JP2005518800A - 構成的に活性化されたチロシンキナーゼレセプターを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 - Google Patents
構成的に活性化されたチロシンキナーゼレセプターを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 Download PDFInfo
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Abstract
その生殖細胞および体細胞が、該哺乳動物、またはその哺乳動物の胚段階の先祖に導入された構成的活性化チロシンキナーゼレセプターを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、癌腫の処置のための選択的チロシンキナーゼモデュレーターの同定および開発のためのリガンド非依存的インビボモデルとして利用できる。
Description
本発明は、腫瘍感受性トランスジェニック非ヒト哺乳動物を目的とするものである。さらに本発明は、抗癌剤および抗癌療法の開発におけるそのような哺乳動物の用途に関するものである。
組換えDNAおよび遺伝子技術における近年の進歩は、所望の配列または遺伝子を、レシピエント動物に導入し発現させることを可能にした。このような方法を使用することで、非天然の配列または遺伝子、即ち、改変されていない動物には通常または天然には存在しない配列または遺伝子を持つような動物が作り出されてきた。この技術はまた、天然に存在する配列または遺伝子の、改変された発現を示す動物を作製するために利用できる。
これらの方法の使用によって作製される動物は、導入された配列または遺伝子を当該動物の幾らかの細胞のみが含み且つ発現する、「キメラ」であるか、または、導入された配列または遺伝子を当該動物の全細胞が含んでいる、「トランスジェニック」であるかのいずれかとなり得る。したがって、子孫への伝達が、当該動物の生殖細胞にその導入された材料が存在するかどうかに依存する、キメラ動物に比して、トランスジェニック動物の場合、全ての動物が、導入された遺伝材料をその子孫に伝達することができる。
培養哺乳動物細胞の高効率形質転換は、特定のDNA配列を細胞核中に直接マイクロインジェクションすることによって達成されてきた（Capecchi,M., Cell 22:479-488(1980))。より詳細には、DNAをマウスの胚にマイクロインジェクションし、得られた子孫にそのDNAが見出されることも証明されている（Gordon et al., P.N.A.S. U.S.A. 77:7380-7384(1978))。このように、或る種のトランスジェニックマウスを作製できることは、記載されそして周知である。
トランスジェニックマウスを作製する基本的方法は、新たに交尾した雌性マウスから受精卵を回収し、次いで雄性マウスにマイクロインジェクションすることを要する。このマイクロインジェクションした卵を偽妊娠1日の養母の卵管に移植し、分娩まで進行させる。次いでこのマウス新生児を、マイクロインジェクションされたDNAの存在を検出するのに好適な、当分野で既知の手段によって、そのマイクロインジェクションされたDNAの存在について検査する。例えば、Wagner et al., P.N.A.S. U.S.A. 78:6376-6380(1981)、米国特許第4873191号を参照されたく、これは、ウサギβ-グロブリンを赤血球に発現できるマウスの作製を記載している。
インスリン様成長因子Iレセプター（「IGF-1R」または「IGF1R」とも称する）は、結腸、乳房、肺、前立腺、膠芽腫および黒色腫を包含する多くのヒト癌腫において過剰発現または活性化される膜貫通チロシンキナーゼである。IGF1Rは、形質転換表現型の確立および維持に必要であると考えられ、そして腫瘍形成において抗アポトーシス作用を発揮すると考えられている。Baserga, R., Cancer Research, 55:249-252(1995)。このレセプターの活性化は、IGF-IまたはIGF-IIのいずれかがIGF1Rの2個のαサブユニットに結合すること、即ちレセプター二量体化、によって開始され、その結果βサブユニットの触媒ドメインにある重要なチロシン残基の自己燐酸化が導かれる。Kato et al., J. Biol. Chem. 265:2655-2661(1993); Gronborg et al., J. Biol. Chem. 258:23435-23440(1993)。リガンドの結合はさらに、成長の調節と分化に関わっていると考えられている下流の基質の燐酸化とその後の活性化につながる。Ottensmeyer et al., Biochemistry 39:12103-12112(2000)。IGF1Rの可溶性キナーゼドメインおよびホモ二量体グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を含む融合蛋白を利用する、IGF1Rの活性化におけるキナーゼ二量体化の役割を研究するためのインビトロモデルが開発されている。Baer et al., Biochemistry 40:14268-14278(2001)。
今日まで、IGF1Rシグナル伝達を研究するために確立されたトランスジェニックモデルは、IGF1Rのリガンドの過剰発現に限定されている（Bol et al., Oncogene 14:1725-1734(1997); DiGiovanni et al., Cancer Research 60:1561-1570(2000))。これらのモデルは、遊離のIGF-IおよびIGF-IIのバイオアベイラビリティーを調節する働きがあり、その結果、腫瘍の発現に長い潜伏期間をもたらす、IGF結合蛋白（IGFBP）のファミリーの存在によって、さらに複雑化している。
リガンド結合活性化の不在下でレセプターの構成的刺激をインビトロで研究するための一つのアプローチは、c-Eykのキナーゼドメインを伴うCD8の細胞外および膜貫通ドメインを含むキメラオンコジーンレセプター型チロシンキナーゼを利用するものであった（Zong et al., EMBO Journal, Vol.15, No.17, 4516-4525(1996))。得られたキメラは、キナーゼ活性の上昇を示し、細胞の形質転換を惹起した。かかるキメラレセプターは、同じまたは異なる種由来の細胞外、膜貫通、および細胞質ドメインを組み込むことができる。サイトカインおよびその他のキナーゼドメインを含むキメラレセプターの製造および使用が当分野で知られている。例えば、Lawson et al., WO99/57268; M. Roberts, 米国特許第5712149号；およびCapon et al., 米国特許第5741899号を参照されたい。
故に、リガンド非依存性IGF-1レセプター駆動性腫瘍形成のためのトランスジェニック非ヒト哺乳動物モデルを開発することは興味深い。その動物が、誕生からかなり短期間でIGF1Rを過剰発現する腫瘍を発現し、多世代の血統の分析を容易にすることもまた望ましい。このようなモデルを使用して、活性化IGF1Rを過剰発現しまたはこれを有する腫瘍の病因および処置を研究することができる。本発明は、キメラレセプターを使用するこのようなモデルを表す。
本発明は、その生殖細胞および体細胞が、オンコジーン配列として働く構成的活性化チロシンキナーゼレセプターを発現する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を目的とするものである。チロシンキナーゼレセプターの構成的活性化は、二量体化誘導部分および活性化されるべきチロシンキナーゼレセプターの触媒キナーゼドメインを含むトランスジーンから生ずる。本発明の好ましい態様では、非ヒト哺乳動物はマウスであり、トランスジーンはCD8の細胞外および膜貫通ドメインならびにIGF1Rの細胞内触媒キナーゼドメインを含み、そして構成的活性化チロシンキナーゼレセプターはIGF1Rのレセプターである。本発明はさらに、その子孫が、有性生殖によって生まれた後に構成的活性化チロシンキナーゼレセプターを持つような生存トランスジェニック動物へと発生することのできる、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターを有する哺乳動物胚を含む。本発明はさらに、最終的に哺乳動物のゲノムに挿入するための、プラスミド中にクローニングされた構成的活性化チロシンキナーゼレセプターcDNAまたはDNAセグメントを加えた、選ばれたプロモーターを含むDNA構築物を含む。
本発明に係るトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、このトランスジェニック非ヒト哺乳動物によって発現される、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに対する特異性を特徴とする。本発明の好ましい態様では、このトランスジェニックマウスは、腫瘍形成を促す活性IGF1Rを構成的に発現し；形質転換されたマウスの唾液腺および乳腺に、早くも8週齢で腺癌が発現する。トランスジーンを発現するトランスジェニックマウス由来の腫瘍は、ヌードマウスに移植すると、特異的構成的活性化チロシンキナーゼレセプターのインヒビターに対して感受性があるが、他のチロシンキナーゼレセプターでは感受性が無く、したがって、新規な抗癌療法のための分子および化学物質の同定と最適化のための手段に利用することができる。よって本発明はさらに、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの選択的モデュレーター同定のための非ヒト哺乳動物および方法、ならびにそのようにして同定された選択的モデュレーターを含む医薬組成物を具体化するものである。
したがって本発明は、その体細胞および生殖系統細胞が、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの配列をコードしているトランスジーンを含むゲノムを含んでいる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物［ここでこの非ヒト哺乳動物は、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに特異的な腫瘍をより発現し易い］を提供するものである。
さらに本発明は、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターのコード配列を含むゲノムDNAフラグメントを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物［ここでこの非ヒト哺乳動物は、これを繁殖させてその子孫のゲノムが該ゲノムDNAフラグメントを含むような子孫非ヒト哺乳動物を生成させることができる］を提供する。
さらに本発明は、そのゲノムがゲノムDNAフラグメントを含む標的マウスを取得する方法［ここで、該DNAフラグメントは構成的活性化チロシンキナーゼレセプターのコード配列を含み、該マウスは、これを繁殖させてその子孫のゲノムが該ゲノムDNAフラグメントを含むような子孫マウスを生成させることができる］を提供するものであって、その方法は、
(a) 第一の雌性マウスから受精卵を単離し；
(b) その受精卵に、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターのコード配列を含むゲノムDNAフラグメントを移し；
(c) そのゲノムDNAフラグメントを含む受精卵を、第二の偽妊娠雌性マウスの子宮に移し；そして、
(d) その第二の雌性マウスを、
(i) この第二の雌性マウスが、該ゲノムDNAフラグメントを含む該受精卵から誘導した胚で妊娠状態となり；
(ii) 該胚が該標的マウスへと発生し；そして、
(iii) 該標的マウスが第二雌性マウスから生きて誕生する、
ように維持する［ここで、該標的マウスのゲノムは該ゲノムDNAフラグメントを含み、そして、該マウスは、これを繁殖させてその子孫のゲノムが該ゲノムDNAフラグメントを含むような子孫マウスを生成させることができる］、
という工程を含む。
(a) 第一の雌性マウスから受精卵を単離し；
(b) その受精卵に、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターのコード配列を含むゲノムDNAフラグメントを移し；
(c) そのゲノムDNAフラグメントを含む受精卵を、第二の偽妊娠雌性マウスの子宮に移し；そして、
(d) その第二の雌性マウスを、
(i) この第二の雌性マウスが、該ゲノムDNAフラグメントを含む該受精卵から誘導した胚で妊娠状態となり；
(ii) 該胚が該標的マウスへと発生し；そして、
(iii) 該標的マウスが第二雌性マウスから生きて誕生する、
ように維持する［ここで、該標的マウスのゲノムは該ゲノムDNAフラグメントを含み、そして、該マウスは、これを繁殖させてその子孫のゲノムが該ゲノムDNAフラグメントを含むような子孫マウスを生成させることができる］、
という工程を含む。
さらに本発明は、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに起因する癌腫の処置に使用するための、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの選択的モデュレーターを求めてスクリーニングする方法であって、本発明に係る非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、その癌腫における該被験物質の癌腫処置有効性を検定することを含む方法を包含する。構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに起因する癌腫を処置するための医薬組成物であって、その癌腫における癌腫処置有効性を有する選択的モデュレーターを求めてスクリーニングするこの方法によって決定された物質を含む組成物もまた提供される。
さらに本発明は、(a) マウスであるところの、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物から腫瘍フラグメントを取得し；(b) 該腫瘍フラグメントをレシピエントヌードマウスに皮下移植し；そして、(c) 工程(b)由来のマウスを、該マウスおよび該腫瘍の成長を促進する条件下に維持する、という工程を含む、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに特異的な腫瘍を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法を包含する。
本発明に係るさらに別の態様は、(a) マウスであるところの、本発明に係るトランスジェニック非ヒト動物から腫瘍フラグメントを取得し；(b) 該腫瘍試料から細胞を単離し；そして、(c) 単離した細胞を、この単離した細胞の成長および生存性を維持するような条件下に置く、という工程を含む、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターを発現するトランスジェニックマウスセルラインを作製する方法である。
発明の詳細な説明
人間の癌腫は多段階のプロセスを経て発現するが、このことは、正常細胞を悪性表現型を持つ細胞に変換するためには複数の変化が起こらなければならないことを示している。関係する遺伝子の一つのクラスに、細胞性オンコジーンがあるが、これは、突然変異により活性化されると、または不適切に発現されると、正常な細胞制御機構を無効にし、抑制の利かない細胞増殖を促進する。
人間の癌腫は多段階のプロセスを経て発現するが、このことは、正常細胞を悪性表現型を持つ細胞に変換するためには複数の変化が起こらなければならないことを示している。関係する遺伝子の一つのクラスに、細胞性オンコジーンがあるが、これは、突然変異により活性化されると、または不適切に発現されると、正常な細胞制御機構を無効にし、抑制の利かない細胞増殖を促進する。
本発明は、発現時にチロシンキナーゼの構成的活性化と若年齢での腫瘍の発現をもたらすキメラレセプターをゲノム中に含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作製に関するものである。この腫瘍は高レベルの活性化チロシンキナーゼを発現することが判明しており、その後これは異種移植片としてヌードマウスに移植できる。このようにして作製した腫瘍を用いて、生物学的研究に使用するためのセルラインを樹立した。
さらに本発明は、体細胞および生殖系統細胞が、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの配列をコードしているトランスジーンを含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関するものである［ここでこの非ヒト哺乳動物は、この構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに特異的な腫瘍をより発現し易い］。
下記の実施例に記載する好ましい態様では、この構築物は、作り出されたヒトCD8:IGF1R融合遺伝子である。当業者は、同様の結果を生じる、即ち、そこから細胞質触媒キナーゼドメインが作り出されたチロシンキナーゼレセプターの二量体化と構成的活性化を導くような他の構築物を作製できるということが認識できるであろう。例として（但しこれに限定されることを意図する訳ではない）、本発明に係るトランスジーンは、二量体化誘導部分、例えばCD8またはグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、ならびに、上皮成長因子レセプター（EGFR）、HER2、インスリンレセプター（IR）、インスリン様成長因子（IGF1R）、血小板由来成長因子（PDGFR）、線維芽細胞成長因子（FGFR）および肝細胞成長因子レセプター（Met）を包含する（但しこれらに限定されない）、チロシンキナーゼ活性を有するレセプターの群から選ばれる細胞内キナーゼドメインを含み得る。
