ES2886958T3 - Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado - Google Patents
Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado Download PDFInfo
- Publication number
- ES2886958T3 ES2886958T3 ES17709888T ES17709888T ES2886958T3 ES 2886958 T3 ES2886958 T3 ES 2886958T3 ES 17709888 T ES17709888 T ES 17709888T ES 17709888 T ES17709888 T ES 17709888T ES 2886958 T3 ES2886958 T3 ES 2886958T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- rodent
- tmprss
- humanized
- human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 title claims abstract description 433
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 372
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 135
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 93
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 93
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims abstract description 70
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 101100260872 Mus musculus Tmprss4 gene Proteins 0.000 claims description 133
- 101000638154 Homo sapiens Transmembrane protease serine 2 Proteins 0.000 claims description 96
- 101100207058 Mus musculus Tmprss2 gene Proteins 0.000 claims description 73
- 101100099740 Homo sapiens TMPRSS11D gene Proteins 0.000 claims description 72
- 101150089613 Tmprss11d gene Proteins 0.000 claims description 72
- 101150109926 Tmprss2 gene Proteins 0.000 claims description 68
- 101000798702 Homo sapiens Transmembrane protease serine 4 Proteins 0.000 claims description 62
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 47
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims description 35
- 102000049800 human TMPRSS2 Human genes 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 31
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 28
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 11
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 9
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 claims description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 124
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 38
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 36
- 102000055733 human TMPRSS11D Human genes 0.000 description 34
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 31
- 102000056947 human TMPRSS4 Human genes 0.000 description 29
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 21
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 18
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 17
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 14
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 14
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 101100099741 Mus musculus Tmprss11d gene Proteins 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 8
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 8
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 8
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 8
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 8
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 8
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 7
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 6
- 102100031989 Transmembrane protease serine 2 Human genes 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 101000598058 Homo sapiens Transmembrane protease serine 11D Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 241000699729 Muridae Species 0.000 description 4
- 102100037025 Transmembrane protease serine 11D Human genes 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- -1 that is Proteins 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 101150079978 AGRN gene Proteins 0.000 description 2
- 102100040026 Agrin Human genes 0.000 description 2
- 108700019743 Agrin Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 2
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 2
- 101000869690 Homo sapiens Protein S100-A8 Proteins 0.000 description 2
- 101000872580 Homo sapiens Serine protease hepsin Proteins 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000000853 LDL receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100032442 Protein S100-A8 Human genes 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034801 Serine protease hepsin Human genes 0.000 description 2
- 101150115575 TMPRSS4 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 108091005725 scavenger receptor cysteine-rich superfamily Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699725 Acomys Species 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 241001330002 Bambuseae Species 0.000 description 1
- 102100028728 Bone morphogenetic protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000654 Bone morphogenetic protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000398949 Calomyscidae Species 0.000 description 1
- 241000700193 Calomyscus Species 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 102100034330 Chromaffin granule amine transporter Human genes 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 241000398985 Cricetidae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003837 Epithelial Sodium Channels Human genes 0.000 description 1
- 108090000140 Epithelial Sodium Channels Proteins 0.000 description 1
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 description 1
- 101710108755 Extracellular serine protease Proteins 0.000 description 1
- 108050007261 Frizzled domains Proteins 0.000 description 1
- 102000018152 Frizzled domains Human genes 0.000 description 1
- 102100040870 Glycine amidinotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102000004989 Hepsin Human genes 0.000 description 1
- 108090001101 Hepsin Proteins 0.000 description 1
- 101000641221 Homo sapiens Chromaffin granule amine transporter Proteins 0.000 description 1
- 101000893303 Homo sapiens Glycine amidinotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001046461 Lophiomys imhausi Species 0.000 description 1
- NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N Meprobamate Chemical compound NC(=O)OCC(C)(CCC)COC(N)=O NPPQSCRMBWNHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000398750 Muroidea Species 0.000 description 1
- 241000699669 Mus saxicola Species 0.000 description 1
- 241001529466 Muscardinus avellanarius Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000398990 Nesomyidae Species 0.000 description 1
- 241001504165 Perognathus Species 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241001338313 Platacanthomyidae Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 241000605112 Scapanulus oweni Species 0.000 description 1
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000398956 Spalacidae Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 241001105470 Valenzuela Species 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 102000025171 antigen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000831 antigen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 102000014108 human airway trypsin-like protease Human genes 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108091007169 meprins Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10332—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un roedor cuyo genoma comprende un gen Tmprss humanizado, en donde el gen Tmprss humanizado - comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, - se encuentra en un locus Tmprss de roedor endógeno, y es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica del gen Tmprss de roedor endógeno con dicha secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín y está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor endógeno, y - codifica una proteína Tmprss humanizada que comprende: (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
Description
DESCRIPCIÓN
Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado
Antecedentes
Las serina proteasas transmembrana de tipo II son una familia de proteasas caracterizadas por un dominio transmembrana aminoterminal (Bugge et al., J. Biol. Chem. 284 (35): 23177-23181,2009; Hooper et al., J. Biol. Chem.
272(2): 857-860, 2001). Todos los miembros de esta familia se expresan como zimógenos monocatenarios y se activan proteolíticamente por escisión dentro de un motivo R/(IV)VGG altamente conservado. Un miembro de la familia, la proteasa transmembrana, serina de tipo 4 (TMPRSS4), se ha demostrado que activa el canal de sodio epitelial (ENaC, por sus siglas en inglés) que regula el flujo de sodio y agua a través de los epitelios (Guipponi et al. 2002 Hum. Mol. Genet. 11:2829; Vuagniaux et al. 2002 J. Gen. Physiol. 120:191). Se desconocen los activadores proteolíticos de TMPRSS4; sin embargo, los datos disponibles hasta la fecha sugieren que la proteína se activa a sí misma. Cuando se activa, el dominio catalítico de TMPRSS4 permanece unido al extremo N de la proteína a través de un enlace disulfuro. Se ha demostrado que TMPRSS4, TMPRSS2 y TMPRSS11D (o proteasa similar a tripsina de las vías respiratorias humana; "HAT, por sus siglas en inglés") escinden la hemaglutinina de la gripe A (HA) in vitro, que es la primera etapa esencial en el ciclo de vida vírico. Esta escisión es esencial para la actividad de HA, ya que la proteína se sintetiza como una proteína precursora (HA0) y necesita la escisión en HA1 y HA2 para su actividad. El ARNi con atenuación génica de TMPRSS4 en células Caco-2 dio como resultado una reducción de la propagación del virus. Así mismo, se demostró que TMPRSS4 está fuertemente regulada positivamente en los pulmones de ratones infectados con gripe (Bottcher et al. 2006 J. Virol. 80:9896; Bottcher et al. 2009 Vaccine 27: 6324; Bottcher-Friebershausser et al.
2010 J. Virol. 84: 5604; Bertam et al. 2010 J. Virol. 84:10016; Bertam et al. 2010 J. Virol. 84:10016; Bottcher-Friebershausser et al. 2011 J. Virol. 85: 1554; Bahgat et al. 2011 Virol. J. 8:27).
Se necesita la creación de un sistema in vivo, por ejemplo, un modelo de infección en roedores, para identificar y probar compuestos que incluyen anticuerpos que se dirigen específicamente a las serina proteasas transmembrana de tipo II humanas para el tratamiento y la prevención de infecciones víricas y otras enfermedades.
También se hace referencia a los siguientes documentos:
• Kuhn et al (2015) consultado de internet: URL: http: //elib.tihohanover.de/dissertations/kuehnn s15.pdf que se refiere a estudios sobre la respuesta del hospedador a las infecciones por el virus de la gripe A en mutantes nuligénicos de ratón;
• WO 2013/158516 A1 que se refiere a métodos para tratar o prevenir la infección por el virus de la gripe administrando un inhibidor de serina proteasas;
• Sol et al (2009) consultado de internet: URL: http: //www.dtic.mil/get-tr-doc/pdf? AD = ADA525092 que se refiere a la caracterización de la proteasa TMPRSS2 como moduladora de la metástasis de cáncer de próstata;
• Bottcher-Friebertshauser et al (2010) Journal of Virology 84 (11): 5605-5614, que se refiere a la escisión de la hemaglutinina del virus de la gripe por las proteasas de las vías respiratorias TMPRSS2 y HAT, que difiere en la localización subcelular y la susceptibilidad a los inhibidores de proteasas;
• Devoy et al (2012) Nature Reviews Genetics, 13: 14-20 que se refiere a ratones humanizados genómicamente: tecnologías y promesas.
• Murphy et al (2014) PNAS USA 111(14): 5153-5158, que se refiere a ratones con humanización de megabases de sus genes de inmunoglobulinas que generan anticuerpos tan eficazmente como ratones normales; y
• Maconald et al (2014) PNAS USA 111(14): 5147-5152 que se refiere a la humanización genética precisa e in situ de 6 Mb de genes de inmunoglobulina de ratón.
Sumario
La presente invención abarca el reconocimiento de que es deseable modificar por ingeniería animales roedores para proporcionar sistemas de identificación in vivo y creación de nuevas terapias. Por ejemplo, la presente invención abarca el reconocimiento de que los roedores que tienen un gen Tmprss humanizado son deseables para su uso en la identificación y creación de agentes terapéuticos para el tratamiento y la prevención de infecciones víricas.
En un aspecto, la invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un gen Tmprss humanizado, en donde el gen Tmprss humanizado:
- comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín,
- se encuentra en un locus Tmprss de roedor endógeno, y es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica del gen Tmprss de roedor endógeno con dicha secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín y está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor endógeno, y
- codifica una proteína Tmprss humanizada que comprende: (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína T mprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
El gen Tmprss humanizado en roedores divulgado en el presente documento codifica una proteína Tmprss humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia al ectodominio de una proteína TMPRSS humana. La proteína Tmprss humanizada contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % (p. ej., al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica en secuencia a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena.
Un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín codifica un polipéptido al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia al ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín. Un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, en donde la secuencia de nucleótidos del gen Tmprss de roedor endógeno codifica un polipéptido al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss humanizado localizado en un locus Tmprss de roedor endógeno que es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss de roedor endógeno con una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano afín. En realizaciones específicas, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano afín que se está insertando incluye secuencias de exones que codifican un ectodominio sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSs codificada por el gen TMPRSS humano. En algunas realizaciones, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano afín también incluye la 3' UTR del gen TMPRSS humano afín.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento es heterocigoto para un gen Tmprss humanizado en un locus Tmprss de roedor endógeno. En otras realizaciones, un roedor es homocigoto para un gen Tmprss humanizado en un locus Tmprss de roedor endógeno.
En realizaciones adicionales, un roedor contiene dos o más genes Tmprss humanizados en diferentes locus Tmprss de roedor endógenos estando cada locus Tmprss de roedor endógeno humanizado con un gen TMPRSS humano afín; por ejemplo, dos o más de los genes Tmprss2 humanizado, Tmprss4, humanizado y Tm prsslld humanizado.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss2 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano, en donde el gen Tmprss2 humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss2 de roedor endógeno.
En algunas realizaciones, el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por el gen TMPRSS2 humano utilizado en la humanización. La proteína TMPRSS2 humana contiene, en algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % idéntica (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta por los restos W106 a G492 o los 387 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS2 humana como se expone en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que además contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor codificada por el gen Tmprss2 de roedor endógeno que se está humanizando. Una proteína Tmprss2 de roedor endógena ilustrativa se expone en la SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, un roedor contiene un gen Tmprss2 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS2 humano codifica un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al
menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por el gen TMPRSS2. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano es una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que contiene el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones particulares, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano contiene además la 3' UTR del gen TMPRSS2 humano. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno incluido en un gen Tmprss2 humanizado codifica una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena codificada por el gen Tmprss2 de roedor endógeno.
En realizaciones particulares, un gen Tmprss2 humanizado contiene los exones 1-2 codificantes de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante de un gen TMPRSS2 humano, en donde el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor codificada por el gen Tmprss2 de roedor endógeno y un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por el gen TMPRSS2 humano. El gen Tmprss2 humanizado contiene un exón 3 que en algunas realizaciones codifica el exón 3 de un gen TMPRSS2 humano y en otras realizaciones codifica el exón 3 de un gen Tmprss2 de roedor endógeno. En algunas realizaciones, el gen Tmprss2 humanizado contiene un exón 3 que incluye una porción 5' del exón 3 codificante de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una porción 3' del exón 3 codificante de un gen TMPRSS2 humano.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss4 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano, en donde el gen Tmprss4 humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss4 de roedor endógeno.
En algunas realizaciones, el gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana codificada por el gen TMPRSS4 humano utilizado en la humanización. La proteína TMPRSS4 humana contiene, en algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % idéntica (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica) a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada contiene un ectodominio al menos un 85 % (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta por los restos K54 a L437 o los 384 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS4 humana como se expone en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que además contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % (al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor codificada por el gen Tmprss4 de roedor endógeno que se está humanizando. Una proteína Tmprss4 de roedor endógena ilustrativa se expone en la SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones, un roedor contiene un gen Tmprss4 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano, en donde la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano codifica un ectodominio al menos un 85 % idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana codificada por el gen TMPRSS4 humano. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano es una secuencia genómica contigua que contiene el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno incluido en un gen Tmprss4 humanizado codifica una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor codificada por el gen Tmprss4 de roedor endógeno.
En realizaciones particulares, un gen Tmprss4 humanizado contiene el exón 1 codificante hasta el exón 3 codificante de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano.
