成員の少なくとも1つと特異的に結合する単一可変ドメイン。
30.CXCR4の成員がヒトCXCR4である、態様29に記載の単一可変ドメイン。
31.CXCR4から成る群の成員の少なくとも1つ、例えばヒトCXCR4と、配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインの少なくとも1つとの間の相互作用をさらに遮断する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
32.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択される配列の少なくとも1つとの、80%の配列同一性を有する単一可変ドメインから成る群から選択される、態様29に記載の単一可変ドメイン。
33.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大10個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択される、態様29に記載の単一可変ドメイン。
34.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大8個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択される、態様29に記載の単一可変ドメイン。
35.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大5個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択される、態様29に記載の単一可変ドメイン。
36.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大3個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択される、態様29に記載の単一可変ドメイン。
37.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239を有する配列から成る群から選択される配列の少なくとも1つとの、80%の配列同一性を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−7モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でGPCR受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
38.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大10個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−7モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でGPCR受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
39.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大8個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−7モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でNotch受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
40.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大5個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−7モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でNotch受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
41.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大3個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−7モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でNotch受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
42.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239を有する配列から成る群から選択される配列の少なくとも1つとの、80%の配列同一性を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−8モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でNotchシグナル伝達経路の成員と結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
43.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大10個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−8モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でNotch受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
44.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大8個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−8モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でGPCR受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
45.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大5個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−8モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でGPCR受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
46.a)配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメイン;及びb)最大3個のアミノ酸残基が天然アミノ酸に置き換わり、上記置き換わったアミノ酸がフレームワーク領域内に位置している配列番号238〜配列番号253、より好ましくは配列番号238、配列番号239の配列を有する単一可変ドメインから成る群から選択され;a)群及びb)群から選択された上記単一可変ドメインが、10−8モル/L〜10−12モル/L以下の解離定数(KD)でGPCR受容体の成員の少なくとも1つと結合する、態様29に記載の単一可変ドメイン。
47.CXCR7の成員の少なくとも1つと特異的に結合する単一可変ドメイン。
48.CXCR7の成員がヒトCXCR7である、態様29に記載の単一可変ドメイン。
49.a)態様1〜29のいずれかに記載のアミノ酸配列を1つ又は複数含むか若しくはこれから本質的に成るか、又はb)態様30〜48のいずれかに記載の単一可変ドメインを1つ又は複数含むか若しくは本質的にこれから成り、任意で1つ又は複数のリンカーを介して連結した、1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに任意で含む、化合物又は構築物。
50.上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である、態様49に記載の化合物又は構築物。
