BR112020015112A2 - Anticorpos anti-tmprss2 e fragmentos que ligam antígenos - Google Patents

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Abstract

anticorpos anti-tmprss2 e fragmentos de ligação a antígeno. a presente invenção inclui um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à tmprss2 e métodos de uso de tais anticorpos e fragmentos para o tratamento ou prevenção de infecções virais (por exemplo, infecções pelo vírus influenza).

Description

ANTICORPOS ANTI-TMPRSS2 E FRAGMENTOS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO
[01] Este Pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/622,292, depositado em 26 de janeiro de 2018; que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[02] A presente invenção refere-se a anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno que se ligam especificamente à TMPRSS2 e métodos para o tratamento ou prevenção de infecções virais com os referidos anticorpos e fragmentos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[03] Os vírus Influenza adquiriram resistência aos medicamentos atualmente utilizados que têm como alvo a neuraminidase viral (NA) ou a proteína de canal iônico, a proteína de matriz 2 (M2). O surgimento da resistência aos medicamentos destaca a necessidade de se desenvolver novas estratégias antivirais. O direcionamento às células hospedeiras pode reduzir ou evitar o surgimento de mutantes de escape, no entanto, pode criar um "dissipador" devido à expressão generalizada e aumenta a preocupação com a toxicidade. Demonstrou-se que várias proteínas de fusão do vírus respiratório requerem clivagem pelas proteases do hospedeiro para ativação (Shirato et al. Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387–16 (2017); Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017); Zhou et al. Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015); Zmora et al. TMPRSS2
Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015)), incluindo o influenza (Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017); Böttcher- Friebertshäuser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology 85, 1554-1562 (2011); Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology 84, 10 016–10025 (2010); Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), maio; 88(9): 4744-51).
[04] O precursor da hemaglutinina do (vírus) influenza A (HA0) requer a clivagem por uma serina protease do hospedeiro, em HA1 e HA2, para ativação. Por exemplo, a serina protease transmembrana 2; TMPRSS2, TMPRSS4 e TMPRSS11D, bem como a protease do tipo tripsina das vias aéreas humanas (HAT) estão envolvidas na clivagem de HA (Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology 84, 10016–10025 (2010); Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology 2006, outubro; 80 (19): 9896- 8; Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2017/151453). Além disso, a TMPRSS2 é um alvo para a terapia anticâncer. Vide, por exemplo, os documentos WO2008127347 e
WO2002004953. Uma fusão entre TMPRSS2 e ERG (TMPRSS2: ERG) é uma fusão de genes conhecida por ser um dos principais impulsionadores da carcinogênese da próstata, que é desencadeada pelo ERα e reprimida pelo ERβ. Bonkhoff, Estrogen receptor signaling in prostate cancer: Implications for carcinogenesis and tumor progression, Prostate 78 (1): 2-10 (2018).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[05] Embora existam inibidores de moléculas pequenas de TMPRSS2 e anticorpos de pesquisa, úteis, por exemplo, para imuno-histoquímica, ainda existe uma necessidade na arte por anticorpos terapêuticos neutralizantes anti-TMPRSS2 e seu uso no tratamento ou prevenção da infecção viral. Vide, por exemplo, Shen et al. Biochimie 142: 1-10 (2017), os documentos WO2008127347; WO2002004953; U.S. 9498529; anticorpo ab92323, disponível na Abcam (Cambridge, MA) ou anticorpos sc-515727 e sc-101847 disponíveis na Santa Cruz Biotech (Dallas, TX). A presente invenção aborda esta necessidade, em parte, ao proporcionar anticorpos humanos anti-TMPRSS2 humana, como H1H7017N, e combinações dos mesmos, incluindo, por exemplo, anticorpos anti-HA de influenza (por exemplo, a HA do Grupo I ou HA do Grupo II) e métodos para o uso dos mesmos no tratamento das infecções virais.
[06] A presente invenção proporciona uma proteína de ligação a antígeno humana neutralizante que se liga especificamente à TMPRSS2 humana, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, a proteína de ligação a antígeno compreende: (a) as CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19; e/ou (b) as CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18. Em uma forma de realização da invenção, a proteína de ligação a antígeno compreende: (a) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18; e/ou (b) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19. Em uma forma de realização da invenção, a presente invenção proporciona a proteína de ligação a antígeno que compreende: (a) CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18 e pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18; e/ou (b) CDR- H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19 e pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, a proteína de ligação a antígeno compreende uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8), (c) uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10); e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende (a) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12); (b) uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14); e/ou (c) uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16). A presente invenção proporciona também uma proteína de ligação a antígeno compreendendo: (a) uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 ou 19, e/ou (b) uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.
[07] A presente invenção proporciona também qualquer proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 que compete com uma proteína de ligação a antígeno que é apresentada aqui pela ligação à TMPRSS2 (por exemplo, conforme determinado pelo uso de um ensaio de interferometria de bicamada sem marcador e em tempo real, por exemplo, em um biossensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.)); ou que se liga ao mesmo ou a um epítopo sobreposto na TMPRSS2 (ou um fragmento da mesma) como qualquer proteína de ligação a antígeno que é apresentada aqui.
[08] A presente invenção proporciona também proteínas de ligação a antígeno multiespecíficas que se ligam à TMPRSS2 e a outro antígeno ou à TMPRSS2 em um epítopo diferente. Por exemplo, a molécula multiespecífica compreende (a) um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS2; e (b) um segundo domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente a outro antígeno ou à TMPRSS2 ou a um epítopo que difere daquele do primeiro domínio de ligação a antígeno.
[09] A presente invenção proporciona também qualquer proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, por exemplo, compreendendo uma sequência definida aqui) que compreende uma ou mais das seguintes propriedades:  Inibe o crescimento do vírus influenza (por exemplo, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)) em células que expressam TMPRSS2 (por exemplo, células Calu-3);  Liga-se à superfície das células que expressam TMPRSS (por exemplo, MDCK/Tet-on), por exemplo, com um valor de EC50 de 440 pM ou 1,06 nM;  Não se liga significativamente às células MDCK/Tet-on que não expressam TMPRSS2;  Liga-se a TMPRSS2 humana com uma KD de cerca de 2,81 x 10-9 M a cerca de 25ºC;  Liga-se a TMPRSS2 humana com uma KD de cerca de 9,31 x 10-9 M a cerca de 37ºC;  Liga-se a TMPRSS2 de cinomolgo com uma KD de cerca de 5,60 x 10-8 M a cerca de 25ºC;  Liga-se a TMPRSS2 de cinomolgo com uma KD de cerca de 1,40 x 10-7 M a cerca de 37ºC;  Limita a propagação da infecção pelo vírus influenza das células in vitro; e/ou  Protege os camundongos desenvolvidos/modificados para expressar a proteína humana TMPRSS2 da morte causada pela infecção pelo vírus influenza.
[010] A presente invenção proporciona também um complexo compreendendo uma proteína de ligação a antígeno apresentada aqui, ligada a um polipeptídeo TMPRSS2, por exemplo, in vitro ou no corpo de um indivíduo.
[011] A presente invenção proporciona também um método para a produção de uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 apresentada neste documento (por exemplo, H1H7017N) ou a cadeia de imunoglobulina da mesma, o qual compreende: (a) introduzir um ou mais polinucleotídeos que codificam uma cadeia leve e/ou uma pesada de imunoglobulina da referida proteína de ligação a antígeno; (b) realizar a cultura da célula hospedeira (por exemplo, célula CHO, célula de Pichia ou célula de Pichia pastoris) sob condições favoráveis para a expressão do polinucleotídeo; e (c) isolar, opcionalmente, a proteína de ligação a antígeno ou a cadeia de imunoglobulina da célula hospedeira e/ou do meio no qual a célula hospedeira é cultivada. Uma cadeia de imunoglobulina ou proteína de ligação a antígeno que é um produto desse método faz parte da presente invenção.
[012] Um polipeptídeo (por exemplo, uma imunoglobulina) compreendendo: (a) CDR1, CDR2 e CDR3 de um domínio VH de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; ou (b) CDR1, CDR2 e CDR3 de um domínio VL de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 (por exemplo, em que o polipeptídeo está em uma célula hospedeira) também faz parte da presente invenção.
[013] A presente invenção proporciona também um polinucleotídeo (por exemplo, DNA ou RNA) que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Em uma forma de realização da invenção, o polinucleotídeo codifica duas cadeias de imunoglobulina diferentes (por exemplo, pesada e leve). Em uma forma de realização da invenção, um polinucleotídeo codifica uma cadeia leve de imunoglobulina e o outro polinucleotídeo codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina, por exemplo, em que as cadeias estão em uma célula hospedeira ou em um recipiente. Por exemplo, o polinucleotídeo está em um vetor (por exemplo, um plasmídeo) e/ou é integrado em um cromossomo da célula hospedeira.
[014] As células hospedeiras (por exemplo, célula CHO, célula de Pichia ou célula de Pichia pastoris) da presente invenção podem incluir uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, H1H7017N), polipeptídeo da mesma ou polinucleotídeo que codifica esse polipeptídeo e/ou um vetor incluindo esse polinucleotídeo.
[015] A presente invenção proporciona também uma composição ou kit compreendendo uma proteína de ligação a antígeno anti- TMPRSS2 apresentada neste documento (por exemplo, H1H7017N) em associação com um agente terapêutico adicional (por exemplo, uma droga antiviral e/ou uma vacina). Por exemplo, a composição pode ser uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de ligação a antígeno e carreador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um agente terapêutico adicional. O agente terapêutico adicional pode ser ledipasvir, sofosbuvir, uma combinação de ledipasvir e sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirina e interferon- alfa2b, interferon-alfa2a e/ou um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a HA do influenza. Em uma forma de realização da invenção, o agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B;
H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B;
H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; e H1H18335B.
[016] Em uma forma de realização da invenção, um outro agente terapêutico que é proporcionado em associação com uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga à proteína HA do influenza do Grupo II, como H1H14611N2; ou um anticorpo ou fragmento que compreende VH e VL de H1H14611N2; ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR-
H2 e CDR-H3 de H1H14611N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 25-27) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de H1H14611N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 29- 31).
[017] Em uma forma de realização da invenção, um outro agente terapêutico que é proporcionado em associação com uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga à proteína HA do influenza do Grupo II, como H1H14612N2; ou um anticorpo ou fragmento que compreende VH e VL de H1H14612N2; ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 de H1H14612N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 41-43) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de H1H14612N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 45- 47).
[018] Em uma forma de realização da invenção, um outro agente terapêutico que é proporcionado em associação com uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga à proteína HA do influenza do Grupo I, como H1H11729P; ou um anticorpo ou fragmento que compreende VH e VL de H1H11729P; ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 de H1H11729P (por exemplo, SEQ ID NOs: 33-35) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 de H1H11729P (por exemplo, SEQ ID NOs: 37-39).
[019] A presente invenção proporciona também um recipiente ou dispositivo de injeção que compreende uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, H1H7017N) ou composição da mesma (por exemplo, composição farmacêutica).
[020] A presente invenção proporciona também um método para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral além da infecção pelo vírus influenza, em um indivíduo (por exemplo, um humano) que precisa do mesmo, o qual compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 apresentada aqui (por exemplo, H1H7017N).
[021] A presente invenção proporciona também um método para o tratamento ou prevenção do câncer (por exemplo, câncer de próstata) ou infecção, por exemplo, uma infecção viral, por exemplo, uma infecção por um vírus influenza, coronavírus, vírus SARS-Co, vírus MERS-Co, vírus parainfluenza, metapneumovírus humano ou vírus da hepatite C (HCV), em um indivíduo (por exemplo, um humano) que precisa do mesmo, o qual compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 apresentada aqui (por exemplo, H1H7017N). Por exemplo, a proteína de ligação a antígeno é administrada em associação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (por exemplo, drogas antivirais e/ou uma vacina). Em uma forma de realização da invenção, um agente terapêutico adicional é um membro selecionado do grupo que consiste em: ledipasvir, sofosbuvir, uma combinação de ledipasvir e sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirina e interferon-alfa2b, interferon-alfa2a e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a HA do influenza. Em uma forma de realização da invenção, um outro agente terapêutico é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo selecionado do grupo que consiste em H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N;
H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B;
H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B;
H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; e H1H18335B.
[022] A presente invenção proporciona também um método para a administração de uma proteína de ligação a antígeno anti- TMRPSS2 (por exemplo, H1H7017N) aqui apresentada no corpo de um indivíduo (por exemplo, um humano), o qual compreende injetar a proteína de ligação a antígeno no corpo do indivíduo por via parenteral (por exemplo, por via subcutânea, intravenosa ou intramuscular).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[023] Figura 1 (A-B). Progressão da propagação do vírus A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP em diferentes linhagens celulares com uma multiplicidade de infecção inicial de 0,01 (A) ou 0,001 (B) na ausência de tripsina exógena. Células Calu3 (círculo), A549 (quadrado), MDCK (triângulo) e HepG2 (triângulo invertido).
[024] Figura 2. Aplicação do H1H7017N durante o ciclo de infecção diminui o número de Unidades de Foco Fluorescente (FFU) do A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) nas 72 horas pós- infecção em comparação com o anticorpo isotipo controle, sem anticorpo, anticorpo anti-HA e controles não infectados.
[025] Figura 3 (A-B). Anti-TMPRSS2, H1H7017N, liga-se à TMPRSS2 humana e de macaco cinomolgo expressa nas células. (A) H1H7017N, ligado a MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 e MDCK/Tet- on/mfTMPRSS2 com valores de EC50 de 460 pM e 1,06 nM, respectivamente, e não mostrou ligação significativa às células MDCK/Tet-on. (B) mAb1 controle, um anticorpo isotipo controle irrelevante, não mostrou ligação a nenhuma das linhagens celulares testadas.
[026] Figura 4. Curva de sobrevivência de um camundongo modificado para expressar a proteína TMPRSS2 humana tratado com 5 mg/kg de H1H7017N no dia -1 PI (triângulo invertido, linha tracejada) ou dia 0 PI (círculo, linha sólida) mostrando proteção contra H1N1 em um modelo profilático. Camundongos tratados com o isotipo controle H1H1238N (triângulo, linha sólida) não mostraram proteção.
[027] Figura 5. Curva de sobrevivência de um camundongo modificado para expressar a proteína TMPRSS2 humana infectado com H1N1, tratado com 10 mg/kg de H1H7017N, demonstrando proteção. Os camundongos foram tratados no dia 0 (diamante, linha pontilhada), dia 1 (círculo, linha sólida), dia 2 (triângulo invertido, linha sólida) ou dia 3 PI
(quadrado, linha tracejada). O isotipo controle H1H1238N (triângulo, linha sólida) apresentou proteção parcial com uma taxa de sobrevivência de 25%.
[028] Figura 6. Curva de sobrevivência de camundongos hTPMRSS2 tratados com 10 mg/kg de H1H7017N no dia 1 PI (triangulo) ou no dia 2 PI (círculo) mostrando proteção contra H3N2. Os camundongos não tratados (quadrado) não mostraram proteção.
[029] Figura 7 (A-B). Curva de sobrevivência de camundongos do tipo selvagem (A) ou camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana (B) infectados com 150 PFU (triângulo), 750 PFU (quadrado), ou 1.500 PFU (círculo) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1). Os camundongos foram pesados diariamente até o dia 14 PI.
[030] Figura 8. Curva de sobrevivência de um camundongo modificado para expressar a proteína TMPRSS2 humana infectado com A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34 (H3N2) no dia 0 e tratado com uma combinação de 2,5 mg/kg, cada, de H1H7017N e H1H14611N2 (diamante), 10 mg/kg de H1H7017N (triângulo), 10 mg/kg de H1H14611N2 (quadrado), 5 mg/kg, cada, de H1H7017N e H1H14611N2 ou 10 mg/kg de isotipo controle hIgG1 (círculo). Os camundongos foram pesados diariamente até o dia 14 PI.
[031] Figura 9. Curva de sobrevivência de um camundongo modificado para expressar a proteína TMPRSS2 humana infectado com A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) no dia 1 PI e tratado com uma combinação de 1 mg/kg de H1H7017N e 2 mg/kg de H1H11729P (círculo), 2,5 mg/kg, cada, de H1H7017N e H1H11729P (triângulo invertido), 5 mg/kg de H1H11729P (diamante), 5 mg/kg de H1H7017N (quadrado) ou 5 mg/kg de isotipo controle hIgG1 (triângulo). Os camundongos foram pesados diariamente até o dia 14 PI.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[032] Antes que os métodos presentes sejam descritos, deve- se entender que essa invenção não se limita a determinados métodos e condições experimentais descritos, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas determinadas formas de realização, e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[033] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o comumente entendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou na análise da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais serão descritos daqui em diante. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência na sua totalidade.
[034] O termo "hemaglutinina do influenza", também chamado de "HA do influenza" é uma glicoproteína trimérica encontrada na superfície dos vírions de influenza, que medeia a ligação viral (via ligação HA1 aos ácidos α-2,3- e α-2,6-siálicos) e a entrada (através de alterações conformacionais) nas células hospedeiras. A HA é composta por dois domínios estruturais: um domínio de cabeça globular contendo o sítio de ligação ao receptor (passível a uma alta frequência de mutações antigênicas) e a região do tronco (mais conservada entre as diversas cepas do vírus influenza). A HA do influenza é sintetizada como um precursor (HA0) que sofre processamento proteolítico para produzir duas subunidades (HA1 e HA2) que se associam para formar a estrutura do tronco/cabeça globular. A HA viral é o antígeno mais variável do vírus e o tronco (HA2) é altamente conservado em cada grupo.
[035] O termo "neuraminidase do influenza", também chamado de "NA do influenza" é uma exosialidase (EC 3.2.1.18) que cliva a ligação α-cetosídica entre o ácido siálico (N- acetilneuramínico) e um resíduo de açúcar adjacente.
[036] A sequência de aminoácidos completa da HA do influenza é exemplificada pela sequência de aminoácidos do isolado de influenza H1N1 A/California/04/2009 apresentado no GenBank com o número de acesso FJ966082.1. O termo "influenza-HA" também inclui variantes de proteínas da HA do influenza isoladas de diferentes isolados de influenza, por exemplo, GQ149237.1, NC_002017, KM972981.1, etc. O termo "influenza- HA" inclui também a HA do influenza recombinante ou um fragmento da mesma. O termo também abrange HA do influenza ou um fragmento da mesma acoplado a, por exemplo, um tag de histidina, Fc de camundongo ou humano, ou uma sequência sinal.
[037] Uma "proteína de ligação a antígeno" anti-TMPRSS2 é um polipeptídeo ou complexo de mais de um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo IgG tetramérico) que se liga especificamente ao polipeptídeo TMPRSS2, por exemplo, um anticorpo anti-TMPRSS2 ou fragmento de ligação a antígeno, seja monoespecífico ou multiespecífico. TMPRSS2
[038] A TMPRSS2 (Serina Protease Transmembrana 2) é uma proteína, localizada no cromossomo 21 humano, que pertence à família da serina protease (serina protease transmembrana do tipo II (TTSPs)), que é importante para a infectividade do vírus influenza. Foi demonstrado que a TMPRSS2 medeia a clivagem da HA0 do vírus influenza em HA1 e HA2.
[039] O gene humano TMPRSS2 codifica uma proteína predita de 492 aminoácidos que se ancora à membrana plasmática. A proteína se converte em sua forma madura por meio da clivagem autocatalítica entre Arg255 e Ile256. Após a clivagem, as proteases maduras são, em sua maioria, ligadas à membrana, mas uma parte delas pode ser liberada no meio extracelular.
