CN113444722A - 单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用 - Google Patents

单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用，首次利用单碱基编辑介导的剪接修复技术，针对SMN2基因的7号外显子进行编辑，通过对该外显子部分碱基的变异，成功地提高了功能性SMN2蛋白的表达。

Description

单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用，所述的剪接修复较佳地是针对SMN2基因7号外显子的修复。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy；SMA)是一种致死性的常染色体隐性运动神经元疾病，主要累及脊髓前角，临床上主要表现为四肢进行性萎缩及无力，死亡率及致残率极高。在婴幼儿致死性遗传病中排名第一位，每6000名新生儿中就有一位发病。在缺乏有效干预的情况下，SMA I型(严重型)患儿会在2岁前死亡。
SMA的致病基因是运动神经元生存1(Survival Motor Neuron 1，SMN1)基因，人类有两种高度同源的SMN基因，分别为端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2，SMN1编码全长的SMN蛋白为功能性SMN蛋白，而SMN2主要编码截短的SMN蛋白。95％的SMA病人纯合缺失SMN1基因，从而导致功能性全长SMN(SMN-FL)蛋白缺失，引起SMA相关的临床症状。SMN1与SMN2这两个基因高度相似，最重要的差异点是位于7号外显子上的第6个碱基(C6T)，从而将一个外显子剪切增强子ESE转换成一个外显子剪切沉默子ESS，这会造成SMN2基因约95％的转录产物编码成截短的，无功能性的SMN2-△7蛋白质。这种蛋白是低效能的，且很快被降解。
2011年，美国冷泉港实验室的研究人员设计了一种反义寡核苷酸(Antisenseoligonucleotides，ASO)SMN-Rx来掩蔽这个ISS-NI位点，从而能够调节SMN2的剪接并提高SMN蛋白的表达，临床上称为Spinraz(nusinersen，诺西那生纳注射液)，已被FDA批准为儿童SMA治疗药物。然而，其制备的ASO在细胞内会降解，功能性SMN蛋白的表达是短期的。以临床SMA治疗为例，维持SMN蛋白表达需要定期不断补充ASO，这需要通过腰椎穿刺鞘内注射给药，病人难以接受，且成本非常高昂，限制了该方法的相关应用。Zolgensma也已被FDA批准为儿童SMA治疗药物，其是一种单剂量的SMA基因替代疗法。然而，不幸的是，它在维持高水平、稳定的基因表达方面并不可靠。种种问题限制了上述两种已批准的SMA药物的治疗效果及可及性。
综上，尽管本领域中已经对于SMA的致病基因有所了解，然而仍然缺少有效的药物。在疾病靶点清楚的情况下，药物的研究仍然是极为困难的。本领域亟需探究安全有效、经济实用的增加SMN蛋白表达的方法，并探索其在SMN治疗中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供单碱基编辑介导的剪接纠正在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用。
在本发明的第一方面，提供一种增加功能性SMN2蛋白表达的方法，包括：靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。
在一个优选方式中，所述7号外显子的第4、5或6位碱基被变异为碱基C；或所述7号外显子的第36、38或45位碱基被变异为G。
在另一优选方式中，所述7号外显子的第36位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第12位氨基酸(Ser))不变。
在另一优选方式中，所述7号外显子的第45位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第15位氨基酸(Leu))不变。
在另一优选方式中，所述7号外显子的第36位和第38位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第12和13位氨基酸)由Ser-Ser变异为Ser-Arg。
在另一优选方式中，所述7号外显子的第4位和第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸)由Phe变异为Pro。
在另一优选方式中，所述7号外显子的第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸)由Phe变异为Ser。
在另一优选方式中，所述7号外显子的第6位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸(Phe))不变。
在另一优选方式中，利用基因编辑、定点突变或同源重组来进行SMN2基因7号外显子的变异；较佳地，利用单碱基编辑介导的剪接修复来进行基因编辑。
在另一优选方式中，所述单碱基编辑介导的剪接修复利用DNA单碱基编辑器进行；较佳地所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器(ABE)或其变体；更佳地，所述腺嘌呤碱基编辑器(ABE)包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n。
在另一优选方式中，所述腺嘌呤碱基编辑器或其变体包括以下操作性连接的元件：
ABE：TadA-TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
ABEmaxF148A：TadAF148A-TadA*F148A，Cas9n或Cas9n-KKH；
MiniABEmax：TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
miniABEmaxV82G：TadA*V82G，Cas9n/Cas9n-KKH；
在另一优选方式中，在其氨基端和/或羧基端还包括核定位序列。
在另一优选方式中，在所述操作性连接的元件形成的构建体的羧基端还包括PolyA序列。
在另一优选方式中，所述核定位序列为bpNLS。
在另一优选方式中，所述Cas9n为SpCas9n。
在另一优选方式中，所述Cas9n-KKH为SaCas9n-KKH。
在另一优选方式中，所述功能性SMN2蛋白为全长SMN2蛋白。
在另一优选方式中，利用SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示序列的sgRNA进行碱基编辑。
在另一优选方式中，所述方法应用于诱导性多能干细胞(iPSCs)、胚胎干细胞(mESCs)、生殖细胞(如卵母细胞或受精卵)或体(组织)细胞，该细胞中SMN2基因编码截短的SMN2蛋白；所述方法包括：提供针对SMN2基因7号外显子的sgRNA以及DNA单碱基编辑器，引入到所述细胞中。
在另一优选方式中，所述的增加功能性SMN2蛋白表达的方法为非治疗性、非诊断性的方法。
在另一优选方式中，所述的增加功能性SMN2蛋白表达的方法为离体的方法。
在另一优选方式中，所述诱导性多能干细胞如商品化的SMA hiPSC细胞系：GM24468和SMA病人来源的hiPSC。
在另一优选方式中，所述胚胎细胞如商品化或已建系的胚胎细胞。
在本发明的另一方面，提供一种SMN2基因突变体，其核苷酸序列的7号外显子上发生一个或多个碱基的变异，所述变异存在于该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基上。
在一个优选方式中，所述7号外显子的第4、5或6位碱基被变异为碱基C；或所述7号外显子的第36、38或45位碱基被变异为G。
在另一优选方式中，所述的SMN2基因变体中，所述7号外显子的第36位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第12位氨基酸(Ser))不变；所述7号外显子的第45位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第15位氨基酸(Leu))不变；所述7号外显子的第36位和第38位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第12和13位氨基酸)由Ser-Ser变异为Ser-Arg；所述7号外显子的第4位和第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸)由Phe变异为Pro；所述7号外显子的第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸)由Phe变异为Ser；或所述7号外显子的第6位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸(Phe))不变。优选的，所述7号外显子的第36位发生突变，更优选变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第12位氨基酸(Ser))不变。
在另一优选方式中，所述SMN2基因7号外显子序列如SEQ ID NO:9(54bp)。
在本发明的另一方面，提供一种细胞，所述的细胞中功能性SMN2蛋白正常表达或高表达，所述的细胞中包含任一所述的SMN2基因变体；较佳地，所述的细胞包括(但不限于)：诱导性多能干细胞(iPSCs)、胚胎干细胞(mESCs)，生殖细胞(如卵母细胞或受精卵)或体细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的SMN2基因变体的用途，用于制备增加功能性SMN2蛋白表达的构建体或试剂。
在一个优选方式中，用于制备增加功能性SMN2蛋白表达的构建体或细胞；较佳地，所述的细胞包括(但不限于)：诱导性多能干细胞(iPSCs)、胚胎干细胞(mESCs)、生殖细胞(如卵母细胞或受精卵)或体细胞。
在本发明的另一方面，提供增加功能性SMN2蛋白表达的试剂在制备缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的药物中的用途；所述的增加SMN2蛋白表达的试剂是靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基；
在一个优选方式中，所述的试剂包括：基因编辑试剂、定点突变试剂或同源重组试剂；较佳地，所述的试剂包括DNA单碱基编辑器和sgRNA；更佳地，所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器(ABE)或其变体。
