CN109022489B - 人dpp4基因敲入的小鼠模型、其产生方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基因组中敲入了人DPP4基因的小鼠、其产生方法和用途。具体而言，本发明在不改变小鼠DPP4功能的情况下，将人DPP4准确插入到小鼠基因组中安全港基因座处，建立了在小鼠安全港基因座处人DPP4基因纯合的新型敲入小鼠模型。本发明还提供了所述在基因组中敲入了人DPP4基因的小鼠模型的用途，用于在BSL‑3设施中使用低剂量MERS‑CoV真病毒感染所述小鼠并评估抗MERS‑CoV的抗病毒剂和疫苗的体内功效，或者在缺乏BSL‑3设施的生物实验室中使用假型MERS‑CoV病毒感染所述小鼠并评估抗病毒剂和疫苗的体内功效。
Description
技术领域：
本发明涉及基因组中敲入了人二肽基肽酶4(hDPP4)基因的小鼠、其产生方法和用途。具体地，本发明在不改变小鼠二肽基肽酶4(mDPP4)功能的情况下，将hDPP4基因准确插入到小鼠基因组中安全港(safe harbor)基因座处，建立了在小鼠安全港基因座处hDPP4基因纯合的新型敲入小鼠模型。所述hDPP4基因敲入小鼠是遗传稳定的，能够在生物安全水平-3(biosafety level-3；BSL-3)设施中使用低剂量MERS-CoV真病毒感染所述小鼠并评估抗MERS-CoV的抗病毒剂和疫苗的体内功效，也能够在缺乏BSL-3设施的生物实验室中使用假型MERS-CoV病毒感染所述小鼠并评估抗病毒剂和疫苗的体内功效。
背景技术
大多数感染人类的冠状病毒引起轻度的上呼吸道疾病，但是，2012年6月在中东地区出现的一种与人类严重呼吸系统疾病相关的新型β冠状病毒－中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus(MERS-CoV))(Zaki AM等人，Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia.NEngl J Med，367(19):1814–1820(2012))引起严重的下呼吸道疾病，使患者短期内快速进展为呼吸衰竭。根据WHO的报告，MERS-CoV病毒是冠状病毒科生物安全水平三级(BSL-3)病毒。自2012年9月在沙特阿拉伯首次分离出MERS-CoV病毒以来，在27个国家中已经导致2121例实验室确诊的人类感染病例，其中包括740例相关的死亡病例(约35％死亡率)(参见http://www.who.int/emergencies/mers-cov/en/)。
MERS-CoV病毒的流行病学趋势不同于与其基因学上密切相关的重症急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndromes coronavirus(SARS-CoV)。SARS-CoV病毒自2005年以来没有进一步的病例报导(L.Du等人,Recombinant receptor-bindingdomain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian,insect and E.colicells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity.Virology393,144-150(2009))，但是，感染MERS-CoV病毒的病例和受感染国家却一直在持续增加。流行病学研究表明，防止MERS-CoV病毒潜在的流行病学状况将是一场漫长且艰难的战斗(G.Zhao等人,A safe and convenient pseudovirus-based inhibition assay todetect neutralizing antibodies and screen for viral entry inhibitors againstthe novel human coronavirus MERS-CoV.Virology journal 10,266(2013))。不幸的是，迄今为止尚无临床批准的针对MERS-CoV病毒的抗体、化学药物或疫苗。
本领域迫切需要模拟由MERS-CoV病毒感染引起的人类发病的临床前动物模型，用来开发针对MERS-CoV病毒的疫苗和疗法。
已在几种动物物种，例如，野生型和先天性免疫缺陷小鼠、叙利亚仓鼠、雪貂和非人灵长类动物中分别评估了所述动物对MERS-CoV病毒的易感性。结果发现，仅非人灵长类动物模型(例如，恒河猴和绒猴)对MERS-CoV病毒是易感的。其他小动物，例如小鼠，对MERS-CoV天然不易感。但是，使用对MERS-CoV天然易感的非人灵长类动物模型来评估抗MERS-CoV的抗病毒剂和疫苗的体内功效成本较高、操作繁琐，制约了这些非人灵长类动物模型在实验中大规模使用。
另外，由于MERS-CoV病毒是生物安全水平三级(BSL-3)病毒，为了保护实验室工作人员和医护人员不被感染、防止该病原微生物扩散出实验室等，必须在生物安全级别至少为BSL-3的设施中操作MERS-CoV病毒。目前，中国仅有少量的BSL-3实验室，其有限的空间和昂贵的运营成本不能满足候选抗病毒剂和疫苗高通量筛选的需求，从而严重限制了抗MERS-CoV病毒剂和疫苗的研发。因此，建立一个经济实用的对MERS-CoV病毒易感的小动物模型是非常必要的，优选地，所述小动物模型不仅能在BSL-3设施的生物实验室中、也能在缺乏BSL-3设施的生物实验室中用来评估抗病毒剂和疫苗的体内功效。
现有技术中已经报道了几种能够感染MERS-CoV病毒的小鼠模型。例如，J.Zhao等人(Rapid generation of a mouse model for Middle East respiratorysyndrome.Proceedings of the National Academy of Sciences 111,4970-4975(2014))报导了将表达人二肽基肽酶4(hDPP4)基因的重组腺病毒载体(Ad-hDPP4)转导入BALB/c小鼠后，该小鼠变得对MERS-CoV病毒易感。但是，所述小鼠模型仅短暂感染MERS-CoV病毒，且不表现出在人类中出现的致命疾病。K.Li等人(Middle East respiratory syndromecoronavirus causes multiple organ damage and lethal disease in micetransgenic for human dipeptidyl peptidase 4.The Journal of infectiousdiseases 213,712-722(2015))报导了在细胞角蛋白18启动子的控制下表达hDPP4蛋白的hDPP4转基因小鼠。所述hDPP4转基因小鼠对MERS-CoV病毒易感并发展为致命疾病，但致死性主要是由于MERS-CoV病毒在hDPP4转基因小鼠中引起脑炎发展而引起的，不像在人类中MERS-CoV病毒感染引起呼吸衰竭。通过CRISPR/Cas9基因编辑策略建立的突变小鼠DPP4基因(mDPP4基因)的小鼠模型或用hDPP4基因取代mDPP4基因的小鼠模型(A.S.Cockrell等人,A mouse model for MERS coronavirus-induced acute respiratory distresssyndrome.Nature microbiology 2,16226(2017)；K.Li等人,Mouse-adapted MERScoronavirus causes lethal lung disease in human DPP4 knockin mice.Proceedingsof the National Academy of Sciences 114,E3119-E3128(2017))可被高滴度的MERS-CoV毒株感染，另外，所述小鼠模型更容易受到MERS–CoV的小鼠适应毒株感染。
由于小鼠DPP4基因对小鼠体内的正常葡萄糖稳态是关键的(A.-M.Lambeir等人,Dipeptidyl-peptidase IV from bench to bedside:an update on structuralproperties,functions,and clinical aspects of the enzyme DPP IV.Criticalreviews in clinical laboratory sciences 40,209-294(2003))，并且在免疫系统中发挥重要作用(L.Simeoni等人,Human CD26 expression in transgenic mice affectsmurine T-cell populations and modifies their subset distribution.Humanimmunology 63,719-730(2002))，在小鼠模型中改变小鼠DPP4基因序列或者将小鼠DPP4基因替换为人DPP4基因潜在地会改变小鼠DPP4基因的功能，并预期会影响小鼠体内的糖代谢或免疫系统的功能。
因此，现有技术中报导的受MERS-CoV病毒感染的小鼠模型不是能够很好地模拟由MERS-CoV病毒感染引起的人类发病的理想的小动物模型、且现有技术中也没有报导能够感染MERS-CoV病毒的小鼠模型是否能够在缺乏BSL-3设施的生物实验室中被假型MERS-CoV病毒感染。本领域还需要开发出不依赖于BSL-3设施的、模拟MERS-CoV病毒引起的人类疾病进展的、能够用于药物评价的小动物模型。本发明的小鼠模型采用人DPP4基因定点插入设计，克服了现有技术中存在的转基因动物模型不稳定的问题；同时，保留了小鼠DPP4基因的功能，避免了建成的小鼠模型在免疫反应、糖代谢等方面潜在的不利异常反应。据发明人所知，本发明的这种设计目前还未见报道。
发明概述
本发明提供了一种保留mDPP4功能的、hDPP4基因敲入小鼠模型，其能很好地模拟由MERS-CoV病毒感染引起的人类疾病进展，且在缺乏BSL-3设施的生物实验室中使用假型MERS-CoV病毒感染所述小鼠也能很好地模拟由MERS-CoV病毒感染引起的人类疾病进展，是用于评估抗MERS-CoV病毒剂和疫苗的有用小动物模型。
本发明的第一方面涉及一种构建保留mDPP4功能的、hDPP4基因敲入小鼠模型的方法，所述方法包括：(a)在保留小鼠基因组中mDPP4的情况下，向小鼠基因组中的安全港基因座处定点插入hDPP4基因；(b)获得在安全港基因座处hDPP4基因纯合的小鼠；和(c)任选地，获得(b)中在安全港基因座处hDPP4基因纯合的小鼠的后代。不特别地限制所述小鼠的品系，例如，包括但不限于C57BL/6、BALB/c、ICR和KM小鼠等现有技术中已知的小鼠品系。在一个实施方案中，所述安全港基因座选自Rosa26基因座、Hipp11基因座等。又在一个实施方案中，所述方法获得了在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的小鼠，例如，本发明的R26-hDPP4小鼠。
在一个实施方案中，所述定点插入是通过使用在安全港基因座(例如，Rosa26基因座、Hipp11基因座等)处产生双链断裂的核酸酶试剂产生的，优选地，所述核酸酶试剂是转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或CRISPR/Cas系统(例如，CRISPR/Cas9系统)。
又在一个实施方案中，所述步骤(a)包括：
(i)向小鼠的合子中引入CRISPR/Cas系统(例如，CRISPR/Cas9系统)和供体DNA，其中所述CRISPR/Cas系统(例如，CRISPR/Cas9系统)能够在所述小鼠基因组Rosa26基因座的靶位点处引入双链断裂，所述供体DNA包含hDPP4基因；
(ii)将获自(i)的各合子分别导入代孕鼠中妊娠，由代孕鼠产下后代；
其中所述合子、代孕鼠可以来自任何小鼠品系。在实施方案中，所述合子来自C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠、ABI小鼠等，代孕鼠来自KM小鼠、ICR小鼠等；
(iii)将代孕鼠产下的后代中经鉴定为hDPP4阳性的小鼠作为首建鼠，并将首建鼠与合子的来源背景鼠品系交配繁育(例如，将雌性首建鼠与合子的来源背景野生型雄鼠交配；或者，将雄性首建鼠与合子的来源背景野生型雌鼠交配)，获得F1子代；
(iv)将F1子代阳性小鼠互交繁育，获得在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的小鼠。
在一个实施方案中，所述向小鼠的合子中引入的CRISPR/Cas系统(例如，CRISPR/Cas9系统)是Cas mRNA(例如，Cas9mRNA)和向导RNA；Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)和向导RNA；或者包含Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)编码基因的表达盒的和/或向导RNA的表达盒的DNA构建体，优选地，所述Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)编码基因有效连接至编码核定位信号的一种或多种多核苷酸。
在一个实施方案中，所述向小鼠的合子中引入的供体DNA是包含hDPP4基因的表达盒；优选地，向小鼠的合子中引入的供体DNA是包含hDPP4基因的打靶载体；更优选地，所述打靶载体包含5’同源臂、剪接受体(SA)、hDPP4基因、增强mRNA稳定性和翻译效率的元件(例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE))、多聚A序列、3’同源臂；最优选地，所述打靶载体包含5’同源臂、剪接受体(SA)、hDPP4基因、内部核糖体进入位点(IRES)序列和/或2A序列、报告基因(例如，tdTomato报告基因)、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、多聚A序列、3’同源臂；其中所述同源臂是与该Rosa26基因座中的基因组序列同源的序列。
在一个实施方案中，所述构建hDPP4敲入的新型小鼠模型的方法在步骤(c)还包括鉴定在安全港基因座(例如，Rosa26基因座)处hDPP4基因纯合的小鼠(例如，R26-hDPP4小鼠)(也称为基因敲入小鼠)的基因型和表型。在一个实施方案中，通过PCR、Sourthern印迹等方式鉴定所述基因敲入小鼠的基因型，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定所述基因敲入小鼠中hDPP4mRNA的表达，和/或通过Western印迹和生物发光成像(BLI)等方式鉴定hDPP4蛋白的表达以及在小鼠体内的分布。
本发明的第二方面涉及通过上述方法构建的hDPP4基因敲入小鼠模型的用途，用于在BSL-3设施中使用MERS-CoV真病毒感染所述hDPP4基因敲入小鼠并评估抗MERS-CoV的抗病毒剂和疫苗的体内功效，例如，评估抗MERS-CoV的抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或治疗性功效，包括通过评估hDPP4基因敲入小鼠的体重、小鼠各组织中的病毒载量、组织病理学评分、和/或通过免疫组织化学分析病毒载量来确定抗病毒剂和疫苗的体内功效。
在一个实施方案中，所述使用MERS-CoV真病毒感染所述hDPP4基因敲入小鼠是通过使用MERS-CoV真病毒鼻内感染hDPP4基因敲入小鼠实施的。
本发明的第三方面涉及通过上述方法构建的hDPP4基因敲入小鼠模型的用途，用于在缺乏BSL-3设施的生物实验室(例如，在BSL-2设施)中使用假型MERS-CoV病毒感染所述hDPP4基因敲入小鼠并评估抗MERS-CoV病毒剂和疫苗的体内功效，例如，评估抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或治疗性功效，包括通过评估hDPP4基因敲入小鼠的假型MERS-CoV病毒载量、通过定量PCR(Q-PCR)、生物发光成像(BLI)检测、组织病理学评分、和/或通过免疫组织化学分析来确定抗病毒剂和疫苗的体内功效。
在一个实施方案中，所述使用假型MERS-CoV病毒感染所述hDPP4基因敲入小鼠是通过将所述假型MERS-CoV病毒以腹膜内途径感染或胸内途径感染hDPP4基因敲入小鼠实施的，优选地，以胸内途径感染hDPP4基因敲入小鼠。
