ES2864529T3 - Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno anti-TMPRSS2 - Google Patents

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Abstract

Una proteína de unión a antígeno humana que se une específicamente a TMPRSS2 humana y que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y en donde la proteína de unión a antígeno comprende: una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende (a) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6), (b) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8) y (c) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10); y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende (a) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12), (b) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14) y (c) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16).

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno anti-TMPRSS2
La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° 62/622.292, presentada el 26 de enero de 2018.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a TMPRSS2 y a los métodos para tratar o prevenir las infecciones víricas con dichos anticuerpos y fragmentos.
Antecedentes de la invención
Los virus de la gripe han adquirido resistencia a los fármacos utilizados actualmente que se dirigen a la neuraminidasa (NA) vírica o a la proteína del canal de iones, proteína de la matriz 2 (M2). La aparición de resistencia a fármacos destaca la necesidad para el desarrollo de estrategias antivíricas nuevas. La actuación sobre células hospedadoras puede reducir o prevenir la aparición de mutantes de escape, pero podría crear un "sumidero" debido a la expresión generalizada y elevar la preocupación por la toxicidad. Se ha demostrado que un número de proteínas de fusión víricas requieren escisión por proteasa(s) hospedadora(s) para la activación (Shirato et al. Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017); Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017); Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015); Zmora et al. TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015)), incluyendo la gripe (Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017); Bóttcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85 , 1554-1562 (2011); Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010); Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), Mayo;88(9):4744-51).
El precursor de la hemaglutinina A de la gripe (HA0) requiere la escisión por una serina proteasa del hospedador, a HA1 y HA2, para la activación. Por ejemplo, la proteasa transmembrana, serina 2; TMPRSS2, TMPRSS4 y TMPRSS11D, así como la proteasa similar a tripsina de las vías respiratorias humanas (HAT) se han implicado en la escisión de HA (Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010); Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 2006 Oct;80(19):9896-8; solicitud de patente internacional N.° WO2017/151453). También, la TMPRSS2 es una diana para la terapia contra el cáncer. Véanse, por ejemplo, los documentos WO2008127347 y WO2002004953. Una fusión entre TMPRSS2 y ERG (TMPRSS2:ERg) es una fusión génica conocida por ser un impulsor principal de la carcinogénesis prostática que se desencadena mediante el ERa y se reprime mediante el ERp. Bonkhoff, Estrogen receptor signaling in prostate cancer: Implications for carcinogenesis and tumor progression, Prostate 78(1): 2-10 (2018).
El documento WO 02/04953 describe TMPRSS2 como una diana terapéutica potencial para ciertos cánceres y describe la generación de anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2.
El documento US 2013/0273070 se refiere a métodos para tratar o prevenir la infección por el virus de la gripe administrando un inhibidor de la serina proteasa, tal como un inhibidor de TMPRSS2. De Nardis et al. (2017) The Journal of Biological Chemistry vol. 292(3): 912-924 se refiere a la proteína 1 relacionada con el receptor de LDL (LRP1) y describe la expresión recombinante del ectodominio de longitud completa de LRP1. Wilson et al. (2005) Biochem J. 388:967-972 se refiere a la activación de PAR-2 en células cancerosas de próstata mediante TMPRSS2 y describe la generación de un anticuerpo policlonal anti-TMPRSS2 humana de humano. Shen et al. (2017) Biochimie 142:1-10 revisa el papel de TMPRSS2 como diana potencial para el tratamiento del virus de la gripe.
El documento WO 2008/076379 se refiere a anticuerpos humanos para el ligando 4 tipo delta humano y secuencias de los mismos.
Sumario de la invención
Aunque hay inhibidores de molécula pequeña de TMPRSS2 y anticuerpos de investigación, útiles, por ejemplo, para inmunohistoquímica, existe una necesidad en la técnica de anticuerpos terapéuticos anti-TMPRSS2 neutralizantes y su uso para tratar o prevenir la infección vírica. Véanse, por ejemplo, Shen et al. Biochimie 142: 1-10 (2017), documento WO2008127347; documento WO2002004953; documento US9498529; anticuerpo ab92323, disponible en Abcam (Cambridge, Massachusetts) o anticuerpos sc-515727 y sc-101847 disponibles en Santa Cruz Biotech (Dallas, Texas). La presente divulgación aborda esta necesidad, en parte, proporcionando anticuerpos anti-TMPRSS2 humana humanos, tales como H1H7017N y combinaciones de los mismos que incluyen, por ejemplo, anticuerpos de HA antigripe (por ejemplo, HA grupo I y HA grupo II) y métodos de uso de los mismos para tratar infecciones víricas.
Específicamente, la presente invención proporciona una proteína de unión a antígeno humana que se une específicamente a TMPRSS2 humana y que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y en donde la proteína de unión a antígeno comprende:
una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende
(a) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8) y
(c) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (Se Q ID NO: 10); y
una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende
(a) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14) y
(c) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (Se Q ID NO: 16).
La presente invención también proporciona un complejo que comprende una proteína de unión a antígeno de la invención unida a un polipéptido TMPRSS2.
También se proporciona en la presente invención un método para fabricar una proteína de unión a antígeno de la invención que comprende:
(a) introducir en una célula hospedadora: (i) un polinucleótido que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina de dicha proteína de unión a antígeno; o (ii) un polinucleótido que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina de dicha proteína de unión a antígeno y un polinucleótido que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina de dicha proteína de unión a antígeno;
(b) cultivar la célula hospedadora en condiciones favorables para la expresión del (de los) polinucleótido(s); y
(c) opcionalmente, aislar la proteína de unión a antígeno de la célula hospedadora y/o medio en el que crece la célula hospedadora.
La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica:
una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende:
(a) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8) y
(c) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (Se Q ID NO: 10);
y
una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende:
(a) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14) y
(c) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (Se Q ID NO: 16).
También se proporciona mediante la presente invención: un vector que comprende un polinucleótido de la invención; una célula hospedadora que comprende una proteína de unión a antígeno de la invención, un polinucleótido de la invención o el vector de la invención; una composición o un kit que comprende una proteína de unión a antígeno de la invención y un agente terapéutico adicional, en donde el kit comprende la proteína de unión a antígeno y el agente terapéutico adicional formulado como una composición única o por separado en dos o más composiciones; una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente, un agente terapéutico adicional; y un recipiente o dispositivo de inyección que comprende una proteína de unión a antígeno de la invención o una composición de la invención (por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención).
La invención también proporciona una proteína de unión a antígeno de la invención para utilizar en un método para tratar o prevenir la infección con un virus de la gripe en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha proteína de unión a antígeno.
También se desvela una proteína de unión a antígeno humana que se une específicamente a TMPRSS2 humana, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En un aspecto de la divulgación, la proteína de unión a antígeno comprende: (a) una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos un 90 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o 18; y/o (b) una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos un 90 % con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, 17 o 19. En donde la proteína de unión a antígeno es una proteína de unión a antígeno de la invención, la proteína de unión a antígeno es como se establece en las reivindicaciones y por consiguiente, comprende una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende (a) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6); (b) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8); (c) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID n O: 10); y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende (a) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12); (b) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14); y/o (c) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16). En una realización de la proteína de unión a antígeno de la invención, la proteína de unión a antígeno comprende: (a) una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 o 19; y/o (b) una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
También se desvela cualquier proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 que compite con cualquier proteína de unión a antígeno que se expone en el presente documento para la unión a TMPRSS2 (por ejemplo, como se determina utilizando un ensayo de interferometría de biocapa sin etiquetas en tiempo real, por ejemplo, en un biosensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.)); o que se une al mismo o a un epítopo solapante en TMPRSS2 (o un fragmento del mismo) como cualquier proteína de unión a antígeno que se expone en el presente documento.
La presente descripción también proporciona proteínas de unión a antígeno multiespecíficas que se unen a TMPRSS2 y otro antígeno o a TMPRSS2 en un epítopo diferente. Por ejemplo, la molécula multiespecífica comprende (a) un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a TMPRSS2; y (b) un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a otro antígeno o a TMPRSS2 o a un epítopo que difiere del del primer dominio de unión a antígeno. En una realización de la invención, la proteína de unión a antígeno de la invención es multiespecífica.
La presente descripción también proporciona cualquier proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, por ejemplo, que comprende una secuencia expuesta en el presente documento) que comprende una o más de las siguientes propiedades:
• Inhibe el crecimiento del virus de la gripe (por ejemplo, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)) en células que expresan TMPRSS2 (por ejemplo, células Calu-3);
• Se une a la superficie de células que expresan TMPRSS (por ejemplo, MDCK/Tet-on), por ejemplo, con un valor de CE50 de 440 pM o 1,06 nM;
• No se une significativamente a células MDCK/Tet-on que no expresan TMPRSS2;
• Se une a TMPRSS2 humana con una Kd de aproximadamente 2,81 x 10-9 M a aproximadamente 25 °C;
• Se une a TMPRSS2 humana con una Kd de aproximadamente 9,31 x 10-9 M a aproximadamente 37 °C;
• Se une a TMPRSS2 de cynomolgus con una Kd de aproximadamente 5,60 x 10-8 M a aproximadamente 25 °C;
• Se une a TMPRSS2 de cynomolgus con una Kd de aproximadamente 1,40 x 10-7 M a aproximadamente 37 °C;
• Limita la propagación del virus de la gripe de células in vitro; y/o
• Protege a un ratón modificado por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana de la muerte causada por la infección por virus de la gripe.
La presente divulgación también proporciona un complejo que comprende cualquier proteína de unión a antígeno expuesta en el presente documento unida a un polipéptido TMPRSS2, por ejemplo, in vitro o en el cuerpo de un sujeto.
La presente divulgación proporciona también un método para fabricar una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 expuesta en el presente documento (por ejemplo, H1H7017N) o cadena de inmunoglobulina de la misma que comprende: (a) introducir uno o más polinucleótidos que codifica(n) una cadena de inmunoglobulina ligera y/o pesada de dicha proteína de unión a antígeno; (b) cultivar la célula hospedadora (por ejemplo, célula CHO, célula de Pichia o célula de Pichia pastoris) en condiciones favorables a la expresión del polinucleótido; y (c) opcionalmente, aislar la proteína de unión a antígeno o cadena de inmunoglobulina de la célula hospedadora y/o medio en el que crece la célula hospedadora. Una proteína de unión a antígeno o cadena de inmunoglobulina que sea un producto de tal método es parte de la presente divulgación.
La presente divulgación también proporciona un polinucleótido (por ejemplo, ADN o ARN) que codifica un polipéptido de la presente divulgación. En un aspecto de la divulgación, el polinucleótido codifica dos cadenas de inmunoglobulina diferentes (por ejemplo, pesada y ligera). En un aspecto de la divulgación, un polinucleótido codifica una cadena ligera de inmunoglobulina y otro polinucleótido codifica una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, en donde las cadenas están en una célula hospedadora o están en un recipiente. Por ejemplo, el polinucleótido está en un vector (por ejemplo, un plásmido) y/o está integrado en un cromosoma de una célula hospedadora. El polinucleótido de la invención es como se establece en las reivindicaciones.
Las células hospedadoras (por ejemplo, célula CHO, célula de Pichia o célula de Pichia pastoris) de la presente divulgación pueden incluir una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, H1H7017N), polipéptido de la misma o polinucleótido que codifica tal polipéptido y/o un vector que incluye tal polinucleótido.
La presente divulgación también proporciona una composición o un kit que comprende una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 expuesta en el presente documento (por ejemplo, H1H7017N) en asociación con un agente terapéutico adicional (por ejemplo, un fármaco antivírico y/o una vacuna). Más específicamente, en la presente invención se proporciona una composición o un kit que comprende la proteína de unión a antígeno de la invención y un agente terapéutico adicional, en donde el kit comprende la proteína de unión a antígeno y el agente terapéutico adicional formulado como una composición única o por separado en dos o más composiciones. Por ejemplo, la composición puede ser una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno y vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente, un agente terapéutico adicional; donde la composición farmacéutica es una composición farmacéutica de la invención, la proteína de unión a antígeno es una proteína de unión a antígeno como se establece en las reivindicaciones. El agente terapéutico adicional puede ser ledipasvir, sofosbuvir, una combinación de ledipasvir y sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirina e interferón-alfa2b, interferón-alfa2a y/o un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HA de la gripe. El agente terapéutico adicional puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado del grupo que consiste en H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2 H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1 H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2 H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2 ; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B H1H17955B ; H1 H17956B ; H1 H17957B ; H1 H17958B H1H17959B ; H1 H17960B ; H1 H17961B H1H17962B H1H17963B ; H1 H17964B ; H1 H17965B ; H1 H17966B H1H17967B ; H1 H17968B ; H1 H17969B H1H17970B H1H17971B ; H1 H17972B ; H1 H17973B ; H1 H17974B H1H17975B ; H1 H17976B ; H1 H17977B H1H17978B H1H17979B ; H1 H17980B ; H1 H17981B ; H1 H17982B H1H17983B ; H1 H17984B ; H1 H17985B H1H17986B H1H17987B ; H1 H17988B ; H1 H17989B ; H1 H17990B H1H17991B ; H1 H17992B ; H1 H17993B H1H17994B H1H17995B ; H1 H17996B ; H1 H17997B ; H1 H17998B H1H17999B ; H1 H18000B ; H1 H18001B H1H18002B H1H18003B ; H1 H18004B ; H1 H18005B ; H1 H18006B H1H18007B ; H1 H18008B ; H1 H18009B H1H18010B H1H18011B ; H1 H18012B ; H1 H18013B ; H1 H18014B H1H18015B ; H1 H18016B ; H1 H18017B H1H18018B H1H18019B ; H1 H18020B ; H1 H18021B ; H1 H18022B H1H18023B ; H1 H18024B ; H1 H18025B H1H18026B H1H18027B ; H1 H18028B ; H1 H18029B ; H1 H18030B H1H18031B ; H1 H18032B ; H1 H18033B H1H18034B H1H18035B ; H1 H18037B ; H1 H18038B ; H1 H18039B H1H18040B ; H1 H18041B ; H1 H18042B H1H18043B H1H18044B ; H1 H18045B ; H1 H18046B ; H1 H18047B H1H18048B ; H1 H18049B ; H1 H18051B H1H18052B H1H18053B ; H1 H18054B ; H1 H18055B ; H1 H18056B H1H18057B ; H1 H18058B ; H1 H18059B H1H18060B H1H18061B ; H1 H18062B ; H1 H18063B ; H1 H18064B H1H18065B ; H1 H18066B ; H1 H18067B H1H18068B H1H18069B ; H1 H18070B ; H1 H18071B ; H1 H18072B H1H18073B ; H1 H18074B ; H1 H18075B H1H18076B H1H18077B ; H1 H18078B ; H1 H18079B ; H1 H18080B H1H18081B ; H1 H18082B ; H1 H18083B H1H18084B H1H18085B ; H1 H18086B ; H1 H18087B ; H1 H18088B H1H18089B ; H1 H18090B ; H1 H18091B H1H18092B H1H18093B ; H1 H18094B ; H1 H18095B ; H1 H18096B H1H18097B ; H1 H18098B ; H1 H18099B H1H18100B H1H18101B ; H1 H18102B ; H1 H18103B ; H1 H18104B H1H18105B ; H1 H18107B ; H1 H18108B H1H18109B H1H18110B ; H1 H18111B ; H1 H18112B ; H1 H18113B H1H18114B ; H1 H18115B ; H1 H18116B H1H18117B H1H18118B ; H1 H18119B ; H1 H18120B ; H1 H18121B H1H18122B ; H1 H18123B ; H1 H18124B H1H18125B H1H18126B ; H1 H18127B ; H1 H18128B ; H1 H18129B H1H18130B ; H1 H18131B ; H1 H18132B H1H18133B H1H18134B ; H1 H18135B ; H1 H18136B ; H1 H18137B H1H18138B ; H1 H18139B ; H1 H18140B H1H18141B H1H18142B ; H1 H18143B ; H1 H18144B ; H1 H18145B H1H18146B ; H1 H18147B ; H1 H18148B H1H18149B H1H18150B ; H1 H18151B ; H1 H18152B ; H1 H18153B H1H18154B ; H1 H18155B ; H1 H18156B H1H18157B H1H18158B ; H1 H18159B ; H1 H18160B ; H1 H18161B H1H18162B ; H1 H18163B ; H1 H18164B H1H18165B H1H18166B ; H1 H18167B ; H1 H18168B ; H1 H18169B H1H18170B ; H1 H18171B ; H1 H18172B H1H18173B H1H18174B ; H1 H18175B ; H1 H18176B ; H1 H18177B H1H18178B ; H1 H18179B ; H1 H18180B H1H18181B H1H18182B ; H1 H18183B ; H1 H18184B ; H1 H18185B H1H18186B ; H1 H18187B ; H1 H18188B H1H18189B H1H18190B ; H1 H18191B ; H1 H18192B ; H1 H18193B H1H18194B ; H1 H18195B ; H1 H18196B H1H18197B H1H18198B ; H1 H18199B ; H1 H18200B ; H1 H18201B H1H18202B ; H1 H18203B ; H1 H18204B H1H18205B H1H18206B ; H1 H18207B ; H1 H18208B ; H1 H18209B H1H18210B ; H1 H18211B ; H1 H18212B H1H18213B H1H18214B ; H1 H18216B ; H1 H18217B ; H1 H18218B H1H18219B ; H1 H18220B ; H1 H18221B H1H18222B H1H18223B ; H1 H18224B ; H1 H18225B ; H1 H18226B H1H18227B ; H1 H18228B ; H1 H18229B H1H18230B H1H18231B ; H1 H18232B ; H1 H18233B ; H1 H18234B H1H18235B ; H1 H18236B ; H1 H18237B H1H18238B H1H18239B ; H1 H18240B ; H1 H18241B ; H1 H18242B H1H18243B ; H1 H18244B ; H1 H18245B H1H18246B H1H18247B ; H1 H18248B ; H1 H18249B ; H1 H18250B H1H18251B ; H1 H18252B ; H1 H18253B H1H18254B H1H18255B ; H1 H18256B ; H1 H18257B ; H1 H18258B H1H18259B ; H1 H18261B ; H1 H18262B H1H18263B H1H18264B ; H1 H18265B ; H1 H18266B ; H1 H18267B H1H18268B ; H1 H18269B ; H1 H18270B H1H18271B H1H18272B ; H1 H18274B ; H1 H18275B ; H1 H18276B H1H18277B ; H1 H18278B ; H1 H18279B H1H18280B H1H18281B ; H1 H18282B ; H1 H18283B ; H1 H18284B H1H18285B ; H1 H18286B ; H1 H18287B H1H18288B H1H18289B ; H1 H18290B ; H1 H18291B ; H1 H18292B H1H18293B ; H1 H18294B ; H1 H18295B H1H18297B H1H18298B ; H1 H18299B ; H1 H18300B ; H1 H18301B H1H18302B ; H1 H18303B ; H1 H18304B H1H18305B H1H18306B ; H1 H18307B ; H1 H18308B ; H1 H18309B H1H18310B ; H1 H18311B ; H1 H18312B H1H18313B H1H18314B ; H1 H18315B ; H1 H18316B ; H1 H18317B H1H18318B ; H1 H18319B ; H1 H18320B H1H18321B H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; y H1H18335B.
