CN103314106A - 修饰的人类U1snRNA分子、编码修饰的人类U1snRNA分子的基因、包括该基因的表达载体及其在基因治疗中的用途 - Google Patents

修饰的人类U1snRNA分子、编码修饰的人类U1snRNA分子的基因、包括该基因的表达载体及其在基因治疗中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN103314106A
CN103314106A CN2011800497409A CN201180049740A CN103314106A CN 103314106 A CN103314106 A CN 103314106A CN 2011800497409 A CN2011800497409 A CN 2011800497409A CN 201180049740 A CN201180049740 A CN 201180049740A CN 103314106 A CN103314106 A CN 103314106A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
exon
sequence
sudden change
molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800497409A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103314106B (zh
Inventor
佛朗哥·帕加尼
米尔科·皮诺蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universita degli Studi di Ferrara
Original Assignee
Universita degli Studi di Ferrara
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universita degli Studi di Ferrara filed Critical Universita degli Studi di Ferrara
Publication of CN103314106A publication Critical patent/CN103314106A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103314106B publication Critical patent/CN103314106B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
    • C12Y306/03049—Channel-conductance-controlling ATPase (3.6.3.49)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明描述了修饰的人类U1snRNA分子，其靶序列位于靶基因的前mRNA的由外显子/内含子连接位点下游的2至50个碱基对构成的区域，其能够恢复治疗感兴趣的含突变的靶基因的正确剪接，该突变引起外显子遗漏并导致遗传疾病。通过关于纠正与外显子遗漏相关联的诸如脊髓型肌萎缩、乙型血友病和囊性纤维化之类的疾病的举例描述了修饰的人类U1snRNA分子。

Description

修饰的人类U1snRNA分子、编码修饰的人类U1snRNA分子的基因、包括该基因的表达载体及其在基因治疗中的用途
技术领域
本发明涉及修饰的人类snRNA分子（下文定名为外显子特异性U1——ExSpeU1），其适宜在基因治疗方法中使用。具体地，本发明涉及能够纠正由基因突变导致的并与通常非常严重的具有不同病史的人类疾病相关的异常剪接过程的snRNA分子。
背景技术
许多人类遗传疾病（约15%）由基因突变导致，其通过干扰正确的信使RNA细胞内成熟，损害随后准确的蛋白生物合成并诱导无功能的蛋白的合成而引起疾病。通常，造成剪接缺陷的点突变涉及对负责加工初级转录物的机器识别该初级转录物关键的基因序列。位于外显子-内含子交界处的供体和受体位点，以及外显子或内含子中的基因特异性调控元件（Cartegni L等人,2002；Pagani等人,2004）是其中最重要的序列。这些突变的结果可能引起多种分子事件，其最频繁地与将一个外显子排除在成熟转录物之外有关，即所谓的外显子遗漏（exon skipping）。
信使RNA的加工中的分子改变是长久已知的，其涉及例如外显子遗漏，代表多种人类疾病的主要发病机制，所述多种人类疾病其中的乙型血友病、囊性纤维化和脊髓型肌萎缩，其临床过程的严重度一致。不同类型的突变可诱导外显子遗漏和在供体位点（或5’剪接位点）中特异性的突变，在受体位点（3’剪接位点）中的突变，或外显子突变。作为引起外显子遗漏的不同类型的突变的例子，以下为所描述的人类疾病的三种模型。
凝血因子IX（FIX）中的缺陷是乙型血友病发病的原因，该病伴随不同程度的出血表现，有时非常严重并使人病废。在一些情况下，该病由剪接缺陷所导致。具体地，在剪接过程中，外显子5被排除出mRNA排除由因子IX基因（F9）的外显子5供体位点中的位置-2处的突变和受体位点中的多嘧啶序列中的位置-8和-9处的突变两者所导致。