本発明で使用するヌクレオチド配列（ヒトcDNA）は、公開されているドメイン（GenBank）で入手できる配列に基づき、標準的分子生物学技術（Maniatus et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1982); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Volume 2(1991))を用いてクローニングした。膜関連二量体化がチロシンキナーゼレセプターの構成的活性化を惹起する、即ち、該活性がその哺乳動物細胞においてシグナル変換を引き起こす限り、他の哺乳動物由来のヌクレオチド配列も本明細書に記載する発明に使用できる。本発明において、トランスジーンの発現は、融合蛋白が結合するチロシンキナーゼレセプターの二量体化を導き、次いで天然に存在するリガンド結合の不在下で該レセプターの構成的活性化を導く。
この構築物はさらに、当分野で一般に知られているように、例えば標的ゲノムへの導入、トランスジェニック哺乳動物における発現位置、発現のオン/オフ外的調節、およびその他の望ましい特徴の仲介のための、トランスジーンに付随する選択された核酸領域（例えばこれとの融合によって）を含むことができる。
或る態様では、本発明は、マウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーターの調節下で活性化IGF1Rを発現するトランスジェニック系統を提供する。唾液腺および乳腺の両方でこのトランスジーンを発現する幾つかのマウスの系統が作製され、このトランスジーンを有するマウスは、早くも8週齢でこれらの組織に腺癌を発現した。培養では、唾液腺腫瘍から誘導したセルラインはIGF1Rのインヒビターに対して感受性であるが、EGFレセプターのような他のレセプターに特異的なインヒビターに対してははるかに感受性が低い。重要なことには、ヌードマウスに移植した場合、これらの系統は、良好に増殖し且つ標準的細胞毒性物質に感受性の腫瘍を形成する。本明細書に記載のトランスジェニック動物は、IGF-1レセプターの阻害を目的とする抗癌治療に使用するための生物学的および化学的部分の同定、開発、および最適化の際の有効な手段として役立ち得る。
本発明に従い、ヒトCD8抗原の細胞外および膜貫通ドメイン（Sukhatmet et al., Cell 40(30):591-597(1985))をIGF1Rの細胞内、触媒性チロシンキナーゼドメインと融合させた構築物を作製した（図1）。この融合蛋白は、IGFリガンドがIGF1Rの二量体化とその後の自己燐酸化を惹起する必要性を軽減する。その代わりにこの融合蛋白のCD8部分は、リガンド非依存的に二量体化し、その結果チロシンキナーゼの構成的活性化をもたらす（図1B）。構成的活性化とは、CD8ドメインによって促される該融合蛋白の二量体化を意味し、これが、細胞内シグナル変換に必要な性質である、キナーゼドメインの自己燐酸化をもたらす。
作製したヒトCD8:IGF1R融合遺伝子を、これがマウス乳癌ウイルス（MMTV）プロモーターの下流にあり、且つ有効なメッセージのプロセシングのためにポリA配列とイントロンに隣接するように、ベクター中にクローニングした。このMMTVプロモーターは、動物においてインビボで発現されるとき、マウスの乳腺および唾液腺で下流配列の転写を促す。当業者は、本発明に係るトランスジーンを、非ヒト哺乳動物の皮膚に腫瘍を発現させる他のプロモーターの調節下でベクター中にクローニングすることができるであろう。例えば、ヒトCD8:IGF1RトランスジーンをK14プロモーターの調節下でベクターにクローニングして同様の結果を得た。
図2は、MMTV-CD8:IGF1Rトランスジーン構築物の模式的表示を示す。このトランスジーン構築物の配列を配列番号1に示し、この構築物のプラスミドを2003年1月10日、American Type Culture Collection（「ATCC」）、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209に寄託し、ATCC Deposit Designation PTA-4930が付与された。本明細書で言及する寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の約定の下に維持される。これらの寄託は当業者の便宜上提供されるに過ぎず、寄託が米国特許法§112の下で必要であるとの容認ではない。寄託された材料に含まれるポリヌクレオチドの配列、およびそれによりコードされているポリペプチドのアミノ酸配列を、引用により本明細書の一部とし、本明細書に記載の配列の何らかの説明と矛盾する場合にそれらを照合する。寄託された材料の製造、使用または販売にはライセンスを要する場合があり、かかるライセンスはここで許諾されていない。
受精卵母細胞の前核中に配列番号1で示されるMMTV-CD8:IGF1R構築物をマイクロインジェクションすると、トランスジーン（CD8:IGF1R）DNAを持つ8匹の創始者マウスの作製が導かれる。これら8匹のマウスのうち、6匹を繁殖させて子孫を作り、5匹がメンデルの法則に従って子孫にトランスジーンを受け渡していることが判明した。これら5つの系統に由来するマウスを、唾液腺組織におけるトランスジーンの発現について引き続き調査した。図3に見られるように、MCI-19と同定された一つのトランスジェニックマウス系統は、唾液腺に極めて高いレベルのトランスジーン発現があった。その後、MCI-15と同定された別のトランスジェニックマウス系統もまた、高レベルの唾液腺発現があることが示された（データは示していない）。二つのトランスジェニックマウス系統は唾液腺および乳腺の腫瘍を発現し（系統MCI-15およびMCI-19）、これらをさらなる研究用に取っておいた。トランスジーンの発現を示さなかった非トランスジェニックマウス由来の組織に比較して、唾液腺および乳腺腫瘍由来の腫瘍もまた高レベルのトランスジーン発現を示し、異種移植された腫瘍およびセルラインもまた同様であった（図4）。
各トランスジェニック系統由来の雄性および雌性マウスの両者が腫瘍を発現した。雌性マウスは約90日齢で唾液腺に腫瘍を発現し始めたが、離乳直後に腺の拡大が明白である。いったん腫瘍が完全に発現すると、それらは迅速に成長し、その結果、しばしば腫瘍の初回観察時の数週間以内にマウスを安楽死させることとなる。しかしながら乳房腫瘍の発現はより潜在性であり、しばしば動物が約150日齢またはそれ以上になるまで出現しない。乳房組織の腫瘍はしばしば多巣性であり、明らかな場所の偏倚を伴わずに腺の複数領域に同時に出現する（図5A（乳房）および5B（唾液腺))。雄性マウスでは、唾液腺は雌と同じ頻度で発現し、同じ時間枠内である。乳腺腫瘍は数匹の雄性マウスにも観察されたが、雌に比べて発生数は低下していた。興味深いことに、唾液腺腫瘍の肺への転移は雌雄両方のマウスで観察された（図6）。唾液腺の腫瘍の成長速度は迅速であるため、実質的な転移を発現させるに充分長くその動物を生存させるために、罹患した腺の外科的除去がしばしば必要となる。
トランスジーンのオンコジーン活性と腫瘍形成の因果関係を立証する過程において、IGF1Rキナーゼの活性を幾つかの試料で評価した（図7）。融合蛋白のCD8部分に対する抗体を用いて、CD8:IGF1R蛋白を、以下の実施例に記載のように、組織試料、腫瘍、およびセルラインの溶解液から免疫沈降させた。ポリアクリルアミドゲル上でのこの免疫沈降物の分離およびこれに続く抗ホスホチロシン抗体によるイムノブロッティングは、これらの試料中のCD8:IGF1R融合蛋白の活性化レベルの観察を可能にした。図7に示すように、両トランスジェニック系統MCI-15およびMCI-19、異種移植腫瘍、およびIGF1R-Salセルライン由来の腫瘍試料にはIGF1Rチロシンキナーゼの著明な燐酸化があるが、対照、即ち非トランスジェニックマウス由来の組織にはこれが無い。
トランスジェニックマウスで観察されたこれらの病変の潜在的腫瘍形成力を決定するため、MCIマウスの唾液腺および乳腺両者からの腫瘍をヌード（nu/nu）マウスに移した。両方の腫瘍型由来のフラグメントは、ヌードマウスの腹側に皮下移植すると、数週間以内に成長した。MCI-15由来の乳腺腫瘍およびMCI-19由来の唾液腺腫瘍は異種移植片として成長した（図8Aおよび8B）。図9は、ヌードマウスに皮下移植したトランスジェニック系統MCI-19由来のIGF1R-Sal腫瘍の、移植後の様々な時点での代表的インビボ成長を示している。初期の継代において、腫瘍は徐々に且つ一定でなく成長し、ほぼ20%が成長を示さなかった。継代を重ねると共に、腫瘍の成長速度は改善され、マウスからマウスへの3回目の連続移行までには腫瘍の獲得率は100%となった（継代3）。図10は、ヌードマウスに皮下移植したトランスジェニック系統MCI-15由来のIGF1R-Mam腫瘍の、移植後の様々な時点での代表的インビボ成長を示している。初回継代（p0、トランスジェニックマウス宿主からヌードマウスへ）の成長は遅く、かなりのパーセンテージが獲得無し（33%）と評価された。その後の継代では、成長と獲得率の両方が改善した。
ヌードマウス中で成長したIGF1R-Sal腫瘍からインビトロセルラインを樹立した。腫瘍の異種移植片から単離し、種々の細胞外マトリックスで被覆した組織培養皿に蒔いた腫瘍細胞は、極めて様々な挙動および成長をした。コラーゲンIおよびIV、フィブロセクチンおよびラミニンは全て線維芽細胞の成長を促進および増強するように見受けられた。ポリ-D-リジンで被覆した皿は、IGF1R-Sal細胞にとって最適条件を提供することが判明した。この条件で、指数関数的に成長する連続的IGF1R-Salセルラインを樹立した（図11Aおよび11B）。以下の細胞培養条件を使用した：10%牛胎児血清および25mM HEPESを添加した完全RPMI 1640培地。
本発明において作製されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物、異種移植した腫瘍、およびそこから樹立したセルラインは、有用な癌治療の性質を開発および最適化するための薬物評価の反復サイクルのための有用な手段を提供する。
以下の実施例に記載の具体的態様では、このように作製されたトランスジェニックマウスは、腫瘍形成におけるIGF1Rの役割および腫瘍形成に影響を及ぼすモデュレーターの同定と開発を特に研究するための優れたモデルである。本発明の特別の態様では、以下に例示するように、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作り上げる。この特別の態様では、トランスジーンの発現が、対応リガンドの発現およびリガンド結合の必要無しに構成的活性化IGF1Rを導く。このモデルは、これらのマウスに作り出された腫瘍がIGF1Rに特異的であるという点で特に有用である。本明細書に記載のマウスに作製された腫瘍は、それらがそこから作製されたキナーゼドメインのモデュレーター、より具体的にはインヒビターに対して極めて感受性である一方で、他のチロシンキナーゼレセプターのモデュレーターに対しては、限定された感受性を持っている。例えば培養において、CD8:IGF1R融合トランスジェニック由来の腫瘍細胞から誘導したセルラインは、IGF1Rのインヒビターに対して感受性であるが、EGFRに特異的なインヒビターに対してははるかに感受性が低い（データは示していない）。本明細書に記載の発明を使用することにより、特定のチロシンキナーゼレセプターに特異的であり、よって選択的チロシンキナーゼレセプターインヒビターの同定および開発を可能にするモデルが開発できる。
したがって本発明に係るトランスジェニック動物は、癌腫、特にチロシンキナーゼレセプターの発現を特徴とする癌腫の処置のための薬物療法の開発にとりわけ有用である。本発明の好ましい態様では、このトランスジェニック動物は、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの選択的モデュレーターの同定に有用である。特に好ましい態様では、本発明に係るトランスジェニック動物は、IGF1Rが過剰発現または活性化する癌腫のための医薬および治療の開発に有用である。このような癌腫は、乳癌、結腸癌、前立腺癌、および肺癌を包含するがこれらに限定される訳ではない。
さらに本発明は、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに起因する癌腫の処置に使用する、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの選択的モデュレーターを求めてスクリーニングする方法を提供する。トランスジェニックマウスを用いるモデュレーターのスクリーニング方法は当分野で一般に知られている。例えば、Omer et al., Cancer Research 60, 2680-2688, May 15, 2000を参照されたい。或る態様では、選択的モデュレーターを求めてスクリーニングする本発明方法は以下の工程を含む。トランスジェニックマウスから誘導した腫瘍を切除し、ヌードマウスに移植する。腫瘍が100ないし200mm3の大きさに達したならば、被験物質または所望の細胞力価および薬動力学的性質を示した化合物の評価のため、マウスを処置群に無作為化する。化合物は40%PEG400/0.1%Tween80のような媒質中に調合し、1日に1または2回の経口栄養によって投与する。媒質のみまたは異なる用量の化合物で処置した動物の腫瘍体積を週に2回測定する。腫瘍成長の阻害を、%T/C［式中、TおよびCはそれぞれ化合物で処置した動物および媒質のみで処置した対照動物の腫瘍体積である］として算出する。最大耐性用量よりも１用量を超えて少ない用量で50%以下の%T/Cを示した化合物は、有効であると考える。
さらに本発明は、本発明に従って或る系統の1またはそれ以上の哺乳動物を遺伝的に改変し、それらのゲノムの各々に少なくとも1個のトランスジーン［ここでこのトランスジーンは、発現されると、好ましくは唾液腺および乳腺にある特定のチロシンキナーゼレセプターを構成的に活性化する］を持つトランスジェニック哺乳動物を取得することにより、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの発現を伴う形質を、その非ヒト哺乳動物の系統または品種に付与するのに役立つ。次いで本明細書に記載のように、所産であるトランスジェニック哺乳動物を遺伝子型決定に基づいて選択する。
ここに本発明を一般的に記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照することで、より容易に理解できる。これら実施例は例示のために提供するものであって、本発明を限定する意図はない。本明細書に引用した参考文献および公開されている文書の全文は、詳細に開示してあるかのように、引用により本明細書の一部とする。
実施例
実施例1 - CD8:IGF1Rトランスジーン構築物
図2および配列番号1に示すMMTV-CD8:IGF1R（MCI）構築物を、標準的分子生物学技術、例えばAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Volume 2(1991)を用いて作製した。配列番号2のヌクレオチド配列を含み、ヒトCD8遺伝子のアミノ酸残基1-218（配列番号3）をコードしているHindIII/BamHIフラグメントを、pcDNA3.1(+)（Invitrogen(登録商標）Corporation, Carlsbad, California）のHindIII/BamHI部位にクローニングした。IGF1Rの完全長ヒトcDNAをR. Baserga（Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA), Morrione et al., J. Virology, 69:5300-5303(1995)から取得した。標準的制限酵素技術を用いて細胞質触媒ドメインを得、その後、配列番号4のヌクレオチド配列を含み配列番号5のアミノ酸配列をコードしているIGF1RのBamHIフラグメントとして、CD8フラグメントを含むベクターのこの部位に挿入した。配列番号6のヌクレオチド配列を含み配列番号7のアミノ酸配列をコードしているCD8:IGF1R融合配列の向きと完全性を制限分析によって検出し、配列決定によって確認した。次いでトランスジーン構築物を作製するために、CD8:IGF1R融合遺伝子を、Mueller et al., Cell: 54, 105-115(1988)に記載のMMTVベクターにサブクローニングし、図2および配列番号1の構築物を得た。この構築物の向きと完全性を配列決定によって確認した。
実施例1 - CD8:IGF1Rトランスジーン構築物