En un aspecto de la divulgación, un agente terapéutico adicional, que se proporciona en asociación con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a la proteína HA grupo II de la gripe, tal como H1H14611N2; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Vh y Vl de H1H14611N2; o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de H1H14611N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 25-27) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H14611N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 29-31).
En un aspecto de la divulgación, un agente terapéutico adicional, que se proporciona en asociación con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a la proteína HA grupo II de la gripe, tal como H1H14612N2; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Vh y Vl de H1H14612N2; o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende c Dr -H1, CDR-H2 y CDR-H3 de H1H14612N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 41-43) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H14612N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 45-47).
En un aspecto de la divulgación, un agente terapéutico adicional, que se proporciona en asociación con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a la proteína HA grupo I de la gripe, tal como H1H11729P; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Vh y Vl de H1H11729P; o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de H1H11729P (por ejemplo, las SEQ ID NO: 33-35) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H11729P (por ejemplo, las SEQ ID NO: 37-39).
La presente divulgación también proporciona un recipiente o un dispositivo de inyección que comprende una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, H1H7017N) o una composición del mismo (por ejemplo, una composición farmacéutica).
La presente divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir una infección vírica diferente de una infección vírica de gripe, en un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 expuesta en el presente documento (por ejemplo, H1H7017N).
La presente divulgación también proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata) o una infección, por ejemplo, una infección vírica, por ejemplo, una infección con un virus de la gripe, coronavirus, virus del SARS-Co, virus del MERS-Co, virus paragripal, metaneumovirus humano o virus de la hepatitis C (VHC), en un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 expuesta en el presente documento (por ejemplo, H1H7017N). Por ejemplo, la proteína de unión a antígeno se administra en asociación con uno o más agentes terapéuticos adicionales (por ejemplo, fármaco antivírico y/o una vacuna). En un aspecto de la divulgación, un agente terapéutico adicional es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: ledipasvir, sofosbuvir, una combinación de ledipasvir y sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirina e interferón-alfa2b, interferón-alfa2a y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HA de la gripe. En un aspecto de la divulgación, un agente terapéutico adicional es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo seleccionado del grupo que consiste en H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2 H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B H1H17954B H1H17955B H1H17956B H1H17957B H1H17958B H1H17959B H1H17960B H1H17961B H1H17962B H1H17963B H1H17964B H1H17965B H1H17966B H1H17967B H1H17968B H1H17969B H1H17970B H1H17971B H1H17972B H1H17973B H1H17974B H1H17975B H1H17976B H1H17977B H1H17978B H1H17979B H1H17980B H1H17981B H1H17982B H1H17983B H1H17984B H1H17985B H1H17986B H1H17987B H1H17988B H1H17989B H1H17990B H1H17991B H1H17992B H1H17993B H1H17994B H1H17995B H1H17996B H1H17997B H1H17998B H1H17999B H1H18000B H1H18001B H1H18002B H1H18003B H1H18004B H1H18005B H1H18006B H1H18007B H1H18008B H1H18009B H1H18010B H1H18011B H1H18012B H1H18013B H1H18014B H1H18015B H1H18016B H1H18017B H1H18018B H1H18019B H1H18020B H1H18021B H1H18022B H1H18023B H1H18024B H1H18025B H1H18026B H1H18027B H1H18028B H1H18029B H1H18030B H1H18031B H1H18032B H1H18033B H1H18034B H1H18035B H1H18037B H1H18038B H1H18039B H1H18040B H1H18041B H1H18042B H1H18043B H1H18044B H1H18045B H1H18046B H1H18047B H1H18048B H1H18049B H1H18051B H1H18052B H1H18053B H1H18054B H1H18055B H1H18056B H1H18057B H1H18058B H1H18059B H1H18060B H1H18061B H1H18062B H1H18063B H1H18064B H1H18065B H1H18066B H1H18067B H1H18068B H1H18069B H1H18070B H1H18071B H1H18072B H1H18073B H1H18074B H1H18075B H1H18076B H1H18077B H1H18078B H1H18079B H1H18080B H1H18081B H1H18082B H1H18083B H1H18084B H1H18085B H1H18086B H1H18087B H1H18088B H1H18089B H1H18090B H1H18091B H1H18092B H1H18093B H1H18094B H1H18095B H1H18096B H1H18097B H1H18098B H1H18099B H1H18100B H1H18101B H1H18102B H1H18103B H1H18104B H1H18105B H1H18107B H1H18108B H1H18109B H1H18110B H1H18111B H1H18112B H1H18113B H1H18114B H1H18115B H1H18116B H1H18117B H1H18118B H1H18119B H1H18120B H1H18121B H1H18122B H1H18123B H1H18124B H1H18125B H1H18126B H1H18127B H1H18128B H1H18129B H1H18130B H1H18131B H1H18132B H1H18133B H1H18134B H1H18135B H1H18136B H1H18137B H1H18138B H1H18139B H1H18140B H1H18141B H1H18142B H1H18143B H1H18144B H1H18145B H1H18146B H1H18147B H1H18148B H1H18149B H1H18150B H1H18151B H1H18152B H1H18153B H1H18154B H1H18155B H1H18156B H1H18157B H1H18158B H1H18159B H1H18160B H1H18161B H1H18162B H1H18163B H1H18164B H1H18165B H1H18166B H1H18167B H1H18168B H1H18169B H1H18170B H1H18171B H1H18172B H1H18173B H1H18174B H1H18175B H1H18176B H1H18177B H1H18178B H1H18179B H1H18180B H1H18181B H1H18182B H1H18183B H1H18184B H1H18185B H1H18186B H1H18187B H1H18188B H1H18189B H1H18190B H1H18191B H1H18192B H1H18193B H1H18194B H1H18195B H1H18196B H1H18197B H1H18198B H1H18199B H1H18200B H1H18201B H1H18202B H1H18203B H1H18204B H1H18205B H1H18206B H1H18207B H1H18208B H1H18209B H1H18210B H1H18211B H1H18212B H1H18213B H1H18214B H1H18216B H1H18217B H1H18218B H1H18219B H1H18220B H1H18221B H1H18222B H1H18223B H1H18224B H1H18225B H1H18226B H1H18227B H1H18228B H1H18229B H1H18230B H1H18231B H1H18232B H1H18233B H1H18234B H1H18235B H1H18236B H1H18237B H1H18238B H1H18239B H1H18240B H1H18241B H1H18242B H1H18243B H1H18244B H1H18245B H1H18246B H1H18247B H1H18248B H1H18249B H1H18250B H1H18251B H1H18252B H1H18253B H1H18254B H1H18255B H1H18256B H1H18257B H1H18258B H1H18259B H1H18261B H1H18262B H1H18263B H1H18264B H1H18265B H1H18266B H1H18267B H1H18268B H1H18269B H1H18270B H1H18271B H1H18272B H1H18274B H1H18275B H1H18276B H1H18277B H1H18278B H1H18279B H1H18280B H1H18281B H1H18282B H1H18283B H1H18284B H1H18285B H1H18286B H1H18287B H1H18288B H1H18289B H1H18290B H1H18291B H1H18292B H1H18293B H1H18294B H1H18295B H1H18297B H1H18298B H1H18299B H1H18300B H1H18301B H1H18302B H1H18303B H1H18304B H1H18305B H1H18306B H1H18307B H1H18308B H1H18309B H1H18310B H1H18311B H1H18312B H1H18313B H1H18314B H1H18315B H1H18316B H1H18317B H1H18318B H1H18319B H1H18320B H1H18321B H1H18322B H1H18323B H1H18324B H1H18325B H1H18326B H1H18327B H1H18328B H1H18329B H1H18330B; H1 H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; y H1H18335B.
La presente divulgación también proporciona un método para administrar la proteína de unión a antígeno anti-TMRPSS2 (por ejemplo, H1H7017N) expuesta en el presente documento en el cuerpo de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) que comprende inyectar la proteína de unión a antígeno en el cuerpo del sujeto por vía parenteral (por ejemplo, vía subcutánea, vía intravenosa o vía intramuscular).
Breve descripción de los dibujos
Figura 1 (A-B). Progresión de la propagación del virus A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP en diferentes líneas celulares con una multiplicidad de infección inicial de 0,01 (A) o 0,001 (B) en ausencia de tripsina exógena. Células Calu3 (círculos), A549 (cuadrados), MDCK (triángulos) y HepG2 (triángulos invertidos).
Figura 2. La aplicación de H1H7017N durante el ciclo de infección disminuye el número de unidades de foco fluorescente (UFF) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) a las 72 horas tras la infección en comparación con el anticuerpo de control de isotipo, sin anticuerpo, anticuerpo anti-HA y controles sin infectar.
Figura 3 (A-B). El anti-TMPRSS2, H1H7017N, se une a TMPRSS2 humana y de mono cynomolgus expresada en células. (A) H1H7017N, unido a MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 y MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2 con valores de CE50 de 460 pM y 1,06 nM respectivamente y no mostró unión significativa a células MDCK/Tet-on. (b) El mAb1 de control, un anticuerpo de control de isotipo irrelevante, no mostró unión a ninguna de las líneas celulares analizadas. Figura 4. Curva de supervivencia de un ratón modificado por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana tratado con 5 mg/kg de H1H7017N el día -1 PI (triángulo invertido, línea discontinua) o el día 0 PI (círculo, línea sólida) mostrando protección contra H1N1 en un modelo profiláctico. Los ratones tratados con control de isotipo H1H1238N (triángulo, línea sólida) no mostraron protección.
Figura 5. Curva de supervivencia de un ratón modificado por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana infectado con H1N1, tratado con 10 mg/kg de H1H7017N, que demuestra protección. Los ratones se trataron el día 0 (diamante, línea de puntos), día 1 (círculo, línea sólida), día 2 (triángulo invertido, línea sólida) o día 3 PI (cuadrado, línea discontinua). El control de isotipo H1H1238N (triángulo, línea sólida) tuvo una protección parcial con una tasa de supervivencia de un 25 %.
Figura 6. Curva de supervivencia de ratones hTPMRSS2 tratados con 10 mg/kg de H1H7017N el día 1 PI (triángulo) o el día 2 PI (círculo) que muestran protección contra H3N2. Los ratones sin tratar (cuadrado) no mostraron protección.
Figura 7 (A-B). Curva de supervivencia de un ratón de tipo silvestre (A) o ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana (B) infectada con 150 UFP (triángulo), 750 u Fp (cuadrado) o 1.500 UFP (círculo) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1). Los ratones se pesaron diariamente hasta el día 14 PI.
Figura 8. Curva de supervivencia de un ratón modificado por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana infectado con A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34 (H3N2) el día 0 y tratado con una combinación de 2,5 mg/kg de H1H7017N y de H1H14611N2 (diamante), 10 mg/kg de H1H7017N (triángulo), 10 mg/kg de H1H14611N2 (cuadrado), 5 mg/kg de H1H7017N y de H1H14611N2 o 10 mg/kg hlgG1 de control de isotipo (círculo). Los ratones se pesaron diariamente hasta el día 14 PI.
Figura 9. Curva de supervivencia de un ratón modificado por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana infectado con A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) el día 1 PI y tratado con una combinación de 1 mg/kg de H1H7017N y 2 mg/kg de H1H11729P (círculo), 2,5 mg/kg de H1H7017N y de H1H11729P (triángulo invertido), 5 mg/kg de H1H11729P (diamante), 5 mg/kg de H1H7017N (cuadrado) o 5 mg/kg de control de isotipo de hlgG1 (triángulo). Los ratones se pesaron diariamente hasta el día 14 PI.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.
La expresión "hemaglutinina de la gripe", también denominada "HA de la gripe" es una glucoproteína trimérica encontrada en la superficie de los viriones de la gripe, que media la unión (a través de la unión de HA1 a los ácidos a-2,3- y a-2,6-siálico) y la entrada vírica (mediante un cambio conformacional) en las células hospedadoras. La HA está compuesta por dos dominios estructurales: un dominio de cabeza globular que contiene el sitio de unión al receptor (sometido a una frecuencia de mutaciones antigénica elevada) y la región del tallo (más conservada entre las diversas cepas del virus de la gripe). La HA de la gripe se sintetiza como un precursor (HA0) que sufre un procesamiento proteolítico para producir dos subunidades (HA1 y HA2) que se asocian entre sí para formar la estructura de tallo/cabeza globular. La HA vírica es la región de antígeno más variable en el virus y el tallo (HA2) está altamente conservado dentro de cada grupo.
La expresión "neuraminidasa de la gripe", también denominada "NA de la gripe" es una exosialidasa (EC 3.2.1.18) que escinde el enlace a-cetosídico entre el ácido siálico (N-acetilneuramínico) y un residuo de azúcar adyacente.
La secuencia de aminoácidos de longitud completa de HA de la gripe se ilustra mediante la secuencia de aminoácidos del aislado de la gripe H1N1 A/California/04/2009 proporcionada en GenBank como el n.° de registro FJ966082.1. La expresión "gripe-HA" también incluye variantes de proteínas de HA de la gripe aisladas de distintos aislados de gripe, por ejemplo, GQ149237.1, NC_o02017, KM972981.1, etc. La expresión "gripe-HA" también incluye HA de gripe recombinante o un fragmento de la misma. El término también abarca HA de la gripe o un fragmento de la misma acoplada a, por ejemplo, una etiqueta de histidina, Fc de ratón o humano o una secuencia de señal.
Una "proteína de unión a antígeno" anti-TMPRSS2 es un polipéptido o complejo de más de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo IgG tetramérico) que se une(n) específicamente al polipéptido TMPRSS2, por ejemplo, un anticuerpo anti-TMPRSS2 o fragmento de unión a antígeno ya sea monoespecífico o multiespecífico.
TMPRSS2
TMPRSS2 (proteasa transmembrana serina 2) es una proteína, situada en el cromosoma 21 humano, que pertenece a la familia de serina proteasas (serina proteasas transmembrana tipo II (TTSP)) que es importante para la infectividad del virus de la gripe. Se ha demostrado que TMPRSS2 media en la escisión de hAo del virus de la gripe a HA1 y HA2.
El gen TMPRSS2 humano codifica una proteína predicha de 492 aminoácidos que se ancla a la membrana plasmática. La proteína se convierte en su forma madura a través de escisión autocatalítica entre Arg255 e Ile256. Después de la escisión, las proteasas maduras están unidas a la membrana en su mayoría, aunque una porción de las mismas puede liberarse en el medio extracelular.
En una realización de la invención, TMPRSS2 humana (V160M) comprende la secuencia de aminoácidos: MALNSGSPPAIGPYYENHGYQPENPYPAQPTWPTVYEVHPAQYYPSPVPQYAPRVLTQASNPWCTQPKSPSGTVC TSKTKKALCITLTLGTFLVGAALAAGLLWKEMGSKCSNSGIECDSSGTCINPSNWCDGVSHCPGGEDENRCVRLYGP NFILQMYSSQRKSWHPVCQDDWNENYGRAACRDMGYKNNFYSSQGIVDDSGSTSFMKLNTSAGNVDIYKKLYHSDAC
SSKAWSLRCIACGVNLNSSRQSRIVGGESALPGAWPWQVSLHVQNVHVCGGSIITPEWIVTAAHCVEKPLNNPWHW
TAFAGILRQSFMFYGAGYQVEKVISHPNYDSKTKNNDIALMKLQKPLTFNDLVKPVCLPNPGMMLQPEQLCWISGWG ATEEKGKTSEVLNAAKVLLIETQRCNSRYVYDNLITPAMICAGFLQGNVDSCQGDSGGPLVTSKNNIWWLIGDTSWG SGCAKAYRPGVYGNVMVFTDWIYRQMRADG
(SEQ ID NO: 22; metionina 160 en fuente negrita). En una realización de la invención, el polipéptido de TMPRSS2 no comprende la mutación V160M. Véase también NM_005656.3.
En un ejemplo, TMPRSS2 de Macaca mulatta (S129L, N251S, I415V, R431Q, D492G) comprende la secuencia de aminoácidos:
MALNSGSPPGVGPYYENHGYQPENPYPAQPTVAPNVYEVHPAQYYPSPVPQYTPRVLTHASNPAVCRQPKSPSGTVC TSKTKKALCVTMTLGAVLVGAALAAGLLWKFMGSKCSDSGIECDSSGTCISLSNWCDGVSHCPNGEDENRCVRLYGP
NFILQVYSSQRKSWHPVCRDDWNENYARAACRDMGYKNSFYSSQGIVDNSGATSFMKLNTSAGNVDIYKKLYHSDAC SSKAWSLRCIACGVRSNLSRQSRIVGGQNALLGAWPWQVSLHVQNIHVCGGSIITPEWIVTAAHCVEKPLNSPWQW TAFVGTLRQSSMFYEKGHRVEKVISHPNYDSKTKNNDIALMKLHTPLTFNEWKPVCLPNPGMMLEPEQHCWISGWG ATQEKGKTSDVLNAAMVPLIEPRRCNNKYVYDGLITPAMICAGFLQGTVDSCQGDSGGPLVTLKNDVWWLIGDTSWG SGCAQANRPGVYGNVTVFTDWIYRQMRADG
(SEQ ID NO: 23). En un ejemplo, el polipéptido de TMPRSS2 no comprende la mutación S129L, N251S, I415V, R431Q y/o D492G.
En un ejemplo, El ARNm de TMPRSS2 de Mus musculus comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en NM_015775.2.
Virus
La presente divulgación incluye métodos para tratar o prevenir una infección vírica en un sujeto. El término "virus" incluye cualquier virus cuya infección en el cuerpo de un sujeto es tratable o prevenible mediante la administración de un anticuerpo anti-TMPRSS2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, en donde la infectividad del virus es al menos parcialmente dependiente de TMPRSS2). En un aspecto de la divulgación, un "virus" es cualquier virus que expresa HA0 u otro sustrato de TMPRSS2 cuya escisión proteolítica se requiere para la infectividad completa del virus contra una célula en un huésped. El término "virus" también incluye un virus respiratorio dependiente de TMPRSS2 que es un virus que infecta el tejido respiratorio de un sujeto (por ejemplo, tracto respiratorio superior y/o inferior, tráquea, bronquios, pulmones) y es tratable o prevenible mediante la administración de un anti-TMPRSS2. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, el virus incluye el virus de la gripe, coronavirus, virus del SARS-Co (coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave), virus del MERS-Co (CoV del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)), virus paragripal, virus sendai (SeV), metaneumovirus humano y/o virus de la hepatitis C (VHC). "Infección vírica" se refiere a la invasión y multiplicación de un virus en el cuerpo de un sujeto. La presente divulgación incluye aspectos con una condición de que "virus" excluye al virus de la gripe, por ejemplo, en donde la infección vírica excluye la infección por virus de la gripe.
Actualmente hay dos géneros del virus paragripal humano (HPIV), respirovirus (HPIV-1 y HPIV-3) y rubulavirus (HPIV-2 y HPIV-4). Ambos géneros (paramixovirus) pueden separarse morfológicamente del virus de la gripe.
El virus sendai, también conocido como virus paragripal murino, es la especie tipo en el género respirovirus, que también contiene las especies del virus paragripal humano 3, virus paragripal bovino 3 y virus paragripal humano 1. TMPRSS2 es una proteasas de activación para los virus paragripales respiratorios tales como los virus paragripales y el virus sendai (SeV). Véase Abe et al., J. Virol. 87(21): 11930-11935 (2013).