在另一优选方式中，所述腺嘌呤碱基编辑器(ABE)包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n；更佳地，包括：ABE：TadA-TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；ABEmaxF148A：TadAF148A-TadA*F148A，Cas9n或Cas9n-KKH；MiniABEmax：TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；miniABEmaxV82G：TadA*V82G，Cas9n/Cas9n-KKH；较佳地，在其氨基端和/或羧基端还包括核定位序列。
在另一优选方式中，所述sgRNA为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示序列的sgRNA。
在本发明的另一方面，提供一种制备细胞的方法，所述的细胞中功能性SMN2蛋白高表达，所述方法包括：将增加SMN2蛋白表达的试剂引入到细胞中，所述试剂是靶向SMN2基因7号外显子、变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。
在一个优选方式中，所述的制备细胞的方法为“非治疗目的”的方法。
在本发明的另一方面，提供一种用于缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的药物组合物或药盒，其中含有增加SMN2蛋白表达的试剂，所述试剂是靶向SMN2基因7号外显子、变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基；更佳地，所述的增加SMN2蛋白表达的试剂包括：DNA单碱基编辑器，sgRNA。
在一个优选方式中，所述的药物组合物或药盒中，所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器(ABE)或其变体；更佳地，所述腺嘌呤碱基编辑器(ABE)包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n；更佳地，所述腺嘌呤碱基编辑器或其变体包括：ABE：TadA-TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；ABEmaxF148A：TadAF148A-TadA*F148A，Cas9n或Cas9n-KKH；MiniABEmax：TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；或miniABEmaxV82G：TadA*V82G，Cas9n/Cas9n-KKH。
在另一优选方式中，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示的序列。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、单碱基编辑介导的外显子剪接沉默子ESS的转变可治疗SMA。
a：单碱基编辑介导SMN2外显子7的ESS-A和ESS-B的转化示意图。黑色箭头表示单个核苷酸(C6T)在SMN1和SMN2之间的差异。横杠表示sgRNA。
b：本发明建立的质粒图谱。
c：针对ESS-A和ESS-B的单碱基编辑效率。
d：显示ABE-sgRNA1编辑SMA iPSC、ABE-sgRNA3编辑SMA iPSC、和2个miniABEmax-sgRNA6编辑SMA iPSC的编辑效率的热图。
e、f：对全长SMN2(SMN2-FL)mRNA(e)和截短的SMN△7mRNA(f)进行TaqMan qPCR分析。基因表达归一化为SMA iPSC，值取1(n＝3)。数据表示±SD。
g：SMN蛋白复合体(白色箭头)定位于4个基因型的iPSC分化来源的运动神经元MNs：SC-SMA36.38G、SC-SMAT5C、SMA和WT，与SMN(绿色)和HB9(红色)抗体共染色。比例尺：10μm。
h：计数100个HB9阳性运动神经元中的SMN蛋白复合体(n＝3)。数据表示±SD。
i：在出生后的第9天，SC-SMAT5C初代小鼠的大小与同窝崽杂合子相似(Smn+/-；SMN2TG/0)(称为HET)。
j：SC-SMAT5C后代小鼠与HETT5C小鼠相比没有明显的表型差异。
k：SMA iPSC分化的有丝分裂后MNs中碱基编辑的时间轴。从左至右：有丝分裂后第15天的MNs形态，以及经过处理的有丝分裂后第20天的MNs与ChAT(红色)、GFP(绿色)和DAPI(蓝色)共染色。比例尺，50μm。
l：成功转染SMA iPSC的有丝分裂后MNs的流式分析。
m：显示miniABEmax-sgRNA6编辑的SMA iPSC分化的有丝分裂后MNs编辑效率的热图。
n：高通量测序分析SMA iPSC来源的未转染(最左侧)和miniABEmax-sgRNA6转染的有丝分裂后MNs的SMN2-FL转录表达水平。散点图中线表示中位数。
o：在SMN△7SMA小鼠体内进行单碱基编辑的时间轴。GFP(绿色)和DAPI(蓝色)共转染神经元的免疫组化。图像中的插图向右放大(原始放大倍数，x5.0)。比例尺：100μm.
p：成功转染后的SMN△7SMA小鼠神经元细胞流式分析。
q：显示SMN△7SMA小鼠神经元中miniABEmax-sgRNA6编辑效率的热图。
图2、单碱基编辑在SMA诱导多功能干细胞中介导的外显子剪接沉默子的转变。
a：SMN2 7号外显子的示意图，指示了ESS-A和ESS-B的sgRNA靶位点。大写字母表示SMN2 7号外显子的54nt序列，小写字母表示6号内含子和7号内含子的部分序列。ESS-A(左端)和ESS-B(右端)的序列突出显示。深蓝色线条表示DNA单碱基编辑器SaCas9n-KKHsgRNAs的目标序列；浅蓝色线条表示DNA单碱基编辑器SpCas9n sgRNAs的目标序列；红色线条表示旁侧邻近基序(PAM)序列(SaCas9n-KKH为NNNRRT，SpCas9n为NGG)。
b：人SMA诱导多功能干细胞(iPSC)克隆的形态图，比例尺，100um。
c：免疫荧光法检测SOX2在人SMA iPSCs中的表达，比例尺，10um。
d：使用微滴数字PCR试剂盒(Bio-Rad)检测WT和SMA iPSC中的SMN2拷贝数。
e：使用多重连接探针扩增技术分析测量SMN1和SMN2拷贝数。红色箭头“1”和“3”表示SMN1外显子7和外显子8，黑色箭头“2”和“4”表示SMN2外显子7和外显子8。
f-h：腺嘌呤单碱基编辑器(ABE)测序结果及分析。热图显示了三个sgRNA(sgRNA1，f；sgRNA2，g；sgRNA3，h)靶向SMN2外显子7的ESS-A和ESS-B。
i，j：在#2-SC-SMAT4C,T5C和#5-SC-SMAT6C iPSC克隆中，基于Taqman的qPCR分析全长SMN2(SMN2-FL)mRNA(i)和截短的SMN2-Δ7mRNA(j)。来自WT和SMA的数据与图1中panel e和f相同。数据表示平均值±标准差。(***)P<0.001；(****)P<0.0001；单向方差分析。
图3、单克隆SC-SMA多能干细胞的基因型鉴定研究。
a-f：通过Sanger测序确认编辑结果。与未处理的细胞(a，c，e)相比，本发明人观察到使用ABE-sgRNA1(b)靶向ESS-A的T到C的转变，同时观察到使用miniABEmax-sgRNA6(d)和miniABEmaxV82G-sgRNA6(f)靶向ESS-B的A到G的转变。紫色箭头表示编辑位点。
图4、#1-SC-SMAT5C和#2-SC-SMAA36G,A38G多能干细胞的特征鉴定。
a,c：#1-SC-SMAT5C(a)和#2-SC-SMAA36G,A38G(c)iPSC的免疫染色显示多能性标记：NANOG、SSEA4和TRA1-60。
b,d：#1-SC-SMAT5C(b)和#2-SC-SMAA36G,A38G(d)多能干细胞的核型正常。
e：诱导多能干细胞向脊髓MNs分化的时间轴。DAPT处理诱导运动神经元祖细胞向MNs的渐进过渡。
f,g：WT、SMA、#1-SC-SMAT5C、#2-SC-SMAA36G,A38G iPSC在第10天(f)分化形成OLIG2阳性的运动神经元前体，在第13天(g)分化形成HB9阳性MNs。
h,i：在所有DAPI标记的细胞(h)中，OLIG2阳性运动神经元前体的细胞计数定量，和所有MAP2标记的细胞(i)中，HB9阳性MNs的细胞计数定量。数据代表平均值±SD。ns；不显著；单向方差分析。比例尺，50μm。
图5、在iPSC分化的MNs中，对错义突变的SMN蛋白的功能验证。MNs添加DMSO(40μM，38小时)，喜树碱(10μM，21小时)或衣霉素(40μM，38小时)。
a：HB9用于标记存活的MNs，DAPI标记细胞总量。
b：处理后的MNs也用TUNEL检测，以标记凋亡细胞。
c：喜树碱或衣霉素处理后，细胞计数细胞活力的量化(存活与细胞总数之比)；与SMA MNs相比，#1-SC-SMAT5C MNs和#2-SC-SMAA36G,A38G MNs的细胞存活率更高。n＝3。
d：用喜树碱或衣霉素处理后，细胞计数死亡的MNs占总细胞的比例。与SMA MNs相比，#1-SC-SMAT5C MNs和#2-SC-SMAA36G,A38G MNs的MNs细胞凋亡程度降低，n＝3。箱形图：中心线表示中间值，误差棒表示最大值和最小值。ns,不显著；(**)P<0.01；(****)P<0.0001；单向方差分析。比例尺，50μm。
图6、HETT5C、SMA和SC-SMAT5C小鼠的表型分析。
a：ABE与sgRNA1针对单只雄性SC-SMAT5C初代小鼠SMN2外显子7的ESS-A识别位点的编辑活性(Smn-/-，SMN2T5C/0)。
b：SC-SMAT5C初代小鼠与杂合Smn敲除小鼠(Smn+/-)杂交产生的SC-SMAT5C后代小鼠的繁殖策略。
c：HET(Smn+/-，SMN22TG/0)和SMA(Smn-/-，SMN22TG/0)的生存效率。*3只HET和SMA小鼠于第9天处死，进行免疫组化分析。
d：HETT5C(n＝14)、SMA(n＝30)和SC-SMAT5C(n＝9)小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。
e：HETT5C(n＝8)、SMA(n＝18)和SC-SMAT5C(n＝4)小鼠的体重从第5天到第55天进行评估。
f：HETT5C(n＝8)、SMA(n＝15)、SC-SMAT5C(n＝4)小鼠P5、P7、P9、P11的翻正反射测定。
g：在#2-SC-SMAT5C和SMA小鼠中，通过与SMN(绿色)和ChAT(红色)抗体联合染色，观察了SMN蛋白复合体在脊髓L1-L2运动神经元中的定位。比例尺，50μm。