En algunas realizaciones, un roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tm prsslld humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tm prsslld de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano, en donde el gen Tm prsslld humanizado está bajo el control del promotor del gen Tm prsslld de roedor endógeno.
En algunas realizaciones, el gen Tm prsslld humanizado codifica una proteína Tmprss11 d humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 %, (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico en secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana codificada por el gen TMPRSS11D humano utilizado en la humanización. La proteína TMPRSS11D humana contiene, en algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % idéntica (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica) a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada contiene un ectodominio al menos un 85 % (al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntico a la secuencia de
aminoácidos compuesta por los restos A42-I418 o los 377 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS11D humana como se expone en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, el gen Tm prsslld humanizado codifica una proteína Tmprss11d humanizada que además contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 %, (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 %) idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss11d de roedor endógena codificada por el gen Tm prsslld de roedor endógeno que se está humanizando. Una proteína Tmprss11d de roedor endógena ilustrativa se expone en la SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, un roedor contiene un gen Tm prsslld humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tm prsslld de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS11D humano codifica un ectodominio sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana codificada por el gen TMPRSS11D humano. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11d humano es una secuencia genómica contigua que contiene el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante de un gen TMPRS11D humano. En realizaciones particulares, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano contiene además la 3' UTR del gen TMPRSS11D humano. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss11d de roedor endógeno incluido en un gen Tmprss11d humanizado codifica una porción citoplasmática y transmembrana que es al menos un 85 % idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss11d de roedor codificada por el gen Tmprss11d de roedor endógeno.
En realizaciones particulares, un gen Tmprss11d humanizado contiene los exones 1-2 codificantes de un gen Tmprss11d de roedor endógeno y el exón 3 codificante hasta el exón 13 codificante de un gen TMPRSS11D humano.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula o tejido de roedor aislado cuyo genoma contiene un gen Tmprss humanizado como se describe en el presente documento. En realizaciones específicas, el gen Tmprss humanizado se selecciona del grupo que consiste en un gen Tmprss2 humanizado, un gen Tmprss4 humanizado y un gen Tmprss11d humanizado.
En otro aspecto más, la invención proporciona una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss humanizado como se describe en el presente documento. En realizaciones específicas, el gen Tmprss humanizado se selecciona del grupo que consiste en un gen Tmprss2 humanizado, un gen Tmprss4 humanizado y un gen Tmprss11d humanizado.
En otro aspecto, también se proporciona un embrión de roedor generado a partir de la célula madre embrionaria de roedor divulgada en el presente documento.
También se divulga un vector de ácido nucleico adecuado para su uso en la humanización de un gen Tmprss endógeno en un roedor. En algunos casos, el vector de ácido nucleico incluye una secuencia del ácido nucleico de Tmprss humano (por ejemplo, un ADN genómico humano que codifica el ectodominio de una proteína TMPRSS humana), flanqueado por un brazo de homología 5' y un brazo de homología 3'. Los brazos de homología 5' y 3' son secuencias de un ácido nucleico que se colocan en 5' y 3', respectivamente, de la secuencia del ácido nucleico de Tmprss humano y son homólogas a las secuencias de ADN genómico en un locus Tmprss endógeno en un roedor que flanquea un ADN genómico de roedor que codifica el ectodominio de una proteína Tmprss de roedor afín. Por tanto, los brazos de homología 5' y 3' son capaces de mediar la recombinación homóloga y la sustitución del ADN genómico de roedor que codifica el ectodominio de la proteína Tmprss de roedor afín con la secuencia del ácido nucleico de Tmprss humano para formar un gen Tmprss humanizado como se describe en el presente documento.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para proporcionar un roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss humanizado. El método incluye modificar el genoma de un roedor para reemplazar una secuencia genómica de un gen Tmprss de roedor endógeno con una secuencia genómica de un gen TMPRSS humano afín para formar un gen Tmprss humanizado.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para hacer que un roedor (tal como un ratón o una rata) tenga un gen Tmprss humanizado, que comprende:
(a) insertar un fragmento genómico en un locus Tmprss de roedor endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, comprendiendo dicho fragmento genómico una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, formando, de este modo, un gen Tmprss humanizado,
en donde el gen Tmprss humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor en el locus Tmprss de roedor endógeno y codifica una proteína T mprss humanizada, y
en donde la proteína Tmprss humanizada comprende (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor codificada por el gen Tmprss de roedor en dicho locus Tmprss de roedor endógeno;
(b) obtener una célula madre embrionaria de roedor que comprende el gen Tmprss humanizado de (a); y,
(c) crear un roedor utilizando la célula madre embrionaria de roedor de (b).
En algunas realizaciones, el gen Tmprss humanizado se selecciona del grupo que consiste en un gen Tmprss2 humanizado, un gen Tmprss4, humanizado y un gen Tm prsslld humanizado. En diversas realizaciones, el gen Tmprss humanizado codifica una proteína Tmprss humanizada que contiene un ectodominio al menos un 85 % idéntico (por ejemplo, al menos un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia) al ectodominio de la proteína Tm p Rs S humana codificada por el gen TMPRSS humano utilizado para la humanización. En realizaciones específicas, la proteína Tmprss humanizada contiene el ectodominio de una proteína TMPRSS humana seleccionada del grupo que consiste en una proteína TMPRSS2 humana, una proteína TMPRSS4 humana y una proteína TMPRSS 11D humana. En realizaciones específicas, la proteína Tmprss humanizada contiene además una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno que se está humanizando.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para utilizar un roedor divulgado en el presente documento para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto (por ejemplo, inhibidores candidatos que se dirigen específicamente a una proteína TMPRSS humana) en el tratamiento de la infección por el virus de la gripe. En particular, la presente invención proporciona un método para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto en el tratamiento de una infección por el virus de la gripe A, que comprende:
proporcionar un roedor de la presente invención;
administrar un virus de la gripe A y un compuesto candidato al roedor, en donde opcionalmente el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana; y
monitorizar la presencia y la gravedad de la infección por el virus de la gripe A en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del compuesto candidato.
En algunas realizaciones, el virus de la gripe se administra al roedor antes que el compuesto. En otras realizaciones, el virus de la gripe se administra al roedor después del compuesto.
En algunas realizaciones, el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana. En realizaciones específicas, el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana seleccionada del grupo que consiste en una proteína TMPRSS2 humana, una proteína TMPRSS4 humana y una proteína TMPRSS11D humana.
Otras características, objetivos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada a continuación. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada, aunque indica realizaciones de la presente invención, se proporciona solamente a modo de ilustración, no de limitación. Serán evidentes diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención para los expertos en la materia a partir de la presente descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos
Los dibujos incluidos en el presente documento, que están compuestos por las siguientes figuras, son solamente para fines de ilustración y no de limitación.
Figuras 1A-1D. Estrategia ilustrativa para la humanización de Tmprss2 de ratón.
La figura 1A muestra un diagrama, no a escala, de la organización genómica de los genes Tmprss2 de ratón y TMPRSS2 humano. Los exones están representados por barras delgadas colocadas a lo largo de las secuencias genómicas, indicando el primer exón codificante para ambos genes mediante el codón de inicio "ATG" por encima del exón e indicando el último exón codificante mediante el codón de "parada" por encima del exón. Se indican un fragmento genómico de ratón de aproximadamente 25.291 pb a eliminar y un fragmento genómico humano de aproximadamente 25.091 pb a insertar. Se indican las ubicaciones de las sondas utilizadas en un ensayo descrito en el ejemplo 1. DT: dominio transmembrana; SRCR: dominio de tipo rico en cisteína del receptor eliminador; LDLRa: receptor de lipoproteínas de baja densidad de clase A.
La figura 1B ilustra, no a escala, un vector BAC modificado ilustrativo para la humanización de un gen Tmprss2 de ratón endógeno, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 22, 23 y 24).
La figura 1C ilustra, no a escala, un alelo Tmprss2 humanizado después de que se haya eliminado el casete de neomicina, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 22 y 25).
La figura 1D establece una alineación de secuencias de una proteína TMPRSS2 humana (SEQ ID NO: 4), una
proteína Tmprss2 de ratón (SEQ ID NO: 2) y una proteína Tmprss2 humanizada ("pro 7010 mutante") (SEQ ID NO: 7).
Figuras 2A-2D. Estrategia ilustrativa para la humanización de Tmprss4 de ratón.
La figura 2A muestra un diagrama, no a escala, de la organización genómica de los genes Tmprss4 de ratón y TMPRSS4 humano. Los exones están representados por barras delgadas colocadas a lo largo de las secuencias genómicas, indicando el primer exón (también el primer exón codificante) para ambos genes mediante el codón de inicio "ATG" por encima del exón e indicando el último exón codificante mediante el codón de "parada" por encima del exón. Se indican el fragmento genómico de ratón de aproximadamente 11.074 pb a eliminar y el fragmento genómico humano de aproximadamente 14.963 pb a insertar. Se indican las ubicaciones de las sondas utilizadas en un ensayo descrito en el ejemplo 2. DT: dominio transmembrana; SRCR: dominio de tipo rico en cisteína del receptor eliminador; LDLRa: receptor de lipoproteínas de baja densidad de clase A.
La figura 2B ilustra, no a escala, un vector BAC modificado ilustrativo para la humanización de un gen Tmprss4 de ratón endógeno, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 38, 39 y 40).
La figura 2C ilustra, no a escala, un alelo Tmprss4 humanizado después de que se haya eliminado el casete de neomicina, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 41 y 40).
La figura 2D establece una alineación de secuencias de una proteína TMPRSS4 humana (SEQ ID NO: 11), una proteína T mprss4 de ratón (SEQ ID NO: 9) y una proteína T mprss4 humanizada ("pro 7224 mutante") (SEQ ID NO: 14).
Figuras 3A-3D. Estrategia ilustrativa para la humanización de Tm prsslld de ratón.
La figura 3A muestra un diagrama, no a escala, de la organización genómica de los genes Tm prsslld de ratón y TMPRSS11D humano. Los exones están representados por barras delgadas colocadas a lo largo de las secuencias genómicas, indicando el primer exón (también el primer exón codificante) para ambos genes mediante el codón de inicio "ATG" por encima del exón e indicando el último exón codificante mediante el codón de "parada" por encima del exón. Se indican un fragmento genómico de ratón de aproximadamente 35.667 pb a eliminar y un fragmento genómico humano de aproximadamente 33.927 pb a insertar. Se indican las ubicaciones de las sondas utilizadas en un ensayo descrito en el ejemplo 3. DT: dominio transmembrana; SEA: dominio que se encuentra en la proteína, enterocinasa y agrina de esperma de erizo de mar.
La figura 3B ilustra, no a escala, un vector BAC modificado ilustrativo para la humanización de un gen Tm prsslld de ratón endógeno, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 57, 58 y 59).
La figura 3C ilustra, no a escala, un alelo Tm prssll humanizado después de que se haya eliminado el casete de neomicina, junto con las secuencias de unión (SEQ ID NO: 57 y 60).
La figura 3D establece una alineación de secuencias de una proteína TMPRSS11D humana (SEQ ID NO: 18), una proteína Tmprss11d de ratón (SEQ ID NO: 16) y una proteína Tmprss11d humanizada ("pro 7226 mutante") (SEQ ID NO: 21).
La figura 4 muestra los resultados de un experimento que muestra que los ratones MAID7225 HumlnTMPRSS4 no difieren en su susceptibilidad a la exposición con dosis altas de gripe A H1N1 grave o H3N2 adaptada a ratón grave. Los ratones MAID7225 Humln TMRPSS4 expuestos con A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) (círculos de color gris claro, línea discontinua) mostraron tasas de supervivencia similares en comparación con los ratones de tipo silvestre (cuadrados de color gris claro, línea discontinua). De forma análoga, los ratones MAID7225 Humln TMRPSS4 expuestos con A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2) (triángulos de color gris oscuro, línea discontinua) mostraron tasas de supervivencia similares en comparación con los ratones de tipo silvestre (triángulos invertidos de color gris claro, línea discontinua). Los ratones se infectaron IN el día 0 con 1150 UFP de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) o 10.000 UFP de A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2). El grupo de control incluía ratones MAID7225 Humln TMPRSS4 no infectado como control negativo y ratones de tipo silvestre (rombos negros, línea continua).
Descripción detallada de determinadas realizaciones
La presente invención se refiere a roedores genéticamente modificados (por ejemplo, ratones y ratas) que tienen un gen humanizado que codifica una serina proteasa transmembrana de tipo II (o "Tmprss", para proteasa/serina transmembrana). Los roedores genéticamente modificados son adecuados para su uso en la exploración de compuestos candidatos que se dirigen específicamente a una molécula de TMPRSS humana para el tratamiento y la prevención de enfermedades tales como la infección por el virus de la gripe. Por consiguiente, la presente invención proporciona roedores genéticamente modificados que tienen un gen Tmprss humanizado, células y tejidos aislados de roedores genéticamente modificados, métodos y composiciones para producir roedores genéticamente modificados
y el uso de roedores genéticamente modificados para explorar y probar compuestos terapéuticos. Las diversas realizaciones de la presente invención se describen con más detalle a continuación.
