ES2877275T3 - Animales con dipeptidil peptidasa IV (DPP4) humanizada - Google Patents
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Abstract
Un roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de un fragmento de un gen Dpp4 endógeno de roedor en un locus de Dpp4 endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde: dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano; el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana; la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor; el roedor es un ratón o una rata; y el roedor presenta inflamación pulmonar cuando se infecta con el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV).
Description
DESCRIPCIÓN
Animales con dipeptidil peptidasa IV (DPP4) humanizada
Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. núm. 62/005,476, presentada el 30 de mayo de 2014, la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. núm. 62/051,626, presentada el 17 de septiembre de 2014, y la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU núm. 62/072,692, presentada el 30 de octubre de 2014.
Campo de invención
Animales no humanos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína dipeptidil peptidasa IV (DPP4) que comprende una secuencia humana. Animales transgénicos no humanos que comprenden un gen DPP4 que es humano en su totalidad o en parte. Animales no humanos que expresan proteínas DPP4 humanas o humanizadas. Métodos para obtener y usar animales no humanos que comprenden secuencias de ácido nucleico de DPP4 humano o humanizado.
Antecedentes
La dipeptidil peptidasa IV (DPP4) es una diana terapéutica para el tratamiento de una variedad de enfermedades, trastornos y afecciones humanas, que incluyen, por ejemplo, la hiperglicemia (véase, por ejemplo, Gerich (2013) Pathogenesis and Management of Postpandrial Hyperglycemia: Role of Incretin-Based Therapies, Intl. J. Gen. Med.
6:877-895) y la infección por coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) (véase, por ejemplo, Raj y otros, (2013) Dipeptidyl Peptidase 4 is a Functional Receptor for the Emerging Human Coronovirus-EMC, Nature 495(7440):251-254).
La evaluación de la farmacocinética (PK) y la farmacodinámica (PD) de moléculas terapéuticas que se dirigen específicamente a la proteína DPP4 humana se realiza rutinariamente en animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas. Sin embargo, la PD de tales moléculas no puede determinarse adecuadamente en ciertos animales no humanos si estas moléculas terapéuticas tampoco se dirigen a la proteína Dpp4 endógena.
Además, la evaluación de la eficacia terapéutica in vivo de los antagonistas de moléculas pequeñas, péptidos o proteínas (es decir, compuestos biológicos) específicos de la DPP4 humana en modelos animales no humanos de enfermedades es problemática en ciertos animales no humanos en los que el antagonista específico de la especie no interactúa con la proteína Dpp4 endógena. Además, la evaluación de la eficacia terapéutica in vivo de antagonistas de moléculas pequeñas, péptidos o proteínas (es decir, compuestos biológicos) que se dirigen a moléculas que interactúan específicamente con la proteína DPP4 humana también es problemática en ciertos animales no humanos en los que la molécula terapéutica diana en sí misma no interactúa con la proteína Dpp4 endógena.
En consecuencia, existe la necesidad de animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas que comprenden un gen DPP4 humano o humanizado. Por ejemplo, existe la necesidad de animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, en los que el gen Dpp4 del animal no humano se humaniza en su totalidad o en parte o se reemplaza (por ejemplo, en los loci endógenos no humanos) con un gen DPP4 humano que comprende secuencias que codifican la proteína DPP4 humana o humanizada.
También existe la necesidad de que los animales no humanos comprendan un gen DPP4 (por ejemplo, humano o humanizado) en el que el gen DPP4 está bajo el control de elementos reguladores no humanos (por ejemplo, elementos reguladores endógenos), por ejemplo, en la región flanqueante 5', por ejemplo, promotor y potenciador(es), o en la región 3' no traducida, del gen DPP4.
También existe la necesidad de que los animales no humanos comprendan un gen DPP4 (por ejemplo, humano o humanizado) en el que el gen DPP4 está bajo el control de elementos reguladores humanos, por ejemplo, en la región flanqueante 5', por ejemplo, promotor o potenciador(es), o en la región no traducida 3', del gen DPP4 humano.
También existe la necesidad de animales no humanos humanizados que expresen proteína DPP4 humana o humanizada en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, y/o en la superficie de las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, a un nivel similar al de la proteína Dpp4 en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, y/o en la superficie de las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, de un animal no humano de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 funcional, pero que no comprende el gen DPP4 humano o humanizado.
Además, existe la necesidad de animales no humanos humanizados que expresen proteína DPP4 humana o humanizada en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, y/o en la superficie de las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, a un nivel superior o inferior al de la proteína Dpp4 en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, y/o en la superficie de las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, de un animal no humano de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 funcional, pero que no comprende el gen DPP4 humano o humanizado.
A lo largo de esta descripción, varias patentes, solicitudes de patentes y otros tipos de publicaciones (por ejemplo, artículos de revistas, entradas de bases de datos electrónicas, etc.) están referenciados. El documento WO2004/104216 describe diagnósticos y terapéuticos asociados con DPP4. Reardon (Nature NEWS, 30 de enero de 2014) describe ratones expuestos a un adenovirus que codifica la DPP4 humana. El documento WO 2013/063556 describe el receptor de IL-6 e IL-6 humanizada.
Resumen de la descripción
La presente invención proporciona un roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de un fragmento de un gen Dpp4 de endógeno de roedor en un locus de Dpp4 de endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde:
dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano;
el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana;
la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor;
el roedor es un ratón o una rata; y
el roedor presenta inflamación pulmonar cuando se infecta con el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV).
La invención además proporciona un método para obtener un roedor de la invención, que comprende reemplazar un fragmento de un gen Dpp4 de endógeno de roedor en un locus de Dpp4 de endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde:
dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano;
el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana;
la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor;
el roedor es un ratón o una rata; y
el roedor presenta inflamación pulmonar cuando se infecta con MERS-CoV.
Se describen en la presente descripción animales no humanos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína DPP4 que comprende una secuencia humana.
Se describen en la presente descripción animales transgénicos no humanos que comprenden un gen DPP4 que es humano en su totalidad o en parte.
Se describen en la presente descripción animales no humanos que expresan la proteína DPP4 humana o humanizada.
Se describen en la presente descripción animales no humanos que tienen un reemplazo (en su totalidad o en parte) del gen Dpp4 endógeno de animal no humano.
Se describen en la presente descripción animales no humanos que comprenden una humanización de DPP4 (total o parcial) en un locus de Dpp4 no humano endógeno.
Se describen en la presente descripción animales no humanos que tienen un gen DPP4 humano o humanizado, en donde los animales no humanos no expresan la proteína Dpp4 endógena, y en donde los animales no humanos expresan la proteína DPP4 humana o humanizada en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, y/o en la superficie de las células en una o más tejidos, incluyendo placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, a un nivel similar al de la proteína Dpp4 presente en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, y/o en la superficie de células en uno o más tejidos, incluyendo placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, de un animal no humano de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional, pero no comprende el reemplazo.
En un aspecto, se describen en la presente descripción animales no humanos que comprenden una secuencia de ácido nucleico de DPP4 humana o humanizada.
En un aspecto, en la presente descripción se describen animales no humanos modificados genéticamente que comprenden un reemplazo en un locus de Dpp4 endógeno de un gen que codifica un gen Dpp4 endógeno que codifica una proteína DPP4 humana o humanizada. Los roedores, por ejemplo, ratones o ratas, se describen en la presente descripción que comprenden un reemplazo de un gen Dpp4 endógeno, en un locus de Dpp4 endógeno, con un gen Dpp4 humano. En un aspecto, el roedor es heterocigoto para el reemplazo en un locus de Dpp4 endógeno de un gen Dpp4 endógeno que codifica una proteína DPP4 humana. En un aspecto, el roedor es homocigoto para el reemplazo en un locus de Dpp4 endógeno de un gen Dpp4 endógeno que codifica una proteína DPP4 humana. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.
En un aspecto, se describen en la presente descripción roedores modificados genéticamente, por ejemplo, ratones o ratas, que comprenden una humanización de un gen Dpp4 de endógeno de roedor, en donde la humanización comprende un reemplazo en el locus de Dpp4 de endógeno de roedor de un gen de roedor que codifica un exón de un gen Dpp4 con una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un exón de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedores en el locus de Dpp4 de endógeno de roedor.
En un aspecto, el roedor es heterocigoto para la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un exón de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado. En un aspecto, el roedor es homocigoto para la secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un exón de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado. En un aspecto, el roedor es un ratón o una rata. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.
En un aspecto, el gen DPP4 humano que codifica una proteína DPP4 humana comprende del exón 2 al exón 26 del gen DPP4.
En un aspecto, la proteína DPP4 humanizada comprende el dominio extracelular de la proteína DPP4 humana. En un aspecto, la proteína DPP4 humanizada comprende el dominio transmembrana y el dominio citoplásmico de la proteína Dpp4 de ratón.
En un aspecto, el roedor es un ratón que es incapaz de expresar una proteína Dpp4 de ratón.
En una modalidad, el roedor es un ratón en donde un fragmento genómico contiguo de la secuencia Dpp4 de ratón que codifica el exón 2 al exón 26 de Dpp4 de ratón se reemplaza con un fragmento genómico contiguo de la secuencia DPP4 humano que codifica el exón 2 al exón 26 de DPP4 humano.
En un aspecto, en la presente descripción se describen roedores modificados genéticamente, por ejemplo, un ratón o una rata, que expresan una proteína DPP4 humana o humanizada, en donde el roedor que expresa una proteína DPP4 humana o humanizada comprende un sistema inmunológico normal, es decir, el número de células inmunitarias, por ejemplo, células T, en la sangre, plasma o suero del roedor que expresa proteína DPP4 humana o humanizada son similares al número de células inmunitarias, por ejemplo, células T, en la sangre, plasma o suero de un roedor que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.
En una modalidad, la sangre del roedor que expresa una proteína DPP4 humana tiene aproximadamente el mismo número de células inmunitarias, por ejemplo, células T, que un roedor que expresa una proteína Dpp4 endógena funcional, por ejemplo, un ratón o rata de tipo salvaje. En una modalidad, el roedor es un ratón. En una modalidad, el roedor es una rata.
En un aspecto, el ratón que expresa DPP4 humana en la superficie de las células T tiene una cantidad de células T presentes en la sangre de al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o 200 % de la cantidad de células T presentes en la sangre de un ratón de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional, pero no comprende un reemplazo de un gen Dpp4 endógeno, en un locus de Dpp4 endógeno de ratón, con un gen DPP4 humano. En una modalidad, el ratón que expresa la proteína DPP4 humana en la superficie de las células T tiene una cantidad de células T en la sangre de entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 200 %, entre aproximadamente 40 % y aproximadamente 160 %, o entre aproximadamente 80 % y aproximadamente 120 % de la cantidad de células T presentes en la sangre de un ratón de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional, pero que no comprende un reemplazo de un gen Dpp4 endógeno, en un locus de Dpp4 endógeno de ratón, con un gen DPP4 humano.
En un aspecto, los roedores modificados genéticamente, un ratón o una rata, siempre que expresen una proteína DPP4 humana, es uno en donde el roedor expresa una proteína DPP4 humana en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, y/o en la superficie de células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta,
riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, de un roedor de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional. En una modalidad, el roedor es un ratón. En una modalidad, el roedor es una rata.
En una modalidad, las células inmunitarias, por ejemplo, las células T, del roedor que expresa una proteína DPP4 humana tienen aproximadamente el mismo nivel de proteína DPP4 en su superficie que las células inmunitarias, por ejemplo, las células T, de un roedor que expresa una proteína Dpp4 endógena funcional, por ejemplo, un ratón o rata de tipo salvaje. En una modalidad, el roedor es un ratón. En una modalidad, el roedor es una rata.
En un aspecto, el ratón expresa la proteína DPP4 humana en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, a un nivel de al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o 200 % del nivel de proteína Dpp4 en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, de un ratón de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional, pero que no comprende un reemplazo de un gen Dpp4 endógeno, en un locus de Dpp4 endógeno de ratón, con un gen DPP4 humano.
En una modalidad, el ratón expresa la proteína DPP4 humana en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, a un nivel de entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 200 %, entre aproximadamente 40 % y aproximadamente 160 %, o entre aproximadamente 80 % y aproximadamente 120 % del nivel de proteína Dpp4 de ratón presente en la superficie de las células inmunitarias, por ejemplo, células T, de un ratón de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional, pero que no comprende un reemplazo de un gen Dpp4 endógeno, en un locus de Dpp4 endógeno de ratón, con un gen DPP4 humano.
En una modalidad, las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, del roedor que expresa una proteína DPP4 humana tienen aproximadamente el mismo nivel de proteína DPP4 en su superficie como las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, de un roedor que expresa una proteína Dpp4 endógena funcional, por ejemplo, un ratón o rata de tipo salvaje. En una modalidad, el roedor es un ratón. En una modalidad, el roedor es una rata.