目前乙型血友病治疗主要基于重组外源性FIX或直接取自血浆的FIX的频繁输注，其局限加强了研究以更高效力和长期效果为特征的替代方法的需要。
囊性纤维化（CF）在高加索人群中是最频繁致死的先天性遗传病：2500-2700个出生存活婴儿中就有一个新生儿罹患该病。
该病的病理发生续发于定名为CFTR（囊性纤维化跨膜传导调节因子）的蛋白的异常，该蛋白位于上皮细胞的顶膜并具有调节水电解质交换的功能。
作为CFTR改变的结果，盐通过细胞膜的传递被抑制，主要导致可定义为“脱水的”分泌物的产生：非常富集钠和氯的汗液与倾向于堵塞导管的浓密和粘稠的粘液，损害了多种器官和系统的功能。在一些研究的过程中，鉴定了CFTR基因序列中的许多改变与囊性纤维化相关联，其引起外显子遗漏。具体地，外显子12的遗漏由位于外显子自身的剪接供体位点中的突变和由外显子突变所导致。
脊髓型肌萎缩（SMA，OMIM253300，253550和253400）是隐性的常染色体神经肌肉病，以脊髓α运动神经元的变性为特征，具有估计的1/10,000出生儿的患病率。SMA相关联的临床症状范围从极其严重的出生后危险性肌张力低下和肌无力，到较晚在童年或青春期期间发病的较轻微的形式。迄今为止，尚未鉴定对于这种根据病史的严重度通常在一定年龄导致死亡的疾病的治疗。
在95%的病例中，疾病由SMN1基因的缺失所导致。在人类基因组中，存在与SMN1同源的基因，称作SMN2。然而，SMN2的表达由于外显子中的同义突变导致信使RNA的异常成熟和随后外显子7的遗漏并使基因自身失活而受损。设计的提高含外显子7的SMN2转录物的数目的方法将因此允许使用由于SMN2的正确表达而对于SMN1基因的缺失的补偿疗法，极大地暗示了为SMA的可能有效的治疗。
在剪接过程中，微核RNA（snRNA）作为负责介导整个mRNA成熟过程的细胞机器的剪接体的必需组分起主要作用。具体地，微小U1RNA（U1snRNA），长度为164核糖核苷酸，由在人类基因组中出现若干拷贝的基因所编码，且代表着核粒子U1snRNP的核糖核酸组分。U1snRNA分子具有茎和环三维结构，且其在5’区域包括通常长为9个核苷酸的单链序列，该单链序列能够通过互补性碱基配对结合前mRNA分子上的剪接供体位点（Horowitz等人,1994）。图1显示了野生型U1snRNA结构的示意图。显示了5’区域中能够识别剪接供体位点的序列与真核基因的初级转录物中的剪接供体位点的共有序列配对。这一序列表现出不同程度的保守，且位于外显子/内含子连接处。由U1snRNA5’区域介导的识别对于界定初级转录物上的外显子/内含子连接位点和剪接体复合物的正确组装是关键的。
渐增数目的与前mRNA剪接缺陷相关联的人类遗传疾病，及其临床过程的常见的严重度，在过去几年刺激着针对在分子水平上纠正剪接缺陷的治疗分子的研究。
Pinotti M等人2008和Pinotti M等人,2009中描述了在突变位于5’剪接位点的情况下，能够在体外引起正确的外显子增加并恢复凝血因子VII mRNA的正确剪接的修饰的U1snRNA分子的应用。所示的机制基于修饰的U1snRNA在5’突变的剪接位点上的直接识别和结合。然而，由于5’剪接位点的相对保守和随之而来的干扰从其他功能性野生型基因生成的转录物的成熟的风险，该方法出现治疗snRNA分子对靶基因的一定程度的非特异性作用。并且，其需要使用对5’剪接位点中的每个突变修饰的U1snRNA。
发明内容
本发明表明了与5’剪接位点的下游内含子序列互补的修饰的U1snRNA（且本文定义为外显子特异性U1，ExSpeU1），在剪接过程中，能够恢复被不同类型的突变损害的外显子增加。在三种治疗感兴趣的不同的人类遗传疾病模型中（脊髓型肌萎缩，血友病和囊性纤维化），本发明表明了，单独的ExSpeU1或ExSpeU1的组能够引起每种疾病模型的相应外显子的增加。单独的ExSpeU1或ExSpeU1的组纠正了由供体位点中的突变、受体位点的多嘧啶区域中的突变和调控外显子序列中的突变导致的外显子遗漏。利用ExSpeU1获得的纠正有效性与现有技术中所描述的相同，但其可能保证对治疗感兴趣的靶基因转录物的作用的更高的选择性。ExSpeU1方法允许使用单独的修饰的U1-snRNA以用于纠正导致外显子遗漏的一套组不同的基因突变。
这些和其他目的通过如权利要求1中所定义的修饰的人类U1snRNA分子来达到。修饰的人类U1snRNA分子特征在于野生型人类U1snRNA的5’区域中的部分单链核苷酸序列被能够与治疗感兴趣的含引起异常剪接的突变的靶基因的初级转录物上的靶核苷酸序列杂交的结合单链核苷酸序列所替换。U1snRNA分子的靶核苷酸序列位于由外显子/内含子连接位点（5’剪接位点）的下游2至50个碱基对构成的前mRNA的区域，条件是靶核苷酸序列不包括所述外显子/内含子连接位点。优选地，靶核苷酸序列长度为5至50个核苷酸，更优选地为9至30个核苷酸。
与现有技术相比较，本发明的U1snRNA分子主题具有进行靶向的和选择性的（外显子特异性的）作用的优点，因为其结合位于剪接供体位点侧翼的内含子区域中的初级转录物上的靶核苷酸序列，其与外显子/内含子连接位点的序列相比较表现出较低程度的保守。然而，令人惊奇地是，尽管在不包括外显子/内含子连接位点的靶序列上运作，本发明的U1snRNA分子仍然能够在存在包括外显子突变或受体位点上的突变的不同类型的突变时引起外显子的增加。
