JP6472807B2 - 嚢胞性線維症の処置のための方法及び医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、嚢胞性線維症の処置のための方法及び組成物に関する。

発明の背景：
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、コーカサス人種において最も多い致死性の一遺伝子性の疾患であり、２５００〜４０００人に１人の発生率であり、世界的には７０，０００人が罹患しており、そのほとんどが２０代において死亡する。嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子遺伝子（ＣＦＴＲ）における突然変異と関連した常染色体性劣性遺伝病であり、その特性が、疾患の臨床的発現及び重症度を決定し、主に呼吸器系、消化器系、及び生殖系に影響を及ぼす。ＣＦＴＲ、塩素イオンチャンネルは、気道上皮細胞を被覆する表面液の変化に関与している。表面液の脱水が、粘膜上皮において、粘膜繊毛クリアランスの変化、そして炎症及び感染をもたらす。ＣＦＴＲタンパク質の機能を低下させるＣＦＴＲ突然変異は、肺の気管支における濃厚で粘着性のある粘液の蓄積、外分泌性の膵機能の消失、腸分泌疾患、及び汗中の塩素イオン濃度の上昇を惹起する（Boucher RC Trends Mol Med., 2007）。ＣＦ患者では、ＣＦＴＲ Ｃｌ（−）チャンネル機能の欠如により、進行性の肺損傷、そして最終的には死に至る。ＣＦ患者においては、慢性肺疾患が死亡率及び疾病率の最大の原因である。

ＣＦ患者では、これらの症状を管理するために、気道疾患を処置するための粘液溶解剤及び抗生剤及び胸部物理療法、並びに外分泌性膵機能の損失を埋めるための消化酵素を含む多くの治療が必要とされる（Farrell PM et al. J Pediatr, 2008）。これら及びその他の治療介入が、平均余命を劇的に延長したが、大きい治療負担を軽減し、生存率を上昇させるためには、改善が必要である（Sawicki GS et al. J Cyst Fibros, 2009）。ＣＦＴＲの賦活剤（potentiator）（アイバカフトール）が、Vertex Pharmaceuticals（Ramsey BW et al. N Engl J Med, 2011）によって開発され、ｐ．Ｇｌｙ５５１Ａｓｐ突然変異を有するＣＦ患者（全患者の２〜５％）の治療について最近承認された。今まで、最も多い突然変異であるｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌのＣＦ患者については、薬物は不成功に終わっている。既に幾つかのＣＦＴＲコレクター（corrector）が、インビトロにおいて活性があることが報告されている（Hutt DM et al. Nature Chem Biol, 2010; Verkman AS and Galietta LJ Nat Rev Drug Discov, 2009）が、ＣＦに対する治療法は、これらの努力からは進展していない。ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌタンパク質の輸送を改善（correct）するコレクターもまた、臨床試験中である（Van Goor F et al. PNAS, 2011）。

したがって、ＣＦ及びＣＦＴＲ関連疾患を予防又は治療するのに適した新薬を開発することが求められている。このようにして、ＣＦ及びＣＦＴＲ関連疾患における新規治療化合物の特徴づけが、高度に望ましいことが示唆されている。

１９８９年のＣＦＴＲ遺伝子のクローニング以来、この遺伝子のほぼ２０００もの突然変異が報告されている。ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌ突然変異（タンパク質５０８位におけるフェニルアラニンの欠失）が、最も多い（ＣＦ患者の突然変異アレルの７０％）。この重度な突然変異により、ＣＦＴＲタンパク質の成熟が損なわれ、タンパク質は、細胞膜に到達することができない。ＣＦＴＲタンパク質に対する作用に基づく他の群には、タンパク質の短縮、塩素イオンコンダクタンスの低下、細胞表面におけるＣＦＴＲの不完全な安定性、誤ったスプライシングによるＣＦＴＲ転写物の数の低下をもたらす突然変異が含まれる（Rowe SM et al. N Engl J Med, 2005）。

選択的スプライシングは、遺伝子発現の間の制御された過程であり、これは、真核細胞の遺伝子発現の重要な転写後制御を構成する多くのタンパク質をコードする単一の遺伝子をもたらす。この過程では、遺伝子の特定のエキソンが、最終的な、処理されたｍＲＮＡに含まれるか、または除外される。スプライシングの異常な変異は、疾患にも関与しており；ヒトの遺伝疾患の大部分は、スプライシングの変異によるものである。スプライシング部位又はシス作用性スプライシング制御部位における各種ＣＦＴＲの突然変異、又は新たな異常な選択的ドナー又はアクセプター部位の創出に至る各種ＣＦＴＲの突然変異により、多くの異常なＣＦＴＲ転写物のミススプライシング及び機能しないＣＦＴＲタンパク質がもたらされる。

選択的スプライシングのメカニズムに加えて、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、転写因子と同期して作用して、遺伝子発現を制御することができ（Martinez NJ et al. Bioessays, 2009; Shalgy R et al. Aging, 2009）、真核細胞の遺伝子発現の転写後制御における重要で新たな複雑さが示されている。最近、ＣＦＴＲが、ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−４９４などのｍｉＲＮＡによって、転写後調節されることがみつかった（Gillen AE et al. Biochem J, 2011; Megiorni F et al. Plos One, 2011; Ramachandran S et al. PNAS, 2012）。ｍｉＲ−１４５を含む幾つかのｍｉＲＮＡは、ヒトの原発性気道上皮細胞において発現され、ＣＦ患者ではそこでＣＦＴＲ発現が抑制され（Gillen AE et al. Biochem J, 2011）、又は脱制御される（Oglesby IK et al. J immunol, 2013; Ramachandran S et al. AJRCMB, 2013）。

発明の概要：
本発明は、ＣＦＴＲ関連疾患及び嚢胞性線維症の処置のための方法及び組成物に関する。

発明の詳細な説明：
本発明においては、新たな抑制的エレメントを同定して嚢胞性線維症（ＣＦ）を改善するための新規ツールを設計することを目的として、本発明者らは、ＣＦにおけるＣＦＴＲ遺伝子発現の転写後調節の役割を検討した。本発明者らは、肺の発生特異的転写因子及びＣＦＴＲ遺伝子発現を制御するｍｉＲＮＡに関与する分子ネットワークの同定を介して、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４５を含む制御因子の結合のための阻害性モチーフの重要性を確立した。本発明者らはまた、世界的なプロファイリングにより、成人対胎児の肺において、ｍｉＲ−１４５が、制御が最も解除されたマイクロＲＮＡの一つであることを証明した。シス及びトランス抑制因子を同定することにより本発明者らは、新たな治療ツールを嚢胞性線維症（ＣＦ）を含む肺疾患のために想定することができ、ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌのＣＦ患者の鼻細胞由来の再構築上皮、及びＣＦの気管支上皮細胞において試験を行った。本発明者らは、目的のｍｉＲＮＡの結合のためのＣＦＴＲ遺伝子に対する制御モチーフを定義した後、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−６００、ｍｉＲ−１４５、及びｍｉＲ−３８４を含む幾つかのｍｉＲＮＡの、ＣＦＴＲ遺伝子の３’ＵＴＲへの結合を阻害するための標的部位ブロッカー（target-site blocker）（ＴＳＢ）（ｍｉＲＮＡ結合遮断オリゴヌクレオチド（ＭＢＢＯ））を設計した。

本発明者らはまた、新規の異常な選択的ドナー又はアクセプター部位を創出し、次いで異常なＣＦＴＲ転写物及び機能しないＣＦＴＲタンパク質をもたらす選択的スプライシングを誘発する幾つかの突然変異について検討した。次いで本発明者らは、ＣＦＴＲ転写物の選択的ドナー及びアクセプター部位へのスプライセオソームタンパク質の結合を阻害するための標的部位ブロッカー（ＴＳＢ）標的スプライス部位を設計した。

したがって、これらの特異的ＴＳＢオリゴヌクレオチドを用いることにより、本発明者らは、ＣＦＴＲ転写物及びタンパク質レベルの上昇、又はＣＦＴＲ全長転写物の回復のいずれかを介してのＣＦＴＲチャンネル活性の改善を証明する。

本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、ＣＦＴＲｍＲＮＡを認識又は標的とする単離された合成又は組換えオリゴヌクレオチドに関する。

用語「オリゴヌクレオチド」は、ＣＦＴＲｍＲＮＡを認識又は標的とする単離された合成又は組換えオリゴヌクレオチドを指す。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、ＣＦＴＲｍＲＮＡの調節モチーフを認識又は標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、又はブロッカーオリゴヌクレオチド（ＢＯ）、又は標的部位ブロッカー（ＴＳＢ）を指す。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、ＣＦＴＲｍＲＮＡの調節モチーフを認識又は標的として、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−６００、ｍｉＲ−１４５、及びｍｉＲ−３８４を含む幾つかのｍｉＲＮＡの、ＣＦＴＲｍＲＮＡの３’ＵＴＲへの結合を阻害するｍｉＲＮＡ結合−ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＭＢＢＯ）を指す。用語「オリゴヌクレオチド」はまた、スプライス部位を認識又は標的として、ＣＦＴＲｍＲＮＡの選択的ドナー及びアクセプター部位へのスプライセオソームタンパク質の結合、並びに突然変異ＣＦＴＲｍＲＮＡへ挿入された潜在性エキソン（cryptic exon）のスプライシングを阻害するスプライシング−ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＳＢＯ）を指す。