En una modalidad, el ratón expresa la proteína DPP4 humana en la superficie de las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, a un nivel de al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o 200 % del nivel de proteína Dpp4 en la superficie de las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, de un ratón de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional, pero que no comprende un reemplazo de un gen Dpp4 endógeno, en un locus de Dpp4 endógeno de ratón, con un gen DPp4 humano.
En una modalidad, el ratón expresa la proteína DPP4 humana en la superficie de las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, a un nivel de entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 200 %, entre aproximadamente 40 % y aproximadamente 160 %, o entre aproximadamente 80 % y aproximadamente 120 % del nivel de proteína Dpp4 de ratón presente en la superficie de las células en uno o más tejidos, por ejemplo, placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y/o páncreas, de un ratón de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena funcional, pero que no comprende un reemplazo de un gen Dpp4 endógeno, en un locus de Dpp4 endógeno de ratón, con un gen DPP4 humano.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un roedor modificado genéticamente, que comprende un gen DPP4 que comprende un reemplazo de la secuencia que codifica el dominio extracelular de Dpp4 de roedor con secuencia que codifica el dominio extracelular de DPP4 de humanos, en donde el gen DPP4 humanizado comprende una secuencia transmembrana de Dpp4 de roedor y una secuencia citoplásmica de Dpp4 de roedor, en donde el gen DPP4 humanizado está bajo el control de elementos reguladores Dpp4 de endógeno de roedores en el locus de Dpp4 endógeno.
En un aspecto, el roedor es heterocigoto para el gen DPP4 humanizado. En un aspecto, el roedor es homocigoto para el gen DPP4 humanizado.
En un aspecto, el roedor es un ratón o una rata. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.
En un aspecto, el ratón es incapaz de expresar una proteína Dpp4 de ratón.
En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor son de un ratón o una rata.
En un aspecto, los elementos o secuencias reguladores de roedor son elementos o secuencias reguladores endógenos de roedor en el locus de Dpp4 de roedor son de un ratón o una rata.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata, que expresa la proteína DPP4 humana, en donde el roedor expresa la proteína DPP4 humana de un locus de Dpp4 endógeno no humano. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata. En un aspecto, el roedor es heterocigoto para el locus de Dpp4 endógeno no humano que expresa una proteína DPP4 humana o humanizada. En un aspecto, el roedor es homocigoto para el locus de Dpp4 endógeno no humano que expresa una proteína DPP4 humana o humanizada.
En un aspecto, se describe en la presente descripción un ratón modificado genéticamente que expresa una proteína DPP4 humana o humanizada de un locus de Dpp4 endógeno de ratón, en donde el gen Dpp4 endógeno de ratón se ha reemplazado, en su totalidad o en parte, con un gen de DPP4 humano.
En una modalidad, aproximadamente 78,8 kb en el locus de Dpp4 endógeno de ratón, incluidos los exones 2 al codón de parada en el exón 26 se elimina y se reemplaza con aproximadamente 81,8 kb de secuencia del gen DPP4 humano que comprende los exones 2 a 26 y una secuencia no traducida 3' del gen DPP4 humano. En una modalidad específica, el gen DPP4 humano comprende del exón 2 al exón 26 y una porción de la secuencia no traducida 3' del gen DPP4 humano de BAC RP11-68L22 humano. En una modalidad específica, el gen DPP4 comprende elementos reguladores 5' del gen Dpp4 de ratón, el exón 1 de Dpp4 de ratón, incluidos los dos primeros aminoácidos, Met y Lys, de la proteína Dpp4 de ratón, y elementos reguladores 3' de Dpp4 de ratón (por ejemplo, región no traducida 3') y el exón 2 al exón 26 del gen DPP4 humano, es decir, las secuencias codificantes de la proteína DPP4 humana, excepto los dos primeros aminoácidos, que se derivan del exón 1 de Dpp4 de ratón.
En un aspecto, se describe en la presente descripción un ratón modificado genéticamente que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína DPP4 humana, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína DDP4 humana reemplaza, en su totalidad o en parte, una secuencia de nucleótidos endógena que codifica una proteína DPP4 endógena de ratón.
En un aspecto, el ratón es heterocigoto para la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína DPP4 humana o humanizada. En un aspecto, el ratón es homocigoto para la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína DPP4 humana o humanizada.
En un aspecto, se describe en la presente descripción un método para obtener un roedor con DPP4 humanizada, que comprende reemplazar una secuencia del gen de Dpp4 de roedor que codifica la proteína Dpp4 de roedor con una secuencia del gen de DPP4 de humano que comprende uno o más exones de la secuencia del gen de DPP4 de humano que codifica la proteína DPP4 humana o humanizada, en donde el reemplazo es en un locus de Dpp4 endógeno de roedor y la secuencia del gen de DPP4 de humano que comprende uno o más exones la secuencia del gen de DPP4 de humano que codifica la proteína DPP4 humana o humanizada está unida operativamente a elementos o secuencias reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor.
En un aspecto, el roedor es heterocigoto para la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína DPP4 humana o humanizada. En un aspecto, el roedor es homocigoto para la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína DPP4 humana o humanizada.
En un aspecto, el roedor es un ratón o una rata. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.
En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor se derivan de un ratón. En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor se derivan de una rata.
En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor son secuencias o elementos reguladores endógenos de roedor en el locus de Dpp4 de roedor. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.
En un aspecto, la secuencia del gen DPP4 humano que sustituye la secuencia del gen de Dpp4 de roedor comprende al menos un exón de la secuencia del gen de DPP4 humano. En otros aspectos, la secuencia del gen de DPP4 humano que reemplaza la secuencia del gen de Dpp4 de roedor comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, o al menos 25 exones de la secuencia del gen de DPP4 humano. En una modalidad, la secuencia del gen de DPP4 humano que reemplaza la secuencia del gen de Dpp4 de roedor comprende los 26 exones de la secuencia del gen de DPP4 humano. En una modalidad, el roedor es un ratón. En una modalidad, el roedor es una rata.
En una modalidad, la secuencia del gen DPP4 humano que reemplaza la secuencia del gen Dpp4 de roedor codifica una proteína que es aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a una DPP4 humana.
En una modalidad, la secuencia del gen DPP4 humano que reemplaza la secuencia del gen Dpp4 de roedor comprende al menos un exón de la secuencia del gen DPP4 humano que codifica el dominio extracelular de la proteína DPP4 humana. En otras modalidades, la secuencia del gen de DPP4 humano que reemplaza la secuencia del gen de Dpp4 de roedor comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, o al menos 23 exones de la secuencia del gen DPP4 humano que codifica el dominio extracelular de la proteína DPP4 humana. En una modalidad, la secuencia del gen DPP4 humano que reemplaza a la secuencia del gen Dpp4 de roedor comprende los 24 exones de la secuencia del gen DPP4 humano que codifica el dominio extracelular de la proteína DPP4 humana. En una modalidad, el roedor es un ratón. En una modalidad, el roedor es una rata.
En una modalidad, la secuencia del gen DPP4 humano que reemplaza la secuencia del gen Dpp4 de roedor codifica un dominio extracelular de la proteína DPP4 que es aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o aproximadamente 99 % idéntico al dominio extracelular de una proteína DPP4 humana.
El reemplazo está en un locus de Dpp4 endógeno de roedor y la secuencia del gen DPP4 humano que comprende uno o más exones de la secuencia del gen DPP4 humano que codifica la proteína DPP4 humana está unida operativamente a elementos o secuencias reguladores endógenos de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor.
En un aspecto, se describe en la presente descripción un método para obtener un ratón con DPP4 humanizada, que comprende reemplazar una secuencia del gen de Dpp4 de ratón que codifica la proteína Dpp4 de ratón con una secuencia del gen DPP4 humano que codifica la proteína DPP4 humana o humanizada.
En un aspecto, el reemplazo es en un locus de Dpp4 endógeno de ratón, y el gen de DPP4 humano que codifica la proteína DPP4 humana está unido operativamente a elementos o secuencias reguladores de ratón en el locus de Dpp4 endógeno de ratón.
En un aspecto, el reemplazo es en un locus de Dpp4 endógeno de ratón, y el gen de DPP4 humano que codifica la proteína DPP4 humana está unido operativamente a elementos o secuencias reguladores endógenos de ratón en el locus de Dpp4 endógeno de ratón.
En diversos aspectos, los roedores, ratones o ratas modificados genéticamente, descritos en la presente descripción comprenden las modificaciones genéticas en su línea germinal.
En un aspecto, se proporciona un embrión de un roedor, por ejemplo, un ratón o rata, que comprende una modificación genética como se describe en la presente descripción. En particular, la presente invención proporciona un embrión de roedor cuyo genoma comprende el remplazo de un fragmento de un gen Dpp4 endógeno de roedor en un locus de Dpp4 endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde:
dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano;
el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana;
la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor;
el embrión de roedor es un embrión de ratón o de rata, y
un roedor derivado de dicho embrión de roedor presenta inflamación pulmonar cuando se infecta con MERS-CoV.
En un aspecto, el embrión huésped de roedor, ratón o rata proporcionado comprende una célula donante que comprende una modificación genética como se describe en la presente descripción.
La invención proporciona además un roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de un fragmento de un gen Dpp4 endógeno de roedor en un locus de Dpp4 endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde:
dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano;
el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana;
la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor;
la célula de roedor es una célula de ratón o una célula de rata. En un aspecto, se proporciona una célula de roedor, ratón o rata pluripotente o totipotente que comprende una modificación genética como se describe en la
presente descripción. En una modalidad, la célula es una célula de ratón. En una modalidad, la célula es una célula madre embrionaria (ES) de roedor. En una modalidad, la célula es una célula ES de ratón.
En un aspecto, se describe en la presente descripción un óvulo de un roedor, por ejemplo, ratón o rata, en donde el óvulo del animal no humano comprende un cromosoma ectópico del animal no humano, en donde el cromosoma ectópico del animal no humano comprende una modificación genética como se describe en la presente descripción. En un aspecto, el animal no humano es un roedor. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.
En un aspecto, el embrión, huevo, o célula de ratón que se modifica genéticamente para comprender un gen DPP4 humano es de un ratón que es de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. En otra modalidad, el ratón es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por ejemplo, Festing y otros (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, ver además, Auerbach y otros (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En una modalidad específica, el ratón modificado genéticamente es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En otra modalidad específica, el ratón es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En una modalidad específica, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otra modalidad, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, una cepa BALB/c. En aún otra modalidad, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente. En una modalidad, el ratón es un ratón Swiss o Swiss Webster.
Los roedores proporcionados son ratones o ratas.
En un aspecto, en la presente descripción se describe un roedor que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen DPP4 o fragmento del mismo, donde el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende al menos un exón del gen DPP4 humano, y donde el gen DPP4 humano o fragmento del mismo codifica una proteína DPP4 humana o humanizada.
En una modalidad, gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 20, 21,22, 23, 24 o 25 exones del gen DPP4 humano.
En una modalidad, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende los 26 exones del gen DPP4 humano. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende además una región flanqueante 5' del gen DPP4 humano. En una modalidad, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo está unido operativamente a la región flanqueante 5' del gen DPP4 humano. En una modalidad, la región flanqueante 5' del gen DPP4 humano comprende al menos 1 kb de longitud (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 kb o más de longitud). En una modalidad, la región flanqueante 5' del gen DPP4 humano comprende al menos 10 kb de longitud. En una modalidad, la región flanqueante 5' del gen DPP4 humano comprende al menos 40 kb de longitud.
En una modalidad, la expresión del gen DPP4 humano o fragmento del mismo está bajo el control de la región flanqueante 5' del gen DPP4 humano.
En una modalidad, la proteína DPP4 humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 o un fragmento de la misma.
En una modalidad, el roedor expresa la proteína DPP4 humana en la superficie de las células T en un nivel que es al menos aproximadamente 20 % (por ejemplo, al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más) del nivel de proteína Dpp4 de roedor presente en la superficie de las células T de un roedor de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena de roedor funcional pero que no comprenden el gen DPP4 humano o fragmento del mismo.
En una modalidad, el roedor expresa la proteína DPP4 humana en la superficie de las células en uno o más tejidos seleccionados del grupo que consiste en placenta, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético, corazón, cerebro y páncreas, en un nivel que es al menos aproximadamente 20 % (por ejemplo, al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o más) del nivel de la proteína Dpp4 de roedor presente en la superficie de uno o más tejidos de un roedor de la misma edad que expresa la proteína Dpp4 endógena de roedor funcional pero que no comprende el gen DPP4 humano o fragmento del mismo.
En un aspecto, el roedor expresa la proteína Dpp4 endógena de roedor funcional.
El roedor es un ratón o una rata.
En un aspecto, se describe en la presente descripción un método para hacer un roedor transgénico humanizado, que comprende integrar una secuencia de ácido nucleico que comprende uno o más exones de una secuencia del gen DPP4 humano en un cromosoma de un roedor, donde el uno o más exones de la secuencia del gen DPP4 humano codifica una proteína DPP4 humana o humanizada.