El metaneumovirus humano (HMPV) se clasifica como el primer miembro humano del género Metapneumovirus en la subfamilia Pneumovirinae dentro de la familia Paramyxoviridae. Es un virus de ARN monocatenario de sentido negativo envuelto. El genoma del ARN incluye 8 genes que codifican 9 proteínas diferentes. HMPV es idéntico en el orden genético al neumovirus aviar (AMPV), que también pertenece al género Metapneumovirus. TMPRSS2 se expresa en el epitelio pulmonar humano, escinde la proteína F de HMPV eficazmente y apoya la multiplicación de HMPV y puede estar implicado en el desarrollo de enfermedades del tracto respiratorio inferior en pacientes infectados por HMPV. Véase Shirogane et al. J Virol. 82(17): 8942-8946 (2008).
El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo, pequeño, envuelto, de la familia Flaviviridae. VHC, con al menos 6 genotipos y numerosos subtipos, es un miembro del género Hepacivirus. TMPRSS2 puede activar la infección por VHC en la etapa tras la unión y entrada. Esumi et al., Hepatology 61(2): 437-446 (2015).
Los virus de la gripe son miembros de la familia Orthomyxoviridae. Esta familia representa virus envueltos cuyo genoma tiene segmentos de ARN monocatenario de sentido negativo segmentados. Hay cuatro géneros de esta familia: tipos A, B, C y Thogotovirus. Las clases de virus de la gripe, A, B y C, se basan en la proteína central y se dividen adicionalmente en subtipos determinados por las glucoproteínas de la envuelta vírica hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) (por ejemplo, subtipo A/H1N1). Hay al menos 18 subtipos de proteínas de hemaglutinina ("HA") de la gripe (H1-H18 o HA1-HA18) y al menos 11 subtipos de proteínas de neuraminidasa (NA) de la gripe (N1-N11 o NA1-NA11) que se utilizan para definir los subtipos de gripe. La gripe del grupo 1 tiene los subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 y H18 y los subtipos NA8, NA5, Na4 y NA1. El grupo 2 tiene los subtipos H3, H4, H7, H10, H14 y H15 y los subtipos NA6 NA9, NA7, NA2 y NA3. Los virus de la gripe A infectan a una gama de especies de mamíferos y aves, si bien las infecciones de tipo B y C se restringen en gran medida a seres humanos. Los ocho segmentos del genoma de los virus de la gripe A y B están encapsulados débilmente por la nucleoproteína.
Los viriones de coronavirus son esféricos con diámetros de aproximadamente 125 nm. La característica más prominente de los coronavirus son las proyecciones de puntas con forma de maza que emanan de la superficie del virión. Estas puntas son una característica definitoria del virión y les dan la apariencia de una corona solar, inspirando el nombre, coronavirus. Dentro de la envoltura del virión se encuentra la nucleocápside. Los coronavirus tienen nucleocápsides simétricas helicoidalmente, que es poco común entre los virus de ARN de sentido positivo, pero mucho más común para los virus de ARN de sentido negativo. Tanto el MERS-CoV (coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio) como el SARS-CoV (coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave) pertenecen a la familia del coronavirus. La unión inicial del virión a la célula hospedadora se inicia mediante interacciones entre la proteína S y su receptor. Los sitios de los dominios de unión al receptor (RBD) dentro de la región S1 de una proteína S de coronavirus varían dependiendo del virus, con algunos que tienen RBD en el extremo C terminal de S1. La interacción proteína-S/receptor es el principal determinante para que un coronavirus infecte a una especie hospedadora y también gobierna el tropismo tisular del virus. Muchos coronavirus utilizan peptidasas como su receptor celular. Después de la unión al receptor, el virus debe acceder al citosol de la célula hospedadora. Esto generalmente se logra mediante la escisión proteolítica dependiente de ácido de la proteína S mediante una catepsina, TMPRRS2 u otra proteasa, seguida de la fusión de las membranas viral y celular.
Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno anti-TMPRSS2
La presente divulgación proporciona proteínas de unión a antígeno, tal como anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a la proteína TMPRSS2 o un fragmento antigénico de la misma. Las proteínas de unión a antígeno de la presente invención son como se establece en las reivindicaciones.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (HC) y dos cadenas ligeras (LC) interconectadas por enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completo"), así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM), por ejemplo, H1H7017N. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "Vh") (por ejemplo, SEQ ID NO: 2) y una región constante de cadena pesada (comprendida por los dominios Ch1, Ch2 y Ch3). Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera ("LCVR o "Vl") (por ejemplo, SEQ ID NO: 4) y una región constante de cadena ligera (Cl). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En ciertas realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) son idénticas a las secuencias de la línea germinal humana o pueden modificarse natural o artificialmente.
Normalmente, los dominios variables de las cadenas tanto pesada como ligera de inmunoglobulina comprenden tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), localizadas dentro de regiones marco (FR) relativamente conservadas. En general, desde el extremo N al extremo C, los dominios variables de las cadenas tanto ligera como pesada comprenden FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio puede estar de acuerdo con las definiciones de las Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5a ed.; NIH Publ. N.° 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 o Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883.
La presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2 monoclonales, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como composiciones monoclonales que comprenden una pluralidad de proteínas de unión a antígeno monoclonales. La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, las moléculas de anticuerpo que constituyen la población son idénticas en la secuencia de aminoácidos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Una "pluralidad" de tales anticuerpos monoclonales y fragmentos en una composición se refiere a una concentración de anticuerpos (es decir, como se ha analizado anteriormente, una secuencia de aminoácidos excepto por mutaciones de origen natural posibles que pueden estar presentes en cantidades minoritarias) y fragmentos que están por encima de lo que sería de origen natural, por ejemplo, en la sangre de un organismo hospedador tal como un ratón o un ser humano.
En un aspecto de la divulgación, una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena pesada, por ejemplo, del tipo IgA (por ejemplo, IgA1 o IgA2), IgD, IgE, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) o IgM. En un aspecto de la divulgación, una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende un dominio constante de cadena ligera, por ejemplo, del tipo kappa o lambda.
El término proteína de unión a antígeno "humano", tal como un anticuerpo, como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana, ya sea en una célula humana o injertada en una célula no humana, por ejemplo, una célula de ratón. Véanse, por ejemplo, los documentos US8502018, US6596541 o US5789215. Los mAb humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir mAb en los que se hayan injertado secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón) en secuencias FR humanas. La expresión incluye anticuerpos producidos de forma recombinante en un mamífero no humano o en células de un mamífero no humano. La expresión no pretende incluir anticuerpos aislados de o generados en un sujeto humano. Véase más adelante.
La presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2 quiméricas, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos y métodos de uso de las mismas. Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que tiene el dominio variable de un primer anticuerpo y el dominio constante de un segundo anticuerpo, donde el primer y segundo anticuerpos son de diferentes especies. (documento US4816567; y Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
La expresión proteínas de unión a antígeno "recombinantes", tales como anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se refiere a tales moléculas creadas, expresadas, aisladas y obtenidas mediante tecnologías o métodos conocidos en la técnica como tecnología de ADN recombinante que incluye, por ejemplo, corte y empalme de ADN y expresión transgénica. La expresión incluye anticuerpos expresados en un mamífero no humano (incluyendo mamíferos no humanos transgénicos, por ejemplo, ratones transgénicos) o en un sistema de expresión celular (por ejemplo, células CHO) o aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes.
Las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2 recombinantes, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno, divulgados en el presente documento también pueden producirse en un sistema de expresión E. coli/T7. En este aspecto, los ácidos nucleicos que codifican las moléculas de inmunoglobulina del anticuerpo anti-TMPRSS2 (por ejemplo, H1H7017N) pueden insertarse en un plásmido basado en pET y expresarse en el sistema E. coli/T7. Por ejemplo, la presente invención incluye métodos para expresar un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una cadena de inmunoglobulina del mismo en una célula hospedadora (por ejemplo, célula hospedadora bacteriana tal como E. coli tal como BL21 o BL21DE3) que comprende la expresión de la ARN polimerasa de T7 en la célula que también incluye un polinucleótido que codifica una cadena de inmunoglobulina que está unida operativamente a un promotor de T7. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, una célula hospedadora bacteriana, tal como una E. coli, incluye un polinucleótido que codifica el gen de la ARN polimerasa de T7 unido operativamente a un promotor lac y la expresión de la polimerasa y la cadena se inducen mediante la incubación de la célula hospedadora con IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido). Véanse los documentos US4952496 y US5693489 o Studier and Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 5 de mayo de 1986;189(1): 113-30.
Existen varios métodos conocidos en la materia para producir anticuerpos recombinantes. Un ejemplo de un método de producción recombinante de anticuerpos se desvela en el documento US4816567.
La transformación puede ser mediante cualquier método conocido de introducción de polinucleótidos en una célula hospedadora. Los métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido o de los polinucleótidos en liposomas, inyección biolística y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamífero mediante vectores víricos. Los métodos de transformación de células son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.399.216; 4,912,040; 4.740.461 y 4.959.455.
Por tanto, la presente divulgación incluye métodos recombinantes para fabricar una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, tal como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención o una cadena de inmunoglobulina del mismo, que comprende (i) introducir uno o más polinucleótidos (por ejemplo, incluir la secuencia de nucleótidos en una o más de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15) que codifican las cadenas de inmunoglobulina ligera y/o pesada de la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N, por ejemplo, en donde el polinucleótido está en un vector; y/o integrado en un cromosoma de la célula hospedadora y/o está unido operativamente a un promotor; (ii) cultivar la célula hospedadora (por ejemplo, CHO o Pichia o Pichia pastoris) en condiciones favorables para la expresión del polinucleótido y (iii) opcionalmente, aislar la proteína de unión a antígeno, (por ejemplo, anticuerpo o fragmento) o cadena de la célula hospedadora y/o medio en el que se cultiva la célula hospedadora. Al fabricar una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno) que comprende más de una cadena de inmunoglobulina, por ejemplo, un anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina, la expresión conjunta de las cadenas en una sola célula hospedadora conduce a la asociación de las cadenas, por ejemplo, en la célula o en la superficie celular o fuera de la célula si se secretan dichas cadenas, de manera que se forma la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno). Los métodos incluyen aquellos en donde solamente se expresa una cadena pesada de inmunoglobulina o solamente una cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, cualquiera de los analizadas en el presente documento que incluyen fragmentos y/o dominios variables maduros de los mismos). Dichas cadenas son útiles, por ejemplo, como intermediarios en la expresión de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que incluye dicha cadena. Por ejemplo, la presente divulgación también incluye proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, tal como anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una cadena pesada de inmunoglobulina (o un dominio variable de la misma o que comprende las CDR de la misma) codificada por un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera de inmunoglobulina (o dominio variable de la misma o que comprende las CDR de la misma) codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 que son el producto de dichos métodos de producción y, opcionalmente, los métodos de purificación expuestos en el presente documento. Por ejemplo, en una realización de la invención, el producto del método es una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 que es un anticuerpo o fragmento que comprende una Vh que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y una Vl que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4; o que comprende una HC que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 o 19 y una LC que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
Las células hospedadoras eucariotas y procariotas, incluyendo células de mamíferos, pueden utilizarse como hospedadores para la expresión de una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2. Tales células hospedadoras se conocen bien en la técnica y muchas están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas células hospedadoras incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, células HEK-293 y un número de otras líneas celulares. Las células hospedadoras de mamífero incluyen seres humanos, ratón, rata, perro, mono, cerdo, cabra, bovino, células de caballo y hámster. Otras líneas celulares que pueden usarse son líneas celulares de insectos (por ejemplo, Spodoptera frugiperda o Trichoplusia ni), células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Las células fúngicas incluyen células de levaduras y de hongos filamentosos que incluyen, por ejemplo, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia iindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens y Neurospora crassa. La presente divulgación incluye una célula hospedadora aislada (por ejemplo, una célula CHO) que comprende una proteína de unión a antígeno, tal como H1H7017N; o un polinucleótido que codifica tal polipéptido del mismo.
La expresión se "une específicamente" se refiere a aquellas proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, mAb) que tienen afinidad de unión por un antígeno, tal como la proteína TMPRSS2 (por ejemplo, TMPRSS2 humana) expresada como Kd, de al menos aproximadamente 10-8 M (por ejemplo, 2,81 X 10-9 M; 9,31 X 10-9M; 10-9 M; 10-10 M, 10-11 M o 10-12 M), como se midió mediante ensayo de interferometría de biocapa sin etiquetas en tiempo real, por ejemplo, a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, un biosensor de HTX de Octet® o mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™ o mediante ELISA de afinidad en solución. La presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a la proteína TMPRSS2.
Las expresiones "porción de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo o proteína de unión a antígeno y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, como se define en el documento WO08/020079 o documento WO09/138519) (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, en un aspecto de la divulgación, comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR, que está adyacente o en marco con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh - Vh, Vh - Vl o Vl - Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En ciertos aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente con al menos un dominio constante. Las configuraciones ilustrativas no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno incluyen: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-CH1-CH2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno) pueden ser monoespecíficas o multiespecíficas (por ejemplo, biespecíficas). Las proteínas de unión a antígeno multiespecíficas se analizan adicionalmente en el presente documento.
En realizaciones específicas, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden estar conjugados con una fracción tal como un ligando o una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un fármaco antivírico, un segundo anticuerpo antigripe o cualquier otra fracción terapéutica útil para tratar una infección vírica, por ejemplo, una infección vírica de gripe. Véase más adelante.
La presente divulgación proporciona también un complejo que comprende una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, analizado en el presente documento en forma de complejo con el polipéptido TMPRSS2 o un fragmento antigénico del mismo y/o con un anticuerpo secundario o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, anticuerpo secundario marcado de forma detectable) que se une específicamente al anticuerpo o fragmento anti-TMPRSS2. En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo o fragmento está in vitro (por ejemplo, está inmovilizado en un sustrato sólido) o está en el cuerpo de un sujeto. En un aspecto de la divulgación, la TMPRSS2 está in vitro (por ejemplo, está inmovilizada en un sustrato sólido) o está en la superficie de una célula o está en el cuerpo de un sujeto. Los anticuerpos anti-TMRPSS2 inmovilizados y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos que están unidos covalentemente a un material de matriz insoluble (por ejemplo, vidrio o polisacárido tal como agarosa o sefarosa, por ejemplo, una perla u otra partícula de los mismos) son también parte de la presente divulgación; opcionalmente, en donde el anticuerpo inmovilizado está en forma de complejo con TMPRSS2 o fragmento antigénico de la misma o un anticuerpo secundario o fragmento del mismo. Los complejos de la presente invención son como se establece en las reivindicaciones.
Las proteínas de unión a antígeno, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, polipéptidos, polinucleótidos y vectores "aislados", están al menos parcialmente libres de otras moléculas biológicas de las células o del cultivo celular a partir del cual se producen. Dichas moléculas biológicas incluyen ácidos nucleicos, proteínas, otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, lípidos, carbohidratos u otros materiales, tales como restos celulares y medio de crecimiento. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno aislado puede estar adicionalmente al menos parcialmente libre de componentes del sistema de expresión tales como moléculas biológicas de una célula hospedadora o del medio de crecimiento de la misma. Generalmente, el término "aislado" no pretende referirse a una ausencia total de dichas moléculas biológicas o a una ausencia de agua, tampones, o sales o componentes de una formulación farmacéutica que incluye los anticuerpos o fragmentos.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico (por ejemplo, en el polipéptido TMPRSS2) que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una región variable de una molécula de anticuerpo, conocida como un paratopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. El término "epítopo"se refiere también a un lugar sobre un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales, es decir, compuestos de aminoácidos no lineales. En ciertas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.
Los métodos para determinar el epítopo de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpo o fragmento o polipéptido, incluyen los análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de hibridación de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), análisis de escisión de péptidos, estudios cristalográficos y análisis por RMN. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Otro método que puede utilizarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interacciona una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento o polipéptido) (por ejemplo, coversina) es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión de la proteína de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpo o fragmento o polipéptido, a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína TMPRSS2/proteína de unión a antígeno se transfiere al agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo del anticuerpo experimentan un intercambio inverso de deuterio a hidrógeno a una velocidad más lenta que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz proteína/proteína de unión a antígeno pueden retener deuterio y por tanto, muestran una masa relativamente mayor en comparación con los aminoácidos no incluidos en la interfaz. Tras la disociación de la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento o polipéptido), la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa la proteína de unión a antígeno. Véanse, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem.
73: 256A-265A.
El término "compite", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a un antígeno (por ejemplo, TMPRSS2) y que inhibe o bloquea la unión de otra proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) al antígeno. El término también incluye la competencia entre dos proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos, en ambas orientaciones, es decir, un primer anticuerpo que se une y bloquea la unión de un segundo anticuerpo y viceversa. En ciertos aspectos, la primera proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) y la segunda proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) pueden unirse al mismo epítopo. Como alternativa, las proteínas de unión a antígeno primera y segunda (por ejemplo, anticuerpos) pueden unirse a diferentes, pero, por ejemplo, epítopos que solapan, en donde la unión a uno inhibe o bloquea la unión del segundo anticuerpo, por ejemplo, a través de impedimento estérico. La competición entre proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos) puede medirse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante ensayo de interferometría de biocapa sin etiquetas en tiempo real. La competición entre una primera proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, anticuerpo) se puede determinar midiendo la capacidad de una primera proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 inmovilizada (por ejemplo, anticuerpo) (inicialmente sin forma de complejo con la proteína TMPRSS2) para unirse a la proteína TMPRSS2 soluble en forma de complejo con una segunda proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, anticuerpo). Una reducción en la capacidad de la primera proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, anticuerpo) para unirse a la proteína TMPRSS2 en forma de complejo, respecto a la proteína TMPRSS2 sin forma de complejo, indica que la primera y la segunda proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, anticuerpos) compiten. El grado de competición puede expresarse como un porcentaje de la reducción en la unión. tal competición puede medirse usando un ensayo de interferometría de biocapa sin etiquetas en tiempo real, por ejemplo, en un biosensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.), ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas) o SPR (resonancia de plasmón superficial).
La competencia de unión entre proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, anticuerpos monoclonales (mAb)) puede determinarse usando un ensayo de interferometría de biocapa sin etiquetas en tiempo real en un biosensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Por ejemplo, para determinar la competencia entre dos anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 humanos, el mAb anti-TMPRSS2 puede capturarse primero en puntas de biosensores Octet revestidas de anticuerpos anti-hFc (Pall ForteBio Corp., N.° 18-5060) sumergiendo las puntas en una solución de mAb anti-TMPRSS2 humana (denominado posteriormente "mAb1").
Como un control positivo para el bloqueo, las puntas de biosensores capturados por anticuerpos, a continuación, pueden saturarse con un mAb de control de isotipo de bloqueo conocido (denominado posteriormente "mAb de bloqueo") mediante inmersión en una solución de mAb de bloqueo. Para determinar si mAb2 compite con mAbl, las puntas de biosensores pueden, a continuación, sumergirse en una solución en forma de co-complejo de polipéptido TMPRSS2 humano y un segundo mAb anti-TMPRSS2 humana (denominado posteriormente "mAb2"), que se ha preincubado durante un periodo de tiempo y puede determinarse la unión del mAbl al polipéptido TMPRSS2. Las puntas de biosensores pueden lavarse en tampón entre cada etapa del experimento. La respuesta de unión en tiempo real puede controlarse durante el curso del experimento y puede registrarse la respuesta de unión al final de cada etapa.