在一个实施方案中，感染所述hDPP4基因敲入小鼠时使用的假型MERS-CoV病毒是通过用包膜基因缺失的HIV骨架质粒和含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒共转染哺乳动物细胞(例如，HEK 293T细胞)并收获细胞培养上清而获得的，优选地，其中所述含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒包含荧光报告基因，例如，Fluc基因、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因以及其它可能的荧光报告基因。
附图简述：
图1.建立R26-hDPP4敲入的小鼠模型。图1A：通过CRISPR/Cas9产生R26-hDPP4敲入小鼠的示意性策略。图1B：对于R26探针，用SpeI分别消化C57BL/6野生型小鼠和R26-hDPP4敲入小鼠的基因组DNA，条带的预期大小分别为8.9kb和14.2kb；对于WPRE探针，用Bgl II分别消化C57BL/6野生型小鼠和R26-hDPP4敲入小鼠F1代的基因组DNA，敲入了hDPP4的阳性条带的预期大小为5.1kb。注：图中1EK5-27、1EK5-29、1EK5-30、1EK5-32代表所检测的四只F1代R26-hDPP4敲入小鼠的实验室编号)。图1C：R26-hDPP4敲入小鼠的PCR基因分型。在hDPP4的编码区中设计引物对(hDPP4正向引物：5'-CTGCAGTACCCAAAGACTGTACGGG-3'(SEQ ID NO:4)；hDPP4反向引物:5'-GACACCTTTCCGGATTCAGCTCACA-3'(SEQ ID NO:5))，且预期的PCR产物为628bp。图1D：R26-hDPP4小鼠和C57BL/6野生型小鼠的肺、脑、心脏、肝、肾、肠中hDPP4mRNA的定量逆转录PCR(RT-qPCR)结果。数值显示为三次独立实验的平均值±SEM，并归一化为相应的Gapdh(甘油醛3-磷酸脱氢酶)水平。图1E：通过在脑和肺中的Western印迹检测hDPP4蛋白。图1F：通过生物发光成像(BLI)显示的hDPP4在新生R26-hDPP4敲入小鼠各器官中的表达。成像的器官是：1.胸腺，2.肝，3.胃，4.肾，5.肠，6.脾，7.心脏，8.肺，9.野生型小鼠全身,和10.R26-hDPP4敲入小鼠全身。
图2.R26-hDPP4敲入小鼠对低剂量的真性MERS-CoV易感。图2A：用真性MERS-CoV病毒分离株hCoV-EMC以1.5x105PFU的低剂量攻击的R26-hDPP4小鼠的体重减轻。在相同的攻毒条件下，图2A的上半部分表示野生型小鼠的体重持续增加，图2A的下半部分表示R26-hDPP4小鼠的体重持续下降，表明野生型小鼠对MERS-CoV病毒感染不敏感，而转基因小鼠对MERS-CoV病毒感染敏感。图2B：在真性MERS-CoV感染后第5天时，检测受攻击的R26-hDPP4小鼠中的肺病毒滴度。检测限(LOD)为0.85PFU。图2C：在真性MERS-CoV感染后第5天时，肺病理损伤的定量分析。图中W.A.S.＝增宽的肺泡隔；I.S.F.＝炎性细胞、浆液性和纤维蛋白性渗出；D.N.B.＝支气管上皮细胞的变性和坏死；P.I.I.＝血管周的炎性细胞浸润；V.H.＝血管扩张充血。图2D至图2O：小鼠的肺、脑和肾中的组织病理学变化和病毒载量。图中H.E.表示用苏木精和伊红染色组织切片进行的组织病理学检查；IHC表示通过免疫组织化学测定的病毒载量。从图2D可见，受感染的基因敲入(KI)小鼠表现出与MERS-CoV感染的人类患者相似的疾病症状，从图2J可见，在野生型小鼠中没有观察到或仅有轻度感染症状。从图2F可见，在受感染的KI小鼠中观察到小脑中的血管周神经胶质增生。图2L显示在野生型小鼠中未观察到小脑中的血管周神经胶质增生。图2I和图2O显示在受感染的KI和野生型小鼠的肾脏中均未发现病理损伤。图2E和图2G分别显示IHC测定证实R26-hDPP4敲入小鼠的肺和小脑中存在病毒，图2K和图2M分别显示在野生型小鼠的肺和小脑中仅检测到少量或没有病毒。每组感染四只小鼠；对来自所有小鼠的样品进行病毒滴定或组织病理学分析(注：图中*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图3.MERS-CoV S-RBD特异的人源化中和抗体H111-1保护R26-hDPP4小鼠免于真性MERS-CoV攻击。用PBS(对照)、1mg/kg的mAb H111-1或5mg/kg的mAb H111-1通过腹膜内(I.P.)施与4周龄的小鼠，6小时后，用hCoV-EMC(1.5x105PFU)通过鼻内(I.N.)途径攻击它们。在感染后第5天，处死小鼠用于病毒滴度和病理学分析。图3A：mAb H111-1可显著降低肺中的病毒滴度。虚线表示LOD。图3B：显示了mAb H111-1减轻由真性MERS-CoV感染引起的病理学损害的功效。横坐标上各指标的含义见图2的描述。图3C：显示了施用1mg/kg mAb(图3C-①、③、⑤、⑦)或5mg/kg mAb(图3C-②、④、⑥、⑧)的R26-hDPP4小鼠的肺和脑中的组织病理学变化和病毒载量。注：图中*表示p<0.05。
图4.建立假型MERS-CoV感染的R26-hDPP4敲入模型。图4A：对4周龄R26-hDPP4小鼠每只分别接种1.27x107.5TCID50(I.P.途径)或3.8x106.5TCID50(I.T.途径)称为“pHIV/MERSS/Fluc”的假型MERS-CoV病毒，在感染后的不同天，观察小鼠体内的生物发光，显示了感染假型MERS-CoV后不同天数时的生物发光成像(BLI)，分别以假色彩(pseudocolor)显示相对生物发光强度，红色表示最强的光子通量，蓝色表示最弱的光子通量。数据显示为平均值±标准误。图4B：显示了感染后不同天数时的生物发光强度，感染后第20天观察不到生物发光。数据显示为平均值±标准误。图4C：通过BLI对小鼠各器官测试Fluc转基因表达：1＝胸腺；2＝心脏；3＝肝；4＝脾；5＝肾；6＝肺；7＝淋巴结；8＝肌肉；9＝皮肤；10＝卵巢或睾丸；11＝脑；12＝肠。图4D：通过Q-PCR检测的pHIV/MERSS/Fluc拷贝数(I.P.攻击途径)。图4E和图4F显示了不同年龄的小鼠对假型MERS-CoV感染的易感性。4至9周龄的小鼠能被假型MERS-CoV感染，其中年轻的小鼠更容易受假型MERS-CoV感染。图4G：显示了来自假型MERS-COV感染小鼠的各器官的组织病理学检查结果，未观察到组织病理学变化。图4H：显示了通过IHC和BLI检测，假型MERS-COV主要感染支气管。明亮的部位是从肺分离的支气管(n＝4-6只/组)。
图5.MERS-CoV假病毒和真病毒感染模型之间的关系。图5A-图5D：在R26-hDPP4小鼠的肺中MERS-CoV假病毒和真病毒感染显示相似的模式，这一点通过IHC使用针对MERS-CoV的受体结合结构域(RBD)的mAb R723检测。图5C和图5D显示MERS-CoV假病毒和真病毒感染后均分布于支气管的纤毛柱状上皮。图5E：假病毒和真病毒的剂量转换。实黑线表示在不同的假病毒攻击量下，人源化mAb H111-1(1mg/kg)对该假病毒的体内抑制率(◆)。蓝色虚线表示人源化mAb H111-1(1mg/kg)对真病毒的体内抑制率。当真病毒攻击量为1.5×105PFU时，计算出人源化mAb H111-1在1mg/kg剂量下对真病毒的抑制率为60％。从假病毒的抑制率曲线看，抗体抑制率为60％时对应的假病毒攻击量为3.25x107TCID50。也就是说，假病毒的1×TCID50对应于0.0046×PFU的真病毒(1.5x105PFU真病毒/3.25x107TCID50假病毒)。每组4-6只小鼠。
图6.新型mAb H111-1和充分表征的mAb m336在R26-hDPP4小鼠中抑制假型MERS-CoV感染。为了评估mAb H111-1的抗病毒功效，对小鼠I.P.(图6A)或I.T.(图6B)施用1毫克mAb H111-1/只小鼠，6小时后，用假病毒以3.8x106.5TCID50的剂量I.T.攻击。图6D显示了在假型MERS-CoV感染后第11天，拍摄的全身或器官的BLI。图6C显示了对mAb m336抗病毒功效的评估，实验中与mAb H111-1相同地进行小鼠的施用、剂量和用与mAb H111-1相同的病毒量进行攻击，并且图6E显示了典型的图像。图6F显示了光通量柱。每组n＝4只小鼠，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图7.肽HR2P-M2在R26-hDPP4敲入小鼠中抑制假型MERS-COV感染。小鼠分别I.T.施用HR2P-M2肽或仅施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)。30分钟后，小鼠I.T.感染3.8x106.5 TCID50的假型MERS-COV。在感染后第11天拍摄BLI图像，并对全身或不同器官记录假病毒的信号。图7A显示了肽HR2P-M2的保护效应，纵坐标显示的是假病毒的通量值。图7B显示了小鼠或器官的BLI图像。图7C显示了光通量柱。每组使用四只小鼠，并且显示了代表性图像。
图8.hCoV-EMC感染引起R26-hDPP4敲入小鼠的肺和脑中的发病。图8A显示了在R26-hDPP4敲入小鼠的肺中观察到的严重病理改变，包括增宽的肺泡隔、水肿、血管扩张和充血、炎性细胞的血管周浸润和支气管上皮细胞坏死。图8B：在来自野生型小鼠的肺中未观察到症状或观察到轻微的症状。图8C：在感染的R26-hDPP4敲入小鼠中观察到血管周围的血管周神经胶质增生。图8D:在野生型小鼠中未观察到血管周围的血管周神经胶质增生。观察的所有小鼠(n＝12)显示均一的症状。
图9.用于产生MERS-CoV假病毒pHIV/MERSS/Fluc的优化方法。图9A显示了产生pHIV/MERSS/Fluc的示意图。用MERS-CoV-Spike表达载体和HIV骨架载体共转染HEK 293T细胞或其他细胞。从上清液中收集假型MERS-CoV。用收集的假型MERS-CoV感染靶细胞，孵育靶细胞48小时，然后进行萤光素酶活性测定。图9B显示了对包膜基因缺失的HIV骨架质粒和MERS-CoV-Spike表达质粒的优化。使用不同的MERS-CoV Spike质粒和HIV骨架质粒实施共转染。图9C：显示了对转染试剂的优化。使用不同的转染试剂共转染pcDNA-opti-MERS-Spike质粒和pSG3.Δenv.Fluc，横坐标表示MERS-CoV病毒S蛋白表达质粒pcDNA-opti-MERS与HIV骨架质粒pSG3.Δenv.Fluc以3:1；2:1；1:1；1:2；1:3；或1:4的比率共转染。图9D：显示了对质粒比例的优化。测试了不同比例的pcDNA-opti-MERS-Spike质粒和pSG3.Δenv.Fluc。图9E显示了用优化的和没有优化的假型MERS-CoV感染的细胞的相对光单位(RLU)值。图9F显示了pHIV/MERSS/Fluc的细胞嗜性，其中使用相同批次的pHIV/MERSS/Fluc感染不同的细胞系，并测量受感染细胞的RLU。
发明详述：
I.定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
术语“中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)”、“MERS-CoV病毒”、“MERS-CoV真病毒”、和“真性MERS-CoV病毒”在本文中可互换地使用，指一种属于冠状病毒科(Coronaviridae)β冠状病毒属(Betacoronavirus)的生物安全水平三级(BSL-3)病毒。MERS-CoV病毒感染人类后，潜伏期约2－14天(平均7天)，一些患者在肺炎基础上，临床病变进展迅速，很快发展为呼吸急促、呼吸困难、和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratorydistress symptom；ARDS)等。除了呼吸道感染症状以外，对MERS-CoV感染病例报道的临床症状还有中枢神经系统(CNS)症状、急性肾炎等。
MERS-CoV是有包膜的单股正链RNA病毒，基因组长度约为29.9kb。MERS-CoV基因组编码的蛋白包括MERS-CoV复制过程的复制酶、4种结构蛋白和5种小分子附属蛋白，其中所述4种结构蛋白分别是刺突蛋白(Spike，S)、核衣壳蛋白(NP)、膜糖蛋白(MP)和小包膜蛋白(EP)。
MERS-CoV的致病性强。在沙特和韩国都发生了MERS-CoV的集中爆发，并且在人群中已经出现了人与人之间的传播。目前除了支持疗法外，尚无针对MERS-CoV的有效药物和疫苗。因此，医护和科研人员在处理MERS-CoV感染患者和收集样本过程中，需要重视个人防护，以免造成医源感染；与MERS-CoV病毒相关的科研工作需要在生物安全三级实验室中完成。
术语“MERS-CoV刺突蛋白”、“MERS-CoV Spike蛋白”、“MERS-CoV S蛋白”或“MERSS”在本文中可互换地使用。MERS-CoV S蛋白是MERS-CoV病毒表面重要的结构蛋白之一，其氨基酸序列全长约1353aa。在不同的MERS-CoV分离株中，MERS-CoV的S蛋白氨基酸序列基本保守。MERS-CoV S蛋白上包含受体结合结构域(Receptor binding domain(RBD))，MERS-CoV借助该结构域与宿主细胞表面受体二肽基肽酶4(Dipeptidyl peptidase 4(DPP4))结合后，介导膜融合，由此将病毒基因组释放入细胞，并迅速在受感染细胞内以(+)RNA病毒基因组序列为模板翻译出病毒的复制酶和结构蛋白等。在细胞内质网和高尔基体中包装为成熟病毒颗粒后，通过囊泡转运到细胞膜表面释放。DPP4是MERS-CoV疫苗研究的主要靶抗原(Zhang N等人，Current advancements and potential strategies in the developmentof MERS-CoV vaccines,Expert Rev.Vaccines,2014,13(6):761-774)。
术语“二肽基肽酶4(DPP4)”或“DPP IV”是一种细胞表面的丝氨酸蛋白酶，广泛分布于各组织器官中，亦称“CD26”。DPP4蛋白的种属特异性是MERS-CoV宿主范围的决定性因素(van Doremalen等人，Host species restriction of Middle East respiratorysyndrome coronavirus through its receptor,dipeptidyl peptidase 4,J.Virol.,2014,88:9220-9232)。人二肽基肽酶4(hDPP4)是MERS-CoV的受体(V.S.Raj等人,Dipeptidyl peptidase 4 is a functional receptor for the emerging humancoronavirus-EMC.Nature 495,251-254(2013))，其具有介导MERS-CoV感染的能力，但小鼠二肽基肽酶4(mDPP4)不是MERS-CoV的功能性受体。
hDPP4基因定位于人类2号染色体长臂(2q24.3)，编码一条约766个氨基酸的多肽链，分子量约110KD。在本发明的上下文中，术语“hDPP4蛋白”或“hDPP4多肽”是指具有UniProtKB-P27487所示的氨基酸序列(http://www.uniprot.org/uniprot/P27487)、其与MERS-CoV RBD结合的部分功能序列、或者是与UniProtKB-P27487所示序列具有至少70％、80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、且能够介导MERS-CoV对表达hDPP4蛋白的细胞或者生物体(例如，人、非人灵长类动物)进行感染的多肽。
术语“安全港(safe harbor)基因座”是这样的位于宿主细胞基因组中的基因座，在所述基因座内敲入外源基因后，对宿主细胞不产生任何不利影响，同时，外源基因的表达也不会受到周边区域的影响。哺乳动物细胞中的安全港基因座的非限制性的例子是Rosa26基因座、Hipp11基因座。Rosa26基因座是用于外源基因组成型、遍在表达的基因座。
术语“向导RNA(gRNA)”指的是特异于靶DNA的RNA，其可以与Cas蛋白质形成复合体并将Cas蛋白质带至靶DNA，从而Cas蛋白质在靶DNA的位点处引入双链断裂。在一个实施方案中，所述靶DNA是小鼠的安全港基因座。
在本发明中，向导RNA可以由两个RNA，即CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)组成，或者向导RNA可以是通过融合crRNA和tracrRNA的必要部分而产生的单一向导RNA(sgRNA)。