[040] Em uma forma de realização da invenção, a TMPRSS2 humana (V160M) compreende a sequência de aminoácidos:
MALNSGSPPAIGPYYENHGYQPENPYPAQPTVVPTVYEVHPAQYYPSPVPQYAPRVLTQASNPVVCTQPK SPSGTVCTSKTKKALCITLTLGTFLVGAALAAGLLWKFMGSKCSNSGIECDSSGTCINPSNWCDGVSHCP GGEDENRCVRLYGPNFILQMYSSQRKSWHPVCQDDWNENYGRAACRDMGYKNNFYSSQGIVDDSGSTSFM KLNTSAGNVDIYKKLYHSDACSSKAVVSLRCIACGVNLNSSRQSRIVGGESALPGAWPWQVSLHVQNVHV CGGSIITPEWIVTAAHCVEKPLNNPWHWTAFAGILRQSFMFYGAGYQVEKVISHPNYDSKTKNNDIALMK LQKPLTFNDLVKPVCLPNPGMMLQPEQLCWISGWGATEEKGKTSEVLNAAKVLLIETQRCNSRYVYDNLI TPAMICAGFLQGNVDSCQGDSGGPLVTSKNNIWWLIGDTSWGSGCAKAYRPGVYGNVMVFTDWIYRQMRA
DG (SEQ ID NO: 22; metionina 160 em negrito). Em uma forma de realização da invenção, o polipeptídeo TMPRSS2 não compreende a mutação V160M. Vide também NM_005656.3.
[041] Em uma forma de realização da invenção, TMPRSS2 de Macaca mulatta (S129L, N251S, I415V, R431Q, D492G) compreende a sequência de aminoácidos:
MALNSGSPPGVGPYYENHGYQPENPYPAQPTVAPNVYEVHPAQYYPSPVPQYTPRVLTHASNPAVCRQPK SPSGTVCTSKTKKALCVTMTLGAVLVGAALAAGLLWKFMGSKCSDSGIECDSSGTCISLSNWCDGVSHCP NGEDENRCVRLYGPNFILQVYSSQRKSWHPVCRDDWNENYARAACRDMGYKNSFYSSQGIVDNSGATSFM KLNTSAGNVDIYKKLYHSDACSSKAVVSLRCIACGVRSNLSRQSRIVGGQNALLGAWPWQVSLHVQNIHV CGGSIITPEWIVTAAHCVEKPLNSPWQWTAFVGTLRQSSMFYEKGHRVEKVISHPNYDSKTKNNDIALMK LHTPLTFNEVVKPVCLPNPGMMLEPEQHCWISGWGATQEKGKTSDVLNAAMVPLIEPRRCNNKYVYDGLI TPAMICAGFLQGTVDSCQGDSGGPLVTLKNDVWWLIGDTSWGSGCAQANRPGVYGNVTVFTDWIYRQMRA DG
(SEQ ID NO: 23). Em uma forma de realização da invenção, o polipeptídeo TMPRSS2 não compreende a mutação S129L, N251S, I415V, R431Q e/ou D492G.
[042] Em uma forma de realização da invenção, o RNAm de TMPRSS2 de Mus musculus compreende a sequência nucleotídica apresentada em NM_015775.2. Vírus
[043] A presente invenção inclui métodos para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral em um indivíduo. O termo "vírus" inclui qualquer vírus cuja infecção no corpo de um indivíduo seja tratável ou evitável pela administração de um anticorpo anti-TMPRSS2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, em que a infectividade do vírus é pelo menos parcialmente dependente da TMPRSS2). Em uma forma de realização da invenção, um "vírus" é qualquer vírus que expressa HA0 ou outro substrato de TMPRSS2, cuja clivagem proteolítica é necessária para a infectividade completa do vírus contra uma célula em um hospedeiro. O termo “vírus” inclui também um vírus respiratório TMPRSS2-dependente, que é um vírus que infecta o tecido respiratório de um indivíduo (por exemplo, trato respiratório superior e/ou inferior, traqueia, brônquios, pulmões), e é tratável ou evitável pela administração de um anti-TMPRSS2. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, o vírus inclui o vírus influenza, coronavírus, vírus SARS-Co (coronavírus da síndrome respiratória aguda grave), vírus MERS-Co (CoV da síndrome respiratória do oriente médio (MERS)), vírus parainfluenza, vírus Sendai (SeV), metapneumovírus humano e/ou vírus da hepatite C (HCV). "Infecção viral" refere-se à invasão e multiplicação de um vírus no corpo de um indivíduo. A presente invenção inclui formas de realização com a condição de que "vírus" exclua o vírus influenza, por exemplo, em que a infecção viral exclui a infecção pelo vírus influenza.
[044] Atualmente, existem dois gêneros do vírus parainfluenza humano (HPIV), Respirovirus (HPIV-1 e HPIV-3) e Rubulavirus (HPIV-2 e HPIV-4). Ambos os gêneros (paramixovírus) podem ser separados morfologicamente do vírus influenza.
[045] O vírus Sendai, também conhecido como vírus parainfluenza de murino, é a espécie tipo no gênero Respirovirus, o qual também contém as espécies vírus parainfluenza humano 3, vírus parainfluenza bovino 3, e vírus parainfluenza humano 1. A TMPRSS2 é uma Protease de Ativação para os Vírus Parainfluenza Respiratórios, tais como os vírus parainfluenza e vírus Sendai (SeV). Vide Abe et al. J. Virol. 87 (21): 11930-11935 (2013).
[046] O metapneumovírus humano (HMPV) é classificado como o primeiro membro humano do gênero Metapneumovirus, da subfamília Pneumovirinae da família Paramyxoviridae. É um vírus RNA de fita simples de sentido negativo e envelopado. O genoma do RNA inclui 8 genes que codificam 9 proteínas diferentes. O HMPV é idêntico em ordem gênica ao pneumovírus aviário (AMPV), que também pertence ao gênero Metapneumovirus. A TMPRSS2 é expressa no epitélio pulmonar humano, cliva a proteína HMPV F com eficiência e propicia a multiplicação do HMPV e pode estar envolvida no desenvolvimento de doenças do trato respiratório inferior em pacientes infectados pelo HMPV. Vide Shirogane et al. J Virol. 82 (17): 8942-8946 (2008).
[047] O vírus da hepatite C (HCV) é um vírus RNA de fita simples de sentido positivo e envelopado, da família
Flaviviridae. O HCV, com pelo menos 6 genótipos e numerosos subtipos, é um membro do gênero Hepacivírus. A TMPRSS2 pode ativar a infecção pelo HCV no estágio pós-ligação e entrada. Esumi et al., Hepatology 61 (2): 437-446 (2015).
[048] Os vírus influenza são membros da família Orthomyxoviridae. Esta família representa os vírus cujo genoma envolvido tem segmentos de RNA de fita simples segmentados de sentido negativo. Existem quatro gêneros dessa família: tipos A, B, C e Thogotovírus. As classes do vírus Influenza, A, B e C, baseiam-se na proteína principal e são divididas em subtipos, que são determinados pelas glicoproteínas do envelope viral, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) (por exemplo, subtipo A/H1N1). Existem pelo menos 18 subtipos de proteína hemaglutinina do influenza ("HA") (H1-H18 ou HA1-HA18) e pelo menos 11 subtipos de proteína neuraminidase do influenza (NA) (N1-N11 ou NA1-NA11) usados para definir os subtipos de influenza. O influenza do Grupo 1 possui os subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 e H18 e os subtipos NA8, NA5, Na4 e NA1. O grupo 2 possui os subtipos H3, H4, H7, H10, H14 e H15 e os subtipos NA6, NA9, NA7, NA2 e NA3. Os vírus influenza A infectam uma variedade de espécies de mamíferos e aves, enquanto as infecções do tipo B e C são amplamente restritas aos seres humanos. Os oito segmentos genômicos dos vírus influenza A e B são fracamente encapsidados pela nucleoproteína.
[049] Os vírions de coronavírus são esféricos com diâmetros de aproximadamente 125 nm. A característica mais proeminente dos coronavírus são as projeções espiculadas em forma de taco que emanam da superfície do vírion. Essas espículas são uma característica definidora do vírion e dão a eles a aparência de uma coroa solar, dando origem ao nome de coronavírus. Dentro do envelope do vírion está o nucleocapsídeo. Os coronavírus têm nucleocapsídeos helicoidicamente simétricos, o que é incomum entre os vírus RNA de sentido positivo, mas muito mais comum em vírus RNA de sentido negativo. Ambos MERS-cov (coronavírus da síndrome respiratória do oriente médio) e SARS-cov (coronavírus da síndrome respiratória aguda grave) pertencem à família coronavírus. A ligação inicial do vírion à célula hospedeira é iniciada pelas interações entre a proteína S e seu receptor. Os sítios dos domínios de ligação ao receptor (RBD) na região S1 de uma proteína S do coronavírus variam dependendo do vírus, em que alguns apresentam o RBD na extremidade C- terminal de S1. A interação proteína S/receptor é o principal determinante para um coronavírus infectar uma espécie hospedeira e também regula o tropismo tecidual do vírus. Muitos coronavírus utilizam peptidases como seu receptor celular. Após a ligação ao receptor, o vírus deve obter acesso ao citosol da célula hospedeira. Isso geralmente é realizado pela clivagem proteolítica dependente de ácido da proteína S por uma catepsina, TMPRRS2 ou outra protease, seguida pela fusão das membranas virais e celulares. Anticorpos Anti-TMPRSS2 e Fragmentos de Ligação a Antígeno
[050] A presente invenção proporciona proteínas de ligação a antígeno, tais como anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que se ligam especificamente à proteína TMPRSS2 ou um fragmento antigênico da mesma.
[051] O termo "anticorpo", conforme utilizado neste documento, refere-se às moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (HCs) e duas cadeias leves (LCs) interconectadas por ligações dissulfeto (isto é, "moléculas de anticorpos completas"), bem como seus multímeros (por exemplo, IgM), por exemplo, H1H7017N. Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada ("HCVR" ou "VH") (por exemplo, SEQ ID NO 2) e uma região constante da cadeia pesada (composta pelos domínios CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve é composta por uma região variável da cadeia leve ("LCVR ou "VL") (por exemplo, SEQ ID NO 4) e uma região constante da cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL compreende três CDRs e quatro FRs, dispostas da extremidade amino terminal à carboxi terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em certas formas de realização da invenção, as FRs do anticorpo (ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) são idênticas às sequências da linhagem germinativa humana, ou são modificadas natural ou artificialmente.
[052] Tipicamente, os domínios variáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulina compreendem três regiões hipervariáveis, também chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), localizadas dentro das regiões estruturais relativamente conservadas (FR). Em geral, da extremidade N-terminal à C-terminal, os domínios variáveis das cadeias leve e pesada compreendem FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Em uma forma de realização da invenção, a designação dos aminoácidos em cada domínio está de acordo com as definições da Sequences of Proteins of Immunological Interest, de Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5ª ed.; NIH Publ. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75; Kabat et al. (1977) J. Biol. Chem. 252: 6609-6616; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 ou Chothia, et al., (1989) Nature 342: 878-883.
[053] A presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno monoclonais anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, bem como composições monoclonais compreendendo uma pluralidade de proteínas de ligação a antígeno monoclonais isoladas. O termo "anticorpo monoclonal", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, as moléculas de anticorpo que compreendem a população são idênticas na sequência de aminoácidos, exceto por possíveis mutações que ocorram naturalmente e que podem estar presentes em quantidades menores. Uma "pluralidade" desses anticorpos e fragmentos monoclonais em uma composição refere-se a uma concentração de anticorpos e fragmentos idênticos (isto é, como discutido acima, na sequência de aminoácidos, exceto por possíveis mutações que ocorram naturalmente e que podem estar presentes em pequenas quantidades) que está acima do que normalmente ocorreria na natureza, por exemplo, no sangue de um organismo hospedeiro, como um camundongo ou um humano.
[054] Em uma forma de realização da invenção, uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio constante da cadeia pesada, por exemplo, do tipo IgA (por exemplo, IgA1 ou IgA2), IgD, IgE, IgG (por exemplo, IgG1,
IgG2, IgG3 e IgG4) ou IgM. Em uma forma de realização da invenção, uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreende um domínio constante da cadeia leve, por exemplo, do tipo kappa ou lambda.
[055] O termo proteína de ligação a antígeno "humana", como um anticorpo, conforme utilizado neste documento, inclui anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana, seja em uma célula humana ou enxertada em uma célula não humana, por exemplo, uma célula de camundongo. Vide, por exemplo, os documentos U.S. 8,502,018, U.S. 6,596,541 ou U.S. 5,789,215. Os mAbs humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas de linhagem germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio- específica in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme utilizado neste documento, não se destina a incluir os mAbs nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outras espécies de mamíferos (por exemplo, camundongos) foram enxertadas em sequências FR humanas. O termo inclui anticorpos produzidos recombinantemente em mamíferos não humanos ou em células de mamíferos não humanos. O termo não se destina a incluir anticorpos isolados ou gerados em um indivíduo humano. Vide abaixo.
[056] A presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno quiméricas anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, e métodos de uso dos mesmos. Conforme utilizado neste documento, um "anticorpo quimérico" é um anticorpo que possui o domínio variável de um primeiro anticorpo e o domínio constante de um segundo anticorpo, em que o primeiro e o segundo anticorpos são de espécies diferentes. (U.S. 4,816,567; e Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851- 6855).
[057] O termo proteínas de ligação a antígeno “recombinantes”, tais como anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, refere-se a tais moléculas criadas, expressas, isoladas ou obtidas por tecnologias e métodos conhecidos na arte, tais como a tecnologia de DNA recombinante, que inclui, por exemplo, o splicing de DNA e expressão transgênica. O termo inclui anticorpos expressos em um mamífero não humano (incluindo mamíferos não humanos transgênicos, por exemplo, camundongos transgênicos) ou um sistema de expressão em células (por exemplo, células CHO) ou isolado de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos recombinantes.
[058] As proteínas de ligação a antígeno recombinante anti- TMPRSS2, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno, aqui divulgados também podem ser produzidos em um sistema de expressão em E. coli/T7. Nesta forma de realização, os ácidos nucleicos que codificam as moléculas de imunoglobulina do anticorpo anti-TMPRSS2 da invenção (por exemplo, H1H7017N) podem ser inseridos em um plasmídeo baseado em pET e expressos no sistema E. coli/T7. Por exemplo, a presente invenção inclui métodos para expressar um anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo ou sua cadeia de imunoglobulina em uma célula hospedeira (por exemplo, célula hospedeira bacteriana como E. coli como BL21 ou BL21DE3) que compreende expressar a RNA polimerase T7 na célula que também inclui um polinucleotídeo que codifica uma cadeia de imunoglobulina que está operacionalmente ligado a um promotor de T7. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, uma célula hospedeira bacteriana, tal como uma E. coli, inclui um polinucleotídeo que codifica o gene da RNA polimerase T7 operacionalmente ligado a um promotor lac e a expressão da polimerase e da cadeia é induzida pela incubação da célula hospedeira com IPTG (isopropil-beta-D- tiogalactopiranosídeo). Vide os documentos U.S. 4,952,496 e U.S. 5,693,489 ou Studier & Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 5 de maio de 1986; 189 (1): 113-
30.
[059] Existem vários métodos pelos quais se produz os anticorpos recombinantes e que são conhecidos na arte. Um exemplo de um método para produção recombinante de anticorpos é divulgado no documento U.S. 4,816,567.
[060] A transformação pode ser através de qualquer método conhecido para a introdução de polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Os métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos nas células de mamíferos são bem conhecidos na arte e incluem a transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas, injeção biobalística e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Além disso, as moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas nas células de mamíferos por vetores virais. Os métodos de transformação de células são bem conhecidos na arte. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 e 4,959,455.
[061] Assim, a presente invenção inclui métodos recombinantes para produzir uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, como um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção, ou uma cadeia de imunoglobulina da mesma, compreendendo (i) introduzir um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, incluindo a sequência nucleotídica em qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ou 15) que codifica as cadeias leve e/ou pesada de imunoglobulina da proteína de ligação a antígeno, por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N, por exemplo, em que o polinucleotídeo está em um vetor; e/ou integrado em um cromossomo da célula hospedeira e/ou está operacionalmente ligado a um promotor; (ii) realizar a cultura da célula hospedeira (por exemplo, CHO ou Pichia ou Pichia pastoris) sob condições favoráveis para a expressão do polinucleotídeo e (iii) isolar, opcionalmente, a proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento) ou a cadeia da célula hospedeira e/ou do meio no qual a célula hospedeira é cultivada. Ao se produzir uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno) compreendendo mais de uma cadeia de imunoglobulina, por exemplo, um anticorpo que compreende duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina, a coexpressão das cadeias em uma única célula hospedeira leva à associação das cadeias, por exemplo, na célula ou na superfície celular ou fora da célula, caso essas cadeias sejam secretadas, de modo a formar a proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno). Os métodos incluem aqueles em que apenas uma cadeia pesada de imunoglobulina ou apenas uma cadeia leve de imunoglobulina (por exemplo, qualquer uma das discutidas aqui, incluindo fragmentos maduros e/ou domínios variáveis das mesmas) é expressa. Tais cadeias são úteis, por exemplo, como intermediárias na expressão de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que contém essa cadeia. Por exemplo, a presente invenção também inclui proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, como anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina (ou domínio variável da mesma ou compreendendo suas CDRs) codificada por um polinucleotídeo que compreende a sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve de imunoglobulina (ou domínio variável da mesma ou compreendendo suas CDRs) codificada pela sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 3, que são o produto de tais métodos de produção e, opcionalmente, os métodos de purificação apresentados aqui. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, o produto do método é uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 que é um anticorpo ou fragmento compreendendo uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; ou compreendendo uma HC compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 ou 19 e uma LC compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.
[062] Células hospedeiras eucarióticas e procarióticas, incluindo células de mamíferos, podem ser usadas como hospedeiras para expressão de uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2. Tais células hospedeiras são bem conhecidas na arte e muitas estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC). Essas células hospedeiras incluem, entre outras, as células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, SP2, células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), Células A549, células 3T3, células HEK-293 e várias outras linhagens celulares.
As células hospedeiras de mamíferos incluem células humanas, de camundongos, ratos, cães, macacos, porcos, cabras, bovinos, cavalos e hamster.
Outras linhagens celulares que podem ser usadas são linhagens celulares de insetos (por exemplo, Spodoptera frugiperda ou Trichoplusia ni), células de anfíbios, células bacterianas, células vegetais e células fúngicas.
As células fúngicas incluem células de levedura e de fungos filamentosos incluindo, por exemplo, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia lindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens e Neurospora crassa.
A presente invenção inclui uma célula hospedeira isolada (por exemplo, uma célula CHO) compreendendo uma proteína de ligação a antígeno, como H1H7017N; ou um polinucleotídeo que codifica esse polipeptídeo.
[063] O termo “liga-se especificamente” refere-se àquelas proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, mAbs) que tem uma afinidade de ligação a um antígeno, tal como uma proteína TMPRSS2 (por exemplo, TMPRSS2 humana), expressa como KD, de pelo menos cerca de 10-8 M (por exemplo, 2,81 X 10-9 M; 9,31 X 10-9 M; 10-9 M; 10-10 M, 10-11 M ou 10-12 M), conforme medição em ensaio de interferometria de bicamada sem marcador e em tempo real, por exemplo, a 25ºC ou 37ºC, por exemplo, um biossensor Octet® HTX ou por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE™ ou por ELISA de afinidade de solução. A presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno que se ligam especificamente à proteína TMPRSS2.