用語「ＣＦＴＲ」は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子、すなわち上皮細胞膜を通して塩素イオン及びチオシアナートイオンの移送に関与するＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータークラスイオンチャンネルを指す。用語「ＣＦＴＲ」はまた、気道上皮細胞を覆う表面液の変化に関与する塩素イオンチャンネルを指す。

本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択される配列と、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９６％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する核酸配列を含む、単離された、合成、又は組換えオリゴヌクレオチドに関する。

核酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ Ｎ（Karlin and Altschul, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87(6):2264-2268 (1990)）などの適当な配列アラインメントアルゴリズム及びデフォルトパラメータを用いて決定するのが好ましい。

特定の態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択される核酸配列を含む。

特定の態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及び配列番号５からなる群から選択される核酸配列を有する。

本発明のオリゴヌクレオチドは、任意の適当な型でかまわない。当業者であれば容易に、オリゴヌクレオチドの臨床的有効性を改善する改変を行うことができる（C. Frank Bennett and Eric E. Swayze, RNA Targeting Therapeutics: Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides as a Therapeutic PlatformAnnu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2010.50:259-293.）。代表的には、化学的改変には、骨格の改変、複素環の改変、糖の改変、及びコンジュゲート化（conjugations）のストラテジーが含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ＬＮＡ、オリゴヌクレオチド、モルホリノ、トリシクロ−ＤＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、Ｕ７−若しくはＵ１−介在ＡＳＯ若しくはそのコンジュゲート産物（ペプチドコンジュゲート若しくはナノ粒子コンジュゲートＡＳＯなど）からなる群から選択されうる。実際、インビボでの使用のためには、オリゴヌクレオチドは、安定化される場合がある。「安定化」オリゴヌクレオチドとは、インビボでの分解（例えば、エクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを介しての）に相対的に耐性であるオリゴヌクレオチドを指す。安定化は、長さ又は二次構造の機能であることができる。特に、オリゴヌクレオチドの安定化は、リン酸骨格の改変を通じて行うことができる。

特定の態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用される用語「ＬＮＡ」（ロックト核酸）（又は「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」）は、ＬＮＡヌクレオチド及びＬＮＡアナログヌクレオチドとも称される、１又はそれ以上の二環、三環、又は多環ヌクレオシドアナログを含むオリゴヌクレオチドを指す。ＬＮＡオリゴヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びＬＮＡアナログヌクレオチドは、国際公開公報第９９／１４２２６号及び以降の出願；国際公開公報第００／５６７４６号、第００／５６７４８号、第００／６６６０４号、第０１／２５２４８号、第０２／２８８７５号、第０２／０９４２５０号、第０３／００６４７５号；米国特許第６，０４３，０６０号、第６２６８４９０号、第６７７０７４８号、第６６３９０５１号、米国特許公開第２００２／０１２５２４１号、第２００３／０１０５３０９号、第２００３／０１２５２４１号、第２００２／０１４７３３２、第２００４／０２４４８４０号、及び第２００５／０２０３０４２号に一般的に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。ＬＮＡオリゴヌクレオチド及びＬＮＡアナログオリゴヌクレオチドは、例えばProligo LLC, 6200 Lookout Road, Boulder, CO 80301 USAから市販されている。

その他の可能な安定化改変には、ホスホジエステル改変、ホスホジエステル及びホスホロチオアート改変の組み合わせ、メチルホスホナート、メチルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ｐ−エトキシ、及びそれらの組み合わせが含まれる。化学的に安定化されたオリゴヌクレオチドの改変版としては、「モルホリノ」（ホスホロジアミダート・モルホリノ・オリゴマー、ＰＭＯ）、２’−Ｏ−Ｍｅｔオリゴマー、トリシクロ（ｔｃ）−ＤＮＡ、Ｕ７短鎖（ｓｎ）ＲＮＡ、又はトリシクロ−ＤＮＡ−オリゴアンチセンス分子（疾患の処置のためのトリシクロ−ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、組成物及び方法に係る米国仮特許出願第６１／２１２，３８４号、２００９年４月１０日出願、その全内容は、参照により本明細書に組み入れられる）が含まれる。

その他の形の本発明のオリゴヌクレオチドは、レンチウイルス又はアデノ関連ウイルス（これらの限定されるものではない）に基づくウイルス輸送方法と組み合わせての、Ｕ１又はＵ７などの核内低分子ＲＮＡ分子に結合したオリゴヌクレオチド配列（Denti, MA, et al, 2008; Goyenvalle, A, et al, 2004）である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において周知の多くの方法のいずれかを用いて、新規に合成することができる。例えば、ｂ−シアノエチルホスホルアミダイト法（Beaucage et al., 1981）；ヌクレオシドＨ−ホスホナート法（Garegg et al., 1986; Froehler et al., 1986, Garegg et al., 1986, Gaffney et al., 1988）。これらの化学は、市販されている各種の自動核酸シンセサイザーにより行うことができる。これらの核酸は、合成核酸と称することができる。或いは、オリゴヌクレオチドは、プラスミド中で大規模に生産することができる（Sambrook, et al., 1989を参照）。オリゴヌクレオチドは、制限酵素、エクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いるものなど公知の技術を用いて既存の核酸配列から調製することができる。この方法で調製されたオリゴヌクレオチドは、単離核酸と称することができる。

特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、第二の分子とコンジュゲート化されている。代表的には、当該第二の分子は、アプタマー、抗体、又はポリペプチドからなる群から選択される。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞貫通ペプチドとコンジュゲート化している場合がある。細胞貫通ペプチドは、当該技術分野において周知であり、例えばＴＡＴペプチド（Bechara C, Sagan S. Cell-penetrating peptides: 20 years later, where do we stand? FEBS Lett. 2013 Jun 19;587(12):1693-702）を含む。特定の態様では、第二の分子は、上皮細胞を標的にできる。特定の態様では、分子は、ＣＦＴＲ輸送体を標的とする。上皮細胞と高い親和性で結合する幾つかの抗体、ペプチド及びアプタマーは、Raksha J et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010 ; Van Meegen MA et al. Plos One. 2011に記載されている。

本発明の治療方法及び使用
本発明のオリゴヌクレオチドは、それを必要とする被験体における疾患を予防又は治療する方法において用いられる場合がある。

したがって、本発明の更なる側面は、医薬として使用するための本発明のオリゴヌクレオチドに関する。

一つの態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、それを必要とする被験体におけるＣＦＴＲ関連疾患の予防又は治療において用いられる場合がある。

本発明はまた、それを必要とする被験体における嚢胞性線維症の予防又は治療において用いるための本発明によるオリゴヌクレオチドにも関する。

本明細書で使用される用語「被験体」は、哺乳動物を意味する。本発明の一つの態様では、本発明による被験体は、ＣＦＴＲ関連疾患に罹った、又は罹るリスクのある任意の被験体（好ましくはヒト）を指す。本発明の好ましい態様では、本発明による被験体は、嚢胞性線維症に罹った、又は罹るリスクのある任意の被験体（好ましくはヒト）を指す。

本発明の方法は、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺がん、輸精管の先天的欠損（ＣＡＶＤ）、突発性慢性膵炎（ＩＣＰ）、気管支拡張症などの任意の種類のＣＦＴＲ関連疾患について実施できる。本発明の文脈においては、ＣＦＴＲ関連疾患は、当業者には周知の技術により被験体において診断し、生物学的試料において決定することができる。これらの方法には、定量的ＰＣＲなどの増幅法、ＣＦＴＲ遺伝子配列決定、及びスプライシングレポーターアッセイが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の方法はまた、嚢胞性線維症の世界保健機関分類（World Health Organisation Classification）において改訂され、Ｅ８４群：嚢胞性線維症（mucoviscidosis）、肺症状を伴う嚢胞性線維症、腸症状を伴う嚢胞性線維症、及びその他の症状を伴う嚢胞性線維症から選択される任意の種類の嚢胞性線維症について実施できる。

特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、単独、又はベクターと共にインビボで送達することができる。その広い意味において、「ベクター」は、本発明のオリゴヌクレオチドの細胞への移送を助長することができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で起こる分解の程度と比較して低い分解程度で核酸を細胞へ移送する。一般的には、本発明において有用なベクターには、裸のプラスミド（naked plasmid）、非ウイルス性の送達システム（カチオン性導入剤、リポソームなど）、ファージミド、ウイルス、オリゴヌクレオチド配列の挿入又は導入により操作されたウイルス若しくは細菌源から誘導されたその他のビヒクルが含まれるが、これらに限定されない。ウイルス性ベクターが、好ましい種類のベクターであり、以下のウイルス：レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、及びレンチウイルスから誘導されるベクター）、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳がんウイルス、及びトリ肉腫ウイルスなどのＲＮＡウイルス；アデノウイルス、アデノ関連ウイルス；ＳＶ４０−型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；に由来する核酸配列を含むが、これらに限定されない。名前は挙げられていないが、当該技術分野では公知のその他のベクターも容易に用いることができる。好ましい態様では、オリゴヌクレオチド配列は、非相同制御領域、例えば非相同プロモーターの制御下にある。プロモーターはまた、例えばＣＭＶプロモーター、又は任意の合成プロモーターなどのウイルス性プロモーターの場合もある。

特定の態様では、２又はそれ以上のオリゴヌクレオチドでさえ同時に用いることができ；オリゴヌクレオチドを発現カセット内（例えばＵ７又はＵ１カセットにより）でベクター化する際には、これは特に興味深い。

本発明はまた、それを必要とする被験体におけるＣＦＴＲ関連疾患の予防又は治療において用いるための、１又はそれ以上の抗ＣＦＴＲ関連疾患薬と組み合わせた本発明によるオリゴヌクレオチドにも関する。