En un aspecto, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 20, 21,22, 23, 24 o 25 exones del gen DPP4 humano.
En un aspecto, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende los 26 exones del gen DPP4 humano. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico comprende además una región flanqueante 5' del gen DPP4 humano. En un aspecto, la secuencia del gen DPP4 humano está unida operativamente a la región flanqueante 5' del gen DPP4 humano.
En un aspecto, la proteína DPP4 humana o humanizada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 o un fragmento de la misma.
En un aspecto, el roedor es un ratón o una rata. En otros aspectos, los métodos para determinar la eficacia terapéutica in vivo de un antagonista de DPP4 específico de humanos en cualquiera de los roedores con DPP4 humanizado descritos en la presente descripción se describen en la presente descripción, el método comprende administrar al roedor un antagonista de DPP4, en donde el roedor está infectado con coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV); y determinar si el antagonista de DPP4 trata o previene uno o más síntomas de la infección por MERS-CoV en comparación con los roedores de control infectados con MERS-CoV a los que no se les ha administrado el antagonista de DPP4. La presente invención proporciona un método para identificar un antagonista de DPP4 para tratar o prevenir uno o más síntomas de MERS-CoV, el método comprende: (a) administrar al roedor de la invención un antagonista de DPP4, en donde el roedor está infectado con el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV); y
(b) determinar si el antagonista de DPP4 trata o previene uno o más síntomas de la infección por MERS-CoV en comparación con los roedores de control infectados con MERS-CoV a los que no se les ha administrado el antagonista de DPP4.
En una modalidad, el antagonista de DPP4 se selecciona del grupo que consiste en moléculas pequeñas, péptidos y anticuerpos.
En una modalidad, el antagonista de DPP4 es un anticuerpo contra una proteína MERS-CoV.
En una modalidad, la proteína MERS-CoV es una proteína espicular de MERS-CoV.
En una modalidad, el roedor está infectado con una o más cepas de MERS-CoV seleccionadas del grupo que consiste en Al-Hasa_1, Al-Hasa_2, Al-Hasa_3, Al-Hasa_4, Al-Hasa_12, Al-Hasa_15, Al-Hasa_16, Al-Hasa_17, Al-Hasa_18, Al-Hasa_19, Al-Hasa_21, Al-Hasa_25, Buraidah_1, EMC/2012, FRA/UAE, Hafr-Al-Batin_1, Hafr-Al-Batin_2, Hafr-Al-Batin_6, Jeddah_1, Jordan-N3/2012, Munich, Riyadh_3, Riyadh_4, Riyadh_5, Riyadh_14, Taif_1, Wadi-Ad-Dawasir_1, Riyadh_9, KFU-HKU 1, KFU-HKU 13, Qatar3, Qatar4, England 1, England-Qatar/2012, Bisha_1, Riyadh_1, y Riyadh_2.
En una modalidad, el antagonista se administra antes de la infección por MERS-CoV. En una modalidad, el antagonista se administra después de la infección por MERS-CoV.
En una modalidad, el antagonista se administra simultáneamente con la infección por MERS-CoV.
En una modalidad, el síntoma de la infección por MERS-CoV es el título viral o el nivel de ARN.
En una modalidad, el título viral o el nivel de ARN se evalúa mediante uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste en qPCR, transferencia Northern, ensayo de placa e hibridación in situ.
En una modalidad, el síntoma de la infección por MERS-CoV es la inflamación pulmonar.
En una modalidad, la inflamación pulmonar se evalúa histoquímicamente.
En una modalidad, el síntoma de la infección por MERS-CoV es la pérdida de peso.
El roedor es un ratón o una rata. En una modalidad, el roedor es un ratón. En una modalidad, el roedor es una rata.
Es posible usar en conjunto cada uno de los aspectos y modalidades descritos en la presente descripción, a menos que se excluyan explícitamente o evidentemente a partir del contexto del aspecto o modalidad.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A-B proporcionan ilustraciones, no a escala, de la estrategia de humanización del locus de Dpp4. La Figura 1A es un esquema que muestra que 78,8 kb del gen Dpp4 de ratón (arriba) que abarca el exón 2 al codón de parada en el exón 26 se eliminan y se reemplazan con 81,7 kb del gen DPP4 (abajo) que abarca del exón 2 al exón 26 y una porción de la región no traducida 3', como se indica. La Figura 1B es un esquema que muestra que el ratón con DPP4 humanizado comprende (i) la región flanqueante 5' del gen Dpp4 de ratón, que incluye las secuencias reguladoras, por ejemplo, el promotor y el sitio de inicio de la transcripción, y el exón 1 , que incluye el codón ATG de iniciación, (ii) el gen DPP4 humano que abarca del exón 2 al exón 26, que incluye el codón de parada, y una parte de la región no traducida 3', que incluye el sitio loxP, y (iii) la región no traducida 3' del gen Dpp4 de ratón comenzando desde solo 3' al codón de parada, como se indica.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 17) de la proteína DPP4 humanizada expresada en los ratones con DPP4 humanizado.
La Figura 3 muestra los resultados de la PCR en tiempo real realizada en el ARN obtenido de tejido pulmonar de ratones con DPP4 humanizado F0 infectados con (PBS) simulación o infectados con MERS-CoV (cepa Jordan), 4 días después de la infección.
La Figura 4 muestra la tinción H&E de las vías respiratorias (aumento de 10X y 40X) y los alvéolos (aumento de 40X) de los pulmones de ratones con DPP4 humanizado F0 infectados con (PBS) simulación o infectados con MERS-CoV (cepa Jordan), 4 días después de la infección.
La Figura 5 es una alineación de secuencias de la secuencia de aminoácidos de Dpp4 (mDpp4) de ratón (SEQ ID NO: 25) con la proteína DPP4 humana (hDPP4) codificada por los ratones mA iD 7326/7327 transgénicos (SEQ ID NO: 26). Los residuos no homólogos que difieren entre las secuencias están subrayados, los residuos homólogos que difieren entre las secuencias están en negrita y en cursiva, y los espacios se indican mediante guiones. Los residuos que son idénticos entre las dos secuencias se muestran en texto sin formato.
La Figura 6 es una tabla que muestra información del gen, secuencia y cromosoma para DPP4 humano.
La Figura 7 es un esquema que muestra la cobertura del gen DPP4 humano y las secuencias genómicas flanqueantes para cada uno de los BAC, BAC RP11-345J9 y BAC RP11-68L22. También se muestra las ubicaciones dentro del gen DPP4 humano y las regiones promotoras en las que se hibridan los conjuntos de cebadores-sondas TaqMan™ humanos (7333hTU para el conjunto aguas arriba y 7333hTD para el conjunto aguas abajo).
La Figura 8 es una tabla que muestra los conjuntos de cebadores-sondas usados para los ensayos de ganancia de alelos humanos TaqMan™, donde 7333 hTU se refiere al conjunto aguas arriba y 7333 hTD se refiere al conjunto aguas abajo.
La Figura 9 es la secuencia de aminoácidos de la proteína DPP4 humanizada codificada por los ratones transgénicos MAID 7333 y 7334 (SEQ ID NO: 24).
La Figura 10A es un gráfico de barras que muestra medidas de PCR cuantitativa del genoma de MERS-CoV (ARN UpE) en ratones infectados 2 y 4 días después de la infección (dpi). La Figura 10B es un gráfico de barras que muestra mediciones de PCR cuantitativa de la transcripción de ARNm de MERS-CoV (ARN líder) en ratones infectados en 2 dpi y 4 dpi. La Figura 10C es un gráfico de barras que cuantifica el título viral de MERS-CoV de pulmón de ratón infectado a 2 dpi y 4 dpi. Los niveles de MERS-CoV en pulmón de ratón homogeneizado se cuantificaron mediante un ensayo de dosis infecciosa en cultivo de tejidos al 50 % (TCID50) y se expresaron como unidades formadoras de placa (pfu) por ml. La Figura 10D es un panel de imágenes histológicas, teñidas con hematoxilina y eosina, de pulmones de ratones infectados con MERS-CoV. Se muestran las vías respiratorias (10X), la vasculatura (10X) y el intersticio (40X) para ratones PBS, 2 dpi y 4 dpi.
La Figura 11A es un gráfico de barras que muestra mediciones de PCR cuantitativa del genoma de MERS-CoV (ARN UpE) de pulmones de ratones pretratados con anticuerpos anti proteína espicular de MERS-CoV (Ab 2 o Ab 4) antes de la infección viral. La Figura 11B es un gráfico de barras que muestra mediciones de PCR cuantitativa del transcrito de ARNm de MERS-CoV (ARN líder) de pulmones de ratones pretratados con anticuerpos anti proteína espicular de MERS-CoV antes de la infección viral. El ARN se cuantificó mediante el uso de cebadores dirigidos contra el genoma de MERS-CoV y se comparó con ratones tratados con control de isotipo hIgG1. Todas las muestras se compararon con el control de hIgG1 ajustado al 100 %. La Figura 11C es un gráfico de barras que muestra el título viral en pulmones de ratones pretratados con anticuerpos anti proteína
espicular de MERS-CoV antes de la infección viral. El título viral se cuantificó mediante ensayo de placa y se informó como pfu/ml.
La Figura 12A es un panel de imágenes histológicas de pulmones de ratones B6/hDPP4 infectados con MERS-CoV con pretratamiento con anticuerpo anti proteína espicular de MERS-CoV (Ab 2 o Ab 4). Secciones teñidas con hematoxilina y eosina de pulmón de ratón que muestran las vías respiratorias, la vasculatura y el intersticio de un ratón representativo de cada grupo. La Figura 12B es un gráfico de barras que muestra la puntuación histológica de los pulmones del ratón que se muestra en la Figura 12A.Las puntuaciones fueron las puntuaciones promedio de todos los ratones en cada grupo experimental y punto de tiempo.
La Figura 13A es un gráfico de barras que muestra mediciones de PCR cuantitativa del genoma de MERS-CoV (ARN UpE) de pulmones infectados. Se compararon los efectos de los anticuerpos anti proteína espicular de MERS-CoV (Ab 2 o Ab 4) inyectados un día antes o un día después de la infección viral. La Figura 13B es un gráfico de barras que muestra medidas de PCR cuantitativa del transcrito de ARNm de MERS-CoV (ARN líder) de pulmones infectados. Se compararon los efectos de los anticuerpos anti proteína espicular de MERS-CoV (Ab 2 o Ab 4) inyectados un día antes o un día después de la infección viral. Para las Figuras 13A-B, se cuantificó el ARN mediante el uso de cebadores dirigidos contra el genoma de MERS-CoV y se comparó con ratones tratados con el control de isotipo hIgG1. Todas las muestras se compararon con el control de hIgG1 ajustado al 100 %. La Figura 13C es un gráfico de barras que muestra el título viral en pulmones de ratones tratados con anticuerpos anti proteína espicular de MERS-CoV (Ab 2 o Ab 4) después de una infección viral. El título viral se cuantificó mediante ensayo de placa y se informó como PFU/ml de pulmón. Se compararon los efectos de los anticuerpos inyectados un día antes o un día después de la infección viral.
La Figura 14A es un panel de imágenes histológicas de pulmones de ratones B6/hDPP4 con tratamiento con anticuerpo Ab 2 anti proteína espicular de MERS-CoV a 1 día después de la infección. Las secciones teñidas con hematoxilina y eosina de pulmón de ratón muestran las vías respiratorias, la vasculatura y el intersticio de un ratón representativo de cada grupo. La Figura 14B es un gráfico de barras que muestra la puntuación histológica de los pulmones de ratón de la Figura 14A.
La Figura 15 describe un estudio de dosis-respuesta del peso en función del tiempo después de la infección con MERS-CoV en ratones con DPP4 humanizada. Se usan 4-5 ratones por grupo.
La Figura 16 representa un estudio de dosis-respuesta del peso en función del tiempo después de la infección con MERS-CoV (1 x 106 pfu/ratón; 4-5 ratones por grupo) en ratones con DPP4 humanizada heterocigóticos y homocigóticos.
La Figura 17 representa la patología (inflamación) observada por el examen histológico en el día 7 en un ratón con DPP4 humanizada expuesto a una dosis alta de virus (1 x 106 pfu/ratón) versus controles tratados con PBS. Descripción detallada
Proteína y gen de DPP4
El gen DPP4 codifica la proteína transmembrana de tipo II, tripeptidil peptidasa IV (DPP4) (también conocida como CD26, adenosina desaminasa proteína formadora de complejo 2 (ADCP2), proteína de unión a adenosina desaminasa (ADABP) y TP103), que tiene actividad serina exopeptidasa, y que juega un papel importante en la activación de las células T y en las cascadas de transducción de señales intracelulares en varios otros tipos de células.
DPP4 humano. ID en NCBI Gene: 1803; Fuente primaria: HGNC:3009; transcrito en RefSeq: NM_001935.3; ID en UniProt: P27487; Ensamblaje genómico: GRCh38; Ubicación: chr2:162,848,755-162,931,052 - cadena. (Ver la Figura 6).
El gen DPP4 humano se encuentra en el cromosoma 2, en 2q24.3. El gen DPP4 humano tiene 26 exones y codifica un polipéptido transmembrana de tipo II de 766 aminoácidos de longitud, que incluye un dominio citoplásmico de 6 aminoácidos N-terminal, un dominio transmembrana de 22 aminoácidos y un dominio extracelular de 738 aminoácidos C-terminal. El dominio extracelular (es decir, ectodominio) de la proteína DPP4 humana está codificado por los exones codificante 3 a 26 del gen DPP4 humano.
Dpp44 de Ratón. ID en NCBI Gene: 13482; Fuente primaria: MGI:94919; transcrito en RefSeq: NM_010074.3; ID en UniProt: P28843; Ensamblaje genómico: GRCm38; Ubicación: chr2:62,330,073-62,412,591 - cadena.
El gen Dpp4 de ratón se encuentra en el cromosoma 2, en 235.85 cM. El gen Dpp4 de ratón tiene 26 exones y codifica un polipéptido transmembrana de tipo II de 760 aminoácidos de longitud, que incluye un dominio citoplásmico de 6 aminoácidos N-terminal, un dominio transmembrana de 22 aminoácidos y un dominio extracelular
de 732 aminoácidos C-terminal. El dominio extracelular (es decir, ectodominio) de la proteína Dpp4 humana está codificado por los exones codificante 3 a 26 del gen Dpp4 de ratón.
Especificidad de especie de la proteína DPP4
Como se analiza a continuación en el Ejemplo 2, la proteína DPP4 humana, pero no la de ratón, es un receptor funcional para la infección por coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV).
Las moléculas terapéuticas candidatas que se dirigen a la proteína DPP4 humana de una manera específica de especie, o moléculas diana, tal como MERS-CoV, que interactúan con la proteína DPP4 humana de una manera específica de especie, se evalúan típicamente para determinar la farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PK) en animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas. Tales moléculas terapéuticas se analizan, además, para determinar la eficacia terapéutica in vivo en modelos animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratón o rata, de enfermedades, trastornos y afecciones humanos en los que DPP4 está asociada.
Sin embargo, las moléculas terapéuticas que son específicas para la proteína DPP4 humana, por ejemplo, inhibidores de DPP4 específicos de humanos, no pueden evaluarse adecuadamente para determinar la p D y/o la eficacia terapéutica in vivo en roedores, en particular ratones, porque faltan las dianas de estas moléculas terapéuticas.
Además, las moléculas terapéuticas que son específicas para dianas que interactúan específicamente con la proteína DPP4 humana, por ejemplo, MERS-CoV específico de DPP4 humana, no pueden evaluarse adecuadamente para determinar la eficacia terapéutica in vivo en roedores, en particular ratones, porque faltan las dianas (por ejemplo, receptor, pareja de interacción) de estas moléculas diana terapéuticas.
En consecuencia, en diversos aspectos, para evaluar la PD y/o la eficacia terapéutica in vivo de un antagonista o inhibidor de la proteína DPP4 específico para humanos en roedores, ratones o ratas, es conveniente reemplazar la proteína Dpp4 endógena con proteína DPP4 humana. En varios aspectos, para evaluar la eficacia terapéutica in vivo de moléculas pequeñas, péptidos o antagonistas o inhibidores biológicos de una molécula diana que interactúa específicamente con una proteína DPP4 humana en roedores, ratones o ratas, es conveniente reemplazar la proteína Dpp4 endógena con proteína DPP4 humana o humanizada.
Además, en diversas modalidades, para evitar problemas potenciales de sobreexpresión o subexpresión de la proteína DPP4 humana o humanizada, y/o la expresión inapropiada de la proteína DPP4 humana o humanizada en células o tejidos en los que la proteína Dpp4 endógena no se expresa normalmente, es conveniente insertar el gen DPP4 humano, en todo o en parte, en el genoma de los animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, en los loci del gen Dpp4 endógeno, y expresar la proteína DPP4 humana o humanizada en animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, bajo el control, al menos en parte, de los elementos reguladores de Dpp4 endógenos.
En algunos aspectos, es conveniente la sustitución dirigida del gen de Dpp4 endógeno, por ejemplo, de ratón o rata, por el gen de DPP4 humano o un fragmento del mismo.
En otros aspectos, el gen de DPP4 humano o fragmento del mismo se inserta aleatoriamente en el genoma de roedor, ratón o rata, en lugar de reemplazar el gen de Dpp4 endógeno con un gen de DPP4 humano o fragmento del mismo. En algunos aspectos, en roedores, ratones o ratas, en los que el gen de DPP4 humano o un fragmento del mismo se ha insertado aleatoriamente en el genoma, se retiene la expresión de Dpp4 endógeno de roedor.
Se describen en la presente descripción roedores, ratones o ratas, que comprenden un gen DPP4 humano o fragmento del mismo en (es decir, al reemplazar) el locus de Dpp4 endógeno. También se describen en la presente descripción animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, que comprenden un gen DPP4 humano o fragmento del mismo tanto en (es decir, al reemplazar) el locus de Dpp4 endógeno, y en un locus/loci adicional.
En algunos aspectos, un fragmento de un gen de DPP4 humano contiene 200 kilobases (kb) o menos nucleótidos, por ejemplo, 180, 160, 140, 120, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2,5, 1 kb o menos nucleótidos, por ejemplo, 1000, 800, 600, 400, 200 o menos nucleótidos.
Generación de células y animales no humanos con DPP4 humano
Para el reemplazo dirigido de un gen Dpp4 endógeno no humano o fragmento con un gen DPP4 humano o fragmento, se genera una construcción de direccionamiento. Véase, por ejemplo, Valenzuela y otros, Nature Biotech, 21.6(2003):652-659; los documentos US 6,586,251; y US 8,759,105. Por ejemplo, una construcción de direccionamiento comprende brazos de homología que flanquean a un gen DPP4 humano de reemplazo o fragmento del mismo.
En algunos aspectos, el gen DPP4 humano de reemplazo o fragmento del mismo comprende todo el gen DPP4 humano. En otros aspectos, el gen DPP4 humano de reemplazo o fragmento del mismo comprende una porción del gen DPP4 humano. Por ejemplo, el gen DPP4 humano de reemplazo o fragmento del mismo comprende uno o más exones del gen DPP4 humano, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 exones del gen DPP4 humano. Por ejemplo, el gen DPP4 humano de reemplazo o fragmento del mismo comprende los exones 1-26 del gen DPP4 humano. En otras modalidades, el gen DPP4 humano de reemplazo o fragmento del mismo comprende los exones 2-26 del gen DPP4 humano. Por ejemplo, el gen DPP4 humano de reemplazo o fragmento del mismo comprende el intrón 1 aguas arriba del exón 2 al exón 26 del gen DPP4 humano. En algunas modalidades, el gen DPP4 humano de reemplazo o fragmento del mismo comprende además un elemento(s) regulador(es) de humano, por ejemplo, una porción de la región no traducida (UTR) 3' humana aguas abajo del gen DPP4, por ejemplo, al menos 1 kb de la región aguas abajo (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 Kb, o más), y/o una región promotora o potenciadora humana aguas arriba del gen DPP4 humano, por ejemplo, al menos 10 kb de la región aguas arriba (por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50 Kb o más). Los brazos de homología son secuencias que son homólogas a las secuencias de ácido nucleico cromosómicas endógenas que flanquean la modificación/reemplazo genético deseado, por ejemplo, flanquean el gen Dpp4 endógeno o fragmento que se va a reemplazar. Las secuencias de ácido nucleico homólogas pueden ser dos o más secuencias de ácido nucleico que son lo suficientemente idénticas o similares como para que puedan hibridar entre sí o experimentar intercambio intermolecular. Debido a la homología entre los brazos de homología y la secuencia endógena correspondiente, los brazos de homología dirigen la construcción de direccionamiento a una ubicación cromosómica específica dentro del genoma, por ejemplo, el locus del gen Dpp4 endógeno. Véase, por ejemplo, Valenzuela y otros, Nature Biotech, 21.6(2003):652-659; los documentos US 6,586,251; y US 8,759,105.
Opcionalmente, la construcción de direccionamiento comprende además un marcador de selección, por ejemplo, entre los dos brazos de homología. Los marcadores de selección ilustrativos incluyen marcadores de resistencia a antibióticos (por ejemplo, neomicina o kanamicina) y proteínas fluorescentes. En algunas modalidades, el marcador de selección está flanqueado por sitios loxP, es decir, flanqueado por dos sitios loxP. El marcador de selección flanqueado por sitios loxP se puede eliminar mediante la adición de recombinasa Cre, que cataliza la escisión del segmento flanqueado por sitios loxP, por ejemplo, al incluir el marcador de selección.
Vector/Construcciones
Los animales transgénicos no humanos (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas) descritos en la presente descripción pueden obtenerse mediante el uso de varios vectores y/o construcciones. En algunos aspectos, la construcción de direccionamiento tiene la forma de una pieza circular de ADN bicatenario, por ejemplo, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), plásmido o cromosoma artificial derivado de P1 (PAC).
Para generar una célula no humana que comprenda un reemplazo dirigido del locus de Dpp4 endógeno, se introduce una construcción de direccionamiento que contiene un gen DPP4 humano o fragmento descrito en la presente descripción en una célula no humana (por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata), por ejemplo, célula madre embrionaria (ES).
Para generar una célula no humana que comprenda un gen DPP4 humano o fragmento insertado aleatoriamente en el genoma, se introduce una construcción de ADN circular, por ejemplo, BAC, que contiene un gen DPP4 humano o fragmento del mismo, en una célula no humana (por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata), por ejemplo, célula ES. En algunos casos, la construcción de ADN circular, por ejemplo, BAC, contiene además un elemento regulador de DPP4 humano, por ejemplo, una región promotora o potenciadora humana aguas arriba y/o aguas abajo del gen DPP4. Por ejemplo, la construcción circular de ADN contiene al menos 10 kb (por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50 kb o más) de la región promotora/potenciadora aguas arriba del codón de inicio ATG del gen DPP4 humano. Además o alternativamente, la construcción de ADN circular contiene al menos 1 kb (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 kb o más) de la región no traducida aguas abajo de la gen DPP4. Por ejemplo, el gen DPP4 humano o fragmento está unido operativamente al elemento regulador de DPP4 humano.
En algunos aspectos, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo en la construcción de ADN circular (por ejemplo, BAC) comprende la totalidad del gen DPP4. En otros aspectos, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende una porción del gen DPP4 humano. Por ejemplo, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende uno o más exones del gen DPP4 humano, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 exones del gen DPP4 humano. Por ejemplo, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende los exones 1-26 del gen DPP4 humano. En otros aspectos, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende los exones 2-26 del gen DPP4 humano. Por ejemplo, el gen DPP4 humano o fragmento del mismo comprende el intrón 1 aguas arriba del exón 2 al exón 26 del gen DPP4 humano.
Por ejemplo, la etapa de introducción en la célula se realiza mediante electroporación o transfección mediada por lípidos.
Opcionalmente, la construcción de ADN circular, por ejemplo, BAC, se linealiza antes de la introducción en la célula. Por ejemplo, la linealización se realiza con enzimas de restricción de corte raro, por ejemplo, SgrDI, Sfil, NotI, PacI o SwaI.
En los casos en los que la construcción de direccionamiento comprende un marcador de selección de antibiótico (por ejemplo, neomicina), las células que han captado la construcción de direccionamiento se seleccionan opcionalmente en medios que contienen neomicina/G418. Las células que sobreviven y/o proliferan en medios que contienen neomicina/G418 se seleccionan y son positivas para la construcción de direccionamiento.
En algunos aspectos, la población celular se analiza en busca de aquellas células que han incorporado a su genoma un gen DPP4 humano o fragmento del mismo, por ejemplo, insertado aleatoriamente en el genoma o dirigido (por ejemplo, por la construcción de direccionamiento) al locus de Dpp4 endógeno.
Los métodos de selección incluyen PCR cuantitativa e hibridación in situ por fluorescencia. Véanse, por ejemplo, los documentos US 6,586,251 B2 y US 8,759,105 B2. Por ejemplo, los métodos de selección incluyen detectar la presencia de un gen DPP4 humano o fragmento. En algunos aspectos, los métodos de selección incluyen la detección de una pérdida del número de copias del gen Dpp4 endógeno o fragmento y/o ganancia del número de copias de gen DPp4 humano o fragmento. En los Ejemplos 1 y 3 se describen métodos de selección ilustrativos. En algunos aspectos en los que la construcción de direccionamiento comprende un marcador de selección flanqueado por sitios loxP, las células dirigidas correctamente se electroporan además opcionalmente con un vector que expresa Cre, por ejemplo, recombinasa Cre que se expresa transitoriamente, para eliminar el marcador de selección flanqueado por sitios loxP.