[064] Os termos "porção de ligação a antígeno" ou "fragmento de ligação a antígeno" de um anticorpo ou proteína de ligação a antígeno, e semelhantes, conforme aqui utilizados, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, sintética, obtida enzimaticamente ou modificada geneticamente que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Exemplos não limitativos de fragmentos de ligação a antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia única (scFv); (vi) fragmentos de dAb; e (vii) unidades mínimas de reconhecimento que consistem nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade isolada (CDR), como um peptídeo CDR3) ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas modificadas, como anticorpos domínio-específicos, anticorpos de domínio único, anticorpos com domínio deletado (domain- deleted antibodies), anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (tal como definido, por exemplo, nos documentos WO 08/020079 ou WO 09/138519) (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), imunofármacos modulares pequenos (SMIPs) e domínios IgNAR variáveis de tubarões, também estão incluídos na expressão "fragmento de ligação a antígeno", conforme utilizado neste documento. Em uma forma de realização da invenção, o fragmento de ligação a antígeno compreende três ou mais CDRs de H1H7017N (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3; ou CDR- L1, CDR-L2 e CDR-L3).
[065] Um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, em uma forma de realização da invenção, compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ter qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR, a qual é adjacente ou está em quadro com uma ou mais sequências estruturais. Nos fragmentos de ligação a antígeno com um domínio VH associado a um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados um em relação ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH - VH, VH - VL ou VL - VL. Alternativamente, o fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.
[066] Em certas formas de realização, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Exemplos de configurações não limitantes de domínios constantes e variáveis que podem ser encontrados no interior de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: ((i) VH-CH1; (ii) VH- CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH- CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer um dos exemplos de configurações listados acima, os domínios variáveis e constantes podem ser diretamente ligados um ao outro ou podem ser ligados por uma região de ligação ou de dobradiça completa ou parcial. Uma região de dobradiça pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre os domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma única molécula polipeptídica. Além disso, um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente entre si e/ou com um ou mais domínios VH ou VL monoméricos (por exemplo, por ligação(ões) dissulfeto).
[067] As proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno) podem ser monoespecíficas ou multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas). As proteínas de ligação a antígeno multiespecíficas são discutidas mais adiante.
[068] Nas formas de realização específicas, o anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção podem ser conjugados com uma porção, tal como um ligante ou uma porção terapêutica ("imunoconjugado"), como uma droga antiviral, um segundo anticorpo anti-influenza ou qualquer outra porção terapêutica útil para o tratamento de uma infecção viral, por exemplo, infecção pelo vírus influenza. Vide abaixo.
[069] A presente invenção proporciona também um complexo compreendendo uma proteína de ligação a antígeno anti- TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, tal conforme discutido aqui, complexado com o polipeptídeo TMPRSS2 ou um fragmento antigênico do mesmo e/ou com um anticorpo secundário ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, anticorpo secundário marcado de forma detectável) que se liga especificamente ao anticorpo ou fragmento anti-TMPRSS2. Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo ou fragmento está in vitro (por exemplo, está imobilizado em um substrato sólido) ou está no corpo de um indivíduo. Em uma forma de realização da invenção, o TMPRSS2 está in vitro (por exemplo, está imobilizado em um substrato sólido) ou está na superfície de uma célula ou no corpo de um indivíduo. Anticorpos anti-TMRPSS2 imobilizados e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que estão covalentemente ligados a um material de matriz insolúvel (por exemplo, vidro ou polissacarídeo, como agarose ou sefarose, por exemplo, uma esfera ou outra partícula do mesmo) também fazem parte da presente invenção; em que, opcionalmente, o anticorpo imobilizado é complexado com TMPRSS2 ou fragmento antigênico do mesmo ou um anticorpo secundário ou fragmento do mesmo.
[070] As proteínas de ligação a antígeno "isoladas", anticorpos ou fragmentos dos mesmos, polipeptídeos,
polinucleotídeos e vetores se encontram parcialmente livres, pelo menos, de outras moléculas biológicas provenientes das células ou cultura de células a partir da qual eles são produzidos. Tais moléculas biológicas incluem ácidos nucleicos, proteínas, outros anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, lipídeos, carboidratos ou outro material, como detritos celulares e meio de crescimento. Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno pode ainda estar pelo menos parcialmente livre de componentes do sistema de expressão, como moléculas biológicas de uma célula hospedeira ou do seu meio de crescimento. Geralmente, o termo "isolado" não se refere a uma ausência completa de tais moléculas biológicas ou a uma ausência de água, tampões ou sais ou a componentes de uma formulação farmacêutica que inclui os anticorpos ou fragmentos.
[071] O termo "epítopo" refere-se a um determinante antigênico (por exemplo, no polipeptídeo TMPRSS2) que interage com um sítio de ligação a antígeno específico de uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, uma região variável de uma molécula de anticorpo, conhecida como parátopo. Um único antígeno pode ter mais de um epítopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas em um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. O termo "epítopo" também se refere a um local em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem. Também se refere a uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epítopos funcionais são geralmente um subconjunto dos epítopos estruturais e que possuem aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Os epítopos podem ser lineares ou conformacionais, isto é, compostos por aminoácidos não lineares. Em certas formas de realização, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativas, como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou grupos sulfonil e, em certas formas de realização, podem apresentar características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas.
[072] Os métodos para determinar o epítopo de uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo, incluem a análise mutacional por varredura com alanina, análise de transferência de peptídeos (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), análise por clivagem de peptídeos, estudos cristalográficos e análise por RMN. Além disso, métodos como a excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). Outro método que pode ser usado para se identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo) (por exemplo, coversina) interage é a troca de hidrogênio/deutério detectada por espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve a proteína de interesse marcada com deutério, seguida pela ligação da proteína de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo, à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína TMPRSS2/proteína de ligação a antígeno é transferido para a água e os prótons trocáveis dentro dos aminoácidos que estão protegidos pelo complexo de anticorpo sofrem troca reversa de deutério para hidrogênio a uma taxa mais lenta do que os prótons trocáveis dentro dos aminoácidos que não fazem parte da interface. Como resultado, os aminoácidos que fazem parte da interface proteína/proteína de ligação a antígeno podem reter o deutério e, portanto, exibir massa relativamente maior em comparação com os aminoácidos não incluídos na interface. Após a dissociação da proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento ou polipeptídeo), a proteína alvo é submetida à análise de clivagem por protease e espectrometria de massa, revelando, assim, os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais a proteína de ligação a antígeno interage. Vide, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen e Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.
[073] O termo "compete", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) que se liga a um antígeno (por exemplo, TMPRSS2) e inibe ou bloqueia a ligação de outra proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) ao antígeno. O termo também inclui competição entre duas proteínas de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpos, em ambas as orientações, isto é, um primeiro anticorpo que se liga e bloqueia a ligação do segundo anticorpo e vice- versa. Em certas formas de realização, a primeira proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo) e a segunda proteína de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo) podem se ligar ao mesmo epítopo. Alternativamente, a primeira e a segunda proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos) podem se ligar a epítopos diferentes, mas que estão, por exemplo, sobrepostos, em que a ligação de um inibe ou bloqueia a ligação do segundo anticorpo, por exemplo, via impedimento estérico. A competição entre proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpos) pode ser medida por métodos conhecidos na arte, por exemplo, por um ensaio de interferometria de bicamada sem marcador e em tempo real. Em uma forma de realização da invenção, a competição entre uma primeira e segunda proteína de ligação a antígeno anti- TMPRSS2 (por exemplo, anticorpo) é determinada medindo-se a capacidade de uma primeira proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 imobilizada (por exemplo, anticorpo) (inicialmente não complexado com a proteína TMPRSS2) em se ligar à proteína TMPRSS2 solúvel complexada com uma segunda proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, anticorpo). Uma redução na capacidade da primeira proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, anticorpo) em se ligar à proteína TMPRSS2 complexada, em relação à proteína TMPRSS2 não complexada, indica que a primeira e a segunda proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, anticorpos) competem. O grau de competição pode ser expresso como um percentual de redução de ligação. Essa competição pode ser medida utilizando-se um ensaio de interferometria de bicamada sem marcador e em tempo real, por exemplo, em um biossensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.), ELISA (ensaios de imunoabsorção enzimática) ou SPR (ressonância de plasmon de superfície).
[074] A competição de ligação entre proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, anticorpos monoclonais
(mAbs)) pode ser determinada utilizando-se um ensaio de interferometria de bicamada sem marcador e em tempo real em um biosensor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). Por exemplo, para se determinar a competição entre dois anticorpos monoclonais anti-TMPRSS2 humanos, o mAb anti-TMPRSS2 pode ser capturado primeiramente nas pontas dos biossensores Octet revestidos com anticorpo anti-hFc (Pall ForteBio Corp., # 18-5060) através da submersão das pontas em uma solução de mAb anti-TMPRSS2 humano (posteriormente denominado "mAb1"). Como controle positivo para o bloqueio, as pontas do biossensor com anticorpo capturado podem então ser saturadas com um mAb isotipo controle de bloqueio conhecido (subsequentemente referido como "mAb de bloqueio") mergulhando-as em uma solução de mAb de bloqueio. Para determinar se o mAb2 compete com o mAb1, as pontas do biossensor podem ser subsequentemente mergulhadas em uma solução co-complexada de polipeptídeo TMPRSS2 humano e um segundo mAb anti-TMPRSS2 humano (subsequentemente referido como "mAb2"), que foi pré-incubado por um período de tempo, e a ligação do mAb1 ao polipeptídeo TMPRSS2 pode ser determinada. As pontas do biossensor podem ser lavadas em tampão entre cada etapa do experimento. A resposta de ligação em tempo real pode ser monitorada durante o curso do experimento e a resposta de ligação ao final de cada etapa pode ser registrada.
[075] Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, o ensaio de competição é realizado a 25ºC e em pH de aproximadamente 7, por exemplo, 7,4, por exemplo, na presença de tampão, sal, tensoativo e uma proteína não específica (por exemplo, albumina de soro bovino).
[076] Tipicamente, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da invenção que é modificado de alguma maneira mantém a capacidade de se ligar especificamente à TMPRSS2, por exemplo, retém pelo menos 10% de sua atividade de ligação à TMPRSS2 (quando comparado ao anticorpo parental) quando essa atividade é expressa em uma base molar. De preferência, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da invenção retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% ou mais da afinidade de ligação à TMPRSS2 que o anticorpo parental. Pretende-se também que um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da invenção possa incluir substituições de aminoácidos conservativas ou não conservativas (referidas como "variantes conservativas" ou "variantes com função conservada" do anticorpo) que não alterem substancialmente suas atividades biológicas.
[077] Uma "variante" de um polipeptídeo, tal como uma cadeia de imunoglobulina (por exemplo, VH, VL, HC ou LC de H1H7017N), refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 70-99,9% (por exemplo, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) idêntica ou semelhante a uma sequência de aminoácidos referenciada que é aqui apresentada (por exemplo, SEQ ID NO: 2, 4, 17, 18 ou 19); quando a comparação é realizada por um algoritmo BLAST, em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para gerar a maior correspondência entre as respectivas sequências ao longo de todo o comprimento das respectivas sequências de referência (por exemplo, expect threshold: 10; word size: 3; max matches in a query range:
0; BLOSUM 62 matrix; gap costs: existence 11, extension 1; conditional compositional score matrix adjustment).
[078] Uma "variante" de um polinucleotídeo refere-se a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos cerca de 70-99,9% (por exemplo, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) idêntica a uma sequência nucleotídica referenciada que é aqui apresentada (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou 3); quando a comparação é realizada por um algoritmo BLAST, em que os parâmetros do algoritmo são selecionados para gerar a maior correspondência entre as respectivas sequências ao longo de todo o comprimento das respectivas sequências de referência (por exemplo, expect threshold: 10; word size: 28; max matches in a query range: 0; match/mismatch scores: 1, -2; gap costs: linear).
[079] As proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção, em uma forma de realização da invenção, incluem uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina com pelo menos 70% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) de identidade de sequência de aminoácidos em relação aos aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19; e/ou uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina com pelo menos 70% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) de identidade de sequência de aminoácidos em relação aos aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 4 ou 18.
[080] Além disso, uma variante de uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 pode incluir um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos aqui apresentada,
exceto por uma ou mais mutações (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10) como, por exemplo, mutações de sentido trocado (por exemplo, substituições conservativas), mutações sem sentido, deleções ou inserções. Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno que incluem uma variante da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18, mas com uma ou mais dessas mutações e/ou uma variante da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19, mas com uma ou mais dessas mutações. Em uma forma de realização da invenção, uma variante de uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 inclui uma variante da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3, em que uma ou mais dessas CDRs (por exemplo, 1 ou 2 ou 3) possui uma ou mais dessas mutações (por exemplo, substituições conservativas) e/ou uma variante da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, em que uma ou mais dessas CDRs (por exemplo, 1 ou 2 ou 3) possui uma ou mais dessas mutações (por exemplo, substituições conservativas).
[081] A invenção proporciona ainda variantes de proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, compreendendo uma ou mais CDRs variantes (por exemplo, qualquer uma ou mais de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3) aqui apresentadas com pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,9% de identidade de sequência ou similaridade com, por exemplo, a SEQ ID NO: 12, 14, 16, 6, 8 e/ou 10.
[082] As formas de realização da presente invenção incluem ainda variantes de proteínas de ligação a antígeno, por exemplo, anticorpos anti-TMPRSS2 e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que compreendem VHs e VLs; ou HCs e LCs de imunoglobulina, que compreendem uma sequência de aminoácidos com 70% ou mais (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99%) de identidade de sequência de aminoácidos total ou similaridade com as sequências de aminoácidos das VHs, VLs, HCs e LCs correspondentes especificamente aqui apresentadas, mas em que a CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de tais imunoglobulinas não são variantes e compreendem a sequência de aminoácidos apresentada nas SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 6, 8 e 10, respectivamente. Assim, nessas formas de realização, as CDRs nas variantes de proteínas de ligação a antígeno não são variantes por si só.
[083] Os anticorpos variantes anti-TMPRSS2 de forma conservativa modificados e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos também fazem parte da presente invenção. Uma "variante modificada de forma conservativa" ou uma "substituição conservativa" refere-se a uma variante em que há uma ou mais substituições de aminoácidos em um polipeptídeo por outros aminoácidos com características semelhantes (por exemplo, carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação e rigidez estrutural, etc.). Tais mudanças podem frequentemente ser feitas sem interromper significativamente a atividade biológica do anticorpo ou fragmento. Os técnicos nos assunto reconhecem que, em geral, substituições únicas de aminoácidos em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (vide, por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4ª Ed.)). Além disso, as substituições de aminoácidos estrutural ou funcionalmente semelhantes têm menos probabilidade de interromper significativamente a atividade biológica.
[084] Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais hidroxil- alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferenciais são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina- arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina- glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alteração que tenha um valor positivo na matriz de verossimilhança PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45.
[085] Variantes com função conservada dos anticorpos anti- TMPRSS2 e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos também fazem parte da presente invenção. Qualquer uma das variantes dos anticorpos anti-TMPRSS2 e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (conforme discutido aqui) podem ser "variantes com função conservada". Tais variantes com função conservada podem, em alguns casos, também ser caracterizadas como variantes modificadas de forma conservativa. "Variantes com função conservada", conforme utilizadas neste documento, referem-se a variantes dos anticorpos anti-TMPRSS2 ou os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos foram alterados sem alterar significativamente uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo ou fragmento.
Em uma forma de realização da invenção, uma variante com função conservada do anticorpo anti-TMPRSS2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção compreendem uma sequência de aminoácidos variante e exibe uma ou mais das seguintes propriedades funcionais:  Inibe o crescimento do vírus influenza (por exemplo, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)) em células que expressam TMPRSS2 (por exemplo, células Calu-3);  Liga-se à superfície das células que expressam TMPRSS (por exemplo, MDCK/Tet-on), por exemplo, com um valor de EC50 de 440 pM ou 1,06 nM, respectivamente;  Não se liga significativamente às células MDCK/Tet-on que não expressam TMPRSS2;  Liga-se a TMPRSS2 humana com uma KD de cerca de 2,81 x 10-9 M a cerca de 25ºC;  Liga-se a TMPRSS2 humana com uma KD de cerca de 9,31 x 10-9 M a cerca de 37ºC;  Liga-se a TMPRSS2 de cinomolgo com uma KD de cerca de 5,60 x 10-8 M a cerca de 25ºC;  Liga-se a TMPRSS2 de cinomolgo com uma KD de cerca de 1,40 x 10-7 M a cerca de 37ºC;  Limita a propagação da infecção pelo vírus influenza (por exemplo, por H1_PR34; H1_CA09; H1_Bris; vírus influenza H9N2 ou H3N2) das células, por exemplo, Calu- 3, in vitro; e/ou  Protege um camundongo modificado para expressar a proteína TMPRSS2 humana da morte causada pela infecção pelo vírus influenza, por exemplo, H1N1 ou H3N2, por exemplo, em que os camundongos são infectados com uma dose letal do vírus, opcionalmente quando combinada com um anticorpo anti-HA.
[086] A presente invenção inclui um camundongo modificado para expressar a proteína TMPRSS2 humana que inclui, dentro do corpo do camundongo, uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno), tais como H1H7017N e H4H7017N. Vide a Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO 2017/151453.
[087] Uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 “neutralizante” ou “antagonista”, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, refere-se a uma molécula que inibe uma atividade de TMPRSS2 em qualquer nível detectável, por exemplo, inibe a atividade proteásica de TMPRSS2, por exemplo, de um substrato como HA; Cbz-Gly-Gly- Arg-AMC (Sigma), em que Cbz é benziloxicarbonila e AMC é 7- amino-4-metilcumarina; vírus influenza HA0; proteína S do coronavírus; ou precursor de TMPRSS2 que é clivado autocataliticamente entre Arg255 e Ile256 e/ou inibe a entrada do vírus influenza em uma célula e/ou inibe a reprodução do vírus influenza no corpo de um indivíduo.
[088] “H1H7017N” e “H4H7017N” referem-se a proteínas de ligação a antígeno, tais como anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que compreendem a cadeia pesada ou VH (ou uma variante da mesma) e cadeia leve ou VL
(ou uma variante da mesma), conforme apresentado abaixo; ou que compreendem uma VH que compreende as CDRs (CDR-H1 (ou uma variante da mesma), CDR-H2 (ou uma variante da mesma) e CDR- H3 (ou uma variante da mesma)) e uma VL que compreende as CDRs (CDR-L1 (ou uma variante da mesma), CDR-L2 (ou uma variante da mesma) e CDR-L3 (ou uma variante da mesma)), por exemplo, em que as cadeias de imunoglobulina, regiões variáveis e/ou CDRs compreendem as sequências de aminoácidos específicas descritas abaixo.
[089] Em uma forma de realização da invenção, “H1H7017N” ou “H4H7017N” refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as CDR-H1, CDR-H2 e CDR- H3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19 e as CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18.
[090] Em uma forma de realização da invenção, “H1H7017N” ou “H4H7017N” refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo uma VH que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4.
[091] Em uma forma de realização da invenção, “H1H7017N” refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17; e uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.