Por ejemplo, el ensayo de competición puede realizarse a 25 °C y pH de aproximadamente 7, por ejemplo, 7,4, por ejemplo, en presencia de tampón, sal, disolvente y una proteína no específica (por ejemplo, albúmina de suero bovino).
Normalmente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación que se modifica de alguna manera retiene la capacidad de unirse específicamente a TMPRSS2, por ejemplo, retiene al menos un 10 % de su actividad de unión a TMPRSS2 (cuando se compara con el anticuerpo parental) cuando esa actividad se expresa sobre una base molar. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación retiene al menos un 20 %, un 50 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % o más de la afinidad de unión a TMPRSS2 como el anticuerpo parental. También se pretende que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la divulgación pueda incluir sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas (denominadas "variantes conservativas o "variantes de función conservada" del anticuerpo) que no alteren sustancialmente su actividad biológica.
Una "variante" de un polipéptido, tal como una cadena de inmunoglobulina (por ejemplo, Vh, Vl, HC o LC de H1H7017N), se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 70-99,9 % (por ejemplo, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9 %) idéntica o similar a una secuencia de nucleótidos de referencia que se expone en el presente documento (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, 4, 17, 18 o 19); cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias correspondientes en toda la longitud de las secuencias de referencia correspondientes (por ejemplo, umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 3; coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; matriz BLOSUM 62; costes por hueco: existencia 11, extensión 1; ajuste de la matriz de puntuación composicional condicional).
Una "variante" de un polinucleótido se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 70-99,9 % (por ejemplo, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia que se expone en el presente documento (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o 3); cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en donde los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias correspondientes en toda la longitud de las secuencias de referencia correspondientes (por ejemplo, umbral esperado: 10; tamaño de palabra: 28; coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0; puntuaciones de coincidencia/falta de coincidencia: 1, -2; costes por hueco: lineal).
Las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención, pueden incluir una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que tiene al menos un 70 % (por ejemplo, un 80 %, un 85 %, un 90 %, 95 % o 99 %) de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, 17 o 19; y/o una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene al menos un 70 % (por ejemplo, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 99 %) de identidad de secuencia de aminoácidos con los aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 4 o 18.
Además, una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 variante puede incluir un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se expone en el presente documento, excepto por una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) mutaciones tales como, por ejemplo, mutaciones sin sentido (por ejemplo, sustituciones conservativas), mutaciones sin sentido, eliminaciones o inserciones. Por ejemplo, la presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno que incluyen una cadena ligera de una inmunoglobulina variante que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o 18 pero que tiene una o más de tales mutaciones y/o una cadena pesada de inmunoglobulina variante que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, 17 o 19 pero que tiene una o más de tales mutaciones. En un aspecto de la divulgación, una proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2 variante incluye una cadena ligera de inmunoglobulina variante que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 en donde una o más (por ejemplo, 1 o 2 o 3) de tales CDR tiene una o más de tales mutaciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) y/o una cadena pesada de inmunoglobulina variante que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 en donde una o más (por ejemplo, 1 o 2 o 3) de tales CDR tiene una o más de tales mutaciones (por ejemplo, sustituciones conservativas).
La divulgación proporciona adicionalmente proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2 variantes, por ejemplo, anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una o más CDR variantes (por ejemplo, una o más de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y/o CDR-H3) que se exponen en el presente documento con al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 %, un 99% o un 99,9 % de identidad de secuencia o similitud con, por ejemplo, la(s) SEQ ID NO: 12, 14, 16, 6, 8 y/o 10.
Algunos aspectos de la presente divulgación incluyen también proteínas de unión a antígeno variantes, por ejemplo, anticuerpos anti-TMPRSS2 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden Vh y Vl de inmunoglobulina; o HC y LC, que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene un 70 % o más (por ejemplo, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 97 % o un 99 %) de identidad de secuencia de aminoácidos global o de similitud con las secuencias de aminoácidos de las correspondientes Vh, Vl, HC o LC específicamente expuestas en el presente documento, pero en donde la CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, c Dr -H2 y CDR-H3 de tales inmunoglobulinas no son variantes y comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 12, 14, 16, 6, 8 y 10, respectivamente. Por tanto, en tales aspectos, las CDR dentro de proteínas de unión a antígeno variantes no son, en sí mismas, variantes.
Los anticuerpos anti-TMPRSS2 variantes modificados de forma conservativa y fragmentos de unión a antígeno de los mismos también se describen también en el presente documento. Una "variante modificada de forma conservativa" o una "sustitución conservativa" se refiere a una variante en donde hay una o más sustituciones de aminoácidos en un polipéptido con otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de cadena lateral, hidrofobicidad/hidrofilicidad, conformación y rigidez de la cadena principal, etc.). Tales cambios se pueden realizar con frecuencia sin alterar de manera significativa la actividad biológica del anticuerpo o fragmento. Los expertos en esta materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4a Ed.)). Además, las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidades de alterar la actividad biológica de manera significativa.
Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valinaleucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina. Como alternativa, un remplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345.
Las variantes de función conservativa de los anticuerpos anti-TMPRSS2 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos también se describen en el presente documento. Cualquiera de las variantes de los anticuerpos anti-TMPRSS2 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (como se analiza en el presente documento) pueden ser "variantes de función conservativa". Tales variantes de función conservativa pueden, en algunos casos, caracterizarse también como variantes modificadas de forma conservativa. "Variantes de función conservativa", como se usa en el presente documento, se refiere a variantes de los anticuerpos anti-TMPRSS2 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en los que uno o más restos de aminoácidos se han cambiado sin alterar significativamente una o más propiedades funcionales del anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, un anticuerpo anti-TMPRSS2 variante de función conservativa o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una secuencia de aminoácidos variante y mostrar una o más de las siguientes propiedades funcionales:
• Inhibe el crecimiento del virus de la gripe (por ejemplo, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)) en células que expresan TMPRSS2 (por ejemplo, células Calu-3);
• Se une a la superficie de células que expresan TMPRSS (por ejemplo, MDCK/Tet-on), por ejemplo, con un valor de CE50 de 440 pM o 1,06 nM, respectivamente;
• No se une significativamente a células MDCK/Tet-on que no expresan TMPRSS2;
• Se une a TMPRSS2 humana con una Kd de aproximadamente 2,81 x 10' 9 M a aproximadamente 25 °C;
• Se une a TMPRSS2 humana con una Kd de aproximadamente 9,31 x 10' 9 M a aproximadamente 37 °C;
• Se une a TMPRSS2 de cynomolgus con una Kd de aproximadamente 5,60 x 10' 8 M a aproximadamente 25 °C;
• Se une a TMPRSS2 de cynomolgus con una Kd de aproximadamente 1,40 x 10' 7 M a aproximadamente 37 °C;
• Limita la propagación de la infección por virus de la gripe (por ejemplo, mediante H1_PR34; H1_CA09; H1_Bris; virus de la gripe H9N2 o H3N2) de células, por ejemplo, Calu-3, in vitro; y/o
• Protege a un ratón modificado por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana de la muerte causada por la infección por virus de la gripe, por ejemplo, H1N1 o H3N2, por ejemplo, en donde se infecta a los ratones con una dosis del virus de otro modo letal, opcionalmente cuando se combina con un anticuerpo anti-HA.
La presente divulgación incluye un ratón modificado por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana que incluye, dentro del cuerpo del ratón, una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno) tal como H1H7017N y H4H7017N. Véase la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO2017/151453.
Una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 "neutralizante" o "antagonista", por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, se refiere a una molécula que inhibe una actividad de TMPRSS2 en cualquier grado detectable, por ejemplo, inhibe la actividad de proteasa de TMPRSS2, por ejemplo, de un sustrato tal como HA; Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (Sigma), donde Cbz es benciloxicarbonilo y AMC es 7-amino-4-metilcumarina; HA0 del virus de la gripe; proteína S de coronavirus; o TMPRSS2 precursora que se escinde autocatalíticamente entre Arg255 e Ile256 y/o inhibe la entrada del virus de la gripe en una célula y/o inhibe la reproducción del virus de la gripe en el cuerpo de un sujeto.
"H1H7017N" y "H4H7017N" se refieren a proteínas de unión a antígeno, tal como anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden la cadena pesada o Vh (o una variante de la misma) y la cadena ligera o Vl (o una variante de la misma) como se expone más adelante; o que comprende una Vh que comprende las CDR de la misma (CDR-H1 (o una variante de la misma), CDR-H2 (o una variante de la misma) y CDR-H3 (o una variante de la misma)) y una Vl que comprende las CDR de la misma (CDR-L1 (o una variante de la misma), CDR-L2 (o una variante de la misma) y CDR-L3 (o una variante de la misma)), por ejemplo, en donde las cadenas de inmunoglobulina, regiones variables y/o CDR comprenden las secuencias de aminoácidos específicas descritas más adelante.
"H1H7017N" o "H4H7017N" pueden referirse opcionalmente a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, 17 o 19 y CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 o 18.
"H1H7017N" o "H4H7017N" pueden referirse opcionalmente a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una Vh que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2; y una Vl que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.
"H1H7017N" puede referirse opcionalmente a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 17; y una inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
"H4H7017N" puede referirse opcionalmente a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 19; y una inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18. El término "H4H7017N" incluye también realizaciones en donde la Vh está fusionada con una IgG4 de tipo silvestre, por ejemplo, en donde el resto 108 es S.
Anticuerpo anti-TMRPS22 o fragmento de unión a antígeno H1H7017N y H4H7017N Región variable de cadena pesada de H1H7017N y H4H7017N (ADN)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGG
ATTCACCTTCAGTTCCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGGCTCGAGTGGGTGGCAGTTATAT
GGAATGATGGAAGTTATGTATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACATTTCCAAGAAC
ACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGGGAGTGGGT
ACTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
(SEQ ID NO: 1)
Región variable de cadena pesada de H4H7017N y H1H7017N (Polipéptido)
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVIWNDGSYVYYADSVKGRFTISRDISKN
TLFLQMNSLRAEDTAVYYCAREGEWVLYYFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 2)
Región variable de cadena ligera (ADN) de H4H7017N H1H7017N
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAG TCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATAAGGCGT CTACTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGC CTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAA GCTGGAGATCAAA
(SEQ ID NO: 3)
Región variable de cadena ligera de H4H7017N H1H7017N (Polipéptido)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS
LQPDDFATYYCQQYNSYSYTFGQGTKLEIK
(SEQ ID NO: 4)
CDR-H1 (ADN) de H1H7017N y H4H7017N
GGA TTC ACC TTC AGT TCC TAT GGC
(SEQ ID NO: 5)
CDR-H1 de H1H7017N y H4H7017N (Polipéptido)
G F T F S S Y G
(SEQ ID NO: 6 (o una variante de la misma que tiene 1, 2, 3 o 4 mutaciones puntuales y/o deleciones puntuales)) CDR-H2 (ADN) de H1H7017N y H4H7017N
ATA TGG AAT GAT GGA AGT TAT GTA
(SEQ ID NO: 7)
CDR-H2 de H1H7017N y H4H7017N (Polipéptido)
I W N D G S Y V
(SEQ ID NO: 8 (o una variante de la misma que tiene 1, 2, 3 o 4 mutaciones puntuales y/o deleciones puntuales)) CDR-H3 (ADN) de H1H7017N y H4H7017N
GCG AGA GAG GGG GAG TGG GTA CTT TAC TAC TTT GAC TAC
(SEQ ID NO: 9)
CDR-H3 de H1H7017N y H4H7017N (Polipéptido)
A R E G E W V L Y Y F D Y
(SEQ ID NO: 10 (o una variante de la misma que tiene 1, 2, 3 o 4 mutaciones puntuales y/o deleciones puntuales)) CDR-L1 (ADN) de H1H7017N y H4H7017N
CAG AGT ATT AGT AGC TGG
(SEQ ID NO: 11)
CDR-L1 de H1H7017N y H4H7017N (Polipéptido)
Q S I S S W
(SEQ ID NO: 12 (o una variante de la misma que tiene 1, 2, 3 o 4 mutaciones puntuales y/o deleciones puntuales)) CDR-L2 (ADN) de H1H7017N y H4H7017N
AAG GCG TCT
(SEQ ID NO: 13)
CDR-L2 de H1H7017N y H4H7017N (Polipéptido)
K A S
(SEQ ID NO: 14 (o una variante de la misma que tiene una mutación puntual y/o deleción puntual))
CDR-L3 (ADN) de H1H7017N y H4H7017N
CAA CAG TAT AAT AGT TAT TCG TAC ACT
(SEQ ID NO: 15)
CDR-L3 de H1H7017N y H4H7017N (Polipéptido)
Q Q Y N S Y S Y T
(SEQ ID NO: 16 (o una variante de la misma que tiene 1, 2, 3 o 4 mutaciones puntuales y/o deleciones puntuales)) H1H7017N
Cadena pesada de longitud completa-IgG1 humana
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVIWNDGSYVYYADSVKGRFTISRDISKN TLFLQMNSLRAEDTAVYYCAREGEWVLYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP CPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 17)
Cadena ligera de longitud completa-Kappa humana
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPDDFATYYCQQYNSYSYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 18)
H4H7017N
Cadena pesada de longitud completa-IgG4 (S108P) humana
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVIWNDGSYVYYADSVKGRFTISRDISKN TLFLQMNSLRAEDTAVYYCAREGEWVLYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPOSRSTSESTAALGCLVKDYFP EPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO: 19)
Cadena ligera de longitud completa-Kappa humana
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISS LQPDDFATYYCQQYNSYSYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO: 18)
Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación comprenden cadenas de inmunoglobulina que incluyen las secuencias de aminoácidos expuestas en el presente documento así como modificaciones postraduccionales celulares e in vitro del anticuerpo. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a TMPRSS2 que comprenden secuencias de aminoácidos de cadena pesada y/o ligera expuestas en el presente documento (por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y/o CDR-L3), así como anticuerpos y fragmentos en donde uno o más restos de aminoácidos está glucosilado, uno o más restos de Asn está desamidado, uno o más restos (por ejemplo, Met, Trp y/o His) está oxidado, la Gln del extremo N terminal es piroglutamato (pyroE) y/o la lisina del extremo C terminal está ausente.
En la presente invención, se proporciona una proteína de unión a antígeno que es una proteína de unión a antígeno humana que se une específicamente a TMPRSS2 humana y que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y en donde la proteína de unión a antígeno comprende:
una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende
(a) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8) y
(c) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (Se Q ID NO: 10); y
una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende
(a) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14) y
(c) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (Se Q ID NO: 16).
La presente invención proporciona también un recipiente (por ejemplo, un vial de plástico o vidrio, por ejemplo, con una tapa o una columna de cromatografía, aguja hueca o un cilindro de jeringuilla) que comprende una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 de la presente invención, por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N.
La presente divulgación también proporciona un dispositivo de inyección que comprende una o más proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno) que se une específicamente a TMPRSS2, por ejemplo, H4H7017N o H1H7017N o una composición farmacéutica de los mismos. El dispositivo de inyección puede envasarse en un kit. Un dispositivo de inyección es un dispositivo que introduce una sustancia en el cuerpo de un sujeto a través de una vía parenteral, por ejemplo, intramuscular, subcutánea o intravenosa. Por ejemplo, un dispositivo de inyección puede ser una jeringa (por ejemplo, precargada con la composición farmacéutica, tal como un autoinyector) que, por ejemplo, incluye un cilindro o barril para contener el fluido que se va a inyectar (por ejemplo, que comprende el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo), una aguja para unir la piel y/o los vasos sanguíneos para la inyección del fluido; y un émbolo para empujar el fluido fuera del cilindro y a través del orificio de la aguja. Un dispositivo de inyección que comprende una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de una combinación de la presente divulgación o una composición farmacéutica de la misma puede ser un dispositivo de inyección intravenosa (IV). Tal dispositivo puede incluir la proteína de unión a antígeno o una composición farmacéutica de la misma en una cánula o trocar/aguja que se puede fijar a un tubo que se puede fijar a una bolsa o depósito para contener líquido (por ejemplo, solución salina) introducido en el cuerpo del sujeto a través de la cánula o trocar/aguja. El anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo puede, en un aspecto de la divulgación, introducirse en el dispositivo una vez que el trocar y la cánula se insertan en la vena de un sujeto y el trocar se retira de la cánula insertada. El dispositivo intravenoso puede, por ejemplo, insertarse en una vena periférica (por ejemplo, en la mano o el brazo); la vena cava superior o la vena cava inferior o dentro de la aurícula derecha del corazón (por ejemplo, una vía IV central); o en una vena subclavia, yugular interna o una vena femoral y por ejemplo, hacerse avanzar hacia el corazón hasta alcanzar la vena cava superior o la aurícula derecha (por ejemplo, una línea venosa central). Un dispositivo de inyección puede ser un autoinyector; un inyector de chorro o una bomba de infusión externa. Un inyector de chorro utiliza un chorro estrecho de líquido a alta presión que penetra en la epidermis para introducir el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en el cuerpo de un sujeto. Las bombas de infusión externas son dispositivos médicos que suministran el anticuerpo o fragmento o una composición farmacéutica del mismo en el cuerpo de sujeto en cantidades controladas. Las bombas de infusión externas pueden accionarse eléctrica o mecánicamente. Las diferentes bombas funcionan de diferentes formas, por ejemplo, una bomba de jeringa contiene líquido en el depósito de una jeringa, y un pistón móvil controla el suministro de líquido, una bomba elastomérica contiene el líquido en un depósito de globo extensible y la presión de las paredes elásticas del globo impulsa el suministro de líquido. En una bomba peristáltica, un juego de rodillos aprieta un tramo de tubo flexible, empujando el líquido hacia adelante. En una bomba multicanal, los líquidos se pueden suministrar desde múltiples depósitos a múltiples velocidades. Los dispositivos de inyección de la presente invención comprenden una proteína de unión a antígeno de la presente invención. Un dispositivo de inyección de la invención puede comprender una composición de la invención. En una realización de la invención, el dispositivo de inyección comprende una composición farmacéutica de la invención.
La presente divulgación proporciona adicionalmente métodos para administrar una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 de la presente divulgación, por ejemplo, H4H7017N o H1H7017N, que comprenden introducir la proteína de unión a antígeno en el cuerpo de un sujeto (por ejemplo, un ser humano). Por ejemplo, el método comprende perforar el cuerpo del sujeto con una aguja de una jeringuilla e inyectar la proteína de unión a antígeno en el cuerpo del sujeto, por ejemplo, en la vena, arteria, tumor, tejido muscular o hipodermis del sujeto. En la presente invención, se proporciona una proteína de unión a antígeno de la invención para utilizar en un método para tratar o prevenir la infección con un virus de la gripe en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha proteína de unión a antígeno.
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos se conocen en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a TMPRSS2. Puede usarse un inmunógeno que comprenda uno cualquiera de los siguientes para generar anticuerpos para TMPRSS2. En ciertos aspectos de la divulgación, los anticuerpos de la divulgación se obtienen de ratones inmunizados con una TMPRSS2 nativa de longitud completa o con un virus vivo atenuado o inactivado o con ADN que codifica la proteína o fragmento de la misma. Como alternativa, la proteína TMPRSS2 o un fragmento de la misma puede producirse usando técnicas bioquímicas estándar y modificarse y usarse como inmunógeno. En un aspecto de la divulgación, el inmunógeno es una proteína TMPRSS2 o fragmento de la misma producida de forma recombinante. En ciertos aspectos de la divulgación, el inmunógeno puede ser una vacuna de polipéptidos de TMPRSS2. En ciertos aspectos, se pueden administrar una o más inyecciones de refuerzo. En ciertos aspectos, el inmunógeno puede ser un polipéptido de TMPRSS2 recombinante expresado en E. coli o en cualquier otra célula eucariota o de mamífero tal como las células de ovario de hámster chino (CHO).