Para generar animales transgénicos, clones de células ES positivas, por ejemplo, sin marcador de selección flanqueado por sitios loxP, que contienen un gen DPP4 humano o fragmento del mismo, se introducen en un embrión de roedor, por ejemplo, un embrión de ratón o rata, tal como un embrión de ratón en estadio de 8 células. Por ejemplo, la etapa de introducción se realiza mediante tecnología de inyección de blastocisto, técnicas de agregación, transferencia nuclear y clonación y/o el método VelociMouse®. Véanse, por ejemplo, los documentos US 8,759,105 B2, US 7,294,754, US 7,576,259 y US 7,659,442. Por ejemplo, un clon de células ES es una subpoblación de células derivadas de una sola célula de la población de células ES después de la introducción de ADN y la posterior selección.
En algunos casos, el ADN de animales transgénicos no humanos se analiza de manera similar a la descrita anteriormente para confirmar la transmitancia del gen DPP4 humanos/fragmento a través de la línea germinal. En algunos aspectos, los roedores con DPP4 humanizado descritos en la presente descripción son heterocigotos para el alelo de DPP4 humano. Como tal, estos roedores tienen un alelo de DPP4 humano y un alelo de DPP4 de roedor de tipo salvaje. En otras modalidades, los roedores con DPP4 humanizado son homocigotos para el alelo de DPP4 humano.
Usos de roedores con DPP4 humanizado
Los roedores con DPP4 humanizado, por ejemplo, ratones o ratas, son útiles para evaluar la farmacodinámica (PD) de antagonistas de DPP4 específicos para humanos, por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos, o inhibidores biológicos, útiles para el tratamiento de la hiperglicemia.
Ensayos de farmacocinética (PK) y PD en roedores con DPP4 humanizado, por ejemplo, ratones o ratas, se realizan de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica.
Los roedores con DPP4 humanizado, por ejemplo, ratones o ratas, son útiles para evaluar la eficacia terapéutica in vivo de antagonistas de DPP4 específicos para humanos, por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos, o inhibidores biológicos, en el tratamiento de la hiperglicemia.
Los roedores con DPP4 humanizado, por ejemplo, ratones o ratas, son útiles para probar la eficacia terapéutica in vivo de antagonistas, por ejemplo, moléculas pequeñas, péptidos o inhibidores biológicos, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes, que son específicos para moléculas diana, por ejemplo, MERS-CoV (por ejemplo, proteína espicular (S) de MERS-CoV, por ejemplo, dominio de unión al receptor de la proteína espicular de MERS-CoV), que interactúan específicamente con DPP4 humana, en el tratamiento o prevención (o profilaxis) de la infección por MERS-CoV. En algunos aspectos, los roedores que son heterocigotos para el alelo de DPP4 humano se usan para probar la eficacia terapéutica in vivo de uno o más antagonistas en el tratamiento o prevención (o profilaxis) de la infección por MERS-CoV. En otros aspectos, los roedores con DPP4 que son homocigotos para el alelo de DPP4 humano se usan para probar la eficacia terapéutica in vivo de uno o más antagonistas en el tratamiento o prevención (o profilaxis) de la infección por MERS-CoV.
Las cepas ilustrativas de MERS-CoV incluyen la cepa MERS-CoV Jordán (número de acceso de GenBank KC776174.1, MERS CoV-Hu/Jordan-N3/2012) y la cepa MERS-CoV EMC/2012 (número de acceso de GenBank JX869059.2). En algunos aspectos, un virus MERS-CoV descrito en la presente descripción comprende un aislado clínico de MERS-CoV. En otros aspectos, un virus MERS-CoV descrito en la presente descripción comprende una cepa que comprende la misma secuencia del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular que un aislado clínico descrito en la presente descripción. En la siguiente tabla se muestran aislados clínicos ilustrativos. La tabla muestra la variación de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína espicular de varios aislados clínicos de MERS-CoV. Las secuencias depositadas en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) de los aislados clínicos de MERS-CoV se alinearon en los aminoácidos 367-606 y se compararon con la cepa EMC/2012. Los aislamientos clínicos que albergan las sustituciones A431P, S457G, S460F, A482V, L506F, D509G y V534A (donde el aminoácido (designación de una sola letra) que precede al número es el de la cepa EMC/2012 y el aminoácido (designación de una sola letra) a continuación, el número es el del aislado clínico) se muestran en la tabla.
Tabla I
En algunas modalidades, se administra un antagonista antes (por ejemplo, al menos 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 horas, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o más antes) de una infección por MERS-CoV en el roedor. En otras modalidades, el antagonista se administra después (por ejemplo, al menos 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48 horas, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o más después) de una infección por MERS-CoV en el roedor.
En algunas modalidades, cuando se administra un antagonista a un roedor después de la infección por MERS-CoV, un título viral o nivel de ARN más bajo (por ejemplo, UpE viral o nivel de ARN de secuencia líder) en el roedor después de la administración del antagonista, por ejemplo, más bajo al menos 5 veces (por ejemplo, al menos 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107 veces o más) en comparación con un nivel de control indica que el antagonista es efectivo en el tratamiento de una infección por MERS-CoV. Por ejemplo, un nivel de control es el título viral o el nivel de ARN en el roedor antes de la administración del antagonista. En otros ejemplos, un nivel de control es el título viral o el nivel de ARN en un roedor infectado con virus que no se trata con el antagonista.
En algunas modalidades, cuando se administra un antagonista a un roedor antes de la infección por MERS-CoV, un título viral o nivel de ARN más bajo (por ejemplo, UpE viral o nivel de ARN de secuencia líder) en el roedor después de la administración del antagonista, por ejemplo, más bajo al menos 5 veces (por ejemplo, al menos 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 104, 105, 106, 107 veces o más) en comparación con un nivel de control indica que el antagonista es efectivo en la prevención de una infección por MERS-CoV. Por ejemplo, un nivel de control es el título viral o el nivel de ARN de un roedor infectado con MERS-CoV que no fue tratado con el antagonista.
En algunas modalidades, los niveles de ARN viral en un pulmón de roedor se pueden determinar al extraer ARN del pulmón de roedor mediante homogeneización en una solución que contiene fenol, por ejemplo, una solución que contiene fenol e isotiocianato de guanidinio (por ejemplo, Trizol® (Life Technologies, Inc)). Por ejemplo, el pulmón se puede homogeneizar mediante el uso de un Magnalyzer (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas modalidades, los niveles de ARN de MERS-CoV se pueden evaluar mediante el uso de PCR cuantitativa (qPCR) con el uso de cebadores que se dirigen al genoma de MERS-CoV y/o cebadores que se dirigen al transcrito de ARNm de MERS-CoV. Por ejemplo, la mezcla maestra de una sola etapa del virus Taqman® Fast (Applied Biosystems) se puede usar en qPCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante mediante el uso de un dúplex de cebadores obtenidos de Life Technologies que se dirigen a una región del genoma aguas arriba del gen de la envoltura (UpE) o la secuencia líder del ARN mensajero de la nucleocápside (cebador líder), y se compara con un control endógeno, tal como el ARNr 18S de roedor (por ejemplo, ratón). Por ejemplo, las reacciones de qPCR en placas de reacción óptica rápida Microamp® (Applied Biosystems) se pueden leer en un instrumento de PCR en tiempo real 7500 Fast DX (Applied Biosystems). En algunos ejemplos, los datos de qPCR se pueden analizar mediante el método delta Ct, con un control no infectado establecido en 1. Por ejemplo, el por ciento de ARN de MERS-CoV detectado puede expresarse en relación con los niveles de ARN detectados en ratones infectados tratados con un antagonista de control, por ejemplo, anticuerpos de control del mismo isotipo, en los casos en los que el antagonista es un anticuerpo contra MERS-CoV.
En algunas modalidades, el título viral en un pulmón de roedor se puede determinar homogeneizando el pulmón de roedor en un tampón (por ejemplo, tampón fosfato salino (PBS)), centrifugado (por ejemplo, a 10 000 rpm). El sobrenadante puede analizarse mediante ensayo de placa en células de mamífero, tales como células Vero (por ejemplo, células Vero E6) para cuantificar los niveles de virus que quedan después del tratamiento con un antagonista. Puede usarse un ensayo de placa estándar, por ejemplo, un ensayo de placa descrito en Page y otros, (2012) Induction of alternatively activated macrophages enhances pathogenesis during severe acute respiratory syndrome coronavirus infection, J Virol 86:13334-13349. En algunos ejemplos, Page y otros, el ensayo de placa se puede modificar dejando las placas durante 3 días para que aparezcan las placas.
En algunas modalidades, menos inflamación (por ejemplo, inflamación intersticial o perivascular), menos células inflamatorias y/o menos manguito bronquiolar, por ejemplo, determinado por análisis histológico, en una muestra de pulmón de un roedor tratado con un antagonista antes o después de la infección por MERS-CoV en comparación con una muestra de pulmón de control puede indicar que el antagonista es efectivo para tratar o prevenir una infección por MERS-CoV. Por ejemplo, una muestra de pulmón de control puede ser de un roedor infectado con MERS-CoV que no está tratado con un antagonista, por ejemplo, no tratado antes y/o después de la infección.
Los roedores descritos en la presente descripción son útiles para la prueba efectiva de fármacos y vacunas para MERS-CoV, por ejemplo, para demostrar la seguridad y eficacia antes de la prueba clínica en humanos. Permiten una rápida identificación y/o validación de terapéuticos/profilácticos, por ejemplo, dentro de varias semanas de la prueba.
Definiciones
Los residuos de aminoácidos homólogos son residuos que comparten características o propiedades similares. Las características o propiedades de un residuo de aminoácido se basan, por ejemplo, en la estructura del esqueleto polipeptídico, por ejemplo, una conformación en forma de hoja o helicoidal, la carga o hidrofobicidad del residuo y/o el volumen de la(s) cadena(s) lateral(es). Por ejemplo, los residuos homólogos son similares en las propiedades de la cadena lateral, por ejemplo, polaridad, carga, tamaño, aromaticidad y/o hidrofobicidad.
El término "aproximadamente" se refiere a un valor establecido más o menos otra cantidad; estableciendo de esa manera un intervalo de valores. En ciertos aspectos, "aproximadamente" indica un intervalo relativo a un valor base (o principal o de referencia) o una cantidad más o menos hasta 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,75 %, 0,5 %, 0,25 % o 0,1 %. Por ejemplo, aproximadamente se refiere a un
intervalo de /- 5 % por debajo y por encima de los números enumerados, por ejemplo, números de bases de nucleótidos.
El término "unido operativamente", como se usa en la presente descripción, se refiere a posiciones de los componentes así descritos, por ejemplo, secuencias de nucleótidos, que están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada.
Como se usa en la presente descripción, el término "proteína" incluye polipéptidos, péptidos, fragmentos de polipéptidos, y polipéptidos de fusión.
Como se usa en la presente descripción, un "ácido nucleico" se refiere a dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos unidos covalentemente juntos ya sea en forma simple o bicatenaria.
El término "reemplazo" en referencia al reemplazo génico se refiere a colocar material genético exógeno en un locus genético endógeno, reemplazando de esta manera todo o una porción del gen endógeno con una secuencia de ácidos nucleicos ortóloga u homóloga. En un ejemplo, un gen endógeno no humano o un fragmento de este se reemplaza con un gen humano correspondiente o un fragmento de este. Un gen humano correspondiente o un fragmento de este es un gen o fragmento humano que es un ortólogo de, un homólogo de, o es sustancialmente idéntico o igual en estructura y/o función, al gen endógeno no humano o fragmento de este que se sustituye.
Como se usa en la presente descripción, el término "roedor" se refiere a cualquier miembro de la orden Rodentia. Los ejemplos de roedores incluyen, sin limitación, ratones, ratas, ardillas, marmota de las praderas, puerco espín, castores, cobayos, y hámsteres. En una modalidad, un roedor es una rata. En otra modalidad, un roedor es un ratón. A menos que se defina de cualquier otra manera en la presente descripción, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Como se usa en la presente descripción, los términos en singular "un", "una" y "la/el" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera.
Se pretende que cada limitación numérica máxima dada a lo largo de esta descripción incluya cada limitación numérica inferior, como si tales limitaciones numéricas inferiores se escribieran expresamente en la presente descripción. Cada limitación numérica mínima dada a lo largo de esta descripción incluirá cada limitación numérica superior, como si tales limitaciones numéricas superiores se escribieran expresamente en la presente descripción. Cada intervalo numérico dado a lo largo de esta descripción incluirá cada intervalo numérico más estrecho que caiga dentro de un intervalo numérico más amplio, como si tales intervalos numéricos más estrechos se escribieran todos expresamente en la presente descripción.
Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1
Reemplazo del gen Dpp4 de ratón endógeno con un gen DPP4 humano
El gen DPP4 humano de 81,8 kb que contiene del exón 2 al exón 26 y una porción de la región no traducida 3' del gen DPP4 humano reemplazó 78,8 kb del locus del gen Dpp4 murino que abarca desde el exón 2 hasta el codón de parada en el exón 26. Ver
Figuras 1A y 1B.
Se construyó una construcción de transformación para sustituir el gen DPP4 de ratón con el humano en una sola etapa de transformación mediante el uso de la tecnología de ingeniería genética VelociGene® (ver Valenzuela y otros (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). El ADN DPP4 de ratón y humano se obtuvo de los clones RP23-362N15 y r P11-68L22 de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), respectivamente. Brevemente, una construcción de transformación linealizada con SgrDI generada por clonación de reparación de brechas que contiene brazos de homología aguas arriba y aguas abajo de Dpp4 de ratón que flanquean 82 kb de la secuencia de DPP4 humano que se extiende desde el intrón 1 aguas arriba del exón 2 hasta el exón 26, incluido el codón de parada y una porción de la región no traducida 3' (coordenadas genómicas de todo el gen DPP4 humano: GRCh38: chr2: 162,848,755 162,931,052 (cadena -)), y un casete de selección neo flanqueado por sitios loxP, se electroporó en células madre embrionarias (ES) de ratón VGB6 (derivadas de ratones C57BL/6N). Las células ES transformadas correctamente (MAID 7326) se sometieron a electroporación adicional con un vector de expresión transitoria de Cre para eliminar el
casete de selección para fármacos. Los clones de células ES transformadas sin el casete de selección por fármacos (MAID 7327) se introdujeron en un embrión de ratón SW en una etapa de 8 células mediante el método VelociMouse® (ver, las patentes de los Estados Unidos núm. 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, y Poueymirou y otros (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). Los VelociMice® (ratones F0 derivados completamente de la célula Es donante) que portan el gen DPP4 humanizado se identificaron mediante el genotipado para la pérdida del alelo de ratón y la ganancia del alelo humano mediante el uso de una modificación del ensayo de alelos (ver, Valenzuela y otros (2003)).
Los clones de células ES transformadas correctamente se identificaron mediante un ensayo de pérdida de alelos nativos (LONA) (Valenzuela y otros, 2003) en el cual el número de copias del gen de Dpp4 nativo no modificado se determinó mediante dos reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas (qPCR) TaqMan™ específicas para las secuencias en el gen Dpp4 de ratón que se transformaron mediante deleción. Los ensayos de qPCR comprendieron los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'): cebador directo aguas arriba, TCGCCACTGT GCCTAACATA G (SEQ ID NO:1); cebador inverso aguas arriba, CCGGGACTAA ACTGGAACAT TC (SEQ ID NO:2); sonda aguas arriba, FAM-TCAGTCAACT TCTTCTGGGT TGTTTCC-BHQ (SEQ ID NO:3); cebador directo aguas abajo, CAGCTCTGGT GGAGAACTAG AC (SEQ ID NO:4); cebador inverso aguas abajo, GGAGGTCCTC GGTCTTTAGA AG (SEQ ID NO:5); sonda aguas abajo, FAM-TCACACTTAG GCTTATAAAC CATTCCCGT-BHQ (SEQ ID NO:6); en los cuales FAM se refiere a la sonda 5-carboxifluoresceína fluorescente y BHQ se refiere al desactivador de fluorescencia del tipo desactivador de agujero negro (Biosearch Technologies). El ADN purificado a partir de los clones de células ES que han incluido el vector de transformación y lo han incorporado en sus genomas se combinó con mezcla Maestra para la Expresión de Genes TaqMan™ (Life Technologies) de conformidad con las sugerencias del fabricante en una placa de PCR de 384 pocillos (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) y se llevaron a cabo los ciclos en un equipo Prism 7900HT de Applied Biosystems, que recoge los datos de fluorescencia durante el transcurso de las PCR y determina un ciclo umbral (Ct), el ciclo de PCR fraccionario en el que la fluorescencia acumulada alcanza un umbral preestablecido. Las qPCR específicas para DPP4 aguas arriba y aguas abajo y las dos qPCR para los genes de referencia no transformados se ejecutaron para cada muestra de ADN. Se calcularon las diferencias en los valores de Ct (ACt) entre cada qPCR específica para DPP4 y cada qPCR para los genes de referencia, y después se calculó la diferencia entre cada ACt y el ACt promedio para todas las muestras analizadas para obtener los valores de AACt para cada muestra. El número de copias del gen DPP4 en cada muestra se calculó con la siguiente fórmula: número de copias = 2x2'AACt. Un clon transformado correctamente, que ha perdido una de sus copias nativas, tendrá un número de copias del gen Dpp4 igual a uno. La confirmación de que la secuencia del gen DPP4 humano sustituyó la secuencia del gen Dpp4 de ratón delecionada en el alelo humanizado se confirmó mediante el ensayo de qPCR TaqMan™ que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'): cebador directo aguas arriba humano, GCGGTCTCCC TCTTCTAACG (SEQ ID NO:7); cebador inverso aguas arriba humano, GCAAGCCGAG CAGATCAAG (SEQ ID NO:8); sonda aguas arriba humana, FAM-ACTCCCACCT GCAAATCCTG CTGC-BHQ (SEQ ID NO:9); cebador directo aguas abajo humano, AACCGCACTG GCATATGGA (SEQ ID NO:10); cebador inverso aguas abajo humano, TACAAGGTAG TCTGGGATTA CTAACAAAA (SEQ ID NO:11); sonda aguas abajo humana, FAM-ACATTTATCT AGAAAGGCTC-BHQ (SEQ ID NO:12).
El mismo ensayo LONA se usó para analizar el ADN purificado a partir de biopsias de la cola de ratones derivados de las células ES objetivo para determinar sus genotipos de DPP4 y confirmar que el alelo de DPP4 humanizado se trasmite a través de la línea germinal. Dos crías heterocigotas para la sustitución se cruzan para generar un ratón que es homocigoto para la sustitución del gen endógeno Dpp4 de ratón por el gen DPP4 humano. Las crías que son homocigotas para la sustitución se usan para el genotipado.
La unión aguas arriba del locus de Dpp4 murino y la secuencia que contiene el gen DPP4 humano está diseñada para estar dentro de 5'-AGGAGAGAAG CCAACAAGAT CATAAGATCA TGCTCAGGGC CAAAATTCAA GGGCTTCTGC (CGTCGACG) GCCTTAGAGA ACTCCAACTG GCGCACTCCA GACGCCACCC CCACCCCCAG CCCGCGGTCT CCCTCTTCTA ACGCACTCCC ACCTGCAAAT (SEQ ID NO:13), en donde las secuencias de DPP4 humano están en cursiva y el sitio de restricción SgrDI está entre paréntesis. La unión aguas abajo de la secuencia que contiene el gen DPP4 humano y el casete de selección neo flanqueado por sitios loxP está diseñada para estar dentro de 5'-TTATTCCAGG GAACTATGAT GAGGCTTATA TAAGAACGAA TAAGATCAGA AATATCATTC TGGCAGTTCT TATGGCTCAG ctcgag(ataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat) atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg (SEQ ID NO:14), en donde las secuencias de DPP4 humano están en cursiva, las secuencias del casete neo están en minúsculas y el sitio loxP está entre paréntesis. La unión aguas abajo de la secuencia del casete de selección neo flanqueado por sitios loxP y el locus de Dpp4 murino está diseñada para estar dentro de 5'-atgtctgga(a taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tat)gctagta actataacgg tcctaaggta gcgagctagc CAGCATAGCT CTCCATAGCT TATTTAAGAC CACATTTGTT CTCATTATCT CAAAAGTGCA CTGTTAAGAT GAAGATCTTA (SEQ ID NO:15), en donde las secuencias del casete neo están en minúsculas, y el sitio loxP está entre paréntesis. Después de la eliminación del casete de selección neo, la unión de la secuencia que contiene el gen DPP4 humano, el sitio loxP que queda después de la eliminación del casete de selección neo, y el locus de Dpp4 murino están diseñados para estar dentro de 5'- TATTCCAGGG AACTATGATG AGGCTTATATAAGAACGAAT AAGATCAGAA ATATCATTCT GGCAGTTCTT ATGGCTCAG ctcgag(ataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat) gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagcCA GCATAGCTCT CCATAGCTTA TTTAAGACCA CATTTGTTCT CATTATCTCA AAAGTGCACT
GTTAAGATGA AGATCTTAAT AATGTTGCAT TGAGACATTT CAGGCTGCTT TCTCCAGTTT TACACCTGCA ATCCTAACTA AGGATGCCTG TCCCCAGAAC (SEQ ID NO:16), en donde las secuencias de DPP4 humano están en cursiva, las secuencias del casete neo están en minúsculas y el sitio loxP está entre paréntesis.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de DPP4 codificada por la secuencia nucleica de DPP4 humanizado en MAID 7326/7327 (SEQ ID NO: 17) es la misma que la DPP4 humana porque el codón 1 de Dpp4 de ratón, codifica solo los dos primeros aminoácidos de DPP4, Met y Lys, que son los mismos que los codificados por el codón 1 de DPP4 humano.
Ejemplo 2
Infección de Ratones con DPP4 humanizado por MERS-CoV
El coronavirus del Síndrome respiratorio de Oriente Medio: (MERS-CoV) es un virus emergente que causa una enfermedad respiratoria aguda grave. El receptor para MERS-CoV es dipeptidil peptidasa IV (DPP4) (ver Raj y otros, (2013) Dipeptidyl Peptidase 4 is a Functional Receptor for the Emerging Human Coronavirus-EMC, Natuere 495(7440):251-254). La prueba in vivo de moléculas antivirales requiere un modelo animal, por ejemplo, un modelo animal pequeño, tal como un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata), que sea susceptible a la infección por MERS-CoV. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que Dpp4 de ratón no puede soportar la infección por MERS-CoV (ver, por ejemplo, Cockrell y otros, (2014) Mouse Dipeptidyl Peptidase is Not a Functional Receptor for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) Infection, J. Virol. 88(9):5195-5199; y Coleman y otros, (2014) Wild-Type and Innate Immune-Deficient Mice are Not Susceptible to the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, J. Gen. Virol. 95(2):408-412), al menos en parte porque la proteína espicular de MERS-CoV interactúa con la DPP4 humana, pero no con la de ratón (ver, por ejemplo, Coleman y otros, (2013); y Raj y otros, (2013)). La comparación de secuencias de las secuencias de DPP4 de ratón y humana reveló que los aminoácidos que se han identificado previamente como sitios de contacto entre la proteína espicular (S) de MERS-CoV y su receptor difieren entre las dos especies. Además, la expresión de DPP4 humana en células de ratón permite la entrada y propagación del virus MERS-CoV, lo que indica que la entrada del virus es la etapa limitante en la infección de células de ratón y que la falta de interacción entre DPP4 de ratón y la glicoproteína de MERS-CoV define el tropismo de especie in vitro.Véase, por ejemplo, Lu y otros, (2013) Molecular basis of binding between novel human coronavirus MERS-CoV and its receptor Cd26, Nature. 500(7461):227-31; y Cockrell y otros, (2014) Mouse Dipeptidyl Peptidase is Not a Functional Receptor for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) Infection, J. Virol.
88(9):5195-5199.
Como consecuencia, no se pueden usar cepas de ratón normales para medir la eficacia de las terapias dirigidas a MERS-CoV. Zhao y otros, (2014) Rapid Generation of a Mouse Model for Middle East Respiratory Syndrome, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111(13):4970-4975 han expresado DPP4 humana en ratones mediante transducción de adenovirus, permitiendo así la infección por MERS-CoV. Sin embargo, este modelo de adenovirus tiene varias limitaciones, que incluyen: (a) el virus se elimina rápidamente de los ratones infectados; (b) hay una pérdida de expresión de DPP4 humana con el tiempo; (c) la distribución tisular de DPP4 transducida viralmente no refleja la expresión observada en ratones o humanos; y (d) la infección por adenovirus induce una respuesta de interferón.
Para generar un modelo de ratón para la infección por MERS-CoV, se generaron ratones con DPP4 humanizado como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Como se muestra en la Figura 1B, los exones 2 a 26 de Dpp4 de ratón fueron reemplazados por las correspondientes secuencias de DPP4 humano. Debido al exón 1 restante de Dpp4 de ratón que codifica solo los dos primeros aminoácidos de Dpp4, Met y Lys, que son los mismos que los correspondientes en el exón 1 de DPP4 humano, la proteína DPP4 expresada en ratones con DPP4 humanizado es completamente humana (ver Figura 2, SEQ ID NO: 17). Así, los ratones con DPP4 humanizado expresan una DPP4 completamente humana bajo el control de las secuencias reguladoras endógenas de ratón, es decir, la región flanqueante 5' (promotor y potenciador(es)) y las secuencias de la región no traducida 3'. Se espera que la DPP4 humanizada se exprese en las mismas células y tejidos, y en niveles iguales o similares, como la Dpp4 de ratón se expresa en ratones de tipo salvaje que carecen de secuencias de ácido nucleico de DPP4 humano.
Dos ratones F0 con DPP4 humanizado se infectaron por vía intranasal con MERS-CoV (cepa Jordan) o se trataron de manera simulada con PBS. Cuatro días después de la infección, se cuantificó el ARN de MERS-CoV en los pulmones mediante PCR en tiempo real mediante el uso de cebadores específicos para la forma replicativa del genoma de MERS-CoV. Los datos se normalizaron a la cantidad de producto de PCR obtenido de los pulmones de los ratones infectados de manera simulada (establecido arbitrariamente en 1). La Figura 3 muestra que el ARN de MERS-CoV podría amplificarse a partir de los pulmones de los ratones con DPP4 humanizado infectados con MERS-CoV. La tinción con H&E también se realizó mediante el uso de tejido pulmonar de ratones infectados con MERS-CoV y simulados. La Figura 4 muestra que la infección por MERS-CoV de ratones con DPP4 humanizado no afectó las vías respiratorias, pero dio como resultado un engrosamiento de las paredes de los alvéolos y menos espacio entre las células alveolares, lo que indica inflamación en los pulmones asociada a la infección por MERS-CoV.
Además, se inocularon ratones de 6 a 8 semanas de edad por vía intranasal con MERS-CoV, por ejemplo, 2 x 105 pfu de MERS-CoV (Jordan). No se observó mortalidad ni signos clínicos de enfermedad hasta el día 4 después de la inoculación. Los días 2 y 4 después de la inoculación, los ratones se sacrificaron y se disecaron sus pulmones. Para obtener los niveles de ARN del virus, se homogeneizaron los pulmones en Trizol®, se extrajo el ARN y se analizaron mediante PCR en tiempo real mediante el uso de cebadores específicos para MERS-CoV (Figuras 10A y 10B). Un conjunto de cebadores era específico para una región del genoma viral aguas arriba del gen de la envoltura (UpE), y otro conjunto de cebadores era específico para la secuencia líder del ARNm de la nucleocápside (cebador líder). Se usó ARNr 18S de ratón como control endógeno.
Para obtener títulos de virus, los pulmones se homogeneizaron en tampón fosfato salino (PBS), se clarificaron mediante centrifugación y se titularon en células Vero E6 (Figura 10C). Por ejemplo, el sobrenadante se analizó mediante un ensayo de placa en células VeroE6 para cuantificar los niveles de virus presentes en los pulmones. Por ejemplo, los ensayos de placa se realizaron como se describe en Page y otros, (2012) Induction of alternatively activated macrophages enhances pathogenesis during severe acute respiratory syndrome coronavirus infection, J Virol 86:13334-13349, dejando las placas durante 3 días para que aparezcan las placas.
La replicación robusta de MERS-CoV en los pulmones fue evidente a los 2 y 4 días después de la infección. La cuantificación del ARN, mediante el uso de un conjunto de cebadores específico para el líder de MERS-CoV, que fue diseñado para amplificar solo el MERS-CoV replicante, demostró niveles altos de ARN replicante del MERS-CoV en los pulmones recolectados el día 2, y estos niveles se mantuvieron hasta el día 4 después de la infección (Figuras 10A-B). El ensayo de placa de homogeneizado de pulmón en células Vero E6 cuantificó los niveles de MERS-CoV (Jordan) de ~7,27x104 pfu/ml de pulmón el día 2 y ~3,75x105 pfu/ml de pulmón 4 días después de la infección (Figura 10C), lo que demuestra la replicación activa de MERS-CoV en los pulmones de los ratones infectados con DPP4 humanizado.
Además, los pulmones de ratones con DPP4 humanizado inoculados por vía intranasal con MERS-CoV (cepa Jordan) o PBS (simulación de infección) se analizaron para detectar cambios patológicos (Figura 10D). En el día 2 después de la infección, la inflamación peribronquiolar era evidente con alteraciones en la estructura de las células bronquiolares encontradas en todos los pulmones. En este momento se observó una mínima inflamación perivascular o efectos sobre las estructuras alveolares. A los 4 días después de la infección se observó infiltración intersticial con manguitos perivasculares y engrosamiento alveolar extenso. También se presentaron alteraciones bronquiolares. Ver la Figura 10D.Esta patología es consistente con los hallazgos radiográficos de desarrollo de neumonía intersticial y enfermedad pulmonar significativa observada en humanos con MERS-CoV.
Los datos anteriores muestran que los ratones con DPP4 humanizado, tal como los descritos en la presente descripción, son susceptibles a la infección por MERS-CoV. Los datos también demuestran que los ratones con DPP4 humanizado descritos en la presente descripción son un modelo in vivo de infección por MERS-CoV que recapitula la patología, por ejemplo, secuelas patológicas, que se observa en la infección por MERS-CoV de humanos.
Así, los ratones con DPP4 humanizado son un modelo robusto de MERS-CoV que es útil para evaluar el tratamiento de MERS-CoV in vivo. Por ejemplo, los ratones con DPP4 humanizado son animales hospedadores apropiados para medir la farmacocinética, la farmacodinámica y la eficacia terapéutica de las moléculas terapéuticas que se dirigen a MERS-CoV.
La Figura 5 muestra una alineación de la secuencia de proteínas de Dpp4 de ratón (SEQ ID NO: 25) y DPP4 humana (codificada por los ratones transgénicos 7326/7327) (SEQ ID NO: 26).
A continuación, se realizó un estudio de dosis-respuesta del peso en función del tiempo después de la infección de MERS-CoV en ratones con DPP4 humanizada. Los ratones se infectaron con MERS-CoV (cepa Jordan) o PBS (simulación de infección) como se describió anteriormente y se analizaron para determinar la pérdida de peso, que es un signo de infección productiva, durante un período de siete días. Como se muestra en la Figura 14, los ratones con DPP4 humanizada presentaron una infección productiva (es decir, patología de la enfermedad manifestada), con la pérdida de peso comenzando a los 4 días después de la infección. Se usaron de cuatro a cinco ratones por grupo. La Figura 15 muestra que los ratones que eran heterocigóticos para el alelo de DPP4 humanizada eran igualmente susceptibles a la infección por MERS-CoV, ya que presentaban un grado similar de pérdida de peso en comparación con los homocigotos. Este hallazgo es significativo porque indica que se pueden realizar estudios con ratones heterocigotos. Además, el uso de ratones heterocigotos evita cualquier problema potencial relacionado con la inactivación de Dpp4 de ratón funcional que podrían estar presentes en ratones con DPP4 humanizada homocigotos.
Los pulmones de estos ratones también se examinaron histológicamente en busca de inflamación de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Como se muestra en la Figura 16, los ratones hDPP4 expuestos a una dosis alta de virus (1 x 10exp6 pfu/ratón) mostraron un aumento de la patología en relación con los controles de PBS.
Ejemplo 3
Generación de ratones transgénicos que contienen al gen DPP4 humano mediante el uso de inserción aleatoria de BAC
Se generaron ratones transgénicos que contienen el gen DPP4 humano, para el cual la secuencia y la información genómica se muestra en la Figura 6. Se usaron dos BAC superpuestos diferentes que contienen el gen DPP4 humano: BAC RP11-68L22 y BAC RP11-345J9 (Figura 7). Ambos BAC contenían la región codificante del gen DPP4 humano, así como también más de 40 kb de la región promotora aguas arriba del codón de inicio ATG del gen DPP4 y varias kilobases aguas abajo del codón de terminación del gen DPP4 (Figura 7).
Para generar los ratones transgénicos con BAC, cada ADN de BAC se sometió a electroporación en células madre embrionarias (ES) de ratón VGB6 (derivadas de ratones C57BL/6N). Las células madre embrionarias que contienen la región codificante del gen DPP4 humano, así como también las regiones promotoras del gen, se introdujeron en un embrión de ratón SW en estadio de 8 células mediante el embrión de ratón SW mediante el método VelociMouse® (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442 y Poueymirou y otros, (2007) f0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99).
Se usaron ensayos de ganancia de alelos humanos para seleccionar clones de células ES en busca de copias que contenían el gen DPP4 junto con regiones promotoras del gen. También se utilizaron ensayos de ganancia de alelos humanos para identificar VelociMice® (ratones F0 totalmente derivados de la célula ES donante) que llevan el gen DPP4 humanizado junto con regiones promotoras del gen.
Brevemente, se extrajo ADN genómico de clones de células ES mediante el uso de métodos estándar y se probó en un ensayo de PCR cuantitativa (qPCR) TaqMan™ con el uso de dos conjuntos de sondas de cebadores para detectar una secuencia de ADN humano aguas arriba (7333 hTU) y aguas abajo (7333 hTD) de la secuencia de codificante de DPP4 humano (Figura 8). Las ubicaciones dentro del gen DPP4 humano y regiones flanqueantes (por ejemplo, regiones promotoras) en las que cada conjunto de cebador-sonda hibrida se muestran la Figura 7. Una lectura fluorescente por encima del fondo en el ensayo qPCR TaqMan™ indicó la presencia del gen DPP4 humano y al menos 40 kb de la región flanqueante 5' del gen DPP4 humano que se había integrado en el genoma del ratón transgénico.
El conjunto de sonda-cebador de hTU 7333 (escrito de 5' a 3') era: cebador directo aguas arriba humano, T GGCTT ATT CT CT ATTCCT CACCT A (SEQ ID NO: 18); sonda aguas arriba humana, FAM-TGCTTTCCCTCCTCCCTTCTGA-BHQ (SEQ ID NO: 19); cebador inverso aguas arriba humano, GGCCTTAGCCCAGAAACTG (SEQ ID nO: 20). El conjunto de sonda-cebador de hTD 7333 (escrito de 5' a 3') era: cebador directo aguas abajo humano, TGCAGACTTGTCTTGACATTCATA (SEQ ID NO: 21); sonda aguas abajo humana, CAL-AGCCTCTGCAGACACAGGAATGGC-BHQ (SEQ ID NO: 22); y cebador inverso aguas abajo humano, TCTGGGCACTGGTGTACTC (SEQ ID NO: 23); en el que FAM y CAL se refieren a las sondas fluorescentes 5-carboxifluoresceína y CAL Orange, respectivamente, y BHQ se refiere al desactivador de fluorescencia del tipo desactivador de agujero negro (Biosearch Technologies).
Por ejemplo, el ADN genómico de los clones de células ES se combinó con mezcla Maestra para la Expresión de Genes TaqMan™ (Life Technologies) de conformidad con las sugerencias del fabricante en una placa de PCR de 384 pocillos (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) y se llevaron a cabo los ciclos en un equipo Prism 7900HT de Applied Biosystems, que recoge los datos de fluorescencia durante el transcurso de las PCR y determina un ciclo umbral (Ct), el ciclo de PCR fraccionario en el que la fluorescencia acumulada alcanza un umbral preestablecido. Las qPCR específicas para DPP4 aguas arriba y aguas abajo y las dos qPCR para los genes de referencia que no son DPP4 se ejecutaron para cada muestra de ADN. Se calcularon las diferencias en los valores de Ct (ACt) entre cada qPCR específica para DPP4 y cada qPCR para los genes de referencia, y después se calculó la diferencia entre cada ACt y el ACt promedio para todas las muestras analizadas para obtener los valores de AACt para cada muestra. El número de copias del gen DPP4 en cada muestra se calculó con la siguiente fórmula: número de copias = 2x2'AACt. Un clon que contiene al menos una copia del DPP4 humano más regiones promotoras integradas en el cromosoma tenían un número de copias del gen DPP4 igual o mayor que uno.
Se usó el mismo ensayo de ganancia de alelos humanos para evaluar el ADN purificado de las biopsias de la cola de los ratones derivados de las células ES para confirmar que el alelo de DPP4 humanizado junto con las regiones flanqueantes 5' humanas se transmitieron a través de la línea germinal.
Mediante el uso de los métodos de selección e inserción de BAC descritos en la presente descripción, se confirmaron dos ratones transgénicos con ADN que codifica la DPP4 humana. Se usó BAC RP11-68L22 para generar clones de células ES y ratones transgénicos denominados MAID 7333, y se usó BAC RP11-345J9 para generar clones de células ES y ratones transgénicos denominados MAID 7334.
La proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico de DPP4 humanizado en los ratones MAID 7333 y 7334 tenía la secuencia de aminoácidos que se muestra en la Figura 9 (SEQ ID NO: 24), que es la misma que la DPP4 humana (codificada por el transcrito, NM_001935.3).
Ejemplo 4
Tratamiento de Ratones con DPP4 Humanizado que fueron infectados con el virus MERS-CoV
Los ratones transgénicos con el gen DPP4 humanizado y las regiones promotoras flanqueantes se probaron para determinar su capacidad para ser infectados por MERS-CoV y para servir como un modelo para evaluar moléculas terapéuticas para tratar o prevenir MERS-CoV.
Se trataron ratones transgénicos MAID 7333 (por ejemplo, generados mediante los métodos descritos en el Ejemplo 3) con 200 |jg de anticuerpos dirigidos contra la proteína espicular de MERS-CoV o controles de isotipo mediante inyección intraperitoneal (ip). Un día después de la inyección de anticuerpos, los ratones se infectaron por vía intranasal con MERS-CoV. Cuatro días después de la infección, se recolectaron los pulmones de los ratones y se midieron los niveles de ARN viral mediante el uso de PCR en tiempo real (RT-PCR). En particular, se midieron los niveles del ARN genómico (UpE) o ARN replicante (líder) (específico para la forma replicativa del genoma de MERS-CoV) de MERS-CoV.
Los datos de RT-PCR se muestran en la siguiente tabla.
El tratamiento de ratones transgénicos con los anticuerpos redujo los niveles de ARN viral (tanto UpE como Líder) en aproximadamente 50 veces a aproximadamente 500 veces.
Los datos descritos en la presente descripción muestran que los ratones transgénicos generados por métodos de integración dirigida (Ejemplo 1) y métodos de inserción aleatoria de BAC (Ejemplo 3) con DPP4 humano fueron susceptibles a la infección por MERS-CoV. Además, los anticuerpos anti-MERS-CoV bloquearon la infección en los ratones transgénicos in vivo. Por tanto, los ratones transgénicos con DPP4 humana (por ejemplo, generados mediante los métodos descritos en la presente descripción) son útiles para evaluar la eficacia de agentes terapéuticos (por ejemplo anticuerpos) que se dirigen al virus MERS-CoV.
Ejemplo 5
Efectos profilácticos de los anticuerpos anti-MERS-CoV sobre la infección por MERS-CoV en ratones con DPP4 humanizado
Los ratones con DPP4 humanizado descritos en la presente descripción se usaron para evaluar la capacidad profiláctica de los dos anticuerpos monoclonales in vivo. Los ratones se inyectaron i.p. con un intervalo de dosis de anticuerpos anti-MERS-CoV de 200 jg, 20 jg o 2 jg de anticuerpo anti-proteína espicular de MERS-CoV 2 (Ab 2), anticuerpo anti-proteína espicular de MERS-CoV 4 (Ab 4), o 200 jg de anticuerpo de control de isotipo IgG1 humana (hIgGI) 24 horas antes de la infección intranasal con 1x105 pfu de MERS-CoV (cepa Jordan). Ab 2 y Ab 4 eran anticuerpos de anti-proteína espicular de MERS-CoV completamente humanos. El ARN se extrajo de los pulmones del ratón y se analizó mediante PCR cuantitativa como se describió anteriormente. Por ejemplo, los datos de qPCR se analizaron mediante el uso del método delta Ct, con un control no infectado establecido en 1. El por ciento de ARN de MERS-CoV detectado se expresó en relación con los niveles de ARN detectados en ratones infectados tratados con los anticuerpos de control de isotipo coincidente (Figuras 11A-B). Además, se determinaron los títulos virales de pulmones de ratón como se describió anteriormente.
Ambos anticuerpos redujeron significativamente los niveles de ARN específico de MERS-CoV en los pulmones en más de 2 logaritmos a la dosis de 200 jg por ratón, en comparación con el anticuerpo de control de isotipo coincidente (Figuras 11A-B). El Ab 2 fue más efectivo para reducir los niveles de ARN de MERS-CoV a la dosis de 20 jg en comparación con el Ab 4 a la misma dosis. La dosificación de 2 jg de cualquiera de los anticuerpos fue ineficaz para reducir los niveles de ARN viral en comparación con los ratones tratados con el control de isotipo. Cuando se analizó el título de MERS-CoV en los pulmones (Figura 11C), tanto la dosis de 200 jg como la de 20 jg
de Ab 2 redujeron los niveles de virus hasta cerca del nivel de detección en el ensayo (2x103 pfu/ml). El Ab 4 fue igualmente eficiente a la dosis de 200 |jg que el Ab 2, mientras que las dosis de 20 |jg y 2 |jg mostraron una inhibición dependiente de la dosis de la inhibición viral. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-MERS-CoV, por ejemplo, Ab 2 y Ab 4, bloquearon efectivamente la infección por MERS-CoV in vivo.
El análisis histológico también se realizó 4 días después de la infección en pulmones de ratones tratados 24 horas antes de la infección con Ab 2, Ab 4 o anticuerpo de control de isotipo hIgGI (Figura 12A). Por ejemplo, los grados de inflamación intersticial, peribronquiolar y perivascular se puntuaron de 0 a 5. También se analizaron otras características histológicas, como la presencia de daño alveolar y epitelial bronquiolar, cambios pleurales y la extensión de la inflamación peribroncovascular. Se promedió una puntuación inflamatoria general para cada ratón para cada grupo experimental, y las puntuaciones se presentaron como puntuaciones promedio de todos los ratones en cada grupo y punto de tiempo (Figura 12B).
Los pulmones de ratones pretratados con control de isotipo hIgGI mostraron una patología pulmonar significativa con aumento de la inflamación intersticial, manguitos perivasculares y engrosamiento de los tabiques alveolares. Los ratones tratados con 200 jg de Ab 2 o Ab 4 tenían una inflamación reducida con focos mínimos de células inflamatorias en el intersticio, un manguito bronquiolar menor y menos engrosamiento de la pared alveolar. En ratones pretratados con 20 jg de Ab 2 y Ab 4, hubo niveles moderados de manguitos perivasculares e inflamación intersticial en comparación con el grupo de anticuerpos de dosis más alta. El grupo pretratado con 2 jg de anticuerpo tenía una patología similar a la del control de isotipo hIgGI, mostrando una inflamación intersticial significativa y una inflamación perivascular predominante. La puntuación histológica cegada demostró puntuaciones de inflamación reducidas para los ratones tratados (Figura 12B).Estos hallazgos demuestran que los anticuerpos anti-MERS-CoV, tal como Ab 2 y Ab 4, confieren una reducción dependiente de la dosis en la patología pulmonar después de la infección por MERS-CoV, corroborando los niveles de ARN viral y los títulos de virus en los ratones.
Por tanto, los anticuerpos anti-MERS-CoV, tal como Ab 2 y Ab 4, fueron efectivos en un modelo in vivo de infección por MERS-CoV: los anticuerpos bloquearon la infección y la enfermedad por MERS-CoV in vivo cuando se inyectan antes de la infección, por ejemplo, 1 día antes de la infección.
Ejemplo 6
Tratamiento con anticuerpos de ratones con DPP4 humanizado que han sido infectados con MERS-CoV
Para determinar el efecto terapéutico (por ejemplo, capacidad para inhibir la replicación de MERS-CoV y la patología pulmonar después de la infección) de anticuerpos anti-MERS-CoV (por ejemplo, Ab 2 o Ab 4), se infectaron con MERS-CoV ratones con DPP4 humanizado. A las 24 horas después de la infección, se inyectó a los ratones por vía i.p. 500 jg de control de isotipo hIgGI o Ab 2 a 500 jg o 200 jg. A los 4 días después de la infección, se sacrificó a los ratones y se analizaron los pulmones de los ratones para determinar el ARN viral, el título del virus y la patología pulmonar. Tanto las dosis de 500 jg como las de 200 jg de Ab 2 redujeron los niveles de ARN viral en aproximadamente 10 veces en los pulmones de los ratones en comparación con los ratones de control tratados con anticuerpos (Figuras 13A-B). Los títulos pulmonares de los mismos ratones demostraron una reducción significativa de los niveles virales en los pulmones, con una reducción de más de 2 logaritmos en el día 4 después de la infección (Figura 13C). Estos datos demuestran que después de la infección, por ejemplo, 24 horas después de la infección, un anticuerpo anti-MERS-CoV (por ejemplo, Ab 2) inhibió significativamente la replicación viral.
El análisis histológico también se realizó en ratones tratados 24 horas después de la infección con anticuerpo de control hIgGI, 500 jg de Ab 2 o 200 jg de Ab 2 (Figuras 14A-B). Los ratones tratados con anticuerpo de control mostraron una patología similar a los controles en los Ejemplos 2 y 5, con inflamación intersticial significativa, manguitos perivasculares y engrosamiento de los tabiques alveolares. Los ratones tratados con 200 jg o 500 jg de Ab 2 tenían una inflamación intersticial mínima con una inflamación perivascular reducida y sólo focal en todos los pulmones. La puntuación histológica cegada demostró puntuaciones de inflamación reducidas para los ratones tratados (Figura 14B). Los datos demuestran que las dosis terapéuticas de anticuerpos anti-MERS-CoV (por ejemplo, Ab 2) redujeron la patología pulmonar inducida por MERS-CoV incluso cuando se administraron después de la infección, por ejemplo, 24 horas después de la infección.
Claims (16)
1. Un roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de un fragmento de un gen Dpp4 endógeno de roedor en un locus de Dpp4 endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde:
dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano;
el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana;
la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor;
el roedor es un ratón o una rata; y
el roedor presenta inflamación pulmonar cuando se infecta con el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV).
2. El roedor de la reivindicación 1, en donde el fragmento del gen DPP4 humano comprende del exón 2 al exón 26 del gen DPP4 humano.
3. El roedor de la reivindicación 2, en donde el roedor es un ratón y el fragmento del gen Dpp4 endógeno de roedor que se reemplaza comprende del exón 2 al exón 26 del gen Dpp4 de ratón.
4. El roedor de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el roedor es un ratón, y en donde el gen DPP4 modificado comprende el exón 1 de Dpp4 endógeno de ratón, unido operativamente al fragmento del gen DPP4 humano.
5. Una célula de roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de un fragmento de un gen Dpp4 endógeno de roedor en un locus de Dpp4 endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde:
dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano;
el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana;
la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor; y
la célula de roedor es una célula de ratón o una célula de rata.
6. La célula de roedor de la reivindicación 5, en donde la célula es una célula madre embrionaria.
7. La célula de roedor de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde el fragmento del gen DPP4 humano comprende del exón 2 al exón 26 del gen DPP4 humano; y opcionalmente el fragmento del gen Dpp4 endógeno de roedor que se reemplaza comprende del exón 2 al exón 26 del gen Dpp4 de roedor.
8. La célula de roedor de cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde la célula de roedor es una célula de ratón, y en donde el gen DPP4 modificado comprende el exón 1 de Dpp4 endógeno de ratón, unido operativamente al fragmento del gen DPP4 humano.
9. Un embrión de roedor cuyo genoma comprende un reemplazo de un fragmento de un gen Dpp4 endógeno de roedor en un locus de Dpp4 endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde:
dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano;
el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana;
la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor;
el embrión de roedor es un embrión de ratón o de rata, y
un roedor derivado de dicho embrión de roedor presenta inflamación pulmonar cuando se infecta con MERS-CoV.
10. El embrión de roedor de la reivindicación 9, en donde:
(a) el fragmento del gen DPP4 humano comprende del exón 2 al exón 26 del gen DPP4 humano; y opcionalmente el fragmento del gen Dpp4 endógeno de roedor que se reemplaza comprende del exón 2 al exón 26 del gen Dpp4 de roedor; y/o
(b) el embrión de roedor es un embrión de ratón, y en donde el gen DPP4 modificado comprende el exón 1 de Dpp4 endógeno de ratón, unido operativamente al fragmento del gen DPP4 humano.
11. Un método para obtener el roedor de la reivindicación 1, que comprende reemplazar un fragmento de un gen Dpp4 endógeno de roedor en un locus de Dpp4 endógeno de roedor con un fragmento de un gen DPP4 humano para formar un gen DPP4 modificado, en donde:
dicho fragmento de un gen DPP4 humano comprende al menos un exón del gen DPP4 humano;
el gen DPP4 modificado codifica una proteína DPP4 humana;
la expresión del gen DPP4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de Dpp4 endógeno de roedor;
el roedor es un ratón o una rata; y
el roedor presenta inflamación pulmonar cuando se infecta con MERS-CoV.
12. El método de la reivindicación 11, en donde:
(a) el fragmento del gen DPP4 humano comprende del exón 2 al exón 26 del gen DPP4 humano; y opcionalmente el fragmento del gen Dpp4 endógeno de roedor que se reemplaza comprende del exón 2 al exón 26 del gen Dpp4 de roedor; y/o
(b) el roedor es un ratón, y en donde el gen DPP4 modificado comprende el exón 1 de Dpp4 endógeno de ratón, unido operativamente al fragmento del gen DPP4 humano.
13. Un método para identificar un antagonista de DPP4 para tratar o prevenir uno o más síntomas de MERS-CoV, el método comprende:
(a) administrar al roedor de cualquier de las reivindicaciones 1 a 4 un antagonista de DPP4, en donde el roedor está infectado con el coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV); y (b) determinar si el antagonista de DPP4 trata o previene uno o más síntomas de la infección por MERS-CoV en comparación con los roedores de control infectados con MERS-CoV a los que no se les ha administrado el antagonista de DPP4.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el antagonista de DPP4 es un anticuerpo contra una proteína de MERS-CoV, tal como la proteína espicular de MERS-CoV.
15. Uso del roedor de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para identificar un agente terapéutico o profiláctico para MERS-CoV.
16. El uso de la reivindicación 15, en donde el antagonista de DPP4 es un anticuerpo contra una proteína de MERS-CoV, tal como la proteína espicular de MERS-CoV.
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