[092] Em uma forma de realização da invenção, “H4H7017N” refere-se a um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 19; e uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18. O termo “H4H7017N” inclui ainda as formas de realização em que a VH é fusionada a uma IgG4 do tipo selvagem, por exemplo, em que o resíduo 108 é S. Anticorpo Anti-TMRPS22 ou Fragmento de Ligação a Antígeno H1H7017N e H4H7017N
[093] Região Variável da Cadeia Pesada de H1H7017N e H4H7017N (DNA)
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAG CGTCTGGATTCACCTTCAGTTCCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGGCAAGGGGCTCGAGTG GGTGGCAGTTATATGGAATGATGGAAGTTATGTATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATC TCCAGAGACATTTCCAAGAACACGCTGTTTCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGT ATTACTGTGCGAGAGAGGGGGAGTGGGTACTTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCAC
CGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 1)
[094] Região Variável da Cadeia Pesada de H1H7017N e H4H7017N (Polipeptídeo)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVIWNDGSYVYYADSVKGRFTI
SRDISKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAREGEWVLYYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2)
[095] Região Variável da Cadeia Leve de H1H7017N e H4H7017N (DNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCC GGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCT GATCTATAAGGCGTCTACTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAA TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTT
ATTCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA (SEQ ID NO: 3)
[096] Região Variável da Cadeia Leve de H1H7017N e H4H7017N (Polipeptídeo)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTE
FTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 4)
[097] CDR-H1 de H1H7017N e H4H7017N (DNA)
GGA TTC ACC TTC AGT TCC TAT GGC (SEQ ID NO: 5)
[098] CDR-H1 de H1H7017N e H4H7017N (Polipeptídeo)
G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6 (ou uma variante do mesmo com 1, 2, 3 ou 4 mutações pontuais e/ou deleções pontuais))
[099] CDR-H2 de H1H7017N e H4H7017N (DNA)
ATA TGG AAT GAT GGA AGT TAT GTA (SEQ ID NO: 7)
[0100] CDR-H2 de H1H7017N e H4H7017N (Polipeptídeo)
I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8 (ou uma variante do mesmo com 1, 2, 3 ou 4 mutações pontuais e/ou deleções pontuais))
[0101] CDR-H3 de H1H7017N e H4H7017N (DNA)
GCG AGA GAG GGG GAG TGG GTA CTT TAC TAC TTT GAC TAC (SEQ ID NO: 9)
[0102] CDR-H3 de H1H7017N e H4H7017N (Polipeptídeo)
A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10 (ou uma variante do mesmo com 1, 2, 3 ou 4 mutações pontuais e/ou deleções pontuais))
[0103] CDR-L1 de H1H7017N e H4H7017N (DNA)
CAG AGT ATT AGT AGC TGG (SEQ ID NO: 11)
[0104] CDR-L1 de H1H7017N e H4H7017N (Polipeptídeo)
Q S I S S W (SEQ ID NO: 12 (ou uma variante do mesmo com 1, 2, 3 ou 4 mutações pontuais e/ou deleções pontuais))
[0105] CDR-L2 de H1H7017N e H4H7017N (DNA)
AAG GCG TCT
(SEQ ID NO: 13)
[0106] CDR-L2 de H1H7017N e H4H7017N (Polipeptídeo)
K A S (SEQ ID NO: 14 (ou uma variante do mesmo com uma mutação pontual e/ou deleção pontual))
[0107] CDR-L3 de H1H7017N e H4H7017N (DNA)
CAA CAG TAT AAT AGT TAT TCG TAC ACT (SEQ ID NO: 15)
[0108] CDR-L3 de H1H7017N e H4H7017N (Polipeptídeo)
Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16 (ou uma variante do mesmo com 1, 2, 3 ou 4 mutações pontuais e/ou deleções pontuais)) H1H7017N
[0109] Cadeia Pesada de IgG1 Humana Completa
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVIWNDGSYVYYADSVKGRFTI SRDISKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAREGEWVLYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 17)
[0110] Cadeia Leve Kappa Humana Completa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTE FTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN
RGEC (SEQ ID NO: 18) H4H7017N
[0111] Cadeia Pesada de IgG4 Humana Completa (S108P)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVIWNDGSYVYYADSVKGRFTI SRDISKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAREGEWVLYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSE STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPS NTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO: 19)
[0112] Cadeia Leve Kappa Humana Completa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTE FTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN
RGEC (SEQ ID NO: 18)
[0113] Os anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno da presente invenção compreendem cadeias de imunoglobulina, incluindo as sequências de aminoácidos aqui apresentadas, bem como modificações pós-traducionais celulares e in vitro no anticorpo. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a TMPRSS2 compreendendo sequências de aminoácidos de cadeia pesada e/ou leve apresentadas aqui (por exemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR- L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3), bem como anticorpos e fragmentos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são glicosilados, um ou mais resíduos de Asn são desamidados, um ou mais resíduos (por exemplo, Met, Trp e/ou His) são oxidados, a Gln N- terminal é o piroglutamato (piroE) e/ou a Lisina C-terminal está ausente.
[0114] A presente invenção proporciona um recipiente (por exemplo, um frasco de plástico ou vidro, por exemplo, com uma tampa ou uma coluna de cromatografia, agulha de orifício oco ou um cilindro de seringa) compreendendo uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 da presente invenção, por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N.
[0115] A presente invenção proporciona também um dispositivo de injeção compreendendo uma ou mais proteínas de ligação a antígeno (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno) que se ligam especificamente a TMPRSS2, por exemplo, H4H7017N ou H1H7017N, ou uma composição farmacêutica das mesmas.
O dispositivo de injeção pode ser embalado em um kit.
Um dispositivo de injeção é um dispositivo que introduz uma substância no corpo de um indivíduo por uma via parenteral, por exemplo, intramuscular, subcutânea ou intravenosa.
Por exemplo, um dispositivo de injeção pode ser uma seringa (por exemplo, preenchida previamente com a composição farmacêutica, como um autoinjetor) que, por exemplo, inclui um cilindro ou contêiner para reter o fluido a ser injetado (por exemplo, compreendendo o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo), uma agulha para perfurar a pele e/ou os vasos sanguíneos para injeção do fluido; e um êmbolo para empurrar o fluido para fora do cilindro e através do orifício da agulha.
Em uma forma de realização da invenção, um dispositivo de injeção que compreende uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, a partir de uma combinação da presente invenção ou uma composição farmacêutica da mesma é um dispositivo de injeção intravenosa (IV). Esse dispositivo pode incluir a proteína de ligação a antígeno ou uma composição farmacêutica da mesma em uma cânula ou trocarte/agulha que pode ser anexada a um tubo e este podendo ser anexado a uma bolsa ou reservatório para reter fluido (por exemplo, solução salina) introduzido no corpo do indivíduo através da cânula ou trocarte/agulha.
O anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo pode, em uma forma de realização da invenção, ser introduzida no dispositivo uma vez que o trocarte e a cânula são inseridos na veia de um indivíduo e o trocarte é removido da cânula inserida. O dispositivo intravenoso pode, por exemplo, ser inserido em uma veia periférica (por exemplo, na mão ou no braço); na veia cava superior ou veia cava inferior, ou dentro do átrio direito do coração (por exemplo, um IV central); ou em uma veia subclávia, jugular interna ou uma veia femoral e, por exemplo, avançado em direção ao coração até atingir a veia cava superior ou o átrio direito (por exemplo, uma linha venosa central). Em uma forma de realização da invenção, um dispositivo de injeção é um autoinjetor; um injetor de jato ou uma bomba de infusão externa. Um injetor de jato usa um jato de líquido estreito e de alta pressão que penetra na epiderme para introduzir o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo no corpo de um indivíduo. Bombas de infusão externas são dispositivos médicos que entregam o anticorpo ou fragmento ou uma composição farmacêutica do mesmo no corpo de um indivíduo em quantidades controladas. As bombas de infusão externas podem ser alimentadas elétrica ou mecanicamente. Bombas diferentes operam de maneiras diferentes, por exemplo, uma bomba de seringa retém o fluido no reservatório de uma seringa e um pistão móvel controla a entrega do fluido, uma bomba elastomérica retém o fluido em um reservatório de balão extensível e a pressão das paredes elásticas do balão impulsiona a entrega dos fluidos. Em uma bomba peristáltica, um conjunto de rolos aperta um tubo flexível, empurrando o fluido para frente. Em uma bomba multicanal, os fluidos podem ser fornecidos a partir de vários reservatórios a várias taxas.
[0116] A presente invenção proporciona ainda métodos para a administração de uma proteína de ligação a antígeno anti-
TMPRSS2 da presente invenção, por exemplo, H4H7017N ou H1H7017N, que compreende introduzir a proteína de ligação a antígeno no corpo de um indivíduo (por exemplo, um humano). Por exemplo, o método compreende perfurar o corpo do indivíduo com uma agulha de uma seringa e injetar a proteína de ligação a antígeno no corpo do indivíduo, por exemplo, na veia, artéria, tumor, tecido muscular ou subcutâneo do indivíduo. Preparação de Anticorpos Humanos
[0117] Os métodos para a geração de anticorpos humanos em camundongos transgênicos são conhecidos na arte. Quaisquer métodos conhecidos podem ser utilizados no contexto da presente invenção para produzir anticorpos humanos que se ligam especificamente à TMPRSS2. Um imunógeno compreendendo qualquer um dos seguintes pode ser usado para gerar anticorpos para TMPRSS2. Em certas formas de realização da invenção, os anticorpos da invenção são obtidos de camundongos imunizados com uma TMPRSS2 nativa completa ou com um vírus vivo atenuado ou inativado ou com DNA que codifica a proteína ou fragmento da mesma. Alternativamente, a proteína TMPRSS2 ou um fragmento da mesma pode ser produzida utilizando-se técnicas bioquímicas padrão, ser modificada e usada como imunógeno. Em uma forma de realização da invenção, o imunógeno é uma proteína TMPRSS2 produzida de forma recombinante ou um fragmento da mesma. Em certas formas de realização da invenção, o imunógeno pode ser uma vacina com polipeptídeo TMPRSS2. Em certas formas de realização, uma ou mais injeções de reforço podem ser administradas. Em certas formas de realização da invenção, o imunógeno pode ser um polipeptídeo TMPRSS2 recombinante expresso em E. coli ou em qualquer outra célula eucariótica ou de mamífero, como células de ovário de hamster chinês (CHO).
[0118] Utilizando a tecnologia VELOCIMMUNE® (vide, por exemplo, o documento U.S. 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ou qualquer outro método conhecido para gerar anticorpos monoclonais, os anticorpos quiméricos de alta afinidade para TMPRSS2 podem ser inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. A tecnologia VELOCIMMUNE® envolve a geração de um camundongo transgênico com um genoma compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada e leve humanas operacionalmente ligadas aos loci endógenos das regiões constantes do camundongo, de modo que o camundongo produz um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta à estimulação antigênica. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo é isolado e operacionalmente ligado ao DNA que codifica as regiões constantes das cadeias pesada e leve humana. O DNA é então expresso em uma célula capaz de expressar o anticorpo totalmente humano.
[0119] Geralmente, um camundongo VELOCIMMUNE® é desafiado com o antígeno de interesse e os linfócitos (como as células B) são recuperadas dos camundongos que expressam anticorpos. Os linfócitos podem ser fusionados a uma linhagem celular de mieloma para preparar linhagens celulares imortais (hibridoma), e essas linhagens celulares (hibridoma) são rastreadas e selecionadas para se identificar as linhagens celulares (hibridoma) que produzem anticorpos específicos para o antígeno de interesse. O DNA que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser isolado e ligado a regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. Essa proteína (anticorpo) pode ser produzida em uma célula, como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos antígeno-específicos ou os domínios variáveis das cadeias leve e pesada pode ser isolado diretamente dos linfócitos antígeno-específicos.
[0120] Inicialmente, os anticorpos quiméricos de alta afinidade tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo são isolados. Como na seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados pelas características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo etc. As regiões constantes do camundongo são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo totalmente humano da invenção, por exemplo IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificado. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de ligação com alta afinidade ao antígeno e especificidade ao alvo residem na região variável. Anticorpos Anti-TMPRSS2 Compreendendo Variantes de Fc
[0121] De acordo com certas formas de realização da presente invenção, proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, são proporcionadas compreendendo um domínio Fc contendo uma ou mais mutações, que, por exemplo, aumentam ou diminuem a ligação do anticorpo ao receptor FcRn, por exemplo, em pH ácido em comparação com pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-TMPRSS2 compreendendo uma mutação na região CH2 ou CH3 do domínio Fc, em que a(s) mutação(ões) aumenta(m) a afinidade do domínio Fc ao FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossoma onde o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Tais mutações podem resultar em um aumento na meia-vida sérica do anticorpo quando administrado a um animal. Exemplos não limitativos de tais modificações de Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T) e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, A, W, H, F ou Y [N434A, N434W, N434H, N434F ou N434Y]); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F) e 434. Em uma forma de realização, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação 428L, 259I (por exemplo, V259I) e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K) e 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação na 252, 254 e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação na 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P). Ainda em outra forma de realização, a modificação compreende uma modificação 265A (por exemplo, D265A) e/ou 297A (por exemplo, N297A).
[0122] Por exemplo, a presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, compreendendo um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de mutações selecionados do grupo que consiste em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); 257I e 311I (por exemplo, P257I e Q311I); 257I e 434H (por exemplo, P257I e N434H); 376V e 434H (por exemplo, D376V e N434H); 307A, 380A e 434A (por exemplo, T307A, E380A e N434A); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F).
[0123] As proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS, por exemplo, anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, que compreendem uma VH e/ou VL, conforme apresentado neste documento compreendendo quaisquer combinações possíveis das mutações do domínio Fc anteriores, encontram-se contempladas no escopo de presente invenção.
[0124] A presente invenção também inclui proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, compreendendo uma VH apresentada aqui e uma região constante da cadeia pesada quimérica (CH), em que a região quimérica da CH compreende segmentos derivados das regiões CH de mais de um isotipo de imunoglobulinas. Por exemplo, os anticorpos da invenção podem compreender uma região CH quimérica que compreende parte ou todo um domínio CH2 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana, combinada com parte ou todo um domínio CH3 derivado de uma molécula de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. De acordo com certas formas de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma região CH quimérica tendo uma região de dobradiça quimérica. Por exemplo, uma dobradiça quimérica pode compreender uma sequência de aminoácidos de "dobradiça superior" (resíduos de aminoácidos das posições 216 a 227 de acordo com a numeração EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou
IgG4 humana, combinada com uma sequência de "dobradiça inferior"(resíduos de aminoácidos das posições 228 a 236 de acordo com a numeração EU) derivada de uma região de dobradiça de IgG1 humana, IgG2 humana ou IgG4 humana. De acordo com certas formas de realização, a região de dobradiça quimérica compreende resíduos de aminoácidos derivados de uma dobradiça superior de IgG1 humana ou IgG4 humana e resíduos de aminoácidos derivados de uma dobradiça inferior de IgG2 humana. Um anticorpo compreendendo uma região CH quimérica, como aqui descrito, pode, em certas formas de realização, exibir funções efetoras de Fc modificadas sem afetar negativamente as propriedades terapêuticas ou farmacocinéticas do anticorpo. (Vide, por exemplo, o documento WO2014/022540). Imunoconjugados
[0125] A invenção abrange proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, conjugados com outra porção, por exemplo, uma porção terapêutica (um "imunoconjugado"), como um toxoide ou uma droga antiviral para tratar a infecção pelo vírus influenza. Em uma forma de realização da invenção, um anticorpo ou fragmento anti-TMPRSS2 é conjugado com qualquer um dos outros agentes terapêuticos aqui apresentados. Conforme utilizado neste documento, o termo "imunoconjugado" refere-se a uma proteína de ligação a antígeno, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, que é química ou biologicamente ligado a um agente radioativo, uma citocina, um interferon, uma porção alvo ou repórter, uma enzima, um peptídeo ou proteína ou um agente terapêutico. A proteína de ligação a antígeno pode estar ligada ao agente radioativo, citocina, interferon, porção alvo ou repórter, enzima, peptídeo ou agente terapêutico em qualquer local ao longo da molécula, desde que seja capaz de se ligar ao seu alvo (TMPRSS2). Exemplos de imunoconjugados incluem conjugados anticorpo-droga e proteínas de fusão anticorpo- toxina. Em uma forma de realização da invenção, o agente pode ser um segundo anticorpo diferente que se liga especificamente a TMPRSS2. O tipo de porção terapêutica que pode ser conjugada com a proteína de ligação a antígeno anti- TMPRSS2 (por exemplo, anticorpo ou fragmento) levará em consideração a condição a ser tratada e o efeito terapêutico que deseja ser alcançado. Vide, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 1984: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985) e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982). Anticorpos Multiespecíficos
[0126] A presente invenção inclui proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, bem como métodos de uso dos mesmos e métodos para produção dessas proteínas de ligação a antígeno. O termo proteínas de ligação a antígeno “anti-TMPRSS2”, por exemplo, anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno, inclui moléculas multiespecíficas (por exemplo, biespecíficas ou biparatópica) que incluem pelo menos um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS2 (por exemplo, um domínio de ligação a antígeno de H1H7017N ou H4H7017N) e pelo menos um segundo domínio de ligação a antígeno que se liga a um antígeno diferente ou a um epítopo na TMPRSS2 que é diferente daquele do primeiro domínio de ligação a antígeno (por exemplo, HA do influenza, como um domínio de ligação a antígeno de H1H14611N2, H1H14612N2 ou H1H11729P). Em uma forma de realização da invenção, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem. Em outra forma de realização da invenção, o primeiro e o segundo epítopos não se sobrepõem. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, um anticorpo multiespecífico é um anticorpo IgG biespecífico (por exemplo, IgG1 ou IgG4) que inclui um primeiro domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS2, incluindo a cadeia pesada e leve de imunoglobulina de H1H7017N ou H4H7017N, e um segundo domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente à HA do influenza (compreendendo uma cadeia leve e pesada de imunoglobulina diferente, como de H1H14611N2, H1H14612N2 ou H1H11729P).
[0127] “H1H7017N” inclui moléculas multiespecíficas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, que incluem as HCDRs e LCDRs, VH e VL, ou HC e LC de H1H7017N
(incluindo variantes das mesmas, conforme descrito neste documento).
[0128] “H4H7017N” inclui moléculas multiespecíficas, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, que incluem as HCDRs e LCDRs, VH e VL, ou HC e LC de H4H7017N (incluindo variantes das mesmas, conforme descrito neste documento).
[0129] Em uma forma de realização da invenção, um domínio de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS e que pode ser incluído em uma molécula multiespecífica, compreende: (1) (i) uma sequência do domínio variável da cadeia pesada que compreende CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6, CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10, e (ii) uma sequência do domínio variável da cadeia leve que compreende CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 12, CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14 e CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 16; ou, (2) (i) uma sequência do domínio variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, e
(ii) uma sequência do domínio variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; ou, (3) (i) uma sequência da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 ou 19, e (ii) uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18.
[0130] Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo ou fragmento multiespecífico inclui mais de duas especificidades de ligação diferentes (por exemplo, uma molécula triespecífica), por exemplo, um ou mais domínios adicionais de ligação a antígeno que são iguais ou diferentes do primeiro e/ou segundo domínios de ligação a antígeno.
[0131] Em uma forma de realização da invenção, uma molécula multiespecífica compreende, além de um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS2, um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente à HA do influenza retirado de um anticorpo selecionado do grupo que consiste em: H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B;
H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B;
H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B;
H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; e H1H18335B; conforme apresentado na Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO2016/100807 (por exemplo, as CDR-Hs, VH ou cadeia pesada dos mesmos; e as CDR-LS, VL ou cadeia leve dos mesmos).