Usando la tecnología VELOCIMMUNE® (véase, por ejemplo, el documento US 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, los anticuerpos quiméricos de alta afinidad de TMPRSS2 pueden aislarse inicialmente teniendo una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera humanas unidas operativamente a loci endógenos de regiones constantes de ratón de manera que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada y ligera humana. A continuación, el ADN puede expresarse en una célula capaz de expresar el anticuerpo totalmente humano.
Generalmente, un ratón VELOCIMMUNE® se desafía con el antígeno de interés y las células linfáticas (tal como los linfocitos B) se recuperan de los ratones que expresan los anticuerpos. Las células linfáticas se pueden fusionar con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales y dichas líneas celulares de hibridoma se detectan de manera sistemática y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones constantes isotípicas deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, El ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas puede aislarse directamente de linfocitos específicos de antígeno.
Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra SRA que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar un anticuerpo totalmente humano, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
Anticuerpos anti-TMPRSS2 que comprenden variantes de Fc
De acuerdo con ciertos aspectos de la presente divulgación, las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, se proporcionan comprendiendo un dominio Fc que comprende una o más mutaciones, que, por ejemplo, potencian o disminuyen la unión de anticuerpos al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-TMPRSS2 que comprenden una mutación en la región Ch2 o Ch3 del dominio Fc, en los que la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en el que el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Tales mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En un ejemplo, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 2591 (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428L (por ejemplo,T250Q y M428L); y una modificación 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P). En todavía otro caso, la modificación comprende una modificación en 265A (por ejemplo, D265A) y/o una modificación en 297A (por ejemplo, N297A).
Por ejemplo, la presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); 2571 y 3111 (por ejemplo, P257I y Q311I); 257I y 434H (por ejemplo, P257I y N434H); 376V y 434H (por ejemplo, D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (por ejemplo, T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F).
Las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprende una Vh y/o Vl como se expone en el presente documento comprendiendo cualesquiera combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anterior, se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.
La presente divulgación también incluye proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, que comprenden una Vh expuesta en el presente documento y una región constante de cadena pesada (Ch) quimérica, en donde la región Ch quimérica comprende segmentos derivados de las regiones Ch de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos pueden comprender una región Ch quimérica que comprende parte o todo el dominio Ch2 derivado de una IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio Ch3 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Los anticuerpos pueden comprender una región Ch quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (restos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, combinada con una secuencia "bisagra inferior" (restos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. Según determinados casos, la región bisagra quimérica comprende restos de aminoácidos derivados de una bisagra superior de IgG1 humana o IgG4 humana y restos de aminoácidos derivados de una bisagra inferior de IgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región Ch quimérica como se describe en el presente documento puede, en ciertos casos, exhibir funciones efectoras de Fc modificadas sin afectar negativamente a las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo. (Véase, por ejemplo, el documento WO2014/022540).
Inmunoconjugados
La divulgación abarca unas proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, conjugadas con otra fracción, por ejemplo, una fracción terapéutica (un "inmunoconjugado"), tal como un toxoide o un fármaco antivíri
fragmento anti-TMPRSS2 puede estar conjugado con cualquiera de los agentes terapéuticos adicionales expuestos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "inmunoconjugado" se refiere a una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, que está química o biológicamente unido a un agente radiactivo, una citocina, un interferón, una diana o fracción indicadora, una enzima, un péptido o proteína o un agente terapéutico. La proteína de unión a antígeno puede estar unida al agente radiactivo, citocina, interferón, diana o fracción indicadora, enzima, péptido o agente terapéutico en cualquier lugar a lo largo de la molécula siempre que sea capaz de unirse a su diana (TMPRSS2). Los ejemplos de inmunoconjugados incluyen conjugados anticuerpo-fármaco y proteínas de fusión anticuerpo-toxina. En un ejemplo, el agente puede ser un segundo anticuerpo diferente que se une específicamente a TMPRSS2. El tipo de fracción terapéutica que se puede conjugar con la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, anticuerpo o fragmento) tendrá en cuenta la afección a tratar y el efecto terapéutico deseado a lograr. Véanse, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 1984: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Anticuerpos multiespecíficos
La presente divulgación incluye proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, así como métodos de uso y métodos de fabricación de tales proteínas de unión a antígeno. La expresión proteínas de unión a antígeno "anti-TMPRSS2", por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, incluye moléculas multiespecíficas (por ejemplo, biespecíficas o biparatópicas) que incluyen al menos un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a TMPRSS2 (por ejemplo, un dominio de unión a antígeno de H1H7017N o H4H7017N) y al menos un segundo dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno diferente o a un epítopo en TMPRSS2 que es diferente al del primer dominio de unión a antígeno (por ejemplo, HA de la gripe tal como un dominio de unión a antígeno de H1H14611N2, H1H14612N2 o H1H11729P). Opcionalmente, el primer y segundo epítopos pueden solapar. Como alternativa, el primer y segundo epítopos no solapan. Por ejemplo, en una realización de la invención, un anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG biespecífico (por ejemplo, IgG1 o IgG4) que incluye un primer dominio de unión a antígeno que se une específicamente a TMPRSS2 que incluye la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de H1H7017N o H4H7017N y un segundo dominio de unión a antígeno que se une específicamente a HA de la gripe (que comprende una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina diferente tal como de H1H14611N2, H1H14612N2 o H1H11729P).
"H1H7017N" incluye unas moléculas multiespecíficas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, que incluye las HCDR y LCDR, Vh y Vl o HC y LC de H1H7017N (incluyendo las variantes de las mismas como se expone en el presente documento).
"H4H7017N" incluye unas moléculas multiespecíficas, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, que incluye las HCDR y LCDR, Vh y Vl o HC y lC de H4H7017N (incluyendo las variantes de las mismas como se expone en el presente documento).
En una realización de la invención, un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a TMPRSS, que puede incluirse en una molécula multiespecífica, comprende:
(1)
(i) una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6, CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 y CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10 y (ii) una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12, CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 y CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16;
o
(2)
(i) una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y
(ii) una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4;
o
(3)
(i) una secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 o 19 y
(ii) una secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En una realización de la invención, el anticuerpo o fragmento multiespecífico incluye más de dos especificidades de unión (por ejemplo, una molécula triespecífica), por ejemplo, uno o más dominios de unión a antígeno adicionales que son los mismos o diferentes del primer y/o segundo dominio de unión a antígeno.
Por ejemplo, una molécula multiespecífica puede comprender, además de un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TMPRSS2, un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a HA de la gripe tomada de un anticuerpo selecciona del grupo que consiste en: H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P H1H11820N; H1H11829N; I H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2 ; H1H11903N; H1H14571N H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2 H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2 H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B H1H18098B H1H18099B H1H18100B H1H18101B H1H18102B H1H18103B H1H18104B H1H18105B H1H18107B H1H18108B H1H18109B H1H18110B H1H18111B H1H18112B H1H18113B H1H18114B H1H18115B H1H18116B H1H18117B H1H18118B H1H18119B H1H18120B H1H18121B H1H18122B H1H18123B H1H18124B H1H18125B H1H18126B H1H18127B H1H18128B H1H18129B H1H18130B H1H18131B H1H18132B H1H18133B H1H18134B H1H18135B H1H18136B H1H18137B H1H18138B H1H18139B H1H18140B H1H18141B H1H18142B H1H18143B H1H18144B H1H18145B H1H18146B H1H18147B H1H18148B H1H18149B H1H18150B H1H18151B H1H18152B H1H18153B H1H18154B H1H18155B H1H18156B H1H18157B H1H18158B H1H18159B H1H18160B H1H18161B H1H18162B H1H18163B H1H18164B H1H18165B H1H18166B H1H18167B H1H18168B H1H18169B H1H18170B H1H18171B H1H18172B H1H18173B H1H18174B H1H18175B H1H18176B H1H18177B H1H18178B H1H18179B H1H18180B H1H18181B H1H18182B H1H18183B H1H18184B H1H18185B H1H18186B H1H18187B H1H18188B H1H18189B H1H18190B H1H18191B H1H18192B H1H18193B H1H18194B H1H18195B H1H18196B H1H18197B H1H18198B H1H18199B H1H18200B H1H18201B H1H18202B H1H18203B H1H18204B H1H18205B H1H18206B H1H18207B H1H18208B H1H18209B H1H18210B H1H18211B H1H18212B H1H18213B H1H18214B H1H18216B H1H18217B H1H18218B H1H18219B H1H18220B H1H18221B H1H18222B H1H18223B H1H18224B H1H18225B H1H18226B H1H18227B H1H18228B H1H18229B H1H18230B H1H18231B H1H18232B H1H18233B H1H18234B H1H18235B H1H18236B H1H18237B H1H18238B H1H18239B H1H18240B H1H18241B H1H18242B H1H18243B H1H18244B H1H18245B H1H18246B H1H18247B H1H18248B H1H18249B H1H18250B H1H18251B H1H18252B H1H18253B H1H18254B H1H18255B H1H18256B H1H18257B H1H18258B H1H18259B H1H18261B H1H18262B H1H18263B H1H18264B H1H18265B H1H18266B H1H18267B H1H18268B H1H18269B H1H18270B H1H18271B H1H18272B H1H18274B H1H18275B H1H18276B H1H18277B H1H18278B H1H18279B H1H18280B H1H18281B H1H18282B H1H18283B H1H18284B H1H18285B H1H18286B H1H18287B H1H18288B H1H18289B H1H18290B H1H18291B H1H18292B H1H18293B H1H18294B H1H18295B H1H18297B H1H18298B H1H18299B H1H18300B H1H18301B H1H18302B H1H18303B H1H18304B H1H18305B H1H18306B H1H18307B H1H18308B H1H18309B H1H18310B H1H18311B H1H18312B H1H18313B H1H18314B H1H18315B H1H18316B H1H18317B H1H18318B H1H18319B H1H18320B H1H18321B H1H18322B H1H18323B H1H18324B H1H18325B H1H18326B H1H18327B H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; y H1H18335B como se establece en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO2016/100807 (por ejemplo, las CDR-H, Vh o cadena pesada de las mismas; y las CDR-L, Vl o cadena pesada de las mismas).
Una molécula multiespecífica puede comprender, además de un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TMPRSS2, un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína HA grupo II de la gripe, por ejemplo, que comprende Vh y Vl de H1H14611N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 24 y 28); o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y c Dr -H3 de H1H14611N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 25-27) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H14611N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 29-31).
Una molécula multiespecífica puede comprender, además de un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TMPRSS2, un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína HA grupo II de la gripe, por ejemplo, que comprende Vh y Vl de H1H14612N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 40 y 44); o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y c Dr -H3 de H1H14612N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 41-43) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H14612N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 45-47).
Una molécula multiespecífica puede comprender, además de un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a TMPRSS2, un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a la proteína HA grupo I de la gripe, por ejemplo, que comprende Vh y Vl de H1H11729P (por ejemplo, las SEQ ID NO: 32 y 36); o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de H1H11729P (por ejemplo, las SEQ ID NO: 33-35) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H11729P (por ejemplo, las SEQ ID NO: 37-39).
En un aspecto de la divulgación, un fragmento de unión a antígeno biespecífico comprende un primer scFv (por ejemplo, que comprende Vh y Vl de H1H7017N o H4H7017N) que tiene especificidad de unión por un primer epítopo (por ejemplo, TMPRSS2) y un segundo scFv (por ejemplo, que comprende Vh y Vl de un anticuerpo anti-HA de la gripe) que tiene especificidad de unión por un segundo epítopo diferente. Por ejemplo, en un aspecto de la divulgación, el primer y segundo scFv están ligados con un enlazador, por ejemplo, un enlazador peptídico (por ejemplo, un enlazador GS tal como (GGGGS)n (SEQ ID NO: 48) en donde n es, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10). Otros fragmentos de unión a antígeno biespecíficos incluyen un F(ab)2 de un anticuerpo IgG biespecífico que comprende las CDR de cadenas pesada y ligera de H1H7017N o H4H7017N y de otro anticuerpo que se une a un epítopo diferente.
Métodos terapéuticos
La presente divulgación proporciona métodos para tratar o prevenir una infección vírica o un cáncer (por ejemplo, cáncer de próstata) mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N) a un sujeto (por ejemplo, un ser humano) en necesidad de tal tratamiento o prevención. En la presente invención, se proporciona una proteína de unión a antígeno de la invención para utilizar en un método para tratar o prevenir la infección con un virus de la gripe en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha proteína de unión a antígeno.
La infección por virus de la gripe puede tratarse o prevenirse, en un sujeto, mediante la administración de una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 de la presente invención a un sujeto. Los virus de la gripe se clasifican en los tipos A, B y C basándose en sus proteínas centrales. Los subtipos de virus de la gripe A están determinados por las glucoproteínas de la envuelta que poseen actividad de hemaglutinina (HA) o de neuraminidasa (NA). Hay varios subtipos de HA (por ejemplo, HA1, HA2, HA3, HA4, HA5, HA6, HA7, HA8, HA9, HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15, HA16, HA17 o HA18; estos subtipos pueden designarse como H1, H2, H3, etc.) y subtipos de NA (por ejemplo, NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7, NA8, NA9, NA10 o NA11; estos subtipos pueden designarse como N1, N2, N3, etc.) del virus de la gripe A que se utilizan para designar el subtipo de la gripe A. Por ejemplo, El virus de la gripe A H1N1 y H3N2 son patógenos humanos comúnmente conocidos. Los seres humanos se infectan comúnmente por virus de los subtipos H1, H2 o H3 y N1 o N2. La presente divulgación incluye métodos para tratar o prevenir la infección con un subtipo de virus de la gripe analizado en el presente documento. Los anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a TMPRSS2, en un aspecto de la divulgación, también se unen a HA y/o a NA, por ejemplo, de un subtipo expuesto en el presente documento.
Una dosis eficaz o terapéuticamente eficaz de la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), para tratar o prevenir una infección vírica se refiere a la cantidad del anticuerpo o fragmento suficiente para aliviar uno o más signos y/o síntomas de la infección en el sujeto tratado, ya sea induciendo la regresión o eliminación de dichos signos y/o síntomas o inhibiendo la progresión de tales signos y/o síntomas. La cantidad de dosis puede variar dependiendo de la edad y el tamaño de un sujeto a recibir la administración, enfermedad diana, afecciones, vía de administración y similares. En una realización de la invención, una dosis eficaz o terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, para tratar o prevenir una infección vírica, por ejemplo, en un sujeto humano adulto, es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 200 mg/kg, por ejemplo, hasta aproximadamente 150 mg/kg. En una realización de la invención, la dosificación es de hasta aproximadamente 10,8 u 11 gramos (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 gramos). Dependiendo de la gravedad de la infección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En ciertas realizaciones, la proteína de unión a antígeno de la presente invención puede administrarse en una dosis inicial, seguida de una o más dosis secundarias. En ciertas realizaciones, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en donde las dosis posteriores están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un mamífero (por ejemplo, rata, ratón, gato, perro, vaca, oveja, caballo, cabra, conejo), preferentemente, un ser humano, por ejemplo, en necesidad de prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno tal como una infección vírica o un cáncer. El sujeto puede tener una infección vírica, por ejemplo, una infección de gripe o estar predispuesto a desarrollar una infección. Los sujetos predispuestos a desarrollar una infección o los sujetos que pueden estar en riesgo elevado de contraer una infección (por ejemplo, del virus de la gripe), incluyen sujetos con sistemas inmunitarios comprometidos debido a una enfermedad autoinmunitaria, sujetos que reciben terapia inmunosupresora (por ejemplo, tras un trasplante de órgano), sujetos afectados por el síndrome de inmunodeficiencia humana (VIH) o el síndrome de deficiencia inmune adquirida (SIDA), sujetos con formas de anemia que disminuye o destruye glóbulos blancos de la sangre, sujetos que reciben radiación o quimioterapia o sujetos afectados por un trastorno inflamatorio. Adicionalmente, los sujetos muy jóvenes (por ejemplo, 5 años de edad o más jóvenes) o de edad avanzada (por ejemplo, 65 años de edad o mayores) están en riesgo aumentado. Además, un sujeto puede estar en riesgo de contraer una infección vírica debido a la proximidad de un brote de la enfermedad, por ejemplo, el sujeto reside en una ciudad densamente poblada o muy cerca de sujetos que tienen infecciones confirmadas de un virus o la sospecha de las mismas o cambia de empleo, por ejemplo, un trabajador de hospital, investigador farmacéutico, viajero a un área infectada o pasajero de avión frecuente.
"T ratar" o "que se trata" significa administrar una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), a un sujeto que tiene uno o más signos o síntomas de una enfermedad o infección, por ejemplo, infección vírica, para la que la proteína de unión a antígeno es eficaz cuando se administrarse al sujeto en una cantidad o dosis eficaz o terapéuticamente eficaz (como se analiza en el presente documento).
La presente divulgación también abarca la administración de una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 profilácticamente, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), a un sujeto que está en riesgo de una infección vírica de manera que se previene tal infección. La inmunoprofilaxis pasiva basada en anticuerpos ha demostrado ser una estrategia eficaz para prevenir al sujeto de una infección vírica. Véanse, por ejemplo, Berry etal., Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis. Influenza Res Treat. 2014; 2014:267594. Epub 22 de septiembre de 2014; y Jianqiang et al., Passive immune neutralization strategies for prevention and control of influenza A infections, Immunotherapy. Febrero de 2012; 4(2): 175-186; Prabhu et al., Antivir Ther. 2009; 14(7):911-21, Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenza. "prevenir" o "que previene" significa administrar una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), a un sujeto para inhibir la manifestación de una enfermedad o infección (por ejemplo, infección vírica) en el cuerpo de un sujeto, para la que la proteína de unión a antígeno es eficaz cuando se administrarse al sujeto en una cantidad o dosis eficaz o terapéuticamente eficaz (como se analiza en el presente documento).
En una realización de la invención, un signo o síntoma de una infección vírica en un sujeto es la supervivencia o proliferación de virus en el cuerpo del sujeto, por ejemplo, como se determina mediante un ensayo de título vírico (por ejemplo, propagación del virus de la gripe en huevos fertilizados de pollo o ensayo de hemaglutinación del virus de la gripe). En el presente documento se discuten otros signos y síntomas de infección vírica.
La presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir una infección vírica (por ejemplo, infección por virus de la gripe o por coronavirus) o para inducir la regresión, eliminación o inhibición de la progresión de al menos un signo o síntoma de infección vírica, tal como:
Fiebre o sensación de fiebre/escalofríos;
Tos;
Dolor de garganta;
Rinorrea o congestión nasal;
Estornudos;
Dolores muscular o corporales;
Dolores de cabeza;
Cansancio (fatiga);
vómitos;
diarrea;
infección del tracto respiratorio;
molestias en el pecho;
dificultad para respirar;
bronquitis; y/o
neumonía,
que es un signo o síntoma secundario de infección vírica, en un sujeto que lo necesite (por ejemplo, un ser humano), mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N) al sujeto, por ejemplo, mediante la inyección de la proteína en el cuerpo del sujeto.