本発明はまた、それを必要とする被験体における嚢胞性線維症の予防又は治療において用いるための、１又はそれ以上の抗嚢胞性線維症薬と組み合わせた本発明によるオリゴヌクレオチドにも関する。

一つの態様では、抗嚢胞性線維症薬又は抗ＣＦＴＲ関連疾患薬には、ＣＦＴＲコレクター又は賦活剤（アイバカフトール（ＶＸ−７７０、Kalydeco）、ＶＸ−６６１、ＶＸ−８０９など）、浸透圧剤（Bronchitolなど）、抗酸化剤、粘膜調整剤（Pulmozyme、Mucomystなど）、気管支拡張剤（Ventolin、Sereventなど）、抗感染性化合物（ＴＯＢＩ、アジスロマイシン、Josacineなど）、又は更に抗炎症剤（イブプロフェン、デキサメサゾン、Zyflo、Accolateなど）が含まれる。

本発明はまた、それを必要とする被験体におけるＣＦＴＲ関連疾患を予防又は治療する方法であって、当該被験体に本発明によるオリゴヌクレオチドを投与する工程を含む方法にも関する。

本発明はまた、それを必要とする被験体における嚢胞性線維症を予防又は治療する方法であって、当該被験体に本発明のオリゴヌクレオチドを投与する工程を含む方法にも関する。

本発明はまた、それを必要とする被験体におけるＣＦＴＲ関連疾患を予防又は治療する方法であって、当該被験体に本発明によるオリゴヌクレオチドを、１又はそれ以上の抗ＣＦＴＲ関連疾患薬と組み合わせて投与する工程を含む方法にも関する。

本発明はまた、それを必要とする被験体における嚢胞性線維症を予防又は治療する方法であって、当該被験体に本発明によるオリゴヌクレオチドを、１又はそれ以上の抗嚢胞性線維症薬と組み合わせて投与する工程を含む方法にも関する。

本発明の医薬組成物及びキット
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬組成物において使用又は調製することができる。

一つの態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容しうる担体を含む、それを必要とする被験体におけるＣＦＴＲ関連疾患の予防又は治療において使用するための医薬組成物に関する。

本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容しうる担体を含む、それを必要とする被験体における嚢胞性線維症の予防又は治療において使用するための医薬組成物に関する。

代表的には、本発明の化合物は、薬学的に許容しうる賦形剤、及び場合により生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて、処置用組成物とするすることができる。

「薬学的に」又は「薬学的に許容しうる」は、哺乳動物、特にヒトに適当に投与した場合に、有害な、アレルギー性の、又はその他の好ましくない反応を惹起しない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容しうる担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体、又は液状のフィラー、希釈剤、包埋物質、又は製剤助剤を指す。

オリゴヌクレオチドの単独で、又は別の活性成分と組み合わせての、経口、吸入、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物は、通常の医薬担体との混合物として、単位投与剤型で動物又はヒトへ投与することができる。適当な単位投与剤型には、錠剤、ゲルカプセル剤、粉剤、顆粒、及び経口懸濁液若しくは液剤などの経口経路用剤型、舌下及び頬側投与用剤型、吸入投与用剤型、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内、及び鼻又は鼻内投与用剤型、並びに直腸投与用剤型が含まれる。

好ましくは、医薬組成物は、鼻内投与又は吸入によって投与することができる製剤用の薬学的に許容しうるビヒクルを含む。鼻内投与は、液剤、懸濁剤、又はエマルションの剤型であることができる。液剤及び懸濁剤は、液滴として投与される。液剤はまた、鼻用のスプレーボトル又は鼻用の吸入器から微細なミストとして投与することもできる。吸入は、液剤、懸濁剤、及び粉剤の剤型で行うことができ；これらの製剤は、エアロゾル、液滴、又はドライパウダー吸入器を介して投与される。粉剤は、注入器、又はパファー（puffer）により投与することができる

本発明の医薬組成物は、生理食塩水、リン酸ナトリウムなどの薬学的に又は生理学的に許容しうる担体を含む。組成物は一般的に、液状の形態であろうが、必ずしもそうである必要はない。適当な担体、賦形剤、及び希釈剤には、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、シロップ水、メチルセルロース、メチル及びプロピルヒドロキシベンゾアート、鉱物油などが含まれる。製剤はまた、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤などを含むことができる。当業者であれば、核酸は、しばしば脂質（例えば、カチオン性脂質若しくは中性脂質、又はそれらの混合物）と合わせて、頻繁にリポソーム又はその他の適当なミクロ若しくはナノ構造の物質（例えば、ミセル、脂質複合体（lipocomplex）、デンドリマー、エマルション、キュービック相（cubic phase）など）の形で送達されることを認識するであろう。

当業者であれば、投与されるオリゴヌクレオチドの量は、望ましくない疾患症状の改善を誘導するのに十分な量であることを認識するであろう。このような量は、特に被験体の性別、年齢、体重、全体的な身体の状態などの因子に応じて変動し、個々の場合に応じて決定することができる。量はまた、処置される状態の種類、及び処置計画のその他の要素（例えば、ステロイドなどその他の医薬の投与など）に応じても変動する。オリゴヌクレオチドのウイルスに基づく送達を選択するのであれば、適当な投与量は、用いるウイルス株、送達経路（筋肉内、静脈内、動脈内、経口、吸入、又はその他）などの各種因子に依存するであろう。当業者であれば、このようなパラメータが、臨床試験の間、正常に把握されることを認識するであろう。更に、被験体の処置は、通常は一度のものではない。むしろ、本発明のオリゴヌクレオチドは、何度も投与される可能性があり、これは、得られる結果に応じて、数日、数週間、又は数か月、或いは数年の間隔を置く場合がある。

本発明の医薬組成物は、嚢胞性線維症又はＣＦＴＲ関連疾患の予防又は治療に用いられる任意の更なる薬剤を含むことができる。例えば、本発明の医薬組成物は、ＣＦＴＲコレクター若しくは賦活剤（アイバカフトールであるＶＸ−７７０、ＶＸ−６６１、ＶＸ−８０９、Kalydecoなど）、浸透圧剤（Bronchitolなど）、抗酸化剤、粘膜の調整剤（Pulmozyme、Mucomystなど）、気管支拡張剤（Ventolin、Sereventなど）、抗感染性化合物（ＴＯＢＩ、アジスロマイシン、Josacineなど）、又は更に抗炎症剤（イブプロフェン、デキサメサゾン、Zyflo、Accolateなど）と共に投与することができる。

本発明はまた、少なくとも１の本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットも提供する。本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットは、処置方法における用途を有しよう。

オリゴヌクレオチド配列
ＭＢＢＯ−１の配列番号１：
ＡＧＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＣＡＧ ＴＡＡ Ｔ
ＭＢＢＯ−２の配列番号２：
ＡＴＡ ＡＡＣ ＣＧＣ ＴＧＡ ＡＧＴ ＴＴＣ ＣＡＧ ＴＴＡ ＴＣ
ＭＢＢＯ−３の配列番号３：
ＡＣＡ ＴＴＡ ＴＴＡ ＡＡＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＴＴＴ ＣＣＴ ＡＧＡ Ｇ
ＴＳＢ１の配列番号４：
ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＴＡ ＡＴＡ
ＴＳＢ２の配列番号５：
ＡＣＣ ＴＴＡ ＣＴＴ ＡＴＡ ＴＣＴ ＣＡＡ

本発明を、以下の図及び実施例により更に詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び図は、いかなる方法によっても本発明の範囲を制限するものとして解釈してはならない。