[0132] Em uma forma de realização da invenção, uma molécula multiespecífica compreende, além de um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS2, um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente à proteína HA do influenza do Grupo II, por exemplo, que compreende VH e VL de H1H14611N2 (por exemplo, SEQ ID NOS: 24 e 28); ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 de H1H14611N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 25-27) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de H1H14611N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 29- 31).
[0133] Em uma forma de realização da invenção, uma molécula multiespecífica compreende, além de um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS2, um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente à proteína HA do influenza do Grupo II, por exemplo, que compreende VH e VL de H1H14612N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 40 e 44); ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 de H1H14612N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 41-43) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de H1H14612N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 45- 47).
[0134] Em uma forma de realização da invenção, uma molécula multiespecífica compreende, além de um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente à TMPRSS2, um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente à proteína HA do influenza do Grupo I, por exemplo, que compreende VH e VL de H1H11729P (por exemplo, SEQ ID NOs: 32 e 36); ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 de H1H11729P (por exemplo, SEQ ID NOs: 33-35) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 de H1H11729P (por exemplo, SEQ ID NOs: 37-39).
[0135] Em uma forma de realização da invenção, um fragmento de ligação a antígeno biespecífico compreende um primeiro scFv (por exemplo, compreendendo VH e VL de H1H7017N ou H4H7017N) tendo especificidade de ligação a um primeiro epítopo (por exemplo, TMPRSS2) e um segundo scFv (por exemplo, compreendendo VH e VL de um anticorpo anti-HA de influenza) tendo especificidade de ligação a um segundo epítopo diferente. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, o primeiro e o segundo scFv são unidos a um ligante,
por exemplo, um ligante peptídico (por exemplo, um ligante GS como (GGGGS)n (SEQ ID NO: 48) em que n é, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10). Outros fragmentos de ligação ao antígeno biespecíficos incluem um fragmento F(ab)2 de um anticorpo IgG biespecífico que compreende as CDRs da cadeia pesada e leve de H1H7017N ou H4H7017N e de um outro anticorpo que se liga a um epítopo diferente. Métodos Terapêuticos
[0136] A presente invenção proporciona métodos para o tratamento ou prevenção da infecção viral ou câncer (por exemplo, câncer da próstata) através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N) a um indivíduo (por exemplo, um humano) que precise de tal tratamento ou prevenção.
[0137] A infecção pelo vírus influenza pode ser tratada ou evitada, em um indivíduo, através da administração de uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 da presente invenção a um indivíduo. Os vírus influenza são classificados nos tipos A, B e C com base em suas proteínas principais. Os subtipos de vírus influenza A são determinados pelas glicoproteínas do envelope que possuem atividade de hemaglutinina (HA) ou neuraminidase (NA). Existem vários subtipos de HA (por exemplo, HA1, HA2, HA3, HA4, HA5, HA6, HA7, HA8, HA9, HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15, HA16, HA17 ou HA18 - esses subtipos podem ser designados como H1, H2, H3, etc.) e subtipos de NA (por exemplo, NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7, NA8, NA9, NA10 ou NA11 - esses subtipos podem ser designados como N1, N2, N3, etc.) de vírus influenza que são utilizados para designar o subtipo A de influenza. Por exemplo, o vírus influenza A H1N1 e H3N2 são patógenos humanos comumente conhecidos. Os seres humanos são comumente infectados por vírus dos subtipos H1, H2 ou H3 e N1 ou N2. A presente invenção inclui métodos para o tratamento ou prevenção da infecção por um subtipo de vírus influenza discutido aqui. Os anticorpos multiespecíficos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos que se ligam à TMPRSS2, em uma forma de realização da invenção, também se ligam à HA e/ou à NA, por exemplo, de um subtipo aqui apresentado.
[0138] Uma dose eficaz ou terapeuticamente eficaz da proteína de ligação ao antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral, refere-se à quantidade do anticorpo ou fragmento suficiente para aliviar um ou mais sinais e/ou sintomas da infecção no indivíduo tratado, induzindo a regressão ou eliminação de tais sinais e/ou sintomas ou inibindo a progressão de tais sinais e/ou sintomas. A quantidade da dose pode variar dependendo da idade e do tamanho de um indivíduo a ser administrado, da doença alvo, condições, da via de administração e similares. Em uma forma de realização da invenção, uma dose eficaz ou terapeuticamente eficaz de anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção, para tratamento ou prevenção da infecção viral, por exemplo, em um indivíduo humano adulto, é de cerca de 0,01 a cerca de 200 mg/kg, por exemplo, até cerca de 150 mg/kg. Em uma forma de realização da invenção, a dosagem é de até 10,8 ou 11 gramas (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 gramas). Dependendo da gravidade da infecção, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. Em certas formas de realização, a proteína de ligação a antígeno da presente invenção pode ser administrada em uma dose inicial, seguida por uma ou mais doses secundárias. Em certas formas de realização, a dose inicial pode ser seguida pela administração de uma segunda ou pluralidade de doses subsequentes de anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, em uma quantidade que pode ser aproximadamente a mesma ou menor que a da dose inicial, em que as doses subsequentes são separadas por pelo menos 1 dia a 3 dias; pelo menos uma semana, pelo menos 2 semanas; pelo menos 3 semanas; pelo menos 4 semanas; pelo menos 5 semanas; pelo menos 6 semanas; pelo menos 7 semanas; pelo menos 8 semanas; pelo menos 9 semanas; pelo menos 10 semanas; pelo menos 12 semanas; ou pelo menos 14 semanas.
[0139] Conforme utilizado neste documento, o termo "indivíduo" refere-se a um mamífero (por exemplo, rato, camundongo, gato, cachorro, vaca, ovelha, cavalo, cabra, coelho), preferencialmente um humano, por exemplo, que precisa de prevenção e/ou tratamento de uma doença ou distúrbio, como uma infecção viral ou câncer. O indivíduo pode apresentar uma infecção viral, por exemplo, uma infecção por influenza, ou ser predisposto a desenvolver uma infecção. Os indivíduos predispostos a desenvolver uma infecção, ou indivíduos que podem estar em risco elevado de contrair uma infecção (por exemplo, pelo vírus influenza), incluem indivíduos com sistema imunológico comprometido por causa de doença autoimune, indivíduos que recebem terapia imunossupressora (por exemplo, após transplante de órgão),
indivíduos afetados pela síndrome da imunodeficiência humana (HIV) ou síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), indivíduos com formas de anemia que depletam ou destroem os glóbulos brancos, indivíduos que recebem radiação ou quimioterapia ou indivíduos afetados por um distúrbio inflamatório. Além disso, indivíduos muito jovens (por exemplo, 5 anos de idade ou menos) ou com idade avançada (por exemplo, 65 anos de idade ou mais) estão sob maior risco. Além disso, um indivíduo pode estar em risco de contrair uma infecção viral devido à proximidade de um surto da doença, por exemplo, o indivíduo reside em uma cidade densamente povoada ou nas proximidades de indivíduos com infecções confirmadas ou suspeitas por um vírus ou devido ao trabalho, por exemplo, trabalhador hospitalar, pesquisador farmacêutico, viajante para área infectada ou passageiro frequente.
[0140] "Tratar" ou "tratando" significa administrar uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da presente invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), a um indivíduo tendo um ou mais sinais ou sintomas de uma doença ou infecção, por exemplo, infecção viral, para a qual a proteína de ligação a antígeno é eficaz quando administrada ao indivíduo em uma quantidade ou dose eficaz ou terapeuticamente eficaz (conforme discutido aqui).
[0141] A presente invenção também abrange a administração profilática de uma proteína de ligação a antígeno anti- TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), a um indivíduo que esteja em risco de infecção viral, de modo a prevenir essa infecção. A imunoprofilaxia passiva baseada em anticorpos provou ser uma estratégia eficaz para impedir a infecção viral no indivíduo. Vide, por exemplo, Berry et al., “Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis”. Influenza Res Treat. 2014; 2014: 267594. Epub 2014 22 de setembro; e Jianqiang et al. “Passive immune neutralization strategies for prevention and control of influenza A infections”, Immunotherapy. Fevereiro de 2012; 4(2): 175-186; Prabhu et al. Antivir Ther. 2009; 14 (7): 911-21, “Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenza". “Prevenir" ou " prevenção" significa administrar uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno da presente invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), a um indivíduo para inibir a manifestação de uma doença ou infecção (por exemplo, infecção viral) no corpo de um indivíduo, para o qual a proteína de ligação a antígeno é eficaz quando administrada ao indivíduo em uma quantidade ou dose eficaz ou terapeuticamente eficaz (conforme discutido aqui).
[0142] Em uma forma de realização da invenção, um sinal ou sintoma de uma infecção viral em um indivíduo é a sobrevivência ou proliferação de vírus no corpo do indivíduo, por exemplo, conforme determinado pelo teste de titulação viral (por exemplo, propagação do vírus influenza em ovos embrionados de galinha ou ensaio de hemaglutinação por vírus influenza). Outros sinais e sintomas de infecção viral são discutidos aqui.
[0143] A presente invenção proporciona um método para o tratamento ou prevenção da infecção viral (por exemplo, infecção por vírus influenza ou coronavírus) ou para induzir a regressão ou eliminação ou inibir a progressão de pelo menos um sinal ou sintoma de infecção viral, como:  Febre ou sensação de febre/calafrios;  Tosse;  Dor de garganta;  Coriza ou nariz congestionado;  Espirros;  Dores musculares ou corporais;  Dores de cabeça;  Fadiga (cansaço);  Vômito;  Diarreia;  Infecção do trato respiratório;  Desconforto no peito;  Falta de ar;  Bronquite; e/ou  Pneumonia, cujo sinal ou sintoma é secundário à infecção viral, em um indivíduo que precisa do mesmo (por exemplo, um humano), através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N) ao indivíduo, por exemplo, injetando a proteína no corpo do indivíduo.
[0144] A presente invenção também inclui métodos para o tratamento ou prevenção do câncer, por exemplo, câncer metastático, por exemplo, câncer de próstata (por exemplo, caracterizado pela expressão de uma fusão TMPRSS2: ERG),
câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer de trato urinário, câncer de mama, câncer de ovário, adenocarcinoma de próstata, carcinoma de células renais, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de células escamosas pulmonares e/ou mesotelioma pleural, em um indivíduo, através da administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a antígeno TMPRSS2 (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N) ao indivíduo, por exemplo, injetando a proteína dentro do corpo do indivíduo. Em uma forma de realização da invenção, a proteína de ligação a antígeno TMPRSS2 em associação com um agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente terapêutico anticâncer, também são administrados ao indivíduo. Em uma forma de realização da invenção, o câncer é um tumor cujas células expressam TMPRSS2 ou uma variante da mesma. Combinações e Composições Farmacêuticas
[0145] Para preparar as composições farmacêuticas das proteínas de ligação ao antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), a proteína de ligação a antígeno é misturada com um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences e US Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, Nova York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams e Wilkins, Nova York, NY; Avis et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms:
Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner e Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nova York, NY. Em uma forma de realização da invenção, a composição farmacêutica é estéril. Tais composições fazem parte da presente invenção.
[0146] O escopo da presente invenção inclui composições dessecadas, por exemplo, liofilizadas, que compreendem as proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), ou uma composição farmacêutica da mesma que inclui um carreador farmaceuticamente aceitável, mas que está isenta substancialmente de água.
[0147] Em uma outra forma de realização da invenção, um outro agente terapêutico que é administrado a um indivíduo em associação com uma proteína de ligação ao antígeno anti- TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), divulgado aqui, é administrado ao indivíduo de acordo com o Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57ª edição (1 de novembro de 2002)).
[0148] O modo de administração pode variar. As vias de administração incluem oral, retal, transmucosa, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutânea, intradérmica, intramedular, intratecal, intraventricular direto, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, intraocular,
inalação, insuflação, tópica, cutânea, transdérmica ou intra-arterial.
[0149] A presente invenção proporciona métodos para a administração de uma proteína de ligação ao antígeno anti- TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), que compreende introduzir a proteína dentro do corpo de um indivíduo. Por exemplo, o método compreende perfurar o corpo do indivíduo com uma agulha de uma seringa e injetar a proteína de ligação a antígeno no corpo do indivíduo, por exemplo, na veia, artéria, tumor, tecido muscular ou subcutâneo do indivíduo.
[0150] A presente invenção proporciona um recipiente (por exemplo, um frasco de plástico ou vidro, por exemplo, com uma tampa ou uma coluna de cromatografia, agulha de orifício oco ou um cilindro de seringa) compreendendo qualquer uma das proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), polipeptídeos (por exemplo, uma HC, LC, VH ou VL de H1H7017N ou H4H7017N) ou polinucleotídeos ou vetores apresentados neste documento ou uma composição farmacêutica dos mesmos compreendendo um carreador farmaceuticamente aceitável.
[0151] Em uma forma de realização da invenção, uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), está em associação com um ou mais outros agentes terapêuticos. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, o agente terapêutico adicional é um fármaco antiviral e/ou uma vacina.
Conforme utilizado neste documento, o termo "droga antiviral" refere-se a qualquer droga ou terapia anti- infecciosa usada para tratar, prevenir ou melhorar uma infecção viral em um indivíduo. O termo "droga antiviral" inclui, mas não se limita a um esteroide catiônico antimicrobiano, leupeptina, aprotinina, amantadina, rimantadina, oseltamivir, zanamivir, ribavirina ou interferon-alfa2b. Métodos para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral (por exemplo, Influenza) em um indivíduo que precisa do referido tratamento ou prevenção através da administração de H1H7017N ou H4H7017N em associação com um outro agente terapêutico fazem parte da presente invenção.
[0152] Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, o agente terapêutico adicional é uma vacina, por exemplo, uma vacina contra influenza. Em uma forma de realização da invenção, uma vacina é uma vacina de vírus inativado/morto, uma vacina de vírus vivo atenuado ou uma vacina de subunidade viral.
[0153] Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, o agente terapêutico adicional é: (mesilato de camostato);
(mesilato de nafamostato);
cloridrato de bromexina (BHH));
Cloridrato de fluoreto de (4-(2-aminometil) benzenossulfonila (AEBSF));
ou (poliamida). Vide Shen et al. Biochimie 142: 1-10 (2017).
[0154] Em uma forma de realização da invenção, a droga antiviral é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente ao vírus influenza, por exemplo, HA do influenza. Por exemplo, em uma forma de realização da invenção, o anticorpo anti-HA é qualquer um dos H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B;
H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B;
H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B;
H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; ou H1H18335B conforme apresentado na Publicação do Pedido de Patente Internacional No. WO2016/100807; ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, por exemplo, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma cadeia leve de imunoglobulina que inclui CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 (por exemplo, a VL ou cadeia leve da mesma); e uma cadeia pesada que inclui CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3 (por exemplo, a VH ou cadeia pesada da mesma) de qualquer um dos anticorpos anti-influenza HA anteriores.
[0155] Em uma forma de realização da invenção, um agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga à proteína HA do influenza do Grupo II, como H1H14611N2; ou um anticorpo ou fragmento que compreende VH e VL de H1H14611N2; ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de H1H14611N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 25-27) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 de H1H14611N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 29-31). “H1H14611N2" refere-se a qualquer anticorpo anti-HA do Grupo II compreendendo essas sequências. H1H14611N2
[0156] Região Variável da Cadeia Pesada
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGFSMNWVRQVPGKGLEWVSSISTSGNYMYYADSVKGRFTI SRDNAKKSFSLQMNSLRAEDSAIYYCARGGGYNWNLFDYWGQGSLVTVSS (SEQ ID NO: 24) CDR-H1: GFTFSGFS (SEQ ID NO: 25) CDR-H2: ISTSGNYM (SEQ ID NO: 26) CDR-H3: ARGGGYNWNLFDY (SEQ ID NO: 27)
[0157] Região Variável da Cadeia Leve
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTITRLESEDFAVYYCQQYGNSPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 28) CDR-L1: QSLNSNY (SEQ ID NO: 29) CDR-L2: GAS (SEQ ID NO: 30) CDR-L3: QQYGNSPLT (SEQ ID NO: 31)
[0158] Em uma forma de realização da invenção, um agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga à proteína HA do influenza do Grupo II, como H1H14612N2; ou um anticorpo ou fragmento que compreende VH e VL de H1H14612N2; ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de H1H14612N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 41-43) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR- L3 de H1H14612N2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 45-47). “H1H14612N2" refere-se a qualquer anticorpo anti-HA do Grupo II compreendendo essas sequências. H1H14612N2
[0159] Região Variável da Cadeia Pesada
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSGFSMNWVRQAPGKGLEWVSSISTSGNYMYYADSVKGRFTI SRDNAKKSFSLQMNSLRAEDSAIYYCARGGGYNWNLFDYWGQGSLVTVSS (SEQ ID NO: 40) CDR-H1: GFSFSGFS (SEQ ID NO: 41) CDR-H2: ISTSGNYM (SEQ ID NO: 42) CDR-H3: ARGGGYNWNLFDY (SEQ ID NO: 43)
[0160] Região Variável da Cadeia Leve
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGA DFTLTISRLESEDFAVYYCQQYGNSPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 44) CDR-L1: QSLNSNY (SEQ ID NO: 45) CDR-L2: GAS (SEQ ID NO: 46) CDR-L3: QQYGNSPLT (SEQ ID NO: 47)
[0161] Em uma forma de realização da invenção, um agente terapêutico adicional é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga à proteína HA do influenza do Grupo
I, como H1H11729P; ou um anticorpo ou fragmento que compreende VH e VL de H1H11729P; ou uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de H1H11729P (por exemplo, SEQ ID NOs: 33-35) e uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de H1H11729P (por exemplo, SEQ ID NOs: 37-39). “H1H11729P" refere-se a qualquer anticorpo anti-HA do Grupo I compreendendo essas sequências. H1H11729P
[0162] Região Variável da Cadeia Pesada
QVQLVQSGAEVKKSGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTPSYAQKFQDRVTI TTDESTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARQQPVYQYNMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 32) CDR-H1: GGTFSSYA (SEQ ID NO: 33) CDR-H2: IIPIFGTP (SEQ ID NO: 34) CDR-H3: ARQQPVYQYNMDV (SEQ ID NO: 35)
[0163] Região Variável da Cadeia Leve
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLGWYQQKPLKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTE FTLTISSLQPEDFATYYCLQYNNYPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 36) CDR-L1: QGIRNN (SEQ ID NO: 37) CDR-L2: AAS (SEQ ID NO: 38) CDR-L3: LQYNNYPWT (SEQ ID NO: 39)
[0164] Em uma certa forma de realização da invenção, o agente terapêutico adicional não é amantadina, rimantadina, oseltamivir, zanamivir, aprotinina, leupeptina, um esteroide catiônico antimicrobiano, uma vacina contra influenza (por exemplo, vacina de subunidade viral ou de vírus inteiro morto, vivo ou atenuado), ou um anticorpo contra o vírus influenza (por exemplo, um anticorpo anti-hemaglutinina).
