ITTO20100840A1 - Molecola di u1snrna umano modificato, gene codificante per la molecola di u1snrna umano modificato, vettore di espressione includente il gene, e loro uso in terapia genica - Google Patents

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Description

“Molecola di U1snRNA umano modificato, gene codificante per la molecola di U1snRNA umano modificato, vettore di espressione includente il gene, e loro uso in terapia genicaâ€
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda molecole di snRNA umano modificate atte ad essere impiegate in procedimenti di terapia genica. In particolare l’invenzione riguarda molecole di snRNA capaci di correggere processi di splicing aberranti causati da mutazioni geniche ed correlati con patologie umane con quadri clinici diversi, sovente di intensa gravità.
Numerose patologie genetiche umane (15% circa) sono determinate da mutazioni geniche che, interferendo sulla corretta maturazione intracellulare dell’RNA messaggero, compromettono l’accurato svolgimento della successiva biosintesi proteica ed inducono la sintesi di proteine non funzionali. Per la maggior parte, le mutazioni puntiformi all ́origine dei difetti di splicing riguardano sequenze geniche critiche per il riconoscimento del trascritto primario da parte del macchinario deputato al suo processamento. Tra le sequenze di maggiore rilevanza vi sono i siti donatore ed accettore posizionati al confine tra esoni ed introni nonché elementi regolatori gene-specifici con localizzazione esonica o intronica (1, 5). Come conseguenza di queste mutazioni, possono essere indotti eventi molecolari diversi, che più frequentemente riguardano l ́esclusione di un esone dal trascritto maturo, il cosiddetto salto dell’esone o exon skipping, o l’attivazione di un sito criptico di splicing.
Da tempo à ̈ noto che alterazioni molecolari del processamento dell’RNA messaggero che comportano ad esempio lo skipping di esoni, ossia il “salto†di esoni, rappresentano il meccanismo eziopatogenetico principale di varie patologie umane, fra cui l ́emofilia B, la fibrosi cistica e l ́atrofia muscolare spinale, che sono accomunate dalla gravità dei loro decorsi clinici.
Il difetto del fattore IX (FIX) della coagulazione à ̈ alla base dell’insorgenza dell’emofilia B, malattia associata a manifestazioni emorragiche di entità variabile, talvolta molto gravi ed invalidanti. Ad esempio, mutazioni in posizione -2 nel sito donatore dell’esone 5 del gene del fattore IX (F9) determinano l’esclusione dell’esone 5 dall’mRNA durante il processo di splicing e rappresentano la causa di forme severe di malattia.
Le limitazioni dell’attuale terapia dell’emofilia B, che à ̈ fondamentalmente basata sulla frequente infusione di FIX esogeno ricombinante o derivato da direttamente da plasma, sottolineano la necessità di sviluppare approcci alternativi caratterizzati da una maggiore efficacia ed effetto duraturo.
La fibrosi cistica (FC) à ̈ la malattia ereditaria congenita ad esito letale più frequente nella popolazione caucasica: ne à ̈ affetto un neonato ogni 2500-2700 nati vivi.
La patogenesi di questa malattia à ̈ secondaria ad un'anomalia della proteina chiamata CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) localizzata nella membrana apicale delle cellule degli epiteli e avente la funzione di regolare gli scambi idroelettrolitici.
Come conseguenza dell’alterazione di CFTR, il trasporto dei sali attraverso le membrane cellulari viene compromesso determinando principalmente una produzione di secrezioni che potrebbero essere definite "disidratate": un sudore molto ricco in sodio e cloro ed un muco denso e vischioso che tende ad ostruire i dotti compromettendo la funzione di vari organi ed apparati. Nel corso di diversi studi, sono state identificate numerose alterazioni della sequenza del gene CFTR associate alla fibrosi cistica e, tra queste, le mutazioni localizzate nel sito di splicing dell’esone 12 provocano l’esclusione di questa porzione genica codificante dal trascritto e sono frequentemente associate a quadri clinici di intensa gravità.
L’atrofia muscolare spinale (SMA, OMIM 253300, 253550, e 253400) à ̈ una malattia neuromuscolare autosomica recessiva caratterizzata dalla degenerazione dei motoneuroni alfa del midollo spinale con una prevalenza stimata di 1/10.000 nati. La SMA à ̈ associata a sindromi cliniche che variano da molto severe con grave ipotonia muscolare e debolezza fin dalla nascita, a forme più lievi in cui l’esordio si verifica più tardivamente durante l’infanzia o l’adolescenza. Sino ad oggi non à ̈ ancora stato individuato un trattamento per questa patologia che in genere conduce a morte ad un’età che dipende dalla severità del quadro clinico.
Nel 95 % dei casi la malattia à ̈ causata dall’assenza del gene SMN1. Nel genoma umano esiste un gene omologo ad SMN1 chiamato SMN2. L’espressione di SMN2 à ̈ tuttavia compromessa da una mutazione sinonima che determina una maturazione aberrante dell’RNA messaggero con conseguente salto dell’esone 7 ed inattivazione del gene stesso. Approcci in grado di incrementare il numero di trascritti SMN2 contenenti l’esone 7 consentirebbero pertanto di applicare una terapia di compensazione per la mancanza del gene SMN1 grazie all’espressione corretta di SMN2, con notevoli implicazioni per un potenziale trattamento efficace della SMA.
Nell’ambito del processo di splicing i piccoli RNA nucleari (snRNA) giocano un ruolo primario quali componenti fondamentali dello spliceosoma, il macchinario cellulare deputato a mediare l’intero processo di maturazione dell’mRNA. In particolare, il piccolo RNA U1 (U1snRNA), lungo 164 ribonucleotidi, à ̈ codificato da geni presenti in più copie nel genoma umano e rappresenta la componente ribonucleica della particella nucleare U1snRNP. Le molecole di U1snRNA hanno una struttura tridimensionale ad ansa e forcina (stem e loop) ed includono nella regione 5’ una sequenza a singolo filamento, lunga in genere 9 nucleotidi, atta a legare per complementarietà il sito donatore dello splicing sulla molecola di pre-mRNA (Horowitz et al., 1994). La figura 1 mostra una rappresentazione schematica della struttura dell’U1snRNA wild-type. La sequenza nella regione 5’ atta al riconoscimento del sito donatore dello splicing à ̈ mostrata appaiata alla sequenza consensus del sito donatore dello splicing nei trascritti primari dei geni eucariotici. Tale sequenza presenta gradi diversi di conservazione ed à ̈ situata in corrispondenza della giunzione esone/introne. Il riconoscimento mediato dalla regione 5’ del U1snRNA à ̈ cruciale per la definizione delle giunzioni esone-introne sul trascritto primario e per l’assemblaggio corretto del complesso dello spliceosoma.
Il crescente numero di patologie genetiche umane associate a difetti di splicing del pre-mRNA e la frequente gravità del loro decorso clinico hanno stimolato negli ultimi anni la ricerca di molecole terapeutiche mirate alla correzione dei difetti di splicing a livello molecolare.