図2および配列番号1に示すMMTV-CD8:IGF1R（MCI）構築物を、標準的分子生物学技術、例えばAusubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Volume 2(1991)を用いて作製した。配列番号2のヌクレオチド配列を含み、ヒトCD8遺伝子のアミノ酸残基1-218（配列番号3）をコードしているHindIII/BamHIフラグメントを、pcDNA3.1(+)（Invitrogen(登録商標）Corporation, Carlsbad, California）のHindIII/BamHI部位にクローニングした。IGF1Rの完全長ヒトcDNAをR. Baserga（Thomas Jefferson University, Philadelphia, PA), Morrione et al., J. Virology, 69:5300-5303(1995)から取得した。標準的制限酵素技術を用いて細胞質触媒ドメインを得、その後、配列番号4のヌクレオチド配列を含み配列番号5のアミノ酸配列をコードしているIGF1RのBamHIフラグメントとして、CD8フラグメントを含むベクターのこの部位に挿入した。配列番号6のヌクレオチド配列を含み配列番号7のアミノ酸配列をコードしているCD8:IGF1R融合配列の向きと完全性を制限分析によって検出し、配列決定によって確認した。次いでトランスジーン構築物を作製するために、CD8:IGF1R融合遺伝子を、Mueller et al., Cell: 54, 105-115(1988)に記載のMMTVベクターにサブクローニングし、図2および配列番号1の構築物を得た。この構築物の向きと完全性を配列決定によって確認した。
実施例2 - トランスジェニックマウスの作製と繁殖
上記構築物由来のPVUIIフラグメントをC57BI/6XDBA2 F2（B6D2F2）胚の前核中にマイクロインジェクションすることにより、MMTV-CD8:IGF1R構築物（MCI）を有するトランスジェニックマウスを作製した。Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual, second edition, Brigid Hogan, Rosa Beddington, Frank Constantini, and Elizabeth Lacey, eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)に記載の技術を用いて、ハイブリッド種畜B6D2雄を同じバックグラウンド（Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana）由来の処女雌と集団内交配して、胚を作製した。注入された胚を偽妊娠ICR雌性マウス（Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana）に移し、分娩まで進行させた。5ないし8日齢の時、足指および尾の試料をトランスジーンのDNA分析用に採取した。融合物のCD8部分のためにオリゴ5'AGGGTGTGGTGAAAGATGAAC3'（配列番号8）を、そして融合物のIGF1R部分のために5'CGTCCGAGTAAGTGGTGAAGA3'（配列番号9）を用いることにより、CD8:IGF1R融合物を検出するよう設計したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）戦略でトランスジーンを有するマウスを同定した。次に、トランスジーンを有することが示された創始者マウス（F0）をICRバックグラウンドと異系交配し、メンデルの法則でこのトランスジーンが伝達されているかどうかについて子孫（F1）を再度検査した。マウスは、唾液腺または乳腺のいずれかに腫瘍があるかどうかを1日に2回観察し、病変が最初に観察された日付を記録した。腫瘍が約1000mgに成長した時、または病変が運動または摂食を損なうようになった時、動物を安楽死させた。全てのマウスは12/12明暗サイクルの靴箱様飼育箱に収容し、食物と水を自由に与え、AAALAC公認施設において、施設ACUCの指針の下で人道的に取り扱った。
上記構築物由来のPVUIIフラグメントをC57BI/6XDBA2 F2（B6D2F2）胚の前核中にマイクロインジェクションすることにより、MMTV-CD8:IGF1R構築物（MCI）を有するトランスジェニックマウスを作製した。Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual, second edition, Brigid Hogan, Rosa Beddington, Frank Constantini, and Elizabeth Lacey, eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)に記載の技術を用いて、ハイブリッド種畜B6D2雄を同じバックグラウンド（Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana）由来の処女雌と集団内交配して、胚を作製した。注入された胚を偽妊娠ICR雌性マウス（Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, Indiana）に移し、分娩まで進行させた。5ないし8日齢の時、足指および尾の試料をトランスジーンのDNA分析用に採取した。融合物のCD8部分のためにオリゴ5'AGGGTGTGGTGAAAGATGAAC3'（配列番号8）を、そして融合物のIGF1R部分のために5'CGTCCGAGTAAGTGGTGAAGA3'（配列番号9）を用いることにより、CD8:IGF1R融合物を検出するよう設計したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）戦略でトランスジーンを有するマウスを同定した。次に、トランスジーンを有することが示された創始者マウス（F0）をICRバックグラウンドと異系交配し、メンデルの法則でこのトランスジーンが伝達されているかどうかについて子孫（F1）を再度検査した。マウスは、唾液腺または乳腺のいずれかに腫瘍があるかどうかを1日に2回観察し、病変が最初に観察された日付を記録した。腫瘍が約1000mgに成長した時、または病変が運動または摂食を損なうようになった時、動物を安楽死させた。全てのマウスは12/12明暗サイクルの靴箱様飼育箱に収容し、食物と水を自由に与え、AAALAC公認施設において、施設ACUCの指針の下で人道的に取り扱った。
実施例3 - 遺伝子発現分析
ノーザンブロット分析によってCD8:IGF1Rトランスジーン発現の検出を実施した。トランスジーンの発現があったトランスジェニック系統を同定するため、創始者のF1子孫を安楽死させ、唾液腺を収穫した。さらに、2つの系統のマウス由来の腫瘍、ならびに異種移植片およびセルライン試料で発現を分析した。組織については、試料を液体窒素で瞬時凍結し、mRNA単離の時まで保存した。フェノールおよびグアニジンイソチオシアナートの単相溶液、例えばTrizol(登録商標）LS試薬系を用いて、製造者（GIBCO(登録商標）Invitrogen Corporation, Carlsbad, California）が記載するように総RNAを単離した。これらのRNA単離物から、製造者（Operon/QIAGEN, Valencia, California）の推奨に従いOligotex Direct mRNAキットを用いてmRNAを抽出した。セルラインについては、細胞をTrizol(登録商標）溶解緩衝液中で直接溶解し、必要時まで-80℃で保存した。17.6%ホルムアルデヒドによる変性条件下、1.0%アガロースゲル電気泳動でmRNAを分離し、ハイブリダイゼーション前にキャピラリーブロッティングによってナイロン膜（Hybond-N, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）に移した。このRNAを、IGF1Rチロシンキナーゼドメインをコードしている構築物の3'末端から誘導した放射標識プローブ（Ready-to-Goキット、New England Nuclear/Perkin Elmer(登録商標）Life Sciences, Boston, Massachusetts）とハイブリダイズさせることにより、CD8:IGF1Rメッセージを検出した。Rapid-hyb緩衝液（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）中で一夜ハイブリダイゼーションを行い、緊縮条件（0.1xSSC中2x20分間、2%SDS、65℃）下で複数回洗浄することにより、プローブの非特異的アニーリングを排除した。このブロットをフィルム（X-OMAT, Kodak Company, Rochester, NY）に一夜暴露することにより、CD8:IGF1Rメッセージに対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションを検出した。