[0165] O termo "em associação com" indica que os componentes, uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção, juntamente com outro agente como oseltamivir, podem ser formulados em uma única composição, por exemplo, para administração simultânea ou formulada separadamente em duas ou mais composições (por exemplo, um kit). Cada componente pode ser administrado a um indivíduo em um momento diferente do que quando o outro componente é administrado; por exemplo, cada administração pode ser administrada não simultaneamente (por exemplo, separada ou sequencialmente) em intervalos durante um determinado período de tempo. Além disso, os componentes separados podem ser administrados a um indivíduo pela mesma via ou por uma diferente (por exemplo, um anticorpo anti-TMPRSS2 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo). Kits
[0166] Além disso, são fornecidos kits que compreendem um ou mais componentes que incluem, mas não estão limitados a uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno conforme discutido aqui (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), em associação com um ou mais componentes adicionais, incluindo, mas não limitado a um outro agente terapêutico, conforme discutido aqui. A proteína de ligação a antígeno e/ou o agente terapêutico adicional podem ser formulados como uma composição única ou separadamente em duas ou mais composições, por exemplo, com um carreador farmaceuticamente aceitável, em uma composição farmacêutica.
[0167] Em uma forma de realização da invenção, o kit inclui uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), ou uma composição farmacêutica da mesma em um recipiente (por exemplo, em um frasco estéril de vidro ou plástico) e outro agente terapêutico em outro recipiente (por exemplo, em um frasco estéril de vidro ou plástico).
[0168] Em outra forma de realização, o kit compreende uma combinação da invenção, incluindo uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), ou composição farmacêutica da mesma em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais formulados juntos, opcionalmente, em uma composição farmacêutica, em um único recipiente comum.
[0169] Se o kit incluir uma composição farmacêutica para administração parenteral a um indivíduo, o kit poderá incluir um dispositivo (por exemplo, um dispositivo de injeção) para realizar tal administração. Por exemplo, o kit pode incluir uma ou mais agulhas hipodérmicas ou outros dispositivos de injeção, como discutido acima, contendo a proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N).
[0170] O kit pode incluir uma bula, incluindo informações sobre as composições farmacêuticas e formas de dosagem no kit. Geralmente, essas informações ajudam pacientes e médicos a usar as composições farmacêuticas contidas e as formas de dosagem de forma eficaz e segura. Por exemplo, as seguintes informações sobre uma combinação da invenção podem ser fornecidas na bula: farmacocinética, farmacodinâmica, estudos clínicos, parâmetros de eficácia, indicações e uso, contraindicações, avisos, precauções, reações adversas, superdosagem, dosagem e administração adequadas,
apresentação, condições adequadas de armazenamento, referências, informações sobre o fabricante/distribuidor e informações sobre patentes. Usos Diagnósticos dos Anticorpos
[0171] As proteínas de ligação ao antígeno anti-TMPRSS2, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo da presente invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N), podem ser utilizados para detectar e/ou medir TMPRSS2 em uma amostra. Exemplos de ensaios para TMPRSS2 podem incluir, por exemplo, colocar uma amostra em contato com uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 da invenção, em que a proteína de ligação a antígeno anti- TMPRSS2 é marcada com um marcador detectável ou molécula repórter ou usada como um ligante de captura para isolar seletivamente a TMPRSS2 das amostras. A presença de uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 complexada com TMPRSS2 indica a presença de TMRPSS2 na amostra. Alternativamente, um anticorpo anti-TMPRSS2 não marcado pode ser usado em combinação com um anticorpo secundário que é marcado de forma detectável. O marcador ou molécula repórter detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente, como isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima como a fosfatase alcalina, β-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre ou luciferase. Exemplos de ensaios específicos que podem ser usados para detectar ou medir TMPRSS2 em uma amostra incluem o ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e separação de células ativada por fluorescência (FACS). Assim, a presente invenção inclui um método para detectar a presença do polipeptídeo TMPRSS2 em uma amostra que compreende colocar a amostra em contato com uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 e detectar a presença de uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2/TMPRSS, em que a presença do complexo indica a presença de TMPRSS2.
[0172] A presente invenção inclui métodos de ELISA baseados em células usando as proteínas de ligação a antígeno anti- TMPRSS2, por exemplo, anticorpos e os fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos da presente invenção (por exemplo, H1H7017N), para detectar a presença de TMPRSS2 em uma célula. Em uma forma de realização da invenção, o método inclui as etapas: (i) colocar as células imobilizadas em contato com uma superfície sólida (por exemplo, uma microplaca) a ser testada quanto à presença de TMPRSS2 com uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 da presente invenção; (ii) lavar opcionalmente a mistura para remover a proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 não ligada; (iii) colocar a proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 em contato com um anticorpo secundário marcado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2; (iv) lavar opcionalmente o complexo para remover a proteína de ligação a antígeno não ligada; e (v) detectar a presença do marcador no anticorpo secundário ou fragmento, em que a detecção do marcador indica que as células contêm TMPRSS2. Por exemplo, a presente invenção inclui esses métodos de ELISA baseados em células para identificar as células TMPRSS2+ em uma amostra.
[0173] Uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 da invenção (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N) pode ser usado em um procedimento de Western blot ou imunoblot de proteína para detectar a presença de TMPRSS2 ou um fragmento da mesma em uma amostra. Tal procedimento faz parte da presente invenção e inclui as etapas de, por exemplo: (1) proporcionar uma membrana ou outro substrato sólido compreendendo uma amostra a ser testada quanto à presença de TMPRSS2, por exemplo, incluindo opcionalmente a etapa de transferência de proteínas de uma amostra a ser testada quanto à presença de TMPRSS2 (por exemplo, de uma separação eletroforética por PAGE ou SDS-PAGE das proteínas na amostra) para uma membrana ou outro substrato sólido usando um método conhecido na arte (por exemplo, blotting semisseco ou blotting úmido (tank blotting)); e colocar a membrana ou outro substrato sólido a ser testado quanto à presença de TMPRSS2 ou um fragmento da mesma em contato com uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 da invenção.
[0174] Essa membrana pode estar sob a forma, por exemplo, de uma membrana à base de nitrocelulose ou vinil (por exemplo, fluoreto de polivinilideno (PVDF)) na qual as proteínas a serem testadas quanto à presença de TMPRSS2 em uma PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida)) em gel não desnaturante ou SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio) foram transferidas (por exemplo, após separação eletroforética no gel). Antes de colocar a membrana em contato com a proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2, a membrana é opcionalmente bloqueada, por exemplo, com leite em pó desnatado ou semelhante, de modo a ligar os sítios de ligação não específicos à proteína na membrana. (2) lavar a membrana uma ou mais vezes para remover a proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 não ligada e outras substâncias não ligadas; e (3) detectar a proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 ligada.
[0175] A detecção da proteína de ligação a antígeno ligada indica que a proteína TMPRSS2 está presente na membrana ou substrato e na amostra. A detecção da proteína de ligação a antígeno ligada pode ser por meio da ligação da proteína de ligação a antígeno com um anticorpo secundário (um anticorpo anti-imunoglobulina) que é marcado de forma detectável e, em seguida, da detecção da presença do marcador de anticorpo secundário.
[0176] As proteínas de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 (por exemplo, anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno (por exemplo, H1H7017N ou H4H7017N)) aqui revelados também podem ser utilizados para a imuno-histoquímica. Esse método faz parte da presente invenção e compreende, por exemplo, (1) colocar o tecido a ser testado quanto à presença da proteína TMPRSS2 em contato com uma proteína de ligação a antígeno anti-TMPRSS2 da invenção; e (2) detectar a proteína de ligação a antígeno no ou dentro do tecido.
[0177] Se a própria proteína de ligação a antígeno for detectável, ela poderá ser detectada diretamente. Alternativamente, a proteína de ligação a antígeno pode ser ligada por um anticorpo secundário marcado de forma detectável, em que o marcador é então detectado.
EXEMPLOS
[0178] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer aos técnicos no assunto uma definição e descrição completas de como fazer e usar os métodos e composições da invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos para garantir a precisão em relação aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. Salvo indicação em contrário, as partes referem-se a partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura está em graus centígrados, a temperatura ambiente é de cerca de 25ºC e a pressão é igual ou próxima à atmosférica. Exemplo 1: Replicação Multiciclo In Vitro.
[0179] A capacidade do vírus influenza, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP, de se replicar em células Calu3, A549, MDCK e HepG2 foi avaliada. Tabela 1. Reagentes utilizados. Descrição Fornecedor American Type Culture Células Calu-3 Collection (ATCC) American Type Culture Células A549 Collection (ATCC) Células MDCK (Londres) IRR American Type Culture Células HepG2 Collection (ATCC) A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) N/A -GFP DMEM Gibco F12 Gibco Pen/Strep Gibco BSA com baixo nível de IgG Sigma PBS Life Technologies Soro fetal bovino Life Technologies
[0180] Procedimento experimental
[0181] As células Calu-3 (ATCC HTB55), células A549 (ATCC CCL-185), células MDCK (IRR FR-58) e células HepG2 (ATCC HB- 8065) foram diluídas para 40.000 células/poço em uma placa de 96 poços em Meio DMEM:F12 com 5% de SFB. No dia seguinte, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) carreando um gene repórter GFP no segmento NS (B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22; 107 (25): 11531-6) foi preparado em uma MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1 e 0,01 em DMEM: F12 com BSA com baixo nível de IgG após três lavagens. O vírus foi incubado nas células por 1 hora a 37ºC, em seguida, o vírus foi removido e os poços foram lavados mais três vezes. O número de células infectadas foi quantificado em 24, 48, 72 e 142 h pós- infecção em um Analisador Universal CTL-ImmunoSpot® S6 (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).
[0182] Resumo dos resultados e conclusões
[0183] Calu-3 é uma linhagem de células epiteliais humanas imortalizadas de vias aéreas, e demonstrou-se que elas permitem múltiplos ciclos de replicação dos vírus influenza humanos na ausência de tripsina exógena (Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology 81, 12439-12449 (2007)). Além disso, foi demonstrado que as células Calu-3 expressam TMPRSS2 e TMPRSS4, mas não TMPRSS11D (HAT) pelo menos no nível do RNAm (Böttcher-Friebertshäuser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology 85, 1554-1562 (2011)). Para confirmar que as células Calu-3 podem propiciar a ativação proteolítica do vírus influenza que possui hemaglutinina com um sítio de clivagem monobásico, o crescimento de um vírus H1N1 com repórter GFP em células Calu-3 foi analisado e a replicação ao longo do tempo em células A549 (epitelial basal alveolar humano), MDCK (Madin Darby Canine Kidney) e HepG2 (carcinoma hepático humano) na ausência de tripsina foi comparada. As células foram infectadas com uma MOI baixa e, no ponto no tempo indicado, os títulos virais foram determinados pela contagem de pontos de foco fluorescentes. A Tabela 2 e a Figura 1 ilustram baixos níveis de infecção nas células A549, MDCK e HepG2, enquanto as células Calu-3 mostram títulos significativamente aumentados a cada ponto no tempo. Embora tenha sido demonstrado que as células Calu- 3 expressam TMPRSS2 e TMPRSS4 no nível do RNAm, o knockdown de TMPRSS2 reduziu os títulos do vírus influenza em 100 a
1.000 vezes (Böttcher-Friebertshäuser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology 85, 1554-1562 (2011). O baixo nível de títulos virais nas células A549, MDCK e HepG2 na ausência de tripsina deve-se provavelmente à adição de vírus clivados (coletados a partir de ovos embrionados de galinha ou da cultura de MDCK com tripsina), mas a presença de outra protease ativadora de HA poderia ser uma explicação. Tabela 2. Número de células infectadas representadas por Unidades de Foco Fluorescente (FFU) em diferentes dias após a infecção com uma MOI de 0,1 ou 0,01 em diferentes tipos celulares após a infecção por A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) -GFP. Linhagem MOI 0,1 MOI 0,01 Dia(s) pós-infecção celular FFU FFU 1 697 54 2 1167 201 Calu3 3 1644 376 4 1530 500 1 238 35 2 238 46 A549 3 258 53 4 228 52 1 740 77 2 750 60
MDCK 3 879 58 4 796 53 1 3 1 2 14 9 HepG2 3 20 13 4 21 20
[0184] REFERÊNCIAS
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387–16 (2017). PMID:
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27733646.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76–84 (2015). PMID:25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID:26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554–1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016–10025 (2010). PMID:
20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), May;88(9):4744-51.doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 2006 Oct;80(19):9896-8. PMID: 16973594.
10. B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22;107(25):11531-6. doi:
10.1073/pnas.0914994107. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439–12449 (2007). PMID: 17855549. Exemplo 2: Anticorpo Anti-TMPRSS2 H1H7017N bloqueia a propagação do influenza in vitro.
[0185] A capacidade de vários anticorpos em reduzir os títulos do vírus influenza A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) foi avaliada em células Calu-3. Tabela 3. Reagentes utilizados. Descrição Fornecedor Células Calu-3 ATCC F12 Gibco SFB Life Technologies A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) ATCC DMEM Gibco Pen/Strep Gibco BSA com baixo nível de IgG Sigma PBS Life Technologies Paraformaldeído (16% p/v aq.) Alfa Aesar Triton X-100 EMD Anticorpo anti-NP Anticorpo Anti-Influenza A, Millipore nucleoproteína, clones A1, A3 Blend IgG de cabra anti-camundongo Life Technologies conjugado com AF488
[0186] Procedimento experimental
[0187] As células Calu-3 (ATCC HTB55) foram diluídas para
40.000 células/poço em uma placa de 96 poços em meio DMEM:
F12 com 5% de SFB. No dia seguinte, os anticorpos monoclonais foram diluídos para 166,7 nM em DMEM: F12 com BSA com baixo nível de IgG e adicionados às células durante 3 horas a 37ºC e 5% de CO2. A solução de mAb foi removida e as células foram infectadas com A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) a uma MOI de 0,001. O vírus foi incubado nas células durante 1 hora a 37ºC em 5% de CO2, em seguida, o vírus foi removido e o meio, substituído por meio DMEM: F12 contendo 166,7 nM de mAbs. Após 24 e 48 h, o meio foi substituído por meio fresco contendo mAb e as células foram lavadas duas vezes com PBS em 72 h. As células foram então fixadas em PBS com 4% de paraformaldeído e o vírus, detectado usando o anticorpo primário anti-NP a uma diluição de 1: 1000. As células foram incubadas durante 1 h e depois lavadas e adicionou-se o anticorpo secundário a uma diluição de 1:2000. O número de células infectadas foi quantificado em um Analisador Universal CTL-ImmunoSpot® S6 (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).
[0188] Resumo dos resultados e conclusões
[0189] Calu-3 é uma linhagem de células epiteliais humanas imortalizadas de vias aéreas, e demonstrou-se que elas permitem múltiplos ciclos de replicação dos vírus influenza humanos na ausência de tripsina exógena (Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology 81, 12439-12449 (2007)). Além disso, foi demonstrado que as células Calu-3 expressam TMPRSS2 e TMPRSS4, mas não TMPRSS11D (HAT) pelo menos no nível do RNAm (Böttcher-Friebertshäuser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology 85, 1554-1562 (2011)). Já foi previamente demonstrado que as células Calu-3 propiciam a ativação proteolítica do vírus influenza - mas a inibição de TMPRSS2 utilizando o anticorpo monoclonal TMPRSS2-específico, H1H7017N foi aqui testado.
O crescimento de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) ao longo de 72 h após o tratamento das células com 166,7 nM de H1H7017N foi analisado.
Os títulos virais foram determinados pela contagem de pontos de foco fluorescente.
A Tabela 4 e a Figura 2 ilustram os títulos diminuídos após o tratamento com o anticorpo H1H7017N.
Embora tenha sido demonstrado que as células Calu-3 expressam TMPRSS2 e TMPRSS4 no nível do RNAm, o knockdown de TMPRSS2 reduziu os títulos do vírus influenza em 100 a 1.000 vezes (Böttcher-Friebertshäuser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology 85, 1554-1562 (2011). O baixo nível de títulos virais existentes na ausência de mAb deve-se provavelmente à adição de vírus clivados (coletados a partir de ovos embrionados de galinha ou da cultura de MDCK com tripsina), mas a presença de outra protease ativadora de HA poderia ser responsável também pela presença do vírus apesar do tratamento com mAb anti-TMPRSS2. Tabela 4. Aplicação de H1H7017N durante o ciclo de infecção diminui o número de Unidades de Foco Fluorescente (UFF) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) em 72 horas pós-infecção.
Tratamento Descrição FFU H1H7017 N MAb Anti-TMPRSS2 259 Controle positivo do Anti-influenza A H1H11729P 18 do Grupo 1 anti-hIgG4 com um IgG2a Fc de Isotipo Controle IgG1 2338 camundongo Sem mAb Controle de infecção 2656 Não infectado Controle negativo 6
[0190] Referências
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387–16 (2017). PMID:
27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID:
27733646.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76–84 (2015). PMID:25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID:26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554–1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016–10025 (2010). PMID:
20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), May;88(9):4744-51.doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 2006 Oct;80(19):9896-8. PMID: 16973594.
10. B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22;107(25):11531-6. doi:
10.1073/pnas.0914994107. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439–12449 (2007). PMID: 17855549. Exemplo 3: Análise por FACS com células MDCK/Tet-on, MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 e MDCK/Tet-on/MfTMPRSS2.
[0191] A capacidade do anticorpo anti-TMPRSS2, H1H7017N, em se ligar a células MDCK que expressam TMPRSS2 ou não que expressam TMPRSS2 foi avaliada. Tabela 5. Reagentes utilizados.
Reagente Fonte
MDCK ATCC pLVX-EF1-Tet3G Clontech pLVX Tight hTMPRSS2 Puro pLVX Tight MfTMPRSS2 Puro DMEM Irvine Scientific SFB Seradigm Pen/strep/glut Invitrogen Piruvato de sódio a 100 mM Specialty Media (100X) Antibiótico seletivo Invitrogen Geneticina™ (sulfato G418) Puromicina Sigma Doxiciclina Sigma PBS sem Ca++/Mg++ Irvine Scientific Accutase Millipore Placas de filtro de 96 poços Pall BD CytoFixTM Becton Dickinson Aloficocianina (APC) AffiniPure Fragmento F(ab’)₂ Jackson Immuno IgG de cabra anti-humano, fragmento Fcγ específico mAb1 Controle (isotipo controle hIgG1) Cytoflex Beckman Coulter FlowJo 10.1r5 FlowJo Prism 7 Graphpad
[0192] Procedimento experimental
[0193] As linhagens celulares foram desenvolvidas para expressar TMPRSS2 humana e de macaco cinomolgo (hTMPRSS2 e mfTMPRSS2) em células MDCK (Madin Darby Canine Kidney) após indução com doxiciclina. As células MDCK foram transduzidas para expressar estavelmente uma proteína transativadora controlada por tetraciclina modificada (Clontech) e a linhagem celular resultante foi denominada linhagem celular MDCK/Tet-on. A linhagem celular MDCK/Tet-on foi transduzida com uma construção contendo hTMPRSS2 (NP_005647.3 com um V160M) ou mfTMPRSS2 (Seq. Ref. XP_015302311.1 com S129L, N251S, I415V, R431Q, D492G) sob o controle do promotor induzível e as linhagens celulares foram denominadas MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 e MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2. As linhagens celulares estáveis foram mantidas em meio de crescimento contendo DMEM suplementado com 10% de SFB, piruvato de sódio, penicilina/estreptomicina/glutamina, 500 µg/mL de G418, com ou sem 2 µg/ml de puromicina.