术语“重组”，当用于例如细胞、核酸、蛋白质或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质、或改变天然核酸或蛋白质而被修饰。
术语“功能片段”、“功能等同的片段”、“功能等同片段”等可互换使用，并且是指保留亲本多肽的功能活性的亲本多肽的一部分序列或子序列。例如，Cas蛋白质的功能片段保留与向导RNA一起产生靶DNA双链断裂的能力。
术语“供体DNA”或“供体核酸序列”是指包含待表达的目的多核苷酸序列的多核苷酸，该目的多核苷酸序列被插入小鼠基因组中的靶位点处。在某些实施方案中，供体DNA进一步包含与基因组序列同源的序列(也被称为“同源臂”)。“同源”意指类似的DNA序列。同源臂足以发生与同源基因组序列的同源重组。例如，同源臂可以包含至少50-3500或更多个碱基长度。在一个实施方案中，待表达的目的多核苷酸序列是全长的hDPP4基因或其与MERS-CoV S蛋白结合的功能片段。
术语“合子”是通过两个配偶体之间的受精事件形成的真核细胞。合子的基因组是对每个配偶体中DNA进行组合后的基因组，其包含形成新个体所需的所有遗传信息。在多细胞生物中，合子是最早的发育阶段。在一个实施方案中，合子是小鼠的受精卵。
氨基酸序列的“同一性百分数(％)”是指将候选序列与本说明书中所示的具体氨基酸序列进行比对并且如有必要的话为达到最大序列同一性百分数而引入空位后，并且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分时，候选序列中与本说明书中所述的氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数。
术语“有效连接”意指指定的各组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系。
术语“MERS-CoV假型病毒(pseudotyped virus)”、“MERS-CoV假病毒(pseudovirus)”、“假型MERS-CoV病毒”、或“假型MERS-CoV”在本申请中可互换地使用，是指人工合成的一种病毒，通常是在选自逆转录病毒鼠白血病病毒(MLV)、人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)和弹状病毒水泡性口炎病毒(VSV)等模式病毒的包膜上具有MERS-CoV病毒的糖蛋白(如MERS-CoV刺突蛋白)，并且所述模式病毒的核酸分子上编码所述模式病毒包膜蛋白的基因被缺失。这种经包装的假型病毒是复制缺陷型的，它对靶细胞只能进行“一个细胞周期”的侵染，不能再次产生新的子代病毒，有效避免了病毒继发扩散感染的危险，具有良好的生物安全性。假型病毒能否感染含有MERS-CoV刺突蛋白的相应受体的细胞以及感染的程度可通过报告基因(例如，GFP或者萤光素酶)在靶细胞中的表达来定量。在一个实施方案中，将源自MERS-CoV病毒的MERS-Spike蛋白与慢病毒(如，HIV-1)的复制缺陷型病毒“核心”组合获得本发明的假型MERS-CoV。假型MERS-CoV允许在低生物安全性设施内进行实验，提供了安全且高效的替代掉野生型MERS-CoV病毒的方案。MERS-CoV假病毒由于具有安全性和多功能性，因此是有用的病毒学工具。
II.一般方法
除非另外说明，本发明的实施将利用本领域技术人员已知并可获得的细胞生物学、细胞培养、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、生物化学、动物学、病毒学和免疫学的常规技术。这类技术在如以下文献中描述：Molecular Cloning:A laboratory Manual,第3版(Sambrook等人,2001)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(P.Herdewijn编著,2004)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编著,1987)；Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编著,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编著,1991)；和ShortProtols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)。除非另外规定，本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。
MERS-CoV真病毒感染小鼠和空斑测定法
四周龄R26-hDPP4小鼠和野生型小鼠通过鼻内(I.N.)途径用真性MERS-CoV株hCoV-EMC以1.5x105PFU的剂量攻击，并且每天测量体重。在感染后(p.i.)第5天，在体重减轻超过25％的情况下，基于人道安乐死的考虑，处死所有小鼠以用于样品收集。按照现有技术中描述的方法(X.-C.Tang等人,Identification of human neutralizing antibodiesagainst MERS-CoV and their role in virus adaptive evolution.Proceedings ofthe National Academy of Sciences 111,E2018-E2026(2014))，通过Vero细胞上的空斑测定法来确定肺组织中的病毒滴度。所有病毒保存在具有严格的个人防护设备的BSL-3条件下。
生物发光成像的检测：
使用IVIS-Lumina II成像系统(Xenogen,Baltimore,USA)检测生物发光成像。当需要获得发光时，通过腹膜内注射(I.P.)戊巴比妥钠(每千克体重240mg)将小鼠麻醉。曝光时间为60秒，使用Living Image软件(Caliper Life Sciences,Baltimore,USA)分析目的区域的荧光强度。选择560nm处的波长和581nm处的波长分别检测假病毒萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase；Fluc)报告基因和R26-hDPP4小鼠中tdTomato的荧光。对小鼠I.P.注射D-萤光素的底物(50mg/kg体重，Xenogen-Caliper Corp.,Alameda,CA)，然后在10分钟后成像。发射光的相对强度呈现出从红色(强的)到蓝色(弱)的颜色，并以光子通量(photonflux)表示，单位为光子/秒/cm2/sr。
RNA提取和实时定量PCR：
解剖组织并立即浸入
稳定试剂(Invitrogen，USA)中并储存于-80℃。使用TRIzol从各个组织提取总RNA，并使用分光光度计在OD260nm处定量。使用随机六聚体用逆转录(RT)PCR试剂盒(Takara,Shiga,日本)引发逆转录反应。使用Light Cycler 480Real-Time PCR系统进行实时定量PCR。每个反应一式三份进行。通过DPP4-Q-F,5’-GGGTCACATGGTCACCAGTG-3’和DPP4-Q-R,5’-TCTGTGTCGTTAAATTGGGCATA-3’确定hDPP4的相对表达水平，并用Gapdh归一化。使用引物组gag-F 1，5'-AGCACAGCAAGCAGCAGC-3'，和gag-R1:5'-GTGGCTCCTTCTGATAATGCTGAA-3'，和TaqMan探针:5'Fam-ACAGGAAACAGCAGCCAGGTCAGCCGA-3'Tamra定量病毒载量。数据表示为Lg病毒RNA拷贝数/Gapdh。
Western印迹分析：
将小鼠组织在补充有1x蛋白酶抑制剂(PI)(Roche，Basel，瑞士)的RIPA裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，100mM EDTA，0.1％SDS)中匀浆。将变性的蛋白质裂解物电泳并在10％SDS-PAGE上分离。用抗hDPP4小鼠单克隆抗体(1:3000，Origene,Rockville,USA)和抗GAPDH(1:5000，Abcam,Cambridge,UK)温育，然后用过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG(1:20000，Santa Cruz,Santa Cruz,CA)检测。使用Immobilon Western化学发光HRP底物试剂盒(Millipore Corporation，Billerica，MA 01821USA)进行检测并在暗室中曝光。
流式细胞术检测细胞因子：
处死感染了病毒或者没有感染病毒的本发明R26-hDPP4小鼠和野生型C57BL/6背景小鼠，以获得血清。根据制造商的说明书，使用Flow Assay Kits(BD Pharmingen，USA)测量血清中IL-12、TNF-α、INF-γ、MCP-1、IL-10和IL-6的产生。在BD FACSCanto II(BDBiosciences,USA)上进行流式细胞术测量，并用FlowJo软件评价数据。
免疫组织化学(IHC)检测：
将小鼠组织固定在10％中性缓冲的福尔马林中，包埋在石蜡中，并切片至约3um。用苏木精和伊红染色组织切片，用于组织病理学检查。对于免疫组织化学(IHC)，将组织切片再水化(rehydrated)并在装有Citra缓冲液(pH 6.0)的Coplin玻片染色瓶中在96℃于微波炉中孵育10分钟，在室温冷却60分钟，然后用10％正常山羊血清在37℃封闭60分钟。将切片在4℃与单克隆兔抗R723抗体(通过噬菌体展示法产生的、针对MERS-CoV的受体结合结构域的mAb R723)(1:200稀释；友情提供自北京万泰生物制药有限公司(Beijing WantaiBiological Pharmacy Enterprise Co.,Ltd.)，中国，北京)或正常山羊血清(对照)过夜温育。然后用PBS洗切片，并与HRP缀合的山羊抗兔二级抗体(中山金桥生物公司(ZhongshanGolden Bridge Biocompany)，中国，北京)室温孵育40分钟，然后用DAB试剂盒(中山金桥生物公司，中国，北京)染色并用苏木精复染。
数据和统计分析：
基于会产生统计学显著差异的原则确定每组中的动物数量和样本量。使用以下公式计算mAb对感染小鼠的抑制率：(PBS对照组的值－mAb处理组的值)/PBS对照组的值。该值可以表示肺组织的假病毒滴度的或真病毒滴度的荧光值。用SPSS(ver.18.0；IBM,Armonk,NY,USA)或GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,San Diego,CA)分析数据。每个实验的结果以平均值±标准差(SD)表示。进行Student t检验以分析两组之间的差异。在多重比较中进行Dunnett检验。P值小于0.05是统计学显著的。
III.构建保留mDPP4功能的、hDPP4基因敲入小鼠模型
本发明通过将hDPP4基因定点敲入小鼠基因组的安全港基因座中并表达hDPP4蛋白，构建了保留mDPP4功能的、hDPP4基因敲入小鼠模型。
III.1.确定hDPP4基因定点整合的位置：
hDPP4基因定点整合的位置是小鼠基因组的安全港基因座处，包括但不限于Rosa26基因座、Hipp11基因座等。在一个实施方案中，将hDPP4基因定点敲入小鼠基因组的Rosa26基因座中并且hDPP4基因能够得到稳定表达。又在一个实施方案中，将hDPP4基因定点敲入小鼠基因组的Hipp11基因座中并且hDPP4基因能够得到稳定表达。
为了实现向小鼠基因组的安全港基因座内定点敲入hDPP4基因，可以使用特异靶向所述安全港基因座的核酸酶试剂，产生DNA双链断裂，然后通过同源重组，将包含hDPP4基因的表达盒整合入安全港基因座内。在一些实施方案中，所述核酸酶试剂是转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或CRISPR/Cas系统等。在一个实施方案中，所述核酸酶试剂是CRISPR/Cas9系统。
III.2.CRISPR/Cas系统的设计和效率检测
在一个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA、和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质的组合物，其中所述靶DNA是小鼠基因组的上述安全港基因座处。
在一个实施方案中，所述向导RNA是含有crRNA和tracrRNA的dualRNA。又在一个实施方案中，所述向导RNA是单一向导RNA(single guide RNA，sgRNA)，其含有crRNA和tracrRNA的部分。
在一个实施方案中，所述向导RNA在单一向导RNA或dualRNA的crRNA的5'末端还包含一个或多个附加的核苷酸，例如，包含2个附加的鸟嘌呤核苷酸。
向导RNA可以以编码该向导RNA的RNA或DNA的形式转移到细胞(例如，本发明的合子)中。向导RNA可以是分离的RNA形式、并入病毒载体中的RNA的形式、或者在载体中编码。优选地，载体可以是病毒载体、质粒载体、或农杆菌载体，但不限于此。
编码向导RNA的DNA可以是包含编码向导RNA序列的载体。例如，可以通过用分离的向导RNA或包含编码向导RNA的序列和启动子的质粒DNA转染细胞(例如，本发明的合子)，将向导RNA转染到细胞(例如，本发明的合子)中。
备选地，可以使用病毒介导的基因递送，将向导RNA转移到细胞(例如，本发明的合子)中。
当向导RNA以分离RNA的形式转染细胞(例如，本发明的合子)时，可使用本领域中已知的任何体外转录系统通过体外转录来制备向导RNA。向导RNA优选以分离RNA的形式，而不是以包含向导RNA的编码序列的质粒的形式，转移到细胞中。然而，不排除使用质粒DNA或病毒介导的基因传递来转染向导RNA。
在一个实施方案中，通过sgRNA引导Cas9蛋白结合于小鼠基因组的特异性位点，Cas9蛋白切割该特异性位点，随后形成的双链断裂在具有同源臂的供体DNA存在的条件下发生同源重组，由此实现目的基因的定点插入。在确定了hDPP4基因定点整合的位点之后，根据整合位点设计sgRNA。为了提高后续的位点整合效率，通常设计多条sgRNA，通过转染小鼠细胞，计算其编辑效率(Hwang W.Y.等人,Efficient genome editing in zebrafishusing a CRISPR-Cas system,Nat.Biotechnol.,2013,31(3):227-229)。根据检测结果选择编辑效率最高的sgRNA进行后续实验。
在一个具体实施方案中，sgRNA引导Cas9蛋白结合的目标小鼠基因组的特异性位点具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列AAGGCCGCACCCTTCTCCGGAGG，Cas9蛋白切割该特异性位点，所设计并经验证的高效靶向所述小鼠基因组Rosa26基因座的sgRNA包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列TAGGCCGCACCCTTCTCCGG和/或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列AAACCCGGAGAAGGGTGCGG。
CRISPR/Cas系统中可包含蛋白质形式或编码Cas蛋白质的核酸形式的Cas成分。
在本发明中，Cas蛋白质可以是任何Cas蛋白质，只要当其与向导RNA复合时具有核酸内切酶或切口酶活性即可。
优选地，Cas蛋白质是Cas9蛋白质或其变体或其功能片段。
Cas蛋白质可以是从生物体如链球菌属物种(Streptococcus sp.)，优选化脓性链球菌(Streptococcus pyogens)中分离的蛋白质、或重组蛋白质，但并不限于此。
在一个实施方案中，Cas蛋白质包含源自化脓性链球菌Cas9的如下SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列：
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD(SEQ ID NO:6)
在另一个实施方案中，Cas蛋白质包含与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％的同源性，但不限于此。