Serina proteasas transmembrana de tipo II ("Tmprss")
Las serina proteasas transmembrana de tipo II, también denominadas en el presente documento "Tmprss" para moléculas no humanas o "TMPRSS" para moléculas humanas ("proteasa/serina transmembrana"), son una familia de proteínas caracterizadas por un dominio transmembrana aminoterminal y un dominio serina proteasa extracelular carboxiterminal. Se han identificado al menos 18 miembros en la familia, que se agrupan en cuatro subfamilias (Bugge et al. (2009), supra). Todos los miembros comparten varias características estructurales comunes que definen a la familia, incluyendo (i) un dominio citoplasmático aminoterminal corto, (ii) un dominio transmembrana y (iii) un ectodominio que contiene un dominio proteasa y una región tallo que une el dominio transmembrana con el dominio proteasa. La región tallo contiene una combinación de dominios estructurales modulares de seis tipos diferentes: un dominio SEA (proteína/enteropeptidasa/agrina de esperma de erizo de mar), un dominio receptor eliminador del grupo A, un dominio LDLA (receptor de lipoproteínas de baja densidad de clase A), un dominio CUB (factor de crecimiento embrionario de erizo Cls/Clr, proteína morfogenética ósea 1), un dominio MAM (meprina/antígeno A5/proteína receptora fosfatasa mu) y un dominio frizzled. Véase la revisión de Bugge et al. (2009), supra. Por ejemplo, TMPRSS2 y TMPRSS4, pertenecen ambas a la subfamilia hepsina/TMPRSS, tienen un dominio receptor eliminador del grupo A, precedido por un solo dominio LDLA en la región tallo. TMPRSS11D, también conocida como "HAT" para la proteasa similar a tripsina de las vías respiratorias humanas que pertenece a la subfamilia HAT/DESC, tiene un único dominio SEA. Véase la figura 1 de Bugge et al. (2009), supra.
Las serina proteasas transmembrana de tipo II se producen inicialmente como proenzimas inactivas que requieren activación por escisión después de un resto de aminoácido básico en un motivo de activación consenso que precede al dominio proteasa. Algunas de las proteasas activadas permanecen unidas a la membrana como resultado de un enlace disulfuro entre el prodominio y el dominio proteasa. Los dominios extracelulares se consideran cruciales para la localización celular, activación, inhibición y/o especificidad de sustrato de estas proteasas (Bugge et al. (2009), supra; Szabo et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 40: 1297-1316 (2008)).
Se ha documentado diversa información bioquímica y fisiopatológica para miembros de las serina proteasas transmembrana de tipo II. Se han mostrado que TMPRSS2, TMPRSS4 y TMPRSS11D escinden la hemaglutinina de la gripe A (HA) in vitro, que es la primera etapa esencial en el ciclo de vida vírico. Animales roedores genéticamente modificados que tienen un gen Tmprss humanizado divulgado en el presente documento proporcionan sistemas in vivo que permiten una comprensión profunda de las funciones biológicas de las moléculas TMPRSS, así como la exploración de compuestos terapéuticos que se dirigen específicamente a moléculas de TMPRSS humanas.
En la presente solicitud se proporcionan secuencias T mprss ilustrativas, incluyendo secuencias de los ácidos nucleicos y proteínas de Tmprss de ratón, humanas y humanizadas y se resumen en la siguiente tabla. También se incluyen en la tabla secuencias de cebadores y sondas utilizados en los ensayos descritos en la sección de ejemplos, y secuencias de unión de inserción de alelos Tmprss humanizados ilustrativos.
Descripción resumida de secuencias
continuación
continuación
Animales Roedores con Tmprss humanizado
En un aspecto, la presente invención proporciona animales roedores que contienen en la línea germinal un gen Tmprss humanizado que codifica una proteína Tmprss humanizada. En particular, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un gen Tmprss humanizado, en donde el gen Tmprss humanizado
comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín,
se encuentra en un locus Tmprss de roedor endógeno, y es el resultado de una sustitución de una secuencia
genómica del gen Tmprss de roedor endógeno con dicha secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín y está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor endógeno, y
- codifica una proteína Tmprss humanizada que comprende: (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína T mprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
El término "humanizado/a", cuando se utiliza en el contexto de ácidos nucleicos o proteínas, se refiere a ácidos nucleicos o proteínas cuyas estructuras (es decir, secuencias de nucleótidos o aminoácidos) incluyen porciones que corresponden sustancial o idénticamente a las estructuras de un gen o proteína particular que se encuentra en la naturaleza en un animal roedor, y también incluyen porciones que difieren de las encontradas en el gen o proteína de roedor relevante y en cambio corresponden de manera más cercana o idéntica a estructuras encontradas en un gen o proteína humanos correspondiente. Un roedor que contiene un gen humanizado o que expresa una proteína humanizada es un roedor "humanizado".
En algunas realizaciones, un roedor de la presente invención se selecciona de un ratón, una rata, y un hámster. En algunas realizaciones, un roedor de la presente invención se selecciona de la superfamilia Muroidea. En algunas realizaciones, un roedor genéticamente modificado de la presente invención es de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratones), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del nuevo mundo, campañoles), Muridae (ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirón espinoso), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas del bambú, y zokores). En algunas realizaciones determinadas, un roedor genéticamente modificado de la presente invención se selecciona de un auténtico ratón o rata (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso y una rata con cresta. En algunas realizaciones determinadas, un ratón genéticamente modificado de la presente invención es de un miembro de la familia Muridae.
En algunas realizaciones, el roedor divulgado en el presente documento contiene un gen Tmprss humanizado en el genoma que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano, en donde la secuencia de nucleótidos del gen Tmprss de roedor endógeno y la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano están operativamente unidos entre sí de modo que el gen Tmprss humanizado codifica una proteína Tmprss y está bajo el control de un o unos elementos 5' reguladores, tal como el o los promotores y/o potenciadores, del gen Tmprss de roedor endógeno.
La presente invención se refiere particularmente a la humanización similar; en otras palabras, una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín para formar un gen humanizado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano para formar un gen Tmprss2 humanizado. En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano para formar un gen Tmprss4 humanizado. En otras realizaciones más, una secuencia de nucleótidos de un gen Tm prsslld de roedor endógeno se une operativamente a una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano para formar un gen Tm prsslld humanizado.
En algunas realizaciones, un roedor genéticamente modificado de la presente invención contiene un gen Tmprss humanizado en su genoma, en donde el gen Tmprss humanizado codifica una proteína Tmprss humanizada que contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS humana. El término "ectodominio" se refiere a la porción de una proteína transmembrana que se extiende fuera de la membrana celular, es decir, la porción extracelular de una proteína transmembrana. El ectodominio de una molécula de TMPRSS incluye un dominio proteasa y una región de tallo que une el dominio transmembrana con el dominio proteasa. Por un ectodominio o polipéptido que es "sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS humana", se entiende en algunas realizaciones, un polipéptido que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia al ectodominio de una proteína TMPRSS humana; en algunas realizaciones, un polipéptido que difiere del ectodominio de una proteína TMPRSS humana en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; en algunas realizaciones, un polipéptido que difiere del ectodominio de una proteína TMPRSS humana solamente en el extremo N o C del ectodominio, por ejemplo, al carecer de aminoácidos o al tener aminoácidos adicionales en el extremo N o C del ectodominio; y en algunas realizaciones, un polipéptido que es sustancialmente el ectodominio de una proteína TMPRSS humana. Por "sustancialmente el ectodominio" de una proteína TMPRSS humana, se entiende un polipéptido que es idéntico al ectodominio, o difiere del ectodominio al carecer de 1-5 (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5) aminoácidos o al tener 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo N o C.
En algunas realizaciones, el gen Tmprss humanizado codifica una proteína Tmprss humanizada que además contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena. Por una porción o polipéptido citoplasmáticos y
transmembrana que es "sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína T mprss de roedor endógena", se entiende en algunas realizaciones, un polipéptido que es al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico en secuencia a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena; en algunas realizaciones, un polipéptido que difiere de la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; en algunas realizaciones, un polipéptido que difiere de la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena solamente en el extremo C, por ejemplo, al carecer de aminoácidos o al tener aminoácidos adicionales en el extremo C del dominio transmembrana; y en algunas realizaciones, un polipéptido compuesto por el dominio citoplasmático y sustancialmente el dominio transmembrana de una proteína Tmprss de roedor endógena. Por "sustancialmente el dominio transmembrana" de una proteína Tmprss de roedor endógena, se entiende un polipéptido que es idéntico al dominio transmembrana, o se diferencia del dominio transmembrana al carecer de 1-5 aminoácidos o al tener 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo C.
El gen Tmprss humanizado en el genoma de un roedor genéticamente modificado incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín codifica un polipéptido sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano. En determinadas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín en un gen Tmprss humanizado codifica el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano.
En algunas realizaciones, el gen Tmprss humanizado en el genoma de un roedor genéticamente modificado incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, en donde la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno codifica un polipéptido sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno. En realizaciones específicas, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno presente en un gen Tmprss humanizado codifica los dominios citoplasmático y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
Un gen Tmprss humanizado en la invención da como resultado una sustitución de una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno en un locus Tmprss de roedor endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss de roedor en un locus Tmprss de roedor endógeno se ha sustituido por una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano afín para formar un gen Tmprss humanizado.
En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS humano insertado en un gen Tmprss de roedor endógeno incluye exones, en su totalidad o en parte, de un gen TMPRSS humano, que codifican un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano.
En determinadas realizaciones, la secuencia genómica de un gen Tmprss de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss de roedor endógeno después de la sustitución de humanización y está operativamente unido a la secuencia genómica de TMPRSS humano contigua codifica una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
En circunstancias en las que una proteína Tmprss endógena y una proteína TMPRSS humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión entre el dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario insertar una secuencia genómica de TMPRSS humano que codifique precisamente el ectodominio de la proteína TMPRSS humana. Es posible insertar una secuencia genómica ligeramente más larga o más corta de un gen TMPRSS humano, que codifica sustancialmente el ectodominio de la proteína TMPRSS humana, en unión operativa a una secuencia genómica de un gen Tmprss de roedor endógeno que codifica el dominio citoplasmático y sustancialmente el dominio transmembrana de la proteína T mprss de roedor endógena, de manera que la proteína T mprss humanizada codificada por el gen Tmprss humanizado resultante incluye un ectodominio que es idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS humana y un dominio transmembrana que es idéntico al dominio transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano incluido en un gen Tmprss humanizado también incluye la región 3' no traducida ("UTR") del gen TMPRSS humano. En determinadas realizaciones, además de la 3' UTR de un gen TMPRSS humano, un gen Tmprss humanizado también incluye una secuencia genómica humana adicional del locus del gen TMPRSS humano, después de la 3' UTR de TMPRSS. La secuencia genómica humana adicional puede consistir en al menos 10-200 pb, por ejemplo, 50 pb, 75 pb, 100 pb, 125 pb, 150 pb, 175 pb, 200 pb o más, encontradas en locus del gen TMPRSS humano inmediatamente cadena abajo de la 3' UTR del gen TMPRSS humano. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano presente en un gen Tmprss humanizado no incluye una 3' UTR humana; en cambio, se incluye la 3' UTR de un gen
Tmprss de roedor endógeno y sigue inmediatamente al codón de parada del gen Tmprss humanizado. Por ejemplo, un gen Tmprss humanizado puede incluir una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno que contiene secuencias de exones que codifican los dominios citoplasmático y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor endógena, seguida de una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano que contiene secuencias de exones que codifican el ectodominio a través del codón de parada de la proteína TMPRSS humana, siguiendo la 3' UTR del gen Tmprss de roedor endógeno inmediatamente después del codón de parada.
En algunas realizaciones, un gen Tmprss humanizado da como resultado una expresión de la proteína Tmprss humanizada codificada en un roedor. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss humanizada se expresa en un patrón comparable con, o sustancialmente el mismo que, una proteína Tmprss de roedor homóloga en un roedor de control (por ejemplo, un roedor sin el gen Tmprss humanizado). En algunas realizaciones, una proteína Tmprss humanizada se expresa a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss de roedor homóloga en un roedor de control (por ejemplo, un roedor sin el gen Tmprss humanizado). En determinadas realizaciones, se expresa y detecta una proteína Tmprss humanizada en la superficie celular. En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss humanizada o una forma soluble (por ejemplo, una forma secretada de ectodominio) se expresa y detecta en el suero de un roedor, por ejemplo, a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss de roedor homóloga o una forma soluble de la misma en un roedor de control. En el contexto de comparar un gen o proteína humanizados en un roedor humanizado con un gen o proteína de roedor endógeno en un roedor de control, el término "comparable" significa que las moléculas o niveles que se comparan pueden no ser idénticos entre sí, pero son suficientemente similares para permitir la comparación entre ellos, de modo que se puedan extraer conclusiones razonablemente en función de las diferencias o similitudes observadas; y la expresión "sustancialmente el mismo" al referirse a los niveles de expresión significa que los niveles que se comparan no son diferentes entre sí en más de un 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 %.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona además una célula o tejido aislados de un animal roedor como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula se selecciona de una célula dendrítica, linfocito (p. ej., un linfocito B o T), macrófago y monocito. En algunas realizaciones, un tejido se selecciona de adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículo, óvulo y una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss humanizado como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón. En otras realizaciones, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de rata. Una célula madre embrionaria de roedor que contiene un gen Tmprss humanizado en su genoma se puede utilizar para producir un animal roedor humanizado, como se describe adicionalmente en el presente documento a continuación.
En algunas realizaciones, un roedor proporcionado en el presente documento es heterocigoto para un gen Tmprss humanizado en su genoma. En otras realizaciones, un roedor proporcionado en el presente documento es homocigoto para un gen Tmprss humanizado en su genoma.
En determinadas realizaciones, un roedor incluye múltiples, es decir, dos o más, genes Tmprss humanizados en su genoma. En otras palabras, se han humanizado dos o más locus Tmprss endógenos diferentes en un roedor utilizando secuencias de nucleótidos de genes TMPRSS humanos afines. Por ejemplo, se ha humanizado un roedor en dos o más de los loci de genes seleccionados de: Tmprss2, Tmprss4, y Tmprsslld.
Se describen con más detalle a continuación roedores (tal como ratones) con Tmprss2 humanizado, roedores (tal como ratones) con Tmprss4 humanizado y roedores (tal como ratones) con Tm prsslld humanizado ilustrativos.
Roedores con Tmprss2 humanizado
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss2 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano, y que está bajo el control de un o unos elementos 5' reguladores, tal como el o los promotores y/o potenciadores, del gen Tmprss2 de roedor endógeno. Ejemplos de roedores incluyen ratones y ratas.
En algunas realizaciones, un gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS2 humana.
En realizaciones específicas, la proteína TMPRSS2 humana tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada contiene los 387 aminoácidos carboxiterminales de una
proteína TMPRSS2 humana, por ejemplo, los aminoácidos 106 a 492 de una proteína TMPRSS2 humana. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta de W106 a G492 de la SEQ ID NO: 4. En realizaciones específicas, una proteína Tmprss2 humanizada contiene un ectodominio que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos compuesta de W106 a G492 de la SEQ ID NO: 4; un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de W106 a G492 de la SEQ ID NO: 4 en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; o un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de W106 a G492 de la SEQ ID NO: 4 solamente en el extremo N o C del ectodominio, por ejemplo, que carece de 1-5 aminoácidos o que tiene 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo N o C.
Una proteína Tmprss2 humanizada contiene además una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss2 de roedor endógena. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada incluye además el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína Tmprss2 de roedor endógena.
Una proteína Tmprss2 humanizada contiene el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína T mprss2 de roedor endógena y el ectodominio de una proteína TMPRSS2 humana. En realizaciones particulares, un gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.
Un gen Tmprss2 humanizado es el resultado de una sustitución de una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno en un locus Tmprss2 de roedor endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS2 humano.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss2 de roedor endógeno en un locus Tmprss2 de roedor endógeno se ha sustituido por una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano para formar un gen Tmprss2 humanizado.
En realizaciones específicas, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano insertado en un gen Tmprss2 de roedor endógeno incluye secuencias de exones, es decir, exones en su totalidad o en parte, de un gen TMPRSS2 humano, que codifican un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por el gen TMPRSS2 humano. En circunstancias en las que una proteína Tmprss2 endógena y una proteína TMPRSS2 humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario insertar una secuencia genómica de TMPRSS2 humano que codifique precisamente el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana, y es posible utilizar una secuencia genómica de TMPRSS2 humano ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el ectodominio de una proteína TMPRSS2 humana para producir una proteína Tmprss2 humanizada que tiene un ectodominio que es idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana.
En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que se está insertando en un gen Tmprss2 de roedor endógeno contiene al menos el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano.
En determinadas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que se está insertando en un gen Tmprss2 de roedor endógeno contiene el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones particulares, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que se está insertando en un gen Tmprss 2 de roedor endógeno contiene una porción 3' del exón 3 codificante, el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones específicas, la porción 3' del exón 3 codificante de un gen TMPRSS2 humano incluido en la humanización tiene una longitud de aproximadamente 5-10 pares de bases, es decir, aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pares de bases del extremo 3' del exón 3 codificante.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano que se está insertando en un gen Tmprss2 de roedor endógeno también contiene la 3' UTR del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones específicas, todo el exón 13 codificante de un gen TMPRSS2 humano está incluido en la secuencia genómica de TMPRSS2 contigua para la humanización, que incluye la 3' UTR del gen TMPRSS2 humano. En realizaciones particulares, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS2 humano incluye una secuencia genómica humana adicional cadena abajo de la 3' UTR del gen TMPRSS2 humano. La secuencia genómica humana adicional puede ser una secuencia de al menos 10-200 pb, o al menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 pb, que se encuentra inmediatamente cadena abajo del 3' UTR del gen TMPRSS2 humano en un locus TMPRSS2 humano.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss2 humanizado codifica un polipéptido que es sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena. En circunstancias en las que una proteína Tmprss2 endógena y una proteína TMPRSS2 humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario mantener la secuencia genómica de Tmprss2 de roedor
endógeno que codifique precisamente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena, y es posible mantener una secuencia genómica de Tmprss2 de roedor ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena en la sustitución de humanización para codificar una proteína Tmprss2 humanizada que tiene un dominio transmembrana que es idéntico al dominio transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor endógena. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss2 de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss2 humanizado incluye los exones 1-2 y una porción 5' del exón 3 codificante de un gen Tmprss2 de roedor endógeno, en donde la porción 5' del exón 3 codificante es una porción sustancial del exón 3 codificante, por ejemplo, todo el exón 3 codificante excepto 5 10 pares de bases en el extremo 3' del exón 3 codificante.
En realizaciones específicas, un gen Tmprss2 humanizado contiene los exones 1-2 codificantes y una porción 5' del exón 3 codificante de un gen Tmprss2 de roedor endógeno y una porción 3' del exón 3 codificante y del exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante de un gen TMPRSS2 humano, en donde el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína T mprss2 humanizada que contiene una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor, y un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana. En determinadas realizaciones, el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que contiene el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana de la proteína T mprss2 de roedor codificada por un gen Tmprss2 de roedor endógeno y el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por un gen TMPRSS2 humano. En realizaciones particulares, un gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, los exones e intrones de un gen TMPRSS2 humano y un gen Tmprss2 de roedor utilizados en la humanización son los que se encuentran en las SEQ ID NO: 1, 3 y 5-6.
En algunas realizaciones, un gen Tmprss2 humanizado da como resultado una expresión de la proteína Tmprss2 humanizada codificada en un roedor. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada se expresa en un patrón comparable con, o sustancialmente el mismo que, una proteína Tmprss2 de roedor homóloga en un roedor de control (por ejemplo, un roedor sin el gen Tmprss2 humanizado). En algunas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada se expresa a un nivel comparable con, o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss2 de roedor homóloga en un roedor de control (por ejemplo, un roedor sin el gen Tmprss2 humanizado). En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada se expresa y detecta en la superficie celular. En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss2 humanizada o una forma soluble (por ejemplo, una forma secretada de ectodominio) se expresa y detecta en el suero de un roedor, por ejemplo, a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss2 de roedor homóloga o una forma soluble de la misma en un roedor de control.
Roedores con Tmprss4 humanizado
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma contiene un gen Tmprss4 humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano, y que está bajo el control de un o unos elementos 5' reguladores, tal como el o los promotores y/o un o unos potenciadores, del gen Tmprss4 de roedor endógeno. Ejemplos de roedores incluyen ratones y ratas.
Un gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS4 humana. En realizaciones específicas, la proteína TMPRSS4 humana tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 11.
En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada contiene los 384 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS4 humana, por ejemplo, los aminoácidos 54 a 437 de una proteína TMPRSS4 humana. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta de K54 a L437 de la SEQ ID NO: 11. En realizaciones específicas, una proteína Tmprss4 humanizada contiene un ectodominio que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos compuesta de K54 a L437 de la SEQ ID NO: 11; un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de K54 a L437 de la SEQ ID NO: 11 en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; o un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de K54 a L437 de la SEQ ID NO: 11 solamente en el extremo N o C del ectodominio, por ejemplo, que carece de 1-5 aminoácidos o que tiene 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo N o C.
Una proteína Tmprss4 humanizada contiene además una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss4 de roedor endógena. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada incluye además el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína Tmprss4 de roedor endógena.
Una proteína Tmprss4 humanizada contiene el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína
Tmprss4 de roedor endógena y el ectodominio de una proteína TMPRSS4 humana. En realizaciones particulares, un gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14.
Un gen Tmprss4 humanizado es el resultado de una sustitución de una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno en un locus Tmprss4 de roedor endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS4 humano.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss4 de roedor endógeno en un locus Tmprss4 de roedor endógeno se ha sustituido por una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano para formar un gen Tmprss4 humanizado.
En realizaciones específicas, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano insertado en un gen Tmprss4 de roedor endógeno incluye secuencias de exones, es decir, exones en su totalidad o en parte, de un gen TMPRSS4 humano que codifica un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana codificada por el gen TMPRSS4 humano. En circunstancias en las que una proteína Tmprss4 endógena y una proteína TMPRSS4 humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario insertar una secuencia genómica de TMPRSS4 humano que codifique precisamente el ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana, y es posible utilizar una secuencia genómica de TMPRSS4 humano ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el ectodominio de una proteína TMPRSS4 humana para producir una proteína Tmprss4 humanizada que tiene un ectodominio que es idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana.
En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano que se está insertando en un gen Tmprss4 de roedor endógeno contiene al menos el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS4 humano.
En determinadas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano que se está insertando en un gen Tmprss4 de roedor endógeno incluye una porción 3' del intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano. En realizaciones específicas, la porción 3' del intrón 3 de un gen TMPRSS4 humano incluido en la humanización tiene una longitud de aproximadamente 140 160 pares de bases, es decir, aproximadamente 140, 145, 150, 155, 160 pares de bases del extremo 3' del intrón 3.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano que se está insertando en un gen Tmprss4 de roedor endógeno contiene la 3' UTR del gen TMPRSS4 humano. En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS4 humano que se está insertando en un gen Tmprss4 de roedor endógeno no contiene la 3' UTR del gen TMPRSS4 humano, y la 3' UTR del gen Tmprss4 de roedor endógeno sigue inmediatamente después del codón de parada en el gen Tmprss4 humanizado.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss4 de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss4 humanizado codifica un polipéptido que es sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor endógena. En circunstancias en las que una proteína Tmprss4 endógena y una proteína TMPRSS4 humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario mantener la secuencia genómica de Tmprss4 de roedor endógeno que codifique precisamente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor endógena, y es posible mantener una secuencia genómica de Tmprss4 de roedor ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor endógena en la sustitución de humanización para codificar una proteína Tmprss4 humanizada que tiene un dominio transmembrana que es idéntico al dominio transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor endógena.
En realizaciones específicas, un gen Tmprss4 humanizado contiene los exones 1-3 codificantes de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el codón de parada del exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano. En realizaciones particulares, un gen Tmprss4 humanizado contiene los exones 1-3 codificantes y una porción 5' del intrón 3 de un gen Tmprss4 de roedor endógeno y una porción 3' del intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada del exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano. En determinadas realizaciones, el gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que contiene el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana de la proteína Tmprss4 de roedor codificada por un gen Tmprss4 de roedor endógeno y el ectodominio de la proteína TMPRSS4 humana codificada por un gen TMPRSS4 humano. En realizaciones particulares, un gen Tmprss4 humanizado codifica una proteína Tmprss4 humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, los exones e intrones de un gen TMPRSS4 humano y un gen Tmprss4 de roedor utilizados en la humanización son los que se encuentran en las SEQ ID NO: 8, 10 y 12-13.
En algunas realizaciones, un gen Tmprss4 humanizado da como resultado una expresión de la proteína Tmprss4 humanizada codificada en un roedor. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada se expresa en un
patrón comparable con, o sustancialmente el mismo que, una proteína Tmprss4 de roedor homóloga en un roedor de control (p. ej., un roedor sin el gen Tmprss4 humanizado que codifica la proteína Tmprss4 humanizada). En algunas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada se expresa a un nivel comparable con, o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss4 de roedor homóloga en un roedor de control (p. ej., un roedor sin el gen Tmprss4 humanizado que codifica la proteína Tmprss4 humanizada). En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada se expresa y detecta en la superficie celular. En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss4 humanizada o una forma soluble (por ejemplo, una forma secretada de ectodominio) se expresa y detecta en el suero de un roedor, por ejemplo, a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss4 de roedor homóloga o una forma soluble de la misma en un roedor de control.
Roedores con Tmprsslldhumanizado
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un roedor cuyo genoma contiene un gen Tm prsslld humanizado que incluye una secuencia de nucleótidos de un gen Tm prsslld de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano, y que está bajo el control de un o unos elementos 5' reguladores, tal como el promotor y/o el o los potenciadores del gen Tmprss11d de roedor endógeno. Ejemplos de roedores incluyen ratones y ratas.
Un gen Tmprss11d humanizado codifica una proteína Tmprss11d humanizada que contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de una proteína TMPRSS11D humana.
En realizaciones específicas, la proteína TMPRSS11D humana tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada contiene los 377 aminoácidos carboxiterminales de una proteína TMPRSS11D humana, por ejemplo, los aminoácidos 42 a 418 de una proteína TMPRSS11D humana. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada contiene un ectodominio que es sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos compuesta de A42 a I418 de la SEQ ID NO: 18. En realizaciones específicas, una proteína Tmprss11d humanizada contiene un ectodominio que tiene al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos compuesta de A42 a I418 de la SEQ ID NO: 18; un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de A42 a I418 de la SEQ ID NO: 18 en no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos; o un ectodominio que difiere de la secuencia de aminoácidos compuesta de A42 a I418 de la SEQ ID NO: 18 solamente en el extremo N o C, por ejemplo, al carecer de 1-5 aminoácidos o al tener 1-5 aminoácidos adicionales en el extremo N o C.
Una proteína Tmprss11d humanizada contiene además una porción citoplasmática y transmembrana que es sustancialmente idéntica a la porción citoplasmática y transmembrana de una proteína Tmprss11d de roedor endógena. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada incluye el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína T mprss11d de roedor endógena.
En realizaciones específicas, una proteína Tmprss11d humanizada contiene el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína Tmprss11d de roedor endógena y el ectodominio de una proteína TMPRSS11D humana. En realizaciones particulares, un gen Tmprss11d humanizado codifica una proteína Tmprss11 d humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21.