[0194] Para análise da ligação celular por citometria de fluxo, as células foram plaqueadas em meio de crescimento e incubadas com doxiciclina a 1 µg/mL durante 16 horas para induzir a expressão de TMPRSS2. As células foram desprendidas usando Accutase e ressuspensas em PBS com 1% de SFB. Os anticorpos foram diluídos em série a partir de 500 nM a 25 pM e cada concentração de anticorpo foi incubada com 1 x 106 células, a 4ºC durante 30 minutos. Foi incluída uma condição em que nenhum anticorpo foi adicionado às células. Após a incubação com anticorpos primários, as células foram coradas com anticorpo secundário anti-IgG humano conjugado com aloficocianina a 1: 1000 a 4ºC por 30 minutos. As células foram fixadas com BD CytoFixTM e analisadas utilizando-se o citômetro de fluxo CytoFLEX. Controles de anticorpo secundário sozinho e não marcado também foram incluídos para todas as linhagens celulares. Os valores de média geométrica de fluorescência para células viáveis foram determinados utilizando-se o software FlowJo e os resultados foram analisados por regressão não linear (logística de 4 parâmetros) com o software Prism 7 (GraphPad) para se obter os valores de EC50 de ligação celular pelos anticorpos.
[0195] Como ilustrado na Figura 3, o anticorpo anti-hTMPRSS2 da invenção, H1H7017N, ligou-se a MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 e MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2 com valores de EC50 de 460 pM e 1,06 nM, respectivamente. O H1H7017N não mostrou ligação significativa às células MDCK/Tet-on. O mAb1 controle, um anticorpo isotipo controle irrelevante, não mostrou ligação a nenhuma das linhagens celulares testadas. Exemplo 4: Cinética de ligação por Biacore de anticorpos monoclonais anti-TMPRSS2 se ligando a diferentes reagentes TMPRSS2 medida a 25ºC e 37ºC.
[0196] A constante de equilíbrio de dissociação (KD) para diferentes reagentes TMPRSS2 que se ligam a anticorpos monoclonais anti-TMPRSS2 purificados foi determinada utilizando-se um biossensor Biacore 4000 baseado em ressonância de plasmon de superfície em tempo real. Todos os estudos de ligação foram realizados em tampão de corrida contendo HEPES a 10 mM, NaCl a 150 mM, EDTA a 3 mM e tensoativo Tween-20 a 0,05% v/v, pH 7,4 (HBS-ET) a 25ºC e 37ºC. A superfície do chip do sensor Biacore CM5 foi primeiro derivatizada por acoplamento de amina com o anticorpo policlonal específico para Fc de coelho anti-camundongo (GE Healthcare Cat. # BR100838) para capturar os anticorpos monoclonais anti-TMPRSS2. Os estudos de ligação foram realizados no domínio extracelular de TMPRSS2 humana expresso com um tag myc-myc-hexa-histidina C-terminal (hTMPRSS2.mmh) e no domínio extracelular de TMPRSS2 de macaco expresso com um tag myc-myc-hexa-histidina C-terminal (mfTMPRSS2.mmh). Diferentes concentrações de HMM-hTMPRSS2 e HMM-mfTMPRSS2 (100nM - 6,25nM; diluição em série de 4 vezes) foram primeiramente preparadas em tampão de corrida HBS-ET e foram injetadas na superfície do anticorpo monoclonal anti- TMPRSS2 capturado pelo Fc anti-camundongo por 2,5 minutos a uma taxa de fluxo de 30 µL/minuto, enquanto a dissociação do reagente TMPRSS2 ligado ao anticorpo monoclonal foi monitorada por 7 minutos em tampão de corrida HBS-ET. A taxa de associação (ka) e a taxa de dissociação (kd) foram determinadas ajustando-se os sensogramas de ligação em tempo real a um modelo de ligação 1: 1 com limitação de transporte de massa usando o software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. A constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e a meia-vida dissociativa (t½) foram calculadas a partir das taxas cinéticas como: 𝒌𝒅 𝐥𝐧(𝟐) KD (M) = , e t½ (min) = . 𝒌𝒂 𝟔𝟎∗𝒌𝒅
[0197] Os parâmetros de cinética de ligação para a ligação de HMM-hTMPRSS2 ou HMM-mfTMPRSS2 a diferentes anticorpos monoclonais anti-TMPRSS2 da invenção a 25ºC e 37ºC são mostrados nas Tabelas 6 a 9.
[0198] A 25ºC, os anticorpos monoclonais anti-TMPRSS2 ligaram-se a HMM-hTMPRSS2 com valor de KD de 2,81 nM, como mostrado na Tabela 6. A 37ºC, os anticorpos monoclonais anti- HMM-hTMPRSS2 ligaram-se a HMM-hTMPRSS2 com valor de KD de 9,31 nM, como mostrado na Tabela 7.
[0199] A 25ºC, os anticorpos monoclonais anti-TMPRSS2 ligaram-se a HMM-mfTMPRSS2 com valor de KD de 56,0 nM, como mostrado na Tabela 8. A 37ºC, os anticorpos monoclonais anti-
TMPRSS2 ligaram-se a HMM-mfTMPRSS2 com valor de KD de 140 nM, como mostrado na Tabela 9.
[0200] Proteínas TMPRSS2
[0201] hTMPRSS2 knob_mmh (W106-R255).mmh:
[0202] aminoácidos 1-150: aminoácidos 106 a 255 da TMPRSS2 humana (número de acesso NP_005647.3 com um V160M)
[0203] Aminoácidos: 151-178: tag myc-myc-hexa-histidina
WKFMGSKCSNSGIECDSSGTCINPSNWCDGVSHCPGGEDENRCVRLYGPNFILQMYSSQRKSWHPVCQDD WNENYGRAACRDMGYKNNFYSSQGIVDDSGSTSFMKLNTSAGNVDIYKKLYHSDACSSKAVVSLRCIACG
VNLNSSRQSREQKLISEEDLGGEQKLISEEDLHHHHHH (SEQ ID NO: 20; tags myc sublinhados, tag de His6 com sublinhado duplo)
[0204] mfTMPRSS2 knob_mmh (W106-R255).mmh:
[0205] Aminoácidos 1-150: aminoácidos 106-255 de TMPRSS2 de macaco (número de acesso XP_005548700.1 com S129L, N251S)
[0206] Aminoácidos 151-178: tag myc-myc-hexa-histidina
WKFMGSKCSDSGIECDSSGTCISLSNWCDGVSHCPNGEDENRCVRLYGPNFILQVYSSQRKSWHPVCRDD WNENYARAACRDMGYKNSFYSSQGIVDNSGATSFMKLNTSAGNVDIYKKLYHSDACSSKAVVSLRCIACG
VRSNLSRQSREQKLISEEDLGGEQKLISEEDLHHHHHH SEQ ID NO: 21; tags myc sublinhados, tag de His6 com sublinhado duplo)
[0207] Resultados Tabela 6. Parâmetros de cinética de ligação da ligação de HMM-hTMPRSS2 a anticorpos monoclonais TMPRSS2 a 25ºC. Nível de 100nM mAb Captura de Ag ka kd KD t½ Capturado do mAb ligado (1/Ms) (1/s) (M) (min) (RU) (RU) H2aM7017N 510±5,3 103 2,65E+05 7,45E-04 2,81E-09 15,5 * H2aM7017N é um anticorpo com os domínios variáveis de H1H7017N aqui apresentados e um IgG2a Fc de camundongo.
Tabela 7. Parâmetros de cinética de ligação da ligação de HMM-hTMPRSS2 a anticorpos monoclonais TMPRSS2 a 37ºC.
Nível de 100nM mAb Captura de Ag ka kd KD t½ Capturado do mAb ligado (1/Ms) (1/s) (M) (min) (RU) (RU) H2aM7017N 587±4,5 117 3,47E+05 3,23E-03 9,31E-09 3,6.
Tabela 8. Parâmetros de cinética de ligação da ligação de HMM-mfTMPRSS2 a anticorpos monoclonais TMPRSS2 a 25ºC. Nível 100nM de mAb de Ag ka kd KD t½ Captura Capturado ligado (1/Ms) (1/s) (M) (min) do mAb (RU) (RU) H2aM7017N 484±1,8 67 2,80E+05 1,57E-02 5,60E-08 0,7 Tabela 9. Parâmetros de cinética de ligação da ligação de HMM-mfTMPRSS2 a anticorpos monoclonais MSR1 a 37ºC. Nível de 100nM mAb Captura de Ag ka kd KD t½ Capturado do mAb ligado (1/Ms) (1/s) (M) (min) (RU) (RU) H2aM7017N 569±1,6 48 3,66E+05 5,12E-02 1,40E-07 0,2 Exemplo 5: Propagação do influenza in vitro das cepas de influenza H1, H3 e FluB.
[0208] Neste exemplo, a capacidade de vários tipos de influenza se propagarem em uma cultura de células Calu-3 in vitro e o efeito dos anticorpos anti-TMPRSS2 nessa propagação foram avaliados. Tabela 10. Reagentes usados e números de lote. Cat. # Descrição Fornecedor ATCC (American Type HTB55 Células Calu-3 Culture Collection) 11995-073 DMEM Gibco 211703 F12 Gibco 15140-122 Pen/Strep Gibco BSA com baixo nível de A033650ML Sigma IgG 10010-023 PBS Life Technologies 26140079 Soro fetal bovino Life Technologies Influenza AA/Puerto VR-1469 ATCC Rico/08/1934 (H1_PR34)
Cat. # Descrição Fornecedor H1N1 NR-13658 A/CaliforniaA/04/2009 BEI Resources (H1_CA09) Influenza Influenza Reagent FR-28 A/Brisbane/59/2007 Resource (H1_Bris) Influenza A/Hong Influenza Reagent FR-1068 Kong/38982/2009 (H9N2) Resource Influenza A H3N2 Kilbourne F108 3483 A/Aichi/2/68 (HA, NA) BEI Resources x A/PR/8/34, Ressortido X-31 Influenza NR-41795 B/Florida/04/2006 ATCC (Flórida) Influenza B Malaysia NR-12280 ATCC (Malásia) Anticorpo Anti- Influenza A, MAB8251 Millipore nucleoproteína, clones A1, A3 Blend Anticorpo Anti- nucleoproteína do Ab20711 Abcam vírus Influenza B [B017] Anticorpo secundário cross-absorbed IgG ThermoFisher A-11001 (H+L) de cabra anti- Scientific camundongo, Alexa Fluor 488
[0209] Procedimento experimental
[0210] As células Calu-3 foram plaqueadas a 40.000 células/poço em uma placa de 96 poços em meio DMEM: F12 com 5% de SFB. No dia seguinte, as cepas do vírus influenza foram diluídas para uma MOI determinada anteriormente (vide Tabela 11) e os anticorpos foram diluídos para 100 µg/mL. Nestes experimentos, os anticorpos anti-HA e anti-TMPRSS2 apresentaram diferentes mecanismos de ação e, por conseguinte, o procedimento experimental foi diferente para estes anticorpos a fim de testá-los de forma adequada. Os anticorpos anti-HA foram pré-incubados com uma cepa específica do vírus influenza por uma hora a 37ºC em uma placa separada. Após o período de pré-incubação, a mistura anticorpo/vírus foi adicionada às células Calu-3 por uma hora. O anticorpo anti-TMPRSS2 foi pré-incubado com as células Calu-3 não infectadas por três horas a 37ºC. Após o período de pré-incubação, o vírus foi adicionado às células Calu-3 pré-incubadas com anticorpos anti-TMPRSS2 por uma hora. Após a infecção de uma hora, as células foram lavadas três vezes com PBS e o anticorpo fresco foi adicionado juntamente com novo meio a cada poço. Anticorpo adicional foi adicionado 24 e 48 horas após a infecção. 72 horas pós- infecção, as células foram marcadas com um anti-NP e quantificadas em um Analisador Universal CTL-ImmunoSpot® S6 (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH). Tabela 11A. Experimento 1. Cepa do influenza MOI final H1_PR34 0,001 H1_CA09 0,001 H1_Bris 0,001 H9N2 0,01 H3N2 0,001 Tabela 11B. Experimento 2. Cepa do influenza MOI final H1_PR34 0,01 Flórida 0,01 Malásia 0,001
[0211] Resumo dos resultados e conclusões
[0212] Calu-3 é uma linhagem de células epiteliais humanas imortalizadas de vias aéreas, e demonstrou-se que elas permitem múltiplos ciclos de replicação dos vírus influenza humanos na ausência de tripsina exógena (Zeng et al., Journal of Virology 81, 12439-12449 (2007)). Além disso, foi demonstrado que as células Calu-3 expressam TMPRSS2 (Böttcher-Friebertshäuser et al., Journal of Virology 85: 1554-1562 (2011)), que é essencial para esses experimentos, uma vez que um anticorpo anti-TMPRSS2 está sendo testado.
Nestes experimentos, avaliou-se se o H1H7017N, um anticorpo anti-TMPRSS2, pode impedir ou não a propagação de diferentes cepas de influenza.
Além disso, utilizou-se o anticorpo anti- HA correspondente para as diferentes cepas como um controle positivo.
Como esperado, houve uma infecção inicial na presença do anticorpo anti-TMPRSS2, mas H1H7017N impediu com êxito a propagação da infecção de H1_PR34, H1_CA09, H1_Bris, H9N2 e H3N2. Isso pode ser observado pela avaliação das diferenças no número de células infectadas entre as células tratadas com anti-TMPRSS2 e os controles infectados (Tabela 12). Concluiu-se que o anticorpo anti-TMPRSS2 não foi capaz de impedir a propagação de nenhuma das cepas de influenza B, porque o número de células infectadas no controle e nos poços tratados foram os mesmos.
Em comparação, os anticorpos anti- HA foram pré-incubados com o vírus e impediram a infecção inicial.
Isso também pode ser observado comparando-se o número de células infectadas.
A contagem das células infectadas foi realizada na máquina CTL e está indicada nas tabelas abaixo.
Tabela 12A.
Experimento 1. Células Células infectadas infectadas tratadas Controle tratadas Cepa do Controle com não com influenza infectado anticorpo infectado anticorpo anti- HA grupo- TMPRSS2 específico H1H7017N
H1_PR34 10 3847,5 3 1496 H1_CA09 3,5 4645,4 1,5 17 H1_Bris 15,5 3882 0,5 1005 H9N2 4,5 4172 4,5 196,5 H3N2 7,5 3922 9 754,5 Tabela 12B. Experimento 2. Células Células infectadas infectadas tratadas Controle tratadas Cepa do Controle com não com influenza infectado anticorpo infectado anticorpo anti- HA grupo- TMPRSS2 específico H1H7017N H1_PR34 1 2848 18 60 Flórida 4 1339 229 1234 Malásia 10 1184 758 1451
[0213] Referências
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387–16 (2017). PMID:
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9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896–9898 (2006). PMID:
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11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439–12449 (2007). PMID: 17855549 Exemplo 6: O efeito do tratamento com H1H7017N sozinho em camundongos humanizados TMPRS22.
[0215] A capacidade dos anticorpos anti-TMPRSS2 em proteger camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana da infecção pelo vírus influenza H1N1 foi avaliada. Tabela 13. Reagentes usados e números de lote. Cat. # Descrição Fornecedor Influenza AA/Puerto VR-1469 ATCC Rico/08/1934 (H1N1) 20012-043 PBS Gibco Cetamina: Xilazina Tabela 14. IDs dos Clones de mAb. AbPID Descrição H1H7017N mAb anti-TMPRSS2 H1H1238N Isotipo controle IgG1
[0216] Procedimento experimental
[0217] Esses experimentos foram realizados em camundongos machos e fêmeas de 5-8 semanas de idade modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana. Os camundongos foram desafiados com 150 unidades formadoras de placas (PFUs) de H1N1. Os camundongos foram sedados com 200 µL de cetamina: xilazina (12 mg/mL: 0,5 mg/mL) por injeção intraperitoneal e depois infectados com 20 µL de vírus por via intranasal. Os anticorpos foram administrados por via subcutânea (SC) um dia antes da infecção ou por via intravenosa (IV) vários dias pós-infecção (PI). O esquema de dosagem dos anticorpos variou entre os experimentos (Tabela 15). Os pesos corporais foram registrados diariamente até o dia 14 PI e os camundongos foram sacrificados quando perderam 20% do peso corporal inicial. Os resultados estão descritos como percentual de sobrevivência. Tabela 15A. Dosagem de Anticorpo (Experimento 1). Anticorpo Dias PI Dose Administração H1H1238N -1 5 mg/kg SC
Anticorpo Dias PI Dose Administração H1H7017N -1, 0 5 mg/kg SC, IV Tabela 15B. Dosagem de Anticorpo (Experimento 2). Anticorpo Dias PI Dose Administração H1H1238N 0 10 mg/kg IV H1H7017N 0, 1, 2, 3 10 mg/kg IV
[0218] Resumo dos resultados e conclusões
[0219] Foi demonstrado que camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana podem ser infectados com uma dose letal de influenza. O objetivo desses experimentos foi demonstrar que o H1H7017N pode proteger os camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana contra o influenza A do Grupo 1. O anticorpo foi testado em modelos profiláticos e terapêuticos. O tratamento com H1H7017N resultou em maior sobrevivência dos que os camundongos tratados com isotipo controle (H1H1238N) em ambos os experimentos (Figuras 4 e 5). No experimento profilático, a sobrevivência foi de 0% para camundongos tratados com H1H1238N, 85,7% para camundongos tratados no dia -1 PI e 100% para camundongos tratados no dia 0 PI com H1H7017N. Para o modelo terapêutico, o grupo tratado com H1H1238N apresentou 25% de sobrevivência, enquanto que os grupos tratados com H1H7017N no dia 0-3 PI apresentaram 100% de sobrevivência. Os dados estão resumidos na Tabela 16. H1H7017N mostra eficácia em camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana. Tabela 16A. Resumo dos dados tabulados (Experimento 1). Percentual de sobrevivência (número Número de de camundongos ID do grupo camundongos sobreviventes/número por grupo total de camundongos no grupo)
H1H1238N, Dia -1 PI, SC 4 0 (0/4) H1H7017N, Dia -1 PI, SC 7 85,7 (6/7) H1H7017N, Dia 0 PI, IV 6 100 (6/6) Tabela 16B. Resumo dos dados tabulados (Experimento 2). Percentual de sobrevivência (número Número de de camundongos ID do grupo camundongos sobreviventes/número por grupo total de camundongos no grupo) H1H1238N, Dia 0 PI, IV 4 25 (1/4) H1H7017N, Dia 0 PI, IV 5 100 (5/5) H1H7017N, Dia 1 PI, IV 5 100 (5/5) H1H7017N, Dia 2 PI, IV 5 100 (5/5) H1H7017N, Dia 3 PI, IV 5 100 (5/5)
[0220] Referências
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11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439–12449 (2007). PMID: 17855549. Exemplo 7: Atividade do mAb Anti-TMPRSS2, H1H7017N, no modelo de camundongo humanizado TMPRSS2.
[0221] A capacidade dos anticorpos anti-TMPRSS2 em proteger um camundongo modificado para expressar a proteína TMPRSS2 humana da infecção pelo vírus influenza H3N2 foi avaliada. Tabela 17. IDs dos Clones de mAb. AbPID Descrição H1H7017N Anticorpo anti-TMPRSS2 Tabela 18. Reagentes utilizados e números de lote. Cat. # Descrição Fornecedor Influenza A H3N2 Kilbourne F108 3483 A/Aichi/2/68 (HA, NA) x BEI Resources A/PR/8/34, Ressortido X- 31 20012-043 PBS Gibco Cetamina: Xilazina
[0222] Procedimento experimental
[0223] Camundongos machos e fêmeas de onze semanas de idade modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana foram desafiados com 20.000 unidades formadoras de placas (PFUs) de H3N2. Os camundongos foram sedados com 200 µL de cetamina: xilazina (12 mg/mL: 0,5 mg/mL) por injeção intraperitoneal e depois infectados com 20 µL de vírus por via intranasal. No dia 1 ou 2 pós-infecção (PI), o anticorpo foi injetado por via intravenosa nos camundongos. Os camundongos foram pesados e observados diariamente até o dia 14 pós-infecção (PI). Eles foram sacrificados quando perderam 25% do seu peso corporal inicial.