肺細胞におけるＣＦＴＲ発現に対するｍｉＲＮＡ−結合ブロッカーオリゴヌクレオチドの効果ＣＦＴＲ遺伝子の転写後調節に対する各種ＭＢＢＯの効果。ＭＢＢＯ（１００nM）を、Ａ５４９及びＢｅａｓ−２Ｂ肺細胞にトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性データは、miRCURY LNA^TM（商標） マイクロＲＮＡ阻害剤陰性対照Ａ（対照オリゴ）まで正常化される。 肺細胞におけるＣＦＴＲ発現に対するｍｉＲＮＡ−結合ブロッカーオリゴヌクレオチドの効果Ａ５４９及びＢｅａｓ−２Ｂ肺細胞における内因性ＣＦＴＲ転写物レベルに対するＭＢＢＯ−１の効果。ＣＦＴＲｍＲＮＡレベルを、ＭＢＢＯ−１のトランスフェクション、又は対照オリゴの使用後にＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した。データは、β−アクチン転写物レベルまで正常化される。 肺細胞におけるＣＦＴＲ発現に対するｍｉＲＮＡ−結合ブロッカーオリゴヌクレオチドの効果対照（ｎ＝８）における内因性ＣＦＴＲ転写物レベルに対するＭＢＢＯ−１の効果。ＣＦＴＲｍＲＮＡレベルは、ＭＢＢＯ−１による１、３、又は５回の処置、或いは対照オリゴの使用の２４時間後にＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した。 肺細胞におけるＣＦＴＲ発現に対するｍｉＲＮＡ−結合ブロッカーオリゴヌクレオチドの効果ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌホモ接合型ＣＦ患者（ｎ＝６）から培養したＡＬＩ上皮における効果。 肺細胞におけるＣＦＴＲ発現に対するｍｉＲＮＡ−結合ブロッカーオリゴヌクレオチドの効果ＣＦ患者における内因性ＣＦＴＲ転写物レベルに対するＭＢＢＯ−１、ＭＢＢＯ−２、及びＭＢＢＯ−３の効果。ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌホモ接合型ＣＦ患者におけるＣＦＴＲ転写物レベルについて、ボックスプロットを評価した（ＭＢＢＯ−１、ＭＢＢＯ−２、ＭＢＢＯ−３、又は対照オリゴによる最初の処置後２４時間）。データは、β−アクチン転写物レベルまで正常化する。 肺細胞におけるＣＦＴＲ発現に対するｍｉＲＮＡ−結合ブロッカーオリゴヌクレオチドの効果ＣＦ患者における内因性ＣＦＴＲタンパク質レベルに対するＭＢＢＯ−１、ＭＢＢＯ−２、及びＭＢＢＯ−３の効果。ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌホモ接合型ＣＦ患者の総タンパク質抽出物について、ＣＦＴＲ抗体（クローンＭＭ１３−４）により免疫ブロットを行った（ＭＢＢＯ−１、ＭＢＢＯ−２、ＭＢＢＯ−３、又は対照オリゴによる最初の処置後２４時間）。データは、ラミンＡ／Ｃタンパク質レベルまで正常化する。再構成（reconstituted）した気道上皮において、ＭＢＢＯ １００nMを、自由培地（free medium）（トランスフェクション試薬なし）中、３７℃で２時間、頂端部側へ直接加えた。 肺細胞におけるＣＦＴＲ発現に対するｍｉＲＮＡ−結合ブロッカーオリゴヌクレオチドの効果１６ＨＢＥｏ−（ＮＣＦ）及びＣＦＢＥ（ＣＦ）細胞中のＣＦＴＲ活性。ハロゲン感受性ＹＦＰを一過性に発現する気管支細胞由来の代表的な細胞の蛍光記録（スケールバーは、全細胞蛍光のパーセントを報告している）。Ｉ⁻（矢印）の細胞外添加は、Ｉ⁻流入速度及びＣＦＴＲ活性に比例する速度で、ＹＦＰのクエンチングを惹起した。プローブの蛍光の低下により、チャンネルの開口が検出される。クエンチの量は、Ｃｌ⁻の流出に直接比例する。グラフは、Ｉ移送の速度を報告する機能アッセイから得られたデータの要約を表す。 値は、＊Ｐ＜０．０００１と、非常に有意である。 肺細胞におけるＣＦＴＲ発現に対するｍｉＲＮＡ−結合ブロッカーオリゴヌクレオチドの効果非処置（ＮＴ）ＣＦＢＥ細胞又はＭＢＢＯ−処置ＣＦＢＥ細胞中のＣＦＴＲ活性。ハロゲン感受性ＹＦＰを一過性に発現する気管支細胞由来の代表的な細胞の蛍光記録（スケールバーは、全細胞蛍光のパーセントを報告している）。Ｉ⁻（矢印）の細胞外添加は、Ｉ⁻流入速度及びＣＦＴＲ活性に比例する速度で、ＹＦＰのクエンチングを惹起した。プローブの蛍光の低下により、チャンネルの開口が検出される。クエンチの量は、Ｃｌ⁻の流出に直接比例する。グラフは、Ｉ移送の速度を報告する機能アッセイから得られたデータの要約を表す。 値は、＊Ｐ＜０．０００１と、非常に有意である。 気管支細胞における異常なスプライシングのＴＳＢ１による改善Ａ及びＣ．気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を、特異的プライマーを用いて行って、野生型（ＩＶＳ１２ｗｔ）又は突然変異株（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ、ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ）ミニ遺伝子及びＴＳＢ（ＷＴ、野生型転写物及びＣＥＩ、潜在性エキソン包含（cryptic exon inclusion））のコ・トランスフェクション後のスプライシングを分析した。異常スプライシングに対するＴＳＢ濃度の効果。異なるＴＳＢ１濃度（２５、５０、１００、１０００nM）で２４時間、細胞をトランスフェクションした。 気管支細胞における異常なスプライシングのＴＳＢ１による改善Ａ及びＣ．気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を、特異的プライマーを用いて行って、野生型（ＩＶＳ１２ｗｔ）又は突然変異株（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ、ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ）ミニ遺伝子及びＴＳＢ（ＷＴ、野生型転写物及びＣＥＩ、潜在性エキソン包含（cryptic exon inclusion））のコ・トランスフェクション後のスプライシングを分析した。異なる濃度での、ＴＳＢのトランスフェクション後のＣＥＩ及びＷＴ転写物の定量。ｐＳＰＬ３プラスミドのスプライスドナーエキソン内に配置したフルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）−標識順方向プライマー、及びスプライスアクセプターエキソン内に配置した逆方向プライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。パーセントでの定量は、ＣＥＩピークの面積を、全ピークの面積（野生型＋ＣＥＩ）で割ることにより行った。データは、少なくとも２回の独立した実験の平均値に対応する。 気管支細胞における異常なスプライシングのＴＳＢ１による改善Ａ及びＣ．気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を、特異的プライマーを用いて行って、野生型（ＩＶＳ１２ｗｔ）又は突然変異株（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ、ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ）ミニ遺伝子及びＴＳＢ（ＷＴ、野生型転写物及びＣＥＩ、潜在性エキソン包含（cryptic exon inclusion））のコ・トランスフェクション後のスプライシングを分析した。５０nM ＴＳＢ１を用いたスプライシング改善に対するインキュベーション時間（２４時間、４８時間、及び７２時間）の効果。異なる試験濃度において、野生型及び突然変異ミニ遺伝子と組み合わせて、対照ＴＳＢ（ＣＴＬ）を用いて、ＴＳＢ１特異性を確認した；図の過負荷を避けるために、５０nM、又は２４時間でのアッセイのみを示した。 気管支細胞における異常なスプライシングのＴＳＢ１による改善Ａ及びＣ．気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を、特異的プライマーを用いて行って、野生型（ＩＶＳ１２ｗｔ）又は突然変異株（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ、ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ）ミニ遺伝子及びＴＳＢ（ＷＴ、野生型転写物及びＣＥＩ、潜在性エキソン包含（cryptic exon inclusion））のコ・トランスフェクション後のスプライシングを分析した。トランスフェクション後の異なる時点（Ｄ）での、ＴＳＢのトランスフェクション後のＣＥＩ及びＷＴ転写物の定量。ｐＳＰＬ３プラスミドのスプライスドナーエキソン内に配置したフルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）−標識順方向プライマー、及びスプライスアクセプターエキソン内に配置した逆方向プライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。パーセントでの定量は、ＣＥＩピークの面積を、全ピークの面積（野生型＋ＣＥＩ）で割ることにより行った。データは、少なくとも２回の独立した実験の平均値に対応する。 気管支細胞における異常なスプライシングのＴＳＢ１による改善Ａ及びＣ．気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を、特異的プライマーを用いて行って、野生型（ＩＶＳ１２ｗｔ）又は突然変異株（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ、ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ）ミニ遺伝子及びＴＳＢ（ＷＴ、野生型転写物及びＣＥＩ、潜在性エキソン包含（cryptic exon inclusion））のコ・トランスフェクション後のスプライシングを分析した。全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる分析を、特異的プライマーを用いて行って、両方の転写物（ＷＴ、野生型、及びＣＥＩ、潜在性のエキソン包含）を分析した。鼻細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を、特異的プライマーを用いて行って、両方の転写物（ＷＴ、野生型、及びＣＥＩ、潜在性のエキソン包含）を分析した。 気管支細胞における異常なスプライシングのＴＳＢ１による改善Ａ及びＣ．気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を、特異的プライマーを用いて行って、野生型（ＩＶＳ１２ｗｔ）又は突然変異株（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ、ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ）ミニ遺伝子及びＴＳＢ（ＷＴ、野生型転写物及びＣＥＩ、潜在性エキソン包含（cryptic exon inclusion））のコ・トランスフェクション後のスプライシングを分析した。対照の個体から得、ＢＥＧＭ（Lonza, Walkersville, MD USA）中１週間培養し、２４ウエルプレートに蒔いた鼻細胞において、ＷＴ又は突然変異ミニ遺伝子と組み合わせて、ＴＳＢ１を１００nMで２４時間トランスフェクションした。鼻細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を、特異的プライマーを用いて行って、両方の転写物（ＷＴ、野生型、及びＣＥＩ、潜在性のエキソン包含）を分析した。 気管支細胞内での異常なスプライシングのＴＳＢ２による改善 異なる濃度での、ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ、又はｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇミニ遺伝子とのコ・トランスフェクション後のＣＥＩ及びＷＴ転写物の定量。ｐＳＰＬ３プラスミドのスプライスドナーエキソン内に配置したフルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）−標識順方向プライマー、及びスプライスアクセプターエキソン内に配置した逆方向プライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。パーセントでの定量は、ＣＥＩピークの面積を、全ピークの面積（野生型＋ＣＥＩ）で割ることにより行った。データは、少なくとも２回の独立した実験の平均値に対応する。異なる試験濃度において、ＷＴ及び突然変異ミニ遺伝子の両方と組み合わせて、対照ＴＳＢ（ＣＴＬ）を用いて、ＴＳＢ２特異性を確認した；図の過負荷を避けるために、５０nMでのアッセイのみを示した。

実施例１：
材料及び方法
遺伝子レポーターベクター及び定方向突然変異誘発
ＣＦＴＲ遺伝子の３’ＵＴＲ（ポリアデニル化シグナルに対する停止コドンから１．７kb）を、ｐＧＬ３−コントロールベクター（Promega）へ、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にサブクローニングした（ｐＧＬ３Ｃ−ＣＦＴＲ−３ＵＴＲ）。シスモチーフの変性は、QuickChange（登録商標）II部位特異的変異誘発キット（Stratagene）を用いて、定方向突然変異誘発により行った。すべての構築物は、直接配列決定法を用いて確認した。

ミクロＲＮＡ前駆体、及び標的部位ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＴＳＢ）
Ambion (Life Technologies)より、Pre-miR^TM（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体及びPre-miR^TM（商標）ｍｉＲＮＡ前駆体陰性対照を購入した。ｍｉＲＮＡ結合ブロッカー（ＭＢＢＯ）として使用したLNA^TM（商標）増強オリゴヌクレオチドは、ＴＳＢと称され、ｍｉＲ−１０１（ＭＢＢＯ−１）、ｍｉＲ−１４５（ＭＢＢＯ−２）、及びｍｉＲ−３８４（ＭＢＢＯ−３）標的部位と重なるＣＦＴＲ３’ＵＴＲが設計されたことが確認された（EXIQON）。対照としては、miRCURY LNA ^TM（商標）マイクロＲＮＡ阻害剤陰性対照Ａが使用された（EXIQON）。

細胞培養
ヒト肺上皮細胞（Ａ５４９及びＢｅａｓ−２Ｂ）を、既に報告されているように培養した（Gras D et al. J Allergy Clin Immunol 2012）。妊娠約２２週の胎児から単離したヒト胎児気管支上皮細胞（HBEpiC, ScienCell, Clinisciences）を、Ｉ型コラーゲン被覆細胞培養フラスコ中、気管支上皮細胞培地（BEpiCM, ScienCell, Clinisciences）中で一次培養した。全細胞を、５％ＣＯ_２下、３７℃で培養した。ヒト気管支上皮細胞株、ＣＦＢＥ４１ｏ−（ｐ．ＰＨＥ５０８ｄｅｌ／ｐ．ＰＨＥ５０８ｄｅｌ）及び野生型ＣＦＴＲ発現、１６ＨＢＥ１４ｏ−細胞（Dr. D.C. Gruenert（San Francisco, CA, USA）から提供された）により幾つかの検討を行った。両方の細胞型を、既に報告されているように（Saint-Criq V et al. Eur J Pharmacol 2012, Cell Signal, 2012）、Earle塩及びＬ−グルタミンを含むＭＥＭ中で保持した。

健康な、又はｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌホモ接合型ＣＦ固体由来の鼻細胞を、ASI Rhino-Pro（登録商標）Curette（Arlington Scientific）による下鼻甲介上皮のスクラッチングにより得た（French Ethical Research Committeeの合意書N°ID-RCB 2011-A01520-41）。抗生物質を添加した気管支上皮細胞増殖培地（BEGM, LONZA）（Life Technologies）を用いて、Ｉ型コラーゲン被覆フラスコ上での上皮細胞の初期増殖を促進した。３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気での単層増殖の３週間後、コラーゲン被覆１２mmのTranswell-Clear（登録商標）支持体、孔径０．４μm（Corning, Inc.）中、細胞を３００，０００個播種した。ＡＬＩ（気相液相界面）培地を用いて、増殖と上皮の分化をサポートした。特定の添加剤（LONZA）と、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びアムホテリシンＢ（１Ｘ）（Life Technologies）を添加したＡＬＩ培地（５０：５０ＢＥＧＭ及びＤＭＥＭ、１g/Lグルコース）の上部を、コンフルエンス後に除去し、底部のＡＬＩ培地を、２〜３日毎に変えた。上皮が十分に分化したら（少なくとも２８日）、実験を行った。

一過性トランスフェクション
ルシフェラーゼアッセイのために、９６ウエルのプレート中、細胞１０，０００個（Ｂｅａｓ−２Ｂ）、１３，０００個（Ａ５４９）、及び２０，０００個（ＨＢＥｐｉＣ）／１００μl・培地の密度で細胞を播種し、Fugene（登録商標）6トランスフェクション試薬（Roche Applied Sciences）を用いて、示したレポーターベクター７２ng、及びRenilla Luciferase（Promega）を含有する内部対照ｐＲＬ−ＳＶ４０ ８ngによりトランスフェクションをして、トランスフェクション効率を正規化した。Interferin（登録商標）トランスフェクション試薬（Polyplus, Ozyme）を用いて、ｍｉＲＮＡ又はＴＳＢ（ＭＭＢＯ）によるコ・トランスフェクション実験を行った。レポーターベクター及びｐＲＬ−ＳＶ４０に加えて、マイクロＲＮＡ前駆体２０nM、又はＴＳＢ（ＭＭＢＯ）１００nMをコ・トランスフェクションした。

ＲＮＡ及びタンパク質の研究のためには、６ウエルのプレート中、細胞２５０，０００個（Ｂｅａｓ−２Ｂ）、３００，０００個（Ａ５４９）、５００，０００個（ＨＢＥｐｉＣ）／２ml・培地の密度で、細胞を播種した。細胞を、上述したように同量のｍｉＲＮＡ前駆体又はＴＳＢ（ＭＭＢＯ）でトランスフェクションした。

ＲＮＡ抽出、逆転写、及び定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
わずかな改変を行ったのみで既に報告されているようにして（Viart V et al. Eur J Hum Genet 2012）、全ＲＮＡを抽出し、逆転写し、増幅した。逆転写は、ランダムプライマー又はＣＦＴＲのいずれか、及びβアクチン特異的プライマーにより行った。定量的ＰＣＲは、１：１０希釈ｃＤＮＡにより行い、LightCycler（登録商標）480 SYBR Green I Master（Roche Applied Science）により増幅した。相対的発現レベルは、内因性対照としてハウスキーピング遺伝子（β−アクチン）発現との比較ＤＤＣｔ法を用いて計算した。ｍｉＲＮＡは、miRNeasy Mini Kit及びRNeasy MinElute Cleanup kit（Qiagen）により精製した。逆転写は、ｍｉＲＮＡ ４０ngについて、miRCURY LNA^TM（商標）Universal ｃＤＮＡ合成キット（EXIQON）により行い、ｑＰＣＲは、１：１０希釈ｃＤＮＡ、及びそれぞれのｍｉＲＮＡ（EXIQON）に特異的なmicroRNA LNA^TM（商標） プライマーセットにより行った。相対的発現レベルは、内因性対照としてＳＮＯＲＤ４４及びＳＮＯＲＤ４８核小体低分子ＲＮＡとの比較ＤＤＣｔ法を用いて計算した。重要なマイクロアレイの結果（ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡプロファイリング）を評価するために、上記で説明したように、ＲＴ−ｑＰＣＲを行った。

レポーターアッセイ
トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収し、Firefly Luciferase及びRenilla Luciferaseの活性を、Dual-Glo（登録商標）Luciferase Assay System（Promega）を用いて測定した。

ウエスタンブロット
総タンパク質を、1X Laemmli緩衝液を用いて直接抽出した。タンパク質を、７％又は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜（Westran（登録商標）Clear Signal Whatman（登録商標）、Dutsher SAS）に移した。タンパク質を、１：４００希釈抗ＣＦＴＲ（クローンＭＭ１３−４、Millipore）を用いて、５％スキムミルク中で検出した。Lamin A/C（１：１０，０００、Sigma Aldrich）のタンパク質レベルを、タンパク質負荷の内部対照のために測定した。抗マウス二次抗体とのインキュベーションの１時間後に、タンパク質を化学発光法により示した。

ＣＦＴＲ活性
ＣＦＴＲタンパク質の活性は、既に報告されているように（Saint-Criq V et al. Eur J Pharmacol 2012）、Premo Halideセンサー技術（Invitrogen, Villebon sur Yvette, France）を用いて、ハロゲン感受性ＹＦＰのＩ−クエンチングにより評価した。ＭＢＢＯ処理の４０時間後、ＣＦＴＲコンダクタンスを、アゴニスト混合物（ホルスコリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、アピゲニン）により刺激した。１０分後、蛍光測定のために、９６ウエルプレートをプレートリーダーに移した。各ウエルを、２秒間（基底ライン）連続的に（４００ms／ポイント）蛍光を測定することにより、ＣＦＴＲ−介在Ｉ⁻流出について個別に測定し、次いで、１４０mM Ｉ⁻溶液５０μlについて測定した。

統計学的分析
ルシフェラーゼ及びＲＴ−ｑＰＣＲアッセイのために、実験を少なくとも３回行い、試料を少なくとも三重に分析し、InStat（GraphPad Software, version 3.0, Instat 3 folder）を用いて、スチューデントのｔ検定を用いて、対比較を行った。データは、平均±ＳＥとして示し、ｐ＜０．０００１において統計学的に有意であると判断した。ＭＢＢＯの影響を評価するために、有意性のあるボックスプロットを発生させるＲソフトウエアによるWilcoxon統計学を用いて、統計学的分析を行った。