本发明的另外的特征在所附权利要求中定义，其为构成本说明书的技术教导的整体必需的部分。
在一个优选的实施方案中，被结合核苷酸序列所替换的野生型U1snRNA的单链5’区域的部分长度为9至12个核苷酸。
优选地，被ExSpeU1所纠正的和导致外显子遗漏的突变位于由内含子/外显子连接位点（3’剪接位点）的上游3至50个碱基对构成的序列，外显子突变和剪接供体位点的共有序列中的突变。
通过举例的方式在治疗感兴趣的基因中监测凝血因子IX，SMN2和CFTR基因，其为含有与使其利用本发明的ExSpeU1来治疗的疾病相关的突变的那些基因。
在一个优选的实施方案中，本发明的修饰的人类U1snRNA分子包括选自由SEQ ID NO:1至11，更优选地从SEQ ID NO:1至10组成的组的结合核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，基因包括启动子序列和聚腺苷酸化信号序列。虽然其他自身已知的容易被本领域中的普通技术人员选择的启动子也可被使用，但是本发明人证实了编码人类U1snRNA的基因的内源性启动子是尤其适宜的。
下文通过举例的方式叙述了野生型人类U1snRNA编码基因的正链的序列（在序列表中定名为SEQ ID NO:12），其中单链5’区域在修饰的U1snRNA分子中被结合序列所替换的部分为粗体。用于插入结合序列的独特的BglII和BclI限制位点的序列以下划线显示。除以大写字母显示的RNA编码区域外，SEQ ID NO:12基因序列还包括其表达所需的一些调控元件，比如启动子和聚腺苷酸化信号。
5’-
taaggaccagcttctttgggagagaacagacgcaggggcgggagggaaaaagggagaggcagacgtcacttccccttggcggctctggcagcagattggtcggttgagtggcagaaaggcagacggggactgggcaaggcactgtcggtgacatcacggacagggcgacttctatgtagatgaggcagcgcagaggctgacgtcttcgccacttgctgcttcaccacgaaggagttcccgtgccctgggagcgggttcaggaccgctgatcggaagtgagaatcccagctgtgtgtcagggctggaaagggctcgggagtgcgcggggcaagtgaccgtgtgtgtaaagagtgaggcgtatgaggctgtgtcggggcagaggcccaagatctgATACTTACCTGGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTGactttctggagtttcaaaagtagactgtacgctaa-3’（SEQ ID NO:12）
明显地，仅以举例的方式提供了以上的基因序列。可选地，为构建编码本发明的修饰的U1snRNA的基因，可使用与SEQ ID NO:12同源的任何基因序列，即能够编码能够有效地介导剪接供体位点的识别的U1snRNA的基因序列。
在实施例的章节中详细描述了含有不同的结合序列的本发明的不同的修饰的U1snRNA分子主题的制备方法。
本发明的又一个另外的目的是包括如先前所定义的分离的基因的表达载体。虽然本身已是本领域中的普通技术人员熟知的其他类型的表达载体也可使用，但是通常优选的表达载体是腺相关病毒载体。
如先前所描述的，修饰的人类U1snRNA分子，编码所述RNA分子的基因和包括所述基因的载体适用于由异常剪接导致的或与异常剪接相关联的并以外显子遗漏为特征的遗传疾病的治疗性处理。优选地，但非以限制性方式地，所述疾病是囊性纤维化、乙型血友病或脊髓型肌萎缩。
为达到该目的，将修饰的U1snRNA分子、所述基因和/或所述载体配制到药物组合物中，所述药物组合物除治疗活性分子外还包括药学上可接受的载体。载体和任选的药物赋形剂的选择是本领域中的普通技术人员所熟知的。
本发明的另一方面是用于在培养的细胞中恢复治疗感兴趣的含有引起异常剪接的突变的靶基因的正确剪接的体外方法，所述体外方法通过用如先前所定义的表达载体转染培养的细胞来进行。
本发明的修饰的U1snRNA分子主题通过利用本领域中的普通技术人员熟知的常规分子生物学方法来生成。为评估本发明的U1snRNA主题对纠正异常剪接过程的作用，和为鉴定最有效的那种，本发明人广泛使用了微基因方法，该方法的应用在科学文献中广泛记载。这一方法包括将含有导致剪接缺陷的突变的基因部分克隆到表达载体中，且然后将重组载体转染到体外培养的细胞中。通过RT-PCR对源自感兴趣的基因的部分的转录物进行分析，从而允许鉴定来源于异常剪接过程的长度异常的mRNA分子。修饰的U1snRNA与微基因的共转染之后正常长度的感兴趣的转录物的出现及其测序，代表了U1snRNA分子恢复正确的剪接过程的能力的明确指示。
然而，正确信使RNA加工的恢复和具有实际治疗意义的最终蛋白水平的恢复之间的类推还不明确。
为此，本发明人使用了杂交微基因方法，其允许剪接和所表达的蛋白的研究。该方法由本发明人引入以研究凝血因子VII中的剪接突变（Pinotti等人,2009）。这一方法包括将整个编码序列中的在含有导致剪接缺陷的突变的区域中包含一些内含子的基因的部分克隆到表达载体中（“剪接胜任cDNA构建体”），并随后将重组载体转染到体外培养的细胞中。通过RT-PCR对源自感兴趣的基因的部分的转录物进行的分析，以及合成的蛋白的水平和活性的测量允许对生物功能的恢复的评估。