[0224] Resumo dos resultados e conclusões
[0225] A amplitude é uma qualidade importante ao considerar uma terapia contra influenza. Já foi demonstrado que o anticorpo anti-TMPRSS2 H1H7017N foi eficaz contra o influenza A do Grupo 1. O objetivo desse experimento foi demonstrar que H1H7017N pode proteger camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana contra o influenza A do Grupo 2. Os camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana foram infectados com uma dose letal de H3N2 e tratados no dia 1 ou no dia 2 PI. Ambos os grupos de tratamento apresentaram maiores taxas de sobrevivência do que o controle infectado. Os camundongos tratados no dia 1 PI apresentaram uma taxa de sobrevivência 100% superior ao grupo tratado no dia 2 PI, que apresentou uma sobrevivência de 50%, enquanto os camundongos não tratados apresentaram 0% de sobrevivência. Todos os camundongos morreram entre os dias 5-6 PI. O gráfico de sobrevivência é ilustrado na Figura 6 e o percentual de sobrevivência está descrito na Tabela 19. Estes resultados demonstram que H1H7017 melhorou os resultados em um modelo letal de H3N2. Tabela 19. Resumo dos dados tabulados. Percentual de sobrevivência (número Número de de camundongos ID do grupo camundongos sobreviventes/número por grupo total de camundongos no grupo) Não tratado 5 0 (0/5) H1H7017N, Dia 1 PI 5 100 (5/5) H1H7017N, Dia 0 PI, IV 4 50 (2/4)
[0226] Referências
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387–16 (2017). PMID:
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4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
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20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896–9898 (2006). PMID:
16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22;107(25):11531-6. doi:
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11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439–12449 (2007). PMID: 17855549. Exemplo 8: Infecção de camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana (versus WT).
[0227] A sobrevivência de camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana infectados com o vírus influenza H1N1 foi avaliada e comparada com a dos camundongos do tipo selvagem (WT). Tabela 20. Reagentes utilizados e números de lote. Cat. # Descrição Fornecedor Influenza AA/Puerto VR-1469 ATCC Rico/08/1934 (H1N1) 20012-043 PBS Gibco Cetamina: Xilazina
[0228] Procedimento experimental
[0229] O experimento foi realizado em camundongos machos e fêmeas, de 7,5-8 semanas de idade, modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana ou companheiros de ninhada do tipo selvagem. Os camundongos foram desafiados com 150, 750 ou
1.500 unidades formadoras de placas (PFUs) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1). Os camundongos foram sedados com 200 µL de cetamina: xilazina (12 mg/mL: 0,5 mg/mL) por injeção intraperitoneal e depois infectados com 20 µL de vírus por via intranasal. Os pesos corporais foram registrados diariamente até o dia 14 PI e os camundongos foram sacrificados quando perderam 20% do peso corporal inicial. Os resultados estão descritos como percentual de sobrevivência (Figura 7).
[0230] Resumo dos resultados e conclusões
[0231] Camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana foram gerados para testar a eficácia terapêutica dos anticorpos anti-TMPRSS2 em um modelo de influenza in vivo. Neste experimento, as taxas de sobrevivência dos camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana e dos camundongos do tipo selvagem infectados com 150, 750 ou 1.500 PFUs de uma cepa histórica de H1N1 foram comparadas. Não houve sobrevivência (0%) entre os camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana e os camundongos do tipo selvagem nos três grupos de infecção. Todos os camundongos morreram entre o dia 5 e o dia 8 PI, sendo que aqueles que receberam uma dose mais alta do vírus morreram mais cedo do que aqueles que receberam uma dose mais baixa do vírus. Os padrões de sobrevivência dos camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana foram semelhantes aos dos camundongos do tipo selvagem. Isso mostra que os camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana podem ser usados como um modelo de influenza in vivo para avaliar a eficácia de anticorpos específicos para TMPRSS2. Vide a Tabela 21. Tabela 21. Resumo dos dados tabulados. Percentual de sobrevivência (número Número de de camundongos ID do grupo camundongos sobreviventes/número por grupo total de camundongos no grupo) Tipo selvagem; 150 PFUs 4 0 (0/4) de H1N1
Percentual de sobrevivência (número Número de de camundongos ID do grupo camundongos sobreviventes/número por grupo total de camundongos no grupo) Tipo selvagem; 750 PFUs 4 0 (0/4) de H1N1 Tipo selvagem; 1.500 3 0 (0/3) PFUs de H1N1 Camundongos modificados para expressar a 4 0 (0/4) proteína TMPRSS2 humana; 150 PFUs de H1N1 Camundongos modificados para expressar a 3 0 (0/3) proteína TMPRSS2 humana; 750 PFUs de H1N1 Camundongos modificados para expressar a 3 0 (0/3) proteína TMPRSS2 humana;
1.500 PFUs de H1N1
[0232] Referências
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387–16 (2017). PMID:
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11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439–12449 (2007). PMID: 17855549.
Exemplo 9: O efeito do tratamento com a combinação de H1H14611N2 e H1H7017N em camundongos após infecção com H3N2.
[0233] A capacidade de uma combinação de anticorpos anti- TMPRSS2 e anti-influenza em proteger camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana da infecção pelo vírus influenza H3N2 foi avaliada. Tabela 22. IDs dos Clones de mAb. AbPID Descrição H1H7017N Anticorpo anti-TMPRSS2 Anticorpo anti-Influenza A do H1H14611N2 Grupo 2 H1H1238N Isotipo controle IgG1 Tabela 23. Reagentes utilizados e números de lote. Descrição Fornecedor Influenza A H3N2 Kilbourne F108 A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34, BEI Resources Ressortido X-31 PBS Gibco Cetamina: Xilazina
[0234] Procedimento experimental
[0235] Camundongos machos e fêmeas de oito semanas, modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana, foram desafiados com 20.000 unidades formadoras de placas (PFUs) de A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34, Ressortidos X-31 sortido (H3N2). Os camundongos foram sedados com 200 µL de cetamina: xilazina (12 mg/mL: 0,5 mg/mL) por injeção intraperitoneal e depois infectados com 20 µL de vírus por via intranasal. No dia 4 pós-infecção (PI), o anticorpo foi injetado por via intravenosa nos camundongos. Os pesos corporais foram registrados diariamente até o dia 14 PI e os camundongos foram sacrificados quando perderam 25% do peso corporal inicial. Os resultados estão descritos como percentual de sobrevivência.
[0236] Resumo dos resultados e conclusões
[0237] Foi demonstrado que, individualmente, o anticorpo TMPRSS2, H1H7017N, e o anticorpo amplo contra influenza A do grupo 2, H1H14611N2, têm eficácia terapêutica contra um desafio letal em camundongos com uma cepa histórica de H3N2. Também foi demonstrado que a sobrevivência de camundongos infectados com um desafio letal de H1N1 pode ser significativamente aumentada após o tratamento com menos anticorpo total do que qualquer um sozinho, através da combinação do H1H7017N com o anticorpo amplo contra influenza A do Grupo 1, H1H11729P.
O objetivo deste experimento foi avaliar o efeito sinérgico do H1H7017N e H1H14611N2 em combinação.
Como ilustrado na Figura 8, 3 de 4 camundongos tratados com o anticorpo isotipo controle hIgG1 no dia 4 PI morreram no dia 7 PI. 3 de 5 animais sobreviveram quando receberam 10 mg/kg de H1H14611N2 e 4 de 5 animais sobreviveram quando receberam 10 mg/kg de H1H7017N.
Quando administrado em uma combinação de 5 mg/kg de cada anticorpo, H1H14611N2 e H1H7017N, houve 40% de sobrevivência.
Cem por cento dos camundongos tratados com a combinação de 2,5 mg/kg de cada anticorpo, H1H14611N2 e H1H7017N, sobreviveram ao desafio.
A sobrevivência de camundongos infectados com um desafio letal de H3N2 foi aumentada através da combinação de concentrações mais baixas de H1H7017N e H1H14611N2 em comparação com concentrações mais altas de anticorpos combinados ou apenas um anticorpo.
O percentual de sobrevivência está descrito na Tabela 24. Tabela 24. Resumo dos dados tabulados.
Percentual de sobrevivência (número Número de de camundongos ID do grupo camundongos sobreviventes/número por grupo total de camundongos no grupo) 10 mg/kg de isotipo 5 20 (1/5) controle hIgG1 10 mg/kg de H1H14611N2 5 60 (3/5) 10 mg/kg de H1H7017N 5 80 (4/5) 5 mg/kg de H1H7017N + 5 5 40 (2/5) mg/kg de H1H14611N2 2,5 mg/kg de H1H7017N + 5 100 (5/5) 2,5 mg/kg de H1H14611N2
[0238] Referências
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387–16 (2017). PMID:
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2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID:
28636671.
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11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type I interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439–12449 (2007). PMID: 17855549. Exemplo 10: O efeito do tratamento com a combinação de H1H11729P e H1H7017N em camundongos após infecção com H1N1.
[0239] A capacidade de uma combinação de anticorpos anti- TMPRSS2 e anti-influenza em proteger camundongos modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana da infecção pelo vírus influenza H1N1 foi avaliada.
Tabela 25. IDs dos Clones de mAb. AbPID Descrição H1H7017N Anticorpo anti-TMPRSS2 Anticorpo anti-Influenza A do H1H11729P Grupo 1 H1H1238N Isotipo Controle IgG1 Tabela 26. Reagentes utilizados e números de lote. Cat. # Descrição Fornecedor Influenza AA/Puerto VR-1469 ATCC Rico/08/1934 (H1N1) 20012-043 PBS Gibco Cetamina: Xilazina
[0240] Procedimento experimental
[0241] Camundongos machos e fêmeas de cinco semanas de idade modificados para expressar a proteína TMPRSS2 humana foram desafiados com 1.500 unidades formadoras de placas (PFUs) de H1N1. O vírus foi administrado sedando os camundongos com 200 µL de cetamina: xilazina (12 mg/mL: 0,5 mg/mL) e administrando 20 µL de vírus por via intranasal. No dia 3 pós-infecção (PI), o anticorpo foi injetado por via intravenosa nos camundongos. Os pesos corporais foram registrados diariamente até o dia 14 PI e os camundongos foram sacrificados quando perderam 25% do peso corporal inicial.
[0242] Resumo dos resultados e conclusões
[0243] Foi demonstrado que, individualmente, o anticorpo TMPRSS2, H1H7017N, e o anticorpo amplo contra influenza A do Grupo 1, H1H11729P, têm eficácia terapêutica contra um desafio letal em camundongos com uma cepa histórica de H1N1. No entanto, o objetivo deste experimento foi avaliar o efeito sinérgico dos anticorpos em combinação. Todos os camundongos tratados com o anticorpo isotipo controle hIgG1 no dia 3 PI morreram no dia 6 PI. Quando os animais receberam 5 mg/kg de H1H11729P ou H1H7017N, 40% e 0% dos animais sobreviveram à infecção, respectivamente. No entanto, a combinação de 2,5 mg/kg de cada anticorpo, H1H11729P e H1H7017N, resultou em 60% de sobrevivência. Oitenta por cento dos camundongos tratados com a combinação de 1 mg/kg de H1H7017N e 2 mg/kg de H1H11729P (3 mg/kg total) sobreviveram ao desafio. A sobrevivência dos camundongos infectados com um desafio letal de H1N1 aumentou significativamente após o tratamento com menos anticorpo total do que qualquer um sozinho, através da combinação de H1H7017N e H1H11729P (vide Figura 9 e Tabela 27). Tabela 27. Resumo dos dados tabulados. Percentual de sobrevivência (número Número de de camundongos ID do grupo camundongos sobreviventes/número por grupo total de camundongos no grupo) 5 mg/kg de isotipo 3 0 (0/3) controle hIgG1 5 mg/kg de H1H11729P 5 40 (2/5) 5 mg/kg de H1H7017N 5 0 (0/5) 2,5 mg/kg de H1H7017N + 5 60 (3/5) 2,5 mg/kg de H1H11729P 1 mg/kg de H1H7017N + 2 5 80 (4/5) mg/kg de H1H11729P
[0244] REFERÊNCIAS
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[0245] Todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência na mesma medida como se cada publicação individual, entrada no banco de dados (por exemplo, sequências Genbank ou entradas GeneID), pedido de patente ou patente, fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência. Os Requerentes pretendem com esta declaração de incorporação por referência se referir a cada publicação individual, entrada no banco de dados (por exemplo, sequências do Genbank ou entradas do GeneID), pedido de patente ou patente identificada, mesmo que essa citação não esteja imediatamente adjacente a uma declaração dedicada de incorporação por referência. A inclusão das declarações dedicadas de incorporação por referência, se houver, dentro do relatório descritivo não prejudica, de maneira alguma, essa declaração geral de incorporação por referência. A citação das referências aqui contidas não se destina a admitir que a referência é um estado da arte pertinente nem constitui qualquer admissão quanto ao conteúdo ou data dessas publicações ou documentos.

Claims (30)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de ligação a antígeno humana CARACTERIZADA por ser ligar especificamente à TMPRSS2 humana.
2. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA por ser um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo.
3. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADA por compreender: (a) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo as CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19; e/ou (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo as CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18.
4. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADA por compreender: (a) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19; e/ou (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18.
5. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADA por compreender:
(a) uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo as CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19 e, pelo menos, 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, 17 ou 19; e/ou (b) uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina compreendendo as CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma cadeia leve de imunoglobulina compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18 e pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 ou 18.
6. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADA por compreender: uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende (a) uma CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12), (b) uma CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos: K A S (SEQ ID NO: 14) e/ou (c) uma CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16); e/ou uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende (a) uma CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6), (b) uma CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8),
(c) uma CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10).
7. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, CARACTERIZADA por compreender: (a) uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 17 ou 19, ou uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; e/ou (b) uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18, ou uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4.
8. Proteína de ligação a antígeno que compete com uma proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADA por se ligar à TMPRSS2 e/ou ao mesmo epítopo ou epítopo sobreposto na TMPRSS2.
9. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADA por ser multiespecífica.
10. Proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, CARACTERIZADA por compreender uma ou mais das seguintes propriedades:  Inibe o crescimento do vírus influenza em células que expressam TMPRSS2;  Liga-se à superfície das células que expressam TMPRSS;
 Não se liga significativamente às células MDCK/Tet-on que não expressam TMPRSS2;  Liga-se a TMPRSS2 humana com uma KD de cerca de 2,81 x 10-9 M a cerca de 25ºC;  Liga-se a TMPRSS2 humana com uma KD de cerca de 9,31 x 10-9 M a cerca de 37ºC;  Liga-se a TMPRSS2 de cinomolgo com uma KD de cerca de 5,60 x 10-8 M a cerca de 25ºC;  Liga-se a TMPRSS2 de cinomolgo com uma KD de cerca de 1,40 x 10-7 M a cerca de 37ºC;  Limita a propagação da infecção pelo vírus influenza das células in vitro; e/ou  Protege os camundongos modificados para expressar a proteína humana TMPRSS2 da morte causada pela infecção pelo vírus influenza.
11. Complexo CARACTERIZADO por compreender uma proteína de ligação a antígeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, ligada a um polipeptídeo TMPRSS2.
12. Método para a fabricação de uma proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, ou a cadeia de imunoglobulina da mesma, CARACTERIZADO por compreender: (a) introduzir um ou mais polinucleotídeos que codificam uma cadeia de imunoglobulina da referida proteína de ligação a antígeno; (b) realizar a cultura da célula hospedeira sob condições favoráveis para a expressão do polinucleotídeo; e (c) isolar, opcionalmente, a proteína de ligação a antígeno ou a cadeia de imunoglobulina da célula hospedeira e/ou do meio no qual a célula hospedeira é cultivada.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de ovário de hamster chinês.
14. Proteína de ligação a antígeno ou cadeia de imunoglobulina CARACTERIZADA pelo fato de que é um produto do método definido em qualquer uma das reivindicações 12-13.
15. Polipeptídeo CARACTERIZADO por compreender: (a) CDR1, CDR2 e CDR3 de um domínio VH de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; ou (b) CDR1, CDR2 e CDR3 de um domínio VL de uma cadeia de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4.
16. Polinucleotídeo CARACTERIZADO por codificar o polipeptídeo conforme definido na reivindicação 15.
17. Vetor CARACTERIZADO por compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 16.
18. Célula hospedeira CARACTERIZADA por compreender a proteína de ligação a antígeno ou cadeia de imunoglobulina ou polipeptídeo ou polinucleotídeo ou um vetor conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 e de 14 a 17.
19. Composição ou kit CARACTERIZADA por compreender a proteína de ligação a antígeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 e 14, em associação com um agente terapêutico adicional.
20. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender a proteína de ligação a antígeno, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 e 14,
e carreador farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um outro agente terapêutico.
21. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, CARACTERIZADA por estar em associação com um outro agente terapêutico, que é uma droga antiviral ou uma vacina.
22. Composição ou kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, CARACTERIZADA pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um membro selecionado do grupo que consiste em: ledipasvir, sofosbuvir, uma combinação de ledipasvir e sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirina e interferon-alfa2b, interferon-alfa2a, um agente anticâncer e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a HA do influenza; e/ou um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo selecionado a partir do grupo que consiste em H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B;
H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B;
H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B;
H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; e H1H18335B.
23. Recipiente ou dispositivo de injeção CARACTERIZADO por compreender a proteína de ligação a antígeno ou composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, 14 e de 19 a 22.
24. Método para o tratamento ou prevenção do câncer ou infecção por vírus influenza, coronavírus, vírus SARS-Co, vírus MERS-Co, vírus parainfluenza, metapneumovírus humano ou vírus da hepatite C (HCV), em um indivíduo que precisa do mesmo, CARACTERIZADO por compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a antígeno conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 e 14.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO por ser para o tratamento ou prevenção do câncer, que é o câncer de próstata, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de pâncreas, câncer do trato urinário, câncer de mama, câncer de ovário, adenocarcinoma de próstata, carcinoma de células renais, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma de células escamosas pulmonares e/ou mesotelioma pleural.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 ou 25, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais agentes terapêuticos adicionais são administrados ao indivíduo.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais agentes terapêuticos adicionais, que são uma droga antiviral ou uma vacina, são administrados ao indivíduo.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 ou 25, CARACTERIZADO pelo fato de que, ao indivíduo, são administrados um ou mais agentes terapêuticos adicionais, o qual é um membro selecionado do grupo que consiste em: ledipasvir, sofosbuvir, uma combinação de ledipasvir e sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirina e interferon- alfa2b, interferon-alfa2a e um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a HA do influenza; e/ou um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo selecionado do grupo que consiste em H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B;
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29. Método para a administração de uma proteína de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10 e 14, no corpo de um indivíduo, CARACTERIZADO por compreender injetar a proteína de ligação a antígeno no corpo do indivíduo.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno é injetada no corpo do indivíduo por via subcutânea, intravenosa ou intramuscular.
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