ノーザンブロット分析によってCD8:IGF1Rトランスジーン発現の検出を実施した。トランスジーンの発現があったトランスジェニック系統を同定するため、創始者のF1子孫を安楽死させ、唾液腺を収穫した。さらに、2つの系統のマウス由来の腫瘍、ならびに異種移植片およびセルライン試料で発現を分析した。組織については、試料を液体窒素で瞬時凍結し、mRNA単離の時まで保存した。フェノールおよびグアニジンイソチオシアナートの単相溶液、例えばTrizol(登録商標）LS試薬系を用いて、製造者（GIBCO(登録商標）Invitrogen Corporation, Carlsbad, California）が記載するように総RNAを単離した。これらのRNA単離物から、製造者（Operon/QIAGEN, Valencia, California）の推奨に従いOligotex Direct mRNAキットを用いてmRNAを抽出した。セルラインについては、細胞をTrizol(登録商標）溶解緩衝液中で直接溶解し、必要時まで-80℃で保存した。17.6%ホルムアルデヒドによる変性条件下、1.0%アガロースゲル電気泳動でmRNAを分離し、ハイブリダイゼーション前にキャピラリーブロッティングによってナイロン膜（Hybond-N, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）に移した。このRNAを、IGF1Rチロシンキナーゼドメインをコードしている構築物の3'末端から誘導した放射標識プローブ（Ready-to-Goキット、New England Nuclear/Perkin Elmer(登録商標）Life Sciences, Boston, Massachusetts）とハイブリダイズさせることにより、CD8:IGF1Rメッセージを検出した。Rapid-hyb緩衝液（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）中で一夜ハイブリダイゼーションを行い、緊縮条件（0.1xSSC中2x20分間、2%SDS、65℃）下で複数回洗浄することにより、プローブの非特異的アニーリングを排除した。このブロットをフィルム（X-OMAT, Kodak Company, Rochester, NY）に一夜暴露することにより、CD8:IGF1Rメッセージに対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションを検出した。
実施例4 - キナーゼ活性分析
トランスジーン構築物から発現されたメッセージが構成的に活性なIGF1Rキナーゼドメインを生成したことを保証するため、幾つかの供給源から得た蛋白をIGF1R特異活性について分析した。分析した試料は、ノーザンブロット分析について記載したものと同じ組織由来のものであった。組織をTriton、Tris、およびグリセロール（TTG）溶解緩衝液（1% Triton X-100、5%グリセロール、0.15M NaCl、20mM Tris-HCl、pH7.6、1mM EDTA、1mMバナジウム酸ナトリウム、40μMモリブデン酸アンモニウム）中、4℃でホモジナイズした。マイクロBCA検定を用いて蛋白を定量した；総組織溶解液またはIGF1R-Sal細胞3mgを、CD8に対する抗体（図4および7のレーンc、d、f、g、h、iおよびj）またはIGF-1レセプターに対する抗体（図4および7のレーンa、bおよびe）で免疫沈降させた。蛋白を10%ポリアクリルアミドゲル上で分離し、抗ホスホチロシン抗体（抗pTyr）を用いるウェスタンブロット分析に付した。その後フィルターを剥がし、平等な蛋白ローディングを保証するためIGF-1レセプターに対する抗体（抗IGF1R）で再プロービングした。
トランスジーン構築物から発現されたメッセージが構成的に活性なIGF1Rキナーゼドメインを生成したことを保証するため、幾つかの供給源から得た蛋白をIGF1R特異活性について分析した。分析した試料は、ノーザンブロット分析について記載したものと同じ組織由来のものであった。組織をTriton、Tris、およびグリセロール（TTG）溶解緩衝液（1% Triton X-100、5%グリセロール、0.15M NaCl、20mM Tris-HCl、pH7.6、1mM EDTA、1mMバナジウム酸ナトリウム、40μMモリブデン酸アンモニウム）中、4℃でホモジナイズした。マイクロBCA検定を用いて蛋白を定量した；総組織溶解液またはIGF1R-Sal細胞3mgを、CD8に対する抗体（図4および7のレーンc、d、f、g、h、iおよびj）またはIGF-1レセプターに対する抗体（図4および7のレーンa、bおよびe）で免疫沈降させた。蛋白を10%ポリアクリルアミドゲル上で分離し、抗ホスホチロシン抗体（抗pTyr）を用いるウェスタンブロット分析に付した。その後フィルターを剥がし、平等な蛋白ローディングを保証するためIGF-1レセプターに対する抗体（抗IGF1R）で再プロービングした。
実施例5 - 異種移植片およびセルラインの樹立
異種移植片およびこの異種移植片から誘導したセルラインの樹立を、当業者に既知のプロトコル、例えばBerger et al., Immunodeficient Mice in Oncology, Contrib. Oncol. Basel, Fiebig, H.H. and Berger, D.P.(eds), Vol.42, 321-351, Karger(1992)に記載のプロトコルを用いて実施した。自然発生的腫瘍を持つドナートランスジェニックMCI-19マウスから取得した腫瘍フラグメント（およそ20mg）を、各ヌードマウスに皮下移植した。移植は、マウスの腹側、乳腺付近に13ゲージのトロカールを皮下挿入して達成した。ヌード（nu/nu）マウスはHarlan Sprague Dawley Co.(Indianapolis, Indiana）から取得し、無アンモニア環境中、病原体の無い限定されたコロニーに維持した。腫瘍の成長を、その腫瘍が前もって定めた「目標」サイズ1gmに達するまで、カリパスで週に1または2回腫瘍を測定することによって決定した。腫瘍重量（mg）を、式：腫瘍重量 = (長さx幅2) ÷ 2を用いて推定した。ヌードマウス中で成長した異種移植片IGF1R-Sal（MCI-19異種移植片腫瘍）を切除して鋏で切り刻み、0.025%コラゲナーゼ（Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri）、0.05%プロナーゼ（Calbiochem, LaJolla, California）および0.04% DNアーゼ（Sigma）より成る酵素カクテルを用いて37℃で1時間解離させた。この細胞懸濁液を70μmナイロンスクリーンを通過させて残屑を除去した後、燐酸緩衝化生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、計数し、10%熱不活性化牛胎児血清（GIBCO(登録商標) Invitrogen Corporation, Carlsbad, California）を添加した完全RPMI(登録商標)(GIBCO(登録商標) Invitrogen Corporation, Carlsbad, California）1640培地に再懸濁した。次に細胞（3x10E+5）を、以下の細胞外マトリックス：コラーゲンI、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIV、ポリ-D-リジン、で別々に被覆した種々のBiocoat Cellware(登録商標)(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey）上に蒔いた。
異種移植片およびこの異種移植片から誘導したセルラインの樹立を、当業者に既知のプロトコル、例えばBerger et al., Immunodeficient Mice in Oncology, Contrib. Oncol. Basel, Fiebig, H.H. and Berger, D.P.(eds), Vol.42, 321-351, Karger(1992)に記載のプロトコルを用いて実施した。自然発生的腫瘍を持つドナートランスジェニックMCI-19マウスから取得した腫瘍フラグメント（およそ20mg）を、各ヌードマウスに皮下移植した。移植は、マウスの腹側、乳腺付近に13ゲージのトロカールを皮下挿入して達成した。ヌード（nu/nu）マウスはHarlan Sprague Dawley Co.(Indianapolis, Indiana）から取得し、無アンモニア環境中、病原体の無い限定されたコロニーに維持した。腫瘍の成長を、その腫瘍が前もって定めた「目標」サイズ1gmに達するまで、カリパスで週に1または2回腫瘍を測定することによって決定した。腫瘍重量（mg）を、式：腫瘍重量 = (長さx幅2) ÷ 2を用いて推定した。ヌードマウス中で成長した異種移植片IGF1R-Sal（MCI-19異種移植片腫瘍）を切除して鋏で切り刻み、0.025%コラゲナーゼ（Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri）、0.05%プロナーゼ（Calbiochem, LaJolla, California）および0.04% DNアーゼ（Sigma）より成る酵素カクテルを用いて37℃で1時間解離させた。この細胞懸濁液を70μmナイロンスクリーンを通過させて残屑を除去した後、燐酸緩衝化生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄し、計数し、10%熱不活性化牛胎児血清（GIBCO(登録商標) Invitrogen Corporation, Carlsbad, California）を添加した完全RPMI(登録商標)(GIBCO(登録商標) Invitrogen Corporation, Carlsbad, California）1640培地に再懸濁した。次に細胞（3x10E+5）を、以下の細胞外マトリックス：コラーゲンI、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンIV、ポリ-D-リジン、で別々に被覆した種々のBiocoat Cellware(登録商標)(Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey）上に蒔いた。