Un gen Tmprss11d humanizado es el resultado de una sustitución de una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss11d de roedor endógeno en un locus Tmprss11d de roedor endógeno con una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS11D humano.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen Tmprss11d de roedor endógeno en un locus Tmprss11d de roedor endógeno se ha sustituido por una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano para formar un gen Tmprss11d humanizado. En realizaciones específicas, la secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano insertado en un gen Tmprss11d de roedor endógeno incluye secuencias de exones, es decir, exones en su totalidad o en parte, de un gen TMPRSS11D humano que codifica un ectodominio que es sustancialmente idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana codificada por el gen TMPRSS11D humano. En circunstancias en las que una proteína Tmprss11d endógena y una proteína TMPRSS11D humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario insertar una secuencia genómica de TMPRSS11D humano que codifique precisamente el ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana, y es posible utilizar una secuencia genómica de TMPRSS11D humano ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el ectodominio de una proteína TMPRSS11D humana para producir una proteína Tmprss11d humanizada que tiene un ectodominio que es idéntico al ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana.
En realizaciones específicas, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano que se está insertando en un gen Tmprss11d de roedor endógeno contiene al menos el exón 3 codificante hasta el codón de
parada en el exón 10 codificante de un gen TMPRSS11D humano.
En determinadas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano que se está insertando en un gen Tmprss11d de roedor endógeno contiene, al menos, una porción 3' del intrón 2 y el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante del gen TMPRSS11D humano. En realizaciones específicas, la porción 3' del intrón 2 de un gen TMPRSS2 humano incluido en la humanización tiene una longitud de aproximadamente 444 pares de bases.
En algunas realizaciones, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano que se está insertando en un gen Tmprss11d de roedor endógeno contiene la 3' UTR del gen TMPRSS11D humano. En realizaciones específicas, todo el exón 10 codificante de un gen TMPRSS11D humano está incluido en la secuencia genómica de TMPRSS11D contigua para la humanización, que incluye la 3' UTR de un gen TMPRSS11D humano. En realizaciones particulares, una secuencia genómica contigua de un gen TMPRSS11D humano incluye una secuencia genómica humana adicional cadena abajo de la 3' UTR del gen TMPRSS11D humano. La secuencia genómica humana adicional puede ser una secuencia de 10-200 pb, 50-200 pb, o aproximadamente 150, 160, 170, 180 pb, que se encuentra inmediatamente cadena abajo del 3' UTR del gen TMPRSS11D humano en un locus TMPRSS11D humano.
La secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss11d de roedor endógeno que permanece en un locus Tmprss11d humanizado codifica un polipéptido que es sustancialmente idéntico a la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss11 d de roedor endógena codificada por el gen Tmprss11d de roedor endógeno. En circunstancias en las que una proteína Tmprss11d endógena y una proteína TMPRSS11D humana comparten aminoácidos comunes cerca de la unión del dominio transmembrana y el ectodominio, puede que no sea necesario mantener la secuencia genómica de Tmprss11d de roedor endógeno que codifique precisamente el dominio transmembrana de la proteína T mprss11d de roedor endógena, y es posible mantener una secuencia genómica de Tmprss11d de roedor ligeramente más larga o más corta que codifique sustancialmente el dominio transmembrana de la proteína Tmprss11d de roedor endógena en la sustitución de humanización para codificar una proteína T mprss11 d humanizada que tiene un dominio transmembrana que es idéntico al dominio transmembrana de la proteína T mprss11d de roedor endógena.
En realizaciones específicas, un gen Tmprss11d humanizado contiene los exones 1-2 codificantes de un gen Tmprss11d de roedor endógeno y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante de un gen TMPRSS11D humano. En determinadas realizaciones, el gen Tmprss11d humanizado codifica una proteína Tmprss11d humanizada que contiene el dominio citoplasmático y el dominio transmembrana de la proteína Tmprss11d de roedor codificada por un gen Tmprss11d de roedor endógeno y el ectodominio de la proteína TMPRSS11D humana codificada por un gen TMPRSS11D humano. En realizaciones particulares, un gen Tmprss11d humanizado codifica una proteína Tmprss11d humanizada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 21.
En algunas realizaciones, los exones e intrones de un gen TMPRSS11D humano y un gen Tmprss11d de roedor utilizados en la humanización son los que se encuentran en las SEQ ID NO: 15, 17 y 19-20.
En algunas realizaciones, un gen Tmprs11D humanizado da como resultado una expresión de la proteína Tmprs11d humanizada codificada en un roedor. En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada se expresa en un patrón comparable con, o sustancialmente el mismo que, una proteína Tmprss11d de roedor homóloga en un roedor de control (p. ej., un roedor sin el gen Tmprss11d humanizado que codifica la proteína Tmprss11d humanizada). En algunas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada se expresa a un nivel comparable con, o sustancialmente igual que, una proteína Tmprss11d de roedor homóloga en un roedor de control (p. ej., un roedor sin el gen Tmprss11d humanizado que codifica la proteína Tmprss11 d humanizada). En determinadas realizaciones, una proteína Tmprss11d humanizada se expresa y detecta en la superficie celular. En determinadas realizaciones, una proteína T mprss11d humanizada o una forma soluble (por ejemplo, una forma secretada de ectodominio) se expresa y detecta en el suero de un roedor, por ejemplo, a un nivel comparable con o sustancialmente igual que, una proteína T mprss11d de roedor homóloga o una forma soluble de la misma en un roedor de control.
Métodos para producir animales roedores con Tmprss humanizados
Otros aspectos de esta divulgación se refieren a métodos para producir un roedor con Tmprss humanizado descrito anteriormente, así como vectores de ácido nucleico y células madre embrionarias no humanas adecuadas para su uso en la producción de un roedor con Tmprss humanizado. En particular, la presente invención también proporciona un método para producir un roedor que tenga un gen Tmprss humanizado, que comprende:
(a) insertar un fragmento genómico en un locus Tmprss de roedor endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, comprendiendo dicho fragmento genómico una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, formando, de este modo, un gen Tmprss humanizado,
en donde el gen Tmprss humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor en el locus Tmprss de roedor endógeno y codifica una proteína T mprss humanizada, y
en donde la proteína Tmprss humanizada comprende (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la
porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor codificada por el gen Tmprss de roedor en dicho locus Tmprss de roedor endógeno;
(b) obtener una célula madre embrionaria de roedor que comprende el gen Tmprss humanizado de (a); y, (c) crear un roedor utilizando la célula madre embrionaria de roedor de (b).
Los roedores proporcionados en el presente documento se pueden producir utilizando métodos conocidos en la técnica. En realizaciones ilustrativas, un clon de un cromosoma artificial bacteriano (BAC, por sus siglas en inglés) que lleva un gen Tmprss de roedor puede modificarse utilizando recombinación bacteriana homóloga y tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, el documento US 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659). Como resultado, se ha eliminado una secuencia de nucleótidos de Tmprss de roedor del clon BAC original y se ha insertado una secuencia de nucleótidos de Tmprss humano, dando como resultado un clon BAC modificado que lleva un gen Tmprss humanizado, flanqueado por brazos de homología 5' y 3' de roedor. El clon BAC modificado, una vez linealizado, se puede introducir en células madre embrionarias de roedor (ES, por sus siglas en inglés) mediante, por ejemplo, electroporación. En la técnica se han descrito tanto células ES de ratón como células ES de rata. Véanse, por, ejemplo, los documentos US 7.576.259, US 7.659.442, US 7.294.754 y US 2008-0078000 A1 describen células ES de ratón y el método VELOCIMOUSE® para producir un ratón genéticamente modificado; los documentos US 2014/0235933 A1, US 2014/0310828 A1, Tong et al. (2010) Nature 467:211-215 y Tong et al. (2011) Nat Protoc. 6(6): doi: 10.1038/nprot.2011.338 describen células ES de rata y métodos para producir una rata genéticamente modificada.
Se pueden seleccionar células ES que tienen un gen Tmprss humanizado integrado en el genoma. En algunas realizaciones, las células ES que tienen un Tmprss humanizado integrado en un locus Tmprss de roedor endógeno se pueden seleccionar basándose en ensayos de pérdida de alelos de roedor y/o ganancia de alelos humanos. Las células ES seleccionadas se utilizan después como células ES donantes para inyección en un embrión en etapa previa a la mórula (p. ej., embrión en etapa de 8 células) mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, los documentos US 7.576.259, US 7.659.442, US 7.294.754 y US 2008-0078000 A1), o los métodos descritos en los documentos US 2014/0235933 A1 y US 2014/0310828 A1. El embrión que comprende las células ES donantes se incuba hasta la etapa de blastocisto y luego se implanta en una madre sustituta para producir un roedor F0 totalmente derivado de las células Es donantes. Las crías de roedores que llevan el gen Tmprss humanizado pueden identificarse mediante genotipificación del ADN aislado de cortes de la cola utilizando ensayos de pérdida de alelos de roedor y/o ganancia de alelos humanos.
Se pueden cruzar roedores heterocigotos para un gen Tmprss humanizado con roedores homocigotos generados. Se pueden cruzar roedores que contienen un gen Tmprss humanizado con roedores que contienen otro gen Tmprss humanizado para hacer producir roedores que contienen múltiples genes Tmprss humanizados. Por ejemplo, se pueden cruzar roedores que contienen un gen Tmprss2 humanizado con roedores que contienen un gen Tmprss4 humanizado para producir roedores que contienen un gen Tmprss2 humanizado y un gen Tmprss4 humanizado.
Métodos que emplean roedores que tienen genes Tmprss humanizados
Los roedores divulgados en el presente documento proporcionan un sistema in vivo útil y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que expresan proteínas Tmprss humanizadas para identificar y probar compuestos que se dirigen específicamente a proteínas TMPRSS humanas.
En un aspecto, un roedor divulgado en el presente documento se usa para determinar la capacidad de un compuesto candidato, tal como un inhibidor de una proteína TMPRSS humana, para tratar y/o prevenir la infección por el virus de la gripe. En particular, la presente invención proporciona un método para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto en el tratamiento de una infección por el virus de la gripe A, que comprende:
proporcionar un roedor de la presente invención;
administrar un virus de la gripe A y un compuesto candidato al roedor, en donde opcionalmente el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana; y
monitorizar la presencia y la gravedad de la infección por el virus de la gripe A en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del compuesto candidato.
En algunas realizaciones, un roedor que contiene un gen Tmprss humanizado y que expresa una proteína Tmprss humanizada divulgada en el presente documento se administra con un compuesto candidato antes de la infección experimental con el virus de la gripe. La eficacia profiláctica del compuesto se puede evaluar determinando si el roedor presenta menos síntomas y/o síntomas menos graves de infección por el virus de la gripe y/o una viabilidad mejorada, en comparación con el o los roedores de control.
En otras realizaciones, un roedor que contiene un gen Tmprss humanizado y que expresa una proteína Tmprss humanizada que comprende el ectodominio de una proteína TMPRSS humana se administra con un inhibidor candidato de esa proteína TMPRSS humana después de la infección experimental con el virus de la gripe. La eficacia profiláctica del inhibidor candidato se puede evaluar determinando si el roedor presenta menos síntomas y/o síntomas
menos graves de infección por el virus de la gripe y/o una viabilidad mejorada, en comparación con el o los roedores de control.
Los roedores de control adecuados incluyen, por ejemplo, roedores que contienen un gen Tmprss humanizado sin estar sometidos a la infección experimental; y roedores que contienen un gen Tmprss humanizado sometidos a la infección experimental sin ningún compuesto; y roedores que contienen un gen Tmprss humanizado sometidos a la infección experimental y un compuesto que se sabe que es terapéuticamente eficaz.
Los compuestos que pueden evaluarse en los métodos de la presente invención incluyen inhibidores de TMPRSS candidatos, por ejemplo, un inhibidor de proteasas de molécula pequeña, un inhibidor basado en ácidos nucleicos (p. ej., ARNip, ribozima, construcción antisentido, etc.), proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo), o un péptido de bloqueo/inhibidor de péptido. Un inhibidor de TMPRSS puede funcionar inhibiendo o reduciendo la capacidad de una proteína TMPRSS de escindir proteolíticamente la proteína precursora de hemaglutinina (HA0) en las subunidades HA1 y HA2.
En algunas realizaciones, un inhibidor candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. Tanto los anticuerpos monoclonales como policlonales son adecuados para los fines de la presente invención. En realizaciones específicas, el anticuerpo se une específicamente a una proteína TMPRSS e inhibe la actividad proteasa de esa proteína TMPRSS y no inhibe sustancialmente la actividad proteasa de otra proteína TMPRSS. Por ejemplo, un inhibidor de anticuerpos anti-TMPRSS2 se une específicamente a una proteína TMPRSS2 e inhibe la actividad proteasa de la proteína TMPRSS2, y no tiene ningún efecto sobre la actividad proteolítica de TMPRSS4 o TMPRSS1 ID, o reduce la actividad proteolítica de TMPRSS4 o TMPRSS1 ID en no más de un 25 % (p. ej., 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, o menos) con respecto a una molécula de control no inhibidora probada en condiciones experimentales idénticas o sustancialmente idénticas.
En algunas realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo anti-TMPRSS2 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo anti-TMPRSS4 o fragmento de unión a antígeno del mismo. En otras realizaciones, el inhibidor es un anticuerpo anti-TMPRSS11D o fragmento de unión a antígeno del mismo.