In Pinotti M et al. 2008 e Pinotti M et al., 2009 (9, 10) à ̈ descritto l’impiego di molecole di U1snRNA modificate capaci di ripristinare in vitro lo splicing corretto dell’mRNA del fattore VII di coagulazione. Poiché il meccanismo illustrato si basa sul riconoscimento e il legame da parte dell’U1snRNA modificato con i siti di giunzione esone/introne mutati e pertanto con sequenze aventi un alto grado di conservazione genomica, esso presenta lo svantaggio di non avere un’assoluta specificità dell ́azione della molecola di snRNA terapeutica verso il gene bersaglio, con il rischio di interferire con la maturazione di trascritti originati da altri geni wild-type funzionali.
La presente invenzione ha dunque lo scopo di mettere a disposizione molecole di U1snRNA modificate capaci di ripristinare il corretto splicing di pre-mRNA trascritti da geni recanti mutazioni che determinano uno splicing aberrante, con un grado di efficacia pari a quello descritto nella tecnica anteriore, ma caratterizzate al tempo stesso da una maggiore selettività di azione sul trascritto del gene bersaglio di interesse terapeutico.
Questi e altri scopi sono raggiunti con una molecola di U1snRNA umano modificato, caratterizzata dal fatto che una porzione della sequenza nucleotidica a singolo filamento della regione 5’ del U1snRNA umano wild-type à ̈ sostituita con una sequenza nucleotidica legante a singolo filamento atta a ibridarsi con una sequenza nucleotidica bersaglio del trascritto primario di un gene bersaglio di interesse terapeutico che porta una mutazione causa di splicing aberrante. La sequenza nucleotidica bersaglio della molecola di U1snRNA à ̈ situata in una regione del pre-mRNA compresa fra le 50 paia di basi a monte e le 100 paia di basi a valle di un sito di giunzione esone/introne il cui splicing à ̈ influenzato dalla suddetta mutazione, con la condizione che la sequenza nucleotidica bersaglio non comprenda il suddetto sito di giunzione esone/introne. Preferibilmente, la sequenza nucleotidica bersaglio ha una lunghezza di 5 a 50 nucleotidi, più preferibilmente 9 a 30 nucleotidi.
Rispetto alla tecnica anteriore, le molecole di U1snRNA oggetto dell’invenzione hanno il vantaggio di svolgere un’azione mirata e selettiva, poiché legano sequenze nucleotidiche bersaglio sul trascritto primario localizzate nelle regioni introniche o esoniche fiancheggianti il sito donatore di splicing, che presentano un grado di conservazione inferiore rispetto alle sequenze dei siti di giunzione esone/introne. E’ tuttavia sorprendente il fatto che, pur operando su sequenze bersaglio che non includono il sito di giunzione esone/introne, le molecole di U1snRNA dell’invenzione siano comunque in grado di influire sul meccanismo di splicing.
Ulteriori caratteristiche dell’invenzione sono definite nelle annesse rivendicazioni, che formano parte integrante dell’insegnamento tecnico della presente descrizione.
In una forma di realizzazione preferita, la porzione della regione 5’ a singolo filamento del U1snRNA wild-type che à ̈ sostituita con la sequenza nucleotidica legante ha una lunghezza di 9 a 12 nucleotidi.
Tra le mutazioni geniche che inducono il processo di splicing aberrante e che sono efficacemente trattate con l’U1snRNA modificato della presente invenzione, si citano a titolo esemplificativo mutazioni atte a causare il salto dell’esone e mutazioni atte a creare un sito donatore criptico. Preferibilmente, le mutazioni sono localizzate in un introne, in un esone o in un sito donatore per lo splicing.
Tra i geni di interesse terapeutico, ossia recanti mutazioni correlate a patologie che si prestano ad essere trattate con l’U1snRNA modificato della presente invenzione, si citano a titolo esemplificativo il gene del fattore IX della coagulazione, il gene SMN2 e il gene CFTR.
In una forma di realizzazione preferita, la molecola di U1snRNA umano modificato dell’invenzione include una sequenza nucleotidica legante scelta dal gruppo che consiste delle sequenze SEQ ID No.: 1 a 11.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione à ̈ un gene isolato codificante per la molecola di U1snRNA umano modificato dell’invenzione.
In una forma di realizzazione preferita, il gene comprende una sequenza promotore e una sequenza segnale di poliadenilazione. Gli inventori hanno verificato che il promotore endogeno del gene codificante per U1snRNA umano à ̈ particolarmente adatto, anche se possono essere impiegati anche altri promotori di per sé noti, che possono essere facilmente selezionati dal tecnico medio del settore.
A titolo esemplificativo, qui di seguito à ̈ riportata la sequenza del filamento senso del gene codificante l’U1snRNA umano wild-type (designata SEQ ID NO: 12 nel sequence listing), nella quale à ̈ evidenziata in grassetto la porzione della regione 5’ a singolo filamento che, nella molecola di U1snRNA modificato, à ̈ sostituita con la sequenza legante. Le sequenze dei siti unici di restrizione BglII e BclI, utilizzati per inserire le sequenze leganti, sono sottolineate. La sequenza genica SEQ ID NO:12 comprende, oltre alla regione codificante per l’RNA, che à ̈ indicata in lettere maiuscole, anche alcuni elementi regolatori necessari per la sua espressione, quali il promotore e il segnale di poliadenilazione.
5’-taaggaccagcttctttgggagagaacagacgcaggggcgggagggaaaaa gggagaggcagacgtcacttccccttggcggctctggcagcagattggtcg gttgagtggcagaaaggcagacggggactgggcaaggcactgtcggtgaca tcacggacagggcgacttctatgtagatgaggcagcgcagaggctgacgtc ttcgccacttgctgcttcaccacgaaggagttcccgtgccctgggagcggg ttcaggaccgctgatcggaagtgagaatcccagctgtgtgtcagggctgga aagggctcgggagtgcgcggggcaagtgaccgtgtgtgtaaagagtgaggc gtatgaggctgtgtcggggcagaggcccaagatctgATACTTACCTGGCAG GGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCAT TGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCG ACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTGactt tctggagtttcaaaagtagactgtacgctaa-3’ (SEQ ID NO:12) Naturalmente, la sequenza genica di cui sopra à ̈ fornita esclusivamente a titolo esemplificativo. In alternativa, per costruire il gene codificante per gli U1snRNA modificati dell’invenzione, può essere impiegata qualsiasi sequenza genica omologa a SEQ ID NO:12, ossia avente la capacità di codificare per un U1snRNA capace di mediare il riconoscimento del sito donatore dello splicing in maniera efficace.
La metodica di preparazione delle diverse molecole di U1snRNA modificate oggetto dell’invenzione, contenenti le diverse sequenze leganti, à ̈ descritta in dettaglio nella sezione relativa agli esempi.
Ancora un altro oggetto dell’invenzione à ̈ un vettore di espressione che comprende un gene isolato come definito in precedenza. Il vettore di espressione preferito à ̈ un vettore adenovirale, anche se possono essere utilizzati anche altri tipi di vettori di espressione che sono di per sé noti al tecnico medio del settore.
Come descritto in precedenza, la molecola di U1snRNA umano modificato, il gene codificante per tale molecola di RNA e il vettore includente il suddetto gene sono idonei all’impiego per il trattamento terapeutico di una patologia genetica causata o associata a splicing aberrante. Preferibilmente, ma non a titolo limitativo, la patologia à ̈ la fibrosi cistica, l’emofilia B o l’atrofia muscolo spinale.
A tale scopo, la molecola di U1snRNA modificato, il gene e/o il vettore sono formulati in una composizione farmaceutica comprendente, oltre alle molecole terapeuticamente attive, un veicolo farmaceuticamente accettabile. La scelta del veicolo e degli eventuali eccipienti farmaceutici rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.
Un altro aspetto dell’invenzione à ̈ un procedimento in vitro per ripristinare in una cellula in coltura il corretto splicing di un gene bersaglio di interesse terapeutico recante una mutazione inducente splicing aberrante mediante la transfezione della cellula in coltura con un vettore di espressione come definito in precedenza.
Le molecole di U1snRNA modificate oggetto dell’invenzione sono state prodotte impiegando metodiche di biologia molecolare tradizionali, ben note al tecnico medio del settore. Per la valutazione degli effetti degli U1snRNA oggetto dell’invenzione sulla correzione dei processi aberranti di splicing, gli inventori hanno impiegato la metodologia dei minigeni, la cui applicazione à ̈ ampiamente documentata nella letteratura scientifica. Tale metodica prevede il clonaggio di una porzione di un gene, recante la mutazione causa di difetti di splicing, in un vettore di espressione e la successiva transfezione del vettore ricombinante in cellule in coltura in vitro. L’analisi dei trascritti originati dalla porzione del gene di interesse viene effettuata mediante RT-PCR, consentendo pertanto l’identificazione di molecole di mRNA di lunghezza anomala derivate dai processi di splicing aberrante. La comparsa di trascritti di interesse di lunghezza normale in seguito alla cotrasfezione degli U1snRNA modificati con i minigeni, ed il loro sequenziamento, rappresenta la chiara indicazione della capacità da parte delle molecole di U1snRNA di ripristinare processi di splicing corretti.
Gli esempi che seguono sono forniti a scopo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione come definita nelle annesse rivendicazioni.
ESEMPIO 1: Creazione degli U1 snRNA modificati Gli U1 snRNA modificati sono stati realizzati con la seguente procedura: il plasmide contenente la sequenza del gene dell’U1-snRNA wild-type, ossia l’U1-snRNA non modificato, à ̈ stato digerito con gli di enzimi di restrizione BglII e BclI. La sequenza compresa tra questi due siti di restrizione à ̈ stata sostituita con un oligonucleotide a doppio filamento comprendente la sequenza legante. Le sequenze diretta e inversa di ciascun oligonucleotide oligonucleotidi sono descritte nella tabella 1 sottostante ed i risultanti U1-snRNA modificati prendono il nome dagli oligonucleotidi utilizzati.
La figura 2 mostra inoltre una rappresentazione schematica degli elementi del gene per lo U1 snRNA. E’ indicata la strategia di clonaggio con la quale sono stati preparati i diversi U1 snRNA modificati. La figura 2 mostra il gene dello U1snRNA con gli elementi promotori DSE E PSE, la regione codificante per lo U1 snRNA (centrale) e il box di processamento al 3’, inseriti in un vettore plasmidico (pGEM). Il sito di inizio di trascrizione à ̈ indicato da una freccia. La sequenza tra i siti di restrizione BgIII e BcII include la regione codificante per la coda a singolo filamento dello U1snRNA che à ̈ stata sostituita da oligonucleotidi specifici per la creazione degli U1 snRNA modificati indicati
in Tabella 1.
Tabella 1
SEQ
Oligonucleotidi per U1 ID FIX esone 5 NO:
FIX U1 ex5 C3T5A6 dir GATCTCattatgacctgGCAGGGGAGATACCAT<13>FIX U1 ex5 C3T5A6 rev GATCATGGTATCTCCCCTGCcaggtcataatGA<14>U1FIXex5 SH-7 dir gatctcataTGACCTGCTGGgcaggggagataccat<15>U1FIXex5 SH-7 rev gatcatggtatctcccctgcCCAGCAGGTCAtatga<16>U1FIXex5 SH1 dir gatctcataGATTATGACgcaggggagataccat<17>U1FIXex5 SH1 rev gatcatggtatctcccctgcGTCATAATCtatga<18>U1FIXex5 SH7 dir GATCTCatcttattcagatGCAGGGGAGATACCAT<19>U1FIXex5 SH7 rev GATCATGGTATCTCCCCTGCatctgaataagatGA<20>U1FIXex5 SH9 dir GATCTCattcttattcagGCAGGGGAGATACCAT<21>U1FIXex5 SH9 rev GATCATGGTATCTCCCCTGCctgaataagaatGA<22>U1FIXex5 SH10 dir GATCTCatatcttattcaGCAGGGGAGATACCAT<23>U1FIXex5 SH10 rev GATCATGGTATCTCCCCTGCtgaataagatatGA<24>U1FIXex5 SH13 dir gatctcataAAATCTTATgcaggggagataccat<25>U1FIXex5 SH13 rev gatcatggtatctcccctgcATAAGATTTtatga<26>U1FIXex5 SH16 dir gatctcataTAAAAAATCTgcaggggagataccat<27>U1FIXex5 SH16 rev gatcatggtatctcccctgcAGATTTTTTAtatga<28>U1FIXex5 SH22 dir gatctcataTTTCTTTAAAgcaggggagataccat<29>U1FIXex5 SH22 rev gatcatggtatctcccctgcTTTAAAGAAAtatga<30>U1FIXex5 SH33 dir GATCTCattcagatacagaGCAGGGGAGATACCAT<31>U1FIXex5 SH33 rev GATCATGGTATCTCCCCTGCtctgtatctgaatGA<32>U1FIXex5 SH38 dir GATCTCatagtttcagatGCAGGGGAGATACCAT<33>U1FIXex5 SH38 rev GATCATGGTATCTCCCCTGCatctgaaactatGA<34>U1FIXex5 SH63 dir GATCTCatttatgtaggtGCAGGGGAGATACCAT<35>U1FIXex5 SH63 rev GATCATGGTATCTCCCCTGCacctacataaatGA<36>
Oligonucleotidi per U1
SMN
U1ex7SMN -1G-2G-3A rev GAT CAT GGT ATC TCC CCT GCG GAG TAA GTT ATG A<37>U1ex7SMN -1G-2G-3A dir GAT CTC ATA ACT TAC TCC GCA GGG GAG ATA CCA T<38>U1ex7SMN sh2 rev GAT CAT GGT ATC TCC CCT GCT AAG TCT GCT ATG A<39>U1ex7SMN sh2 dir GAT CTC ATA GCA GAC TTA GCA GGG GAG ATA CCA T<40>U1ex7SMN sh17 rev GAT CAT GGT ATC TCC CCT GCT ATG AAA GTT ATG A<41>U1ex7SMN sh17 dir GAT CTC ATA ACT TTC ATA GCA GGG GAG ATA CCA T<42>
Oligonucleotidi per U1
CFTR esone 12
U1 -1A 4T dir gatctcATACaTACtTGgcaggggagataccat<43>U1 -1A 4T rev gatcatggtatctcccctgcCAaGTAtGTATga<44>U1 G3 T4 dir gatctcATACacACCTGgcaggggagataccat<45>U1 G3 T4 REV gatcatggtatctcccctgcCAGGTgtGTATga<46>U1 T4 A5 dir gatctcATAtaTACCTGgcaggggagataccat<47>U1 T4 A5 REV gatcatggtatctcccctgcCAGGTAtaTATga<48>U1 CF sh+1 dir gatctcTCAAAGAACATACgcaggggagataccat<49>U1 CF sh+1 REV gatcatggtatctcccctgcGTATGTTCTTTGAga<50>CF12 SH+9 Dir gatctcATAGGTATTCAAAgcaggggagataccat<51>CF12 SH+9 Rev gatcatggtatctcccctgcTTTGAATACCTATga<52>CF12 SH+11 Dir gatctcATAAGTAAGGTATTCAgcaggggagataccat<53>CF12 SH+11 Rev gatcatggtatctcccctgcTGAATACCTTACTTATga<54>CF12 SH+33 DIR gatcatggtatctcccctgCTCATGCTAAAATAga<55>CF12 SH+33 REV gatctcTATTTTAGCATGAGcaggggagataccat<56>
ESEMPIO 2: Trasfezione dei minigeni in cellule in coltura ed analisi dei prodotti di splicing
I vettori contenenti sono stati inseriti nelle cellule mediante transfezione transiente con Lipofectamina (liposomi). In seguito all’estrazione dell’RNA cellulare totale con Trizol, l’RNA à ̈ stato analizzato mediante RT-PCR con inneschi specifici.
La reazione si svolge in due fasi: la retrotrascrizione dell’RNA in un filamento di cDNA a opera di una trascrittasi inversa usando come stampi random primers e l’amplificazione del cDNA ottenuto mediante una DNA polimerasi.
La reazione di PCR Ã ̈ stata effettuata in un volume finale di 25 µl di una miscela contenente:
- 5 µl di AMV/Tfl 5x buffer idoneo al corretto funzionamento di entrambi gli enzimi sopra citati;
- 1 µl di dNTPs mix 10 mM;
- 50 pmol di primer forward e 50 pmol di primer reverse;
- 2 µl MgSO425mM;
- 2 µl di RNA estratto dalle cellule;
- 1 µl di AMV-RT (0,1µ/µl), 1 µl di Tfl DNA polimerasi;
- H2O ultra pura a volume.
La fase di retrotrascrizione à ̈ stata effettuata a 45°C per 45’. E’ poi seguita una fase in cui la miscela di PCR à ̈ stata portata alla temperatura di 94°C per 2’, a cui a cui hanno fatto seguito 40 cicli di PCR ed infine una fase di estensione per 7†a 68 °C.
I prodotti dell’amplificazione sono stati sottoposti a separazione elettroforetica in gel di agaroso e/o a corsa in elettroforesi capillare.
Esempio 3: Mutazioni esoniche vicino al sito donatore dell’esone 5 del Fattore IX della coagulazione associate ad emofilia B
Nel gene del fattore IX (F9) le mutazioni esoniche in posizione -2 nel sito donatore dell’esone 5 sono associate all’emofilia B. E’ interessante notare che le mutazioni in posizione -2 nell’esone sono sinonime e non modificano la sequenza codificante ma inducono il salto dell’esone e pertanto sono classificabili come mutazioni di splicing.
La tabella 2 mostra le mutazioni esoniche in posizione -2 dell’esone 5 del gene del FIX identificate in pazienti affetti da emofilia B (Emofilia B International database). I nucleotidi appartenenti all’esone 5 sono mostrati in maiuscole, mentre quelli appartenenti all’introne sono in minuscolo. Ogni posizione, mostrata nella parte bassa della figura, à ̈ interessata da una o più mutazioni, il cui cambio nucleotidico à ̈ mostrato in grassetto. Tabella 2
Posizione Sostituzione nucleo- Sequenza del sito donatore tidica Posizioni : -3 -2 -1 \ 1+2+3+4+5+6<-2>A>C CCG\ gtcata
<-2>A>G CGG\ gtcata
<-2>A>T CTG\ gtcata
Per lo studio dello splicing del FIX normale e mutato à ̈ stato costruito un vettore per espressione di un costrutto minigenico chiamato pTB NdeI FIX. Per far questo, una porzione di DNA genomica di 308 bp a monte dell’esone 5 e 283bp a valle della regione interessata dalle mutazioni à ̈ stata inserita in un vettore ampiamente utilizzato per lo studio dello splicing in vitro, il plasmide pTBNdeI (6-8).
Nella figura 3 à ̈ rappresentata schematicamente la parte centrale del costrutto pTB FIX ex5 usato nello studio dello splicing. I rettangoli azzurro ed arancione rappresentano le regioni centrali del costrutto di α-globina e dell’esone 5 del FIX, con gli introni rappresentati come linee. L’esone 5 e le regioni introniche fiancheggianti (IVS4 and IVS5) sono state clonate nel plasmide pTB. La trascrizione à ̈ sotto il controllo del promotore dell’α-globina e dell’enhancer di SV40 enhancer. Le due possibili isoforme di splicing sono indicate.
In seguito all’introduzione delle mutazioni gli inventori ne hanno successivamente dimostrato l’effetto causativo mediante l’espressione dei minigeni creati in cellule eucariotiche HepG2, il modello cellulare ideale per studiare proteine di origine epatica, come il FIX. In particolare i vettori sono stati inseriti nelle cellule mediante transfezione transiente ed l’RNA analizzato come indicato nell’allegato metodi utilizzando come inneschi gli oligonucleotidi alfa2-3 e BRA2. Nello specifico, tutte le mutazioni in posizione -2 inducono la completa esclusione dell’esone. Nella figura 4 à ̈ rappresentata l’analisi del mutante -2C. Simili risultati sono stati ottenuti con gli altri due mutanti in posizione -2.
In Tabella 3 à ̈ riportata la lista delle U1-snRNA modificate create, la loro sequenza bersaglio e la loro localizzazione intorno al sito donatore. Sulla mutazione in posizione -2C sono state testate le diverse U1-snRNA modificate ed il loro effetto sulla percentuale di inclusione dell’esone 5 à ̈ mostrato nella figura 4.
Tabella 3: Sequenze leganti degli U1-snRNA modificati per la correzione dei difetti di splicing dell’esone 5 del gene del fattore IX
FIX Sequenza le- Sequenza bersa- Lunghezza SEQ ID U1-snRNAs gante (5’->3’) glio (5’3’) (bp) NO: C3T5A6 uaugaccug caggtcata 9 57 FIX_SH-7 ugaccugcugg ccagcaggtca 11 58 FIX_SH1 agauuaugac gtcataatct 9 1 FIX_SH7 ucuuauucaga tctgaataaga 13 2 FIX_SH9 ucuuauuca tgaataaga 9 3 FIX_SH10 aucuuauuc gaataagat 9 4 FIX_SH13 aaaaucuua taagatttt 9 5 FIX_SH16 uaaaaaauc gatttttta 9 6 FIX_SH22 uuucuuuaa ttaaagaaa 9 7
Nella figura 5 à ̈ mostrata la localizzazione degli U1 snRNA modificati utilizzati per la correzione dei difetti di splicing dell’esone 5 del gene del fattore di coagulazione IX. Il rettangolo indica l’esone 5, la sequenza rimanente indica l’introne.
La figura 4 mostra chiaramente che numerosi U1snRNA modificati sono in grado di aumentare in modo significativo la percentuale di inclusione dell’esone 5, compensando così gli effetti della mutazione in posizione -2C. Ciò indica che il legame di U1-snRNA al sito donatore (U1-C3T5A6, corsa 3) o vicino ad esso (U1-SHIFT) favorisce la definizione dell’esone 5. L’efficienza dipende dalla posizione e le U1-SH1, SH9, SH10, mostrano una attività maggiore. L’efficienza diminuisce all’aumentare della distanza dal sito di splicing canonico. E’ importante notare che la complementarietà degli U1 snRNA su sequenze introniche non conservate fiancheggianti il sito di splicing à ̈ importante per aumentarne la specificità. Occorre inoltre sottolineare che anche piccoli aumenti di FIX (>2% del normale) risulterebbero in un significativo miglioramento della tendenza emorragica nei pazienti. Per questa ragione anche le molecole U1-snRNA modificate meno efficienti possono avere significato terapeutico nell’emofilia B, così come in altri difetti della coagulazione. Effetti analoghi con gli le molecole U1snRNA modificate sono stati ottenuti con le altre due mutazioni in posizione -2, la -2A>G e al -2A>T.
Esempio 4: Mutazione intronica vicino al sito donatore dell’esone 5 del Fattore IX della coagulazione associate ad emofilia B
Nel gene del fattore IX (F9) la mutazioni intronica in posizione 13 al 5’ del sito donatore dell’esone 5 à ̈ associata alla malattia. Questa mutazione testata nel minigene pTB induce la attivazione di un sito criptico 13 paia di basi dopo il sito canonico. L’approccio di correzione mediato dalle U1-snRNA modificate à ̈ stato anche applicato alla mutazione 13A>G che causa l’attivazione di un sito criptico in posizione 13 (figura 6). Come si può osservare in figura 6, la coespressione della variante 13A>G con uno dei più attivi U1snRNA modificati SH9 analizzato nell’esempio 3, à ̈ in grado di ripristinare parzialmente l’utilizzo del sito corretto e quindi il normale processamento del messaggero.
La Tabella 4 sottostante mostra la localizzazione della mutazione 13 A>G nell’introne 5 del F9 identificata in pazienti con emofilia B (database internazionale Emofilia B). I nucleotidi appartenenti all’esone 5 sono mostrati in maiuscole,mentre quelli appartenenti all’introne sono in minuscolo. Il nucleotide mutato à ̈ indicato in grassetto.
Tabella 4
Posizione Sostituzione Sequenza SEQ ID nucleotidica NO:
13 A>G CAG\ gtcataatctgagtaaga 59
La figura 6 mostra i risultati dell’analisi mediante elettroforesi capillare delle isoforme di splicing derivanti dalla trasfezione del minigene FIX ex5 con la mutazione 13A>G da solo o associato allo U1 modificato U1Sh9. La trasfezione del costrutto 13G mostra la comparsa di un banda che corrisponde alla attivazione di un sito 5’ss criptico. La costrafezione con U1 Sh9 induce un aumento significativo nella percentuale di inclusione dell’esone normale. A destra i grafici rappresentano le percentuali delle diverse isoforme calcolate dai rispettivi tracciati elettroforetici indicati a sinistra. I pozzetti 1, 2 e 3 corrispondono alle percentuali di inclusione delle bande con salto dell’esone, inclusione dell’esone e sito 5’ss criptico, rispettivamente.
Esempio 5: Atrofia Muscolare Spinale
Per lo studio sono stati utilizzati i vettori esprimenti i minigeni di SMN1 (pCI-SMN1) e SMN2 (pCI-SMN2) (2). Tali minigeni sono ampiamente utilizzati per validare l’effetto di molecole terapeutiche in grado di correggere il difetto di splicing nel gene SMN2 (2, 3).
I due minigeni sono costituiti da 111 nucleotidi dell’esone 6, 200 nucleotidi dell’introne 6, i 54 nucleotidi dell’esone 7, i 444 nucleotidi dell’introne 7 e i primi 75 nucleotidi dell’esone 8 sotto il controllo del promotore CMV. I due minigeni differiscono per la presenza di una sostituzione nucleotidica nell’esone 7 in posizione 6. Nel pCI-SMN1 à ̈ presente una C mentre nel pCI-SMN2 à ̈ presente una T. Questa sostituzione sinonima induce nel pCI-SMN2 un difetto di splicing con salto dell’esone 7 dal trascritto maturo. Nella figura 7 viene rappresentato schematicamente il minigene pCI-SMN2. La variante sinonima all’interno dell’ esone in posizione 6T che induce salto dell’esone à ̈ indicata.
Numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato che la correzione dello splicing del gene SMN2 rappresenta una valida strategia terapeutica nella SMA (2-4). La Tabella 5 riporta la lista delle U1-snRNA modificate create, la loro sequenza bersaglio e la loro localizzazione intorno al sito donatore. Le diverse U1-snRNA modificate ed il loro effetto sulla percentuale di inclusione dell’esone 7 sono state testate nel minigene SMN2 e come controllo sul minigene SMN1.
Tabella 5: Sequenze di riconoscimento (U1-SR) nel gene per le U1-snRNA modificate per la correzione del difetto di splicing dell’esone 7 del gene SMN2 SMN Sequenza le- Sequenza Lunghezza SEQ U1-snRNAs gante (5’3’) bersaglio (bp) ID (5’3’) NO:
-1G-2G-3A acuuacucc ggagtaagt 9 60 SMN_SH2 gcagacuua taagtctgc 9 8 SMN_SH17 acuuucaua tatgaaagt 9 9
La figura 8 mostra la localizzazione degli SMN U1 snRNA modificati utilizzati per la correzione del difetto di splicing del gene SMN2.
I minigeni sono stati introdotti in cellule HeLa mediante transfezione transiente con Lipofectamina (liposomi). L’RNA à ̈ stato analizzato RT-PCR come indicato nell’esempio 2: L’RNA estratto dalla cellule à ̈ stato successivamente sottoposto ad RT-PCR con i primers pCIFwdB e E8–75 R al fine di valutare i prodotti di splicing.
Come si può osservare in figura 9, la trasfezione del plasmide pCI SMN2 in cellule in coltura mostra prevalentemente salto dell’esone 7. La cotrasfezione con il plasmide di controllo U1-Wt (pozzetto 2) non ha nessun effetto. La cotrasfezione del plasmidi di U1ex7SMN -1G-2G-3A (pozzetto 3), di U1ex7SMN sh2 (pozzetot 4) e di U1ex7SMN sh17 (pozzetto 5) induce un incremento significativo della percentuale di inclusione dell’esone 7. La cotrasfezione dei diversi SMN U1 snRNA modificati nel plasmide di controllo SMN1 non ha mostrato nessun effetto.
In particolare, la figura 9 mostra l’effetto degli SMN U1 modificati sullo splicing dell’SMN2. Nella parte superiore della figura à ̈ indicato il profilo di splicing dell’esone 7 del gene SMN2 (pozzetto 1) e l’effetto della coespressione degli U1 snRNA modificati (pozzetti 2-5). Le due isoforme di inclusione (+) ed esclusione (-) dell’esone 7 sono indicate. Nel panello inferiore l’istogramma riporta la percentuale di inclusione dell’esone 7 e quindi di splicing corretto. I dati sono la media di tre esperimenti indipendenti.
Esempio 6: Mutazioni nel sito donatore dell’esone 12 del CFTR associate a Fibrosi Cistica
La fibrosi cistica à ̈ dovuta a mutazioni nel gene CFTR. Le mutazioni localizzate nel sito di splicing dell’esone 12, associate a gravi forme di malattia che inducono salto dell†̃esone aberrante sono indicate nella tabella 6.
Tabella 6: Lista delle mutazioni nel sito donatore l’ esone 12 del gene CFTR. Le mutazione sono evidenziate in grassetto
Sequenza del sito do-Posizione<Sostituzione nucleoti->natore CF esone 12dicaPosizioni : -3 -2 -1 \ 1+2+3+4+5+6 -1 G>A AAA\ gtatgt 3 A>G AAG\ gtgtgt 5 T>A AAG\ gtatat
Nella figura 10 c’à ̈ una rappresentazione schematica della parte centrale del costrutto pTB CFex12 usato nello studio dello splicing. I rettangoli rappresentano le regioni centrali del costrutto di α-globina, e dell’esone 12 del CFTR, con gli introni rappresentati come linee. L’esone 12 e le regioni introniche fiancheggianti sono state clonate nel plasmide pTB. La trascrizione à ̈ sotto il controllo del promotore dell’α-globina e dell’enhancer di SV40 enhancer. Le due possibili isoforme di splicing sono indicate.
Nella Tabella 7 sono elencate le Sequenze di riconoscimento (U1-SR) nel gene per le U1-snRNA modificate per la correzione dei difetti di splicing dell’esone 12 del gene CFTR.
Tabella 7
CFTR Sequenza Legante Sequenza bersaglio Lunghezza SEQ U1- (5’3’) (5’3’) (bp) ID snRNAs NO:
-1A+4T ACaUACuUG CAaGTAtGT 9<61>+3G+4T ACacACCUG CAGGTgtGT 9<62>+4T+5A AuaUACCUG CAGGTAtaT 9<63>CF_SH1 UCAAAGAACAUAC GTATGTTCTTTGA 13<10>CF_SH11 AUAAGUAAGGTAUUCA TGAATACCTTACTTAT 16<11>
La figura 11 mostra la localizzazione degli U1 snRNA modificati utilizzati per la correzione dei difetti di splicing dell’esone 12 del gene CFTR.
L’RNA à ̈ stato analizzato RT-PCR come indicato nell’esempio 2: trasfezione dei minigeni in cellule in coltura ed analisi dei prodotti di splicing, utilizzando alfa2-3 e BRA2 come inneschi. La trasfezione del mutante 5A ha mostrato che gli U1 snRNA modificati sono in grado di ripristinare il corretto splicing dell’esone 12 (figura 12). Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando i minigene contenenti le mutazioni -1A e 3G) In particolare il CF U1snRNA 11 induce un aumento significativo della percentuale di inclusione dell’esone 12 in questi tre difetti di splicing.
La figura 12 mostra gli effetti degli U1-snRNA sullo splicing aberrante indotto dalla mutazione -1A nel minigene pCFex12. Nella parte superiore à ̈ indicato il profilo di splicing della variante na turale 5A (pozzetto 2) e l’effetto della a coespressione delle u1-snRNA modificate (pozzetti 2-6). Le due isoforme con inclusione (+) o esclusione (-) dell’esone 12 sono indicate. Nel pannello inferiore l’istogramma riporta la percentuale di inclusione dell’esone 12, e quindi di splicing corretto.
I dati sono la media di 3 esperimenti indipendenti.
Le cellule sono state transfettate con 0,5 µg di vettore esprimente ogni specifica variante. Il profilo di splicing à ̈ stato valutato mediante RT-PCR con i primer ALPHA2,3 e BRA2. I frammenti amplificati sono stati separati su gel di agaroso al 2%. L’identità dei trascritti includenti (+) o escludenti (-) l’esone 12 à ̈ indicate sulla destra del gel ed à ̈ stata validata mediante sequenziamento.
Esempio 7: Mutazioni esoniche nell’ esone 12 del CFTR associate a Fibrosi Cistica
Alcune mutazioni localizzate nell’esone 12 possono indurre un difetto di splicing (8) che comporta la esclusione di questo esone dal trascritto maturo. Le mutazioni che inducono esclusione dell’esone 12 sono indicate nella Tabella 8. I minigene utilizzati sono rappresenti nella figura 13. I rettangoli nella figura rappresentano le regioni centrali del costrutto di α-globina e dell’esone 12 del CFTR, con gli introni rappresentati come linee. La posizione delle due mutazioni esoniche à ̈ indicata. L’esone 12 e le regioni introniche fiancheggianti sono state clonate nel plasmide pTB. La trascrizione à ̈ sotto il controllo del promotore dell’α-globina e dell’enhancer di SV40 enhancer. Le due possibili isoforme di splicing sono indicate nella figura. Le sequenze bersaglio e la localizzazione dei CF U1 snRNA sono come indicati nell’esempio precedente.
Tabella 8
Sostituzione Sostituzione aminoaci- Posizione Nucleotidica dica nell’ esone G>A A566T 17
C>T Y577Y 52
L’RNA à ̈ stato analizzato RT-PCR come indicato nell’esempio 2: trasfezione dei minigeni in cellule in coltura ed analisi dei prodotti di splicing, utilizzando alfa2-3 e BRA2 come inneschi. In confronto alla trasfezione del plasmide normale pTBCFex12WT, la trasfezione del plasmide pTBCFex12A566T induce un calo significativo nella percentuale di inclusione dell’esone 12 (figura 14, pozzetti 1 e 2). La cotrasfezione di alcuni U1 modificati e specificatamente lo U1ex12CF 4T+5G e U1ex12CF sh11 (pozzetti 4 e 6 induce un aumento significativo della percentuale di inclusione dell’esone 12. Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando il minigene contenente la mutazione Y577Y. In particolare il CF U1 snRNA 11 induce un aumento significativo della percentuale di inclusione dell’esone 12 in questi due difetti esonici di splicing.
La figura 14 mostra in particolare gli effetti dei CF U1-snRNA sullo splicing aberrante indotto dalla mutazione A566T nel minigene pCFex12. Nella parte superiore della figura à ̈ indicato il profilo di splicing della variante naturale A566T (pozzetto 2) e l’effetto della a coespressione delle u1-snRNA modificate (pozzetti 2-8). Le due isoforme con inclusione (+) o esclusione (-) dell’esone 12 sono indicate. Nel pannello inferiore l’istogramma riporta la percentuale di inclusione dell’esone 12, e quindi di splicing corretto. I dati sono la media di tre esperimenti indipendenti.
Le cellule sono state transfettate con 0,5µg di vettore esprimente ogni specifica variante. Il profilo di splicing à ̈ stato valutato mediante RT-PCR con i primers ALPHA2,3 e BRA2. I frammenti amplificati sono stati separati su gel di agaroso al 2%.
L’identità dei trascritti includenti (+) o escludenti (-) l’esone 12 à ̈ indicate sulla destra del gel, ed à ̈ stata validata mediante sequenziamento. RIFERIMENTI
1. Cartegni, L., S. L. Chew, and A. R. Krainer.
2002. Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat Rev Genet 3:285-98.
2. Hua, Y., T. A. Vickers, B. F. Baker, C. F. Bennett, and A. R. Krainer. 2007. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol 5:e73.
3. Hua, Y., T. A. Vickers, H. L. Okunola, C. F. Bennett, and A. R. Krainer. 2008. Antisense masking of an hnRNP A1/A2 intronic splicing silencer corrects SMN2 splicing in transgenic mice. Am J Hum Genet 82:834-48.
4. Lorson, C. L., H. Rindt, and M. Shababi. Spinal muscular atrophy: mechanisms and therapeutic strategies. Hum Mol Genet 19:R111-8.
5. Pagani, F., and F. E. Baralle. 2004. Genomic variants in exons and introns: identifying the splicing spoilers. Nat Rev Genet 5:389-96.
6. Pagani, F., E. Buratti, C. Stuani, R. Bendix, T. Dork, and F. E. Baralle. 2002. A new type of mutation causes a splicing defect in ATM. Nat Genet 30:426-9.
7. Pagani, F., E. Buratti, C. Stuani, M. Romano, E. Zuccato, M. Niksic, L. Giglio, D. Faraguna, and F. E. Baralle. 2000. Splicing factors induce cystic fibrosis transmembrane regulator exon 9 skipping through a nonevolutionary conserved intronic element. J Biol Chem 275:21041-7.
8. Pagani, F., C. Stuani, M. Tzetis, E. Kanavakis, A. Efthymiadou, S. Doudounakis, T. Casals, and F. E. Baralle. 2003. New type of disease causing mutations: the example of the composite exonic regulatory elements of splicing in CFTR exon 12. Hum Mol Genet 12:1111-20.
9. Pinotti, M., L. Rizzotto, D. Balestra, M. A. Lewandowska, N. Cavallari, G. Marchetti, F. Bernardi and F. PaganiI. Maestri, F. Pagani, and F. Bernardi. 2008. U1-snRNA mediated rescue of mRNA processing in severe factor VII deficiency. Blood 111:2681-2684
10. Pinotti, M., D. Balestra, L. Rizzotto, I. Maestri, F. Pagani, and F. Bernardi. 2009. Rescue of coagulation factor VII function by the U1+5A snRNA. Blood 113:6461:6464

Claims (20)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Molecola di U1snRNA umano modificato, caratterizzata dal fatto che una porzione della sequenza nucleotidica a singolo filamento della regione 5’ del U1snRNA umano wild-type à ̈ sostituita con una sequenza nucleotidica legante a singolo filamento atta a ibridarsi con una sequenza nucleotidica bersaglio sul pre-mRNA trascritto da un gene bersaglio di interesse terapeutico recante una mutazione inducente splicing aberrante, la sequenza nucleotidica bersaglio essendo situata in una regione del pre-mRNA del gene bersaglio compresa fra le 50 paia di basi a monte e le 100 paia di basi a valle di un sito di giunzione esone/introne il cui splicing à ̈ influenzato dalla suddetta mutazione, con la condizione che la sequenza nucleotidica bersaglio non comprenda il suddetto sito di giunzione esone/introne.
  2. 2. Molecola di U1snRNA umano modificato secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza nucleotidica bersaglio ha una lunghezza di 5 a 50 nucleotidi, preferibilmente 9 a 30 nucleotidi.
  3. 3. Molecola di U1snRNA umano modificato secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la porzione della regione 5’ che à ̈ sostituita con la sequenza nucleoti dica legante ha una lunghezza di 9 a 12 nucleotidi.
  4. 4. Molecola di U1snRNA umano modificato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui la mutazione inducente splicing aberrante à ̈ una mutazione atta a causare skipping dell’esone o una mutazione atta a creare un sito donatore criptico.
  5. 5. Molecola di U1snRNA umano modificato secondo la rivendicazione 4, in cui la mutazione à ̈ nell’introne, nell’esone o nel sito donatore per lo splicing.
  6. 6. Molecola di U1snRNA umano modificato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui il gene bersaglio di interesse terapeutico à ̈ il gene del fattore IX della coagulazione, il gene SMN2 o il gene CFTR.
  7. 7. Molecola di U1snRNA umano modificato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in cui la sequenza nucleotidica legante à ̈ scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11.
  8. 8. Molecola di U1snRNA umano modificato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, per l’uso nel trattamento terapeutico di una patologia genetica causata o associata a splicing aberrante.
  9. 9. Molecola di U1snRNA umano modificato secondo la rivendicazione 8, in cui la patologia à ̈ fibrosi cistica, emofilia B o atrofia muscolo spinale.
  10. 10. Gene isolato codificante per una molecola di U1snRNA umano modificato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7.
  11. 11. Gene isolato secondo la rivendicazione 10, comprendente una sequenza promotore e una sequenza segnale di poliadenilazione.
  12. 12. Gene isolato secondo la rivendicazione 11, in cui il promotore à ̈ il promotore endogeno del gene codificante per U1snRNA umano.
  13. 13. Gene isolato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 12, per l’uso nel trattamento terapeutico di una patologia genetica causata da splicing aberrante.
  14. 14. Gene isolato secondo la rivendicazione 13, in cui la patologia à ̈ fibrosi cistica, emofilia B o atrofia muscolo spinale.
  15. 15. Vettore di espressione comprendente un gene isolato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 12.
  16. 16. Vettore di espressione secondo la rivendicazione 15, che à ̈ un vettore adenovirale.
  17. 17. Vettore di espressione secondo la rivendicazione 15 o 16, per l’uso nel trattamento terapeutico di una patologia genetica causata o associata a splicing aberrante.
  18. 18. Vettore di espressione secondo la rivendicazione 17, in cui la patologia à ̈ fibrosi cistica, emofilia B o atrofia muscolo spinale.
  19. 19. Composizione farmaceutica comprendente una molecola di U1snRNA umano modificato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 7, o un gene isolato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 12, o un vettore di espressione secondo la rivendicazione 15 o 16, e un veicolo farmaceuticamente accettabile.
  20. 20. Procedimento in vitro per ripristinare in una cellula in coltura il corretto splicing di un gene bersaglio di interesse terapeutico recante una mutazione inducente splicing aberrante, comprendente transfettare la cellula in coltura con un vettore di espressione secondo la rivendicazione 15 o 16.
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ES11799816.1T ES2545815T3 (es) 2010-10-15 2011-10-14 Molécula de ARNnpU1 humana modificada, gen que codifica para la molécula de ARNnpU1 humana modificada, vector de expresión que incluye el gen y el uso del mismo en terapia génica
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RU2013122109/10A RU2013122109A (ru) 2010-10-15 2011-10-14 МОДИФИЦИРОВАННАЯ МОЛЕКУЛА U1мяРНК ЧЕЛОВЕКА, ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ МОДИФИЦИРОВАННУЮ МОЛЕКУЛУ U1мяРНК ЧЕЛОВЕКА, ЭКСПРЕССИОННЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ГЕН, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ
JP2013533322A JP5985487B2 (ja) 2010-10-15 2011-10-14 改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子、改変ヒトＵ１ｓｎＲＮＡ分子をコードしている遺伝子、遺伝子を含む発現ベクターおよび遺伝子治療におけるその使用
EP11799816.1A EP2627339B1 (en) 2010-10-15 2011-10-14 A modified human u1snrna molecule, a gene encoding for the modified human u1snrna molecule, an expression vector including the gene, and the use thereof in gene therapy
CN201180049740.9A CN103314106B (zh) 2010-10-15 2011-10-14 修饰的人类U1snRNA分子、编码修饰的人类U1snRNA分子的基因、包括该基因的表达载体及其在基因治疗中的用途
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4148135A1 (en) * 2012-07-05 2023-03-15 The Trustees of the University of Pennsylvania U1 snrnp regulates gene expression and modulates oncogenicity
JP6472807B2 (ja) * 2013-09-12 2019-02-20 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 嚢胞性線維症の処置のための方法及び医薬組成物
US9669109B1 (en) 2015-11-24 2017-06-06 Universita Di Ferrara Modified human U1snRNA molecule, a gene encoding for the modified human U1snRNA molecule, an expression vector including the gene, and the use thereof in gene therapy of familial dysautonomia and spinal muscular atrophy
EP3534922B1 (en) * 2016-11-04 2024-04-17 Takeda Pharmaceutical Company Limited Adeno-associated virus formulations
CN109486813B (zh) * 2018-10-10 2022-01-18 广州医科大学附属第二医院 一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用
KR20220035338A (ko) * 2019-07-23 2022-03-22 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드 렌티바이러스 벡터의 생산 향상
CN113444722B (zh) * 2020-03-24 2024-09-24 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用
CN114457072B (zh) * 2021-04-19 2023-08-15 苏州系统医学研究所 一种具有抗病毒活性的多核苷酸及其用途
IL311101A (en) * 2021-09-03 2024-04-01 Tacit Therapeutics Inc RNA editing through recruitment of SPLICEOSOME components
US20230279397A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Locanabio, Inc. Compositions and methods comprising engineered short nuclear rna (snrna)
WO2023240236A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020058287A1 (en) * 2000-03-10 2002-05-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Novel small nuclear RNA vectors and uses therefor
WO2007002390A2 (en) * 2005-06-23 2007-01-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of smn2 splicing
US20100087511A1 (en) * 2004-12-03 2010-04-08 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (sma) treatment via targeting of smn2 splice site inhibitory sequences

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020058287A1 (en) * 2000-03-10 2002-05-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Novel small nuclear RNA vectors and uses therefor
US20100087511A1 (en) * 2004-12-03 2010-04-08 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (sma) treatment via targeting of smn2 splice site inhibitory sequences
WO2007002390A2 (en) * 2005-06-23 2007-01-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of smn2 splicing

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURATTI EMANUELE ET AL.: "SR protein-mediated inhibition of CFTR exon 9 inclusion: molecular characterization of the intronic splicing silencer", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 35, no. 13, 2007, pages 4359 - 4368, XP002637679, ISSN: 0305-1048 *
DE ANGELIS FERNANDA GABRIELLA ET AL.: "Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES (PNAS), vol. 99, no. 14, 9 July 2002 (2002-07-09), pages 9456 - 9461, XP002616473, ISSN: 0027-8424, [retrieved on 20020620], DOI: DOI:10.1073/PNAS.142302299 *
DENTI MICHELA ALESSANDRA ET AL.: "Chimeric adeno-associated virus/antisense U1 small nuclear RNA effectively rescues dystrophin synthesis and muscle function by local treatment of mdx mice", HUMAN GENE THERAPY, vol. 17, no. 5, May 2006 (2006-05-01), pages 565 - 574, XP002637682, ISSN: 1043-0342 *
DHIR ASHISH AND BURATTI EMANUELE: "Alternative splicing: role of pseudoexons in human disease and potential therapeutic strategies", FEBS JOURNAL, vol. 277, no. 4, February 2010 (2010-02-01), pages 841 - 855, XP002637680 *
GARCIA-BLANCO MARIANO A. ET AL.: "Alternative splicing in disease and therapy - Supplementary Information", May 2004 (2004-05-01), XP002637684, Retrieved from the Internet <URL:http://www.nature.com/nbt/journal/v22/n5/suppinfo/nbt964_S1.html> [retrieved on 20110518] *
GARCIA-BLANCO MARIANO A. ET AL.: "Alternative splicing in disease and therapy", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 22, no. 5, May 2004 (2004-05-01), pages 535 - 546, XP002637683, ISSN: 1087-0156 *
GORMAN LINDA ET AL.: "Restoration of correct splicing of thalassemic beta-globin pre-mRNA by modified U1 snRNAs", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, no. 46, November 2000 (2000-11-01), pages 35914 - 35919, XP002637678, ISSN: 0021-9258 *
INCITTI TANIA ET AL.: "Exon Skipping and Duchenne Muscular Dystrophy therapy: selection of the most active U1 snRNA-antisense able to induce Dystrophin exon 51 skipping", MOLECULAR THERAPY, vol. 18, no. 9, 1 September 2010 (2010-09-01), pages 1675 - 1682, XP008131506, ISSN: 1525-0016, [retrieved on 20100615], DOI: DOI:10.1038/MT.2010.123 *
KATO K. ET AL.: "Hyperstable U1snRNA complementary to the K-ras transcripts induces cell death in pancreatic cancer cells.", BRITISH JOURNAL OF CANCER, vol. 87, no. 8, 7 October 2002 (2002-10-07), pages 898 - 904, XP002637681, ISSN: 0007-0920 *
LUND E. ET AL.: "True genes for human U-1 small nuclear RNA. Copy number, polymorphism and methylation", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 259, no. 3, 1984, pages 2013 - 2021, XP002637920, ISSN: 0021-9258 *
NLEND NLEND RACHEL ET AL.: "Repair of pre-mRNA splicing. Prospects for a therapy for Spinal Muscular Atrophy", RNA BIOLOGY, vol. 7, no. 4, July 2010 (2010-07-01), pages 430 - 440, XP002637685 *
PAGANI FRANCO ET AL.: "A new type of mutation causes a splicing defect in ATM", NATURE GENETICS, vol. 30, no. 4, April 2002 (2002-04-01), pages 426 - 429, XP002637919, ISSN: 1061-4036 *
SINGH NATALIA N. ET AL.: "Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 35, no. 2, January 2007 (2007-01-01), pages 371 - 389, XP002637921, ISSN: 0305-1048 *

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