実施例6 - CD8:Her2トランスジーンを持つトランスジェニックマウスの作製
上の実施例に記載したものと同じアプローチを用いて、ヒトCD8膜貫通および細胞外ドメインとHer2/erbB2遺伝子の細胞内キナーゼドメインの融合物をコードしているトランスジーンを有する動物をも作製した（配列番号10のヌクレオチド配列を含み配列番号11のアミノ酸をコードしている融合配列)(プラスミド57584および59296をATCCから取得し、合してヒトHer2の完全長クローンを作製し（GenBank No. M11730）；次いでヒトCD8との融合構築物の形成に使用した）。CD8:IGF1Rトランスジーンと同様にCD8:Her2融合蛋白がMMTVプロモーターの調節下で発現される。したがってこの構築物は、細胞内キナーゼドメインの相違を除いてCD8:IGF1Rトランスジーンのものと同一である。この構築物は当業者に既知の分子生物学技術を用いて作製したが、そこでは、CD8遺伝子のアミノ酸1-218（配列番号13）をコードしている配列番号12のヌクレオチド配列を含むフラグメントを、XhoI部位およびコネクター（配列番号16）を介して、配列番号15で示されるC末端570アミノ酸Her2キナーゼドメインをコードしている配列番号14のヌクレオチド配列を含むフラグメントにフレーム内クローニングした。この組換え蛋白の転写融合物をMMTVプロモーターの下流にクローニングした最終構築物を、CD8:IGF1Rのマウスの作製に関して本明細書で述べたように取り扱った。このCD8:Her2マウス（Her2マウス）は、CD8:IGF1Rマウスおよびラットneu遺伝子に対する突然変異（Mueller et al., Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene, Cell: 54, 105-115(1988))によって作製したものと同様、乳腺および唾液腺腫瘍を発現した。CD8:IGF1Rマウス（MCI-15およびMCI-19）と同様に、キナーゼインヒビターを構成的活性化Her2チロシンキナーゼレセプターに対する特異性について試験するために、乳腺および唾液腺腫瘍を異種移植片および細胞培養で樹立した。
上の実施例に記載したものと同じアプローチを用いて、ヒトCD8膜貫通および細胞外ドメインとHer2/erbB2遺伝子の細胞内キナーゼドメインの融合物をコードしているトランスジーンを有する動物をも作製した（配列番号10のヌクレオチド配列を含み配列番号11のアミノ酸をコードしている融合配列)(プラスミド57584および59296をATCCから取得し、合してヒトHer2の完全長クローンを作製し（GenBank No. M11730）；次いでヒトCD8との融合構築物の形成に使用した）。CD8:IGF1Rトランスジーンと同様にCD8:Her2融合蛋白がMMTVプロモーターの調節下で発現される。したがってこの構築物は、細胞内キナーゼドメインの相違を除いてCD8:IGF1Rトランスジーンのものと同一である。この構築物は当業者に既知の分子生物学技術を用いて作製したが、そこでは、CD8遺伝子のアミノ酸1-218（配列番号13）をコードしている配列番号12のヌクレオチド配列を含むフラグメントを、XhoI部位およびコネクター（配列番号16）を介して、配列番号15で示されるC末端570アミノ酸Her2キナーゼドメインをコードしている配列番号14のヌクレオチド配列を含むフラグメントにフレーム内クローニングした。この組換え蛋白の転写融合物をMMTVプロモーターの下流にクローニングした最終構築物を、CD8:IGF1Rのマウスの作製に関して本明細書で述べたように取り扱った。このCD8:Her2マウス（Her2マウス）は、CD8:IGF1Rマウスおよびラットneu遺伝子に対する突然変異（Mueller et al., Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene, Cell: 54, 105-115(1988))によって作製したものと同様、乳腺および唾液腺腫瘍を発現した。CD8:IGF1Rマウス（MCI-15およびMCI-19）と同様に、キナーゼインヒビターを構成的活性化Her2チロシンキナーゼレセプターに対する特異性について試験するために、乳腺および唾液腺腫瘍を異種移植片および細胞培養で樹立した。
実施例7 - CD8:Metトランスジーンを持つトランスジェニックマウスの作製
上の実施例に記載したものと同じアプローチを用いて、CD8膜貫通および細胞外ドメインとcMet遺伝子の細胞内キナーゼドメインの融合物をコードしているトランスジーンを有する動物をも作製した（配列番号18のアミノ酸をコードしている配列番号17のヌクレオチド配列を含む融合配列)。CD8:IGF1Rトランスジーンと同様にCD8:Met融合蛋白がMMTVプロモーターの調節下で発現される。したがってこの構築物は、細胞内キナーゼドメインの相違を除いてCD8:IGF1Rトランスジーンのものと同一である。この構築物は当業者に既知の分子生物学技術を用いて作製したが、そこでは、CD8遺伝子のアミノ酸1-218（配列番号20）をコードしている配列番号19のヌクレオチド配列を含むフラグメントを、BamHI部位およびコネクター（配列番号23）を介して、配列番号22で示されるC末端425アミノ酸cMetキナーゼドメインをコードしている配列番号21のヌクレオチド配列を含むフラグメントにフレーム内クローニングした（ヒトMet構築物はG. Van der Woude, P.N.A.S. U.S.A., 84:6379-6383(1987)の好意により得られた）。この組換え蛋白の転写融合物をMMTVプロモーターの下流にクローニングした最終構築物を、CD8:IGF1Rのマウスの作製に関して本明細書で述べたように取り扱った。このCD8:Metマウス（MCMマウス。Mmtv/Cd8/Metであることから）は、本明細書に記載のCD8:IGF1Rマウスと同様、乳腺および唾液腺腫瘍を発現した。CD8:IGF1Rマウス（MCI-15およびMCI-19）と同様に、キナーゼインヒビターを構成的活性化cMetチロシンキナーゼレセプターに対する特異性について試験するために、乳腺および唾液腺腫瘍を異種移植片および細胞培養で樹立した。
上の実施例に記載したものと同じアプローチを用いて、CD8膜貫通および細胞外ドメインとcMet遺伝子の細胞内キナーゼドメインの融合物をコードしているトランスジーンを有する動物をも作製した（配列番号18のアミノ酸をコードしている配列番号17のヌクレオチド配列を含む融合配列)。CD8:IGF1Rトランスジーンと同様にCD8:Met融合蛋白がMMTVプロモーターの調節下で発現される。したがってこの構築物は、細胞内キナーゼドメインの相違を除いてCD8:IGF1Rトランスジーンのものと同一である。この構築物は当業者に既知の分子生物学技術を用いて作製したが、そこでは、CD8遺伝子のアミノ酸1-218（配列番号20）をコードしている配列番号19のヌクレオチド配列を含むフラグメントを、BamHI部位およびコネクター（配列番号23）を介して、配列番号22で示されるC末端425アミノ酸cMetキナーゼドメインをコードしている配列番号21のヌクレオチド配列を含むフラグメントにフレーム内クローニングした（ヒトMet構築物はG. Van der Woude, P.N.A.S. U.S.A., 84:6379-6383(1987)の好意により得られた）。この組換え蛋白の転写融合物をMMTVプロモーターの下流にクローニングした最終構築物を、CD8:IGF1Rのマウスの作製に関して本明細書で述べたように取り扱った。このCD8:Metマウス（MCMマウス。Mmtv/Cd8/Metであることから）は、本明細書に記載のCD8:IGF1Rマウスと同様、乳腺および唾液腺腫瘍を発現した。CD8:IGF1Rマウス（MCI-15およびMCI-19）と同様に、キナーゼインヒビターを構成的活性化cMetチロシンキナーゼレセプターに対する特異性について試験するために、乳腺および唾液腺腫瘍を異種移植片および細胞培養で樹立した。
実施例8 - IGF1Rインヒビターの評価
細胞における二つのIGF1Rインヒビターの増殖活性を、ヒトIGF1Rの触媒ドメインを過剰発現するよう作り上げたトランスジェニックマウスIGF1R Sal（CD8-IGF1R）で作製した異種移植片腫瘍から誘導したセルラインに対してインビトロ評価した。評価した二つのIGF1Rインヒビターとは、WO02/079192および米国特許出願第10/263448号に記載のベンズイミダゾール化合物（引用により本明細書の一部とする）およびパクリタキセルであった。細胞増殖の阻害もまた、Colo205（結腸）、Geo（結腸）、RD1（横紋筋肉腫）、H3396（乳房）、およびMDA PCa2b（前立腺）を包含する種々のヒト腫瘍異種移植片セルラインで判定した。試薬に72時間暴露した後、DNA中への[3H]-チミジンの取り込みによって増殖を評価した。細胞を96ウェル微量定量プレートに1500細胞/ウェルで蒔き、24時間後に細胞を一定範囲の薬物濃度に暴露した。37℃で72時間インキュベートした後、細胞を4μCi/ml[6-3H]チミジン（Amersham Pharmacia Biotech, UK）で3時間パルスし、トリプシン処理し、UniFilter-96、GF/Bプレート（PerkinElmer, Boston, Massachusetts）上に収穫し、TopCount.NXT（Packard, Connecticut）でシンチレーションを測定した。結果を、非処置対照細胞に比して細胞増殖を50%阻害するのに必要な薬物濃度であるIC50で表す。この検定で評価した化合物のIC50値を表Iに示す。
細胞における二つのIGF1Rインヒビターの増殖活性を、ヒトIGF1Rの触媒ドメインを過剰発現するよう作り上げたトランスジェニックマウスIGF1R Sal（CD8-IGF1R）で作製した異種移植片腫瘍から誘導したセルラインに対してインビトロ評価した。評価した二つのIGF1Rインヒビターとは、WO02/079192および米国特許出願第10/263448号に記載のベンズイミダゾール化合物（引用により本明細書の一部とする）およびパクリタキセルであった。細胞増殖の阻害もまた、Colo205（結腸）、Geo（結腸）、RD1（横紋筋肉腫）、H3396（乳房）、およびMDA PCa2b（前立腺）を包含する種々のヒト腫瘍異種移植片セルラインで判定した。試薬に72時間暴露した後、DNA中への[3H]-チミジンの取り込みによって増殖を評価した。細胞を96ウェル微量定量プレートに1500細胞/ウェルで蒔き、24時間後に細胞を一定範囲の薬物濃度に暴露した。37℃で72時間インキュベートした後、細胞を4μCi/ml[6-3H]チミジン（Amersham Pharmacia Biotech, UK）で3時間パルスし、トリプシン処理し、UniFilter-96、GF/Bプレート（PerkinElmer, Boston, Massachusetts）上に収穫し、TopCount.NXT（Packard, Connecticut）でシンチレーションを測定した。結果を、非処置対照細胞に比して細胞増殖を50%阻害するのに必要な薬物濃度であるIC50で表す。この検定で評価した化合物のIC50値を表Iに示す。
【配列表】
Claims (13)
- その体細胞および生殖系統細胞が、構成的に活性化されたチロシンキナーゼレセプターの配列をコードしているトランスジーンを含むゲノムを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに特異的な腫瘍をより発現し易い非ヒト哺乳動物。
- トランスジーンが、マウスプロモーターと機能的に結合した構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの配列を含む、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- トランスジーンが、二量体化誘導部分をコードしている配列およびチロシンキナーゼレセプターの細胞内触媒キナーゼドメインを含む、請求項２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 二量体化誘導部分がCD8の細胞外および膜貫通ドメインをコードしている配列であり、そしてキナーゼドメインが、上皮成長因子レセプター（EGFR）、HER2、トランスフォーミング成長因子-α（TGF-α）、インスリンレセプター（IR）、インスリン様成長因子（IGFR）、血小板由来成長因子（PDGFR）、線維芽細胞成長因子（FGFR）、および肝細胞成長因子レセプター（Met）より成る群から選ばれる、請求項３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- プロモーターがMMTVである、請求項２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- キナーゼドメインがIGF1Rである、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 構成的活性化チロシンキナーゼレセプターのコード配列を含むゲノムDNAフラグメントを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物を繁殖させて、該ゲノムDNAフラグメントをそのゲノムが含む子孫非ヒト哺乳動物を生成することができる、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- そのゲノムがゲノムDNAフラグメントを含む標的マウスを取得する方法［ここで、該DNAフラグメントは構成的活性化チロシンキナーゼレセプターのコード配列を含み、該マウスは、これを繁殖させてその子孫のゲノムが該ゲノムDNAフラグメントを含むような子孫マウスを生成させることができる］であって、
(a) 第一の雌性マウスから受精卵を単離し；
(b) その受精卵に、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターのコード配列を含むゲノムDNAフラグメントを移し；
(c) そのゲノムDNAフラグメントを含む受精卵を、第二の偽妊娠雌性マウスの子宮に移し；ついで
(d) その第二の雌性マウスを、
(i) この第二の雌性マウスが、該ゲノムDNAフラグメントを含む該受精卵から誘導した胚で妊娠状態となり；
(ii) 該胚が該標的マウスへと発生し；および
(iii) 該標的マウスが第二雌性マウスから生きて誕生する、
ように維持する［ここで、該標的マウスのゲノムは該ゲノムDNAフラグメントを含み、そして、該マウスは、これを繁殖させてその子孫のゲノムが該ゲノムDNAフラグメントを含む子孫マウスを生成させることができる］、
という工程を含む方法。 - 構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに起因する癌腫の処置に使用するための、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターの選択的モデュレーターを求めてスクリーニングする方法であって、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、その癌腫における該被験物質の癌腫処置有効性を検定することを含む方法。
- 構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに起因する癌腫を処置するための医薬組成物であって、その癌腫における癌腫処置有効性を有する請求項９に記載の方法により決定された物質を含む医薬組成物。
- (a)請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物［ここでこのトランスジェニック非ヒト動物はマウスである］から腫瘍フラグメントを取得し；
(b) 該腫瘍フラグメントをレシピエントヌードマウスに皮下移植し；ついで
(c) 工程(b)由来のマウスを、該マウスおよび該腫瘍の成長を促進する条件下に維持する、
という工程を含む、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターに特異的な腫瘍を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法。 - (a) 請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物［ここでこのトランスジェニック非ヒト動物はマウスである］から腫瘍フラグメントを取得し；
(b) 該腫瘍試料から細胞を単離し；ついで
(c) 単離した細胞を、この単離した細胞の成長および生存性を維持するような条件下に置く、
という工程を含む、構成的活性化チロシンキナーゼレセプターを発現するトランスジェニックマウスセルラインを作製する方法。 - 請求項１２に記載の方法により取得した構成的活性化チロシンキナーゼレセプターを発現するトランスジェニックマウスセルライン。
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