La infección con el virus de la gripe experimental se puede inducir y controlar siguiendo protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, el documento US 2013/0273070 A1. Por ejemplo, los animales roedores se pueden administrar por vía intranasal con el virus de la gripe. Los animales infectados pueden evaluarse para determinar los síntomas y la gravedad de la infección. Por ejemplo, los animales pueden analizarse para determinar(1) cambio de peso y supervivencia, (2) cambios celulares a través de citometría de flujo, (3) inmunoquímica, tinción de PAS y H&E de pulmones completos y (4) niveles de citocinas en suero. Los animales de control que se sabe que son susceptibles al virus presentan un aumento significativo en la frecuencia de células dendríticas, los niveles de macrófagos alveolares positivos para gripe, neutrófilos o células epiteliales en los pulmones y los niveles de IFNy, en comparación con los animales no infectados.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de describir para los expertos en la materia como preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores de la presente invención consideran como su invención. A menos que se indique lo contrario, la temperatura se indica en grados Celsius y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.
Ejemplo 1. Humanización de un gen
Tmprss2
endógeno.
Este ejemplo ilustra métodos ilustrativos de humanización de un gen endógeno que codifica Tmprss2 en un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo se pueden emplear para humanizar un gen Tmprss2 endógeno de un roedor utilizando cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias (o fragmentos de secuencias) humanas según se desee.
Un vector de direccionamiento para la humanización de un gen Tmprss2 endógeno se construyó utilizando clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y tecnología VELOCIGENe® (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with highresolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659).
Brevemente, se utilizó el clon bMQ-264A15 de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón que contiene un gen Tmprss2 de ratón y se modificó de la siguiente manera. Se generó un fragmento de ADN para incluir una secuencia de nucleótidos de homología de ratón 5', un ADN genómico de TMPRSS2 humano de aproximadamente 25.091 pb (que contiene los últimos 7 pb del exón 3 codificante, el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el exón 13 (incluida la 3' UTR que forma parte del exón 13 codificante), de un gen TMPRSS2 humano), un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 2.691 pb y una secuencia de homología 3' de ratón. Este fragmento de ADN se utilizó para modificar el clon BAC bMQ-264A15 mediante recombinación homóloga en células bacterianas. Como resultado, un ratón con un fragmento genómico de Tmprss2 de ratón que codifica un ectodominio (de aproximadamente 25.291 pb)
en el clon BAC se sustituyó con el fragmento genómico de TMPRSS2 humano de aproximadamente 25.091 pb, seguido de un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 2691 pb. Específicamente, el fragmento genómico de Tmprss2 de ratón que se sustituyó incluía los últimos 7 pb del exón 3 codificante, el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen Tmprss2 de ratón (figuras 1A-1B). El fragmento genómico de TMPRSS2 humano que se insertó incluía los últimos 7 pb del exón 3 codificante, el intrón 3 y el exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante de un gen TMPRSS2 humano (incluida la 3' UTR de TMPRSS2 humano) y una secuencia genómica 3' humana de 131 pb cadena abajo de la 3' UTR de TMPRSS2 humano (figuras 1A-1B). El clon BAC modificado resultante incluía, de 5' a 3', (i) un brazo de homología 5' de ratón que contiene aproximadamente 12 kb de ADN genómico de ratón que incluye la 5' UTR de Tmprss2 de ratón, el exón 1 (no codificante) de Tmprss2 de ratón, los exones 1-3 codificantes (excepto los últimos 7 pb del exón 3 codificante); (ii) un fragmento genómico de TMPRSS2 humano de aproximadamente 25.091 pb que incluye los últimos 7 pb del exón 3 codificante humano, el intrón 3, los exones 4 a 13 codificantes humanos (incluida la 3' UTR de TMPRSS2 humano),y una secuencia genómica 3' humana; (iii) un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 2691 pb, seguido de (iv) un brazo de homología 3' de ratón de 45 kb que contiene la 3' UTR de Tmprss2 de ratón y el ADN genómico de ratón restante en el clon BAC original. Véase las figuras 1A-1B. Las secuencias de unión también se exponen en la parte inferior de la figura 1B. La parte del clon BAC modificado que contiene el fragmento genómico de TMPRSS2 humano y el casete de neomicina, así como las uniones de inserción cadena arriba y cadena abajo, se expone en la SEQ ID NO:5. La secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Tmprss2 humanizado se expone en la SEQ ID NO: 7. Se proporciona una alineación de esta proteína Tmprss2 humanizada ("proteína 7010 mutante"), una proteína Tmprss2 de ratón (SEQ ID NO: 2) y una proteína TMp Rs S2 humana (SEQ iD NO: 4) en la figura 1D.
El clon BAC modificado que contiene el gen Tmprss2 humanizado, como se describe anteriormente, se utilizó para someter a electroporación a células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen Tmprss2 humanizado. Las células ES dirigidas positivamente que contienen un gen Tmprss2 humanizado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia de secuencias de TMPRSS2 humano (p. ej., los exones 4-13 codificantes de TMPRSS2 humano) y confirmó la pérdida y/o conservación de secuencias de Tmprss2 de ratón (p. ej., pérdida de los exones 4-13 codificantes de Tmprss2 de ratón). La tabla 1 muestra los cebadores y las sondas que se utilizaron para confirmar la humanización de un gen Tmprss2 endógeno como se describe anteriormente (figuras 1A-1B). Una vez que se ha seleccionado un clon de células ES correctamente dirigido, el casete de selección de neomicina se puede escindir introduciendo una recombinasa Cre, por ejemplo, a través de electroporación. Como alternativa, el casete de selección de neomicina puede eliminarse cruzando la descendencia generada a partir del clon ES con una cepa de roedor eliminador que expresa una recombinasa Cre. El locus Tmprss2 humanizado después de la eliminación del casete se muestra en la figura 1C, con las secuencias de unión que se muestran en la parte inferior de la figura 1C.
Se utilizaron clones de células ES seleccionados (con o sin el casete) para implantar en ratones hembra utilizando el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de los EE.UU. N.° 7.294.754 y Poueymirou et al., F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) para generar una camada de crías que contenía un alelo Tmprss2 humanizado en el genoma. Se pueden confirmar e identificar nuevamente ratones que llevan un alelo Tmprss2 humanizado mediante la genotipificación del ADN aislado de los cortes de la cola utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra) que detecta la presencia de las secuencias del gen TMPRSS2 humano. Las crías se genotipifican y se seleccionan las cohortes de animales heterocigotos para el locus Tmprss2 humanizado para la caracterización. Se producen animales homocigotos para el locus Tmprss2 humanizado cruzando animales heterocigotos.
TABLA 1
Nombre Cebador Secuencia (5'-3') SEQ ID NO
7010U Directo GCCGTGACT GTGACCTTCTC (SEQ ID NO: 26)
Sonda (BHQ) TGGAGGAGCCACCTGATGCCTC (SEQ ID NO: 27)
Inverso GCCTTGCCCTCAATGGAAAC (SEQ ID NO 28)
7010D Directo GGTTGCACAGCAAGGAAGAAG (SEQ ID NO: 29)
Sonda (BHQ) CCAGGAGTTCCTGTGAGCCTACCC (SEQ ID NO: 30)
Inverso TGGAATGGAAGGAGCTGGAG (SEQ ID NO 31)
7010hU Directo GTCCCACCTCCTGCAACTG (SEQ ID NO: 32)
Sonda (BHQ) TGAGCCTTCCCATCAGCCTGGG (SEQ ID NO: 33)
Inverso CCACAATGGCACATGGGTCTG (SEQ ID NO: 34) 7010hTD Directo GGTGCTTGCTCCCCAAGA (SEQ ID NO: 35)
Sonda (BHQ) CCTAAAAGGTGTTGTAATGG (SEQ ID NO: 36)
Inverso GGCAATAAAGAAGGAAGACGTTTT (SEQ ID NO: 37)
Ejemplo 2. Humanización de un gen
Tmprss4
endógeno.
Este ejemplo ilustra métodos ilustrativos de humanización de un gen endógeno que codifica Tmprss4 en un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo se pueden emplear para humanizar un gen Tmprss4 endógeno de un roedor utilizando cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias (o fragmentos de
secuencias) humanas según se desee.
Un vector de direccionamiento para la humanización de un gen Tmprss4 endógeno se construyó utilizando clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003), supra).
Brevemente, se utilizó el clon RP23-71M15 de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón que contiene un gen Tmprss4 de ratón y se modificó de la siguiente manera. Se generó un fragmento de ADN para incluir una secuencia de nucleótidos de homología de ratón 5', un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4996 pb, un ADN genómico humano de aproximadamente 14.963 pb (que contiene el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante de un gen TMPRSS4 humano), y una secuencia de homología 3' de ratón. Este fragmento de ADN se utilizó para modificar el clon BAC RP23-71M15 mediante recombinación homóloga en células bacterianas. Como resultado, un fragmento genómico de ratón que codifica un ectodominio (de aproximadamente 11.074 pb) en el clon BAC se sustituyó con un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4.996 pb, seguido del ADN genómico humano de aproximadamente 14.963 pb. Específicamente, el fragmento genómico de ratón que se eliminó y sustituyó incluía las 130 pb 3' del intrón 3 de ratón, el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen Tmprss4 de ratón (figuras 2A-2B). El fragmento genómico humano que se insertó incluía una porción 3' del intrón 3 de TMPRSS4 humano de aproximadamente 150 pb, y el exón 4 codificante de TMPRSS4 humano hasta el codón de parada en el exón 13 codificante (figuras 2A-2B). El clon BAC modificado resultante incluía, de 5' a 3', un brazo de homología 5' de ratón que contiene aproximadamente 44,8 kb de ADN genómico de ratón (incluida una 5' UTR de Tmprss4 de ratón, los exones 1 a 3 codificantes de Tmprss4 de ratón, el intrón 3 de Tmprss4 de ratón en parte (sin los 130 pb 3'), un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4996 pb, una porción 3' del intrón 3 de TMPRSS4 de aproximadamente 150 pb, el exón 4 codificante de TMPRSS4 hasta el codón de parada en el exón 13 codificante, seguido directamente por la 3' UTR de Tmprss4 de ratón y el ADN genómico de ratón restante en el clon BAC original (un brazo de homología 3' de ratón de aproximadamente 118 kb en total). Véase las figuras 2A-2B. Las secuencias de unión también se exponen en la parte inferior de la figura 2B. La parte del clon BAC modificado que contiene el casete de neomicina y el fragmento genómico de TMPRSS4 humano, así como las uniones de inserción cadena arriba y cadena abajo, se expone en la SEQ ID NO:12. La secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Tmprss4 humanizado se expone en la SEQ ID NO: 14. Se proporciona una alineación de esta proteína Tmprss4 humanizada ("pro 7224 mutante"), una proteína Tmprss4 de ratón (SEQ ID NO: 9) y una proteína TMPRSS4 humana (SEQ ID n O: 11) en la figura 2 D.
El clon BAC modificado que contiene el gen Tmprss4 humanizado, como se describe anteriormente, se utilizó para someter a electroporación a células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen Tmprss4 humanizado. Las células ES dirigidas positivamente que contienen un gen Tmprss4 humanizado se identificaron mediante un ensayo (Valenzuela et al., supra) que detectó la presencia de secuencias de TMPRSS4 humano (p. ej., los exones 4-13 codificantes de TMPRSS4 humano) y confirmó la pérdida y/o conservación de secuencias de Tmprss4 de ratón (p. ej., pérdida de los exones 4-13 codificantes de Tmprss4 de ratón). La tabla 2 muestra los cebadores y las sondas que se utilizaron para confirmar la humanización de un gen Tmprss4 endógeno como se describe anteriormente (figuras 2A-2B). Una vez que se ha seleccionado un clon de células ES correctamente dirigido, el casete de selección de neomicina se puede escindir introduciendo una recombinasa Cre, por ejemplo, a través de electroporación. Como alternativa, el casete de selección de neomicina puede eliminarse cruzando la descendencia generada a partir del clon ES con una cepa de roedor eliminador que expresa una recombinasa Cre. El locus Tmprss4 humanizado después de la eliminación del casete se muestra en la figura 2C, con las secuencias de unión que se muestran en la parte inferior de la figura 2C.
Se utilizaron clones de células ES seleccionados (con o sin el casete) para implantar en ratones hembra utilizando el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007), supra) para generar una camada de cachorros que contenía un alelo Tmprss4 humanizado en el genoma. Se pudieron confirmar e identificar nuevamente ratones que llevaban un alelo Tmprss4 humanizado mediante la genotipificación del ADN aislado de los cortes de la cola utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra) que detectaba la presencia de las secuencias del gen TMPRSS4 humano. Las crías se genotipificaron y se seleccionaron las cohortes de animales heterocigotos para el locus Tmprss4 humanizado para la caracterización. Se produjeron animales homocigotos para el locus Tmprss4 humanizado cruzando animales heterocigotos.
TABLA 2
Nombre Cebador Secuencia (5'-3') SEQ ID NO 7224mTU Directo GAGCAGGGCCAT GACACAT (SEQ ID NO 42)
Sonda (BHQ) ACCATT AGAT CCCAGCACT GG AC A (SEQ ID NO 43) Inverso AAACCCTT CCCGAGAGAGAA (SEQ ID NO 44) Directo GAGG AACACT GT GT CAAGGACTT (SEQ ID NO: 45) 7224mTU2 Sonda (BHQ) CCT GAAAAGCCCGGAGTGGCAG (SEQ ID NO 46)
Inverso GGGCAGAGACCACAT CTGA (SEQ ID NO: 47)
______________ (continuación)
Nombre Cebador Secuencia (5'-3') SEQ ID NO 7224mTD Directo GG AAGCCCT CT CT CGAT ACTT G (SEQ ID NO: 48)
Sonda (BHQ) TT CT ACCCT GAGGGCATGC AGC (SEQ ID NO: 49) Inverso T GGGAT GT AGAAGGTT GT CAGA (SEQ ID NO: 50) 7224hTU Directo CT GAGCCT GGAACTCACACAT G (SEQ ID NO: 51)
Sonda (BHQ) T CT GAG AGCCCAGCACT AT CGCC (SEQ ID NO: 52) Inverso GCT GAGGGT CAGGCTT GAG (SEQ ID NO: 53) 7224hTD Directo T CT GCAGGGT AGGGAGAGAAG (SEQ ID NO: 54)
Sonda (BHQ) TGTTTCAGAAAAGGAAGACTCACGTTA (SEQ ID NO: 55)
CA
Inverso GAGACCGAT GAAGAGAAAGT CAGA (SEQ ID NO: 56)
Ejemplo 3. Humanización de un gen
T m p rs s lld
endógeno.
Este ejemplo ilustra métodos ilustrativos de humanización de un gen endógeno que codifica Tmprss11d en un roedor (por ejemplo, un ratón). Los métodos descritos en este ejemplo se pueden emplear para humanizar un gen Tm prsslld endógeno de un roedor utilizando cualquier secuencia humana, o combinación de secuencias (o fragmentos de secuencias) humanas según se desee.
Un vector de direccionamiento para la humanización de un gen Tm prsslld endógeno se construyó utilizando clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 6.586.251 y Valenzuela et al. (2003), supra).
Brevemente, se utilizó el clon RP23-95N22 de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de ratón que contiene un gen Tm prsslld de ratón y se modificó de la siguiente manera. Se generó un fragmento de ADN para incluir una secuencia de nucleótidos de homología de ratón 5', un ADN genómico de TMPRSS11D humano de aproximadamente 33.927 pb (que contiene 444 pb en el extremo 3' del intrón 2, y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante (incluida la 3' UTR que es parte del exón 10 codificante), de un gen TMPRSS11D humano), un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4.996 pb y una secuencia de homología de ratón 3'. Este fragmento de ADN se utilizó para modificar el clon BAC RP23-95N22 mediante recombinación homóloga en células bacterianas. Como resultado, un ratón con un fragmento genómico de Tmprss11d de ratón que codifica un ectodominio (de aproximadamente 35.667 pb) en el clon BAC se sustituyó con el fragmento genómico de TMPRSS11D humano de aproximadamente 33.927 pb, seguido de un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4996 pb. Específicamente, el fragmento genómico de Tmprss11d de ratón que se sustituyó incluía una porción 3' del intrón 2 y el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante del gen Tmprss11d de ratón (figuras 3A-3B). El fragmento genómico de TMPRSS11D humano que se insertó incluía 444 pb en el extremo 3' del intrón 2 y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante de un gen TMPRSS11D humano (incluida la 3' UTR de TMPRSS11D humano) y una secuencia genómica 3' humana de aproximadamente 172 pb cadena abajo de la 3' UTR de TMPRSS11D humano (figuras 3A-3B). El clon BAC modificado resultante incluía, de 5' a 3', (i) un brazo de homología 5' de ratón que contiene aproximadamente 143 kb de ADN genómico de ratón que incluye la 5' UTR de Tmprss11d de ratón, los exones 1-2 codificantes de Tmprss11d de ratón y una porción 5' del intrón 2; (ii) un fragmento genómico de TMPRSS11D humano que incluía una porción 3' del intrón 2 y los exones 3 a 10 codificantes (incluida la 3' UTR) de TMPRSS11D humano y una secuencia genómica 3' humana; (iii) un casete de neomicina autoeliminable de aproximadamente 4996 pb, seguido de (iv) un brazo de homología 3' de ratón de 10 kb que contiene la 3' UTR de Tmprss11d de ratón y el ADN genómico de ratón restante en el clon BAC original. Véase las figuras 3A-3B. Las secuencias de unión también se exponen en la parte inferior de la figura 3B. La parte del clon BAC modificado que contiene el fragmento genómico de TMPRSS11D humano y el casete de neomicina, así como las uniones de inserción cadena arriba y cadena abajo, se expone en la SEQ ID n O:19. La secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen Tmprss11d humanizado se expone en la SEQ ID NO: 21. Se proporciona una alineación de esta proteína Tmprss11d humanizada ("pro 7226 mutante"), una proteína Tmprss11d de ratón (SEQ ID NO: 16) y una proteína TMPRSS11D humana (SEQ ID NO: 18) en la figura 3D.
El clon BAC modificado que contiene el gen Tmprss11d humanizado, como se describe anteriormente, se utiliza para someter a electroporación a células madre embrionarias (ES) de ratón para crear células ES modificadas que comprenden un gen Tmprss11d humanizado. Las células ES dirigidas positivamente que contienen un gen Tmprss11d humanizado se identifican mediante un ensayo (Valenzuela et al., supra) que detecta la presencia de las secuencias de TMPRSS11D humano (p. ej., los exones 3-10 codificantes de TMPRSS11D humano) y confirma la pérdida y/o conservación de secuencias de Tmprss11d de ratón (p. ej., pérdida de los exones 3-10 codificantes de Tmprss11d de ratón). La tabla 3 muestra los cebadores y las sondas que se utilizaron para confirmar la humanización de un gen Tmprss11d endógeno como se describe anteriormente (figuras 3A-3B). Una vez que se ha seleccionado un clon de
células ES correctamente dirigido, el casete de selección de neomicina se puede escindir introduciendo una recombinasa Cre, por ejemplo, a través de electroporación. Como alternativa, el casete de selección de neomicina puede eliminarse cruzando la descendencia generada a partir del clon ES con una cepa de roedor eliminador que expresa una recombinasa Cre. El locus Tm prsslld humanizado después de la eliminación del casete se muestra en la figura 3C, con las secuencias de unión que se muestran en la parte inferior de la figura 3C.
Se utilizan clones de células ES seleccionados (con o sin el casete) para implantar en ratones hembra utilizando el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 7.294.754 y Poueymirou et al. (2007), supra) para generar una camada de cachorros que contenía un alelo Tm prsslld humanizado en el genoma. Se pueden confirmar e identificar nuevamente ratones que llevaba un alelo Tm prsslld humanizado mediante la genotipificación del ADN aislado de los cortes de la cola utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuela et al., supra) que detecta la presencia de las secuencias del gen TMPRSS11D humano. Las crías se genotipifican y se seleccionan las cohortes de animales heterocigotos para el locus Tm prsslld humanizado para la caracterización. Se producen animales homocigotos para el locus Tm prsslld humanizado cruzando animales heterocigotos.
__________________________________________ TABLA 3__________________________________________
Nombre Cebador Secuencia (5'-3') SEQ ID NO 7226mTU Directo TCCTCT CCAGACAAGAAAGCT (SEQ ID NO: 61)
Sonda (BHQ) TCATAGCAGCTTTCAAATCCTAAACGT (SEQ ID NO: 62) TGA
Inverso TCGTGTGT AGCT GGT GAGTT (SEQ ID NO: 63) 7226mTD Directo CAT GCGAT CACAGGAGGAGAT C (SEQ ID NO: 64) Sonda (BHQ) AATT GGGCCCGAAGCCAGAT GC (SEQ ID NO: 65) Inverso CGGAAGGCTT CT GT GACTT C (SEQ ID NO: 66) 7226hTU Directo GT CTCCCACTT CT GACAT AAT GAAC (SEQ ID NO: 67) Sonda (BHQ) CCCAGT GTT AACCCT ACAT CTGGTTCC (SEQ ID NO: 68) Inverso T GGG AAGAGACT CTT GGAC A (SEQ ID NO: 69) 7226hTD Directo AT GAGCTCCT AGT ACAGCTAAAGTT (SEQ ID NO: 70) Sonda (MGB) ATGCATGATCATCTATGCGTCAGAGC (SEQ ID NO: 71) Inverso TGCCCAGAT GCAGGGAGTT AG (SEQ ID NO: 72)
Ejemplo 4. Evaluación de los virus de la gripe A del grupo 1 y del grupo 2 en ratones MAID7225 Humln frente a ratones Tmprss4 de tipo silvestre
Para validar el uso de roedores con Tmprss humanizados como modelo animal de infección, se realizaron experimentos para evaluar la supervivencia de ratones MAID7225 Humln TMPRSS4 frente a compañeros de camada de tipo silvestre (TS) en un modelo de infección grave por gripe A del grupo 1 y del grupo 2.
Los ratones MAID7225 Humln TMPRSS4 son homocigotos para un gen Tmprss4 humanizado en su genoma y se generaron como se describe en el ejemplo 2. Las cepas víricas utilizadas en estos estudios incluyeron el aislado histórico del virus de la gripe A del grupo 1 A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) y un aislado del virus de la gripe A del grupo 2 propio adaptado a ratón A/Aichi/02/1968 (HA, NA) X-31 (H3N2). Todos los experimentos se realizaron en ratones machos y hembras MAID7225 Humln TMPRSS4 de 6-8 semanas de edad o compañeros de camada de TS. Los ratones se expusieron con 1150 unidades formadoras de placa (UFP) de A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) o 10.000 UFP de A/Aichi/02/1968-X31 (H3N2). En estos modelos de supervivencia, los ratones se expusieron por vía intranasal (IN) el día 0 después de la infección (p.i.). Los ratones se pesaron y observaron diariamente hasta el día 14 p.i. y se sacrificaron cuando perdieron el 20 % de su peso inicial. Los resultados se indican como porcentaje de supervivencia (tabla 4).
Tabla 4
Claims (16)
1. Un roedor cuyo genoma comprende un gen Tmprss humanizado, en donde el gen Tmprss humanizado
- comprende una secuencia de nucleótidos de un gen Tmprss de roedor endógeno y una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín,
- se encuentra en un locus Tmprss de roedor endógeno, y es el resultado de una sustitución de una secuencia genómica del gen Tmprss de roedor endógeno con dicha secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS humano afín y está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor endógeno, y
- codifica una proteína Tmprss humanizada que comprende: (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína T mprss de roedor endógena codificada por el gen Tmprss de roedor endógeno.
2. El roedor de la reivindicación 1, en donde el gen Tmprss humanizado es un gen Tmprss2 humanizado, el gen Tmprss de roedor endógeno es un gen Tmprss2 de roedor endógeno y el gen TMPRSS humano afín es un gen TMPRSS2 humano.
3. El roedor de la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS2 humano comprende el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano.
4. El roedor de la reivindicación 2, en donde el gen Tmprss2 humanizado comprende
(i) los exones 1-2 codificantes del gen Tmprss2 de roedor endógeno,
(ii) un exón 3 que comprende una porción 5' del exón 3 codificante del gen Tmprss2 de roedor endógeno y una porción 3' del exón 3 codificante del gen TMPRSS2 humano, y
(iii) el exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano, y
en donde el gen Tmprss2 humanizado codifica una proteína Tmprss2 humanizada que comprende una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss2 de roedor codificada por dicho gen Tmprss2 de roedor endógeno y un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS2 humana codificada por dicho gen TMPRSS2 humano.
5. El roedor de la reivindicación 1, en donde el gen Tmprss humanizado es un gen Tmprss4 humanizado, el gen Tmprss de roedor endógeno es un gen Tmprss4 de roedor endógeno y el gen TMPRSS humano afín es un gen TMPRSS4 humano.
6. El roedor de la reivindicación 5, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS4 humano comprende el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS4 humano.
7. El roedor de la reivindicación 5, en donde el gen Tmprss4 humanizado comprende el exón 1 codificante hasta el exón 3 codificante del gen Tmprss4 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS4 humano.
8. El roedor de la reivindicación 1, en donde el gen Tmprss humanizado es un gen Tm prsslld humanizado, el gen Tmprss de roedor endógeno es un gen Tm prsslld de roedor endógeno y el gen TMPRSS humano afín es un gen TMPRSS11D humano.
9. El roedor de la reivindicación 8, en donde la secuencia de nucleótidos del gen TMPRSS11D humano comprende el exón 3 codificante hasta el codón de parada en el exón 10 codificante del gen TMPRSS11D humano.
10. El roedor de la reivindicación 8, en donde el gen Tmprss11d humanizado que comprende los exones 1-2 codificantes del gen Tmprss11d de roedor endógeno y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante del gen TMPRSS11D humano.
11. El roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor es homocigoto para el gen Tmprss humanizado.
12. Un método para producir un roedor que tiene un gen Tmprss humanizado, que comprende:
(a) insertar un fragmento genómico en un locus Tmprss de roedor endógeno en una célula madre embrionaria de roedor, comprendiendo dicho fragmento genómico una secuencia de nucleótidos de un gen TMPRSS humano afín, formando, de este modo, un gen Tmprss humanizado,
en donde el gen Tmprss humanizado está bajo el control del promotor del gen Tmprss de roedor en el locus Tmprss
de roedor endógeno y codifica una proteína T mprss humanizada, y
en donde la proteína Tmprss humanizada comprende (i) un ectodominio que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con el ectodominio de la proteína TMPRSS humana codificada por el gen TMPRSS humano afín y (ii) una porción citoplasmática y transmembrana que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la porción citoplasmática y transmembrana de la proteína Tmprss de roedor codificada por el gen Tmprss de roedor en dicho locus Tmprss de roedor endógeno;
(b) obtener una célula madre embrionaria de roedor que comprende el gen Tmprss humanizado de (a); y, (c) crear un roedor utilizando la célula madre embrionaria de roedor de (b).
13. El método de la reivindicación 11 o 12, en donde el gen Tmprss humanizado se selecciona del grupo que consiste en un gen Tmprss2 humanizado, un gen Tmprss4 humanizado y un gen Tm prsslld humanizado.
14. El método de la reivindicación 13,
en donde el gen Tmprss2 humanizado comprende (i) los exones 1-2 codificantes del gen Tmprss2 de roedor endógeno, (ii) un exón 3 que comprende una porción 5' del exón 3 codificante del gen Tmprss2 de roedor endógeno y una porción 3' del exón 3 codificante del gen TMPRSS2 humano y (iii) el exón 4 codificante hasta el exón 13 codificante del gen TMPRSS2 humano; y/o
en donde el gen Tmprss4 humanizado comprende el exón 1 codificante hasta el exón 3 codificante del gen Tmprss4 de roedor endógeno y el exón 4 codificante hasta el codón de parada en el exón 13 codificante del gen TMPRSS4 humano; y/o en donde el gen Tm prsslld humanizado comprende los exones 1-2 codificantes del gen Tm prsslld de roedor endógeno y el exón 3 codificante hasta el exón 10 codificante del gen TMPRSS11D humano.
15. El roedor acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde el roedor es un ratón o una rata.
16. Un método para evaluar la eficacia terapéutica de un compuesto en el tratamiento de una infección por el virus de la gripe A, que comprende:
proporcionar un roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 o 15;
administrar un virus de la gripe A y un compuesto candidato al roedor, en donde opcionalmente el compuesto candidato es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para una proteína TMPRSS humana; y
monitorizar la presencia y la gravedad de la infección por el virus de la gripe A en el roedor para determinar la eficacia terapéutica del compuesto candidato.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201662301023P | 2016-02-29 | 2016-02-29 | |
PCT/US2017/019574 WO2017151453A1 (en) | 2016-02-29 | 2017-02-27 | Rodents having a humanized tmprss gene |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2886958T3 true ES2886958T3 (es) | 2021-12-21 |
Family
ID=58264641
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES17709888T Active ES2886958T3 (es) | 2016-02-29 | 2017-02-27 | Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US10070632B2 (es) |
EP (2) | EP3422845B1 (es) |
JP (1) | JP6980674B2 (es) |
KR (2) | KR20230021759A (es) |
CN (1) | CN109068621B (es) |
AU (1) | AU2017228293B2 (es) |
CA (1) | CA3014645C (es) |
DK (1) | DK3422845T3 (es) |
ES (1) | ES2886958T3 (es) |
IL (1) | IL261139B (es) |
PT (1) | PT3422845T (es) |
RU (1) | RU2749715C2 (es) |
SG (2) | SG10202001578RA (es) |
WO (1) | WO2017151453A1 (es) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2886958T3 (es) | 2016-02-29 | 2021-12-21 | Regeneron Pharma | Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado |
EP3585162B1 (en) * | 2017-09-29 | 2023-08-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Rodents comprising a humanized ttr locus and methods of use |
SG11202006898TA (en) | 2018-01-26 | 2020-08-28 | Regeneron Pharma Inc | Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments |
LT3823443T (lt) | 2018-07-16 | 2024-08-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Ditra ligos graužikų modeliai ir jų naudojimas |
WO2020150426A1 (en) * | 2019-01-17 | 2020-07-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | A rodent model of mood disorders |
KR20220140503A (ko) | 2020-02-10 | 2022-10-18 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 항-tmprss2 항체 및 항원 결합 단편 |
WO2023122506A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci |
Family Cites Families (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002065266A (ja) * | 2000-08-28 | 2002-03-05 | Teijin Ltd | 気道特異的トリプシン様酵素およびその利用法 |
US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
EP1469717A4 (en) * | 2001-12-20 | 2007-08-22 | Univ California | TRIPLE TRANSGENIC MOUSE MODEL OF ALZHEIMER'S DISEASE |
US20050026255A1 (en) * | 2002-06-25 | 2005-02-03 | Morser John Michael | Corin, a serine protease |
AU2003279754A1 (en) * | 2002-10-04 | 2004-05-04 | Schering Aktiengesellschaft | Modified hepsin molecules having a substitute activation sequence and uses thereof |
RU2006100035A (ru) * | 2003-06-11 | 2006-08-27 | Шеринг Акциенгезельшафт (De) | Новые модифицированные кориновые молекулы, имеющие замещенные активирующие последовательности, и их применение |
US7491865B2 (en) * | 2004-08-19 | 2009-02-17 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Mouse models of prostate cancer development and metastasis through expression of a hepsin transgene |
CA2827654C (en) | 2004-10-19 | 2019-04-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method for generating an animal homozygous for a genetic modification |
KR101069089B1 (ko) * | 2006-05-23 | 2011-09-30 | 아이알엠 엘엘씨 | 채널 활성화 프로테아제 억제제로서의 화합물 및 조성물 |
GB0821624D0 (en) * | 2008-11-26 | 2008-12-31 | Eisai London Res Lab Ltd | Assay |
BRPI1006141B8 (pt) * | 2009-01-12 | 2021-05-25 | Cytomx Therapeutics Llc | composições de anticorpo modificado, métodos para preparar e usar as mesmas |
RU2425880C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Способ получения трансгенных мышей |
EP4049535A1 (en) | 2009-10-06 | 2022-08-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mice and engraftment |
PT3375284T (pt) * | 2011-02-15 | 2023-06-28 | Univ Yale | Ratinhos humanizados para m-csf e utilizações dos mesmos |
ES2525368T3 (es) | 2011-10-28 | 2014-12-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | IL-6 y receptor de IL-6 humanizados |
CN104039133B (zh) | 2011-10-28 | 2018-05-04 | 瑞泽恩制药公司 | 表达嵌合主要组织相容性复合物(mhc)ii类分子的基因修饰小鼠 |
ES2962287T3 (es) | 2011-10-28 | 2024-03-18 | Regeneron Pharma | Ratones con complejo principal de histocompatibilidad genéticamente modificados |
AU2013249577A1 (en) * | 2012-04-16 | 2014-10-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating or preventing influenza virus infection by administering a serine protease inhibitor |
US8962913B2 (en) | 2012-06-18 | 2015-02-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized IL-7 rodents |
WO2013192550A2 (en) * | 2012-06-22 | 2013-12-27 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof |
KR20240045263A (ko) | 2012-09-07 | 2024-04-05 | 예일 유니버시티 | 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법 |
KR102649893B1 (ko) | 2012-11-05 | 2024-03-25 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 유전자 변형된 비-인간 동물 및 그것의 사용 방법 |
SI2958938T1 (sl) | 2013-02-20 | 2019-08-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Miši, ki izražajo humanizirane koreceptorje za celice T |
AU2014218931C1 (en) | 2013-02-20 | 2020-05-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetic modification of rats |
CN110192541B (zh) | 2013-02-22 | 2022-02-18 | 瑞泽恩制药公司 | 表达人源化主要组织相容性复合物的小鼠 |
US20150342163A1 (en) | 2013-02-22 | 2015-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex mice |
BR112015026197B1 (pt) | 2013-04-16 | 2022-12-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc | Método para modificação marcada de um lócus genômico de interesse em uma célula de rato pluripotente |
EP3003387A1 (en) | 2013-06-04 | 2016-04-13 | Cytomx Therapeutics Inc. | Compositions and methods for conjugating activatable antibodies |
HUE063376T2 (hu) | 2013-09-23 | 2024-01-28 | Regeneron Pharma | Humanizált szignál-szabályozó fehérje gént tartalmazó nem humán állatok |
SG11201601828XA (en) | 2013-10-15 | 2016-04-28 | Regeneron Pharma | Humanized il-15 animals |
KR102173297B1 (ko) | 2013-11-19 | 2020-11-03 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화된 증식-유도 리간드 유전자를 가지고 있는 비-인간 동물 |
SG11201603360QA (en) | 2013-11-19 | 2016-05-30 | Regeneron Pharma | Non-human animals having a humanized b-cell activating factor gene |
CA2935472C (en) | 2014-04-08 | 2024-02-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having humanized fc-gamma receptors |
NO2785538T3 (es) | 2014-05-07 | 2018-08-04 | ||
ES2964597T3 (es) | 2014-05-19 | 2024-04-08 | Regeneron Pharma | Ratones modificados genéticamente que expresan EPO humana |
PT3157956T (pt) | 2014-06-19 | 2020-04-09 | Regeneron Pharma | Animais não humanos com um gene 1 de morte programada humanizada em células |
DK3223605T3 (da) | 2014-11-24 | 2020-11-16 | Regeneron Pharma | Ikke-humane dyr, der eksprimerer humaniseret cd3-kompleks |
PL3086637T3 (pl) | 2014-12-05 | 2019-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Zwierzęta nie będące człowiekiem mające humanizowany gen kompleksu różnicowania 47 |
US9913461B2 (en) | 2014-12-09 | 2018-03-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mouse whose genome comprises a humanized CD274 gene |
DK3280257T3 (da) | 2015-04-06 | 2023-09-04 | Regeneron Pharma | Humaniseret T-celle-formidlet immunrespons i ikke-humane dyr |
WO2017087780A1 (en) | 2015-11-20 | 2017-05-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3 |
ES2886958T3 (es) | 2016-02-29 | 2021-12-21 | Regeneron Pharma | Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado |
KR101693243B1 (ko) * | 2016-06-15 | 2017-01-05 | 재단법인 한국파스퇴르연구소 | 인플루엔자 바이러스의 복제에 관여하는 신규 인간 유전자 및 이의 용도 |
-
2017
- 2017-02-27 ES ES17709888T patent/ES2886958T3/es active Active
- 2017-02-27 KR KR1020237003004A patent/KR20230021759A/ko active Search and Examination
- 2017-02-27 EP EP17709888.6A patent/EP3422845B1/en active Active
- 2017-02-27 AU AU2017228293A patent/AU2017228293B2/en active Active
- 2017-02-27 PT PT177098886T patent/PT3422845T/pt unknown
- 2017-02-27 CN CN201780010404.0A patent/CN109068621B/zh active Active
- 2017-02-27 WO PCT/US2017/019574 patent/WO2017151453A1/en active Application Filing
- 2017-02-27 SG SG10202001578RA patent/SG10202001578RA/en unknown
- 2017-02-27 JP JP2018545182A patent/JP6980674B2/ja active Active
- 2017-02-27 KR KR1020187026552A patent/KR102493894B1/ko active IP Right Grant
- 2017-02-27 CA CA3014645A patent/CA3014645C/en active Active
- 2017-02-27 DK DK17709888.6T patent/DK3422845T3/da active
- 2017-02-27 SG SG11201807038UA patent/SG11201807038UA/en unknown
- 2017-02-27 EP EP21170433.3A patent/EP3895529A1/en active Pending
- 2017-02-27 RU RU2018131152A patent/RU2749715C2/ru active
- 2017-02-27 US US15/442,857 patent/US10070632B2/en active Active
- 2017-06-16 US US15/624,774 patent/US10070631B2/en active Active
-
2018
- 2018-08-02 US US16/052,700 patent/US10863729B2/en active Active
- 2018-08-13 IL IL261139A patent/IL261139B/en unknown
-
2020
- 2020-11-17 US US17/099,942 patent/US11910787B2/en active Active
-
2024
- 2024-01-16 US US18/413,096 patent/US20240147971A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2886958T3 (es) | Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado | |
ES2950399T3 (es) | Ratones humanizados Sirpa-IL15 insertados y métodos de uso de los mismos | |
Cann et al. | Developmental expression of LC3α and β: absence of fibronectin or autophagy phenotype in LC3β knockout mice | |
ES2703549T3 (es) | Animales no humanos que tienen un gen de un ligando inductor de la proliferación humanizado | |
ES2877275T3 (es) | Animales con dipeptidil peptidasa IV (DPP4) humanizada | |
CN104837989A (zh) | 通过等位基因替代生成fmdv抗性牲畜 | |
ES2975416T3 (es) | Modelo humanizado de trastornos renales y hepáticos | |
KR20210005661A (ko) | 변형된 아미노펩티다제 n(anpep) 유전자를 갖는 병원체-내성 동물 | |
KR20220017939A (ko) | 인간화 알부민 좌위를 포함하는 비-인간 동물 | |
WO2005003342A1 (ja) | メチル化を利用したトランスジェニック生物を作製する方法およびシステム | |
JP2024041751A (ja) | サイトカイン産生の調節 | |
Min et al. | Generation of antiviral transgenic chicken using spermatogonial stem cell transfected in vivo | |
KR20030022762A (ko) | Trp 유전자 파괴를 포함하는 형질전환 마우스 | |
JP2009511050A (ja) | バイオルミネセンス撮像のためのトランスジェニックrosa26−ルシフェラーゼマウス | |
JP6267785B2 (ja) | Cmp−アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼタゲッティングベクター、そのベクターが導入された異種間移植用形質転換動物及びその製造方法 | |
WO2011042874A1 (en) | Visualization of proprotein convertase activity in living cells and tissues | |
JP2005518800A (ja) | 構成的に活性化されたチロシンキナーゼレセプターを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 | |
JP6078383B2 (ja) | トランスジェニック非ヒト哺乳動物 | |
WO2023122506A1 (en) | Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci | |
CN117042600A (zh) | 具有经编辑的anp32基因的抗甲型流感动物 | |
JP2007151552A (ja) | Taar1トランスジェニック動物 | |
Stephan | Analysis of the functional interaction of neurotrypsin and agrin in the murine central nervous system | |
JP2010276505A (ja) | 新規癌転移抑制剤の探索法 | |
JP2014073080A (ja) | 神経芽腫モデルマウス | |
JP2005245255A (ja) | 誘導的に骨細胞を欠失させることのできるトランスジェニック動物 |