h：HETT5C(n＝3)、SMA(n＝3)和SC-SMAT5C(n＝3)小鼠中，每100个运动神经元中SMN蛋白复合体的计数量化。数据表示平均值±标准差。(*)P<0.05；(***)P<0.001；(****)P<0.0001；单向方差分析。
图7、筛选针对SMN2外显子7位点ESS-A和ESS-B的有效sgRNAs。
a：HEK293T细胞、SMA mESCs和SMA iPSC中筛选sgRNA的实验设计。
b：表达GFP的转染细胞的代表性图像。比例尺：100μm。
c：流式细胞仪分析转染细胞。
图8、四种DNA单碱基编辑器在三种不同细胞类型中的碱基编辑活性综述。
a-c：Sanger测序层析图证实了四个DNA单碱基编辑器ABE、ABEmaxF148A、miniABEmax和miniABEmaxV82G分别针对HEK293T细胞(a)、SMA mESCs(b)和SMA iPSCs(c)中SMN2外显子7ESS-A和ESS-B的sgRNAs 1-6的编辑活性。紫色箭头表示编辑位点。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次利用单碱基编辑介导的剪接修复技术，针对SMN2基因的7号外显子进行编辑，通过对该外显子部分碱基的变异，成功地提高了功能性SMN2蛋白的表达。
术语
如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸/蛋白序列，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。所述的“构建物”包括“质粒”、“体外转录产物”或病毒载体等；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。
如本文所用，所述的“sgRNA”即“单一引导RNA(Single-guide RNA，sgRNA)”，其是基于“目标基因上的靶位点”设计，其包含的序列足以与内切核酸酶Cas9协同作用，引导发生Cas9介导的靶位点上DNA双链断裂。本发明中，所述的“sgRNA”包括RNA形式(如mRNA形式)的sgRNA，也包括与该sgRNA序列相应的DNA形式的序列或含有所述序列的构建体，只要它们在细胞内能够被加工或转化为活性的“sgRNA”。
如本文所用，所述“动物(mammal)”没有特别的限制，只要其细胞具有一般意义上的基因组，且基因编辑体系在其细胞内具有活性。例如，所述的动物可以是哺乳纲的动物，包含人、非人灵长类动物(猴、猩猩)、家畜与农畜(例如，猪、绵羊、牛)，鼠(小鼠)，以及啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔)等等。较佳地，所述动物的细胞表达SMN蛋白。
如本文所用，所述“细胞”是指能够表达SMN蛋白的细胞，且基因编辑体系在其内具有活性。所述“细胞”包括但不限于：体(组织)细胞，诱导性多能干细胞，生殖细胞(如受精卵细胞，卵母细胞)。
如本文所用，所述“脱靶效应”是指对于基因组中特定位置的改造未能达到预先设定的目标，改造发生偏移或未能发生改造。发生“脱靶效应”的原因包括但不限于：对靶点的结合不精确、识别序列以后的切割操作不精确、对切割位点的编辑的精确程度不够等。
提高SMN蛋白表达的方法及试剂
尽管基因组编辑技术在近年来已经被较多地运用，但是其存在着脱靶效应等问题，如何运用这一技术来纠正细胞基因组，改变疾病状态，仍是一个不易于实现的课题。现有技术中绝大多数的疾病，尚没有发现有效的基于基因编辑技术的治疗方法和治疗药物，例如脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy；SMA)，SMN2是和SMN1高度相似的基因，但是由于SMN2基因7号外显子上C6T的变异导致其在剪接过程当中7号外显子被跳过，形成了缺少7号外显子的转录本，翻译产生了截短的SMN蛋白。理论上而言，使得截短表达的情况更正为正常表达即可，理论上的操作方式也不少，但是却鲜少有真正有效的操作工具来成功地、稳定地、无差错地实现这种表达更正。因此，本发明人致力于优化研究针对SMN的基因组编辑策略。
一方面，本发明提供了一种增加功能性SMN2蛋白表达的方法，所述方法包括：靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。在具体的一些实施方式中，该方法是体外(离体)的，也即是针对离体的细胞进行的操作。
另一方面，本发明提供了一种制备SMN蛋白高表达的细胞的方法，所述方法包括：靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。在具体的一些实施方式中，该方法是体外(离体)的，也即是针对离体的细胞进行的操作。
其它方面，基于本发明的揭示，还可以制备基因组发生基因编辑的动物，所述方法包括：(1)将增加SMN蛋白表达的试剂引入到动物生殖细胞如受精卵中，所述的增加SMN2蛋白表达的试剂是靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基；(2)使(1)的动物受精卵发育，获得基因组的待编辑基因区域发生编辑的动物。在具体的一些实施方式中，该方法是以研究为目的的而非以为治疗目的的。
作为本发明的优选方式，将所述7号外显子的第4、5或6位碱基变异为碱基C，或将所述7号外显子的第36、38或45位碱基变异为G。部分的变异，使得核苷酸序列发生变化的同时，也使得蛋白的氨基酸序列中相应位点产生变异，即发生非同义变异(非同义突变)；而另一部分的变异，则没有改变氨基酸序列，即发生同义变异(同义突变)。
在更为具体的实施方式中，一些产生同义突变的位点为：所述7号外显子的第36位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第12位氨基酸(Ser))不变；所述7号外显子的第45位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第15位氨基酸(Leu))不变；或，所述7号外显子的第6位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸(Phe))不变。
在更为具体的实施方式中，一些产生非同义突变的位点为：所述7号外显子的第36位和第38位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第12和13位氨基酸)由Ser-Ser变异为Ser-Arg；所述7号外显子的第4位和第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸)由Phe变异为Pro；或，所述7号外显子的第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸(7号外显子第2位氨基酸)由Phe变异为Ser。
在本发明中，相对更为优选的是发生同义突变的情形。本领域技术人员可以预期：在这一情形下，仅在基因水平上改造个别碱基的类型，而不产生蛋白水平上的变化，可以预期这种改变在改变(提高或增加)SMN2蛋白的表达以外，对细胞其它方面的影响必然是微小的或不发生改变的。
在获知了本发明已经揭示的一些SMN2基因7号外显子的碱基位点后，本领域技术人员可以运用多种已知的技术来进行这些位点的变异，从而实现SMN蛋白表达的提高。所述的技术例如但不限于：定点突变技术，RNA干扰技术，同源重组技术或基因编辑技术等。一些基因编辑试剂、定点突变试剂或同源重组试剂也是可以由本领域技术人员设计获得的。在本发明的优选方式中，优选的是基因编辑技术，通过单碱基编辑进行所述位点的变异，为此本发明也提供了适当的DNA单碱基编辑器。
在本发明的优选实施方式中，所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器(ABE)或其突变体；更佳地，所述腺嘌呤碱基编辑器包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n。本发明人建立了多种腺嘌呤碱基编辑器或其变体，从而实现了所述位点的靶向性变异。在更为具体的实施方式中，所述腺嘌呤碱基编辑器包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n；更佳地，包括：
ABE：TadA-TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
ABEmaxF148A：TadAF148A-TadA*F148A，Cas9n或Cas9n-KKH；
MiniABEmax：TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；或
miniABEmaxV82G：TadA*V82G，Cas9n/Cas9n-KKH。
在更为优选的实施方式中，在所述腺嘌呤碱基编辑器的氨基端和/或羧基端还包括核定位序列。
与上述这些腺嘌呤碱基编辑器相配合地，本发明也提供了一些优选的sgRNA。在优选的实施例中，所述sgRNA为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示序列的sgRNA。
在本发明的最为优选的实施方式中，提供了一种靶向SMN2外显子7的ESS-B的A36G的同义突变(同义丝氨酸)。这一突变通过使用miniABEmax和sgRNA6的组合来获得。这一突变的优异特点在于：一方面，其可实现同义突变，也即不改变SMN2的氨基酸序列；另一方面，其提高SMN2表达水平的能力是非常显著的，本发明的实施例、特别是图1e中，显示了其对于SMN2表达水平的极为有效的提高；第三方面，在一项考察DNA脱靶效应的实验中，本发明人发现针对这一位点没有可检测到的脱靶效应，无疑这是更有利于临床研究以及临床应用的。
SMN2基因突变体及含有突变体的细胞
基于本发明所揭示的技术方案，还提供了一种SMN2基因突变体，所述SMN2基因突变体与野生型的序列相比，其核苷酸序列的7号外显子上发生一个或多个碱基的变异，所述变异存在于该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基上。在优选的实施方式中，所述7号外显子的第4、5或6位碱基被变异为碱基C；或所述7号外显子的第36、38或45位碱基被变异为G。
野生型的SMN2核苷酸序列是本领域技术人员已知的，例如其序列可以如SEQ IDNO:2所示。在野生型序列的基础上，除了本发明中所感兴趣的第7外显子上的位点，SMN2核苷酸序列上的其它位置，在不同个体或不同来源下，也可能存在部分碱基的变化，这些变化形式可能是不影响SMN2蛋白表达的，它们也应被涵盖在本发明中。例如，还涵盖与SEQ IDNO:2所示序列同源性高于80％、85％、90％、95％、98％、99％或更高的SMN2序列，或还涵盖SEQ ID NO:2所示序列的片段，它们也能编码全长的SMN2蛋白或其具有活性的部分。