通过示例的方式提供了以下的实施例，且并不限制所附权利要求中所定义的本发明的范围。
具体实施方式
实施例1：修饰的U1snRNA的生成
通过以下程序生成修饰的U1snRNA：用BglII和BclI限制酶消化包含野生型U1-snRNA基因的序列，即未修饰的U1-snRNA的质粒。用含有结合序列的双链寡核苷酸替换由该两个限制位点之间构成的序列。以下表1中描述了每个寡核苷酸的正向序列和反向序列，并以所用的寡核苷酸来命名所得的修饰的U1-snRNA。
并且，图2显示了U1snRNA基因元件的示意图。标示了通过其制备不同的修饰的U1snRNA的克隆策略。图2显示了插入到质粒载体（pGEM）中的具有启动子元件DSE和PSE，编码U1snRNA的区域（在中部），和3’加工盒的U1snRNA基因。转录起始位点以箭头示出。BglII和BclI限制位点之间的序列包括编码单链U1snRNA尾巴的区域，其已被用于特异性生成表1中所示的修饰的U1snRNA的寡核苷酸所替换。
表1
Figure BDA00003049402800091
实施例2：将微基因转染到培养细胞中并分析剪接产物
通过利用Lipofectamine（脂质体）进行瞬时转染将包含载体插入到细胞中。在用Trizol提取总细胞RNA后，用特异性的引物通过RT-PCR分析RNA。
反应在两步中发生：利用随机引物作为模板通过逆转录酶将RNA逆转录为cDNA链，和通过DNA聚合酶扩增所得的cDNA。
在终体积25μl的混合物中进行PCR反应，该混合物包含：
-5μl的AMV/Tfl5x缓冲液，适宜于上述两种酶正确行使功能；
-1μl的10mM dNTP混合物；
-50pmol的正向引物和50pmol的反向引物；
-2μl的25mM MgSO4；
-2μl的细胞提取的RNA；
-1μl的AMV-RT（0.1μ/μl），1μl的Tfl DNA聚合酶；
-适量的超纯H2O
逆转录步骤在45℃下进行45分钟。然后进行将PCR混合物调节到94℃的温度持续2分钟的步骤，然后进行40次循环的PCR，且最终为68℃下持续7秒的延伸步骤。
通过在琼脂糖凝胶中电泳和/或通过毛细管电泳来分离扩增产物。
实施例3：与乙型血友病相关联的凝血因子IX的供体位点附近的外显子 突变和外显子5受体位点的上游的多聚嘧啶序列中的突变
在所述因子IX基因（F9）中，供体位点中的位置-2处的外显子突变，以及外显子5的受体位点中的位置-8和-9处的突变与乙型血友病相关联。令人感兴趣地是注意到外显子中的位置-2处的突变是同义突变且不会改变编码序列，但引起外显子遗漏且因此其被分类为剪接突变。受体部位中的位置-8和-9处的突变也引起外显子5的遗漏。
表2显示了所讨论的突变，其在罹患乙型血友病的患者中被鉴定（乙型血友病国际数据库）。属于外显子5的核苷酸以大写字母来显示，而属于内含子的那些核苷酸为小写体。在图的底部显示的每个位置受到一个或多个突变的影响，其核苷酸改变以粗体显示。
表2
Figure BDA00003049402800101
构建了定名为pTB NdeI FIX的用于表达微基因构建体的载体以研究正常的和突变的FIX的剪接。为此，将受突变影响的外显子5的上游的308bp和区域的下游的283bp的基因组DNA的部分插入到广泛用于研究体外剪接的载体，质粒pTBNdeI中（Pagani等人,2000；Pagani等人2002；Pagani等人,2003）。
在图3中，图示了用于研究剪接的构建体pTB FIX ex5的中间部分。矩形代表了α球蛋白和FIX外显子5的构建体的中间区域，内含子以线表示。外显子5和侧翼的内含子区域（IVS4和IVS5）被克隆到质粒pTB中。转录在α球蛋白启动子和SV40增强子的控制下进行。示出了两种可能的剪接同工型。
在插入突变之后，本发明人然后已证明通过在HepG2真核细胞中生成的微基因的表达由此引起的效果，HepG2真核细胞是用于研究肝源性的蛋白诸如FIX的理想的细胞模型。具体地，通过瞬时转染将载体插入到细胞中并通过利用寡核苷酸alfa2-3和BRA2作为引物依照所附的方法中所示的分析RNA。特别地，所有突变引起外显子遗漏（图4）。
所构建的修饰的U1-snRNA、其靶序列和其在供体位点周围的位置的列表记录在表3中。
表3：用于纠正所述因子IX基因的外显子5的剪接缺陷的修饰的U1-snRNA的结合序列
Figure BDA00003049402800111
图5中显示了纠正凝血因子IX基因的外显子5剪接缺陷所采用的修饰的U1snRNA上的结合位点的位置。外显子5的序列以大写字母示出，而其余序列表示内含子。
对位置-2C处的突变检验了不同的修饰的U1snRNA，图6中显示了其对于外显子5增加的百分比的作用。如可观察到的，许多修饰的U1snRNA能够显著地提高外显子5增加的百分比，从而补偿了位置-2C处的突变的影响。这表明U1snRNA与供体位点或附近（ExSpeU1）的结合有利于外显子5的限定。效率根据位置而不同，且U1-FIX1、FIX9、FIX10显示了较高活性。效率随距5’剪接位点剪接位点的距离增大而降低。重要的是注意到U1snRNA与剪接位点侧翼非保守的内含子序列的互补性对于提高其特异性是重要的。并且，必须指出的是即使FIX的少量增加（>正常的2%）可能导致患者出血倾向的显著增高。为此，甚至效率不高的ExSpeU1分子可能在乙型血友病以及在其他凝血缺陷中具有治疗意义。利用修饰的U1snRNA分子，关于供体位点（-2A>G，-2A>T）和受体位点（-8T>G，-9T>G）中的其他突变达到了相似的效果。