La presente divulgación incluye también métodos para tratar o prevenir el cáncer, por ejemplo, cáncer metastásico, por ejemplo, cáncer de próstata (por ejemplo, que se caracteriza por la expresión de una fusión de TMPRSS2:ERG), cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer del tracto urinario, cáncer de mama, cáncer de ovario, adenocarcinoma de próstata, carcinoma de células renales, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón y/o mesotelioma pleural, en un sujeto, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína de unión a antígeno TMPRSS2 (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N) al sujeto, por ejemplo, mediante la inyección de la proteína en el cuerpo del sujeto. En un aspecto de la divulgación, se administra también al sujeto la proteína de unión a antígeno TMPRSS2 en asociación con un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente terapéutico contra el cáncer. En un aspecto de la divulgación, el cáncer es un tumor cuyas células expresan TMPRSS2 o una variante de la misma.
Combinaciones y composiciones farmacéuticas
Para preparar composiciones farmacéuticas de las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), se mezcla la proteína de unión a antígeno con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Véanse, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. (1984); Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nueva York, Nueva York; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott, Williams y Wilkins, Nueva York, Nueva York; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, Nueva York; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, Nueva York; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, Nueva York; Weiner y Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York. En la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente, un agente terapéutico adicional. En una realización de la invención, la composición farmacéutica es estéril. Tales composiciones son parte de la presente invención.
El alcance de la presente divulgación incluye composiciones desecadas, por ejemplo, criodesecadas, que comprenden unas proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N) o una composición farmacéutica de las mismas que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable pero que sustancialmente carece de agua.
En un aspecto adicional de la divulgación, un agente terapéutico adicional que se administra a un sujeto en asociación con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), desvelado en el presente documento se administra al sujeto de acuerdo con la Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57a edición (1 de noviembre de 2002)).
El modo de administración puede variar. Las vías de administración incluyen oral, rectal, transmucosa, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutánea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular, inhalación, insuflación, tópica, cutánea, transdérmica o intraarterial.
La presente divulgación proporciona métodos para administrar una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), que comprende introducir la proteína en el cuerpo de un sujeto. Por ejemplo, el método comprende perforar el cuerpo del sujeto con una aguja de una jeringuilla e inyectar la proteína de unión a antígeno en el cuerpo del sujeto, por ejemplo, en la vena, arteria, tumor, tejido muscular o hipodermis del sujeto.
La presente divulgación proporciona también un recipiente (por ejemplo, un vial de plástico o vidrio, por ejemplo, con una tapa o una columna de cromatografía, aguja hueca o un cilindro de jeringuilla) que comprende cualquiera de las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), polipéptidos (por ejemplo, un HC, LC, Vh o Vl de H1H7017N o H4H7017N) o polinucleótidos o vectores expuestos en el presente documento o una composición farmacéutica de los mismos que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los dispositivos de inyección de la presente invención comprenden una proteína de unión a antígeno de la presente invención. Un dispositivo de inyección de la invención puede comprender una composición de la invención. En una realización, el dispositivo de inyección comprende una composición farmacéutica de la invención.
Una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), puede estar en asociación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, el agente terapéutico adicional puede ser un fármaco antivírico y/o una vacuna. Como se usa en el presente documento, la expresión "fármaco antivírico" se refiere a cualquier terapia o fármaco antiinfeccioso que se utiliza para tratar, prevenir o mejorar una infección vírica en un sujeto. La expresión "fármaco antivírico" incluye, pero no se limita a un antimicrobiano esteroide catiónico, leupeptina, aprotinina, amantadina, rimantadina, oseltamivir, zanamivir, ribavirina o interferón-alfa2b. Los métodos para tratar o prevenir la infección por virus (por ejemplo, gripe) en un sujeto que necesita dicho tratamiento o prevención mediante la administración de H17017N o H4H7017N en asociación con un agente terapéutico adicional, son parte de la presente divulgación.
Por ejemplo, el agente terapéutico adicional puede ser una vacuna, por ejemplo, una vacuna de la gripe. Opcionalmente, una vacuna es una vacuna de virus inactivados/muertos, una vacuna de virus vivos atenuados o una vacuna de subunidades de virus.
Por ejemplo, el agente terapéutico adicional puede ser:
Figure imgf000027_0001
(mesilato de camostat);
Figure imgf000028_0001
(mesilato de nafamostat);
Figure imgf000028_0002
(clorhidrato de bromhexina (BHH));
Figure imgf000028_0003
(clorhidrato de fluoruro de 4-(2-aminometil)bencenosulfonilo (AEBSF));
Figure imgf000028_0004
o
Figure imgf000029_0001
(poliamida). Véase Shen et al. Biochimie 142: 1-10 (2017).
Opcionalmente, el fármaco antivírico es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente al virus de la gripe, por ejemplo, HA de la gripe. Por ejemplo, el anticuerpo anti-HA puede ser uno cualquiera de H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N: H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2 H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B H1H17956B ; H1 H17957B ; H1 H17958B ; H1 H17959B H1H17960B ; H1 H17961B ; H1 H17962B H1H17963B H1H17964B ; H1 H17965B ; H1 H17966B ; H1 H17967B H1H17968B ; H1 H17969B ; H1 H17970B H1H17971B H1H17972B ; H1 H17973B ; H1 H17974B ; H1 H17975B H1H17976B ; H1 H17977B ; H1 H17978B H1H17979B H1H17980B ; H1 H17981B ; H1 H17982B ; H1 H17983B H1H17984B ; H1 H17985B ; H1 H17986B H1H17987B H1H17988B ; H1 H17989B ; H1 H17990B ; H1 H17991B H1H17992B ; H1 H17993B ; H1 H17994B H1H17995B H1H17996B ; H1 H17997B ; H1 H17998B ; H1 H17999B H1H18000B ; H1 H18001B ; H1 H18002B H1H18003B H1H18004B ; H1 H18005B ; H1 H18006B ; H1 H18007B H1H18008B ; H1 H18009B ; H1 H18010B H1H18011B H1H18012B ; H1 H18013B ; H1 H18014B ; H1 H18015B H1H18016B ; H1 H18017B ; H1 H18018B H1H18019B H1H18020B ; H1 H18021B ; H1 H18022B ; H1 H18023B H1H18024B ; H1 H18025B ; H1 H18026B H1H18027B H1H18028B ; H1 H18029B ; H1 H18030B ; H1 H18031B H1H18032B ; H1 H18033B ; H1 H18034B H1H18035B H1H18037B ; H1 H18038B ; H1 H18039B ; H1 H18040B H1H18041B ; H1 H18042B ; H1 H18043B H1H18044B H1H18045B ; H1 H18046B ; H1 H18047B ; H1 H18048B H1H18049B ; H1 H18051B ; H1 H18052B H1H18053B H1H18054B ; H1 H18055B ; H1 H18056B ; H1 H18057B H1H18058B ; H1 H18059B ; H1 H18060B H1H18061B H1H18062B ; H1 H18063B ; H1 H18064B ; H1 H18065B H1H18066B ; H1 H18067B ; H1 H18068B H1H18069B H1H18070B ; H1 H18071B ; H1 H18072B ; H1 H18073B H1H18074B ; H1 H18075B ; H1 H18076B H1H18077B H1H18078B ; H1 H18079B ; H1 H18080B ; H1 H18081B H1H18082B ; H1 H18083B ; H1 H18084B H1H18085B H1H18086B ; H1 H18087B ; H1 H18088B ; H1 H18089B H1H18090B ; H1 H18091B ; H1 H18092B H1H18093B H1H18094B ; H1 H18095B ; H1 H18096B ; H1 H18097B H1H18098B ; H1 H18099B ; H1 H18100B H1H18101B H1H18102B ; H1 H18103B ; H1 H18104B ; H1 H18105B H1H18107B ; H1 H18108B ; H1 H18109B H1H18110B H1H18111B ; H1 H18112B ; H1 H18113B ; H1 H18114B H1H18115B ; H1 H18116B ; H1 H18117B H1H18118B H1H18119B ; H1 H18120B ; H1 H18121B ; H1 H18122B H1H18123B ; H1 H18124B ; H1 H18125B H1H18126B H1H18127B ; H1 H18128B ; H1 H18129B ; H1 H18130B H1H18131B ; H1 H18132B ; H1 H18133B H1H18134B H1H18135B ; H1 H18136B ; H1 H18137B ; H1 H18138B H1H18139B ; H1 H18140B ; H1 H18141B H1H18142B H1H18143B ; H1 H18144B ; H1 H18145B ; H1 H18146B H1H18147B ; H1 H18148B ; H1 H18149B H1H18150B H1H18151B ; H1 H18152B ; H1 H18153B ; H1 H18154B H1H18155B ; H1 H18156B ; H1 H18157B H1H18158B H1H18159B ; H1 H18160B ; H1 H18161B ; H1 H18162B H1H18163B ; H1 H18164B ; H1 H18165B H1H18166B H1H18167B ; H1 H18168B ; H1 H18169B ; H1 H18170B H1H18171B ; H1 H18172B ; H1 H18173B H1H18174B H1H18175B ; H1 H18176B ; H1 H18177B ; H1 H18178B H1H18179B ; H1 H18180B ; H1 H18181B H1H18182B H1H18183B ; H1 H18184B ; H1 H18185B ; H1 H18186B H1H18187B ; H1 H18188B ; H1 H18189B H1H18190B H1H18191B ; H1 H18192B ; H1 H18193B ; H1 H18194B H1H18195B ; H1 H18196B ; H1 H18197B H1H18198B H1H18199B ; H1 H18200B ; H1 H18201B ; H1 H18202B H1H18203B ; H1 H18204B ; H1 H18205B H1H18206B H1H18207B ; H1 H18208B ; H1 H18209B ; H1 H18210B H1H18211B ; H1 H18212B ; H1 H18213B H1H18214B H1H18216B ; H1 H18217B ; H1 H18218B ; H1 H18219B H1H18220B ; H1 H18221B ; H1 H18222B H1H18223B H1H18224B ; H1 H18225B ; H1 H18226B ; H1 H18227B H1H18228B ; H1 H18229B ; H1 H18230B H1H18231B H1H18232B ; H1 H18233B ; H1 H18234B ; H1 H18235B H1H18236B ; H1 H18237B ; H1 H18238B H1H18239B H1H18240B ; H1 H18241B ; H1 H18242B ; H1 H18243B H1H18244B ; H1 H18245B ; H1 H18246B H1H18247B H1H18248B ; H1 H18249B ; H1 H18250B ; H1 H18251B H1H18252B ; H1 H18253B ; H1 H18254B H1H18255B H1H18256B ; H1 H18257B ; H1 H18258B ; H1 H18259B H1H18261B ; H1 H18262B ; H1 H18263B H1H18264B H1H18265B ; H1 H18266B ; H1 H18267B ; H1 H18268B H1H18269B ; H1 H18270B ; H1 H18271B H1H18272B H1H18274B H1H18275B H1H18276B H1H18277B H1H18278B H1H18279B H1H18280B H1H18281B H1H18282B H1H18283B H1H18284B H1H18285B H1H18286B H1H18287B H1H18288B H1H18289B H1H18290B H1H18291B H1H18292B H1H18293B H1H18294B H1H18295B H1H18297B H1H18298B H1H18299B H1H18300B H1H18301B H1H18302B H1H18303B H1H18304B H1H18305B H1H18306B H1H18307B H1H18308B H1H18309B H1H18310B H1H18311B H1H18312B H1H18313B H1H18314B H1H18315B H1H18316B H1H18317B H1H18318B H1H18319B H1H18320B H1H18321B H1H18322B H1H18323B H1H18324B H1H18325B H1H18326B H1H18327B H1H18328B H1H18329B H1H18330B H1H18331B H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; o H1H18335B; como se establece en la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO2016/100807; o un fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, en donde el anticuerpo o fragmento comprende una inmunoglobulina de cadena ligera que incluye CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 (por ejemplo, la cadena Vl o ligera de la misma); y una cadena pesada que incluye CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 (por ejemplo, la Vh o cadena pesada de la misma) de cualquiera de los anticuerpos anti-HA de la gripe anteriores.
Un agente terapéutico adicional puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a la proteína HA grupo II de la gripe, tal como H1H14611N2; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Vh y Vl de H1H14611N2; o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de H1H14611N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 25-27) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H14611N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 29-31). "H1H14611N2" se refiere a cualquier anticuerpo anti-HA grupo II que comprende tales secuencias.
H1H14611N2
Región variable de cadena pesada
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGFSMNWVRQVPGKGLEWVSSISTSGNYMYYADSVKGRFTISRDNAKK
SFSLQMNSLRAEDSAIYYCARGGGYNWNLFDYWGQGSLVTVSS (SEQ ID NO: 24)
CDR-H1: GFTFSGFS (SEQ ID NO: 25)
CDR-H2: ISTSGNYM (SEQ ID NO: 26) CDR-H3: ARGGGYNWNLFDY (SEQ ID NO: 27)
Región variable de cadena ligera
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP
DRFSGSGSGTDFTLTITRLESEDFAVYYCQQYGNSPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 28)
CDR-L1: QSLNSNY (SEQ ID NO: 29)
CDR-L2: GAS (SEQ ID NO: 30)
CDR-L3: QQYGNSPLT (SEQ ID NO: 31)
Un agente terapéutico adicional puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a la proteína HA grupo II de la gripe, tal como H1 H14612N2; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Vh y Vl de H1H14612N2; o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de H1H14612N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 41-43) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H14612N2 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 45-47). "H1H14612N2" se refiere a cualquier anticuerpo anti-HA grupo II que comprende tales secuencias.
H1H14612N2
Región variable de cadena pesada
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSGFSMNWVRQAPGKGLEWVSSISTSGNYMYY
ADSVKGRFTISRDNAKKSFSLQMNSLRAEDSAIYYCARGGGYNWNLFDYWGQGSLVTVSS (SEQ ID NO: 40)
CDR-H1: GFSFSGFS (SEQ ID NO: 41)
CDR-H2: ISTSGNYM (SEQ ID NO: 42)
CDR-H3: ARGGGYNWNLFDY (SEQ ID NO: 43)
Región variable de cadena ligera
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP
DRFSGSGSGADFTLTISRLESEDFAVYYCQQYGNSPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 44)
CDR-L1: QSLNSNY (SEQ ID NO: 45)
CDR-L2: GAS (SEQ ID NO: 46)
CDR-L3: QQYGNSPLT (SEQ ID NO: 47)
Un agente terapéutico adicional puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une a la proteína HA grupo I de la gripe, tal como H1H11729P; o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende Vh y Vl de H1H11729P; o una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de H1H11729P (por ejemplo, las SEQ ID NO: 33-35) y una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de H1H11729P (por ejemplo, las SEQ ID NO: 37-39). "H1H11729P" se refiere a cualquier anticuerpo anti-HA grupo I que comprende tales secuencias.
H1H11729P
Región variable de cadena pesada
Figure imgf000031_0001
CDR-H1: GGTFSSYA (SEQ ID NO: 33)
CDR-H2: IIPIFGTP (SEQ ID NO: 34)
CDR-H3: ARQQPVYQYNMDV (SEQ ID NO: 35)
Región variable de cadena ligera
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLGWYQQKPLKAPKRLIYAASSLQSGVPS
RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQYNNYPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 36)
CDR-L1: QGIRNN (SEQ ID NO: 37) CDR-L2: AAS (SEQ ID NO: 38)
CDR-L3: LQYNNYPWT (SEQ ID NO: 39)
Opcionalmente, el agente terapéutico adicional no es amantadina, rimantadina, oseltamivir, zanamivir, aprotinina, leupeptina, un antimicrobiano esteroideo catiónico, una vacuna de la gripe (por ejemplo, una vacuna de virus enteros muertos, vivos, atenuados o de subunidades) o un anticuerpo contra el virus de la gripe (por ejemplo, un anticuerpo anti-hemaglutinina).
La expresión "en asociación con" indica que los componentes, una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, junto con otro agente tal como oseltamivir, pueden formularse en una sola composición, por ejemplo, para suministro simultáneo o formularse por separado en dos o más composiciones (por ejemplo, un kit). Cada componente se puede administrar a un sujeto en un momento diferente al momento cuando se administra el otro componente; por ejemplo, cada administración puede administrarse de forma no simultánea (por ejemplo, por separado o secuencialmente) a intervalos durante un período de tiempo determinado. Además, los componentes separados pueden administrarse a un sujeto por la misma o diferente vía (por ejemplo, en donde un anticuerpo anti-TMPRSS2 o fragmento de unión a antígeno del mismo).
Kits
Se proporcionan además kits que comprenden uno o más componentes que incluyen, pero no están limitados a, una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se analiza en el presente documento (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), en asociación con uno o más componentes adicionales que incluyen, aunque no de forma limitativa, un agente terapéutico adicional, como se analiza en el presente documento. La proteína de unión a antígeno y/o el agente terapéutico adicional puede formularse como una composición única o por separado en dos o más composiciones, por ejemplo, con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en una composición farmacéutica. En la presente invención, se proporciona un kit que comprende una proteína de unión a antígeno de la invención y un agente terapéutico adicional, en donde el kit comprende la proteína de unión a antígeno y el agente terapéutico adicional formulado como una composición única o por separado en dos o más composiciones.
En un ejemplo, el kit incluye una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N) o una composición farmacéutica del mismo en un recipiente (por ejemplo, en un vial de vidrio o plástico estéril) y un agente terapéutico adicional en otro recipiente (por ejemplo, en un vial de vidrio o plástico estéril).
En otro caso, el kit comprende una combinación descrita en el presente documento, que incluye una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N) o composición farmacéutica del mismo en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales formulados juntos, opcionalmente, en una composición farmacéutica, en un solo envase común.
Si el kit incluye una composición farmacéutica para administración parenteral a un sujeto, el kit puede incluir un dispositivo (por ejemplo, un dispositivo de inyección) para realizar tal administración. Por ejemplo, el kit puede incluir una o más agujas hipodérmicas u otros dispositivos de inyección como se analizó anteriormente, conteniendo la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N).
El kit puede incluir un prospecto que incluya información sobre las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación del kit. Generalmente, dicha información ayuda a los pacientes y médicos a usar las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación adjuntas de manera eficaz y segura. Por ejemplo, la siguiente información sobre una combinación de la invención se puede proporcionar en el prospecto: farmacocinética, farmacodinámica, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosis, dosis y administración adecuadas, cómo suministrarlo, condiciones adecuadas de almacenamiento, referencias, información sobre el fabricante/distribuidor e información sobre patentes.
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N), pueden utilizarse para detectar y/o medir TMPRSS2 en una muestra. Los ensayos ilustrativos para TMPRSS2 pueden incluir, por ejemplo, poner en contacto una muestra con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 de la invención, en donde la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 se marca con un marcador detectable o molécula indicadora o se usa como un ligando de captura para aislar selectivamente la TMPRSS2 de las muestras. La presencia de una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 en forma de complejo con TMPRSS2 indica la presencia de TMPRSS2 en la muestra. Como alternativa, un anticuerpo anti-TMPRSS2 sin marcar puede usarse junto con un anticuerpo secundario que en sí está marcado de manera detectable. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; una fracción fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos ilustrativos específicos que pueden usarse para detectar o medir TMPRSS2 en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Por tanto, en el presente documento se describe un método para detectar la presencia de polipéptido TMPRSS2 en una muestra que comprende poner en contacto la muestra con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 y detectar la presencia de una proteína de unión a antígeno TMPRSS/anti-TMPRSS2, en donde la presencia del complejo indica la presencia de TMPRSS2.