本发明的SMN2基因突变体可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。其序列可以是只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。当需要制备所述的基因突变体时，其全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或经改造的酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来重组表达或生产重组的SMN2蛋白。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码经改造的酶的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
基于本发明的披露，本发明还提供了一种SMN2蛋白高表达的细胞，所述细胞中包含本发明所述的SMN2基因变体；较佳地，所述的细胞包括(但不限于)：诱导性多能干细胞(iPSCs)、胚胎干细胞(mESCs)，生殖细胞(如卵母细胞或受精卵)，体细胞；或，其为一种基因工程宿主细胞(例如，用于重组表达SMN2蛋白)。
本发明的SMN2蛋白高表达的细胞，其中可含有外源的增加SMN2蛋白表达的核酸(核酸构建体或试剂)，所述的增加SMN2蛋白表达的试剂是靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。
所述的增加SMN2蛋白表达的试剂可以包括但不限于：基因编辑试剂、定点突变试剂或同源重组试剂。作为本发明的优选实施方式，所述的试剂包括DNA单碱基编辑器和sgRNA；更佳地，所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器(ABE)或其突变体。
应用
本发明提供了一种利用单碱基编辑介导的剪接修复技术，针对SMN2基因的7号外显子进行编辑的技术，以及提供了一系列进行所述修复的方法和工具。本发明的技术方案可以应用于包括但不限于以下的一些方面：(1)应用于对hiPSC等细胞进行基因编辑，挑选出修正的细胞株，进行SMN2表达水平的验证以及功能验证；(2)应用于对生殖细胞如受精卵进行基因编辑，对获得的细胞或个体进行SMN2表达水平的验证以及功能验证；(3)应用于对生物体如小鼠进行注射，如对侧脑室和鞘内进行注射，观察疾病改善情况、生物体生存情况和SMN2的功能等。
脊髓性肌萎缩症(SMA)是导致婴幼儿死亡的遗传性疾病，主要由于SMN1基因的突变或者缺失导致SMN蛋白缺失所致。基于本发明的新发现，本发明还提供了一种增加SMN2蛋白表达的试剂在制备缓解或治疗脊髓性肌萎缩症中的用途；所述的增加SMN2蛋白表达的试剂是靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。
进一步地，本发明提供了一种用于缓解或治疗SMA的药物组合物或药盒，其中含有增加SMN2蛋白表达的试剂，所述试剂是靶向SMN2基因7号外显子、变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基；更佳地，所述的增加SMN2蛋白表达的试剂包括：DNA单碱基编辑器，sgRNA。
所述的sgRNA可以为mRNA形式的，通过注射(如显微注射)进入到细胞中，也可以将之构建于构建体如表达质粒上、进而引入到细胞中。所述的构建物可以为表达质粒，包括：病毒质粒或非病毒质粒。较佳地，为病毒质粒，例如但不限于：腺相关病毒质粒(AAV)，慢病毒质粒(Lentivirus)等。
所述的DNA单碱基编辑器可以为mRNA形式的，通过注射(如显微注射)进入到细胞中，也可以将之构建于构建体如表达质粒上、进而引入到细胞中。所述的构建物可以为表达质粒，包括：病毒质粒或非病毒质粒。较佳地，为病毒质粒，例如但不限于：腺相关病毒质粒(AAV)，慢病毒质粒(Lentivirus)等。
所述的sgRNA可以与DNA碱基编辑器被分别或共同引入到细胞中。
所述的药物组合物中，还可含有药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明还提供了一种用于缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的药盒，所述的药盒包括本发明所述的药物组合物；或包括本发明所述的sgRNA和碱基编辑器；或包括本发明所述的表达构建物。
在本发明的具体实施例中，本发明人利用了转入人SMN基因的小鼠作为SMA模型小鼠，在观测到全长SMN2转录本和SMN蛋白明显提高的同时，本发明人还观测到编辑过的SMA小鼠体重明显增加、运动功能显著提高、寿命明显延长。同时，本发明人出乎意料地发现，靶向变异第7外显子6号位置(第6位)以外的位置的碱基效果更佳。本发明人观测到的这些结果，证实了可以运用碱基编辑介导的剪接纠正SMN2基因，藉由单碱基编辑技术来治疗SMA患或制备SMA药物，这是一种新的治疗途径。
根据SMA疾病的特点，临床上所有的病人都携带有病变的SMN2基因，所以本发明的这个策略适合临床所有的SMA病人。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
SMN1核苷酸序列(SEQ ID NO:1)(以下划线标出7号外显子)：
ATGGCGATGAGCAGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAGGAGGATTCCGTGCTGTTCCGGCGCGGCACAGGCCAGAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGCACTGATAAAAGCATATGATAAAGCTGTGGCTTCATTTAAGCATGCTCTAAAGAATGGTGACATTTGTGAAACTTCGGGTAAACCAAAAACCACACCTAAAAGAAAACCTGCTAAGAAGAATAAAAGCCAAAAGAAGAATACTGCAGCTTCCTTACAACAGTGGAAAGTTGGGGACAAATGTTCTGCCATTTGGTCAGAAGACGGTTGCATTTACCCAGCTACCATTGCTTCAATTGATTTTAAGAGAGAAACCTGTGTTGTGGTTTACACTGGATATGGAAATAGAGAGGAGCAAAATCTGTCCGATCTACTTTCCCCAATCTGTGAAGTAGCTAATAATATAGAACAAAATGCTCAAGAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTCAACAGATGAAAGTGAGAACTCCAGGTCTCCTGGAAATAAATCAGATAACATCAAGCCCAAATCTGCTCCATGGAACTCTTTTCTCCCTCCACCACCCCCCATGCCAGGGCCAAGACTGGGACCAGGAAAGCCAGGTCTAAAATTCAATGGCCCACCACCGCCACCGCCACCACCACCACCCCACTTACTATCATGCTGGCTGCCTCCATTTCCTTCTGGACCACCAATAATTCCCCCACCACCTCCCATATGTCCAGATTCTCTTGATGATGCTGATGCTTTGGGAAGTATGTTAATTTCATGGTACATGAGTGGCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTT CAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGAAATGCTGGCATAGAGCAGCACTAAATGACACCACTAAAGAAACGATCAGACAGATCTGGAATGTGAAGCGTTATAGAAGATAACTGGCCTCATTTCTTCAAAATATCAAGTGTTGGGAAAGAAAAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCTTCTTGATTAAAAGTTATGTAATAACCAAATGCAATGTGAAATATTTTACTGGACTCTATTTTGAAAAACCATCTGTAAAAGACTGGGGTGGGGGTGGGAGGCCAGCACGGTGGTGAGGCAGTTGAGAAAATTTGAATGTGGATTAGATTTTGAATGATATTGGATAATTATTGGTAATTTTATGAGCTGTGAGAAGGGTGTTGTAGTTTATAAAAGACTGTCTTAATTTGCATACTTAAGCATTTAGGAATGAAGTGTTAGAGTGTCTTAAAATGTTTCAAATGGTTTAACAAAATGTATGTGAGGCGTATGTGGCAAAATGTTACAGAATCTAACTGGTGGACATGGCTGTTCATTGTACTGTTTTTTTCTATCTTCTATATGTTTAAAAGTATATAATAAAAATATTTAATTTTTTTTTAAA
SMN2核苷酸序列(SEQ ID NO:2)(以下划线标出突变位置)：
ATGGCGATGAGCAGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAGGAGGATTCCGTGCTGTTCCGGCGCGGCACAGGCCAGAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGCACTGATAAAAGCATATGATAAAGCTGTGGCTTCATTTAAGCATGCTCTAAAGAATGGTGACATTTGTGAAACTTCGGGTAAACCAAAAACCACACCTAAAAGAAAACCTGCTAAGAAGAATAAAAGCCAAAAGAAGAATACTGCAGCTTCCTTACAACAGTGGAAAGTTGGGGACAAATGTTCTGCCATTTGGTCAGAAGACGGTTGCATTTACCCAGCTACCATTGCTTCAATTGATTTTAAGAGAGAAACCTGTGTTGTGGTTTACACTGGATATGGAAATAGAGAGGAGCAAAATCTGTCCGATCTACTTTCCCCAATCTGTGAAGTAGCTAATAATATAGAACAAAATGCTCAAGAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTCAACAGATGAAAGTGAGAACTCCAGGTCTCCTGGAAATAAATCAGATAACATCAAGCCCAAATCTGCTCCATGGAACTCTTTTCTCCCTCCACCACCCCCCATGCCAGGGCCAAGACTGGGACCAGGAAAGCCAGGTCTAAAATTCAATGGCCCACCACCGCCACCGCCACCACCACCACCCCACTTACTATCATGCTGGCTGCCTCCATTTCCTTCTGGACCACCAATAATTCCCCCACCACCTCCCATATGTCCAGATTCTCTTGATGATGCTGATGCTTTGGGAAGTATGTTAATTTCATGGTACATGAGTGGCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTTAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAAGGAGAAATGCTGGCATAGAGCAGCACTAAATGACACCACTAAAGAAACGATCAGACAGATCTGGAATGTGAAGCGTTATAGAAGATAACTGGCCTCATTTCTTCAAAATATCAAGTGTTGGGAAAGAAAAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCTTCTTGATTAAAAGTTATGTAATAACCAAATGCAATGTGAAATATTTTACTGGACTCTATTTTGAAAAACCATCTGTAAAAGACTGAGGTGGGGGTGGGAGGCCAGCACGGTGGTGAGGCAGTTGAGAAAATTTGAATGTGGATTAGATTTTGAATGATATTGGATAATTATTGGTAATTTTATGAGCTGTGAGAAGGGTGTTGTAGTTTATAAAAGACTGTCTTAATTTGCATACTTAAGCATTTAGGAATGAAGTGTTAGAGTGTCTTAAAATGTTTCAAATGGTTTAACAAAATGTATGTGAGGCGTATGTGGCAAAATGTTACAGAATCTAACTGGTGGACATGGCTGTTCATTGTACTGTTTTTTTCTATCTTCTATATGTTTAAAAGTATATAATAAAAATATTTAATTTTTTTTTAAA
sgRNA序列(其靶向位置如图1a、图2a中所示)：
sgRNA1：5’-TTTGTCTAAAACCCTGTAAG-3’(SEQ ID NO:3)；
sgRNA2：5’-TAGACAAAATCAAAAAGAAG-3’(SEQ ID NO:4)；
sgRNA3：5’-CACATTCCTTAAATTAAGGA-3’(SEQ ID NO:5)；
sgRNA4：5’-TTTAGACAAAATCAAAAAGA-3’(SEQ ID NO:6)；
sgRNA5：5’-GACAAAATCAAAAAGAAGGA-3’(SEQ ID NO:7)；
sgRNA6：5’-CACATTCCTTAAATTAAGGA-3’(SEQ ID NO:8)。
ABE基因编辑器表达构建体的建立：
本发明人设计了多种ABE基因编辑器，具体如下(结构示意图见图1b)：
ABE(从N端至C端)：bpNLS(核定位序列)、TadA、TadA*、SpCas9n/SaCas9n-KKH、bpNLS、polyA。
ABEmaxF148A(从N端至C端)：bpNLS、TadAF148A-TadA*F148A、SpCas9n/SaCas9n-KKH、bpNLS、polyA。
MiniABEmax(从N端至C端)：bpNLS、TadA*、SpCas9n/SaCas9n-KKH、bpNLS、PolyA。
miniABEmaxV82G(从N端至C端)：bpNLS、TadA*V82G、SpCas9n/SaCas9n-KKH、bpNLS、PolyA。
bpNLS序列为：N端：5’-atgaaacggacagccgacggaagcgagttcgagtcaccaaagaagaagcggaaagtc-3’(SEQ ID NO:10)；C端：5’-aaaagaaccgccgacggcagcgaattcgagcccaagaagaagaggaaagtc-3’(SEQ ID NO:11)。
TadA(腺苷脱氨酶)序列见：L.W.Koblan,J.L.Doman,C.Wilson,et al,Improvingcytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestralreconstruction[J],Nat Biotechnol,2018,36(9):843-846。
TadA*(突变的腺苷脱氨酶)序列：L.W.Koblan,J.L.Doman,C.Wilson,et al,Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization andancestral reconstruction[J],Nat Biotechnol,2018,36(9):843-846。
saCas9-KKH序列：参见文献B.P.Kleinstiver,M.S.Prew,S.Q.Tsai,et al,Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 bymodifying PAM recognition[J],Nat Biotechnol,2015,33(12):1293-1298。
SaCas9n-KKH(为SaCas9-KKH突变体，在SaCas9-KKH基础上发生D10A的突变)序列：参见文献B.P.Kleinstiver,M.S.Prew,S.Q.Tsai,et al,Broadening the targetingrange of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition[J],Nat Biotechnol,2015,33(12):1293-1298。
TadA*V82G是指在TadA*基础上，将其第82位的V突变为G。
TadAF148A，TadA*F148A突变位置：参见文献C.Zhou,Y.Sun,R.Yan,et al,Off-targetRNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis[J],Nature,2019,571(7764):275-27。
SMN Exon7序列为(54bp)(SEQ ID NO:9)：
Figure BDA0002424041890000201
T4C：SMN2基因7号外显子上的4号位置(Exon7的第4个碱基)产生的T→C的转变；对应于SMN2核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，指第838位发生转变。
T5C：SMN2基因7号外显子上的5号位置(Exon7的第5个碱基)产生的T→C的转变；对应于SMN2核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，指第839位发生转变。
T6C：SMN2基因7号外显子上的6号位置(Exon7的第6个碱基)产生的T→C的转变；对应于SMN2核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，指第840位发生转变。
A45G：SMN2基因7号外显子上的45号位置(Exon7的第45个碱基)产生的A→G的转变；对应于SMN2核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，指第879位发生转变。
A36G：SMN2基因7号外显子上的36号位置(Exon7的第36个碱基)产生的A→G的转变；对应于SMN2核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，指第870位发生转变。
A38G：SMN2基因7号外显子上的38号位置(Exon7的第38个碱基)产生的A→G的转变；对应于SMN2核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，指第872位发生转变。
轻型SMA小鼠(Smn-/-，SMN22TG/2TG)的构建：参见文献H.M.Hsieh-Li,J.G.Chang,Y.J.Jong,et al,A mouse model for spinal muscular atrophy[J],Nat Genet,2000,24(1):66-70.
杂合Smn敲除小鼠(Smn+/-)的构建：参见文献H.M.Hsieh-Li,J.G.Chang,Y.J.Jong,et al,A mouse model for spinal muscular atrophy[J],Nat Genet,2000,24(1):66-70.
重型SMA小鼠胚胎干细胞的诱导：将雌性轻度SMA小鼠(Smn-/-,SMN22TG/2TG)与雄性杂合Smn敲除小鼠(Smn+/-)交配后，至囊胚期时取出胚胎，后续诱导及扩增方法，参见文献E.W Zuo,X.N.Huo,X.Yao,et al.,CRISPR/Cas9-mediated Targeted ChromosomeElimination[J],Genome Biol,2017,18(1):224.基因型鉴定，Smn-/-,SMN22TG/0为阳性克隆。
将ABE或经改造的ABE连同sgRNA转染细胞的方法步骤：HEK293T或重型SMA小鼠胚胎干细胞消化后铺于6孔板，～60％细胞密度，采用Lipofectamine 3000(Thermo FisherScientific)转染细胞，每孔细胞的质粒转染量为4ug，转染后72小时流式分选获得荧光阳性细胞。
iPSC的培养与电穿孔转染及单克隆获取步骤：iPSC的培养方法，参见文献Lin X,Li JJ,Qian WJ,et al.Modeling the differential phenotypes of spinal muscularatrophy with high-yield generation of motor neurons from human inducedpluripotent stem cells.[J],Oncotarget,2017,8:42030-42042.待细胞密度达～80％，采用核穿孔转染仪(Lonza 2B)电转细胞，1X107细胞量对应质粒转染量为10ug，转染后72小时流式分选获得荧光阳性细胞。单克隆采用机械法挑取获得，具体参见文献J.J.Li,X.Lin,C.Tang,et al.,Disruption of splicing-regulatory elements using CRISPR/Cas9 torescue spinal muscular atrophy in human iPSCs and mice.[J]Natl Sci Rev,2019,7(1):92-101.