尤其值得注意地是表明了一种单独的修饰的U1snRNA，且尤其是在位置9（FIX9）处配对的那种，能够在所研究的所有不同的突变存在的情况下显著地恢复剪接。
至今从未报道与该发现有关的数据，其显示于图7中。
通过其引起蛋白合成的能力检验了任何治疗方法的有效性，在病理状况下所述蛋白合成的水平下降了。
为验证在信使RNA水平上观察到的纠正是否导致增加的合成和分泌的FIX的功能，构建了微基因，其中外显子5和其侧翼内含子序列已被插入到FIX全长编码序列中。图8示意性地记录了所生成的用于该研究并被克隆到载体pBskFIX的构建体。矩形指示了编码序列，和ATG起始密码子和TAA终止密码子，而内含子以线示出。
将该微基因转染到合成和分泌功能性FIX的能力经过选择的BHK仓鼠肾细胞中，显示了信使RNA被正确地加工和被翻译成蛋白（图9）。事实上，在培养基中测量了相当数量的功能性蛋白。对比之下，供体位点（-2A>G，-2A>T）或受体位点（-8T>G，-9T>G）中的突变导致了外显子5的排除和在正常凝集测定中无功能的截短的蛋白变体的合成。通过蛋白质印迹（上图），事实上证明了由于编码序列中的外显子5的缺少，突变导致了具有较低分子量的FIX变体的合成。无可评估的凝集活性对应于该形式（下图）。
内含子ExSpeU1fix9的表达能够恢复剪接并将功能性分泌的FIX的水平增高至高达若到达患者将极大地高于治疗阈值的水平。这些结果证实了ExSpeU1方法的有效性。
实施例4：脊髓型肌萎缩
对该研究使用了表达SMN1（pCI-SMN1）和SMN2（pCI-SMN2）微基因的载体（Hua等人，2007）。该微基因广泛用于验证能够纠正SMN2基因中的剪接缺陷的治疗分子的作用（Hua等人，2007，Hua等人，2008）。
两种微基因在CMV启动子控制下由外显子6的111个核苷酸、内含子6的200个核苷酸、外显子7的54个核苷酸、内含子7的444个核苷酸和外显子8的前75个核苷酸构成。两种微基因的差异在于外显子7中的位置6处的一个核苷酸置换的出现。在pCI-SMN1中为C，而在pCI-SMN2中为T。这一同义置换引起pCI-SMN2的剪接缺陷，成熟转录物中的外显子7的遗漏。pCI-SMN2微基因在图10中示意性地示出。示出了外显子中位置+6T处的同义变体，其引起外显子遗漏。
许多实验证据已表明SMN2基因的剪接的纠正代表着SMA的有效治疗策略（Hua等人，2007；Hua等人，2008；Lorson等人，2010）。表5显示了生成的修饰的U1-snRNA、其靶序列和其在供体位点周围的定位的列表。在SMN2微基因中检验了不同的修饰的U1-snRNA和其对外显子7增加的百分比的作用，并在SMN1微基因中作为对照。
表5：基因中对于用于纠正SMN2基因中的外显子7的剪接缺陷的修饰的U1-snRNA的识别序列（U1-SR）
Figure BDA00003049402800131
图11显示了用于纠正SMN2基因的剪接缺陷的修饰的SMN U1snRNA的定位。
通过利用Lipofectamine（脂质体）进行瞬时转染将微基因插入到HeLa细胞中。如实施例2中所示通过RT-PCR分析RNA。然后使从细胞提取的RNA经受利用引物pCIFwdB和E8-75R的RT-PCR以评估剪接产物。
如在图12中所观察到的，将pCI SMN2质粒转染到培养的细胞中主要显示了外显子7的遗漏。与U1-Wt对照质粒（孔2）的共转染无作用。与U1ex7SMN-1G-2G-3A质粒的共转染（孔3）、与U1ex7SMN sh2质粒的共转染（孔4）和与U1ex7SMN sh17质粒的共转染（孔5）引起外显子7的增加的百分比的显著增高。与SMN1对照质粒中的不同的修饰的SMN U1snRNA的共转染显示无作用。
具体地，图12显示了修饰的SMN U1对SMN2剪接的作用。SMN2基因（孔1）的外显子7的剪接图谱和修饰的U1snRNA（孔2-5）的共表达的作用在图的上部示出。示出了外显子7增加（＋）和排除（－）两种同工型。在下图中柱状图显示了外显子7的增加的百分比，并从而显示了正确剪接的百分比。数据是三次独立实验的平均数。
实施例5：与囊性纤维化相关联的外显子和CFTR外显子12供体位点中 的突变
囊性纤维化由CFTR基因中的突变所导致。表6中示出了与严重疾病形式相关联的引起异常外显子遗漏的位于外显子12剪接位点的突变。位于外显子12中的一些突变引起外显子遗漏（Pa-gani等人,2003）。表7中示出了引起外显子12的排除的外显子突变。
表6：CFTR基因的外显子12供体位点中的突变的列表。突变以粗体显示
Figure BDA00003049402800141
表7
核苷酸置换 氨基酸置换 外显子中的位置
G>A A566T +17
C>T Y577Y +52
表8显示了经修饰以用于纠正CFTR基因的外显子12中的剪接缺陷的U1-snRNA基因中的识别序列，其选自修饰的U1snRNA的较大的套组。
表8
Figure BDA00003049402800151