結果
３’ＵＴＲにおけるシス及びトランス作用性のエレメントの複雑なパターンが、ＣＦＴＲ遺伝子の時間的発現の制御に関与している。
ＣＦＴＲ遺伝子の転写後制御に対する３’ＵＴＲの効果を評価するために、本発明者らは、成人細胞株及び原発性胎児ＨＢＥｐｉＣを、ＣＦＴＲ３’ＵＴＲと共に、又は無しのいずれかで、レポーターベクターによりトランスフェクションした。その結果、全ての細胞型で、ＣＦＴＲ遺伝子の３’ＵＴＲが、ルシフェラーゼ活性の強い発現を誘導したことが示され、この領域が、シス抑制的エレメントを含むことが示された。バイオインフォマティクス用ツールであるAREsite（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/AREsite.cgi）を用いて、本発明者らは、ＣＦＴＲ遺伝子の３’ＵＴＲ中のＡＵが多いことが想定される４つのエレメント（ＡＲＥ）：ＡＲＥ−４８１６、ＡＲＥ−５５３３、ＡＲＥ−５６９８、及びＡＲＥ−６０７４を確認した。これらの部位は、すでに報告されているもの（Baudouin-Legros M et al. AJPCP, 2005）（発明者らは、そのヌクレオチド位に応じて、ＡＲＥ−４５８５、ＡＲＥ−４７６０、及びＡＲＥ−４８９１と命名している）に追加されるものである。発明者らは、次に、レポーターアッセイを用いて、これらのモチーフの変性を評価した。一つのモチーフ、ＡＲＥ−４７６０のみが、ｍＲＮＡの安定化に関与していると考えられた。その変性が、ルシフェラーゼ活性の低下と関連していたからである。ＡＲＥ−４５８５、ＡＲＥ−５５３３、ＡＲＥ−５６９８、及びＡＲＥ−６０７４は、Ａ５４９及びＢｅａｓ−２Ｂの不安定化に関与していると考えられた一方、ＨＢＥｐｉＣには、作用を有しなかった。最大の効果は、ＡＲＥ−５６９８を用いて得られ、これは、ＣＦＴＲ３’ＵＴＲにおいて最も保存されたＡＲＥモチーフとしてインシリコで確認された。その他のシス作用性エレメントにより、成人細胞株におけるＣＦＴＲの３’ＵＴＲの抑制活性が説明されるかもしれない。TargetScan（http://www.targetscan.org/）、Pictar（http://pictar.mdc-berlin.de）、miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）、及びmiRDB（http://mirdb.org/miRDB/）を用いた計算予測により、ＣＦＴＲ３’ＵＴＲにおける１３の推定ｍｉＲＮＡ結合モチーフが検出される。既に研究されている８つのｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲ−１４５は、結腸及び膵細胞株におけるＣＦＴＲ発現の制御に関与している（Gillen AE et al. Biochem J, 2011）。

次いで本発明者らは、肺細胞におけるＣＦＴＲの転写後制御におけるｍｉＲＮＡの役割を、前駆体によるトランスフェクション後にルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて評価した。ＭｉＲ−６６５、ｍｉＲ−３８３、及びｍｉＲ−１２９０は、いずれの細胞型にも効果を誘導しなかったが、ｍｉＲ−６００は、検討した全ての細胞で、ルシフェラーゼ活性に影響した。ＭｉＲ−５０５、ｍｉＲ−９４３、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３８４、ｍｉＲ−１０１、及びｍｉＲ−１２４６は、Ａ５４９及び／又はＢｅａｓ−２Ｂにおいてルシフェラーゼ活性の低下を誘導したが、ＨＢＥｐｉＣでは誘導しなかった。同族の（cognate）シスエレメントの重要性を確認するために、本発明者らは、ＣＦＴＲの転写後制御に対する最大の効果をもたらすｍｉＲ−５０５及びｍｉＲ−１０１の両方の結合に対するモチーフを変性した。このような２か所の変性部位が、ルシフェラーゼ活性の中程度の増加と関連していたが、成人肺細胞においてのみであった。次に本発明者らは、成人肺細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子の転写後制御に対するｍｉＲ−１０１の抑制的作用を評価した。ｍｉＲ−１０１前駆体の過剰発現が制御された。

これまでの研究では、ｍｉＲＮＡが介在する制御には、ＡＲＥ配列の存在が必要であることが証明されている（Jing Q et al. Cell, 2005; Sun G et al NAR, 2010; Glorian V et al. Cell Death Differ, 2011）。ｍｉＲ−１０１及びｍｉＲ−６００結合部位は両方とも、ＡＲＥ−６０７４モチーフと重なり、ｍｉＲ−３８４結合部位は、ＡＲＥ−５６９８モチーフと重なる。ｍｉＲＮＡ結合の影響が、ＡＲＥモチーフの完全性（integrity）に依存するのかどうかを検討するために、我々は、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−６００、及びｍｉＲ−３８４前駆体と、野生型又は変性ＣＦＴＲ３’ＵＴＲを含有する構築物によるコ・トランスフェクションアッセイを行った。そのシード領域に相同性であるＣＦＴＲ配列の変性、及びＡＲＥ−６０７４の抑止の両方の後に、ｍｉＲ−１０１のみが、ルシフェラーゼ活性に対する抑制的効果を失った。ＡＲＥ−６０７４及びＡＲＥ−５６９８の変性は、ｍｉＲ−６００及びｍｉＲ−３８４の活性にそれぞれ影響しなかった。

これらのデータは、ＣＦＴＲ発現の緊密に制御された発生制御にｍｉＲＮＡが関与していることを証明しており、より詳細には、ｍｉＲ−１０１が、重なり合うＡＲＥモチーフと共同してその同族部位に直接作用することを証明している。

嚢胞性線維症の重大な制御因子の同定から新たな可能性のある治療ツールの試験まで
ｍｉＲ−１０１結合部位及びＡＲＥ−６０７４を包含する領域は、ｍｉＲ−１０１の制御作用にとって重大である。そこで、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−６００、ｍｉＲ−１４５、及びｍｉＲ−３８４を含む幾つかのｍｉＲＮＡの、ＣＦＴＲ遺伝子の３’ＵＴＲへの結合を防止するために、ｍｉＲＮＡ結合ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＭＢＢＯ）を設計した。これらのＭＢＢＯを、レポーター遺伝子とコ・トランスフェクションして使用することにより、各種細胞株においてルシフェラーゼ活性が１．５〜６倍過剰発現されるに至った（図１Ａ）。ＭＢＢＯ−１による内因性ＣＦＴＲレベルの上昇が、肺細胞において確認された（図１Ｂ）。

次に、インビボでのＭＢＢＯの効果を評価するために、本発明者らは、対照の個体と、ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌホモ接合型ＣＦ患者とに由来するヒト鼻細胞から培養した再構築ＡＬＩ上皮へ、ＭＢＢＯを導入した。対照オリゴヌクレオチド、ＭＢＢＯ−１又はＭＢＢＯ−２を、トランスフェクション試薬なしで一次鼻細胞（primary nasal cell）の頂端側に添加した。３７℃で２時間後、頂端側培地を除去して、気液境界面を復元した。新たに調製した対照オリゴヌクレオチド又はＭＢＢＯのいずれかの適用を２日毎に繰り返した。ＭＢＢＯ−１の使用により、対照においては、内因性ＣＦＴＲ転写物レベルが２〜６倍上昇し（図１Ｃ）、患者では２〜３倍上昇し（図１Ｄ）、ＭＢＢＯ−１を繰り返し導入した回数による顕著な改善は誘導されなかった。図１Ｅは、ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌホモ接合型ＣＦ患者から培養したＡＬＩ上皮における処置２４時間後のＭＢＢＯ−１、ＭＢＢＯ−２、及びＭＢＢＯ−３のボックスプロットを表す（図１Ｅ）。免疫ブロットアッセイによっても、ＣＦ患者から培養したＡＬＩ上皮におけるＭＢＢＯ−１、ＭＢＢＯ−２、及びＭＢＢＯ−３の両方により処理された上皮においてＣＦＴＲタンパク質がより強度に発現されたことが示された。機能的アッセイにより、野生型１６ＨＢＥｏ−と比較してＣＦＢＥ４１ｏ−細胞では、ＣＦＴＲ依存性アニオン移送が存在しないことが示された。反対に、免疫ブロットにより検出される機能的ＣＦＴＲ量によると、非処理ＣＦＢＥと比較してＭＢＢＯで処理されたＣＦ細胞では、アニオン移送レベルの顕著な増大が観察された。

これらのデータは、天然細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子の制御におけるｍｉＲ−１０１及びｍｉＲ−１４５結合部位を包含する領域の重要性を支持しており、ＣＦ治療学のための新たな見識が提供される。

考察
本明細書においては、本発明者らは、ｍｉＲ−１０１及びｍｉＲ−１４５を含むｍｉＲＮＡが、成人肺細胞におけるＣＦＴＲ転写物のレベルを負に制御する一方、胎児の肺細胞において効果を有しないことを示した。興味深いことに、ｍｉＲ−１０１は、成熟肺細胞におけるその特異的な役割に加えて、膵細胞株におけるＣＦＴＲｍＲＮＡの安定性には影響しない（Gillen AE et al. Biochem J, 2011）が、胎児腎細胞株においてはルシフェラーゼ活性の低下を招く（Mergiorni F et al Plos One, 2011）と報告されており、組織特異的因子としての役割を有する可能性が示唆されている。本発明者らは、ＣＦＴＲ発現の緊密に制御された発生制御にｍｉＲＮＡが関与することを証明し、より詳細には、ｍｉＲ−１０１が、重なり合うＡＲＥモチーフと共同して、その同族部位に作用することを証明した。

本明細書においては、本発明者らはまた、制御因子を特徴付けすることにより、新規の治療標的を同定するという利点を証明した。加えて、早期の研究により、６〜１０％と低いＣＦＴＲ転写物の補完により、上皮における正常な塩素イオン移送を保持するのに十分なＣＦＴＲレベルを生じさせることが示された（Sinn PL et al. Hum Mol Genet, 2011）。これらのデータは、重度の突然変異のシスでは、ＣＦＴＲプロモーターにおいて自然に発生する配列の変動の存在（これが、転写を増大させる）により、十分なＣＦＴＲタンパク質が頂端膜細胞に到達することが可能となり、部分的機能が回復され、このようにして中程度のＣＦ表現型が誘導されるという知見により支持されている（Romey MC et al. JBC, 2000）。より最近では、ｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌ ＣＦＴＲタンパク質の量の増加が、活性化されたｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌ ＣＦＴＲチャンネル活性と関連している（Hutt DM et al. Nat Chem Biol, 2010）。最近の研究では、可能性のある治療ツールとして、ｍｉＲ−１３８ミミックを使用することにより、ＣＦＴＲ−Ｐｈｅ５０８ｄｅｌ及び機能的Ｃｌ−移送が回復されることが証明されている（Ramachandran S et al. PNAS, 2012）。ｍｉＲ−１３８は、多くの遺伝子を制御する高度に保存された転写抑制因子であるＳＩＮ３を標的とするので、筆者らは、ｍｉＲ−１３８ミミックの使用が、望ましくない作用を有しうることを強調している（Ramachandran S et al. PNAS, 2012）。本明細書において、発明者らは、ＣＦＴＲ遺伝子を特異的に標的とする新規の推定上の治療ツールを試験した。本発明者らは、ｍｉＲ−１０１及びｍｉＲ−１４５に注目して、ＭＢＢＯオリゴヌクレオチドを設計し、ＣＦＴＲ３’ＵＴＲにおけるそれらの結合部位を認識した。この遮断により、最も重度な突然変異であるホモ接合性のｐ．Ｐｈｅ５０８ｄｅｌを有するＣＦ患者でのｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの上昇を介して、ＣＦＴＲチャンネル活性の改善がもたらされた。ｍｉＲ−１０１及びｍｉＲ−１４５のノックダウンが、癌の進行（Varambally S et al. Science, 2008）及び肺癌（Guan P et al. J Exp Clin Cancer Res, 2012）をもたらすエピジェネティックな経路の調節不全と関連しているため、同族ＣＦＴＲｍＲＮＡモチーフへの結合を遮断する本発明者らのアプローチは、ＣＦＴＲ転写物を安定化し、十分な機能タンパク質を完全に提供しており、ＣＦ患者の表現型を改善することによる治療上の利益を有しうる。

実施例２
材料及び方法
ＴＳＢオリゴヌクレオチド配列
ＴＳＢ１：ＧＴＴ ＧＧＴ ＡＣＴ ＴＣＴ ＧＴＡ ＡＴＡ
ＴＳＢ２：ＡＣＣ ＴＴＡ ＣＴＴ ＡＴＡ ＴＣＴ ＣＡＡ

インシリコ分析
まず、２種類の異なる計算アルゴリズム（(HSF及びMaxEnt）及びNNSplice （http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html；Neural Network又はSSPNNによるSplice Site Prediction）を含むHuman Splicing Finder 2.4.1（http://www.umd.be/HSF/HSF.html）を用いて、ＣＦＴＲ変異体を分析した。我々は、突然変異配列において新規のスプライシング部位が予想された場合、又は最適以下の既存のｓｓのスコアが、劇的に上昇した場合に、異常なスプライシングが起こりうると推定した。我々はまた、SpliceAid 2データベース（http://193.206.120.249/splicing_tissue.html）を用いて、野生型（ｗｔ）及び突然変異配列を評価した。

次いで我々は、選択した哺乳動物の一連の相同分子種において、置換により影響されるヌクレオチド位の保存を評価した。我々はまず、www.phylogeny.frにおいて入手できるMUSCLE3.7アルゴリズムを用いて、ＣＦＴＲのヒトゲノム配列（ＮＣ＿０００００７．１３）を、Ｅｎｓｅｍｂｌ由来の９種の脊髄動物の相同分子種と整列させた。Jalviewソフトウエア（http://www.jalview.org/）による多重アラインメントを分析することにより結果が得られ、これをｗｔ及び変種ヌクレオチドのパーセントとして示す。ヒトＣＦＴＲを含む１９のＣＦＴＲ相同分子種の多重アラインメントの視覚化によるより広範囲な分析が、Multiz Alignmentsツールを用いてＵＣＳＣから得られた。ｗｔヌクレオチドは、その頻度が９０％よりも高い場合に、高度に保存されており、５０〜９０％の間で中程度に保存されており、その頻度が５０％未満であるか、及び／又は突然変異ヌクレオチドが少なくとも１０％の頻度で確認された場合に、ほとんど保存されていないと考えられた。

スプライシングレポーター構築物
新たに発見された変種のスプライシングに対する効果を、ｐＳＰＬ３エキソン捕捉ベクター（Dr I. Bottilloから恵与）を用いて試験した。我々は、患者のゲノムＤＮＡ（５ng/μlに希釈した）及びHigh Fidelity Phusion（登録商標）ポリメラーゼ（Finnzymes, Espoo, Finland）を用いて、イントロン１２（旧命名法では、イントロン１１）中の目的のＣＦＴＲ配列（６３２bp）を増幅した。T4 DNA ligase High Concentration（Invitrogen, Villebon sur Yvette, France）を、製造業者の指示に従って用いて、ＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ制限部位の間のｐＳＰＬ３にアンプリコンを挿入した。野生型（ｗｔ）及び突然変異（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ）ミニ遺伝子に加えて、ＳＮＰであるｃ．１６８０−８７０Ｔ＞Ａ（異常なスプライシングに対する陰性対照）又はスプライシング突然変異であるｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ（１８１１＋１．６ｋｂ Ａ＞Ｇ）（異常なスプライシングに対する陽性対照）を有する２種のその他のＣＦＴＲミニ遺伝子を発生させた。プライマー配列はすべて、要望に応じて入手可能である。ミニ遺伝子構築物の配列は、サンガー配列決定法により確認した。

細胞培養、トランスフェクション、及び標的部位ブロッカー（ＴＳＢ）処置
ヒト気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、既に報告されているように培養した（Rene C et al. Cell. Mol. Life Sci. 2010）。トランスフェクションの２４時間前に細胞を６ウエルプレートに蒔き、約８０％のコンフルエンスで一度、PolyFect（登録商標）トランスフェクション試薬（Qiagen, Courtaboeuf, France）を用いてそれぞれのミニ遺伝子構築物１．５μgにより一過性のトランスフェクションをした。４８時間後の転写物の分析のために細胞を回収した。ＴＳＢ（ＴＳＢ１及びＴＳＢ２）処置については、Interferin（登録商標）トランスフェクション試薬（Polyplus, Ozyme, Illkirch, France）を用いて、細胞を、ＣＦＴＲミニ遺伝子構築物、及び２５nM、５０nM、１００nm、又は１μM ＴＳＢによりコ・トランスフェクションした。

転写物の分析
RNeasy Plus kit（Qiagen）を用いて、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞から全ＲＮＡを抽出した。全ての実験条件において、少なくとも２回の独立したコ・トランスフェクションを行った。スプライシングに対する影響を、既に報告したように試験した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物もまた、ABI-3130XL Genetic Analyzerにおいて、Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用いて配列決定した。ピーク面積（GeneMapperソフトウエアにより評価した）を測定し、同じＰＣＲ反応において検出された全ピーク面積の合計で割ることにより、それぞれのＣＦＴＲスプライシング生成物の相対量を決定した。

患者の鼻細胞及び２人の非ＣＦ対照から、RNeasy Plus kit（Qiagen）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡ５００ngから、MMLV-RT（Invitrogen）により逆転写物を生成した。各ＲＴ−ＰＣＲ １μｌを、イントロン１２（ｆ１１−ｒ１３）を含むプライマー、及びプソイドエキソン、ＰＥ（ｆ１１−ｒＰＥ）を増幅する特異的プライマー対によるＰＣＲ増幅に用いた。

結果
疾患を惹起することが推定される新たな突然変異の同定
ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ変異（イントロン１２に位置；染色体座位：１１７，２２９，５２４；ｈｇ１９）の効果を探求するために、突然変異配列について、ドナー（５’ｓｓ）及びアクセプター部位（３’ｓｓ）のインシリコ予測を生成した。突然変異は、イントロン１２において、新たなハイスコア５’ｓｓを生成させ、この部位を、選択的スプライシングに用いることができることが示唆された。新たに同定された、疾患を惹起することが推定される突然変異ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇは、成熟転写物におけるＰＥの包含を起こすドナー部位を創出する周知のスプライス突然変異［ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ（１８１１＋１，６ｋｂＡ＞Ｇ） Chillon M et al. Am J Hum Genet, 1995］からは３ヌクレオチド離れている。別の観点から、Sanger配列決定分析により２００の対照染色体において、突然変異を試験したが、確認されなかった。

スプライシングレポーターアッセイを患者の鼻細胞において用いた、ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇイントロン突然変異の確認
我々は次に、スプライシングレポーターアッセイを用いて、スプライシングに対するｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ変異の影響を試験した。ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ変異（陽性対照として用いた）を有するミニ遺伝子によりＢＥＡＳ−２Ｂ細胞をトランスフェクションした場合（４９bpのイントロン配列（潜在性エキソン包含、ＣＥＩ）の包含を惹起する）、異常にスプライシングした転写物は、全（野生型＋異常にスプライシングした）ＣＦＴＲｍＲＮＡの約９０〜９５％であった。反対に、中性の変異であるｃ．１６８０−８７０Ｔ＞Ａ（陰性対照）を有するミニ遺伝子のトランスフェクションは、スプライシングに対する効果を有しなかった。最後に、新たに同定されたｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ突然変異を有するミニ遺伝子のトランスフェクションは、プソイドエキソン（ＰＥ）の活性化をもたらし、Sanger配列決定によって示されるように、５３bpの追加の配列の包含と、ｗｔＣＦＴＲ転写物の完全な消失をもたらした。

我々は次に、この突然変異が、ファミリートリオアナリシス（family trio analysis）に含まれるＣＦ患者由来の鼻細胞における配列保存を誘導するかどうかを調べた。そこで、我々は、ＰＥに対する非特異的及び特異的プライマー対（それぞれｆ１１−ｒ１３及びｆ１１−ｒＰＥ）を用いて、ＰＣＲ増幅により、患者が、対照と比較して、イントロン１２における５３bpのＰＥの包含を有することを確認した。

標的部位ブロッカー（ＴＳＢ１及びＴＳＢ２）を用いたＣＦＴＲの異常なスプライシングの改善
我々は、ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ及びｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ突然変異によって惹起される異常なスプライシングを改善するために、３’ｓｓ（アクセプター部位）及び５’ｓｓ（ドナー部位）それぞれへのアクセスを遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＴＳＢ１及びＴＳＢ２）を設計した。異常なスプライシングに対するＴＳＢ濃度の効果を決定するために、ヒト気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、２つの突然変異を有するミニ遺伝子、及び４種の異なるＴＳＢ濃度（２５nM、５０nM、１００nM、１μM）で２４時間コ・トランスフェクションした。３’ｓｓ（アクセプター部位）を標的とするＴＳＢ１は、ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ及びｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ突然変異によって惹起される異常なスプライシングに対して、低濃度（５０nM）で顕著な改善効果を有していた（図２Ａ、それぞれ上及び下のパネル）。ＴＳＢ１特異性は、ＴＳＢ対照（ＣＴＬ）を用いて確認した。ｗｔのスプライシングの回復の効率は、フラグメント分析ＰＣＲにより定量した（図２Ｂ）。我々は次に、５０nM ＴＳＢ１をトランスフェクションし、２４時間、４８時間、及び７２時間後に細胞を回収することにより経時的実験を行った。２４時間後で既に顕著な効果が明らかであった（図２Ｃ）。特に、定量により、異常にスプライシングされた転写物のパーセント（潜在性のエキソンを含む）が、全ＣＦＴＲｍＲＮＡ（野生型＋異常にスプライシングされた転写物）の４５％（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ）及び３０％（ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ）まで低下したことが示された。したがって、５０nM ＴＳＢ１による２４時間のトランスフェクションにより、正常なＣＦＴＲｍＲＮＡの５５％及び７０％の回復がそれぞれ誘導された（図２Ｄ）。最後に我々は、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞での両方のＴＳＢ（ＴＳＢ１及びＴＳＢ２）の作用時間を評価し、トランスフェクション培地を洗い落とした７２時間後でもスプライシングに対する強力な効果を有していた（１６時間のインキュベーション）（図２Ｅ）ことを認めた。ＴＳＢ１（１００nMで２４時間）により誘導された正しくスプライシングされたＣＦＴＲｍＲＮＡの部分的回復は、対照の個体から得られた鼻一次培養物において確認された（図２Ｆ）。ＴＳＢ２については、スプライシングに対して作用するにはより高い濃度が必要であった（図３）。

考察
報告された１９７６個のＣＦＴＲ突然変異のうち、２２８個（１１．５４％）が、プレｍＲＮＡのスプライシングに影響すると考えられる（www.genet.sickkids.on.ca/）。ほとんどのスプライシング突然変異は、基準のスプライス部位の配列を妨害し、エキソン認識を完全に無効にし、及び／又は正しくスプライシングされた転写物がほぼ完全に消失することを招いた。現在では、ＣＦ突然変異の２〜５％がまだ知られておらず、多分、イントロンの深部に位置しており、異常なスプライシング事象を誘導している。ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇを有するＣＦ患者由来の鼻細胞についての機能的分析、ミニ遺伝子のスプライシングアッセイ、及びＰＣＲにより、このイントロン深部の突然変異が、ＰＥ包含に関与するイントロン１２において、新たなハイスコアの５’ｓｓ（ドナー部位）を発生させたことが示された。興味深いことに、この突然変異は、別の既に同定されているイントロン深部の突然変異であるｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ（これも、プソイドエキソンＰＥの包含を誘導する）と近接しており、このイントロン領域が、突然変異する傾向にあることが示唆された。ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ突然変異は、ヨーロッパの南西部では３．４％、フランスでは０．２％の頻度で発生する（Federici S, 2001）。反対に、ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇは、これまで報告されていなかったが、ここでは３人の関連のない患者で同定された。

本研究の最終目的は、ＣＦの処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計であった。実際、プレｍＲＮＡスプライシングのアンチセンス改変によるＰＥ包含は、個別化遺伝子医療の一種を表している。標的部位へのアクセスを遮断するオリゴヌクレオチド（標的部位ブロッカー、ＴＳＢ）の開発により、その他の遺伝疾患にも新たな治療の機会が提供される（Webb TR et al.Hum Mol Genet 2012, Nuzzo F et al. Blood, 2013）。ここでは、我々は、ＣＦＴＲ遺伝子におけるイントロン深部の突然変異（ｃ．１６８０−８８３Ａ＞Ｇ及びｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ）によって惹起された異常なスプライシングを改善するために、このアプローチを用いた。気管支ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞における異常なスプライシングの改善に対するＴＳＢの効果は、速やかで、長い時間をかけて維持されるので、ＴＳＢは、ＣＦＴＲ遺伝子においてイントロン深部の突然変異を有するＣＦ患者における治療ツールになり得ることが示唆された。ＴＳＢは、正常な転写物を回復するからである。ＣＦ患者については、ｃ．１６８０−８８６Ａ＞Ｇ突然変異は、ヨーロッパ南西部では４番目に多く（３．４％）、正常な機能に必要な機能的ｍＲＮＡ、そしてＣＦＴＲタンパク質の閾値は、極めて低く、５％と推定されている（Ramalho AS et al. Am J Respir Cell Mol Biol 2002）ため、これらのデータは特に興味深い。可能であれば、本研究で試験した両方の突然変異を有するＣＦ患者由来の気道細胞においてこれらのＴＳＢを試験し、またＣＦＴＲにおけるその他のイントロン性スプライシングの突然変異についてＴＳＢを評価できれば興味深いであろう。

参考文献
本願を通して、各種の参考文献が、本発明が関連する技術の水準を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本発明の開示に組み入れられる。

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Claims (11)

1. 配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選択される核酸配列からなるオリゴヌクレオチド。
2. ＣＦＴＲ関連疾患を予防又は治療するための医薬の製造における請求項１記載のオリゴヌクレオチドの使用。
3. ＣＦＴＲ関連疾患が、嚢胞性線維症、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺がん、輸精管の先天的欠損（ＣＡＶＤ）、突発性慢性膵炎（ＩＣＰ）、気管支拡張症からなる群より選択される、請求項２に記載の使用。
4. 嚢胞性線維症を予防又は治療するための医薬の製造における請求項１記載のオリゴヌクレオチドの使用。
5. 該医薬が、１又はそれ以上の抗ＣＦＴＲ関連疾患薬と組み合わせて投与される、請求項２に記載の使用。
6. ＣＦＴＲ関連疾患が、嚢胞性線維症、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺がん、輸精管の先天的欠損（ＣＡＶＤ）、突発性慢性膵炎（ＩＣＰ）、気管支拡張症からなる群より選択され、抗ＣＦＴＲ関連疾患薬が、ＣＦＴＲコレクター又は賦活剤、ＶＸ−７７０、ＶＸ−６６１、ＶＸ−８０９、浸透圧剤、抗酸化剤、粘膜調整剤、プルモザイム、ムコミスト、気管支拡張剤、ベントリン、セレベント、抗感染性化合物、ＴＯＢＩ、アジスロマイシン、ヨサシン（Josacine）、抗炎症剤、イブプロフェン、デキサメサゾン、ジフロ（Zyflo）、及びアコレートからなる群より選択される、請求項５に記載の使用。
7. 該医薬が、１又はそれ以上の抗嚢胞性線維症薬と組み合わせて投与される、請求項４に記載の使用。
8. 抗嚢胞性線維症薬が、ＣＦＴＲコレクター又は賦活剤、ＶＸ−７７０、ＶＸ−６６１、ＶＸ−８０９、浸透圧剤、抗酸化剤、粘膜調整剤、プルモザイム、ムコミスト、気管支拡張剤、ベントリン、セレベント、抗感染性化合物、ＴＯＢＩ、アジスロマイシン、ヨサシン（Josacine）、抗炎症剤、イブプロフェン、デキサメサゾン、ジフロ（Zyflo）、及びアコレートからなる群より選択される、請求項７に記載の使用。
9. 該抗嚢胞性線維症薬又は該抗ＣＦＴＲ関連疾患薬が、アイバカフトール、ＶＸ−７７０、ＶＸ−６６１、及びＶＸ−８０９から選択される、請求項５〜８のいずれかに記載の使用。
10. 請求項１記載のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容しうる担体を含む、それを必要とする被験体におけるＣＦＴＲ関連疾患の予防又は治療において使用するための医薬組成物。
11. 請求項１記載のオリゴヌクレオチド及び薬学的に許容しうる担体を含む、それを必要とする被験体における嚢胞性線維症の予防又は治療において使用するための医薬組成物。