iPSC的运动神经元分化与电转染步骤：运动神经元的分化方法，参见文献Lin X,Li JJ,Qian WJ,et al.Modeling the differential phenotypes of spinal muscularatrophy with high-yield generation of motor neurons from human inducedpluripotent stem cells.[J],Oncotarget,2017,8:42030-42042.培养至第15天后，采用核穿孔转染仪(Lonza 2B)电转细胞，1X107细胞量对应质粒转染量为10ug，转染后72小时流式分选获得荧光阳性单细胞。
在体神经元电穿孔与组织染色的步骤：将出生后第0天的SMNΔ7SMA小鼠在冰上麻醉30-60秒，将1.5μg质粒混合0.05％Fast Green染料，使用玻璃针进行侧脑室注射。随后使用ECM-830仪器进行在体电穿孔，电脉冲持续时间60ms，间隔950ms，电压80V。出生后第7天将小鼠处死。使用胰酶消化脑组织，通过流式细胞分选分离出GFP阳性神经元进行后续步骤。准备进行免疫组化染色的小鼠使用PFA及30％蔗糖进行灌注后进行脑组织切片，切片厚度为40μm。随后使用DAPI染色30分钟。
受精卵注射及胚胎移植步骤：将轻型SMA mice(Smn-/-,SMN22TG/2TG)雌性小鼠超数排卵后与杂合Smn敲除小鼠(Smn+/-)交配。随后取出受精卵，通过通过显微注射法将50ng/μlABE mRNA and 100ng/μl sgRNA1体外转录产物注射入受精卵胞质中，在KSOM中孵育过夜至二细胞期后，移入假孕ICR雌性小鼠的输卵管中。
TaqMan探针法qPCR分析步骤：使用TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒及FAM-based TaqMan assays定制探针试剂盒依据操作说明书，在LightCycler480实时定量PCR系统进行反应并测定细胞的SMN2-FL以及SMN2-△7转录本水平。以上具体使用到的引物及探针序列如表1。
表1
名称 引物或探针(5’-3’)
Fwd_SMN2-FL GCTGATGCTTTGGGAAGTATGTTA(SEQ ID NO:12)
Rev_SMN2-FL GAGCACCTTCCTTCTTTTTGA(SEQ ID NO:13)
SMN2-FL_probe TACATGAGTGGCTATCATACT(SEQ ID NO:14)
Fwd_SMN2-Δ7 TATCATACTGGCTATTATATGGAA(SEQ ID NO:15)
Rev_SMN2-Δ7 TCCAGATCTGTCTGATCGTTTCTT(SEQ ID NO:16)
SMN2-Δ7Probe CTGGCATAGAGCAGCACTAAATGACACCAC(SEQ ID NO:17)
免疫染色步骤：细胞使用4％甲醛溶液进行固定后用0.2％Triton-X-100和10％驴血清进行打孔及封闭。使用一抗在4℃下孵育过夜。随后使用荧光二抗(稀释比1：1000)及DAPI(稀释比1：1000)室温孵育两小时。一抗的具体信息及稀释比例如表2。
表2
抗体 稀释比 抗体 稀释比
OLIG2 1:300 SSEA4 1:400
HB9 1:100 SOX2 1:1000
MAP2 1:5000 TRA-1-60 1:1000
SMN 1:75 TUNEL 1:10
NANOG 1:1000
用于免疫荧光染色的小鼠在出生后9天时处死，取出脊髓后在4％PFA中室温固定1-3小时，随后使用30％蔗糖4℃脱水过夜。将脊髓腰段(L1-L2)以20μm厚度切片。运动神经元及核双子星体分别使用ChAT抗体(稀释比1：500)和SMN抗体(稀释比1：300)在4℃下与TritonX-100、BSA、NaN3混合孵育过夜。随后使用荧光二抗及DAPI 4℃孵育过夜。使用LeicaTCS SP8进行图像采集，随后使用Image-J软件对细胞进行计数。
高通量测序建库及数据处理步骤：流式分选阳性细胞群裂解、巢式PCR扩增(如下表3，巢式引物)，单个神经元通过逆转录及特异性扩增(单细胞引物)。依据Illumina HiSeqX-Ten平台构建扩增子进行测序。数据使用fastp(v0.19.6)进行预处理，FASTQ文件通过barcodes序列进行分离，并通过Smith-Waterman算法与参考基因组匹配，提取并计算突变序列数目。
表3
名称 引物(5’-3’)
巢式引物-外-F AGCCACTGCAAGAAAACCTTAACTG(SEQ ID NO:18)
巢式引物-外-R CCAGAGGCTTGACGAATTCCA(SEQ ID NO:19)
巢式引物-内-F TGGGATAACTTTTAAAGTAC(SEQ ID NO:20)
巢式引物-内-R GAATTC-barcode-GGATCCGTTTTCCACAAACCATAAAG(SEQ ID NO:21)
单细胞引物-F TCTCTTGATGATGCTGATGC(SEQ ID NO:22)
单细胞引物-R TCTGATCGTTTCTTTAGTGGTGTC(SEQ ID NO:23)
实施例1、利用碱基编辑器ABE靶向ESSA和ESSB的单碱基编辑
SMN2是和SMN1高度相似的基因，但是由于SMN2的7号外显子上C6T的差异导致其在剪接过程当中7号外显子被跳过，如图1a。
Hua等在2007年报道，通过ASO靶向SMN2第7外显子中的ESS可增强SMN2第7外显子的inclusion(剪接产物包含exon7)。在此基础上，本发明人检验了这种策略是否也可以通过基因组编辑来实现。
本发明人发现，NHEJ(非同源末端连接)会导致潜在的随机序列生成和CRISPR/Cas9介导的同源重组修复途径的编辑效率低下。在此基础上，本发明人选择单碱基编辑的方案，为此设计了三个ABE(产生A-to-G或T-to-C的转变)的KKH变体(金黄色酿脓葡萄球菌的Cas9单切口酶(Cas9n)，识别序列为NNNRRT)的sgRNA(sgRNA1-3)作用于SMN2第7外显子位点的ESS-A或ESS-B(图2a)，并用于后续实验。本发明设计的ABE基因编辑器的表达构建体的图谱如图1b，该ABE基因编辑器能够在特定的基因位点产生一个精确的核苷酸的转变且不产生双链断裂。
本发明人测试了这些sgRNAs在诱导多功能干细胞(iPSCs)系中恢复全长SMN(SMN-FL)表达的能力，获取存在7号外显子C6T突变的细胞系，该细胞系来源于携带3个SMN2拷贝的SMA患者(图2b～d)。本发明人还使用了健康个体来源的诱导多功能干细胞作为野生型对照(有2个SMN1拷贝和3个SMN2拷贝)(图2b、d)。
本发明人计算了PAM位点上游20bp区域的A-G编辑频率，利用热图显示了三个sgRNA(sgRNA1；sgRNA2；sgRNA3)靶向SMN2外显子7的ESS-A和ESS-B(图2f～h)的情况。高通量测序显示，sgRNA1和sgRNA3产生有效编辑。
进行测序和基于TaqMan的qPCR分析，如图1c，以碱基编辑器ABE-sgRNA1和ABE-sgRNA3靶向ESSA和ESSB的单碱基编辑效率。对于所分析的46个克隆(sgRNA1)和10个克隆(sgRNA3)，可分别获得6个针对ESS-A的剪接纠正型SMA(SC-SMA)克隆(例如：﹟1-SC-SMAT5C；Phe-to-Ser)和1个针对ESS-B的克隆(﹟1-SC-SMAA45G；Leu-to-Leu)。ABE-sgRNA1编辑SMAiPSC、ABE-sgRNA3编辑SMA iPSC的编辑效率的热图显示于图1d中。全长SMN2(SMN2-FL)mRNA和截断的SMN△7mRNA的TaqMan qPCR分析结果如图1e～f和图2i～j，可见﹟1-SC-SMAT5C、﹟1-SC-SMAT6C、﹟1-SC-SMAA45G、﹟1-SC-SMAT4C,T5C中全长SMN2有了显著的提高，而SMN△7的表达有了显著的降低。Sanger测序确认编辑结果如图3a～b。
各个突变导致的氨基酸变化如下表4。
表4
核苷酸突变 氨基酸变异
SC-SMA<sup>T4C,T5C</sup> Phe→Pro 非同义
SC-SMA<sup>T5C</sup> Phe→Ser 非同义
SC-SMA<sup>T6C</sup> Phe→Phe 同义
SC-SMA<sup>A45G</sup> Leu→Leu 同义
为了验证错义T5C转变(在SMN2基因7号外显子上的5号位置产生的T-to-C的转变)产生的影响，本发明人选择了﹟1-SC-SMAT5C克隆作进一步研究。该克隆可以显示特征表达的多能性标记和正常核型(图4a，b)。通过全基因组测序(WGS)进行的DNA脱靶分析显示没有检测到非目标效应即脱靶效应(表5)。
表5、WGS检测#1-SC-SMAT5C and#2-SC-SMAA36G,A38G iPSCs脱靶情况
Figure BDA0002424041890000251
为了测试剪接修复对运动神经元(Motor neurons，MNs)的影响，本发明人将脊髓MNs从三种基因型的iPSCs中进行了分化：#1-SC-SMAT5C、SMA和WT。诱导多能干细胞向脊髓MNs分化的时间轴以及诱导所用的因子如图4e。WT、SMA、#1-SC-SMAT5C iPSCs在第10天(图4f)分化形成OLIG2+运动神经元前体，在第13天(图4g)分化形成HB9+MNs。结果说明，SC-SMAT5C、SMA和WT，这些细胞都表现出典型的分化(图4e～i)。
此外，免疫细胞化学分析显示，与SMA MNs相比，﹟1-SC-SMAT5C MNs具有更多的SMN蛋白复合体(P<0.001，增加了约1.6倍)(图1g、h)。由于SMN蛋白也发挥轻微的抗凋亡作用，本发明人发现﹟1-SC-SMAT5C MNs中增加的SMN蛋白对凋亡诱导物喜树碱(Camptothecin)和衣霉素(Tunicamucin)的敏感性低于SMA MNs(图5)。
接下来，本发明人通过将编码ABE和sgRNA1的mRNA共注射到轻型SMA小鼠(Smn-/-，SMN22TG/2TG)与杂合Smn敲除小鼠(Smn+/-)杂交获得的合子细胞质中，出生了一只携带T5C编辑(称为：SC-SMAT5C，Smn-/-，SMN2T5C/0)的重型SMA小鼠(Smn-/-，SMN22TG/0)(图6a)。在出生后第9天，SC-SMAT5C初代小鼠明显比同年龄未编辑的SMA小鼠更健康(图1i)。雄性的SC-SMAT5C初代小鼠与雌性杂合子Smn+/-小鼠杂交，产生12只存活的SMA幼鼠，均携带T5C转换位点(SC-SMAT5C)(图6b、c)，与携带T5C转换的同窝杂合子(HETT5C，Smn+/-，SMN2T5C/0)相比，没有任何明显的表型差异(图1j，图6c)。
然而，与未编辑的SMA小鼠(14天内死亡)相比，SC-SMAT5C小鼠显示出更长的寿命(>400天)，体重的明显增加，以及运动功能的提高(翻正反射)(图6d～f)。
此外，免疫细胞化学分析显示，与未编辑过的SMA小鼠相比，SC-SMAT5C小鼠脊髓MNs中出现的SMN蛋白复合体数量显著增加(P<0.001，图6g、h)。
实施例2、利用改造的碱基编辑器靶向ESSA和ESSB的单碱基编辑
本发明人的工作证实，最初使用的ABE不会产生可检测到的DNA脱靶效应，然而，它会产生成千上万的脱靶RNA单核甘酸变异。因此，为了最小化T5C编辑过程中的RNA脱靶和任何生物效应，本发明人使用了三个新开发的高保真的单碱基编辑器：TadAF148A-TadA*F148A-ABEmax(简称ABEmaxF148A)、TadA*-ABEmax(简称miniABEmax)和TadA*V82G-ABEmax(简称miniABEmaxV82G)，并且进一步设计了sgRNAs 4～6(图1a～b，图2a)。
将上述单碱基编辑器同sgRNAs 1-6转染细胞，并在HEK293T细胞、重型SMA模型小鼠来源的胚胎干细胞(mESCs)和SMA小鼠诱导多功能干细胞(iPSC)中识别任何剪接修复相关位点(图7a)；转染后细胞表达报告基因GFP的代表性图像如图7b；流式细胞仪分析转染细胞如图7c。4种DNA单碱基编辑器(ABE、ABEmaxF148A、miniABEmax和miniABEmaxV82G)在3个细胞系中使用6种不同的sgRNAs(sgRNA1到sgRNA6)识别的编辑位点的摘要如表6(靶向SMN2外显子7中的ESS-A和ESS-B)，表中“N”表示没有编辑。
Figure BDA0002424041890000271
通过使用miniABEmax和sgRNA6的组合来靶向SMN2外显子7的ESS-B，这个方式有助于功获得一个新的A36G的同义突变(同义丝氨酸)(图1c、f，图3c～f和图8)。
比较各个剪接修复型SMA(SC-SMA)克隆(图1e～f，图2i～j)中全长SMN2和SMN△7的表达，﹟1-SC-SMAA36G克隆中呈现相对更高的全长SMN2表达以及相对更低的SMN△7表达，其次为﹟2-SC-SMA A36G,A38G克隆、﹟1-SC-SMAT4C,T5C克隆。
值得注意的是，本发明人获得的﹟2-SC-SMAA36G,A38G克隆，具有两个转变，即前面提到的A36G(Ser-to-Ser)和A38G(His-to-Arg)(图1c～d，图4c～d)，未检测到DNA脱靶效应(表5)。此外，本发明人发现iPSC分化的﹟2-SC-SMAA36G,A38G MNs对凋亡诱导物喜树碱和衣霉素的敏感性低于SMA MNs(图1g、h，图4e～i和图5)。因此，从蛋白水平检测表型的结果可见，﹟2-SC-SMAA36G,A38G增加的SMN蛋白具有正常功能。
为了评估神经元有丝分裂后期的单碱基编辑可行性，本发明人用miniABEmax和sgRNA6(miniABEmax-sgRNA6)(图1k)转染了有丝分裂后期的源自于SMA iPCSs的MNs。实现了A36G和A38G碱基转变的成功编辑(图1l、m)。转染后的单个MNs细胞的高通量测序结果显示编辑后的MNs的SMN2-FL基因的表达明显增加，同时A36G转变编辑效率高于A38G(图1n)。此外，miniABEmax-sgRNA6编辑后的SMN△7SMA小鼠的在体内的神经元电切显示，其碱基转变(A36G、A38G)的编辑效率的检测如图1o～q。
综上所述，本发明人成功地使用单碱基编辑系统对SMN2外显子7的ESS-A和ESS-B进行了编辑，从而实现了高效的同义A36G转变，实现了SMN2基因异常剪接的修复。体外凋亡实验证实了A36G和A38G同步转变诱导的SMN蛋白的具备正常的功能。
本发明的研究表明，可以运用单碱基编辑系统修复SMN2基因的异常剪接，藉由单碱基编辑技术来治疗SMA患者，而且，靶向变异第7外显子6号位置以外的碱基效果更佳，这是一种新的治疗途径。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心
<120> 单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用
<130> 201187
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1462
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atggcgatga gcagcggcgg cagtggtggc ggcgtcccgg agcaggagga ttccgtgctg 60
ttccggcgcg gcacaggcca gagcgatgat tctgacattt gggatgatac agcactgata 120
aaagcatatg ataaagctgt ggcttcattt aagcatgctc taaagaatgg tgacatttgt 180
gaaacttcgg gtaaaccaaa aaccacacct aaaagaaaac ctgctaagaa gaataaaagc 240
caaaagaaga atactgcagc ttccttacaa cagtggaaag ttggggacaa atgttctgcc 300
atttggtcag aagacggttg catttaccca gctaccattg cttcaattga ttttaagaga 360
gaaacctgtg ttgtggttta cactggatat ggaaatagag aggagcaaaa tctgtccgat 420
ctactttccc caatctgtga agtagctaat aatatagaac aaaatgctca agagaatgaa 480
aatgaaagcc aagtttcaac agatgaaagt gagaactcca ggtctcctgg aaataaatca 540
gataacatca agcccaaatc tgctccatgg aactcttttc tccctccacc accccccatg 600
ccagggccaa gactgggacc aggaaagcca ggtctaaaat tcaatggccc accaccgcca 660
ccgccaccac caccacccca cttactatca tgctggctgc ctccatttcc ttctggacca 720
ccaataattc ccccaccacc tcccatatgt ccagattctc ttgatgatgc tgatgctttg 780
ggaagtatgt taatttcatg gtacatgagt ggctatcata ctggctatta tatgggtttc 840
agacaaaatc aaaaagaagg aaggtgctca cattccttaa attaaggaga aatgctggca 900
tagagcagca ctaaatgaca ccactaaaga aacgatcaga cagatctgga atgtgaagcg 960
ttatagaaga taactggcct catttcttca aaatatcaag tgttgggaaa gaaaaaagga 1020
agtggaatgg gtaactcttc ttgattaaaa gttatgtaat aaccaaatgc aatgtgaaat 1080
attttactgg actctatttt gaaaaaccat ctgtaaaaga ctggggtggg ggtgggaggc 1140
cagcacggtg gtgaggcagt tgagaaaatt tgaatgtgga ttagattttg aatgatattg 1200
gataattatt ggtaatttta tgagctgtga gaagggtgtt gtagtttata aaagactgtc 1260
ttaatttgca tacttaagca tttaggaatg aagtgttaga gtgtcttaaa atgtttcaaa 1320
tggtttaaca aaatgtatgt gaggcgtatg tggcaaaatg ttacagaatc taactggtgg 1380
acatggctgt tcattgtact gtttttttct atcttctata tgtttaaaag tatataataa 1440
aaatatttaa ttttttttta aa 1462
<210> 2
<211> 1462
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
atggcgatga gcagcggcgg cagtggtggc ggcgtcccgg agcaggagga ttccgtgctg 60
ttccggcgcg gcacaggcca gagcgatgat tctgacattt gggatgatac agcactgata 120
aaagcatatg ataaagctgt ggcttcattt aagcatgctc taaagaatgg tgacatttgt 180
gaaacttcgg gtaaaccaaa aaccacacct aaaagaaaac ctgctaagaa gaataaaagc 240
caaaagaaga atactgcagc ttccttacaa cagtggaaag ttggggacaa atgttctgcc 300
atttggtcag aagacggttg catttaccca gctaccattg cttcaattga ttttaagaga 360
gaaacctgtg ttgtggttta cactggatat ggaaatagag aggagcaaaa tctgtccgat 420
ctactttccc caatctgtga agtagctaat aatatagaac aaaatgctca agagaatgaa 480
aatgaaagcc aagtttcaac agatgaaagt gagaactcca ggtctcctgg aaataaatca 540
gataacatca agcccaaatc tgctccatgg aactcttttc tccctccacc accccccatg 600
ccagggccaa gactgggacc aggaaagcca ggtctaaaat tcaatggccc accaccgcca 660
ccgccaccac caccacccca cttactatca tgctggctgc ctccatttcc ttctggacca 720
ccaataattc ccccaccacc tcccatatgt ccagattctc ttgatgatgc tgatgctttg 780
ggaagtatgt taatttcatg gtacatgagt ggctatcata ctggctatta tatgggtttt 840
agacaaaatc aaaaagaagg aaggtgctca cattccttaa attaaggaga aatgctggca 900
tagagcagca ctaaatgaca ccactaaaga aacgatcaga cagatctgga atgtgaagcg 960
ttatagaaga taactggcct catttcttca aaatatcaag tgttgggaaa gaaaaaagga 1020
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attttactgg actctatttt gaaaaaccat ctgtaaaaga ctgaggtggg ggtgggaggc 1140
cagcacggtg gtgaggcagt tgagaaaatt tgaatgtgga ttagattttg aatgatattg 1200
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tggtttaaca aaatgtatgt gaggcgtatg tggcaaaatg ttacagaatc taactggtgg 1380
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<210> 3
<211> 20
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<213> 向导RNA(sgRNA)
<400> 3
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<212> DNA
<213> 向导RNA(sgRNA)
<400> 6
tttagacaaa atcaaaaaga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 向导RNA(sgRNA)
<400> 7
gacaaaatca aaaagaagga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 向导RNA(sgRNA)
<400> 8
cacattcctt aaattaagga 20
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> SMN第七外显子(SMN Exon7)
<400> 9
ggttttagac aaaatcaaaa agaaggaagg tgctcacatt ccttaaatta agga 54
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> bpNLS序列(bpNLS)
<400> 10
atgaaacgga cagccgacgg aagcgagttc gagtcaccaa agaagaagcg gaaagtc 57
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> bpNLS序列(bpNLS)
<400> 11
aaaagaaccg ccgacggcag cgaattcgag cccaagaaga agaggaaagt c 51
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 12
gctgatgctt tgggaagtat gtta 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 13
gagcaccttc cttctttttg a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 14
tacatgagtg gctatcatac t 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 15
tatcatactg gctattatat ggaa 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 16
tccagatctg tctgatcgtt tctt 24
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 17
ctggcataga gcagcactaa atgacaccac 30
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 18
agccactgca agaaaacctt aactg 25
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 19
ccagaggctt gacgaattcc a 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 20
tgggataact tttaaagtac 20
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 21
gaattcggat ccgttttcca caaaccataa ag 32
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 22
tctcttgatg atgctgatgc 20
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 23
tctgatcgtt tctttagtgg tgtc 24

Claims (23)

1.一种增加功能性SMN2蛋白表达的方法，其特征在于，该方法包括：靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述7号外显子的第4、5或6位碱基被变异为碱基C；或所述7号外显子的第36、38或45位碱基被变异为G。
3.如权利要求1～2任一所述的方法，其特征在于，
所述7号外显子的第36位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变；
所述7号外显子的第45位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变；
所述7号外显子的第36位和第38位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Ser-Ser变异为Ser-Arg；
所述7号外显子的第4位和第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Phe变异为Pro；
所述7号外显子的第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Phe变异为Ser；或
所述7号外显子的第6位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用基因编辑、定点突变或同源重组来进行SMN2基因7号外显子的变异；较佳地，利用单碱基编辑介导的剪接修复来进行基因编辑。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述单碱基编辑介导的剪接修复利用DNA单碱基编辑器进行；较佳地所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器或其变体；更佳地，所述腺嘌呤碱基编辑器包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述腺嘌呤碱基编辑器或其变体包括以下操作性连接的元件：
ABE：TadA-TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
ABEmaxF148A：TadAF148A-TadA*F148A，Cas9n或Cas9n-KKH；
MiniABEmax：TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
miniABEmaxV82G：TadA*V82G，Cas9n/Cas9n-KKH；
较佳地，在其氨基端和/或羧基端还包括核定位序列。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:8所示序列的sgRNA进行碱基编辑。
8.如权利要求5～7任一所述的方法，其特征在于，所述方法应用于诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、生殖细胞或体细胞，该细胞中SMN2基因编码截短的SMN2蛋白；所述方法包括：提供针对SMN2基因7号外显子的sgRNA以及DNA单碱基编辑器，引入到所述细胞中。
9.一种SMN2基因突变体，其核苷酸序列的7号外显子上发生一个或多个碱基的变异，所述变异存在于该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基上。
10.如权利要求9所述的SMN2基因突变体，其特征在于，所述7号外显子的第4、5或6位碱基被变异为碱基C；或所述7号外显子的第36、38或45位碱基被变异为G。
11.如权利要求10所述的SMN2基因变体，其特征在于，
所述7号外显子的第36位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变；
所述7号外显子的第45位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变；
所述7号外显子的第36位和第38位变异为G，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Ser-Ser变异为Ser-Arg；
所述7号外显子的第4位和第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Phe变异为Pro；
所述7号外显子的第5位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸由Phe变异为Ser；或
所述7号外显子的第6位变异为C，SMN2蛋白中相应位置的氨基酸不变。
12.如权利要求9～11任一所述的SMN2基因变体，其特征在于，所述SMN2基因7号外显子序列如SEQ ID NO:9。
13.一种细胞，所述的细胞中功能性SMN2蛋白正常表达或高表达，其特征在于，所述的细胞中包含权利要求9～12任一所述的SMN2基因变体；较佳地，所述的细胞包括：诱导性多能干细胞、胚胎干细胞，生殖细胞或体细胞。
14.权利要求9～12任一所述的SMN2基因变体的用途，用于制备增加功能性SMN2蛋白表达的构建体或试剂。
15.如权利要求1～8任一所述的方法的用途，用于制备增加功能性SMN2蛋白表达的构建体或细胞；较佳地，所述的细胞包括：诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、生殖细胞或体细胞。
16.增加功能性SMN2蛋白表达的试剂在制备缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的药物中的用途；所述的增加SMN2蛋白表达的试剂是靶向SMN2基因7号外显子，变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括：基因编辑试剂、定点突变试剂或同源重组试剂；较佳地，所述的试剂包括DNA单碱基编辑器和sgRNA；更佳地，所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器或其变体。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述腺嘌呤碱基编辑器包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n；更佳地，包括：
ABE：TadA-TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
ABEmaxF148A：TadAF148A-TadA*F148A，Cas9n或Cas9n-KKH；
MiniABEmax：TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
miniABEmaxV82G：TadA*V82G，Cas9n/Cas9n-KKH；
较佳地，在其氨基端和/或羧基端还包括核定位序列。
19.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述sgRNA为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示序列的sgRNA。
20.一种制备细胞的方法，所述的细胞中功能性SMN2蛋白高表达，其特征在于，所述方法包括：将增加SMN2蛋白表达的试剂引入到细胞中，所述试剂是靶向SMN2基因7号外显子、变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基。
21.一种用于缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的药物组合物或药盒，其特征在于，其中含有增加SMN2蛋白表达的试剂，所述试剂是靶向SMN2基因7号外显子、变异其中一个或多个碱基的试剂；较佳地，所述的一个或多个碱基为该7号外显子的第4、5、6、36、38和/或45位碱基；更佳地，所述的增加SMN2蛋白表达的试剂包括：DNA单碱基编辑器，sgRNA。
22.如权利要求21所述的药物组合物或药盒，其特征在于，所述DNA单碱基编辑器为腺嘌呤碱基编辑器或其变体；更佳地，所述腺嘌呤碱基编辑器包括以下操作性连接的元件：TadA和/或TadA*，Cas9n；更佳地，所述腺嘌呤碱基编辑器或其变体包括：
ABE：TadA-TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
ABEmaxF148A：TadAF148A-TadA*F148A，Cas9n或Cas9n-KKH；
MiniABEmax：TadA*，Cas9n或Cas9n-KKH；
miniABEmaxV82G：TadA*V82G，Cas9n/Cas9n-KKH。
23.如权利要求21所述的药物组合物或药盒，其特征在于，所述sgRNA具有如SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示的序列。
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