La presente divulgación incluye métodos de ELISA basados en células que utilizan las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención (por ejemplo, H1H7017N), para detectar la presencia de TMPRSS2 en una célula. Opcionalmente, el método incluye las etapas:
(i) poner en contacto células inmovilizadas en una superficie sólida (por ejemplo, una microplaca) para analizar la presencia de TMPRSS2 con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 de la presente invención;
(ii) opcionalmente lavar la mezcla para eliminar la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 no unida;
(iii) poner en contacto la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 con un anticuerpo secundario marcado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2;
(iv) opcionalmente lavar el complejo para eliminar la proteína de unión a antígeno no unida; y
(v) detectar la presencia del marcador en el anticuerpo secundario o fragmento, en donde la detección del marcador indica que las células contienen TMPRSS2. Por ejemplo, la presente divulgación incluye tales métodos ELISA basados en células para identificar células TMPRSS2+ en una muestra.
Una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 de la invención (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N) puede utilizarse en una transferencia Western o procedimiento de inmunotransferencia de proteínas para detectar la presencia de TMPRSS2 o un fragmento de la misma en una muestra. Tal procedimiento forma parte de la presente divulgación e incluye las etapas de, por ejemplo:
(1) proporcionar una membrana u otro sustrato sólido que comprende una muestra para analizar la presencia de TMPRSS2, por ejemplo, incluyendo opcionalmente la etapa de transferir proteínas de una muestra para analizar la presencia de TMPRSS2 (por ejemplo, de una separación electroforética PAGE o SDS-PAGE de las proteínas en la muestra) a una membrana u otro sustrato sólido usando un método conocido en la técnica (por ejemplo, transferencia semiseca o transferencia en tanque); y poner en contacto la membrana u otro sustrato sólido para analizar la presencia de TMPRSS2 o un fragmento de la misma con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 de la invención.
Tal membrana puede adoptar la forma, por ejemplo, de una membrana basada en nitrocelulosa o vinilo (por ejemplo, fluoruro de polivinilideno (PVDF)) en la que se analizarán las proteínas que se van a probar para determinar la presencia de TMPRSS2 en un gel de PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) no desnaturalizante o gel de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) se han transferido (por ejemplo, después de la separación electroforética en el gel). Antes de poner en contacto la membrana con la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2, la membrana se bloquea opcionalmente, por ejemplo, con leche en polvo desnatada o similar para unir sitios de unión a proteínas inespecíficos en la membrana. (2) lavar la membrana una o más veces para eliminar el la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 no unida y otras sustancias no unidas; y
(3) detectar la proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2.
La detección de la proteína de unión a antígeno indica que la proteína TMPRSS2 está presente en la membrana o sustrato y en la muestra. La detección de la proteína de unión a antígeno se puede realizar uniendo la proteína de unión a antígeno con un anticuerpo secundario (un anticuerpo anti-inmunoglobulina) que está marcado de manera detectable y a continuación, detectando la presencia del marcador del anticuerpo secundario.
Las proteínas de unión a antígeno anti-TMPRSS2 (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, H1H7017N o H4H7017N)) desvelados en el presente documento pueden utilizarse también para inmunohistoquímica. Tal método forma parte de la presente divulgación y comprende, por ejemplo,
(1) poner en contacto un tejido para analizar la presencia de la proteína TMPRSS2 con una proteína de unión a antígeno anti-TMPRSS2 de la invención; y
(2) detectar la proteína de unión a antígeno sobre o en el tejido.
Si la proteína de unión a antígeno en sí está marcada de manera detectable, puede detectarse directamente. Como alternativa, la proteína de unión a antígeno puede unirse mediante un anticuerpo secundario marcado de forma detectable en donde después se detecta el marcador.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados, la temperatura ambiente es de aproximadamente 25 °C y la presión es o está cerca de la atmosférica.
Ejemplo 1: Replicación multiciclo in vitro.
Se evaluó la capacidad del virus de la gripe, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP, para replicarse en células Calu3, A549, MDCK y HepG2.
Tabla 1. Reactivos utilizados.
Figure imgf000033_0001
continuación
Figure imgf000034_0002
Procedimiento experimental
Las células Calu-3 (ATCC HTB55), células A549 (ATCC CCL-185), células MDCK (IRR FR-58) y células HepG2 (ATCC HB-8065) se diluyeron a 40.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en medio DMEM:F12 con SBF al 5 %. Al día siguiente, se preparó A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) que transporta un gen indicador GFP en el segmento NS (B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 22 junio de 2010; 107(25): 11531-6) en una MOI (multiplicidad de infección) de 0,1 y 0,01 en DMEM:F12 con low IgG BSA después de tres lavados. El virus se incubó en las células durante 1 h a 37 °C, después se retiró el virus y los pocillos se lavaron tres veces más. El número de células infectadas se cuantificó a las 24, 48, 72 y 142 h tras la infección en un analizador CTL-ImmunoSpot® S6 Universal Analyzer (Cellular Technology Limited, Cleveland, Ohio).
Sumario de resultados y conclusiones
Calu-3 es una línea celular de epitelio de vías respiratorias humana inmortalizada que se ha demostrado que permite la replicación multiciclo de virus de la gripe humana en ausencia de tripsina exógena (Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007)). Además, se ha demostrado que las células Calu-3 expresan tanto TMPRSS2 como TMp Rs S4, pero no TMp Rs S11d (HAT), al menos al nivel del ARNm (Bottcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). Para confirmar que las células Calu-3 pueden apoyar la activación proteolítica del virus de la gripe poseyendo hemaglutinina con un sitio de escisión monobásica, se analizó el crecimiento de un virus indicador H1N1 GFP en células Calu-3 y se comparó la replicación en el tiempo con células de A549 (epitelial basal alveolar humano), MDCK (riñón canino Madin-Darby) y HepG2 (carcinoma de hígado humano) en ausencia de tripsina. Las células se infectaron con una MOI baja, en el punto temporal indicado, se determinaron los títulos víricos contando los puntos de foco fluorescente. La Tabla 2 y la Figura 1 muestran niveles bajos de infección en células A549, MDCK y HepG2, si bien las células Calu-3 muestran titulaciones aumentadas significativamente en cada punto temporal. Aunque se ha demostrado que las células Calu-3 expresan TMPRSS2 y TMPRSS4 al nivel de ARNm, la atenuación de TMPRSS2 redujo los títulos del virus de la gripe en 100 a 1.000 veces (Bottcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptideconjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). El nivel bajo de títulos víricos en las células A549, MDCK y HepG2 en ausencia de tripsina se debe probablemente a la adición de virus escindidos (recogidos de huevos fertilizados de pollo o de cultivo de MDCK con tripsina), pero la presencia de otra proteasa activadora de HA podría ser una explicación.
Tabla 2. Número de células infectadas representado por las unidades de foco fluorescentes (UFF) en días diferentes tras la infección con una MOI de 0,1 o 0,01 en diferentes tipos celulares tras la infección con ________________________________ A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP.________________________________
MOI 0,1 MOI 0,01 Línea celular
Figure imgf000034_0001
UFF UFF
1 697 54
2 1167 201 Calu3
3 1644 376
4 1530 500
(continuación)
Línea celular Día(s) tras la infección MOI 0,1 MOI 0,01
UFF UFF
1 238 35
2 238 46
A549
3 258 53
4 228 52
1 740 77
2 750 60 MDCK
3 879 58
4 796 53
1 3 1
2 14 9 HepG2
3 20 13
4 21 20
Referencias
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosóme for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 27733646.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID:25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID:26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bottcher-Friebertshauser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), Mayo;88(9):4744-51.doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. Octubre de 2006;80(19):9896-8. PMID: 16973594.
10. B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 22 de junio de 2010; 107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Ejemplo 2 : El anticuerpo H1H7017N anti-TMPRSS2 bloquea la propagación de la gripe in vitro.
Se evaluó la capacidad de diversos anticuerpos para reducir los títulos del virus de la gripe A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) en células Calu-3.
Tabla 3. Reactivos utilizados.
Figure imgf000036_0001
Procedimiento experimental
Se diluyeron células Calu-3 (ATCC HTB55) a 40.000 células/pocillo en una placa de 96 pocilios en medio DMEM:F12 con SBF al 5 %. Al día siguiente, los anticuerpos monoclonales se diluyeron a 166,7 nM en DMEM:F12 con low IgG BSA y se añadieron a las células durante 3 h a 37 °C y CO2 al 5 %. La solución de mAb se retiró y se infectaron las células con A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) en una MOI de 0,001. El virus se incubó en las células durante 1 h a 37 °C en CO2 al 5 %, después se retiró el virus y el medio se reemplazó con DMEM:F12 que contenía mAb 166,7 nM. Después de 24 h y 48 h, se reemplazó el medio con medio fresco que contenía mAb y las células se lavaron dos veces con PBS a las 72 h. A continuación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS y se detectó el virus utilizando el anticuerpo primario anti-NP en una dilución 1:1000. Las células se incubaron durante 1 h y a continuación, se lavaron y se añadió el secundario en una dilución 1:2000. El número de células infectadas se cuantificó en un analizador CTL-ImmunoSpot® S6 Universal Analyzer (Cellular Technology Limited, Cleveland, Ohio).
Sumario de resultados y conclusiones
Calu-3 es una línea celular de epitelio de vías respiratorias humana inmortalizada que se ha demostrado que permite la replicación multiciclo de virus de la gripe humana en ausencia de tripsina exógena (Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. noviembre de 2007; 81 (22): 12439-49). Además, se ha demostrado que las células Calu-3 expresan tanto TMPRSS2 como TMPRSS4, pero no TMPRSS11D (HAT), al menos al nivel del ARNm (Bottcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptideconjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). Se ha demostrado previamente que las células Calu-3 soportan la activación proteolítica del virus de la gripe, pero la inhibición de TMPRSS2 utilizando el anticuerpo monoclonal específico de TMPRSS2, H1H7017N, se analizó en el presente documento. Se analizó el crecimiento de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) durante 72 h después de tratar las células con H1H7017N 166.7 nM. Se determinaron los títulos víricos contando los puntos de foco fluorescente. La Tabla 4 y la Figura 2 mostraron disminución de títulos después del tratamiento con el anticuerpo H1H7017N. Aunque se ha demostrado que las células Calu-3 expresan TMPRSS2 y TMPRSS4 al nivel de ARNm, la atenuación de TMPRSS2 redujo los títulos del virus de la gripe en 100 a 1.000 veces (Bottcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). El nivel bajo de los títulos víricos existentes en las células en ausencia de mAb se debieron probablemente a la adición de virus escindidos (recogidos de huevos fertilizados de pollo o de cultivo de MDCK con tripsina), pero la presencia de otra proteasa activadora de HA podría también explicar la presencia de virus a pesar del tratamiento con mAb anti-TMPRSS2.
Tabla 4. La aplicación de H1H7017N durante el ciclo de infección disminuye el número de unidades de foco ___________fluorescente (UFF) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) a las 72 horas tras la infección.___________
Tratamiento Descripción UFF
H1H7017N mAb anti-TMPRSS2 259
H1H11729P Control positivo anti-gripe A grupo 1 18
anti-hlgG4 con un Fc de IgG2a de ratón Control de isotipo de IgG1 2338
Sin mAb Control de infección 2656
Sin infectar Control de fondo 6
Referencias
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosóme for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 27733646.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID:25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID:26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bottcher-Friebertshauser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), Mayo;88(9):4744-51.doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. Octubre de 2006;80(19):9896-8. PMID: 16973594.
10. B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 22 de junio de 2010; 107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Ejemplo 3: Análisis FACS con células MDCK/Tet-on, MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 y MDCK/Tet-on/MfTMPRSS2.
Se evaluó la capacidad del anticuerpo anti-TMPRSS2, H1H7017N, para unirse a células MDCK que expresan TMPRSS2 o que no expresan TMPRSS2.
Tabla 5. Reactivos utilizados.
Figure imgf000037_0001
continuación
Figure imgf000038_0001
Procedimiento experimental
Las líneas celulares se desarrollaron para expresar TMPRSS2 humana y de mono cynomolgus (hTMPRSS2 y mfTMPRSS2) en células MDCK (riñón canino Madin-Darby) tras la inducción con doxiciclina. Las células MDCK se transdujeron para expresan de manera estable una proteína transactivadora controlada por tetraciclina modificada (Clontech) y la línea celular resultante se denominó línea celular MDCK/Tet-on. La línea celular MDCK/Tet-on se transdujo con un constructo que contiene hTMPRSS2 (NP_005647.3 con una V160M) o mfTMPRSS2 (Ref seq XP_015302311.1 con S129L, N251S, I415V, R431Q, D492G) bajo el control de un promotor inducible y las líneas celulares se denominaron MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 y MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2. Las líneas celulares estables se mantuvieron en medios de crecimiento que contenían DMEM suplementado con SBF al 10 %, piruvato de sodio, penicilina/estreptomicina/glutamina, 500 pg/ml de G418 con o sin 2 pg/ml de puromicina.
Para el análisis de unión a células mediante citometría de flujo, se sembraron células en medios de crecimiento y se incubaron con doxiciclina en 1 pg/ml durante 16 horas para inducir la expresión de TMPRSS2. Las células se separan utilizando Accutase y se resuspendieron en SBF al 1 % en PBS. Los anticuerpos se diluyeron en serie desde 50o nM a 25 pM y cada concentración de anticuerpo se incubó con 1 X 106 células a 4 °C durante 30 minutos. Se incluyó una condición donde no se añadió anticuerpo a las células. Después de la incubación con anticuerpos primarios, las células se tiñeron con anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con aloficocianina a 1:1000 a 4 °C durante 30 minutos. Las células se fijaron utilizando BD CytoFixTM y se analizaron utilizando un citómetro de flujo CytoFLEX. Los controles sin teñir y de anticuerpo secundario solo se incluyeron también para todas líneas celulares. Los valores de la media geométrica de fluorescencia para células viables se determinaron utilizando el software FlowJo y los resultados se analizaron utilizando regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con el software Prism 7 (GraphPad) para obtener valores de CE50 de unión a células por los anticuerpos.
Como se muestra en la Figura 3, el anticuerpo anti-hTMPRSS2 de la invención, H1H7017N, unido a MDCK/Teton/hTMPRSS2 y MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2 con valores de CE50 de 460 pM y 1,06 nM respectivamente. H1H7017N no mostró unión significativa a células MDCK/Tet-on. El Control mAb1, un anticuerpo de control de isotipo irrelevante, no mostró unión a ninguna de las líneas celulares analizadas.
Ejemplo 4: Cinéticas de unión de Biacore de anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 que se unen a diferentes reactivos de TMPRSS2 medidos a 25 °C y 37 °C.
La constante de disociación (KD) de equilibrio para diferentes reactivos de unión de TMPRSS2 a anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 purificados se determinó utilizando una resonancia de plasmón superficial en tiempo real basada en un biosensor Biacore 4000. Todos los estudios de unión se realizaron en HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, tampón de ejecución pH 7,4 (HBS-ET) a 25 °C y 37 °C. La superficie del chip del sensor Biacore CM5 se derivatizó primero mediante acoplamiento de aminas con el anticuerpo policlonal específico de conejo anti-Fc de ratón (GE Healthcare N.° de cat. BR100838) para capturar anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2. Se realizaron estudios de unión en el dominio extracelular de TMPRSS2 humana expresado con un marcador del extremo C terminal myc-mic-hexahistidina (hTMPRSS2.mmh) y dominio extracelular de TMPRSS2 de mono expresado con un marcador del extremo C terminal myc-mic-hexahistidina (mfTMPRSS2.mmh). Se prepararon primero diferentes concentraciones de HMM-hTMPRSS2 y HMM-mfTMPRSS2 (100 nM - 6,25 nM; dilución en serie de 4 veces) en tampón de ejecución HBS-ET y se inyectaron sobre la superficie de anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 capturados de Fc antirratón durante 2,5 minutos a un caudal de 30 ^l/minuto, al tiempo que la disociación de anticuerpo monoclonal unido al reactivo de TMPRSS2 se controló durante 7 minutos en tampón de ejecución HBS-ET. La tasa de asociación (ka) y la tasa de disociación (kd) se determinaron mediante el ajuste de los sensogramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el software de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. La constante de equilibrio de disociación de unión (KD) y la semivida disociativa (t%) se calcularon a partir de las tasas cinéticas como:
Kd (M) = S y ™ N n ) = SÍ
Los parámetros de las cinéticas de unión para la unión de HMM-hTMPRSS2 o HMM-mfTMPRSS2 a diferentes anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 de la invención a 25 ° C y 37 ° C se muestran en las Tablas 6 a 9.
A 25 °C, los anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 se unieron a HMM-hTMPRSS2 con un valor de KD de 2,81 nM, como se muestra en la Tabla 6. A 37 °C, los anticuerpos monoclonales anti-HMM-hTMPRSS2 se unieron a HMM-hTMPRSS2 con un valor de KD de 9,31 nM, como se muestra en la Tabla 7.
A 25 °C, los anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 se unieron a HMM-mfTMPRSS2 con un valor de KD de 56,0 nM, como se muestra en la Tabla 8. A 37 °C, los anticuerpos monoclonales anti-TMPRSS2 se unieron a HMM-mfTMPRSS2 con un valor de KD de 140 nM, como se muestra en la Tabla 9.
Proteínas TMPRSS2
hTMPRSS2 knob_mmh (W106-R255).mmh:
aminoácidos 1-150: aminoácidos 106 a 255 de TMPRSS2 humana (número de registro NP_005647.3 con una V160M)
Aminoácidos: 151-178: marcador myc-myc-hexahistidina
WKFMGSKCSNSGIECDSSGTCINPSNWCDGVSHCPGGEDENRCVRLYGPNFILQMYSSQRKSWHPVCQDDWNENYGR
AACRDMGYKNNFYSSQGIVDDSGSTSFMKLNTSAGNVDIYKKLYHSDACSSKAWSLRCIACGVNLNSSRQSREQKL
ISEEDLGGEQKLISEEDLHHHHHH
(SEQ ID NO: 20; marcadores myc subrayados, marcador His6 doblemente subrayado)
mfTMPRSS2 knob_mmh (W106-R255).mmh:
Aminoácidos 1-150: aminoácidos 106-255 de TMPRSS2 de mono (número de registro XP_005548700.1 con S129L, N251S)
Aminoácidos 151-178: marcador myc-myc-hexahistidina
WKFMGSKCSDSGIECDSSGTCISLSNWCDGVSHCPNGEDENRCVRLYGPNFILQVYSSQRKSWHPVCRDDWNENYAR
AACRDMGYKNSFYSSQGIVDNSGATSFMKLNTSAGNVDIYKKLYHSDACSSKAWSLRCIACGVRSNLSRQSREQKL
ISEEDLGGEQKLISEEDLHHHHHH
(SEQ ID NO: 21; marcadores myc subrayados, marcador His6 doblemente subrayado)
Resultados
Tabla 6. Parámetros de cinéticas de unión de la unión de HMM-hTMPRSS2 a anticuerpos monoclonales TMPRSS2 a 25 °C.
Figure imgf000039_0001
Tabla 7. Parámetros de cinéticas de unión de la unión de HMM-hTMPRSS2 a anticuerpos monoclonales TMPRSS2 a 37 °C.