图13中示意性地表示了所用的pTB CFex12微基因（Pagani等人,2003）。矩形代表CFTR外显子12的中间区域和α球蛋白构建体的中间区域，内含子以线表示。外显子12和侧翼内含子区域被克隆到质粒pTB中。转录在α-球蛋白启动子和SV40增强子的控制下。示出了两种可能的剪接同工型。
图14显示了用于纠正CFTR基因的外显子12的剪接缺陷的ExSpeU1cf11的定位。
如实施例2中所示的通过RT-PCR分析RNA：将微基因转染到培养的细胞中并通过利用alfa2-3和BRA2作为引物和微基因分析剪接产物。
图15显示了ExSPeU1cf11对由位于5’剪接位点和外显子中的不同类型的突变引起的异常剪接的作用。在所分析的所有突变体中ExSPeU1 cf11引起了外显子12的增加的百分比的显著提高。
图15的上部中示出了不同的变体（奇数孔）的剪接图谱和ExSPeU1 cf11的共转染（偶数孔）的作用。示出了外显子12增加（＋）和排除（－）两种同工型。在下图中柱状图显示了外显子12的增加的百分比，并从而显示了正确剪接的百分比。数据为3次独立的实验的平均数。
利用表达每种特异性变体的0.5μg载体转染细胞。通过利用引物ALPHA2,3和BRA2的RT-PCR评估剪接图谱。在2%琼脂糖凝胶上分离扩增的片段。增加（＋）或排除（－）外显子12的转录物的身份在凝胶的右侧示出，并已通过测序来验证。
参考文献
-Cartegni,L.,S.L.Chew,和A.R.Krainer.2002.Listening to silence andunderstanding nonsense:exonic mutations that affect splicing（倾听沉默和理解无意义：影响剪接的外显子突变）.Nat Rev Genet3:285-98.
-Horowitz DS,Krainer AR.Mechanisms for selecting5'splice sites inmammalian pre-mRNA splicing（在哺乳动物前mRNA剪接中选择5’剪接位点的机制）.Trends Genet.1994Mar;10(3):100-6.
-Hua,Y.,T.A.Vickers,B.F.Baker,C.F.Bennett,和A.R.Krainer.2007.Enhancement of SMN2exon7inclusion by antisense oligonucleotides targeting theexon（通过靶向外显子的反义寡核苷酸增强SMN2外显子7增加）.PLoSBiol 5:e73.
-Hua,Y.,T.A.Vickers,H.L.Okunola,C.F.Bennett,和A.R.Krainer.2008.Antisense masking of an hnRNP A1/A2intronic splicing silencer corrects SMN2splicing in trans-genic mice（在转基因小鼠中hnRNP A1/A2内含子剪接沉默子的反义屏蔽纠正了SMN2剪接）.Am J Hum Genet 82:834-48.
-Lorson,C.L.,H.Rindt,和M.Shababi.Spinal muscular atrophy:mechanisms and thera-peutic strategies（脊髓型肌萎缩：机制和治疗策略）.Hum Mol Genet 19:R111-8.
-Pagani,F.,E.Buratti,C.Stuani,M.Romano,E.Zuccato,M.Niksic,L.Giglio,D.Faraguna,和F.E.Baralle.2000.Splicing factors induce cystic fibrosistransmembrane regulator exon9skipping through a nonevolutionary conservedintronic element（剪接因子通过非进化的保守的内含子元件引起囊性纤维化跨膜调控因子外显子9遗漏）.J Biol Chem275:21041-7.
-Pagani,F.,E.Buratti,C.Stuani,R.Bendix,T.Dork,和F.E.Baralle.2002.A new type of mutation causes a splicing defect in ATM（导致ATM中的剪接缺陷的新型突变）.Nat Genet30:426-9.
-Pagani,F.,C.Stuani,M.Tzetis,E.Kanavakis,A.Efthymiadou,S.Doudounakis,T.Ca-sals,和F.E.Baralle.2003.New type of disease causingmutations:the example of the composite exonic regulatory elements of splicing inCFTR exon12（导致突变的新型疾病：CFTR外显子12中的剪接的合成的外显子调控元件的例子）.Hum Mol Genet12:1111-20.
-Pagani,F.,和F.E.Baralle.2004.Genomic variants in exons and introns:identifying the splicing spoilers（外显子和内含子中的基因组变体：鉴定剪接破坏者）.Nat Rev Genet5:389-96.