51.上記1つ又は複数のリンカーが存在する場合、該リンガーが1つ又は複数のアミノ酸配列である、態様50に記載の化合物又は構築物。
52.上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が免疫グロブリン配列である、態様49〜51のいずれかに記載の化合物又は構築物。
53.上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が単一ドメイン抗体から成る群から選択される、態様49〜52のいずれかに記載の化合物又は構築物。
54.上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がナノボディである、態様49〜53のいずれかに記載の化合物又は構築物。
55.例えば配列番号261〜配列番号266、好ましくは配列番号263、264のような多価構築物、及びa)配列番号261〜配列番号266との80%の同一性を有し、b)上記GPCRのリガンド依存性の活性化を完全に阻害する、例えば化合物又は構築物のような機能的同等物であり、該リガンドは、100nM以下、より好ましくは30nM以下の濃度で存在するか、又は該GPCRが基礎活性を有する場合、完全なアンタゴニストであるか若しくは好ましくは活性を、基礎活性の90%以上、より好ましくは基礎活性の80%以上、さらにより好ましくは基礎活性の70%以上、さらにより好ましくは基礎活性の60%以上に低減する、態様49〜54のいずれかに記載の化合物又は構築物。
56.多重特異性構築物である、態様49〜55のいずれかに記載の化合物又は構築物。
57.態様1〜48のいずれかに記載の対応するアミノ酸配列又は単一可変ドメイン自体と比較して半減期が増大している、態様49〜56のいずれかに記載の化合物又は構築物。
58.上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、態様1〜48のいずれかに記載の対応するアミノ酸配列又は単一可変ドメイン自体と比較して半減期が増大している化合物又は構築物を提供する、態様57に記載の化合物又は構築物。
59.半減期が増大している化合物又は構築物を提供する、上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質と結合することができる結合単位、Fc部分、及び血清タンパク質と結合することができる小タンパク質又は小ペプチドから成る群から選択される、態様58に記載の化合物又は構築物。
60.半減期が増大している化合物又は構築物を提供する、上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ヒト血清アルブミン又はその断片から成る群から選択される、態様58又は59に記載の化合物又は構築物。
61.半減期が増大している化合物又は構築物を提供する、上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン(例えばヒト血清アルブミン)又は血清免疫グロブリン(例えばIgG)と結合することができる結合単位から成る群から選択される、態様60に記載の化合物又は構築物。
62.半減期が増大している化合物又は構築物を提供する、上記1つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「dAb」、dAbとしての使用に好適なアミノ酸配列、又は血清アルブミン(例えばヒト血清アルブミン)若しくは血清免疫グロブリン(例えばIgG)と結合することができるナノボディからなる群から選択される、態様61に記載の化合物又は構築物。
63.態様1〜48のいずれかに記載の対応するアミノ酸配列又は単一可変ドメイン自体より少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、例えば少なくとも5倍、例えば少なくとも10倍又は20倍超大きい血清半減期を有する、態様57〜62のいずれかに記載の化合物又は構築物。
64.血清半減期が、態様1〜48のいずれかに記載の対応するアミノ酸配列又は単一可変ドメイン自体と比較して1時間超、好ましくは2時間超、より好ましくは6時間超、例えば12時間超、又はさらに24時間超、48時間超又は72時間超増大している、態様57〜62のいずれかに記載の化合物又は構築物。
65.ヒトにおける血清半減期が少なくとも約12時間、好ましくは少なくとも24時間、より好ましくは少なくとも48時間、さらにより好ましくは少なくとも72時間以上、例えば少なくとも5日(約5日〜10日等)、好ましくは少なくとも9日(約9日〜14日等)、より好ましくは少なくとも約10日(約10日〜15日等)、若しくは少なくとも約11日(約11日〜16日等)、より好ましくは少なくとも約12日(約12日〜18日以上等)、又は14日超(約14日〜19日等)である、態様57〜64のいずれかに記載の化合物又は構築物。
66.態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列又は単一可変ドメインを1つ含むか又はこれから本質的に成る一価構築物。
67.上記本発明のアミノ酸配列が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「dAb」、dAbとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディから成る群から選択される、態様66に記載の一価構築物。
68.態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物をコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
69.遺伝子構築物の形態である、態様68に記載の核酸又はヌクレオチド配列。
70.態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物を発現する、又は好適な状況下で発現することが可能である、及び/又は態様68、69のいずれかに記載の核酸若しくはヌクレオチド配列を含む、宿主又は宿主細胞。
71.態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物を作製する方法であって、
a)好適な宿主細胞若しくは宿主生物又は別の好適な発現系において、態様68に記載の核酸若しくはヌクレオチド配列又は態様69に記載の遺伝子構築物を発現する工程と、場合によってはその後、
b)態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物を単離及び/又は精製する工程とを少なくとも含む、方法。
72.態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物を作製する方法であって、
a)態様70に記載の宿主又は宿主細胞が少なくとも1つの態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物を発現及び/又は産生するような条件下で、上記宿主又は宿主細胞を培養及び/又は維持する工程と、場合によってはその後、
b)態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物を単離及び/又は精製する工程とを少なくとも含む、方法。
73.態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物を少なくとも1つ含む組成物。
74.薬学的組成物である、態様73に記載の組成物。
75.少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び/又はアジュバントをさらに含み、任意で1つ又は複数のさらなる薬学的に活性のあるポリペプチド及び/又は化合物を含む、態様74に記載の組成物。
76.少なくとも1つのGPCR関連の疾患又は障害を予防及び/又は治療する方法であって、少なくとも1つの態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様66、67のいずれかに記載の一価構築物、又は態様74若しくは75に記載の組成物を、それを必要とする被験体に薬学的に活性のある量投与することを含む、方法。
77.GPCR、その生物学的又は薬理学的な活性、及び/又はGPCRが関与する生物学的経路又はシグナル伝達に関連する少なくとも1つの疾患又は障害を予防及び/又は治療する方法であって、少なくとも1つの態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様66、67のいずれかに記載の一価構築物、又は態様74若しくは75に記載の組成物を、それを必要とする被験体に薬学的に活性のある量投与することを含む、方法。
78.態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物を、それを必要とする被験体に投与することにより予防及び/又は治療することができる少なくとも1つの疾患又は障害を予防及び/又は治療する方法であって、少なくとも1つの態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様66、67のいずれかに記載の一価構築物、又は態様76若しくは77に記載の組成物を、それを必要とする被験体に薬学的に活性のある量投与することを含む、方法。
79.免疫療法であって、少なくとも1つの態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様66、67のいずれかに記載の一価構築物、又は態様72若しくは73に記載の組成物を、それを必要とする被験体に薬学的に活性のある量投与することを含む、免疫療法。
80.少なくとも1つのGPCR関連の疾患又は障害の予防及び/又は治療用の薬学的組成物の調製における態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物の使用。
81.態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメイン、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物の少なくとも1つの構成要素、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物の少なくとも1つの構成要素を生成する方法であって、
a)ラクダ科動物、好ましくはラマに、生きた状態で、かつ天然立体構造における表面上で上記GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7の所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)を過剰発現する全細胞を免疫付与する工程と、
b)GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7を過剰発現する異なる(免疫付与に使用したもの以外の)細胞型の細胞膜調製物を使用して、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ(複数可)との結合に関して選択する工程と、
c)任意で洗浄剤を用いずにPBS等のバッファーで穏やかに洗浄する工程とを少なくとも含む、方法。
82.GPCR、例えばヒトCXCR4及び/又はヒトCXCR7に指向性を有するアミノ酸配列、例えば単一可変ドメインを同定するためにスクリーニングする方法であって、態様1〜48のいずれかに記載のアミノ酸配列若しくは単一可変ドメインのいずれか、態様49〜65のいずれかに記載の化合物若しくは構築物のいずれか、又は態様66、67のいずれかに記載の一価構築物のいずれかを上記GPCRに接触させる工程を含む、方法。
83.i)結合の際、インバースアゴニスト作用又はインバースアンタゴニスト作用を引き起こすことが可能であるエピトープに指向性を有するか又はこれに対して親和性を有する、第1のリガンドと、ii)結合の際、アンタゴニスト作用を引き起こすことが可能であるエピトープに指向性を有するか又はこれに対して親和性を有する、第2のリガンドとを含む構築物。
84.リガンドの少なくとも1つが免疫グロブリン配列である、態様83に記載の構築物。
85.リガンドの少なくとも1つがdAb又はナノボディ、好ましくはナノボディである、態様83又は84に記載の構築物。
86.両方のリガンドが免疫グロブリン配列である、態様83〜85のいずれかに記載の構築物。
87.両方のリガンドがdAb又はナノボディ、好ましくはナノボディである、態様83〜86のいずれかに記載の構築物。
88.ポリペプチドである、態様83〜87のいずれかに記載の構築物。
Claims (10)
- ヒトCXCR4(配列番号254)と特異的に結合する2つ以上のナノボディを含むポリペプチドであって、
a)ヒトCXCR4と特異的に結合する少なくとも1つの第1ナノボディが、CXCR4の第1の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造に対して向けられ、
ヒトCXCR4と特異的に結合する第1ナノボディは、4個のフレームワーク領域(それぞれFR1ないしFR4)と、3個の相補性決定領域(それぞれCDR1ないしCDR3)からなり、
CDR1は配列番号142のアミノ酸配列であり、
CDR2は配列番号174のアミノ酸配列であり、
CDR3は配列番号206のアミノ酸配列であり、
b)ヒトCXCR4と特異的に結合する少なくとも1つの第2ナノボディが、ヒトCXCR4の第2の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造に対して向けられ、
ここで、ヒトCXCR4の第2の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造はヒトCXCR4の第1の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造とは異なり、並びに
ヒトCXCR4と特異的に結合する第2ナノボディは、4個のフレームワーク領域(それぞれFR1ないしFR4)と、3個の相補性決定領域(それぞれCDR1ないしCDR3)からなり、
CDR1は配列番号143のアミノ酸配列であり、
CDR2は配列番号175のアミノ酸配列であり、
CDR3は配列番号207のアミノ酸配列であり、
並びに、該ポリペプチドがペプチドリンカーをさらに1つ又は複数含む、ポリペプチド。 - 前記ヒトCXCR4と特異的に結合する2つ以上のナノボディは配列番号263又は264のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 血清タンパク質と特異的に結合する1つ又は複数のナノボディをさらに含む、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする、核酸又はヌクレオチド。
- 好適な状況下で請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを発現することが可能である宿主細胞。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを含む薬学的組成物。
- 少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び/又はアジュバントをさらに含む、請求項6に記載の薬学的組成物。
- 1つ又は複数のさらなる薬学的に活性のあるポリペプチド及び/又は化合物を含む、請求項7に記載の薬学的組成物。
- a)アミノ酸配列をコードする核酸のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
b)ヒトCXCR4と結合することができ、及び/又はヒトCXCR4に対する親和性を有する、アミノ酸配列をコードする核酸に関して、請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを交差遮断することにより、前記核酸のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
c)前記核酸を単離し、その後前記核酸がコードするアミノ酸配列を発現する工程とを少なくとも含む、ヒトCXCR4(配列番号254)に指向性を有するポリペプチドをスクリーニングする方法。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のポリペプチドを有効成分として含む、癌又はAIDSを治療するための薬剤。
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