就本发明而言，Cas蛋白质编码核酸可以是载体形式，如包含在启动子如CMV或CAG下的Cas编码序列的质粒。当Cas蛋白质是Cas9时，Cas9编码序列可源自链球菌属，优选源自化脓性链球菌。例如，Cas9编码核酸可以包含编码SEQ ID NO：6的核苷酸序列。此外，Cas9编码核酸可包含与编码SEQ ID NO：6的核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列，优选地与编码SEQ ID NO：6的核苷酸序列具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％的同源性，但不限于此。
III.3.供体DNA的构建
在确定了向导RNA后，根据向导RNA的作用位置构建供体DNA。在供体DNA中，5’同源臂、3’同源臂分别是与向导RNA作用位置左、右两边各150－3500个核苷酸长度的基因组序列同源的序列，用于有效介导同源重组。在一些实施方案中，5’同源臂、3’同源臂分别是与约250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250个核苷酸长度的基因组序列同源的序列。此处所用的术语“同源”，除了序列彼此完全(即，100％)同一的情况以外，只要能够有效介导同源重组即可，因此，也包含部分序列不同的情况。通常至少95％以上、优选为97％以上、进一步优选为99％以上的序列同一。通过小鼠染色体上的基因组区域与供体DNA上的5’同源臂、3’同源臂相互作用，供体DNA上位于5’同源臂和3’同源臂之间的核酸序列敲入至小鼠染色体上的基因组的特定位置。
在一个实施方案中，供体DNA中依次包含5’同源臂、hDPP4基因或其功能片段和3’同源臂。
在一个实施方案中，供体DNA是打靶载体。不特别地限制作为骨架的基础打靶载体，只需具备用于细菌中的载体增殖的原核复制起点和选择标记即可。
在一个优选的实施方案中，为了增加hDPP4基因或其片段的表达，在打靶载体中连接入内含子的剪接受体(SA)来驱动hDPP4基因的cDNA，这使得能够通过Rosa26的启动子遍在表达hDPP4。
在一个实施方案中，打靶载体中包含报告基因，用来检测hDPP4基因或其功能片段在基因敲入后的小鼠体内的表达情况。优选地，所述报告基因是荧光报告基因。更优选地，所述报告基因是tdTomato报告基因，其表达后的荧光呈红色。
在一个实施方案中，打靶载体中包含加强mRNA转录稳定性的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
在一个具体实施方案中，打靶载体包含有效连接的5’同源臂、剪接受体(SA)、hDPP4基因或其功能片段、内部核糖体进入位点(IRES)序列和/或2A序列、报告基因(例如，tdTomato报告基因)、WPRE、多聚A序列、3’同源臂。
III.4.hDPP4基因敲入小鼠的获得
将上述特异于靶DNA的向导RNA或编码向导RNA的DNA、Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质、以及供体DNA引入小鼠合子中；和将所述合子转移到代孕鼠中，以产生种系可传递的hDPP4基因敲入小鼠。
可以在本发明中使用来自任何小鼠的合子。小鼠的合子可通过如下方法产生：向4～7周雌性小鼠注射PMSG(孕母马血清促性腺激素)和hCG(人绒毛膜促性腺激素)，将超排卵雌性小鼠与雄性小鼠交配，并从输卵管收集受精的合子。在一些实施方案中，所述合子是C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠、ABI小鼠的合子或受精卵。
将本发明的CRISPR/Cas系统和供体DNA引入合子，由此，通过Cas蛋白质作用来切割与向导RNA互补的靶DNA，引起靶DNA(例如，本发明的小鼠基因组的Rosa26基因座)中的hDPP4基因敲入。
在一个具体实施方案中，本发明的hDPP4基因敲入小鼠是种系可传递的。
将本发明的CRISPR/Cas系统和供体DNA引入合子的方法可以是本领域已知的任何方法，如微注射法、干细胞插入法、逆转录病毒插入等等。优选地，可使用前核(pronucleus)微注射技术，将本发明的CRISPR/Cas系统和供体DNA引入合子或受精卵的前核中。在一个实施方案中，将本发明的CRISPR/Cas系统和供体DNA显微注射到合子或受精卵的细胞质或前核中，并使用体外培养出的胚胎分析hDPP4基因在小鼠基因组的Rosa26基因座处的插入。
任何代孕鼠均可以在本发明中使用。在一个非限制性实施方案中，代孕鼠来自KM小鼠或ICR小鼠。
将代孕鼠产下的后代中经鉴定为hDPP4阳性的小鼠作为首建鼠，并将首建鼠与合子的来源背景鼠品系交配繁育，获得F1子代；然后，将F1子代阳性小鼠互交繁育，获得在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的小鼠。
使用现有技术中已知的多种方法能够鉴定在小鼠的安全港基因座(例如，Rosa26基因座)处hDPP4基因敲入的纯合小鼠的基因型和表型，包括但不限于使用PCR、Sourthern印迹等方式鉴定所述基因敲入小鼠的基因型，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定所述基因敲入小鼠中各器官或者组织中hDPP4mRNA的表达，和/或通过Western印迹鉴定hDPP4蛋白的表达，以及通过检测报告基因如tdTomato报告基因表达后的荧光，以生物发光成像(BLI)等方式检测hDPP4蛋白的分布。
在一个具体实施方案中，获得了在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的小鼠。在所述小鼠中，存在hDPP4基因的广泛表达。在人类中，hDPP4也是广泛表达于人体组织和细胞中。
另外，在所述小鼠的肺中检测到了最高的hDPP4表达。与A.S.Agrawal等人(Generation of a transgenic mouse model of Middle East respiratory syndromecoronavirus infection and disease.Journal of virology 89,3659-3670(2015))构建的转基因小鼠在心脏和脑中具有最高hDPP4表达的情形不同，本发明构建的小鼠在肺中的最高hDPP4稳定表达显示了所述小鼠模型将能更好地模拟MERS-CoV病毒对人肺部的感染引起的损伤。在所述小鼠的脑中也检测到了hDPP4的表达，这表明本发明构建的小鼠模型也能很好地模拟MERS-CoV病毒对人脑的感染所引起的脑损伤。
由于小鼠基因组上的野生型mDPP4基因在小鼠的免疫和糖代谢中具有多种生物学活性(C.Morimoto等人,The structure and function of CD26 in the T-cell immuneresponse.Immunological reviews 161,55-70(1998))，因此，在设计本发明的小鼠模型时，保留了小鼠基因组上的野生型mDPP4基因。通过流式细胞术检测本发明的小鼠模型中多种细胞因子如IL-12、TNF-α、INF-γ、MCP-1、IL-10和IL-6的表达，结果表明与野生型小鼠中相应细胞因子的表达相比不受影响，因此本发明的小鼠模型对mDPP4的正常功能或小鼠免疫系统的正常功能均没有造成任何不利影响，是一种理想的小鼠模型。
IV.MERS-CoV真病毒对保留mDPP4功能的、hDPP4基因敲入小鼠模型的感染
在本发明中，涉及MERS-CoV真病毒的操作均在BSL-3设施中实施。
在一个实施方案中，测试了本发明的hDPP4基因敲入小鼠是否能支持MERS-CoV真病毒的复制和有效感染。
使用的MERS-CoV真病毒优选地是感染人类的任一MERS-CoV临床分离株。在一个实施方案中，使用的MERS-CoV真病毒是A.M.Zaki等人(Isolation of a novel coronavirusfrom a man with pneumonia in Saudi Arabia.New England Journal of Medicine367,1814-1820(2012))分离出的MERS-CoV临床株hCoV-EMC。
将MERS-CoV真病毒以约105PFU－108PFU的剂量感染本发明的hDPP4基因敲入小鼠。在一些实施方案中，将MERS-CoV真病毒以约1x105PFU－3x105PFU的低剂量鼻内(I.N.)感染本发明的hDPP4基因敲入小鼠。在一个具体实施方案中，将MERS-CoV真病毒以约1.5x105PFU的低剂量鼻内(I.N.)感染本发明的hDPP4基因敲入小鼠。
本发明的hDPP4基因敲入小鼠在感染所述低剂量MERS-CoV真病毒后，表现出体重显著减轻。在一个实施方案中，本发明的hDPP4基因敲入小鼠体重显著减轻了达33.6％，这与用33倍剂量的MERS-CoV小鼠适应毒株感染报导的小鼠体重减轻类似，其中所述MERS-CoV小鼠适应毒株是衍生自hCoV-EMC的传代15代的小鼠适应株(X.Tao等人,Characterizationand demonstration of the value of a lethal mouse model of Middle Eastrespiratory syndrome coronavirus infection and disease.Journal of virology90,57-67(2016))。
使用空斑测定法测定了受MERS-CoV真病毒感染的本发明小鼠的肺中的病毒滴度。在一个具体实施方案中，在肺中检测到的病毒滴度达到3.18log10 PFU/g，这高于之前报导的结果(A.S.Cockrell等人,A mouse model for MERS coronavirus-induced acuterespiratory distress syndrome.Nature microbiology2,16226(2017)。在受MERS-CoV真病毒感染的本发明小鼠的肺中观察到多种弥漫性发病，包括肺泡隔增宽、血管扩张和充血、炎性细胞的血管周浸润、支气管上皮细胞坏死、水肿和透明膜(hyaline membrane)形成，小鼠中的这些表现与人类患者的临床表现密切相关(S.Cauchemez等人,Middle Eastrespiratory syndrome coronavirus:quantification of the extent of theepidemic,surveillance biases,and transmissibility.The Lancet infectiousdiseases 14,50-56(2014))。通过病理学定量评分显示，受MERS-CoV真病毒感染的所有本发明小鼠均具有一致的疾病症状，且与野生型小鼠之间相比具有显著差异。
通过测定受MERS-CoV真病毒感染的本发明小鼠各组织中的病毒滴度或IHC确定了：小鼠的肺、特别是支气管，是代表性的MERS-CoV真病毒感染部位。
尽管呼吸道感染和ARDS是人类患者中的常见临床症状，但已报导了具有严重神经综合征的人类患者，包括意识模糊到昏迷和共济失调以及灶性运动功能障碍(focal motordeficit)(Y.Arabi等人,Severe neurologic syndrome associated with Middle Eastrespiratory syndrome corona virus(MERS-CoV).Infection 43,495-501(2015))。
在现有技术中，对MERS-CoV真病毒是否可以感染模型小鼠的神经系统仍然存在争议。A.S.Agrawal等人(Generation of a transgenic mouse model of Middle Eastrespiratory syndrome coronavirus infection and disease.Journal of virology89,3659-3670(2015))报导了在其产生转基因小鼠中MERS-CoV感染引起了小鼠脑中的高病毒载量，但未观察到坏死或炎症反应。另外，在用小鼠适应的病毒株感染的基因敲入小鼠模型中，即使MERS-CoV以5×106PFU的剂量感染也未在小鼠脑中检测到病毒复制，这种动物模型是一种在没有CNS并发症的情况下模拟ARDS临床表现的小鼠模型。
在本发明中，将MERS-CoV真病毒以约1x105PFU－3x105PFU的低剂量鼻内(I.N.)感染本发明的hDPP4基因敲入小鼠。该感染剂量远低于现有技术中报导的使用MERS-CoV小鼠适应的病毒株的感染剂量。通过IHC测定法检测MERS-CoV真病毒感染后的本发明小鼠的小脑、脑神经节和大脑中的病毒载量。结果表明，在所有受检的本发明小鼠的小脑、脑神经节和大脑中检测到MERS-CoV病毒，且与病毒载量相关地，也观察到血管周神经胶质增生(一种炎症反应的指示)，但在以相同方式攻击的任何野生型小鼠中没有检测到MERS-CoV病毒，也没有观察到血管周神经胶质增生。因此，本发明的hDPP4基因敲入小鼠可靠地模拟MERS-CoV真病毒感染后对人类患者神经系统、尤其是中枢神经系统(CNS)的影响。
由此可见，本发明的hDPP4基因敲入小鼠能够可靠地模拟MERS-CoV真病毒感染后对人类患者的影响，产生了包括类似于临床人类患者的体重减轻、肺和脑中的疾病症状。
本发明的小鼠能够用来筛选和评估任一抗病毒剂和疫苗对抗MERS-CoV感染的体内功效。在一些实施方案中，本发明的所述小鼠能够用来评估抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或治疗性功效。
V.假型MERS-CoV对保留mDPP4功能的、hDPP4基因敲入小鼠模型的感染
假型病毒允许在低生物安全性设施内实施实验，理论上能够提供一种安全且高效的替代掉相应的真病毒的方案。假病毒由于具有安全性和多功能性，因此是有用的病毒学工具，但是现有技术中获得的假型MERS-CoV效价低，很大程度上限制了它们更广泛的应用。
本发明人开发了一种高效的假病毒生产系统，其能够产生高滴度的假型MERS-CoV。其中所述假型MERS-CoV病毒是通过用包膜基因缺失的HIV骨架质粒和含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒共转染哺乳动物细胞(例如，HEK293T细胞)并收获细胞培养上清而获得的，优选地，其中所述含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒包含荧光报告基因，例如，Fluc基因、EGFP基因以及其它可能的荧光报告基因。
本发明人开发的假型MERS-CoV病毒滴度通常高达1×105－1×109TCID50/ml。在一个实施方案中，假型MERS-CoV病毒滴度为1.27×107.5TCID50/ml，比现有技术中报导的假型MERS-CoV病毒滴度提高了约100倍。
采用该高滴度的假病毒，我们开发出了一个在缺乏BSL-3设施的生物实验室(例如，在BSL-2设施)中使用假型MERS-CoV病毒感染的小鼠模型，用于评估抗病毒剂和疫苗的体内功效，例如，评估抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或治疗性功效，而在现有技术中，这些测定和评估均依赖于使用MERS-CoV活病毒的测定。
通过使用本发明的假型MERS-CoV病毒实施细胞水平的体外中和试验能够实现对抗病毒剂和疫苗的体外初步筛选，然后，通过使用本发明的假型MERS-CoV病毒感染本发明的小鼠能够确定所述抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或治疗性功效。这些使用假型MERS-CoV病毒的测定法均在实验的再现性和安全性上优于基于MERS-CoV活病毒的测定法。
由于腹膜内(I.P.)感染途径在构建埃博拉假病毒小鼠模型(Q.Liu等人,Biodistribution and residence time of adenovector serotype 5 in normal andimmunodeficient mice and rats detected with bioluminescent imaging.Scientificreports 7,3597(2017))方面有效，因此，对本发明小鼠I.P.施用本发明的假型MERS-CoV。在感染后的不同日期麻醉小鼠并用BLI系统观察。观察到本发明小鼠在I.P.感染本发明的假型MERS-CoV后第6天生物发光达到峰值强度，小鼠的胸腺、肝、脾、肾、肺和肌肉均有感染，且检测到假型MERS-CoV的较高拷贝数(图4D)，表明本发明的假型MERS-CoV可有效感染hDPP4基因敲入小鼠。
由于人类患者感染MERS-CoV后主要引起临床ARDS，即，MERS-CoV的主要感染部位是呼吸道。因此，为了在小鼠模型中获得主要感染部位位于呼吸道附近，还调整了假型MERS-CoV的施用途径。通过胸内(I.T.)途径接种假型MERS-CoV至本发明的小鼠。逼真的图像显示胸内(I.T.)途径的感染主要出现在胸部，其中最强的感染出现在感染后第10天和第11天。在这种情况下，小鼠的胸腺、心脏和肺均有感染，并且在所有小鼠中均观察到一致的感染特征，这表明将假型MERS-CoV病毒对本发明的小鼠进行I.T.攻击比I.P.攻击有一些优势。
进一步地，也尝试了将假型MERS-CoV病毒对本发明的小鼠进行鼻内和静脉内攻击，但这两种攻击途径均未能感染小鼠。
由于受假型MERS-CoV病毒感染的小鼠组织中的荧光强度与假型MERS-CoV病毒拷贝数强烈相关，因此，检测荧光强度可以用作假型MERS-COV感染的指标。通过观察荧光强度，结果表明假病毒感染不引起本发明小鼠的组织病理学或细胞因子表达的改变(图4G)，因此，本发明的假型MERS-CoV病毒对小鼠是安全的。通过BLI可视化和IHC测定法确认了，假型MERS-CoV病毒倾向于感染支气管(图4H)，这与MERS-CoV真病毒感染相一致(图2E)。
由此可见，本发明的hDPP4基因敲入小鼠还能够被假型MERS-CoV病毒感染，并可靠地模拟MERS-CoV真病毒感染后对人类患者呼吸道的影响，因此，本发明的所述小鼠能够在被假型MERS-CoV病毒感染后用来筛选和评估任一抗病毒剂和疫苗对抗MERS-CoV感染的体内功效。在一个实施方案中，本发明的所述小鼠能够用来评估抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或治疗性功效。
VI.假型和真性MERS-CoV感染的本发明小鼠模型的关联
通过比较假型和真性MERS-CoV感染的本发明小鼠模型之间的感染特性可见，本发明小鼠的肺是假型和真性MERS-CoV的主要感染器官之一。
在一个实施方案中，通过使用不同剂量的假型MERS-CoV病毒感染本发明的小鼠，并施用抗MERS-CoV病毒的抗病毒剂如抗体，计算抗病毒剂如抗体对假型MERS-CoV病毒感染小鼠的体内抑制率，获得抗病毒剂如抗体对假型MERS-CoV病毒感染小鼠的抑制率曲线。
类似地，使用某个剂量的MERS-CoV真病毒感染本发明的小鼠，并施用抗MERS-CoV病毒的抗病毒剂如抗体，计算抗病毒剂如抗体对该攻击剂量的MERS-CoV真病毒感染小鼠的体内抑制率。在抗病毒剂如抗体对假型MERS-CoV病毒感染小鼠的抑制率曲线上找到抗病毒剂如抗体对MERS-CoV真病毒感染小鼠的体内抑制率的值，建立假型与真性MERS-CoV感染的本发明小鼠模型之间的病毒的攻击量转换率，用来评估在假病毒小鼠模型中使用的抗病毒剂的效果。
描述以下实施例以辅助对本发明的理解。不意在且不应当以任何方式将实施例解释成限制本发明的保护范围。
实施例
伦理上的声明
野生型C57BL/6小鼠和代孕小鼠由中国食品药品检定研究院实验动物资源所提供(Institute for Laboratory Animal Resources,National Institute for Food andDrug Control)。所有研究均按照中国食品和药物管理局(China Food and DrugAdministration，CFDA)中国食品药品检定研究院的机构动物护理和使用委员会批准的动物方案(#2017-B-004)进行，并遵守“Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals"(National Academies Press:Washington,DC,USA,2011；第8版)。中国科学技术部颁发的动物使用证书的许可证编号为SYXK(北京)2016-004。
实施例1.包含hDPP4基因的打靶载体的构建
人二肽基肽酶4(hDPP4)是MERS-CoV的受体，其具有介导MERS-CoV感染宿主的能力。小鼠二肽基肽酶4(mDPP4)不是MERS-CoV的功能性受体，因此，MERS-CoV不能通过mDPP4感染小鼠。
本实施例构建了包含hDPP4基因的打靶载体，用于将hDPP4基因敲入小鼠基因组的Rosa26基因座中并表达hDPP4蛋白，旨在获得能够感染MERS-CoV的基因敲入小鼠。
打靶载体包含5’同源臂、剪接受体(splicing acceptor，SA)、hDPP4基因、内部核糖体进入位点(IRES)序列、tdTomato报告基因、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element(WPRE))、多聚A序列、3’同源臂；其中所述5’同源臂和3’同源臂分别是与小鼠Rosa26基因座中待插入位点处的5’基因组序列和3’基因组序列同源的序列。
具体而言，将合成的SA片段克隆到用PacI和MluI消化的mROSA-KI-12载体中以获得mROSA-KI-SA构建体。所述mROSA-KI-12载体获自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，载体的构建和结构信息可参见A safe and sensitive enterovirus A71 infectionmodel based on human SCARB2 knock-in mice，Vaccine 34(2016)2729–2736。
将用MfeI和EcoRV消化质粒pminiTol2-CAG-DPP4-IRES-Tdtomato-WPRE得到的CAG-hDDP4-IRES-tdtomao-WPREpA片段与MfeI和EcoRV消化的mROSA-KI-SA连接以获得mROSA-CAG-SA-hDPP4-IRES-tdtomato-WPREpA。所述质粒pminiTol2-CAG-DPP4-IRES-Tdtomato-WPRE获自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，载体的构建和结构信息可参见Asafe and sensitive enterovirus A71infection model based on human SCARB2knock-in mice，Vaccine 34(2016)2729–2736。将MfeI和SwaI消化后的hDDP4-1片段与MfeI和SwaI消化的mROSA-CAG-SA-hDPP4-IRES-tdtomato-WPREpA连接以除去CAG并获得mROSA-SA-hDPP4-IRES-tdtomato-WPREpA(也称为“mROSA-hDPP4打靶载体”)，其中5’同源臂长1812bp，3’同源臂长1779bp。
在所述打靶载体中，剪接受体(SA)驱动hDPP4的cDNA表达。将tdTomato基因序列插入hDPP4基因和内部核糖体进入位点(IRES)序列的下游，这允许hDPP4和tdTomato的共表达。添加了多聚A序列和WPRE元件来增强mRNA稳定性和翻译效率(图1A)。
实施例2.Rosa26基因座的靶位点处靶向敲入了hDPP4基因的小鼠的产生
将实施例1构建的包含hDPP4基因的打靶载体、高效靶向Rosa26基因座的sgRNA(包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列TAGGCCGCACCCTTCTCCGG和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列AAACCCGGAGAAGGGTGCGG)和现有技术中已知的Cas9 mRNA序列(例如，编码SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的Cas9 mRNA序列)显微注射入294枚C57BL/6小鼠合子，然后将所述合子植入假孕的代孕鼠KM小鼠或ICR小鼠中妊娠，由代孕鼠产下后代。共获得41个后代。
对代孕鼠产下的41个后代使用引物hDpp4正向引物：5'-CTGCAGTACCCAAAGACTGTACGGG-3'(SEQ ID NO:4)；hDpp4反向引物:5'-GACACCTTTCCGGATTCAGCTCACA-3'(SEQ ID NO:5)进行基因分型，阳性产物的条带大小为628bp。在41个后代中，7个后代为基因组中定点插入了hDPP4基因的阳性后代，选取其中4个后代的Southern印迹结果示于图1B。在图1B中，对于R26探针，例如，5'正向探针：ACTCCCGAAGGAAAAGGCATTGGTT(SEQ ID NO:7)、5'反向探针：CCAGTGCAAGTGACATGAATTCCTCC(SEQ ID NO:8)、3'正向探针：GGTATCTTTAGAACCAAGGGTCT(SEQ ID NO:9)、3'反向探针：AGGTTGCGGTGATAATAATTCAAG(SEQ ID NO:10)，用SpeI分别消化小鼠的基因组DNA，C57BL/6野生型基因组和R26插入的基因组的条带的预期大小分别为8.9kb和14.2kb；对于WPRE探针，例如，正向探针：GTGGATACGCTGCTTTAATGCC(SEQ ID NO:11)、反向探针：AAGGGAGATCCGACTCGTCTG(SEQ ID NO:12)，用Bgl II分别消化小鼠的基因组DNA，阳性条带的预期大小为5.1kb。这7个后代也称为首建鼠。
一只雄性首建鼠和一只雌性首建鼠在断奶前死亡。对其余5只首建鼠，将雌性首建鼠与野生型C57BL/6小鼠交配繁育，获得F1子代.取小鼠尾尖进行PCR基因分型(图1C)和Southern印迹以鉴定正确插入了hDPP4基因的阳性F1子代。共获得四只F1阳性小鼠。
将F1子代阳性小鼠互交繁育，获得在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的C57BL/6小鼠。该纯合小鼠和其后代称为B6-Gt(Rosa)26Sortml(SA-hDPP4-tdTomato)小鼠，简称为R26-hDPP4小鼠。
实施例3.对R26-hDPP4小鼠中hDPP4基因表达的检测和免疫系统的检测
实施逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测R26-hDPP4小鼠中hDPP4mRNA的表达。图1D示出了在肺、脑、心脏、肝、肾、和肠中均可检测到hDPP4mRNA的明显表达。肺和脑组织的Western印迹证实了hDPP4蛋白的表达情形(图1E)。本发明的R26-hDPP4小鼠在肺中具有最高的hDPP4表达。受益于hDPP4基因后插入的tdTomato基因，通过生物发光成像(bioluminescent imaging；BLI)可视地展示了hDPP4在小鼠组织和全身的表达模式(图1F)。
通过流式细胞术检测到R26-hDPP4小鼠中IL-12、TNF-α、INF-γ、MCP-1、IL-10和IL-6的表达与野生型C57BL/6小鼠中相应细胞因子的表达相当，这表明插入人DPP4对小鼠DPP4(mDPP4)或小鼠免疫系统的正常功能没有任何不利影响。
实施例4.MERS-CoV真病毒对R26-hDPP4小鼠的感染
为了测试实施例2的R26-hDPP4小鼠是否能支持MERS-CoV真病毒复制和有效感染，用A.M.Zaki等人(Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia inSaudi Arabia.New England Journal of Medicine 367,1814-1820(2012))分离出的MERS-CoV临床株hCoV-EMC以1.5x105PFU的低剂量鼻内(I.N.)感染4-5周龄R26-hDPP4和野生型C57BL/6小鼠。每组感染四只小鼠。
在感染后(post-infection；p.i.)第5天，野生型小鼠的体重增加24％(图2A的上半部分)，而R26-hDPP4小鼠体重明显下降了23％-33.5％(图2A的下半部分)。在感染后第4天，所有4只R26-hDPP4小鼠的体重减轻达到20％，并且其中有两只小鼠甚至失去了约30％的体重，符合处死动物的标准(A.S.Cockrell等人,A mouse model for MERScoronavirus-induced acute respiratory distress syndrome.Nature microbiology2,16226(2017))。
在感染后第5天按照现有技术中描述的方案(X.-C.Tang等人,Identification ofhuman neutralizing antibodies against MERS-CoV and their role in virusadaptive evolution.Proceedings of the National Academy of Sciences 111,E2018-E2026(2014))，通过Vero细胞上的空斑测定法来确定受感染小鼠肺组织中的病毒滴度。所有病毒保存在具有严格的个人防护设备的BSL-3条件下。经测定，受感染的R26-hDPP4小鼠肺中的病毒滴度为3log10 PFU/g，而在野生型小鼠中未检测到病毒(图2B，平均差异＝2.958，差异的95％CI＝1.266-4.699)。
尽管体重减轻和病毒载量提供了R26-hDPP4小鼠模型易感性的重要量值，但这些参数并不直接反映病毒感染引起的病理变化。接下来，对从感染小鼠收集的肺、脑、肝和肾进行了组织病理学分析和免疫组织化学分析。
结果如图2C至图2O和图8A至图8D所示。真性MERS-CoV感染的R26-hDPP4小鼠显示为在肺中严重的疾病症状，包括肺泡隔(alveolar septa)增宽、水肿、血管扩张和充血、炎性细胞的血管周浸润和支气管上皮细胞坏死(图2D，图8A)。在野生型小鼠的肺中没有发现明确的症状(图2J，图8B)。通过病理评分进行定量分析，结果如图2C所示。在R26-hDPP4小鼠中图2C横坐标上所示的疾病症状与野生型小鼠相比均具有显著的差异。
另外，与野生型小鼠比较，观察到了R26-hDPP4小鼠小脑、脑神经节和大脑、血管周神经胶质增生(图2F，图2L；图8C，图8D)。通过IHC测定法检测了在小脑、脑神经节和大脑中的病毒载量(图2G，图2M)。与病毒载量相关，在所有MERS-CoV真病毒攻击的R26-hDPP4小鼠的小脑、脑神经节和大脑中观察到血管周神经胶质增生(一种炎症反应的指示)，但在以相同方式攻击的任何野生型小鼠中并非如此。
由此可见，与病理变化相关地，通过IHC测定证实了在R26-hDPP4小鼠的肺(图2E)和小脑(图2G)中检测到病毒载量，但在野生型小鼠的肺(图2K)和小脑(图2M)中仅检测到少量或没有病毒。这些结果表明本发明的R26-hDPP4小鼠容许真性MERS-CoV感染，并且感染伴有与MERS-CoV感染人类患者类似的严重疾病症状。
尽管现有技术报导了MERS-CoV感染导致在人类中存在急性肾炎患者(R.-h.Cha等人,A case report of a Middle East respiratory syndrome survivor with kidneybiopsy results.Journal of Korean medical science 31,635-640(2016))，但在本实施例中，受感染的R26-hDPP4小鼠和野生型C57BL/6小鼠的肾均未见明显病变(图2H，I，N，O)。
在本实施例中，R26-hDDP4小鼠以1.5×105PFU的剂量感染临床株hCoV-EMC。该使用的病毒攻击剂量(即，1.5×105PFU)远低于之前报导的使用小鼠适应病毒株的攻击剂量(A.S.Cockrell等人,A mouse model for MERS coronavirus-induced acuterespiratory distress syndrome.Nature microbiology 2,16226(2017))，其中使用的病毒攻击剂量是5×106PFU。
实施例5.抗病毒剂和疫苗阻止MERS-CoV真病毒对R26-hDPP4小鼠感染的体内功效
制备抗体：
来自人β-冠状病毒2c EMC/2012病毒株(GenBank登录号AFS88936.1)的刺突(Spike，缩写为“S”)蛋白的重组胞外结构域(aa 1-1297，目录号：40069-V08B)和其重组RBD(受体结合结构域)蛋白(aa 367-606，目录号：40071-V08B1)购自Sino Biological,Inc.(中国，北京)。
如以下步骤所示进行噬菌体文库构建和抗体筛选。用5μg重组S蛋白胞外结构域腹膜内(I.P.)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠。使用从脾细胞提取的RNA来建立免疫的噬菌体展示抗体文库。重组RBD蛋白用于筛选噬菌体抗体。经过四轮淘选后，获得了多种与作为糖蛋白的S蛋白胞外结构域特异性结合的噬菌体抗体，其中之一命名为噬菌体抗体MERS-H111。
使用PCR技术将小鼠噬菌体抗体MERS-H111的轻链的和重链的可变区与人抗体种系文库进行比对，并选择最合适的人构架区来交换(P.Steinberger等人,Generation andCharacterization of a Recombinant Human CCR5-specific Antibody A PHAGEDISPLAY APPROACH FOR RABBIT ANTIBODY HUMANIZATION.Journal of BiologicalChemistry 275,36073-36078(2000)；Y.Yu等人,A humanized anti-VEGF rabbitmonoclonal antibody inhibits angiogenesis and blocks tumor growth inxenograft models.PLoS One 5,e9072(2010))。关键氨基酸被改变回小鼠序列以保持结构稳定性。基因合成密码子优化的VL和VH序列。将VL和VH基因序列分别构建到κ链表达载体中和IgG1链表达载体中。将MERS-H111-1的轻链表达质粒和重链表达质粒转染入悬浮培养的HEK-293细胞(ATCC，美国)中，并且使用蛋白A亲和柱从7天培养物的上清液纯化表达的抗体，将获得的人源化单克隆抗体命名为H111-1抗体。H111-1抗体由神州细胞工程有限公司(http://www.sinobiological.com)提供。阳性对照抗体m336由江世波教授(Prof.ShiboJiang)提供(A.S.Agrawal等人,Passive transfer of a germline-like neutralizinghuman monoclonal antibody protects transgenic mice against lethal Middle Eastrespiratory syndrome coronavirus infection.Scientific reports 6,31629(2016))。
抗体的体内预防功效：
将1mg/kg的mAb H111-1或5mg/kg的mAb H111-1通过I.P.施与4周龄的R26-hDPP4小鼠，6小时后，用1.5x105PFU的低剂量hCoV-EMC鼻内(I.N.)感染所述小鼠。在感染后第5天，处死小鼠用于病毒滴度和病理学分析。
对于5mg/kg和1mg/kg组，H111-1抗体的施用分别显著地将肺中的病毒滴度从3log10PFU/g降低至0.9和1.2log10PFU/g(图3A)，并且抗体以剂量依赖性方式降低了体重减轻率(表1)。较高单克隆抗体H111-1剂量组的病毒滴度低于检测限(limit of detection；LOD)。对于5mg/kg组，对真病毒的平均抑制率为70％，且对于1mg/kg组，真病毒的平均抑制率为60％。值得注意的是，H111-1抗体在低和高剂量组的每组四只小鼠中的两只小鼠中完全消除了肺中的病毒载量(图3A)，肺的IHC结果也表明较少的病毒载量(图3C中的小图③，④)，而小脑病毒减少不明显(图3C中的小图⑦，⑧)。虽然mAb H111-1施用后在小鼠中仍然可以观察到与ARDS和病毒载量相关的病理学变化，但mAb H111-1能够减轻肺和脑部的症状(图3C中的小图①，②，⑤，⑥)，且显著改善了支气管上皮细胞的变性和坏死(图3B，p<0.05)。这些结果表明，人源化mAb H111是防止MERS-CoV感染的有前景的抗病毒剂。
表1.施用中和性mAb H111-1对受感染的R26-hDPP4小鼠体重的影响
注:*全部R26-hDPP4小鼠用真性MERS-CoV以1.5x105PFU的剂量攻击
#每组包括四只小鼠，表中数值表示小鼠体重变化％
本实施例的结果也意味着R26-hDPP4小鼠是体内评估抗MERS-CoV的抗病毒剂的有效模型。
实施例6.假型MERS-CoV病毒包装系统的构建
本实施例的假型MERS-CoV病毒包装系统包含两种质粒，一种是HIV包膜基因缺失的HIV骨架质粒，另一种是含有编码人β-冠状病毒2c EMC/2012病毒株(GenBank登录号AFS88936.1)刺突蛋白(也称为Spike蛋白或S蛋白)的基因的表达质粒。
在本实施例中，使用了四种HIV包膜基因缺失的HIV骨架质粒，分别是：pSG3.Δenv.Fluc(其结构参见CN104830908A)、pSG3.Δenv.Fluc.Δnef(通过将pSG3.Δenv.Fluc中的nef基因缺失，获得pSG3.Δenv.Fluc.Δnef)、pSG3.Δenv.cmvFluc(其结构参见CN104830908A)和NTL-3.Fluc.R-.E-(NIH惠赠)。
在本实施例中，构建了四种表达MERS-CoV病毒S蛋白的质粒，分别是：pCAG-MERS、pcDNA-MERS、pCMV-MERS和pcDNA-opti-MERS。具体构建方法如下。
将MERS-CoV病毒S蛋白的如下编码基因(中国苏州金唯智生物科技有限公司合成)
GGATCCCGCCGCCGCCATGATACACTCAGTGTTTCTACTGATGTTCTTGTTAACACCTACAGAAAGTTACGTTGATGTAGGGCCAGATTCTGTTAAGTCTGCTTGTATTGAGGTTGATATACAACAGCTTTCTTTGATAAAACTTGGCCTAGGCCAATTGATGTTTCTAAGGCTGACGGTATTATATACCCTCAAGGCCGTACATATTCTAACATAACTATCACTTATCAAGGTCTTTTTCCCTATCAGGGAGACATGGTGATATGTATGTTTACTCTGCAGGACATGCTACAGGCACAACTCCACAAAAGTTGTTTGTAGCTAACTATTCTCAGGACGTCAAACAGTTTGCTAATGGGTTTGTCGTCCGTATAGGAGCAGTGCCAATTCCACTGGCACTGTTATTATTAGCCCATCTACCAGCGCTACTATACGAAAAATTTACCCTGCTTTTATGCTGGGTTCTTCAGTTGGTAATTTCTCAGATGGTAAAATGGGCCGCTTCTTCATCATACTCTAGTTCTTTTGCCCGATGGATGTGGCACTTTACTTAGAGCTTTTTATTGTATTCTAGAGCCTCGCTCTGGAAATCATTGTCCTGCTGGCAATTCCTATACTTCTTTTGCCACTTATCAACTCCTGCAACAGATTGTTCTGATGGCAATTACAATCGTAATGCCAGTCTGAACTCTTTTAAGGAGTATTTTAATTTACGTAACTGCACCTTTATGTACACTTATAACATTACCGAAGATGAGATTTAGAGTGGTTTGGCATTACACAAACTGCTCAAGGTGTTCACCTCTTCTCATCTCGGTATGTTGATTTGTACGGCGGCAATATGTTTCAATTTGCCACCTTGCCTGTTTATGATACTATTAAGTATTATCTATCATTCCTCACAGTATTCGTTCTATCCAAAGTGATAGAAAAGCTTGGGCTGCCTTCTACGTATATAAACTTCAACCGTTAACTTTCCTGTTGGATTTTTCTGTTGATGGTTATATACGCAGAGCATAGACTGTGGTTTTAATGATTTGTCACAACTCCACTGCTCATATGAATCCTTCGATGTTGAATCTGGAGTTTATTCAGTTTCGTCTTTCGAAGCAAAACCTTCTGGCTCAGTTGTGGAACAGGCTGAGGTGTTGAATGTGATTTTTCACCTCTTCTGTCTGGCACACCTCCTCAGGTTTATAATTTCAAGCGTTTGGTTTTTACCAATTGCAATTATAATCTTACCAAATTGCTTTCACTTTTTTCTGTGAATATTTTACTTGTAGTCAAATATCTCCAGCAGCAATTGCTAGCAACTGTTATTCTTCACTGATTTTGGATTACTTTTCATACCCACTTAGTATGAAATCCGATCTCAGTGTTAGTTCTGCTGGTCCAATTCCCAGTTTAATTATAAACAGTCCTTTTCTAATCCCACATGTTTGATTTTAGCGACTGTTCCTCATAACCTTACTACTATTACTAAGCCTCTTAAGTACAGCTATATTAACAAGTGCTCTCGTCTTCTTCTGATGATCGTACTGAAGTACCTCAGTTAGTGAACGCTAATCAATACTCACCCTGTGTATCCATTGTCCCATCCACTGTGTGGGAAGACGGTGATTATTATAGGAAACAACTATCTCCACTTGAAGTGGTGGCTGGCTTGTTGCTAGTGGCTCAACTGTTGCCATGACTGAGCAATTACAGATGGGCTTTGGTATTACAGTTCAATATGGTACAGACACCAATAGTGTTTGCCCCAAGCTTGAATTTGCTAAGACACAAAAATTGCCTCTCAATTAGGCAATTGCGTGGAATATTCCCTCTATGGTGTTTCGGGCCGTGGTGTTTTTCAGAATTGCACAGCTGTAGGTGTTCGACAGCAGCGCTTTGTTTATGATGCGTCCAGAATTTAGTTGGCTATTATTCTGATGATGGCAACTACTACTGTTTGCGTGCTTGTGTTAGTGTTCCTGTTTCTGTCATCTATGATAAAGAAACTAAAACCCACGCTACTCTATTTGGTAGTGTTCATGTGAACACATTTCTTCTACCATGTCTCAATACTCCCGTTCTACGCGATCAATGCTTAAACGGCGAGATTCTACATATGGCCCCCTTCAGACACCTGTTGGTTGTGTCCTAGGACTTGTTAATTCTCTTTGTTCGTAGAGGACTGCAAGTTGCCTCTTGGTCAATCTCTCTGTGCTCTTCCTGACACACCTAGTACTCTCACACCTCGCAGTGTGCGCTCTGTTCCAGGTGAAATGCGCTTGGCATCCATTGTTTTAATCATCCTATTCAGGTTGATCAACTTAATAGTAGTTATTTTAAATTAAGTATACCCACTAATTTTTCCTTTGGTGTGACTCAGGAGTACATTCAGACAACCATTCAGAAAGTTACTGTTGATGTAAACAGTACGTTTGCAATGGTTTCCAGAAGTGTGAGCAATTACTGCGCGAGTATGGCCAGTTTTGTTCCAAAATAAACCAGGCTCTCCATGGTGCCAATTTACGCCAGGATGATTCTGTACGTAATTGTTTGCGAGCGTGAAAAGCTCTCAATCATCTCCTATCATACCAGGTTTTGGAGGTGACTTTAATTTGACACTTCTAGAACCTGTTTCTATATCTACTGGCAGTCGTAGTGCACGTAGTGCTATTGGGATTTGCTATTTGACAAAGTCACTATAGCTGATCCTGGTTATATGCAAGGTTACGATGATTGCATGCAGCAAGGTCCAGCATCAGCTCGTGATCTTATTTGTGCTCAATATGTGGCTGGTTACAAATATTACCTCCTCTTATGGATGTTAATATGGAAGCCGCGTATACTTCATCTTTGCTTGGCAGCATAGCAGGTGTTGGCTGGACTGCTGGCTTATCCTCCTTTGCTGCTATTCCATTTGCACAGAGTATCTTTTATAGGTTAAACGGTGTTGGCATTACTCAACAGTTCTTTCAGAGAACCAAAAGCTTATTGCCAATAAGTTTAATCAGGCTCTGGGAGCTATGCAAACAGGCTTCACTACAACTAATGAAGCTTTTCAGAAGGTTCAGGATGCTGTGAACAACAATGCACGGCTCTATCCAAATTAGCTAGCGAGCTATCTAATACTTTTGGTGCTATTTCCGCCTCTATTGGAGACATCATACAACGTCTTGATGTTCTCGAACAGGACGCCCAAATAGACAGACTTATTAATGGCGTTTGACAACACTAAATGCTTTTGTTGCACAGCAGCTTGTTCGTTCCGAATCAGCTGCTCTTTCCGCTCAATTGGCTAAAGATAAAGTCAATGAGTGTGTCAAGGCACAATCCAAGCGTTCTGGATTTGCGGTCAAGGCACACATATAGTGTCCTTTGTTGTAAATGCCCCTAATGGCCTTTACTTCATGCATGTTGGTTATTACCCTAGCAACCACATTGAGGTTGTTTCTGCTTATGGTCTTTGCGATGCAGTAACCCTACTAATTGTATAGCCCCTGTTAATGGCTACTTTATTAAAACTAATAACACTAGGATTGTTGATGAGTGGTCATATACTGGCTCGTCCTTCTATGCACCTGAGCCCATTACCTCCCTTAATCTAAGTATGTTGCACCACAGGTGACATACCAAAACATTTCTACTAACCTCCCTCCTCCTCTTCTCGGCAATTCCACCGGGATTGACTTCCAAGATGAGTTGGATGAGTTTTTCAAAAATGTTAGCACAGTATACCTAATTTTGGTTCCCTAACACAGATTAATACTACATTACTCGATCTTACCTACGAGATGTTGTCTCTTCAACAAGTTGTTAAAGCCCTTAATGAGTCTTACATAGACCTTAAAGAGCTTGCAATTATACTTATTACAACAAATGGCCGTGGTACATTTGGCTTGGTTTCATTGCTGGGCTTGTTGCCTTAGCTCTATGCGTCTTCTTCATACTGTGCTGCACTGGTTGTGGCACAAACTGTATGGGAAACTTAAGTGTAATCGTTGTTGTGATAGATACGAGGAATACGACCTCGAGCCGCATAAGGTTCATGTTCACTAACTCGAG(SEQ ID NO:13)
经BamH1和XhoI酶切后，分别连接入同样经酶切的真核表达质粒pCAG3.1、pCMV3.1、和pcDNA 3.1(其结构均参见CN104830908A)中，获得的质粒分别称为pCAG-MERS、pcDNA-MERS、pCMV-MERS。
将经优化的如下MERS-CoV病毒S蛋白编码基因(中国苏州金唯智生物科技有限公司合成)
GGATCCCGCCGCCGCCATGATCCACTCCGTGTTCCTGCTGATGTTTCTGCTGACCCCCACAGAGAGCTACGTGGACGTGGGACCTGACAGCGTCAAGTCCGCCTGCATCGAGGTGGATATTCAACAGCATTCTTCGATAAGACATGGCCCAGACCTATCGACGTGAGCAAAGCCGACGGCATCATCTATCCTCAGGGAAGAACCTACTCCAACATTACCATCACATACCAGGGCCTGTTTCCTTACCAGGGCGACACGGCGATATGTACGTGTACTCCGCCGGCCACGCTACCGGCACCACACCTCAAAAACTGTTCGTCGCCAACTATTCCCAGGACGTGAAGCAGTTCGCCAATGGATTTGTGGTGAGAATCGGCGCTGTGCCAACAGCACCGGAACCGTCATTATCAGCCCCAGCACCAGCGCCACAATTAGGAAGATCTACCCCGCCTTCATGCTGGGCTCCAGCGTGGGCAACTTCAGCGACGGAAAAATGGGAAGGTTCTTCACCATACACTGGTGCTGCTGCCCGACGGATGCGGAACCCTGCTGAGGGCTTTCTACTGCATTTTAGAACCTAGGTCCGGCAACCACTGCCCTGCTGGAAATAGCTACACCTCCTTTGCTACATACCAACACCTGCCACCGACTGCTCCGACGGCAACTATAACAGAAACGCCAGCCTGAACAGCTTCAAGGAATACTTCAACCTCAGAAATTGTACCTTCATGTACACCTATAACATTACAGAGGACGAGATTTAGAATGGTTCGGCATTACCCAGACAGCCCAGGGCGTCCATCTGTTTAGCTCCAGATATGTCGACCTGTATGGCGGAAACATGTTCCAGTTCGCTACCCTGCCTGTCTATGACACAATCAAGTACTACGCATCATCCCTCACAGCATCAGAAGCATCCAGTCCGACAGGAAGGCCTGGGCCGCCTTTTATGTCTACAAGCTGCAGCCTCTGACATTCCTCCTGGATTTTTCCGTCGACGGCTACATTAGGAGAGCATCGACTGCGGCTTTAACGATCTCAGCCAGCTCCACTGCTCCTATGAAAGCTTCGATGTCGAGTCCGGCGTCTACAGCGTGTCCAGCTTTGAAGCCAAACCTTCCGGCTCCGTCGTCGAACAGGCTGGGGAGTGGAATGCGACTTTAGCCCTCTGCTGTCCGGAACCCCCCCCCAGGTGTACAATTTCAAGAGGCTGGTCTTTACCAACTGTAATTACAACCTCACCAAGCTGCTGAGCCTGTTTTCCGTGAACACTTTACCTGCTCCCAAATCTCCCCCGCCGCTATCGCCAGCAATTGCTACTCCAGCCTGATCCTCGATTACTTTAGCTACCCCCTGAGCATGAAGTCCGATCTCTCCGTCAGCTCCGCTGGCCCTATAGCCAGTTCAACTATAAACAATCCTTCTCCAATCCCACCTGTCTGATCCTCGCCACAGTGCCCCACAACCTGACAACCATCACAAAGCCTCTGAAGTACAGCTACATTAATAAGTGCAGCAGGCTGCCAGCGACGACAGGACAGAGGTCCCCCAGCTGGTGAACGCTAATCAGTACTCCCCTTGCGTGTCCATCGTGCCTTCCACCGTGTGGGAAGACGGAGACTACTACAGAAAGCAACTCTCCCCTTTAGAAGAGGCGGCTGGCTGGTCGCTTCCGGAAGCACCGTCGCCATGACAGAACAGCTGCAGATGGGCTTCGGAATCACCGTCCAGTACGGAACAGATACCAACTCCGTCTGCCCCAAATTAGAATTTGCCAACGACACAAAGATTGCCAGCCAGCTGGGCAATTGTGTGGAGTACTCCCTCTACGGAGTCAGCGGCAGGGGCGTGTTTCAGAACTGACCGCTGTCGGCGTGAGACAACAGAGGTTCGTCTACGACGCTTATCAGAACCTCGTCGGCTACTATAGCGACGATGGCAACTACTATTGCCTCAGAGCCTGCGTCAGCGTGCCCGTCAGCGTGATTTCGATAAGGAGACCAAGACACACGCCACCCTGTTCGGCTCCGTGGCTTGTGAACACATCTCCTCCACCATGTCCCAATACAGCAGATCCACAAGGAGCATGCTGAAGAGGAGAGACAGCACATACGGACTCTGCAGACACCCGTCGGATGTGTGCTCGGACTGGTCAACTCCAGCCTGTTTGTGGAAGACTGCAAACTGCCTCTGGGCCAGTCCCTGTGTGCTCTCCCCGACACACCTTCCACACTGACACCCAGAGCGTGAGAAGCGTGCCCGGCGAGATGAGACTGGCCAGCATCGCCTTCAACCACCCCATCCAGGTGGACCAACTCAACAGCAGCTACTTCAAGCTGAGCATCCCCACCAACTTCTCCTTTGGCGTGAACAAGAATATATTCAGACAACAATTCAGAAGGTGACAGTGGATTGTAAGCAGTACGTGTGCAATGGCTTCCAGAAGTGTGAGCAGCTGCTGAGAGAGTATGGACAGTTTTGCTCCAAGATTAATCAACCCTCCACGGCGCCAATCTGAGGCAGGATGACAGCGTCAGAAATCTGTTCGCCTCCGTGAAAAGCAGCCAATCCAGCCCCATTATTCCCGGCTTCGGCGGAGATTTCAATCTCACACTGCTGGAGCCGTGAGCATTTCCACAGGCAGCAGGTCCGCTAGGAGCGCCATTGAAGACCTGCTGTTCGACAAAGTCACCATCGCTGATCCCGGCTATATGCAGGGCTATGACGACTGTATGCAACAAGGCCCCGCTTCGCCAGAGATCTCATCTGTGCTCAGTACGTCGCCGGATATAAAGTCCTGCCTCCTCTGATGGACGTGAACATGGAGGCCGCCTACACCAGCAGCCTGCTGGGAAGCATCGCCGGAGTGGGCTGGACACCGGCCTGTCCTCCTTTGCCGCTATCCCCTTTGCCCAGAGCATTTTCTACAGGCTGAATGGCGTGGGAATCACCCAGCAGGTGCTGTCCGAAAATCAGAAGCTCATCGCCAATAAGTTCAACCAGGCCTCGGAGCCATGCAAACAGGCTTCACCACCACCAACGAAGCCTTTCAAAAGGTCCAGGATGCTGTGAACAACAATGCTCAGGCCCTCAGCAAGCTGGCTTCCGAGCTGAGCAACACATTTGGCGCTACAGCGCCAGCATCGGCGATATTATCCAAAGGCTCGACGTGCTGGAGCAAGACGCTCAAATCGACAGGCTCATCAACGGAAGACTCACCACCCTCAACGCCTTCGTCGCTCAGCAACTGGTCAGATCCAAAGCGCCGCCCTGAGCGCTCAGCTGGCTAAGGATAAGGTCAATGAGTGTGTGAAGGCCCAGAGCAAGAGGTCCGGCTTCTGCGGACAGGGAACCCACATTGTGAGCTTTGTGGTCAACGCCCCTAAGGACTGTATTTCATGCACGTGGGCTACTACCCTTCCAACCACATTGAGGTGGTGTCCGCTTACGGACTGTGCGATGCCGCCAACCCTACAAACTGCATCGCCCCTGTGAACGGCTACTTTATTAAGAAAACAATACCAGGATCGTGGACGAGTGGAGCTACACAGGTTCTAGCTTCTACGCCCCTGAGCCCATTACCTCCCTGAACACCAAGTATGTCGCTCCCCAAGTCACATACCAGAACATCTCCACAAACTCCCCCCTCCTCTCCTCGGAAACTCCACAGGCATCGACTTCCAGGACGAGCTGGACGAATTTTTCAAGAATGTCTCCACCAGCATCCCCAACTTCGGCTCCCTCACCCAGATCAACACCACCCTCCTGATCTCACCTACGAGATGCTGTCCCTCCAACAGGTCGTGAAGGCTCTGAACGAGTCCTACATTGACCTGAAGGAACTCGGCAATTACACATATTACAATAAGTGGCCCTGGTATATCTGGCTCGGCTCATTGCCGGACTGGTCGCTCTGGCCCTGTGCGTGTTCTTCATTCTGTGCTGCACCGGATGTGGAACCAATTGTATGGGAAAACTCAAGTGTAATAGGTGCTGCGACAGGTACGAGGAGTACGACCTGAGCCTCACAAAGTGCACGTGCATTGACTCGAG(SEQ ID NO:14)
经BamH1和XhoI酶切后，分别连接入同样经酶切的真核表达质粒pcDNA3.1中，获得的质粒称为pcDNA-opti-MERS。
在相同的实验条件下，将上述4ug每种HIV包膜基因缺失的HIV骨架质粒与2ug每种表达MERS-CoV病毒S蛋白的质粒一一组合，使用共转染试剂
3000以总量10ul共转染入人胚肾(HEK)293T细胞(来自ATCC，美国)，培养48小时后，以210xg离心5分钟收集含假型MERS-CoV病毒的培养上清液，将培养上清液通过0.45uM孔径滤器过滤，然后感染靶细胞Huh7，并在萤光素酶活性测定前孵育48小时。使用Promega’s Bright-GloTM萤光素酶检测试剂盒，检测Fluc表达的化学发光值，用“相对光单位(relative light units；RLU)”表示，结果见图9B，在16种组合中，HIV骨架质粒pSG3.Δenv.Fluc与MERS-CoV病毒S蛋白表达质粒pcDNA-opti-MERS的组合获得了最高的RLU值。
实施例7.包装假型MERS-CoV病毒的包装细胞和转染试剂的选择
将实施例6的HIV骨架质粒pSG3.Δenv.Fluc与MERS-CoV病毒S蛋白表达质粒pcDNA-opti-MERS以如上的2:1的比率共转染入不同的包装细胞，包括人胚肾(HEK)293T细胞(来自ATCC，美国)、293细胞(来自ATCC，美国)，其中使用了不同的转染试剂，包括Lipofectamine 2000(Invitrogen,11668019)、Lipofectamine 3000(Invitrogen,L3000015,USA)、PEI(Alfa Aesar,43896,USA)、Necfect,VigoFect(VigrousBiotechnology,T001，中国)、和TurboFectTM in vitroTransfection Reagent(ThermoScientific,R0531，USA))。
与实施例6同样地实施细胞培养、感染靶细胞和测定RLU。结果表明，当使用HEK293T包装细胞系且转染试剂为
3000时获得的RLU最大(见图9C，其中横坐标上的“lipo 2000”代表Lipofectamine 2000；“lipo 3000”代表Lipofectamine 3000；“TurboFect”代表“TurboFectTM in vitroTransfection Reagent”)。
实施例8.假型MERS-CoV病毒包装系统的优化
将实施例6所述的HIV骨架质粒pSG3.Δenv.Fluc与MERS-CoV病毒S蛋白表达质粒pcDNA-opti-MERS以1:3；1:2；1:1；2:1；3:1；或4:1的比率使用
3000共转染入作为包装细胞的HEK 293T细胞。
与实施例6同样地实施细胞培养、感染靶细胞和测定RLU。结果表明，当pSG3.Δenv.Fluc与pcDNA-opti-MERS的比率为3:1时获得的RLU最大(图9D)。
为了进一步提高假型MERS-CoV病毒的效价，使用优化的密码子优化了HIV骨架质粒pSG3.Δenv.Fluc和MERS-CoV病毒S蛋白表达质粒pcDNA-opti-MERS。比较了用优化的和没有优化的假型MERS-CoV病毒感染的细胞的RLU值(图9E)。
实施例9.假型MERS-CoV病毒的体外滴度测定
使用实施例8的经优化的HIV骨架质粒pSG3.Δenv.Fluc和MERS-CoV病毒S蛋白表达质粒pcDNA-opti-MERS以3:1的比率，使用
3000共转染入作为包装细胞的HEK 293T细胞。培养48小时后，以210xg离心5分钟收集含假型MERS-CoV病毒(也称为pHIV/MERSS/Fluc)的培养上清液，将培养上清液通过0.45uM孔径滤器过滤，然后用30kDa超滤离心管(Millipore，Boston，MA，USA)浓缩，分装冻存于-80℃备用。然后进行病毒滴定。取冻存的假型MERS-CoV病毒，3倍系列稀释加入96孔板中，然后感染293T细胞，制备1×105个细胞/ml的293T细胞悬液，每孔加入100μl，感染48h后，检测生物发光，利用Reed-Muench公式计算50％组织培养物感染剂量(TCID50)高达1.27×107.5TCID50/ml，比现有技术中报导的假型MERS-CoV病毒滴度提高了约100倍。
实施例10.假型MERS-CoV病毒的小鼠体内滴度测定和感染动物模型的建立
用实施例9的假型MERS-CoV病毒(1.27×107.5TCID50/ml)感染4周龄R26-hDPP4小鼠。在I.P感染模型中确定所述假型MERS-CoV病毒的50％动物感染剂量(50％animalinfectious dose；AID50)为每毫升1×101TCID50。具体实验过程如下。将4周龄R26-hDPP4小鼠分为6组，每组8只；分别使用1.27×107.5TCID50/ml，1.27×106.5TCID50/ml，1.27×105.5TCID50/ml，1.27×104.5TCID50/ml，1.27×103.5TCID50/ml的假型MERS-CoV病毒攻击小鼠，设置不使用病毒攻击的小鼠组作为对照；第六天测试荧光读值，计算获得TCID50。
对4周龄的R26-hDPP4小鼠组腹膜内(I.P.)施用实施例9制备的假型MERS-CoV病毒，施用的假病毒量为1.27x107.5TCID50/只。在假病毒感染后的多个时间点麻醉小鼠并用BLI系统观察由假型MERS-CoV病毒中含有的Fluc报告蛋白发射的生物发光。
在感染后第2天，在靠近注射部位处的腹部观察到生物发光(图4A)。然后在感染后第6天，生物发光传播到胸腔；同时，生物发光达到峰值强度，然后逐渐减弱，直至感染后第20天观察不到生物发光(图4B)。
为了确定感染部位，在感染后第6天(即，感染高峰那天)解剖小鼠并进观察。用BLI对器官测试以下器官的Fluc转基因表达：1＝胸腺；2＝心脏；3＝肝；4＝脾；5＝肾；6＝肺；7＝淋巴结；8＝肌肉；9＝皮肤；10＝卵巢或睾丸；11＝脑；12＝肠。图4C显示在所述器官和组织中，胸腺、肝、脾、肾、肺和肌肉被感染。在这些器官中检测到假病毒的较高拷贝数(图4D)，说明假型MERS-CoV病毒可有效感染hDPP4-KI小鼠。
由于MERS-CoV感染主要引起临床ARDS，其中重要的感染部位为呼吸道。因此，为了获得针对呼吸道感染的假病毒感染动物模型，对4周龄的R26-hDPP4小鼠组胸内(I.T.)途径施用实施例9制备的假型MERS-CoV病毒，施用的假病毒量为3.8x106.5TCID50/只。
逼真的图像显示感染主要出现在胸部，其中最强的感染出现在感染后第10天和第11天。在这种情况下，受感染的器官是胸腺、心脏和肺(图4C)。在所有小鼠中均观察到一致的感染特征，这表明对R26-hDPP4小鼠，I.T.攻击比I.P.攻击有一些优势。
也尝试了鼻内和静脉内攻击，但未能感染小鼠。
另外，为了测试动物年龄对感染易感性的影响，用实施例9制备的假型MERS-CoV病毒接种4-9周龄的R26-hDPP4小鼠。结果显示，4周龄的年轻小鼠和9周龄的老年小鼠都能受假型MERS-CoV病毒感染，但年轻小鼠更容易受到假型MERS-CoV病毒感染(图4E、图4F)。
在上述使用假型MERS-CoV病毒感染的R26-hDPP4小鼠中，对小鼠器官进行组织病理学检查，未观察到组织病理学变化(图4G)。对自上述使用假型MERS-CoV病毒感染的R26-hDPP4小鼠获得血清，使用Flow Assay Kits(BD Pharmingen，USA)，根据该制造商的说明书，测量了血清中IL-12、TNF-α、INF-γ、MCP-1、IL-10和IL-6的产生。在BD FACSCanto II(BD Biosciences,USA)上进行流式细胞术测量，并用FlowJo软件评价数据。结果表明，所述细胞因子表达与不使用假型MERS-CoV病毒感染的对照R26-hDPP4小鼠相比无变化。因此，假型MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠的动物模型是一种安全的动物模型。
通过BLI可视化和IHC测定法确认，胸内(I.T.)途径假型MERS-CoV病毒倾向于感染R26-hDPP4小鼠的支气管，如图4H所示，这一点与MERS-CoV真病毒感染的情形(图2E)是一致的。
实施例11.抗病毒剂和疫苗体外中和假型MERS-CoV病毒的功效
体外假病毒中和测试法是检测抗病毒剂和疫苗的功效的有用工具(G.Zhao等人,Asafe and convenient pseudovirus-based inhibition assay to detect neutralizingantibodies and screen for viral entry inhibitors against the novel humancoronavirus MERS-CoV.Virology journal 10,266(2013))。为了建立一种良好的体外中和测定方法，在多种细胞系中测试了实施例9中的假型MERS-CoV病毒(下文中有时也称为pHIV/MERSS/Fluc)的细胞嗜性。
所有12种受测试的细胞系都允许pHIV/MERSS/Fluc感染，这表明本发明构建的假型MERS病毒具有广泛的细胞嗜性；在所有12种受测试的细胞系中，人肝癌细胞系Huh7细胞系显示出最高的感染效率(图9F)。因此，在研究抗病毒剂和疫苗的体外功效时，可以选择Huh7细胞系来建立基于化学发光的高通量中和测定法，这样能够显示出好的灵敏性和特异性。
1)抗体
抗体的体外中和作用：
如在高通量体外中和测定法中所述，将本发明的假型MERS-CoV病毒与每种mAb在37℃孵育1小时，然后与购自Fengh Bio.Inc.(中国长沙)的人肝癌细胞系Huh7细胞或其他假型MERS病毒嗜性细胞在96孔板中混合和培养48小时。如之前所述(Q.Liu等人,A novelhigh-throughput vaccinia virus neutralization assay and preexisting immunityin populations from different geographic regions in China.PloS one 1,e33392(2012))，通过测量生物发光来确定假型MERS-CoV病毒的感染性。
确定了mAb H111-1和m336抗体对细胞感染假型MERS-CoV病毒的50％抑制浓度(IC50)分别为4.5和2.7ng/ml，代表了高的体外抑制活性。
2)肽抑制剂
衍生自MERS-CoV S蛋白的七重复序列(heptad repeat，HR)2的肽，如HR2P或其类似物HR2P-M2(L.Lu等人,Structure-based discovery of Middle East respiratorysyndrome coronavirus fusion inhibitor.Nature communications S,3067(2014))能够保护RAG-/-转导的小鼠免于MERS-CoV(EMC/2012株)感染，是一种针对MERS-CoV的肽抑制剂(R.Channappanavar等人,Protective effect of intranasal regimens containingpeptidic Middle East respiratory syndrome coronavirus fusion inhibitoragainst MERS-CoV infection.The Journal of infectious diseases 212,1894-1903(2015))。
在Huh7细胞系中测试了肽抑制剂HR2P-M2对本发明的假型MERS-CoV病毒感染的体外抑制潜力，确定了HR2P-M2对细胞感染的IC50为4504.5ng/ml。
实施例12.抗病毒剂和疫苗阻止假型MERS-CoV病毒感染的体内功效
使用本发明的R26-hDPP4小鼠研究了体内保护作用。
1)抗体
评估了人源化中和性单克隆抗体H111-1保护R26-hDPP4小鼠抗假型MERS-CoV病毒感染的体内功效。为了确认本发明的假型MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠的动物模型用于体内评估针对MERS-CoV病毒的抗体功效的适格性，还使用mAb m336(32)证实了保护R26-hDPP4小鼠抗感染的体内功效。
对5周龄R26-DPP4小鼠I.P.(图6A)或I.T.(图6B)施用1毫克抗体mAb H111-1/只小鼠；或仅施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为对照。每组使用四只小鼠。6小时后，对所述R26-DPP4小鼠I.T.施用实施例9的假型MERS-CoV病毒攻击，施用量为3.8x106.5TCID50/只。在假病毒感染后第11天，拍摄全身或器官的BLI(图6D，IT途径施用抗体的结果)。图6D显示了相对于PBS对照，抗体m336对小鼠的保护作用。
对于抗体m336(图6C)，与抗体mAb H111-1同样地进行R26-DPP4小鼠的施用和攻击，除了使用的抗体不同之外。图6E显示了相对于PBS对照，抗体m336对小鼠的保护作用。
2)肽抑制剂
对5周龄R26-DPP4小鼠I.T.施用肽抑制剂HR2P-M2，剂量为1000μg/只小鼠；或仅施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为对照。每组使用四只小鼠。30分钟后，对所述R26-DPP4小鼠I.T.施用实施例9的假型MERS-CoV病毒攻击，施用量为3.8x106.5TCID50/只。在假病毒感染后第11天拍摄BLI图像，并对全身或不同器官记录假病毒的信号。
如图7A所示，肽抑制剂HR2P-M2非常显著地降低了肺中假病毒的量。图7B显示了相对于PBS对照，肽抑制剂HR2P-M2对小鼠的保护作用。因此，本发明的假型MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠的动物模型能够用于体内评估针对MERS-CoV病毒的肽抑制剂的功效。
实施例13.假型MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠模型和真MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠模型的相关性研究
在假型或真性MERS-CoV感染的R26-hDPP4小鼠中，假型或真性MERS-CoV具有下表2中所示的生物学分布。
表2.在假型或真性MERS-CoV感染的R26-hDPP4小鼠中，假型或真性MERS-CoV的生物学分布
| 器官 | 肝 | 脾 | 肺 | 支气管 | 肾 | 肠 | 胸腺 | 肌肉 | 脑 |
| 假病毒<sup>①</sup> | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | ×√<sup>③</sup> |
| 真病毒<sup>②</sup> | nd<sup>④</sup> | nd | √ | √ | × | nd | nd | nd | √ |
①通过BLI和Q-PCR确定假病毒的分布，√意指阳性；×意指阴性
②通过滴定病毒或IHC确定真病毒的分布；
③通过BLI和Q-PCR在约50％感染的小鼠的脑中观察到假病毒，但是显示真病毒在所有感染小鼠的脑中。
④nd:没有测定到。
(注：表2中将肺和支气管分开描述，仅是为了强调假型或真性MERS-CoV在支气管中的分布)
通过IHC使用针对MERS-CoV的RBD的mAb R723检测假型MERS-CoV病毒感染的R26-hDPP4小鼠的肺和真性MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠的肺。如图5A-D所示，在R26-hDPP4小鼠的肺中假病毒和真病毒感染显示相似的模式。图5C和图5D显示假病毒和真病毒均分布于肺支气管的纤毛柱状上皮。由此可见，在假型或真性MERS-CoV感染的R26-hDPP4小鼠之间，肺部感染的症状是非常相似的，如局限于支气管上皮细胞，而所述肺部正是MERS-CoV感染的主要靶。
考虑到假型或真性MERS-CoV感染的R26-hDPP4小鼠之间共有常见的主要感染器官－肺，有必要在假型与真性MERS-CoV感染的R26-hDPP4小鼠模型之间建立病毒的攻击量转换率，用来评估在假病毒小鼠模型中使用的抗病毒剂的效果。
使用不同剂量的假型MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠，并施用人源化mAb H111-1(1mg/kg)，实验方法同上述实施例12。每组4-6只小鼠。计算mAb H111-1对假型MERS-CoV病毒感染小鼠的体内抑制率(◆)，获得图5中所示的mAb H111-1对假型MERS-CoV病毒感染小鼠的抑制率曲线。
当使用攻击量为1.5×105PFU的MERS-CoV真病毒感染R26-hDPP4小鼠时，计算出1mg/kg H111-1抗体对该攻击剂量的MERS-CoV真病毒感染小鼠的体内抑制率为60％(见实施例5)。
因此，当使用1.5x105PFU的MERS-CoV真病毒感染小鼠且抗病毒剂对感染小鼠发挥同样的体内抑制率时，对应使用的假型MERS-CoV病毒攻击量为3.25x107TCID50假病毒，也就是说，假病毒的1×TCID50对应于0.0046×PFU的真病毒(1.5x105PFU真病毒/3.25x107TCID50假病毒)。
本发明的实施例中例举了一种KI小鼠模型，其特征在于它的遗传稳定性、对MERS-CoV真病毒和假病毒的易感性、在呼吸道和CNS这两者中疾病症状的呈现与临床患者相近、以及明确的感染器官和部位，这意味着R26-hDPP4小鼠模型是一个独特的研究人类发病机理的模型。建立的假病毒模型具有信号强、重复性好和安全性高的优点，使其在缺乏BSL-3设施的常规生物学实验室中与真病毒模型一样高效地用来评价抗病毒剂和疫苗。
尽管已经出于说明本发明的目的显示了某些代表性实施方案和细节，但是本领域技术人员显而易见的是可以对它们进行多种变化和修改而不脱离主题发明的范围。在这个方面，本发明范围仅由以下权利要求限定。
Claims (20)
1.构建人二肽基肽酶4基因敲入的C57BL/6小鼠模型的方法，所述人二肽基肽酶4的缩写是hDPP4，所述方法包括：(a)在保留小鼠基因组中二肽基肽酶4基因的情况下，向C57BL/6小鼠基因组中的Rosa26基因座处定点插入hDPP4基因，所述小鼠基因组中二肽基肽酶4的缩写是mDPP4；(b)获得在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的小鼠；和(c)任选地，获得(b)中在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的C57BL/6小鼠的后代，
其中所述步骤(a)包括：
(i)向C57BL/6小鼠的合子中引入CRISPR/Cas9系统和供体DNA，其中所述CRISPR/Cas9系统能够在所述小鼠基因组Rosa26基因座的靶位点处引入双链断裂，且包含特异于靶DNA的单一向导RNA和Cas9蛋白质编码核酸或Cas9蛋白质，其中所述单一向导RNA包含SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列TAGGCCGCACCCTTCTCCGG和/或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列AAACCCGGAGAAGGGTGCGG，所述Cas9蛋白质是衍生自链球菌属物种(Streptococcus sp.)的Cas9蛋白质；其中所述供体DNA是包含hDPP4基因的打靶载体，所述打靶载体包含5’同源臂、剪接受体、hDPP4基因、增强mRNA稳定性和翻译效率的元件、多聚A序列、3’同源臂；所述增强mRNA稳定性和翻译效率的元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，所述同源臂是与该Rosa26基因座中的基因组序列同源的序列；
(ii)将获自(i)的各合子分别导入代孕鼠中妊娠，由代孕鼠产下后代；
其中所述代孕鼠可以来自任何小鼠品系；
(iii)将代孕鼠产下的后代中经鉴定为hDPP4阳性的小鼠作为首建鼠，并将首建鼠与C57BL/6小鼠交配繁育，获得F1子代；
所述步骤(b)包括：将步骤(a)获得的F1子代阳性小鼠互交繁育，获得在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的C57BL/6小鼠；所述小鼠在肺中具有最高的hDPP4表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述代孕鼠来自KM小鼠或ICR小鼠。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤(iii)中，将雌性首建鼠与C57BL/6小鼠交配繁育，获得F1子代。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas9蛋白质编码核酸有效地连接至编码核定位信号的一种或多种多核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述打靶载体包含5’同源臂、剪接受体、hDPP4基因、内部核糖体进入位点序列和/或2A序列、报告基因、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件、多聚A序列、3’同源臂；其中所述同源臂是与该Rosa26基因座中的基因组序列同源的序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述报告基因是用来检测hDPP4基因的表达情况的荧光报告基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述报告基因是tdTomato报告基因。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的R26-hDPP4小鼠的基因型和表型，所述在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的R26-hDPP4小鼠也称为基因敲入小鼠。
9.根据权利要求8所述的方法，其中通过PCR、Sourthern印迹鉴定所述基因敲入小鼠的基因型，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定所述基因敲入小鼠中hDPP4 mRNA的表达，和/或通过Western印迹和生物发光成像鉴定hDPP4蛋白的表达以及分布。
10.通过权利要求1－9中任一项所述的方法构建的hDPP4基因敲入小鼠模型的用途，用于在BSL-3设施中使用MERS-CoV真病毒感染所述hDPP4基因敲入小鼠并评估抗MERS-CoV的抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或治疗性功效，包括通过评估hDPP4基因敲入小鼠的体重、病毒载量、组织病理学评分、和/或通过免疫组织化学分析来确定抗病毒剂和疫苗的体内功效。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述MERS-CoV真病毒感染是通过鼻内、腹膜内或胸内等途径感染hDPP4基因敲入小鼠实施的。
12.通过权利要求1－9中任一项所述的方法构建的hDPP4基因敲入小鼠模型的用途，用于在缺乏BSL-3设施的生物实验室中使用假型MERS-CoV病毒感染所述hDPP4基因敲入小鼠并评估抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或治疗性功效，包括通过评估hDPP4基因敲入小鼠的假型MERS-CoV病毒载量、通过Q-PCR、生物发光成像检测、组织病理学评分、和/或通过免疫组织化学分析来确定抗病毒剂和疫苗的体内功效。
13.根据权利要求12所述的用途，其中使用所述假型MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠模型评估的抗病毒剂和疫苗的效果与使用真MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠模型评估的抗病毒剂和疫苗的效果具有相关性。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述缺乏BSL-3设施的生物实验室是BSL-2设施的生物实验室。
15.根据权利要求12所述的用途，其中所述假型MERS-CoV病毒感染是通过将所述假型MERS-CoV病毒以腹膜内途径感染或胸内途径感染hDPP4基因敲入小鼠实施的。
16.根据权利要求12－15中任一项所述的用途，其中所述假型MERS-CoV病毒是通过用包膜基因缺失的HIV骨架质粒和含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒共转染哺乳动物细胞并收获细胞培养上清而获得的。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述哺乳动物细胞选自HEK293细胞、HEK 293T细胞、HEK293FT细胞。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒包含荧光报告基因。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述荧光报告基因是Fluc基因或EGFP基因。
20.根据权利要求16所述的用途，其中所述MERS-Spike蛋白基因是经优化的SEQ IDNO:14所示的MERS-CoV病毒S蛋白编码基因。
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