-Pinotti,M.,L.Rizzotto,D.Balestra,M.A.Lewandowska,N.Cavallari,G.Marchetti,F.Bernardi和F.PaganiI.Maestri,F.Pagani,和F.Bernardi.2008.U1-snRNA mediated rescue of mRNA processing in severe factor VII deficiency（U1-snRNA介导严重的因子VII缺陷中的mRNA加工的恢复）.Blood111:2681-2684
-Pinotti,M.,D.Balestra,L.Rizzotto,I.Maestri,F.Pagani,和F.Bernardi.2009.Rescue of coagulation factor VII function by the U1+5A snRNA（通过U1+5A snRNA对凝血因子VII功能的恢复）.Blood113:6461:6464
Figure IDA00003049403200011
Figure IDA00003049403200031
Figure IDA00003049403200041
Figure IDA00003049403200051
Figure IDA00003049403200071
Figure IDA00003049403200081
Figure IDA00003049403200101
Figure IDA00003049403200111

Claims (17)

1.一种修饰的人类U1snRNA分子，其能够纠正由位于由外显子的上游的50个碱基对和下游的20个碱基对之间构成的序列中的突变导致的外显子遗漏，所述修饰的人类U1snRNA分子特征在于野生型人类U1snRNA的5’区域的单链核苷酸序列的部分被能够与从含引起外显子遗漏的突变的治疗感兴趣的靶基因转录的前mRNA上的靶核苷酸序列杂交的单链结合核苷酸序列所替换，所述突变选自由外显子上游的50个碱基对和下游的20个碱基对之间构成的序列中的突变，所述靶序列位于由外显子/内含子连接位点的下游的2至50个碱基对构成的靶基因的前mRNA的区域中，所述靶序列的剪接受到所述突变的影响。
2.根据权利要求1所述的修饰的人类U1snRNA分子，其中被所述结合核苷酸序列所替换的所述5’区域的所述部分的长度为9至20个核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的修饰的人类U1snRNA分子，其中所述治疗感兴趣的靶基因为凝血因子IX基因、SMN2基因或CFTR基因。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的修饰的人类U1snRNA分子，其中所述结合核苷酸序列选自由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10组成的组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的修饰的人类U1snRNA分子，用于由外显子遗漏导致的或与外显子遗漏相关联的遗传疾病的治疗性处理。
6.根据权利要求5所述的修饰的人类U1snRNA分子，其中所述疾病是囊性纤维化、乙型血友病或脊髓型肌萎缩。
7.一种分离的基因，所述基因编码根据权利要求1至4中任一项所述的修饰的人类U1snRNA分子。
8.根据权利要求7所述的分离的基因，包括启动子序列和聚腺苷酸化信号序列。
9.根据权利要求8所述的分离的基因，其中所述启动子是编码人类U1snRNA的基因的内源性启动子。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的分离的基因，用于由外显子遗漏导致的遗传疾病的治疗性处理。
11.根据权利要求10所述的分离的基因，其中所述疾病是囊性纤维化、乙型血友病或脊髓型肌萎缩。
12.一种表达载体，所述表达载体包括根据权利要求7至9中任一项所述的分离的基因。
13.根据权利要求12所述的表达载体，其为腺相关病毒载体。
14.根据权利要求13或14所述的表达载体，用于由外显子遗漏导致的或与外显子遗漏相关联的遗传疾病的治疗性处理。
15.根据权利要求14所述的表达载体，其中所述疾病是囊性纤维化、乙型血友病或脊髓型肌萎缩。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1至4中任一项所述的修饰的人类U1snRNA分子，或包括根据权利要求7至9中任一项所述的分离的基因，或包括根据权利要求12或13所述的表达载体，和药学上可接受的运载体。
17.一种在培养的细胞中恢复治疗感兴趣的靶基因的正确剪接的体外方法，所述治疗感兴趣的靶基因含引起外显子遗漏的突变，所述体外方法包括利用根据权利要求12或13所述的表达载体转染所述培养的细胞。
CN201180049740.9A 2010-10-15 2011-10-14 修饰的人类U1snRNA分子、编码修饰的人类U1snRNA分子的基因、包括该基因的表达载体及其在基因治疗中的用途 Expired - Fee Related CN103314106B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITTO2010A000840A IT1405793B1 (it) 2010-10-15 2010-10-15 Molecola di u1snrna umano modificato, gene codificante per la molecola di u1snrna umano modificato, vettore di espressione includente il gene, e loro uso in terapia genica
ITTO2010A000840 2010-10-15
PCT/IB2011/054573 WO2012049665A1 (en) 2010-10-15 2011-10-14 A modified human u1snrna molecule, a gene encoding for the modified human u1snrna molecule, an expression vector including the gene, and the use thereof in gene therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103314106A true CN103314106A (zh) 2013-09-18
CN103314106B CN103314106B (zh) 2017-09-12

Family

ID=43738379

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180049740.9A Expired - Fee Related CN103314106B (zh) 2010-10-15 2011-10-14 修饰的人类U1snRNA分子、编码修饰的人类U1snRNA分子的基因、包括该基因的表达载体及其在基因治疗中的用途

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9074207B2 (zh)
EP (1) EP2627339B1 (zh)
JP (1) JP5985487B2 (zh)
CN (1) CN103314106B (zh)
BR (1) BR112013008759A2 (zh)
ES (1) ES2545815T3 (zh)
IT (1) IT1405793B1 (zh)
RU (1) RU2013122109A (zh)
WO (1) WO2012049665A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113444722A (zh) * 2020-03-24 2021-09-28 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用
CN114174513A (zh) * 2019-07-23 2022-03-11 牛津生物医学（英国）有限公司 慢病毒载体的优化生产
CN114457072A (zh) * 2021-04-19 2022-05-10 苏州系统医学研究所 一种具有抗病毒活性的多核苷酸及其用途

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11142762B2 (en) * 2012-07-05 2021-10-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania U1 snRNP regulates gene expression and modulates oncogenicity
JP6472807B2 (ja) 2013-09-12 2019-02-20 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 嚢胞性線維症の処置のための方法及び医薬組成物
US9669109B1 (en) 2015-11-24 2017-06-06 Universita Di Ferrara Modified human U1snRNA molecule, a gene encoding for the modified human U1snRNA molecule, an expression vector including the gene, and the use thereof in gene therapy of familial dysautonomia and spinal muscular atrophy
CA3042689A1 (en) * 2016-11-04 2018-07-12 Baxalta Incorporated Adeno-associated virus formulations
CN109486813B (zh) * 2018-10-10 2022-01-18 广州医科大学附属第二医院 一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用
KR20240052034A (ko) * 2021-09-03 2024-04-22 태시트 테라퓨틱스, 인코포레이티드 스플라이세오솜 구성요소의 동원을 통한 rna 편집