Figure imgf000040_0001
Tabla 8. Parámetros de cinéticas de unión de la unión de HMM-mfTMPRSS2 a anticuerpos monoclonales TMPRSS2 a 25 °C.
Figure imgf000040_0002
Tabla 9. Parámetros de cinéticas de unión de la unión de HMM-mfTMPRSS2 a anticuerpos monoclonales MSR1 a 37 °C.
Figure imgf000040_0003
Ejemplo 5: Propagación de la gripe in vitro de las cepas de gripe H1, H3 y Gripe B.
En este ejemplo, se determinó la capacidad de diversos tipos de gripe para propagarse en un cultivo in vitro de células Calu-3 y el efecto de anticuerpos anti-TMPRSS2 sobre esta propagación.
Tabla 10. Reactivos utilizados números de lote.
Figure imgf000040_0004
Procedimiento experimental
Se sembraron células Calu-3 a 40.000 células/pocillo en una placa de 96 pocilios en medio DMEM:F12 con SBF al 5 %. Al día siguiente, las cepas de virus de la gripe se diluyeron en una MOI determinada previamente (véase la Tabla 11) y los anticuerpos se diluyeron a 100 |jg/ml. En estos experimentos, los anticuerpos anti-HA y anti-TMPRSS2 tuvieron diferentes mecanismos de acción, por tanto, el procedimiento experimental fue diferente para estos anticuerpos con el fin de someterlos a prueba adecuadamente. Los anticuerpos anti-HA se preincubaron con una cepa del virus de la gripe individual durante una hora a 37 °C en una placa separada. Después del período de preincubación, la mezcla de anticuerpo/virus se añadió a las células Calu-3 durante una hora. El anticuerpo anti-TMPRSS2 se preincubó con células Calu-3 sin infectar durante tres horas a 37 °C. Después del período de preincubación, se añadió virus a las células Calu-3 preincubadas con anticuerpos anti-TMPRSS2 durante una hora. Después de la infección de una hora de duración, las células se lavaron tres veces con PBS y el anticuerpo nuevo se añadió junto con medio nuevo, a cada pocillo. Se añadió anticuerpo adicional a las 24 y 48 horas tras la infección. A las 72 horas tras la infección, las células se tiñeron con un anti-NP y se cuantificaron en un CTL-ImmunoSpot® S6 Universal Analyzer (Cellular Technology Limited, Cleveland, Ohio).
T l 11A. Ex rim n 1.
Figure imgf000041_0002
T l 11B. Ex rim n 2.
Figure imgf000041_0003
Sumario de resultados y conclusiones
Calu-3 es una línea celular de epitelio de vías respiratorias humana inmortalizada que se ha demostrado que permite la replicación multiciclo de virus de la gripe humana en ausencia de tripsina exógena (Zeng et al., Journal of Virology 81: 12439-12449 (2007)). Además, se ha demostrado que las células Calu-3 expresan TMPRSS2 (Bottcher-Friebertshauser et al., Journal of Virology 85: 1554-1562 (2011)) que es esencial para estos experimentos dado que se está ensayando un anticuerpo anti-TMPRSS2. En estos experimentos, ya sea o no H1H7017N, un anticuerpo dirigido contra TMPRSS2, puede prevenir la propagación en diferentes cepas de gripe. Además, se ejecutó el anticuerpo anti-HA correspondiente para las diferentes cepas como control positivo. Como cabía esperar, hubo una infección inicial en presencia del anticuerpo anti-TMPRSS2, pero H1H7017N previno satisfactoriamente la propagación de la infección de H1_PR34, H1_CA09, H1_Bris, H9N2 y H3N2. Esto puede observarse examinando las diferencias en el número de células infectadas entre las células tratadas con anti-TMPRSS2 y los controles infectados (Tabla 12). Se concluyó que el anticuerpo anti-TMPRSS2 no fue capaz de prevenir la propagación en las cepas de gripe B debido a que el número de células en los pocillos de control y tratados fue el mismo. En comparación, los anticuerpos anti­ HA se preincubaron con el virus y previnieron la infección inicial. Esto puede observarse también al comparar el número de células infectadas. Se realizó un recuento de células infectadas en la máquina de CTL y se notifican en las tablas a continuación.
T l 12A. Ex rim n 1.
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
Referencias
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosóme for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bottcher-Friebertshauser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 22 de junio de 2010;107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 7 de junio de 2010. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Ejemplo 6 : El efecto del tratamiento con H1H7017N solo en ratones humanizados TMPRS22.
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-TMPRSS2 para proteger a ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana de la infección con el virus de la gripe H1N1.
Tabla 13. Reactivos utilizados números de lote.
Figure imgf000042_0002
Tabla 14. ID de los clones de mAb.
Figure imgf000042_0003
Procedimiento experimental
Estos experimentos se realizaron en ratones modificados por ingeniería genética machos y hembras de 5-8 semanas de edad para expresar la proteína TMPRSS2 humana. Los ratones se desafiaron con 150 unidades formadoras de placa (UFP) de H1N1. Los ratones se sedaron con 200 pl de ketamina:xilacina (12 mg/ml:0,5 mg/ml) a través de inyección intraperitoneal y a continuación, se infectaron con 20 pl de virus vía intranasal. Los anticuerpos se administraron por vía subcutánea (SC) un día antes de la infección o por vía intravenosa (IV) varios días tras la infection (PI). La dosificación de anticuerpos varió entre experimentos (Tabla 15). Los pesos corporales se recogieron diariamente hasta el día 14 PI y los ratones se sacrificaron cuando perdieron el 20 % de su peso corporal inicial. Los resultados se notifican como porcentaje de supervivencia.
Tabla 15A. Dosificación de anticuer os Ex erimento 1.
Figure imgf000043_0004
Tabla 15B. Dosificación de anticuer os Ex erimento 2.
Figure imgf000043_0003
Sumario de resultados y conclusiones
Se ha demostrado que los ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana se pueden infectar con una dosis letal de gripe. El objetivo de estos experimentos fue demostrar que H1H7017N puede proteger a ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana contra la gripe A grupo 1. El anticuerpo se ensayó en modelos profilácticos y terapéuticos. El tratamiento con H1H7017N dio como resultado una supervivencia mayor que los ratones tratados con el control de isotipo (H1H1238N) en ambos experimentos (Figuras 4 y 5). En el experimento profiláctico, la supervivencia fue de un 0 % en ratones tratados con H1H1238N, un 85,7 % para ratones tratados el día -1 PI y de un 100 % para ratones tratados el día 0 PI con H1H7017N. Para el modelo terapéutico, el grupo tratado con H1H1238N dio como resultado un 25 % de supervivencia, si bien los grupos tratados con H1H7017N el día 0-3 PI dio como resultado un 100 % de supervivencia. Los resultados se resumen en la Tabla 16. H1H7017N muestra eficacia en los ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana.
Tabla 16A. Sumario de datos tabulados Ex erimento 1.
Figure imgf000043_0001
Tabla 16B. Sumario de datos tabulados Ex erimento 2.
Figure imgf000043_0002
Referencias
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosóme for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bottcher-Friebertshauser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 22 de junio de 2010; 107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 7 de junio de 2010. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Ejemplo 7 : Actividad del mAb anti-TMPRSS2, H1H7017N, en el modelo de ratón humanizado TMPRSS2.
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos anti-TMPRSS2 para proteger un ratón modificado por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana de la infección con el virus de la gripe H3N2.
Tabla 17. ID de los clones de mAb.
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Tabla 18. Reactivos utilizados números de lote.
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Procedimiento experimental
Se desafiaron ratones modificados por ingeniería genética machos y hembras de once semanas de edad para expresar la proteína TMPRSS2 humana con 20.000 unidades formadoras de placa (UFP) de H3N2. Los ratones se sedaron con 200 |jl de ketamina:xilacina (12 mg/ml:0,5 mg/ml) a través de inyección intraperitoneal y a continuación, se infectaron con 20 j l de virus vía intranasal. El día 1 o día 2 tras la infección (PI), se inyectó a los ratones con anticuerpo por vía intravenosa. Los ratones se pesaron y observaron diariamente hasta el día 14 tras la infección (PI). Se sacrificaron cuando perdieron un 25 % del peso corporal inicial.
Sumario de resultados y conclusiones
La amplitud es una cualidad importante cuando se considera una terapia de gripe. Se ha demostrado ya que el anticuerpo anti-TMPRSS2 H1H7017N fue eficaz contra la gripe A grupo 1. El objetivo de este experimento fue demostrar que H1H7017N puede proteger a ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana contra la gripe A grupo 2. Se infectaron ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana con una dosis letal de H3N2 y se trataron el día 1 o día 2 PI. Ambos grupos de tratamiento tuvieron tasas de supervivencia mayores que el control infectado. Los ratones tratados el día 1 PI tuvieron una tasa de supervivencia de un 100 %, que fue mayor que el grupo tratado el día 2 PI que tuvo una supervivencia de un 50 %, si bien los ratones sin tratar tuvieron una supervivencia de un 0 %. Todos los ratones murieron entre los días 5-6 PI. El gráfico de supervivencia se muestra en la Figura 6 y el % de supervivencia se resume en la Tabla 19. Estos resultados demuestran que H1H7017 mejoró los resultados en un modelo letal de H3N2.
Tabla 19. Sumario de datos tabulados.
Figure imgf000045_0001
Referencias
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bóttcher-Friebertshauser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 22 junio de 2010; 107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 7 de junio de 2010. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Ejemplo 8: Infección de ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana (frente al TS).
Se evaluó la supervivencia de ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana infectados con el virus de la gripe H1N1 y se comparó con la de los ratones de tipo silvestre (TS).
Tabla 20. Reactivos utilizados números de lote.
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Procedimiento experimental
El experimento se realizó en ratones modificados por ingeniería genética machos y hembras de 7,5-8 semanas de edad para expresar la proteína TMPRSS2 humana o en compañeros de camada de tipo silvestre. Se desafiaron ratones con 150, 750 o 1.500 unidades formadoras de placa (u Fp ) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1). Los ratones se sedaron con 200 pl de ketamina:xilacina (12 mg/ml:0,5 mg/ml) a través de inyección intraperitoneal y a continuación, se infectaron con 20 pl de virus vía intranasal. Los pesos corporales se recogieron diariamente hasta el día 14 PI y los ratones se sacrificaron cuando perdieron el 20 % de su peso corporal inicial. Los resultados se notifican como porcentaje de supervivencia (Figura 7).
Sumario de resultados y conclusiones
Se generaron ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana con el fin de ensayar la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-TMPRSS2 en un modelo de gripe in vivo. En este experimento, se compararon las tasas de supervivencia de los ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana y de los ratones de tipo silvestre infectados con 150, 750 o 1.500 de UFP de la cepa H1N1. La supervivencia fue de un 0 % para los ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana y para los ratones de tipo silvestre en los tres grupos de infección. Todos los ratones murieron entre el día 5 y el día 8 P i, muriendo antes los que recibieron una dosis de virus mayor que los que recibieron una dosis de virus menor. Los patrones de supervivencia de los ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana fueron similares a los ratones de tipo silvestre. Esto muestra que los ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana pueden utilizarse como modelo de gripe in vivo para evaluar la eficacia de los anticuerpos específicos de TMPRSS2. Véase la Tabla 21.
Tabla 21. Sumario de datos tabulados.
Figure imgf000046_0001
Referencias
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bóttcher-Friebertshauser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 22 de junio de 2010;107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 7 de junio de 2010. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Ejemplo 9: El efecto del tratamiento con la combinación de H1H14611N2 y H1H7017N en ratones tras la infección con H3N2.
Se evaluó la capacidad de una combinación de anticuerpos anti-TMPRSS2 y anticuerpos anti-gripe para proteger a ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana de la infección con el virus de la gripe H3N2.
Tabla 22. ID de los clones de mAb.
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Tabla 23. Reactivos utilizados números de lote.
Figure imgf000047_0002
Procedimiento experimental
Se desafiaron ratones modificados por ingeniería genética machos y hembras de ocho semanas de edad para expresar la proteína TMPRSS2 humana con 20.000 unidades formadoras de placa (UFP) de A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/p R/8/34, Re*assorted X-31 (H3N2). Los ratones se sedaron con 200 pl de ketamina:xilacina (12 mg/ml:0,5 mg/ml) a través de inyección intraperitoneal y a continuación, se infectaron con 20 pl de virus vía intranasal. El día 4 tras la infección (PI), se inyectó a los ratones con anticuerpo por vía intravenosa. Los pesos corporales se recogieron diariamente hasta el día 14 PI y los ratones se sacrificaron cuando perdieron el 25 % de su peso corporal inicial. Los resultados se notifican como porcentaje de supervivencia.
Sumario de resultados y conclusiones
Se ha demostrado que, individualmente, el anticuerpo TMPRSS2, H1H7017N y el anticuerpo de gripe A grupo 2 general, H1H14611N2, tienen eficacia terapéutica contra un desafío letal para ratones con una cepa histórica de H3N2. Se ha demostrado también que la supervivencia de ratones infectados con un desafío de H1N1 letal puede aumentar significativamente después del tratamiento con menos anticuerpo total que solo por la combinación de H1H7017N y el anticuerpo de gripe A grupo 1 general, H1H11729P. El objetivo para este experimento fue evaluar el efecto sinérgico de H1H7017N y H1H14611N2 en combinación. Como se muestra en la Figura 8, 3 de los 4 ratones tratados con el anticuerpo de control de isotipo de hlgGI el día 4 PI, murieron el día 7 PI. 3 de 5 animales sobrevivieron cuando se les dosificaron 10 mg/kg de H1H14611N2 y 4 de 5 animales sobrevivieron cuando se les dosificaron 10 mg/kg de H1H7017N. Cuando se les dosificó una combinación de 5 mg/kg de cada anticuerpo, H1H14611N2 y H1H7017N, hubo una supervivencia de un 40 %. Un cien por cien de los ratones tratados con la combinación de 2,5 mg/kg de cada anticuerpo, H1H14611N2 y H1H7017N, sobrevivieron al desafío. La supervivencia de los ratones infectados con un desafío letal de H3N2 aumentó a través de la combinación de concentraciones más bajas de H1H7017N y H1H14611N2, en comparación con concentraciones mayores de anticuerpos combinados o cualquier anticuerpo solo. El porcentaje de supervivencia se resume en la Tabla 24.
Tabla 24. Sumario de datos tabulados.
Figure imgf000047_0001
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Ejemplo 10: El efecto del tratamiento con la combinación de H1H11729P y H1H7017N en ratones tras la infección con H1N1.
Se evaluó la capacidad de una combinación de anticuerpos anti-TMPRSS2 y anticuerpos anti-gripe para proteger a ratones modificados por ingeniería genética para expresar la proteína TMPRSS2 humana de la infección con el virus de la gripe H1N1.
Tabla 25. ID de los clones de mAb.
Figure imgf000048_0002
Tabla 26. Reactivos utilizados números de lote.
Figure imgf000048_0001
Procedimiento experimental
Se desafiaron ratones modificados por ingeniería genética machos y hembras de cinco semanas de edad para expresar la proteína TMPRSS2 humana con 1.500 unidades formadoras de placa (UFP) de H1N1. El virus se administró sedando a los ratones con 200 pl de ketamina:xilacina (12 mg/ml:0,5 mg/ml) y administrando 20 pl de virus por vía intranasal. El día 3 tras la infección (PI), se inyectó a los ratones con anticuerpo por vía intravenosa. Los pesos corporales se recogieron diariamente hasta el día 14 PI y los ratones se sacrificaron cuando perdieron el 25 % de su peso corporal inicial.
Sumario de resultados y conclusiones
Se ha demostrado que, individualmente, el anticuerpo TMPRSS2, H1H7017N y el anticuerpo de gripe A grupo 1 general, H1H11729P, tienen eficacia terapéutica contra un desafío letal para ratones con una cepa histórica de H1N1. Sin embargo, el objetivo de este experimento fue evaluar el efecto sinérgico de los anticuerpos en combinación. Todos los ratones tratados con el anticuerpo de control de isotipo de hlgG1 el día 3 PI murieron el día 6 PI. Cuando los animales recibieron 5 mg/kg de H1H11729P o H1H7017N, un 40 % o un 0 % de los animales sobrevivieron a la infección, respectivamente. Sin embargo, la combinación de 2,5 mg/kg de cada anticuerpo, H1H11729P y H1H7017N, dio como resultado un 60 % de supervivencia. Un ochenta por ciento de los ratones tratados con la combinación de

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión a antígeno humana que se une específicamente a TMPRSS2 humana y que es un anticuerpo 0 fragmento de unión a antígeno del mismo y en donde la proteína de unión a antígeno comprende:
una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende
(a) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8) y
(c) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (Se Q ID NO: 10); y
una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende
(a) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14) y
(c) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (Se Q ID NO: 16).
2. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1 que comprende:
(a) una inmunoglobulina de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 17 o 19 o una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2;
y
(b) una inmunoglobulina de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 o una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.
3. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1 o 2 que es multiespecífica.
4. Un complejo que comprende una proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 unido a un polipéptido TMPRSS2.
5. Un método para fabricar una proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende:
(a) introducir en una célula hospedadora: (i) un polinucleótido que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina de dicha proteína de unión a antígeno; o (ii) un polinucleótido que codifica una cadena pesada de inmunoglobulina de dicha proteína de unión a antígeno y un polinucleótido que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina de dicha proteína de unión a antígeno;
(b) cultivar la célula hospedadora en condiciones favorables para la expresión del (de los) polinucleótido(s); y
(c) opcionalmente, aislar la proteína de unión a antígeno de la célula hospedadora y/o medio en el que crece la célula hospedadora.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la célula hospedadora es una célula de ovario de hámster chino.
7. Un polinucleótido que codifica:
una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende:
(a) una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos: I w N D G S Y V (SEQ ID NO: 8) y
(c) una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (s EQ ID NO: 10);
y
una cadena ligera de inmunoglobulina que comprende:
(a) una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14) y
(c) una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (Se Q ID NO: 16).
8. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 7.
9. Una célula hospedadora que comprende la proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el polinucleótido de la reivindicación 7 o el vector de la reivindicación 8.
10. Una composición o kit que comprende la proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un agente terapéutico adicional, en donde el kit comprende la proteína de unión a antígeno y el agente terapéutico adicional formulado como una composición única o por separado en dos o más composiciones.
11. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente, un agente terapéutico adicional.
12. La composición o kit de la reivindicación 10 u 11, en donde: (i) el agente terapéutico adicional es un fármaco antivírico o una vacuna; o (ii) el agente terapéutico adicional es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: oseltamivir, zanamivir, ribavirina e interferón-alfa2b, interferón-alfa2a y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HA de la gripe.
13. Un recipiente o dispositivo de inyección que comprende la proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 10-12.
14. Una proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para utilizar en un método para tratar o prevenir la infección con un virus de la gripe en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha proteína de unión a antígeno.
15. Una proteína de unión a antígeno para su uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde:
(i) se administra al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales;
(ii) se administra al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales, que es un fármaco antivírico o una vacuna; (iii) se administra al sujeto uno o más agentes terapéuticos adicionales, que es un miembro seleccionado del grupo que consiste en: oseltamivir, zanamivir, ribavirina e interferón-alfa2b, interferón-alfa2a y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HA de la gripe; o
(iv) la proteína de unión a antígeno se inyecta en el cuerpo del sujeto, opcionalmente por vía subcutánea, vía intravenosa o vía intramuscular.
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