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020058287A1 (en) * 2000-03-10 2002-05-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Novel small nuclear RNA vectors and uses therefor
US7838657B2 (en) * 2004-12-03 2010-11-23 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences
EP3470072A1 (en) * 2005-06-23 2019-04-17 Biogen MA Inc. Compositions and methods for modulation of smn2 splicing

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DHIR ASHISH AND BURATTI EMANUELE: "alternative splicing :role of pseudoexons in human disease and potential therapeutic strategies", 《FEBS JOURNAL》 *
LINDA GORMAN,ET AL: ""Restoration of Correct Splicing of Thalassemic β-Globin Pre-mRNA by Modified U1 snRNAs"", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
PAGANI F.ET AL: "A new type of mutation causes a splicing defect in ATM", 《GENETICS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114174513A (zh) * 2019-07-23 2022-03-11 牛津生物医学（英国）有限公司 慢病毒载体的优化生产
CN113444722A (zh) * 2020-03-24 2021-09-28 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用
CN114457072A (zh) * 2021-04-19 2022-05-10 苏州系统医学研究所 一种具有抗病毒活性的多核苷酸及其用途
CN114457072B (zh) * 2021-04-19 2023-08-15 苏州系统医学研究所 一种具有抗病毒活性的多核苷酸及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
ES2545815T3 (es) 2015-09-16
EP2627339B1 (en) 2015-05-27
US20130210902A1 (en) 2013-08-15
WO2012049665A1 (en) 2012-04-19
RU2013122109A (ru) 2014-11-20
BR112013008759A2 (pt) 2016-06-28
EP2627339A1 (en) 2013-08-21
CN103314106B (zh) 2017-09-12
JP5985487B2 (ja) 2016-09-06
JP2014501493A (ja) 2014-01-23
IT1405793B1 (it) 2014-01-24
US9074207B2 (en) 2015-07-07
ITTO20100840A1 (it) 2012-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103314106A (zh) 修饰的人类U1snRNA分子、编码修饰的人类U1snRNA分子的基因、包括该基因的表达载体及其在基因治疗中的用途
Liu et al. Improved prime editors enable pathogenic allele correction and cancer modelling in adult mice
Katrekar et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases
Jang et al. Application of prime editing to the correction of mutations and phenotypes in adult mice with liver and eye diseases
Meganck et al. Tissue-dependent expression and translation of circular RNAs with recombinant AAV vectors in vivo
Hordeaux et al. The GPI-linked protein LY6A drives AAV-PHP. B transport across the blood-brain barrier
Maule et al. Allele specific repair of splicing mutations in cystic fibrosis through AsCas12a genome editing
Ruan et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing as a therapeutic approach for Leber congenital amaurosis 10
Kemaladewi et al. Correction of a splicing defect in a mouse model of congenital muscular dystrophy type 1A using a homology-directed-repair-independent mechanism
Villiger et al. In vivo cytidine base editing of hepatocytes without detectable off-target mutations in RNA and DNA
EP3288594B1 (en) Dual aav vector system for crispr/cas9 mediated correction of human disease
Karakikes et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy
Rodríguez-Lebrón et al. Silencing mutant ATXN3 expression resolves molecular phenotypes in SCA3 transgenic mice
Farrar et al. Mitochondrial disorders: aetiologies, models systems, and candidate therapies
BR112021006844A2 (pt) métodos para editar um rna alvo e para tratar ou prevenir uma doença ou condição, rna editado ou uma célula hospedeira tendo um rna editado, rna que recruta desaminase, construção, biblioteca, composição, célula hospedeira, e, kit para editar um rna alvo .
Sinnamon et al. In vivo repair of a protein underlying a neurological disorder by programmable RNA editing
KR20200006054A (ko) 신규 타입 vi crispr 오르소로그 및 시스템
JP2022529650A (ja) 酵素発現を調節および自己不活性化するための組成物ならびに酵素のオフターゲット活性を調整するための方法
Shao et al. A novel mutation in exon 9 of Cullin 3 gene contributes to aberrant splicing in pseudohypoaldosteronism type II
Sinnamon et al. Targeted RNA editing in brainstem alleviates respiratory dysfunction in a mouse model of Rett syndrome
Jang et al. Prime editing enables precise genome editing in mouse liver and retina
Alves et al. Optimization of base editors for the functional correction of SMN2 as a treatment for spinal muscular atrophy
De Conti et al. Complexities of 5'splice site definition: implications in clinical analyses
Hillen et al. In vivo targeting of a variant causing vanishing white matter using CRISPR/Cas9
Bellingrath et al. Programmable RNA editing with endogenous ADAR enzymes–a feasible option for the treatment of inherited retinal disease?

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170912

Termination date: 20211014

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee