KR20200055723A - 인슐린 저항성 검출 및 치료용 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)의 적어도 일부에 상보적인 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 일부가 CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)의 적어도 2 내지 8 뉴클레오티드를 포함하는 것인, miR-1983 억제제.

Description

인슐린 저항성 검출 및 치료용 조성물 및 방법
관련 출원
본 발명은 　2018년 7월 13일 출원된 가출원 특허 제62/697,935호와 2017년 8월 25일 출원된 가출원 특허 제62/550,233호의 우선권을 기반으로 35 U.S.C. 119의 이익을 주장하는 PCT 출원이며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
서열 목록
2018년 8월 23일에 생성된 컴퓨터 판독 가능 형태의 서열 목록 "SequenceListing.txt"은 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 인슐린 저항성 및 치료제로서 이의 길항제의 사용과 관련된 miRNA에 관한 것이다.
시상 하부는 신체의 영양 상태 및 에너지 항상성의 주요 조절제로서 기능한다. 뉴로펩타이드 Y (NPY)/아구티(agouti)-조절 펩타이드 (AgRP)-및 프로-오피오멜라노코르틴 (POMC)-발현 뉴런은 음식 섭취 및 에너지 소비를 조정하는 것으로, 에너지 항상성을 유지하는데 중요하다. 궁상핵(ARC)에 위치하며 (Gao and Horvath, 2008; Varela and Horvath, 2012), 세 번째 심실 근처에 위치하고, 중앙 에미넌스(median eminence)에 투영하는 이러한 NPY 뉴런, 공동-발현 아구티(agouti)-관련 펩타이드 (AgRP), 및 POMC 뉴런은 말초 호르몬 및 식이 성분과 같은 순환 인자의 변화를 감지하기 위해 이상적으로 국소화된다. 이 정보는 시상 하부의 다른 핵 및 추가 뇌 영역으로 전달되어 건강한 에너지 균형을 유지한다. NPY/AgRP 또는 POMC 뉴런 집단, 특히 인슐린 및 렙틴과 같은 말초 신호에 대한 이들의 반응을 변화시키는 집단의 기능적 장애는 비만, 인슐린 저항성 및 제2형 당뇨병 (T2DM)의 발달과 관련이 있다 (Konner 및 Bruning, 2012; Roh et al., 2016).　저지방 식이를 통한 체중 감소는 비만 마우스에서 순환하는 microRNA의 차등 발현을 야기하는 것이 확인되었다 (Hsieh et al., 2015).
인슐린 저항성은 말초 조직에서 상당히 잘 정의되어 있지만, 기본 병리학은 뇌에서 덜 특징지어졌다 (Kleinridders et al., 2014).　 설치류 모델에서 뇌 인슐린 신호 전달의 연구는 식이 유발 비만 예방, 고지방 섭취에 대한 반응으로 간 글루코스 생성 조절 장애에 대한 인슐린 신호 전달의 결정적인 역할을 확인하는 것 뿐만 아니라, T2DM에서 방해되는 정상적인 백색 지방 조직 지방생성 및 지방분해를 유지하는 데 있어서 성과가 있었다 (Bruning et al., 2000; Obici et al., 2002b; Scherer et al., 2011). 　대사 조절 장애의 발달에서 뇌의 중요성을 추가로 지지하는 Clegg 등은　인슐린 저항성이 말초 조직 이전에 뇌에서 발생하고, 고지방식이 (HFD)에서 지방의 발달보다 앞선다는 것을 확립하였다 (Clegg et al., 2011). 실제로, ARC 단독의 NPY/AgRP 뉴런에서 인슐린 수용체 (InsR) 수준의 부분적인 감소조차 랫트에서 인슐린 저항성 및 섭식항진증을 유발하기에 충분하다 (Obici et al., 2002a).　가장 최근 동안,　특히 NPY 뉴런에서 인슐린 신호전달은 음식 섭취 및 에너지 균형의 제어에 결정적인 것으로 밝혀졌다 (Loh et al., 2017).　따라서, 중앙 인슐린 신호 전달의 손상은 잠재적으로 말초 인슐린 저항성의 발달을 위한 침전 인자(precipitating factor)로서 작용하지만, 이 병리가 일어나는 메커니즘은 여전히 연구되고 있다.
인슐린 저항성을 유발할 수 있는 고인슐린혈증(Hyperinsulinemia)은 또한 비만과 독립적으로 발생할 수 있다 (Rizza et al., 1985).　예를 들어, 높은 수준의 인슐린에 노출된 NPY/AgRP 뉴런 세포 모델은 8-24 시간 사이에 인슐린 저항성을 갖게 된다는 것이 입증되었다 (Mayer and Belsham, 2010a).　InsR 및 InsR 기질-1 (IRS-1)의 mRNA 수준이 아닌 단백질 수준의 감소는 관찰된 폐 세포(abolished cellular) 신호전달에 대해 인정되었다.　프로테아솜(proteosomal) 및 리소좀(lysosomal)의 경로는 각각 장기간 인슐린 노출시 IRS-1 및 InsR 분해와 관련이 있다.　유사하게, POMC 발현 뉴런 세포 모델은 또한 이 패러다임으로 인슐린 저항성을 발달시키는 것으로 밝혀졌다 (Nazarians-Armavil et al., 2014). 이러한 실험은 시상 하부 세포에서 높은 인슐린 노출 시 인슐린 신호 전달 경로의 주요 단백질이 분해 될 수 있는 수단을 설명하였다.
본 발명의 일 측면에 따르면, CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)의 적어도 일부에 상보적인 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 일부가 CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)의 적어도 2 내지 8 뉴클레오티드를 포함하는 것인, miR-1983 억제제를 제공한다.
실시예에서, mIR-1983 억제제는 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, miR-1983억제제 및 희석제를 포함하는 조성물이다.
또 다른 측면에 따르면, miR-1983의 수준을 측정하는 것 및 역치 또는 대조군과 비교하는 것을 포함하는, 세포가 인슐린 저항성인지를 검출하는 방법이며, 여기서, 대조군과 비교하여 증가된 수준은 세포가 인슐린 저항성인 것을 나타낸다.
다른 측면에 따르면, 대상체의 생물학적 샘플에서 miR-1983의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대상체에서 당뇨병 전증 또는 당뇨병 발생의 증가 가능성을 검출하는 방법이며, 여기서, 역치 또는 대조군과 비교하여 증가된 수준은 대상체가 당뇨병 전증 또는 당뇨병 발생의 증가 가능성을 가지는 것을 나타낸다.
다른 측면에 따르면, miR-1983 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 인슐린 민감도를 개선시키는 방법이 있다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다. 그러나, 개시의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정은 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 본 개시의 바람직한 실시예를 나타내는 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 예시의 방식으로 주어진 것으로 이해되어야 한다.
이하, 도면과 관련하여 실시예를 설명하도록 한다:
도 1은 인슐린 저항성의 유도시 mHypoE-46 세포주에서 변경된 것으로 밝혀진 miRNAs의 마이크로어레이(n=3) 및 qPCR 검증(n=4-5)을 도시한 것이다. 도 1A는 miR-1983을 도시한 것이고, 도 1B는 miR-20a-3p를 도시한 것이고, 도 1C는 miR-296-5p를 도시한 것이고, 및 도1D은 Let-7d-5p를 도시한 것이다. *p<0.05, ** p<0.01.
도 2는 miR-1983이 성체 세포주에서 조절되고 인슐린 치료시 영구적으로 상향 조절되지 않음을 보여준다. 성체 도 2A 암컷 mHypoA-NPY/GFP (n=3-7) 및 도 2B 수컷 mHypoA-POMC/GFP-2 (n=8-16) 세포주 둘 모두에 대해서 인슐린 저항성은 miR-1983에서 차등적 변화를 유도하지만, miR-20a-3p에서는 아니다. 도 2C mHypoE-46 세포에서 miR-1983 상향 조절은 48 시간 후에 부재하지만, InsRβ-서브유닛 단백질 수준의 손실은 지속된다 (n=8). 표시된 데이터는 평균 ± s.e.m이다. *P<0.05, ** P<0.01, **** P<0.0001.
도 3은 miR-1983의 mRNA 표적의 인실리코 및 시험 관내(in vitro) 분석을 도시한 것이다. 도 3A는 관심있는 miR-1983 유전자 표적을 평가하기 위한 인실리코 분석 워크 플로우 개략도를 나타내고, 및 도 3B는 마우스에서 인슐린 수용체 (Insr) 3'비해석부위(3'UTR)(위) 및 miR-1983에 대한 Insr 3'UTR 서열 표적 영역의 보존 종간 정렬(conserved cross-species alignment)(아래)의 표적 스캔 분석이다. 도 3C는 miR-1983 miRNA 미믹 (25 nM)을 mHypoE-46 세포 내로 24 시간 동안 트랜스펙션시킨 후 Insr의 mRNA 수준이 변경되지 않음을 나타낸다 (n=4). 도 3D InsRβ 단백질 수준은 miR-1983 miRNA 미믹(25 nM)을 mHypoE-46 세포 내로 24 시간 동안 트랜스펙션시킨 후 감소된다 (n=4). 도 3E miR-1983 miRNA 미믹 (25 nM)을 mHypoE-46 세포 내로 48시간 동안트랜스펙션시킨 후 Insr의 mRNA 수준은 변경되지 않은 반면(n=4), miR-1983 miRNA 미믹 (25 nM)을 mHypoE-46 세포 내로 48시간 동안 트랜스펙션시킨 후 InsRβ 단백질 수준은 감소된다 (n=4). 도 3F ~ 3000 bp 3'Insr-UTR 서열과 miR-1983 미믹 (25 nM)을 동시에 함유하는 pmirGLO 벡터 (1 μg)의 트랜스펙션(n=3-4 독립적인 실험/그룹, 각각 3회 반복). * 나타낸 데이터는 평균 ± s.e.m이다. P<0.05, ** P<0.01.
도 4는 뉴로펩타이드 mRNA 수준에서 유사한 변화를 보여줌에도 불구하고, miR-1983이 7-9주 동안 HFD를 공급받은 수컷 C57BL/6 마우스의 시상 하부에서 상향 조절되나 암컷은 그렇지 않음을 보여준다.　7-9주 동안 60% HFD를 공급받은 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스는 수크로스-매칭 대조 식이(Chow)와 비교하여 체중(도 4A, n=4-7/그룹) 및 공복 혈당 (도 4B, n=3-7/그룹)이 증가하였고, Npy, AgRP 및 Insr에서 유사한 변화를 나타내지만, Pome 발현은 나타내지 않았다(도 4C 및 D, n=7-8/그룹). 오직 수컷 C57BL/6만이 공복 인슐린 및 시상 하부 miR-1983 수준에서 증가를 보였다(도 4E 및 F, n=7-8/그룹), *p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001. 나타낸 데이터는 평균 ± s.e.m이다.
도 5는 뉴로펩타이드 mRNA 수준에서의 완전한 변경에 앞서, miR-1983이 5주 후 HFD에서 수컷 CD-1 마우스의 시상 하부에서 상향 조절되나, 10주 후에는 그렇지 않음을 보여준다.　수크로스-매칭 대조 식이(sucrose-matched control diet)와 비교하여, 5주 동안 60% HFD를 공급받은 마우스는 순환 공복 혈당 (도 5A, n=4/그룹) 및 인슐린 수준 (도 5B, n=8/그룹)이 증가했다. miR-1983의 발현은 Npy, AgRP, Pomc, 또는 Insr mRNA 수준(도 5D, n=8-14/그룹)에서 변경 없이, 이러한 마우스의 시상 하부에서 증가했다(도 5C, n=9-12). 10주 동안 동일한 식이를 공급받은 CD-1 마우스는 시상 하부 miR-198의 수준이 증가하지 않았지만 (도 5E, n=10-11/그룹), mRNA에서 Npy 및 AgRP의 감소 및 Pome mRNA의 증가를 보였다. 변화없는　Insr mRNA 존재가 검출되었다 (도 5F,　n=8-11/그룹).　나타낸 데이터는 평균 ± s.e.m, *p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001이다.
도 6은 60% HFD를 5주 동안 공급받은 CD-1 암컷 마우스의 시상 하부에서 miR-1983이 상승하지 않았으나, 수컷 마우스는 신장에서 수준 감소와 함께 시상 하부 및 혈청에서의 상향 조절을 보여준다. 두 성별 모두 대조군 및 60% HFD 그룹 (도 6A 및 6B, n=8-9/그룹) 둘 다에 대한 체중 증가량 및 총 체중 (도 6C, n=8-9/그룹)이 chow를 공급받은 그들의 한배 새끼와 비교하여 증가하였다.　Chow(수크로스-매칭 대조 식이) 또는 60% HFD를 공급받은 수컷 및 암컷 CD-1 마우스에 대한 4시간 공복 혈당(n=7-9/그룹) (도 6D, n=7-9/그룹). (FIG. 6E) chow(n=7-8) 또는 60% HFD(n=8)의 수컷 CD-1 마우스의 시상 하부 miR-1983 및 공복 인슐린 수준을 MKR (n=8) 마우스와 비교하였다. 수컷 (도 6F) 시상 하부 miR-1983 및 chow(n=7-8) 또는 60% HFD(n=8)의 암컷 CD-1 마우스의 공복 인슐린 수준 둘 다를 MKR (n=8) 마우스와 비교하였다. 수컷 (도 6G, n=7-9/그룹) 및 암컷 (도 6H, n=8-9/그룹) 마우스는 AgRP 또는 Pomc mRNA 양의 변화없이 낮은 수준의 Npy mRNA를 나타냈다; 그러나, Insr Mrna 수준은 오직 암컷 마우스에서 증가했다. (도 6I) 60% HFD 대 chow에 대해 근육, 신장 및 혈청 (n=5-8/그룹)에서 수컷 CD-1 마우스의 miR-1983 수준. 나타낸 데이터는 평균 ± s.e.m, *p<0.05, ** p<0.01, **** p<0.0001이다.
도 7은 5주 60% HFD 연대에 걸쳐 CD-1 마우스에서 miR-1983 억제제 또는 대조군의 생체 내 비강 내 전달이 인슐린 민감도, 공복 혈당 및 시상 하부 InsRβ- 서브유닛 단백질 수준의 변화를 유도함을 보여준다. (도 7A) 60% HFD의 마우스에 생체 내(in vivo) miR-1983 억제제 투여의 실험적 패러다임 (타임 라인). 이러한 동물들은 chow(수크로스-매칭 대조 식이)와 비교하여 체중 증가량 (도 7B, n=5-6/그룹) 및 총 체중 (도 7C, n=5-6/그룹)이 증가하는 것을 보여준다. (도 7D) 복강 내 인슐린 내성 시험 (IpITT), (4시간 fast + 인슐린/kg 체중의 1 유닛) (n=5-6/그룹). (도 7E) miR-1983 억제제의 비강 내 투여 후 2주 후 공복 혈당 수준 (n=5-6/그룹). (도 7F) 뉴로펩타이드 시상 하부 Npy, Agrp, Pomc 및 Insr mRNA 수준은 5주 후 60% HFD 그룹 둘 다에서 유사하게 감소하였다. (도 7G) InsRβ-서브유닛 단백질 서브유닛은 5주 연구 종료시 (n=5-6/그룹) miR-1983 억제제 그룹이 아닌 60% HFD의 마우스에서 감소하였다. 나타낸 데이터는 평균 ± s.e.m, *p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001이다.
도 8은 mHypoE-46 세포주에서 100 nM 인슐린 처리시 변화된 60 miRNA의 마이크로어레이 히트맵을 도시한 것이다.
도 9는 4시간 대 24시간 동안 모든 처리 그룹에 걸쳐 변경된 60 miRNAs의 벤다이어그램 그림을 도시한 것이다. 비히클 PBS 처리 (Veh) 및 100 nM 인슐린 처리 (Ins).
도 10은 4 시간 또는 24 시간 동안 100nM의 인슐린으로 처리된 mHypoE-46 세포에서 InsR의 mRNA 수준이 변경되지 않은 채로 남아 있음을 입증하는 검증 데이터를 도시한 것이다 (도 10A, n=5). 이 세포 모델은 인슐린 저항성의 특징적인 InsRβ-서브유닛 단백질 수준의 감소를 보여준다 (도 10B, n=10). 나타낸 데이터는 평균 ± s.e.m이다. **** P <0.0001.
도 11은 수컷 마우스 및 남성 및 여성 인간 대상체 둘다에서 혈청 miR-1983 수준이 순환 인슐린 수준과 상관 관계가 있음을 보여준다. (도 11A) chow (수크로스-매칭 대조 식이) 또는 60% HFD를 공급받은 수컷 및 암컷 CD-1 마우스의 총 체중 (n=8-9/그룹). (도 11B) chow 또는 60% HFD를 공급받은 수컷 CD-1 마우스에서 혈청 miR-1983 수준과 글루코스 (왼쪽) 및 인슐린 (오른쪽)의 상관 관계. (도 11C) 25 미만(<25)의 체질량 지수에 의해 분리된 인간에서의 miR-1983의 혈청 수준 (n=2, 5명의 대상체로 나타나는 SD는 검출 가능한 miR-1983의 수준이 없었음), 25-29.9 (n=8), >30 (n=9). (도 11D) 다양한 혈액 파라미터와 혈청 miR-1983 수준의 상관관계 분석 (고체 원은 통계적으로 유의미함, 전체 분석 세부 사항은 표 1 참조). (도 11E) 인간에서 혈청 miR-1983 수준과 혈청 인슐린 (왼쪽) 및 항상성 모델 평가-인슐린 저항성 (HOMA-IR) (오른쪽) 점수의 선형 회귀 분석. 달리 표시되지 않는 한, 나타낸 데이터는 평균 ± s.e.m 이다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, **** P <0.0001.
달리 정의되지 않는 한, 본 개시와 관련하여 사용된 과학 및 기술적 용어는 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형은 복수를 포함하고 복수형은 단수를 포함할 것이다. 예를 들어, 용어 "세포"는 단일 세포뿐만 아니라 복수 또는 세포 집단을 포함한다. 일반적으로, 본원에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 혼성화와 관련하여 활용되는 명명법 및 기술은 당 업계에 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것들이다 (예를 들어, Green 및 Sambrook, 2012).
본원의 종말점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포함된 모든 수 및 분수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4 및 5를 포함한다).　또한, 모든 수 및 분수는 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 추정되는 것으로 이해된다.　또한, "a", "an"및 "the"는 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다는 것으로 이해된다.　용어 "약"은 기준이 되는 수의 0.1 내지 20%, 5-20%, 또는 10-20%, 바람직하게는 5-15%, 보다 바람직하게는 5% 또는 10%를 더하거나 빼는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 및 이의 파생어는 언급된 특징, 요소, 성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 특정하는 개방된 용어로 의도되지만, 언급되지 않은 다른 특징, 요소, 구성 요소, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하는 것은 아니다. 또한 전술한 용어는 "포함하는", "갖는" 및 그 파생어와 같은 용어와 유사한 의미를 갖는 단어에도 적용된다. 마지막으로, 본 명세서에서 사용된 "실질적으로", "약" 및 "대략"과 같은 정도의 용어는 최종 결과가 크게 변경되지 않도록 변형된 용어의 합리적인 양의 편차를 의미한다. 이러한 정도의 용어는 이 편차가 이를 수정하는 단어의 의미를 부정하지 않는 경우 수정된 용어의 적어도 ±5%의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 개시의 범위를 이해하는데 있어서, 본원에 사용된 용어 "구성되는" 및 그 파생어는 언급된 특징, 요소, 성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 특정하는 폐쇄된 용어로 의도되고, 또한 다른 언급되지 않은 기능, 요소, 구성 요소, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제한다.
또한, 특정 섹션에서 설명된 정의 및 실시예는 당업자가 이해하는 바에 따라 본 명세서에서 설명된 적합한 다른 실시예에 적용될 수 있는 것으로 의도된다. 예를 들어, 다음 구절들에서, 본 개시의 상이한 양상들은 더 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각각의 양상은 달리 명확하게 지시되지 않는 한 임의의 다른 양상 또는 양상들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
본원에 사용된 "약", "실질적으로" 및 "대략"과 같은 정도의 용어는 최종 결과가 크게 변경되지 않도록 변형된 용어의 합리적인 양의 편차를 의미한다. 이러한 정도의 용어는 이 편차가 이를 수정하는 단어의 의미를 부정하지 않는 경우 수정된 용어의 적어도 ±5%의 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 자연적으로 발생하는 염기, 당 및 당간 (백본) 연결로 이루어진 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오티드 단량체의 서열을 지칭한다.　용어는 또한 비-자연적으로 발생하는 단량체 또는 이의 일부를 포함하는 변형 또는 치환된 서열을 포함한다.　본 발명의 핵산은 데옥시리보핵산 핵산 서열 (DNA) 또는 리보핵산 서열(RNA)일 수 있고, 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티미딘 및 우라실을 포함하는 자연적으로 발생하는 염기를 포함할 수 있다.　또한 서열은 예를 들어 뉴클레아제 저항성을 증가시키기 위해 변형된 염기를 함유할 수 있다.　핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다.　또한, 용어 "핵산"은 상보적 핵산 서열뿐만 아니라 코돈 최적화 또는 동의 코돈 등가물을 포함한다.　본원에 사용된 용어 "단리된 핵산 서열"은 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 때의 세포 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적 전구체, 또는 화학적으로 합성될 때의 다른 화학 물질이 실질적으로 없는 핵산을 지칭한다.　또한 단리된 핵산은 핵산이 유래된 핵산 (즉, 핵산의 5' 및 3'말단에 위치한 서열)에 자연적으로 플랭크한(flank) 서열이 실질적으로 없는 것이다. 용어 "핵산"은 또한 예를 들어 "안티센스 핵산", "안티센스 올리고뉴클레오티드", "miRNA", 항-miRNA 등을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 염기, 당 및 당간 (백본) 연결로 이루어진 뉴클레오티드 또는 뉴클레오사이드 단량체의 서열을 포함하는 짧은 핵산을 지칭하고, 단일-가닥 및 이중-가닥 분자, RNA 및 DNA를 포함한다.　전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 50개 미만의 단량체이며, 비-자연적으로 발생하는 단량체를 포함하며, 보다 전형적으로는 30개 미만의 단량체이다.　용어 "올리고뉴클레오티드"는 예를 들어, "안티센스 올리고뉴클레오티드" 및 "miRNA" 뿐만 아니라 "모르폴리노 올리고뉴클레오티드", "포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드"와 같은 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드"는 적어도 하나의 비-자연적으로 발생하는 단량체 (예를 들어, 변형된 단량체)를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.　이러한 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 비-변형된 올리고뉴클레오티드와 유사성을 가지거나 더 좋은 결합 능력을 가질 수 있다.　이 문맥에서 사용된 유사성은, 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 특정 변형이 결핍된 폴리뉴클레오티드의 20% 내에 있는 결합 특이성으로 이의 표적에 결합한다는 것을 의미한다.　화학적 변형은 잠금 핵산(LNA)에서 발견된 하나일 수 있거나 2'-플루오로(2'-F), 2'-0-메톡시에틸(2'-MOE) 또는 2'-0-메틸(2'-O-Me) 일 수 있으며, 이는 리보오스 모이어티 또는 모르폴리노의 2'위치에서의 변형이며, 여기서 6-원 모르폴린 고리가 당 모이어티 또는 포스포로티오에이트(PS) 연결을 대체하며 여기서 황은 포스페이트기의 비-브리징(non-bridging) 산소 원자 중 하나를 대체한다. 비-자연적으로 발생하는 단량체는 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 연결은 또한 상기 언급된 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드 중 임의의 것에 통합될 수 있다.　이와 같은 변형 또는 치환된 핵산은 뉴클레아제 존재 하에 증가된 안정성과 같은 특성으로 인해 자연적으로 발생하는 형태보다 바람직할 수 있다. 또한 용어는 둘 이상의 화학적으로 구별된 영역을 함유하는 키메라 핵산을 포함한다. 예를 들어, 키메라 핵산은 유리한 특성(예를 들어, 증가된 뉴클리아제 저항성, 세포 내로 흡수 증가)을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역, 또는 변형된 뉴클레오티드의 둘 또는 영역을 함유할 수 있다.
"안티센스 핵산" 또는 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 "센스" 핵산에 상보적이며, 예를 들어, miR-1983에 상보적이다. 따라서, 안티센스 핵산은 센스 핵산에 수소 결합할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 DNA, RNA 또는 화학적 유사체(예를 들어, 하나 이상의 변형된 단량체를 포함함)를 포함할 수 있으며, 이는 표적 DNA 또는 RNA에 결합한다. 안티센스 핵산 분자는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 또는 표적 RNA 또는 DNA로 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드(예, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드)를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 안티센스 핵산은 전체 표적 가닥 또는, 그 일부에만 상보적일 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같이, 안티센스 서열은 다양한 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 안티센스 서열은 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화 바이러스의 형태로 세포에 도입된 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 제조될 수 있으며, 여기서 안티센스 서열은 고효율 조절 영역의 제어 하에 생성되며, 이의 활성은 벡터가 도입된 세포 유형에 의해 결정될 수 있다. 추가적으로, 안티센스 서열은 제조사로부터 구입할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항-miR-1983 올리고뉴클레오티드"는 적어도 7 개의 뉴클레오티드 길이 및 서열 5'-3', CTCACCTGGAGCATGTTTTCT(서열번호: 1)의 적어도 뉴클레오티드 2 내지 8개에 상보적인 것을 지칭한다.　항-miR-1983은 예를 들어 DNA, RNA 또는 LNA 단량체 또는 다른 변형된 염기 또는 이들의 임의의 조합으로 구성될 수 있다.
용어 "코딩 영역"은 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 지칭하며, 이는 아미노산 잔기로 번역된다.
용어 유전자 또는 cDNA의 "비코딩 영역"은 5' 및 3'서열을 지칭하며, 이는 아미노산으로 번역되지 않은 코딩 영역에 플랭크한다 (즉, 또한 5' 및 3' 번역되지 않은 영역으로 지칭됨).
용어 "모르폴리노 단량체"는 핵산 염기, 6 원 모르폴린 고리 및 비-이온성 포스포로디아미데이트 서브유닛간(intersubunit) 결합을 포함하는 서브유닛을 지칭한다.　모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 약 25개의 모르폴리노 서브유닛의 단쇄이다.　각 모르폴리노는 리보핵산(RNA)의 염기-쌍 표면의 작은 (~25개의 염기) 영역을 차단한다.
본원에 사용된 용어 “세포”는 복수의 세포를 포함하고 세포주를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "세포주"는 시험관 내에서 무기한 동안 번식되는 유전적으로 균일한 불멸 세포의 그룹을 지칭한다.　세포주는 단일 클론(예, 단일 클론 세포주) 또는 하나 이상의 클론(예, 폴리클론 세포주)으로부터 유래할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 유래된 유체 또는 조직 샘플의 샘플을 지칭한다.　유체 샘플의 예에는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 척수액, 림프액, 눈물, 타액, 가래 및 젖이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.　조직 샘플의 예는 뇌 조직 샘플 또는 신경 조직 샘플을 포함한다.　이와 같은 생물학적 샘플을 얻는 방법은 당 업계에 공지된 표준 혈액 검색 절차를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "방법"은 공지되거나 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차로부터 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실무자에 의해 쉽게 개발되는 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하는 주어진 과업을 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 지칭하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 인슐린 저항성으로의 진행을 늦추거나 역전시키는 것과 같은, 병태의 진행을 폐지, 실질적으로 억제, 둔화 또는 역전시키는 것, 실질적으로 인슐린 민감도 개선과 같은 병태의 임상적 또는 심미적 증상 개선 또는 실질적으로 병태의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 예방하는 것을 포함한다.
본원에 사용된, 용어 "투여"는 비강내 투여 경로와 같은 유효 경로에 의해 유효량의 miR-1983 억제제를 포함하는 조성물과 같은, 작용제(agent)를 대상체에게 제공하거나 공급하는 것을 의미한다.
본원에 사용된, 용어 "유효량"은 병태의 징후 또는 증상을 감소시키거나 제거하는 것과 같이, 원하는 반응을 생성하기에 충분한 miR-1983 억제제와 같은, 작용제의 양을 지칭한다.　일부 실시예에서, "유효량"은 임의의 장애 또는 질병의 하나 이상의 증상 및/또는 근본적인 원인을 치료(예방 포함)하는 것이다.　유효량은 예컨대 인슐린 저항성 또는 당뇨병 전증과 관련된 하나 이상의 징후 또는 증상과 같은 특정 질병 또는 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상의 발달을 예방하는 양을 포함하는, 치료학적 유효량일 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "상보성"은 제1 핵산과 제2 핵산 사이의 핵염기 쌍 형성 능력을 의미한다.
본원에 사용된, 용어 "인슐린 민감도"는 세포가 호르몬 인슐린의 정상적인 작용에 반응하는 생리학적 조건을 지칭한다.　이는 세포가 인슐린의 정상적인 작용에 반응하지 않는 생리적 조건인 인슐린 저항성과 대조적인 것이다.　따라서, 세포, 조직, 또는 대상체에서 "인슐린 민감도 개선"은 기준 수준 (예를 들어, 방법 및/또는 작용제를 사용하기 전의 인슐린 민감도)과 비교하여 세포, 조직 또는 대상체에서 인슐린 민감도의 증가를 의미한다.
본원에 사용된, 용어 "잠금 핵산"은 이환식 RNA 유사체를 지칭하는 것으로, 이는 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지의 도입에 의해 리보스가 C3'-엔도 형태로 잠금된 것이다.　바람직한 LNA 모노머 및 이들의 합성 방법은 또한 미국 특허 제6,043,060호, 제6,268,490호, PCT 공개 WO 01/07455, WO 01/00641, WO 98/39352, WO 00/56746, WO 00/56748 및 WO 00/66604 뿐만 아니라 다음의 논문에 개시되어 있다: Morita et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12(1):73-76, 2002; Hakansson et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11(7):935-938, 2001; Koshkin et al., J. Org. Chem. 66(25):8504-8512, 2001; Kvaerno et al., J. Org. Chem. 66(16):5498-5503, 2001; Halkansson et al., J. Org. Chem. 65(17):5161-5166, 2000; Kvaerno et al., J. Org. Chem. 65(17):5167-5176, 2000; Pfundheller et al., Nucleosides Nucleotides 18(9):2017-2030, 1999; 및 Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(16):2219-2222, 1998.
용어 "믹스머(mixmer)”는 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 둘 다를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.　그러나, 5개 초과의 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 인접한 서열(contiguous sequence)은 존재하지 않는다.
용어 “A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A” (서열번호: 2)는 상기 서열의 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A"는 miRNA-유도 침묵화 복합체(miRNA--Induced Silencing Complex)와 연관된 mi-1983의 상보적 가닥이다.
본원에 사용된, 용어 "미스매치"는 이중 가닥 영역에서 하나 이상 미스매치된 뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에 사용된, 용어 "희석제"는 투여되는 활성 화합물의 생리학적 활성 또는 특성을 억제하지 않고, 대상체를 자극하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 제거하지 않는 약학적으로 허용 가능한 담체를 지칭한다. 희석제는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면 활성제, 산화 방지제, 보존제 염, 보존제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함하며, 이는 당업자에게 공지된 것이다(예를 들어, 본원에 참조문헌으로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329 참조).　임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없는 한,　약제학적 조성물에서의 이의 사용을 고려한다.　세포막을 가로지르는 핵산의 수송을 허용하거나 향상시키는 희석제가 또한 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "당뇨병 전증(pre-diabetes)"은 혈당 수준이 정상보다 높지만 당뇨병 진단으로는 충분히 높은 것은 아닌 상태를 지칭한다.　당뇨병 전증은 경구 글루코스 내성 시험(OGTT)의 시작 2시간 후 140 mg/dL 내지 199 mg/dL의 수준인 것이다.
본원에 사용된 용어 "비강내 제형"은 비강내 전달용으로 제형화된 약제학적 조성물을 지칭하고, 분말, 수용액, 수성 에어로졸, 점비액 및/또는 에어로졸의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 "약제학적 조성물"은 본원에 기술된 하나 이상의 활성 성분, 예컨대 생리학적으로 적합한 담체와 같은 하나 이상의 다른 화학적 성분을 갖는 miR-1983 억제제의 제제를 지칭한다.　약제학적 조성물의 목적은 유기체에 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
본원에 사용된, 용어 "증폭"은 표적 폴리뉴클레오티드, 표적 폴리뉴클레오티드 대체물, 또는 이들의 조합의 적어도 일부가 전형적으로 주형-의존적 방식으로 복제되는 임의의 수단을 지칭하며, 제한없이, 선형적으로 또는 지수적으로, 핵산 서열을 증폭시키기 위한 광범위한 기술을 포함한다.　증폭 단계를 수행하기 위한 예시적인 절차는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 포함한다.　본 발명의 교시에서 사용될 수 있는 추가적인 기술의 설명은, 다른 곳들 사이, Sambrook et al. Molecular Cloning, 3rd　Edition; Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002), Msuih et al., J. Clin. Micro. 34:501-07 (1996); The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002); Abramson et al., Curr Opin Biotechnol. 1993 February; 4(1):41-7, 미국 특허 제6,027,998호; 미국 특허 제6,605,451호, Barany et al., PCT 공개 WO 97/31256; Wenz et al., PCT 공개 WO 01/92579; Day et al., Genomics, 29(1): 152-162 (1995), Ehrlich et al., Science 252:1643-50 (1991); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990); Favis et al., Nature Biotechnology 18:561-64 (2000); 및 Rabenau et al., Infection 28:97-102 (2000); Belgrader, Barany, and Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (available on the world wide web at: promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html); LCR Kit Instruction Manual, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188-93 (1991); Bi and Sambrook, Nucl. Acids Res. 25:2924-2951 (1997); Zirvi et al., Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999); Dean et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66 (2002); Barany and Gelfand, Gene 109:1-11 (1991); Walker et al., Nucl. Acid Res. 20:1691-96 (1992); Polstra et al., BMC Inf. Dis. 2:18-(2002); Lage et al., Genome Res. 2003 February; 13(2):294-307, 및 Landegren et al., Science 241:1077-80 (1988), Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn. 2002 November; 2(6):542-8., Cook et al., J Microbiol Methods. 2003 May; 53(2):165-74, Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 February; 12(1):21-7, 미국 특허 제5,830,711호, 미국 특허 제6,027,889호, 미국 특허 제5,686,243호, 공개된 P.C.T. 출원 WO0056927A3, 및 공개된 P.C.T. 출원 WO9803673A1에서 찾을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "miR-1983 억제제"는, miR-1983의 세포내 발현 또는 활성을 감소시키는 작용제를 지칭하는 것으로 의도된다.　보다 상세하게, 작용제는 miR-1983에 직접적으로 또는 miR-1983의 전구체에 간접적으로 작용하여 전사 수준에서 microRNA-1983의 발현을 감소시키거나, 발현된 miR-1983의 분해를 촉진시키거나, miR-1983의 활성을 방해하여, miR-1983의 발현 수준 또는 활성을 감소시킨다.　"miR-1983 억제제"는 예를 들어 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드 및 예를 들어 라벨 또는 태그, 안정화 모이어티 및/또는 수송 모이어티를 포함하는 이의 변형된 버전을 포함한다.
용어 "인슐린 저항성 개선"은 일반적으로 그것이 발달하기 시작한 후 인슐린 저항성 또는 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 개선시키는 치료학적 조정(intervention)을 지칭한다.　"개선(Ameliorating)"은 일반적으로 질병의 징후 또는 증상의 수 또는 심각성의 감소를 지칭한다.
상기 개시는 일반적으로 본 출원을 설명한다.　다음의 구체적인 예를 참조하면 보다 완전한 이해를 얻을 수 있다.　이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 설명되고 본 개시의 범위를 제한하려는 것이 아니다.　형태 및 동등물의 대체의 변화는 방편을 제안 또는 만드는 상황에 따라 고려된다.　본 명세서에서 특정 용어가 사용되었지만, 이러한 용어는 설명의 의미로 의도된 것이며 제한의 목적이 아니다.
조성물 및 방법
연구는 대사 질환에서, 개별적으로 또는 서로 협력하여 작용하는 miRNA에 관련된 것이다(Feng et al., 2016; Hashimoto and Tanaka, 2016; Vienberg et al., 2016).　일부는 시상 하부 조직에서 인슐린 민감도를 매개하는 miRNA 조절에 관련된 것이다.　예를 들어, ob/ob 렙틴-결핍 마우스의 시상 하부에서 miR-200a의 침묵은 렙틴 수용체 및 InsR 기질 2(IRS-2) 발현 수준 둘 모두를 증가시킴으로써 렙틴 및 인슐린 신호 전달을 개선시키는 데에 충분하였다 (Crepin et al., 2014).　또한, miRNA 생합성의 필수 성분 중 하나인, 다이서(Dicer)의 시상 하부 녹다운은 miR-103의 미믹의 뇌 실내(ICV) 전달시 역전될 수 있는 과식증 비만을 초래한다 (Vinnikov et al., 2014). 연구에 따르면 중추 신경계(CNS)의 miRNA가 전신 에너지 항상성 조절에 중요한 역할을 할 수 있으며, 시상 하부는 특유의 특정 대사 상태의 miRNA 시그니처 특성을 나타낼 수 있다. 이러한 시그니처는 인간 질병의 치료에 있어서 진단 도구 또는 치료적 표적으로서 작용할 수 있다.　대사 항상성에 대한 인슐린 신호의 중요성과 이러한 균형을 달성하는데 있어서 시상 하부 뉴런이 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 확립된 시험관 내(in vitro) 세포를 사용하여 인슐린 저항성의 유도 시 뉴런이 HFD-공급받은 마우스와 동일한 특징적인 miRNA 표현 프로파일을 나타내는지를 조사하였다.
miR-1983은 인슐린 저항성의 유도와 직접적으로 관련되고, 시상 하부에서의 miR-1983의 상승은 HFD상의 마우스의 혈청에서 증가된 수준과 일치하였음을 발견하였고, 이는 중앙 인슐린 저항성(central insulin resistance)에 대한 바이오 마커일 수 있음을 시사한다. 게다가, miR-1983은 과체중 및 비만인 사람에게도 존재하며 이들의 혈청 miR-1983 수준은 순환 인슐린 수준 및 인슐린 저항성 정도와 관련이 있는 것을 확인하였다(인슐린 저항성의 항상성 모델 평가, HOMA-IR). 최종적으로, miR-1983 억제제의 비강내 전달은 마우스에서 전신 인슐린 신호 전달 및 글루코스 항상성을 회복시키는 것을 확인하였다.
시상 하부 수준에서 인슐린 저항성은 글루코스 항상성의 조절 장애를 선행할 수 있다. 여기서, microRNA miR-1983은 InsR이 miR-1983의 하류 표적임을 시사하는 인슐린 수용체(InsR) 단백질의 역 조절을 갖는 피딩(feeding)-관련 시상 하부 세포주에서 시험관 내(in vitro) 인슐린-유도 인슐린 저항성의 유도 동안 유의하게 변경되었다. 인간 혈청에서 miR-1983 수준의 조사는 HOMA-IR을 포함하여, 인슐린 저항성 수치와 양의 상관 관계가 있음을 밝혔다. miR-1983 LNA 억제제에 대한 비강내 노출은 말초 인슐린 민감도 및 공복 혈당 수준을 회복시키면서 HFD상의 마우스에서 InsR 단백질 수준을 보존하였다. 동시에, 이러한 결과는 miR-1983이 초기 시상 하부 인슐린 저항성에 대한 표적화 가능한 예측 바이오 마커로서 당뇨병으로의 진행을 정지시킬 가능성을 암시한다.
첫 번째 측면은 CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)의 적어도 일부에 상보적인 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 일부가 CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)의 적어도 2 내지 8 뉴클레오티드를 포함하는 miR-1983 억제제이다.　일 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 또는 1 내지 8에 상보적이다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1의 뉴클레오티드 2 내지 21, 2 내지 20, 2 내지 19, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 또는 2 내지 8에 상보적이다.
일 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 적어도 일부에 상보적이며, 여기서 일부는 TCACCTGGAGCATGT (서열번호: 4)이거나 이를 포함한다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 적어도 일부에 상보적이며, 여기서 일부는 TCACCTGGAGCATG (서열번호: 5), TCACCTGGAGCAT (서열번호: 6), TCACCTGGAGCA (서열번호: 7), TCACCTGGAGC (서열번호: 8), TCACCTGGAG (서열번호: 9), TCACCTGGA (서열번호: 10), TCACCTGG (서열번호: 11), 또는 TCACCTG (서열번호: 12) 이거나 이를 포함한다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 적어도 일부에 상보적이며, 여기서 일부는 CTCACCTGGAGCATGT (서열번호: 13), CTCACCTGGAGCATG (서열번호: 14), CTCACCTGGAGCAT (서열번호: 15), CTCACCTGGAGCA (서열번호: 16), CTCACCTGGAGC (서열번호: 17), CTCACCTGGAG (서열번호: 18), CTCACCTGGA (서열번호: 19), CTCACCTGG (서열번호: 20), 또는 CTCACCTG (서열번호: 21)이거나 이를 포함한다.
일 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 9 내지 15, 8 내지 15, 7 내지 15, 6 내지 15, 5 내지 15, 4 내지 15, 3 내지 15, 2 내지 15, 또는 1 내지 15, 서열번호: 2의 뉴클레오티드이거나 이를 포함한다. 항-miR 1983 올리고뉴클레오티드는 또한 DNA 및/또는 RNA 서열에 대한 안정화 서열을 포함하며 더 길 수 있으며, 예를 들어 약 또는 최대 21개의 뉴클레오티드, 약 또는 최대 25개의 뉴클레오티드, 약 또는 최대 30개의 뉴클레오티드, 약 또는 최대 35개의 뉴클레오티드, 약 또는 최대 40개의 뉴클레오티드, 약 또는 최대 45개의 뉴클레오티드, 약 또는 최대 50개의 뉴클레오티드, 또는, 또는 예를 들어 최대 132개의 뉴클레오티드까지 더 길 수 있다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 RNA 단량체를 포함한다.　일 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 DNA 단량체, RNA 단량체, LNA 단량체 또는 이들의 조합을 포함한다.　예를 들어, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 DNA 모노머 단독, RNA 모노머 단독, DNA 및 LNA 모노머, RNA 및 LNA 모노머, 또는 LNA 모노머 단독을 포함한다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다.　예를 들어, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 존재 하에서 안정성을 향상시키는 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다.　다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 비-화학적으로 변형 및 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 둘 다 포함하는 키메라 핵산이다. 다른 실시예에서, 뉴클레아제 저항성은 또한 모 포스포디에스테르 결합의 포스포로티오에이트 결합으로의 백본 변형에 의해 개선되며 여기서 황 원자는 포스페이트기에서 비-브리징 산소 원자 중 하나를 대체하거나 모르폴리노 올리고머를 사용함으로써 대체하며, 여기서 6-원 모르폴린 고리는 당 모이어티를 대체한다.　예를 들어 모르폴리노는 하전되지 않으며 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 본질적으로 저항성이 있다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 2 '위치에서의 화학적 변형을 포함한다. 예를 들어, 2'위치에서의 화학적 변형은 특허 US20130116419에 기술된 바와 같이 "클릭 화학(click chemistry)"을 포함하지만 이에 제한되지 않는 화학적 변형 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 화학적으로 변형된 핵산은 다른 제조사로부터 구매할 수 있다. 다른 실시예에서, 화학적 변형은 2'O메틸(2'O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE), 2'플루오로(2'F), 잠금 핵산 단량체(LNAM), 알킨 작용기, 또는 리간드를 표적화하는데 유용한 다른 작용기일 수 있다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 화학적 변형을 포함하며, 여기서 변형은 2'O메틸(2'O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE), 2'플루오로(2'F), 및 잠금 핵산 단량체(LNAM)로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2'O-Me 화학적 변형을 포함한다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2'O-MOE 화학적 변형을 포함한다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 (2'F) 화학적 변형을 포함한다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNAM 화학적 변형을 포함한다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 2'O-Me, 2'O-MOE, 및 2'F 화학적 변형의 조합을 포함한다. 다른 실시예에서, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 다른 실시예에서, 제조자로부터 변형된 올리고뉴클레오티드를 구입한다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 복수의 뉴클레오티드 단량체의 화학적 변형을 포함한다.　일 실시예에서, 항-miR-1983은 2'O-Me, 2'O-MOE, 2'F 또는 이들의 조합 중 하나의 복수의 화학적 변형을 포함한다.　다른 실시예에서, 항-miR-1983은 복수의 단독 LNAM을 포함한다.　다른 실시예에서, 제조사로부터 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 구입한다.
다른 실시예에서, 항-mRNA 1983 올리고뉴클레오티드는 복수의 잠금 핵산 단량체 (LNAM)를 포함한다.　일 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 LNA를 포함하며, 이는 하나 이상의 non-LNA 뉴클레오티드에 의해 연속적이거나 분리된 것이다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 LNA/DNA 믹스머이다.　일 실시예에서, 믹스머는 5개 초과의 인접(contiguous) DNA 단량체를 함유하지 않는다.　다른 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 LNA 및 RNA 단량체를 포함한다.　다른 실시예에서, 5개 이하의 인접 단량체가 존재한다.　다른 실시예에서, 올리고 뉴클레오티드는 2'-O, 4'-C-메틸렌 리보뉴클레오사이드(구조 A)를 함유하는 잠금 뉴클레오티드 또는 LNA를 함유하며, 여기서 리보오스 당 모이어티는 "잠금" 형태이다.　다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 2', 4'-C-bridged 2'데옥시리보뉴클레오사이드(CDNA, 구조 B)를 함유한다.　미국 특허 제6,403,566호 및 Wang et al.　(1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol.　9 : 1147-1150 참고, 둘 다 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 또는 LNA/DNA 믹스머이고 여기서 LNA는 서열 5'-3', A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A (서열번호: 2), 또는 이의 일부를 포함하고, 여기서 일부는 적어도 뉴클레오티드 7개의 뉴클레오티드 길이이고, 서열번호: 2의 9 내지 15 위치에 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드가 LNA일 때, 뉴클레오티드 간 연결(별표로 표시)은 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결이다.
잠금 핵산 (LNA™)은 고-친화성 RNA의 유사체 클래스이며, 이는 리보오스 고리가 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 결합에 대해 이상적인 형태로 "잠금된" 것이다. LNA™ 올리고뉴클레오티드는 상보적 DNA 또는 RNA 가닥에 혼성화될 때 높은 열적 안정성을 나타낸다. 또한, LNA™ 올리고뉴클레오티드는 통상적인 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드보다 짧아질 수 있고 여전히 높은 Tm을 유지할 수 있다. LNA™ 올리고뉴클레오티드는 LNA™ 및 DNA의 혼합물 또는 RNA로 구성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 LNA™의 혼합은 PCR, 마이크로어레이 및 in situ 혼성화를 포함하는 많은 혼성화-기반 기술에 대한 민감도 및 특이성을 개선시키는 것으로 나타났다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 오직 DNA 및 LNA 단량체만을 포함한다.
별표는 뉴클레오티드 간, 선택적으로 포스포디에스테르 또는 바람직하게는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 연결을 표시하며, 이는 LNA의 백본을 형성한다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 LNA이며, 서열 5'-3', A*C*A*T*G*C*T*C*C*A*G*G*T*G*A (서열번호: 2) 또는 적어도 뉴클레오티드 9-15개를 포함하는 이의 일부를 포함한다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 LNA이며, 서열 5'-3', A*C*A*U*G*C*U*C*C*A*G*G*U*G*A (서열번호: 2) 또는 적어도 뉴클레오티드 9-15개를 포함하는 이의 일부를 포함한다. 다른 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 변이 DNA 또는 RNA 단량체 A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A (서열번호: 2) 또는 적어도 뉴클레오티드 9-15개를 포함하는 이의 일부를 포함한다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 미스매치 및 최대 4개의 미스매치를 포함할 수 있다. 미스매치는 miRNA 서열과 관련이 있으며, 예를 들어, 항-miR 올리고 뉴클레오티드의 중간물, 예를 들어, 7개의 단량체에 포함될 수 있다. 미스매치는 3, 4, 5 또는 6 위치 중 어느 하나에 있을 수 있다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥이다. 예를 들어, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 분자로서 합성 또는 구조화될 수 있고 나중에 변성될 수 있다. 다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥으로 합성된다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다.
다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 2의 핵산 서열과 동일하거나 최대 60%, 70%, 80% 또는 최대 90%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 2로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드 차이를 갖는다. 추가 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 동일한 길이, miR-1983보다 긴 길이 또는 짧은 길이를 갖는다.　특정 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 5 '말단 서열번호: 1에서 7 또는 8 개의 뉴클레오티드에 상보적이다.　다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,　49 또는 50개 뉴클레오티드 길이 또는 뉴클레오티드 최대 132개의 뉴클레오티드의 임의의 수 또는 이의 유도 가능한 임의의 범위이다.　다른 실시예에서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 7-10, 10-20, 20-50, 50-75, 75-100, 또는 100-132개의 뉴클레오티드 길이, 또는 이의 유도 가능한 임의의 범위이다.
다른 실시예에서, miR-1983 억제제는 마커 분자 또는 표지 분자 예컨대 UV/VIS 또는 FITC, TRITC, Texas Red, Cy-염료, alexa 염료 (Bioprobes)와 같은 적외선에서 여기되고 방출되는 형광염료, 또는 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드에 접합된 것 등을 포함한다.
일 실시예에서, miR-1983 억제제는 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부착된 수송 모이어티를 포함하여 세포막 및 혈액 뇌 장벽을 통한 수송을 용이하게 한다.　예를 들어, 단백질 형질 도입 도메인뿐만 아니라 콜레스테롤 도메인, 라우르산, 및 C32 작용기를 갖는 리토콜산 유도체와 같은 친유성기로도 지칭되는 단 신호 펩타이드는 세포로의 전달을 용이하게 하기 위해 올리고뉴클레오티드에 접합된다. 핵산과 복합체를 형성하고 DOTAP (또는 다른 양이온성 지질), DDAB, DHDEAB 및 DOPE와 같은 지질, 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 및 이들의 덴드리머 및 다른 폴리머와 같은 비 지질 기반 폴리머를 포함하는 세포 내 전달을 개선시키는 다른 화합물을 사용할 수 있다. 또한　이들의 조합을 사용할 수 있다.　예를 들어 특정 실시예에서, 지질의 조합은 DOTAP 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체와 같은 것을 사용한다 (미국 특허 제6,770,291호, 본원에 참조로 포함됨).
다른 실시예에서, miR-1983 억제제는 안정성 모이어티를 포함하여 억제제의 안정성을 증가시킨다.
추가 측면은 miR-1983 억제제 및 선택적으로 희석제를 포함하는 조성물이다.　희석제는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면 활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장화제, 염, 보존제, 결합제, , 윤활제, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합일 수 있으며, 당업자에게 알려진 바이며(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, 본원에 참조로 포함됨), 이는 핵산과 함께 사용될 수 있다.　임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없는 한, 약제학적 조성물에서의 이의 사용을 고려한다.
다른 실시예에서, 조성물 희석제는 염분을 포함한다.
일 실시예에서, 조성물은 비강내 제형으로 제형화된다.　일 실시예에서, 비강내 제형은 분말, 수용액, 점비액 및/또는 에어로졸의 형태일 수 있다.
다른 실시예에서, 비강내 투여용 고체 제형은 부형제, 예컨대 락토오스, 전분 또는 덱스트란을 함유할 수 있다.　예를 들어, 흡입기 장치 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드 또는 조성물의 분말 혼합물 및 적합한 분말 부형제 예컨대 락토오스, 전분 또는 덱스트란을 함유하여 제형화될 수 있다.　다른 실시예에서, 비강내 투여용 액체 제형은 에어로졸, 점비액 및/또는 계량 스프레이의 형태로 사용하기 위한 수성 또는 유성 용액일 수 있다.
에어로졸 제형은 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소, 프로판, 질소 또는 다른 적합한 가스와 같은 가압 가능한 추진제에 넣을 수 있다.　제형은 예를 들어 적합한 추진제를 사용하여 가압팩, 분무기 또는 다른 흡입 장치로부터 에어로졸 스프레이의 형태로 전달될 수 있다.
일부 실시예에서, 흡입을 통한 비강내 투여용 제형은 리포좀 제형을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시예에서, 비강내 전달용 약제학적 조성물은 흡입 장치를 사용하여 투여된다.　용어 "흡입 장치"는 대상체의 비강에 miR-1983 억제제를 투여할 수 있는 임의의 장치를 지칭한다.　흡입 장치는 계량식 투여 흡입기 (MDI), 건조 분말 흡입기 (DPI), 제트 분무기 및 초음파 분무기를 포함하는 분무기, 열 기화기, 연무 분무기, 열적 에어로졸 흡입기, 및 전기유체역학-기반 용액 분무 흡입기와 같은 장치를 포함한다.　또한 흡입 장치는 고효율 분무기를 포함한다.　일부 실시예에서, 분무기는 제트 분무기, 초음파 분무기, 맥동 막 분무기, 다수의 개구를 갖는 진동 메쉬 또는 플레이트를 포함하는 분무기,　진동 발생기 및 수성 챔버를 포함하는 분무기, 또는 대상체의 비강으로 에어로졸화 수용액의 흡기 흐름을 돕는 제어된 장치 특징을 사용하는 분무기이다.　분무기, 계량 투여 흡입기, 및 연무 분무기는 쉽게 흡입할 수 있는 액적 크기를 포함하는 에어로졸을 형성함으로써 의약을 전달한다.
가압 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다.　예를 들어, 흡입 장치는 계량 투여 분무기가 부착된 소형 하드 보틀(small hard bottle)일 수 있다.
miR-1983 억제제는 또한 뇌에 직접적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 직접 주사 (선택적으로 캐뉼레이션) 또는 뇌 실내 (ICV) 투여에 의해 투여될 수 있다.
다른 전달 방식이 사용될 수 있으며, 예를 들어 여기서 miR-1983 억제제는 수송 모이어티를 포함한다.　예를 들어, 투여 경로의 예는 비경구, 예, 정맥내, 피하, 경구 및 경점막을 포함한다.
또 다른 측면은 miR-1983의 수준을 측정하는 것 및 역치 또는 대조군과 비교하는 것을 포함하는, 세포가 인슐린 저항성인지를 검출하는 방법이며, 여기서, 대조군과 비교하여 증가된 수준은 세포가 인슐린 저항성인 것을 나타낸다. 일 실시예에서, 대조군은 정상적인 인슐린 민감도를 갖는 마우스 세포이다.　다른 실시예에서, 대조군은 정상적인 인슐린 민감도를 갖는 인간 세포이다.
다른 실시예에서, 세포는 뉴런 세포, 선택적으로 시상 하부 세포이다.　다른 실시예에서, 세포는 시상 하부 세포이다.　다른 실시예에서, 세포는 뉴로펩타이드 Y 발현 시상 하부 세포이다.
또 다른 측면은 대상체의 생물학적 샘플에서 miR-1983의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대상체에서 당뇨병 전증 또는 당뇨병 발생의 증가 가능성을 검출하는 방법이며, 여기서, 역치 또는 대조군과 비교하여 증가된 수준은 대상체가 당뇨병 발생의 증가 가능성을 가지는 것을 나타낸다.　일 실시예에서, 대조군은 정상적인 인슐린 민감도를 갖는 마우스 세포이다.　다른 실시예에서, 대조군은 정상적인 인슐린 민감도를 갖는 인간 세포이다.
세포 또는 샘플에서의 miRNA의 수준은 PCR 기반 방법 또는 하나 이상의 혼성화 프로브를 사용하여 검출할 수 있다.　일 실시예에서, miR-1983의 수준을 측정하는 것은 마이크로어레이 분석을 이용하는 것을 포함한다.　다른 실시예에서, miR-1983의 수준을 측정하기 위해 정량적 PCR 분석을 사용한다. 또 다른 실시예에서, miRNA의 수준은 miRNA를 단리함으로써 검출되고, 상기 miRNA를 혼성화 프로브, 예를 들어 본원에 기술된 안티센스 분자와 혼성화시킨다.
다른 실시예에서, miR-1983의 수준을 측정하는 것은 (a) miRNA를 ATP 및 폴리(A) 폴리메라아제로 폴리아데닐화하여 연속적인 A 잔기의 서열을 갖는 폴리아데닐화된 miRNA를 형성하는 것; (b) 폴리아데닐화 miRNA를 역전사시켜 (i) miRNA의 적어도 2개의 3 '말단 뉴클레오티드에 대해 상보성을 갖는 길이가 40개 이하의 뉴클레오티드의 제1 프라이머 및 이와 함께 혼성화하고 폴리아데닐화 miRNA에 상보적인 cDNA의 합성을 개시하기 위한 폴리아데닐화 miRNA의 인접 A 잔기의 서열, (ii) 역전사 효소 및 (iii) 4개의 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 포함하는 반응 혼합물에서 cDNA를 형성하는 것; (c) (i) cDNA, (ii) 제1 프라이머; (iii) 제2 프라이머, 이는 cDNA의 3 '뉴클레오티드에 충분히 상보적이며, 혼성화하고 연장 생성물의 합성을 개시함; (iv) DNA 폴리머라제 및 (v) 4개의 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 포함하는 반응 혼합물에서 cDNA를 포함하는 DNA 분자를 증폭시키는 것; (d) 증폭된 DNA 분자를 검출 및/또는 정량화하는 것, 여기서 증폭 된 DNA의 존재 및/또는 양은 miRNA의 존재 및/또는 양에 상응한다. 추가 실시예에서, miRNA 수준의 측정 동안 사용된 프라이머는 Balcells et al., 2018에 기술된 방법을 사용하여 설계된다. 다른 실시예에서, 증폭된 cDNA 분자의 검출 및/또는 정량화는 실시간 RT-PCR을 이용하는 것을 포함한다. 추가 실시예에서, 증폭된 cDNA를 검출 및/또는 정량하는 것은 겔 전기 영동을 이용하는 것을 포함한다.
miRNA의 혈청 수준이 검출되었다.　일 실시예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장 또는 혈청, 소변 또는 조직 중 하나이다.
일 실시예에서, 생물학적 샘플은 적어도 8 시간 동안 단식한 대상체로부터 채취한다.　다른 실시예에서, 방법은 인슐린 및/또는 글루코스 수준을 측정하는 것을 추가로 포함한다.　일부 실시예에서, 콜레스테롤 및/또는 LDL와 같은 지질 또한 측정된다. 일부 실시예에서, 방법은 miR1983의 표준화된 수준을 측정하는 것을 추가로 포함하며, 선택적으로 snoRNA202와 같은 내부 대조군의 수준으로 표준화된다.
일 실시예에서, 대상체는 적어도 25의 BMI를 갖는 대상체이다. 일 실시예에서, 대상체는 예를 들어 인슐린 또는 인슐린 증감제를 복용하지 않는 당뇨병 전증이다.
실시예에 나타난 바와 같이, 미리 결정된 표준 또는 이전 수준에 대비하여 miR-1983 또는 이의 증가된 수준을 검출하는 것은 인슐린 저항성의 발달을 예측한다.　이는 초기 마커이고, 인슐린 저항성 발달보다 앞선다.　이는 인슐린 저항성으로 향하는 대상을 식별하고, 이에 의해 조기 개입을 제공할 수 있는 기회를 제공한다.
한 실시예에서, 생물학적 샘플은 혈청 샘플이다.　다른 실시예에서, 혈청 샘플은 표준 인간 혈액 검색 절차를 사용하여 검색한다.
다른 실시예에서, miR-1983의 수준은 정량적 PCR 분석으로 측정한다.　다른 실시예에서, PCR 방법 이외의 다른 증폭 절차는 미국 특허 제5,830,711호, 미국 특허 제6,027,889호, 미국 특허 제5,686,243호, 공개된 PCT 출원 W00056927A3, 및 공개된 PCT 출원 WO9803673A1 중에 설명된 바를 사용한다.　
다른 실시예에서, 정량적 PCR 방법은 세포 또는 생물학적 샘플로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 생성하는 것, 서열 특이적 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시키는 것, miR-1983의 수준을 정량하는 것을 포함한다.
증가된 수준의 miR-1983을 갖는 대상체는 추가적인 변화에 대해 모니터링될 수 있고, 식이 변형 또는 당뇨병 전증 또는 당뇨병에 적합한 치료로 치료될 수 있다. 증가된 miR-1983 수준을 갖는 대상체는　예를 들어 본원에서 설명한 항-miR 억제제를 사용하여 치료될 수 있다.
따라서 또 다른 측면은 대상체에서 인슐린 민감도를 개선시키는 방법으로, miR-1983 억제제 또는 상기 억제제를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다.　일 실시예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 인슐린 저항성 또는 당뇨병 전증을 갖는 동물이다.　다른 실시예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 인슐린 저항성 또는 당뇨병 전증을 갖는 인간이다.　또 다른 실시예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 당뇨병으로 진단을 받은 것이다.　이의 조합을 포함하며 본원에 설명된 임의의 miR-1983 억제제를 투여할 수 있으며, 이의 조합을 포함한다.
일 실시예에서, 대상체가 인슐린 저항성의 하나 이상의 징후를 나타내는 경우, 예를 들어 임의의 다른 항-당뇨병 약물이 전형적으로 처방되기 전, 대상체에 miR-1983 억제제 또는 상기 억제제를 포함하는 조성물을 투여한다.　다른 실시예에서, 대상체에 인슐린 저항성 또는 당뇨병에 대한 다른 치료와 조합하여 miR-1983 억제제를 투여한다.
miR1983의 수준은 miR-1983을 투여하기 전에 측정되어 수준이 상승되었음을 확인할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 증가된 수준의 miR-1983을 갖는 대상체는 miR-1983 억제제를 투여 받는다.
일 실시예에서, 인슐린 민감도 개선은 치료의 투여 전 기준선 수준과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30% 이상 증가된 인슐린 민감도 수준을 달성하는 것을 의미한다. 예를 들어, 복강내 인슐린 내성 시험 (IpITT)에 의해 측정되는 경우, 선택적으로 민감도는 인슐린 저항성이 진단되지 않은 대상체에 비례하여 유사하게 증가된다.
다른 실시예에서, miR-1983 억제제 또는 상기 억제제를 포함하는 조성물을 뉴런과 접촉 및/또는 표적화를 허용하는 방식으로 투여한다. 다른 실시예에서, miR-1983 억제제 또는 상기 억제제를 포함하는 조성물을 시상 하부 뉴런과 접촉 및/또는 표적화를 허용하는 방식으로 투여한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, miR-1983 억제제 또는 상기 억제제를 포함하는 조성물을 비강 내 투여한다.
일 실시예에서, 투여된 miR-1983 억제제는 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드이다. 다른 실시예에서, 투여된 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 희석제와 함께 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물에 포함된다. 다른 실시예에서, 희석제는 염분 또는 본원에 기술된 다른 희석제이다.
다른 실시예에서, miR-1983 억제제 또는 상기 억제제를 포함하는 조성물을 비강내, 패치 또는 정맥내 투여한다.
miR-1983 억제제를 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 특히, miR-1983 억제제를 비강내 투여되는 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 일 실시예예에서, 다른 치료제는 렙틴이다.
본원에 기재된 바와 같이, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 본원에 기재된 miR-1983 억제제 및 조성물의 용도를 또한 제공한다.
본원에 기술된 miRNA 1983 억제제를 포함하는 비강 전달 장치(nasal delivery apparatus)를 제공한다. 일 실시예에서, 장치는 비강 스프레이 펌프 또는 가압 전달 장치이다.
상기 개시는 일반적으로 본 출원을 설명한다.　다음의 구체적인 예를 참조하면 보다 완전한 이해를 얻을 수 있다.　이들 실시예는 단지 예시의 목적으로 설명되고 본 개시의 범위를 제한하려는 것이 아니다.　형태 및 동등물의 대체의 변화는 방편을 제안 또는 만드는 상황에 따라 고려된다.　본 명세서에서 특정 용어가 사용되었지만, 이러한 용어는 설명의 의미로 의도된 것이며 제한의 목적이 아니다.
실시예
하기 비-제한적인 예는 본 발명의 예시이다.
실시예 1 : 시상 하부 NPY-발현 뉴런 세포주에서 인슐린 저항성의 유도는 miR-1983 및 miR-20a-3p 수준의 변화를 유도한다
NPY 및 AgRP를 발현하고 분비하는 mHypoE-46 세포주는 인슐린에 대한 이의 반응이 잘 특성화되었고 세포 수준에서 인슐린 저항성이 발달하는 메커니즘을 확인하였다 (Mayer and Belsham, 2009, 2010a). 특히 중요한 것은, 인슐린 저항성의 발달시 InsR 또는 InsR 기질 1(IRS-1) 단백질의 손실은 mRNA 전사 수준에서 임의의 변화를 수반하지 않았다. 이 발견은 다른 조절 계층이 존재할 수 있음을 시사한다. 이것이 miRNA를 통해서일 수 있다는 가설을 세웠다. miRNA는 작은 RNA 분자로, 이는 mRNA p-본체(mRNAs p-bodies)를 격리시켜 단백질 번역을 방지할 수 있다 (Bhattacharyya et al., 2006; Liu et al., 2005). 이 가설을 테스트하고, 인슐린-유도 인슐린 저항성 상태에 의해 miRNA가 변경되는지를 보다 광범위하게 결정하기 위해, mHypoE-46 세포를 비히클 또는 100 nM의 인슐린으로 둘 다 4시간 및 24시간 동안 처리하였고 그들의 총 RNA를 마이크로어레이 분석을 위해 전송했다. 이 시점을 정상적인 신호 전달 조건 (4시간 후) 대 인슐린 저항성이 확립된 시점 (24시간 후)하에서 인슐린에 반응하는 miRNA를 구별하기 위해 선택하였다. 마이크로어레이 데이터는 60개의 miRNA가 모든 그룹에 걸쳐 현저하게 변화되었음을 보여주었다 (도 8). 그 다음 데이터를 4시간 및 24시간 사이에 인슐린으로 처리된 그룹에서만 변화하는 miRNA를 결정하기 위해 분류하였다 (도 9). 12개의 miRNA는 24시간 시점에서 비히클과 비교하여 현처한 차이가 있는 것으로 밝혀졌고, 가장 큰 배수 변화(fold change)의 정도에 따라 순위가 매겨졌다. 24시간 시점에서 증가된 상위 4개의 miRNA를 qPCR에 의한 검증을 위해 선택하였다. 마이크로어레이 분석에 의해 확인된 인슐린 저항성의 특징을 확인하기 위해, mHypoE-46 세포를 비히클 또는 100 nM의 인슐린으로 4시간 및 24시간 동안 처리하고, qPCR 및 웨스턴 블로팅을 수행하여 InsR mRNA 및 단백질을 정량화하였다(도 10). miRNA의 qPCR 검증은 miR-296-5p (도 1C) 또는 Let-7d-5p (도 1D)와 달리, 오직 miR-1983 (도 1A) 및 miR-20a-3p (도 1B)만이 100nM 인슐린으로 24시간 처리에서 상향 조절이 계속 나타나는 것을 밝혔다. 그 다음 이러한 발견을 바탕으로 추가 실험 분석을 위해 miR-1983 및 miR-20a-3p를 선택하였다. 이 실시예의 방법은 실시예 10에서 찾을 수 있다.
실시예 2: miR-1983은 NPY- 대 POMC-발현 세포주에서 인슐린 저항성 동안 차등적으로 조절되고 인슐린 저항성 유도 후 NPY 뉴런에서 영구적으로 상승되지 않는다
miR-1983 및 miR-20a-3p에서의 변화가 mHypoE-46 (male) 세포주에 특유한 것인지를 확인하기 위해, 성체-유래 비-클론 mHypoA-NPY/GFP (female) 및 mHypoA-POMC/GFP-2 (male) 세포주를 100 nM 인슐린 또는 비히클로 16시간 동안 처리하여, 충분한 인슐린 저항성을 끌어냈다 (Wellhauser et al., 2016) (각각 도 2A 및 2B). miR-1983의 수준은 mHypoA-NPY/GFP 세포주에서 상향 조절된 것으로 확인되었으며, 이는 장기간 인슐린 치료에 대한 반응에서의 miR-1983의 상승이 기원 (배아 대 성체) 또는 성별 (male 대 female)에 관계없이 NPY 세포 중에서 보존됨을 시사한다.
miRNA가 또한 ARC의 뉴런 집단들 사이에서 차등적으로 발현될 수 있다는 발견에 비추어 볼 때(Herzer et al., 2012), mHypoA-POMC/GFP-2 세포주가 또한 인슐린 노출시 miR-1983의 변화와 동일하게 나타나는지를 시험하였다. NPY/AgRP 세포 모델과 달리, 16시간의 100 nM 인슐린 노출은 miR-1983 수준의 감소를 야기하였다. 따라서, 주어진 패러다임 하에서 인슐린 저항성이 되는 NPY/AgRP 및 POMC 모델에도 불구하고, 특정 miRNA는 이러한 뉴런 집단 사이에서 상이할 수 있다. 이러한 두 뉴런 세포주에서 보인 인슐린의 반대 효과에 대한 관찰은 일반적으로 인슐린에 반응하여 이 두 세포 집단에서 관찰되는 차등적인 신호 전달의 특징이며 (Belgardt et al., 2009), miR-1983에 대한 인슐린 저항성의 효과는 NPY 발현 뉴런에 특유한 것일 가능성을 높인다. mHypoA-NPY/GFP 또는 mHypoA-POMC/GFP-2 세포에서 miR-20a-3p의 변화는 없었으며, 이는 이 특정 miRNA에 대한 인슐린의 효과가 mHypoE-46 세포주를 넘어 보존되지 않을 수 있음을 나타낸다.
일단 miR-1983이 mHypoE-46 모델에서 인슐린 저항성의 마커로서 정의되면, 다음 단계는 인슐린 저항성의 온셋(onset)이 miR-1983 수준에서 일시적 또는 영구적 변경을 유도하는지를 결정하는 것이다. qPCR 및 웨스턴 블롯 데이터는 100 nM 인슐린 처리 48시간 후 정상 수준으로의 miR-1983의 복귀(return)에도 불구하고 InsR β-서브유닛의 수준이 낮게 유지됨을 보였다 (도 2C). 따라서, 이 세포 모델에서 miR-1983의 변화는 실제로 일시적이며, 인슐린 노출에 반응하여 특정 기간 내에 발생하는 것으로, 이는 miR-1983은 뉴런이 더 이상 인슐린을 감지하는 능력을 보유하지 않는 최종 상태의 마커보다는 인슐린 저항성의 진행 또는 발달에 대한 기여자일 수 있음을 나타낸다. 이 실시예에서 사용된 방법은 실시예 10에서 찾을 수 있다.
실시예 3: miR-1983은 시험관 내에서 InsR 단백질을 표적으로 한다
인슐린에 의한 miR-1983 조절의 타임라인을 확립하고, 궁극적인 mRNA 표적의 설명 및 어떻게 이러한 표적이 mHypoE-46 모델에서 저항성 발달에 기여할 수 있는지의 확인을 수행하였다. 인실리코 생물 정보학 분석은 InsR의 3'비해석부위(UTR)가 miR-1983의 가능한 표적임을 밝혔고, mRNA의 이 시드 서열 영역이 또한 인간을 포함한, 종에 걸쳐 보존됨을 밝혔다 (도 3A, 3B). 참고로, miR-1983 자체는 아직 온라인 데이터베이스 리소스에서 인간에게 보존된 것으로 인식되지 않았지만, 이 miRNA는 정상적인 피부에 비해 건선 인간 피부에서 존재하고 증가하는 것으로 밝혀졌다 (Edinger et al., 2014). 보다 최근에, miR-1983이 이소류신 (Ile) pre-tranfer RNA (tRNA)로부터 독특하게 유도되어 인간 세포에서 완전한 기능적 miRNA가 되는 과정을 또한 설명하였다 (Hasler et al., 2016).
miR-1983이 InsR의 3'UTR에서 예측된 위치에 결합할 수 있는지를 평가하기 위해, 이 영역을 함유하는 pmirGLO 벡터의 일시적 트랜스펙션을 miR-1983 미믹 또는 음성 대조군의 존재하에서 수행하였다. 루시페라아제 분석 결과는 miR-1983 미믹이 생성된 광 유닛을 48시간 후 대략 15% 감소시킴을 밝혔다 (도 1F).
miR-1983의 미믹으로 mHypoE-46 뉴런의 트랜스펙션은 24시간에서 miR-1983 수준의 증가를 초래하였다. 관찰된 miR-1983의 증가는 24시간 후에 인슐린 민감도 또는 InsR mRNA의 수준에 영향을 미치지 않았다 (도 3C). 그럼에도 불구하고, miR-1983 수준의 상향 조절만으로도 24시간 후 20% (도 3D) 및 48시간 후 35%(도 3E)까지 InsR의 단백질 수준을 감소시키기에 충분하다는 것을 발견했으며, 반면 InsR mRNA의 수준은 24시간 또는 48시간 후 시점에 관계없이 변하지 않고 유지됨을 발견하였다(도 3D 및 E). 이는 miR-1983이 인슐린 저항성이 발달하는 과정에 기여할 수 있음을 시사한다. 종합적으로, 이전의 관찰과 결합된 이러한 데이터는 miR-1983이 높은 수준의 인슐린 노출에 의해 구동된 뉴런에서 초기 인슐린 저항성에 대한 마커임을 지적한다. 궁극적으로, 다음으로 다루어야 할 질문은 miR-1983이 생체 내(in vivo) 인슐린 저항성의 설정에서 시상 하부에서 조절될 수 있을 것인지이다. 따라서 시상 하부에서 miR-1983 수준에 대한 마우스의 인슐린 저항성을 유도할 수 있는 HFD 식이요법(regimen)의 영향을 평가하였다. 이 실시예에서 사용된 방법은 실시예 10에서 찾을 수 있다.
실시예 4: 수컷 C57BL /6 마우스는 60% HFD의 7-9주 후 시상 하부 miR -1983의 증가를 나타낸다
수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스 모두 7-9주 동안 60% HFD로 두었으며 두 성별 모두 상당한 체중을 얻었고 증가된 혈당 수준을 나타냈다 (도 4A 및 4B). 이러한 말초 변화는 수컷 및 암컷 둘 다에서 Npy 및 Agrp 둘 다의 mRNA 수준의 감소, 및 암컷 마우스에서 Pomc의 증가를 동반하였다 (도 4C 및 4D). 수컷 C57BL/6 마우스는 7주에서 순환 인슐린 수준의 증가를 나타내어, 인슐린 저항성을 나타내며, 이들의 시상 하부에서 miR-1983의 수반되는 증가를 나타냈다 (도 4E 및 4F). 따라서, C57BL/6 마우스 계통(strain)에서, 높은 순환 수준의 인슐린이 동반될 때만 60% HFD에 노출되면 시상 하부 miR-1983 수준이 상승한 것으로 나타난다. 암컷 마우스는 7주에 인슐린의 증가가 없었기 때문에, miR-1983의 변화는 감지되지 않았다. 두 성별에서 InsR의 mRNA 수준에서 변화가 없음이 관찰되었다 (도 4C 및 4D). 수컷 마우스에서 생체 내 miR-1983의 변화가 관찰되었다는 것을 고려할 때, 다음 목표는 이것이 마우스의 한 계통에 특유한 것인지를 결정하고 이 조절과 관련된 타임라인이 보존되는지를 결정하는 것이다. 이 실시예에서 사용된 방법은 실시예 10에서 찾을 수 있다.
실시예 5: 60% HFD를 공급받은 수컷 CD-1 마우스의 시상 하부에서 miR -1983의 관찰된 증가는 HFD 노출의 길이에 의존한다
수컷 CD-1 마우스는 60% HFD의 5-6주 사이에 말초 인슐린 저항성을 발달시키는 것으로 알려져 있으며 (Liu et al., 2016), C57BL/6 계통과 비교하여 더 짧은 기간; 따라서 이 시점에서 공복 혈당을 수집하였다. 시상 하부 Npy, AgRP, Pomc 또는 InsR mRNA에서 야기하는 변화없이(도 5D), HFD의 5주는 공복 혈당 (도 5A), 순환 인슐린 (도 5B), 및 시상 하부에서 miR-1983 수준(도 5C)을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. HFD의 시간의 길이가 10주로 연장되었을 때, 실험 그룹들 사이의 시상 하부에서 관찰된 miR-1983 수준의 차이는 더 이상 없었다 (도 5E). 그러나, 10주 후, chow와 비교하여 HFD를 공급받은 마우스에서 Npy 및 AgRP의 mRNA 수준이 감소하였고 Pomc가 증가하였다 (도 5F). 다시 한번, Insr mRNA 수준에서는 변화가 관찰되지 않았다. (도 5F). 이러한 데이터는 수컷 CD-1 마우스에서 miR-1983의 상향 조절이 뉴로펩타이드 수준의 변경보다 앞서는 것을 나타내었다. 수컷 CD-1 마우스에서 miR-1983 조절의 타이밍을 확립하고, 식이 요법의 5주 기간 내에 암컷 마우스에서의 반응을 연구하였다. 이 실시예에서 사용된 방법은 실시예 10에서 찾을 수 있다.
실시예 6: CD-1 수컷 마우스는 5주 후 60% HFD에서 시상 하부 및 혈청에서 miR-1983이 증가하지만, 신장에서는 감소한다
5주에 걸쳐 chow 또는 60% HFD에서 수컷 (도 6A) 및 암컷 (도 6B) CD-1 마우스 모두 유의한 체중 증가를 나타내었고 (도 11A), 두 성별에 대한 총 체중 증가는 60% HFD 그룹에서 약 2배 더 크다 (도 6A 및 C). 공복 혈당은 암컷에서는 증가했지만, 수컷 마우스에서는 증가하지 않았으며 (도 6D), 수컷 마우스는 공복 혈액 인슐린 수준 및 miR-1983이 증가한 것으로 나타났다(각각, 도 6E 및 6F). 뉴로펩타이드 mRNA 수준의 조사는 수컷 및 암컷에서 Npy의 감소를 나타내었고 (도 6G), 오직 암컷에서만 InsR mRNA의 7%의 증가를 나타냈다 (도 6G 및 6H). 시상 하부에서 miR-1983의 증가가 HFD와 무관하게, 수컷 및 암컷 마우스 둘 다에서 고인슐린 혈증에 의해 유도될 수 있는지를 결정하기 위해, 수컷 및 암컷 MKR 마우스 둘 다로부터 시상 하부를 수집하였다. 이러한 마우스는 HFD 노출이 없는 CD-1 마우스와 비교할 때 순환 혈장 인슐린의 유사한 수준으로 상응하는 시상 하부에서 miR-1983의 뚜렷한 상승을 나타냈다 (도 6E 및 F).
수컷 마우스에서 시상 하부의 수준에서의 변화를 입증한 후, 다른 대사적으로 관련된 조직, 즉 근육 및 간에서 miR-1983의 변화가 또한 있는지를 평가하였다. 또한, 신장에서의 수준은 마우스의 이 조직에서 이전에 발견된 miR-1983로 분석되었으며, 이는 알도스테론에 의해 조절된다 (Edinger et al., 2014). 신장에서 가자미근(soleus muscle) 감소의 miR-1983는 변화가 없는 것으로 관찰되었으며 (도 6I), 간에서 이 miRNA의 수준은 검출 가능한 것이 아니다.
miRNA는 마우스 및 인간의 혈장 및 혈청에서 검출될 수 있고 대사 질환의 추정 바이오 마커일 수 있다. miR-1983이 이전에 HFD-공급받은 마우스의 순환에서 검출되었으므로, 수컷 CD-1 마우스에서 혈청 수준을 평가하였다. miR-1983의 수준은 HFD-공급받은 마우스 혈청에서 거의 3배 증가하였고 (도 6I), 혈청에서 인슐린 수준 및 miR-1983 사이에 유의한 상관 관계를 검출하였다 (p=0.03, 도 11b).
miRNA는 신체의 다양한 조직에 위치할 뿐만 아니라, 마우스 및 인간의 혈장과 혈청에서도 발견되며, 이는 엑소좀에 둘러싸여 있거나 Argonaute 2 (AGO2)와 같은 단백질에 결합되어 있어 매우 안정적이다 (Turchinovich et al., 2011; Valadi et al., 2007). 이전의 miRNA 연구는 또한 miR-1983이 순환계에서 검출될 수 있음을 보여주었으므로, 수컷 CD-1 마우스의 혈청에서 miR-1983의 수준을 평가하였다 (Hsieh et al., 2015). HFD에서 5주 후 miR-1983의 수준은 수컷 CD-1 마우스의 혈청에서 거의 3배 증가한 것으로 밝혀졌다 (도 12B). 따라서, 시상 하부에서 miR-1983 상승의 타이밍은 5주 시점에서 순환계에서 검출 가능한 수준의 증가와 일치한다.
이 결과를 바탕으로, miR-1983의 혈청 수준이 혈액에서 다른 파라미터와 상관관계가 있는지를 조사하였다. 혈청에서 글루코스 수준의 상관관계, 및 인슐린 수준 및 miR-1983 사이의 유의한 상관관계에 대한 경향을 발견하였다. 이는 실시예 7에 요약된 바와 같이, 인간 환자에서 miR-1983이 이러한 파라미터와 상관관계가 있는지의 평가로 이끌었다.
실시예 7: 인간에서 인슐린 저항성의 바이오 마커로서 miR -1983의 혈청 수준
마우스에서의 혈청 miR-1983 상승은 시상 하부의 상승과 일치함이 나타났으며, 이는 혈청 수준이 시상 하부 변화에 대한 대체로서 사용될 수 있음을 시사한다.
miR-1983을 인간에게서 설명하였다 (Edinger et al., 2014; Hasler et al., 2016). 이와 같이, 인간 대상체의 혈청에서 이 miRNA를 분석하기로 결정하였다.
miR-1983은 순환 인슐린 수준 및 HOMA-IR 점수의 증가와 상관관계가 있다.
miR-1983은 체질량 지수(BMI)가 25보다 큰 것으로 평가되고, 과체중 및 비만으로 분류된 모든 인간 대상체에서 검출되었다 (도 11C). miR-1983의 혈청 수준은 다양한 혈액 파라미터와 유의한 상관 관계가 있었으며 (도 11D, 표 1), 선형 회귀 분석으로 나타난 인슐린 및 HOMA-IR 점수 증가와 가장 긍정적으로 연관되어 있다 (도 11E). 이러한 데이터는 마우스에서의 발견을 보완하고 miR-1983이 인슐린 저항성의 순환 지표로서 작용할 수 있다는 발견을 지지한다. 데이터는 miR-1983이 검출될 수 있고 인슐린 저항성을 발달시키는 상이한 단계를 제안한다. 사용된 방법의 세부 사항은 실시예 10에 제공된다.
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실시예 8: 60% HFD를 공급한 CD-1 수컷 마우스에서 miR-1983의 억제는 인슐린 민감도, 공복 혈당을 향상시키고, 시상 하부의 InsR 단백질 수준을 회복시킨다
수컷 CD-1 마우스에서 60% HFD 챌린지에 반응하여 miR-1983이 신체에서 하나 이상의 위치에서 변화한다는 것을 알고, miR-1983 억제제의 유도된 비강 내 노출을 사용한 시상 하부에서 주요한 miR-1983 수준 증가의 영향을 결정하는 것으로 밝혀졌다. 이 실시예에서 사용된 방법은 실시예 10에서 찾을 수 있다.
실험적 패러다임은 뇌에서 특이적으로 miR-1983의 억제가 60% HFD에 노출시 전신 인슐린 민감도를 변화시킬 수 있는지를 시험하도록 설계되었다. 60% HFD를 공급 받은 수컷 CD-1 마우스 및 비강내 단일 용량으로 생체 내 LNA miRNA miR-1983 억제제가 투여되거나 또는 생체 내 LNA miRNA 음성 대조군(도 7A)의 그룹 모두 생체 내 LNA miRNA 음성 대조군으로 주어진 chow 그룹과 비교하여 5주 실험에 걸쳐 동일한 무게를 얻었다 (도 7B 및 도 7C). 생체 내 연구를 miR-1983에 의한 InsR 조절의 시험관 내 발견과 연결하기 위해, 마우스의 인슐린 민감도를 miR-1983의 억제제에 대한 비강 내 또는 음성 대조군에 대해 노출 1주 후 검사하였다. 복강 내 (IP) 인슐린 투여 후 10분 및 20분에 음성 대조군이 주어진 이들의 대응물에 비해 억제제-처리된 60% HFD 공급받은 마우스의 인슐린 민감도에서 유의미한 개선이 관찰되었다 (도 7D). 비강 내 처리 2주 후 모든 마우스에 대한 공복 혈당 분석은 억제제가 주어진 HFD 공급 그룹이 HFD 공급 음성 대조군과 비교하여 유의하게 더 낮은 값을 나타냈지만, 여전히 chow 공급 동물와 대비해서는 높았다(도 7E). 5주 실험의 완료시, 마우스의 시상 하부를 수집하여 miR-1983이 음성 대조군과 비교하여 억제제-처리된 그룹에서 여전히 감소되었으며, 이들 그룹 둘 다가 chow 대조군과 비교하여 Npy mRNA의 유사한 감소와 함께 AgRP, Pomc 및 Insr의 유사한 mRNA 수준을 보임을 밝혔다(도 7F). 도 7G에 도시된 바와 같이, HFD상의 miR-1983 억제제-처리된 동물은 대조군 동물과 비교하여 시상 하부에서 유사한 InsR 단백질 수준을 갖는 반면, 음성 대조군으로 주어진 동물은 miR-1983의 증가된 수준에 상응하여 InsR 수준을 상당히 감소했다. 전반적으로, 이러한 발견은 miR-1983 억제제를 수용하는 HFD-공급 동물에서 관찰된 증가된 인슐린 민감도가 시상 하부에서의 InsR 단백질 신호 전달의 보유에 기인한 것임을 시사한다. 이 실시예에서 사용된 방법은 실시예 10에서 찾을 수 있다.
실시예 9: miR-1983 억제제의 비강 내 투여를 통한 인간의 miR-1983 억제
Exiqon (서열번호 2)에 의해 생산된 생체 내(in vivo) 준비된 miR-1983 LNA 억제제의 비강 내 전달, 일반적으로 연구자들은 이러한 억제제를 입체 정위 캐뉼라(stereotaxic cannulation) 및 주사를 통해 뇌에 투여하거나 뇌실 내(ICV)는 혈액 뇌 또는 CSF-뇌 장벽을 우회함으로써 시상 하부를 선택적으로 표적화하기 위해 인간에서 사용될 가능성이 있다 (Born et al., 2002; Dhuria et al., 2010). 다수의 펩타이드의 비강 내 투여가 높은 침투에서 시상 하부에 도달하는 것을 제안하는 증거는 본 연구에서 궁상핵이 항-miRNA로 표적화될 수 있음을 허여한다 (Meredith et al., 2015). ICV 투여와 비교하여 일반적으로 사용되지는 않지만, 비강 내 투여 방법론은 마우스 뇌에서 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF)를 조절하는 miR-206의 역할을 결정하는데 성공적이었다 (Lee et al., 2012). 결과는 HFD에 2주 노출 후 주어진 단일 용량의 miR-1983 억제제가 일주일 후에 복강 내 인슐린 내성 시험(IpITT) 시험에 의해 측정된 바와 같이 인슐린 민감도를 개선시키기에 충분하고, 대조군 LNA를 받은 그룹과 비교하여 2주 후 공복 혈당을 낮추기에 충분하다는 것을 입증하였다 (도 7D). miR-1983 억제제에 단 한 번의 노출만으로 인슐린 민감도가 크게 개선됨이 관찰되었다. LNA miR 억제제는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드와 비교하여 안정성이 증가하였으며, 이는 생체 내(in vivo) 이들 약물의 오랜 지속 효과를 설명할 수 있다. 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드의 투여는 또한 수컷 HFD-공급 CD-1 마우스의 시상 하부에서 InsR 단백질 수준의 감소를 방지하였고 (도 7G), 이 miRNA의 하류 표적으로서 InsR을 암시하는 시험관 내(in vitro) 데이터를 추가로 지지한다.
실시예 10: 방법
세포 모델 및 배양 조건
뮤린 mHypoE-46 (수컷), mHypoA-NPY/GFP (암컷), mHypoA-POMC/GFP-2 (수컷) 세포주는 전술한 바와 같이 5% 태아 소 혈청 (FBS; (Gibco, Thermofisher Scientific, MA, Waltham, MA), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco)이 37℃에서 5% CO2로 보충된 5.5 mM 글루코스 둘베코의 변형 이글스 배지(Dulbecco’s Modified Eagles Medium) (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)에서 배양되며, 이전에 전술된 바와 같다(Belsham et al., 2004; Dhillon et al., 2011; Mayer and Belsham, 2009, 2010a; Nazarians-Armavil et al., 2014; Wellhauser et al., 2016).
동물 모델
C57B1/6, CD-1 및 MKR 계통의 수컷 및 암컷 마우스를 7주령에 Charles River Laboratories (Montreal, QC, Canada)에서 구입하고 실험 시작 전 1주일 동안 적응하게 하였다. 마우스는 12:12 명-암 스케줄 (오전 7시-오후 7시)에 유지하였다. 모든 동물 실험은 토론토 대학 (University of Toronto)의 동물 관리 위원회의 승인으로 수행되었다. CD-1 및 C57BL/6 마우스는 지방 식이 (60% HFD) 또는 대조군 (7% 수크로스 매칭)식이 (각각 D12492 및 D12450J, Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ, USA)로부터 60% kcal를 공급받았다. MKR 마우스에는 Teklad Diet 8664 (Envigo, Madison, WI, USA)를 공급하였다. 지시된 경우, 마우스를 매주 체중을 측정하여 5주 식이 노출 코스 동안의 체중 증가를 추적하였다. 모든 동물을 이소플루란으로 안락사시키고, 4-16시간 단식(fast) 후 (도면 범례에 언급된 바와 같이), 조직 및 혈액을 수집하고 분석을 위해 처리될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 인슐린 수준을 분석하기 위해 수집된 혈액을 헤파린 코팅된 주사기를 사용하여 수집한 후 샘플을 4℃에서 10분 동안 6,000 x g에서 회전시켰으며, 이때 혈장을 분리하고 -80℃에서 저장하였다. 혈청 샘플을 심장 천자(cardiac puncture)를 통해 마취하에 회수하고 얼음에 1시간 동안 응고시킨 후, 3,000 x g에서 10분 동안 원심 분리 한 후 (Hsieh et al., 2015), 샘플을 -80℃에 보관하였다. CD-1 (수컷) 및 C57 (수컷 및 암컷) 마우스의 초기 코호트로부터 시상 하부를 수득하였고, 이러한 마우스로부터의 물질대사 파라미터의 추가 세부 사항을 공개하였다 (Liu et al., 2016; Prentice et al., 2014).
인간 환자 연구 참가자
인간 환자 연구는 University Health Network Research Ethics Board에 의해 승인되었으며 헬싱키 선언에 준수해서 수행되었다. 다양한 체질량 지수 (BMI) 및 인슐린 민감도를 갖는 대상체를 모집하였다. 총 24명의 피험자가 연구에 포함되었다. 총 11명의 남성 (m) 및 13명의 여성 (f)이 있으며, BMI에 의해, 25 미만 (m=2, f=4), 25-29 사이 (m=6, f=3), 및 30 보다 큰 것(m=3, f=6)으로 분류되었다. 혈청을 코팅되지 않은 튜브에서, 밤새-단식된 상태로 수집하고, 응고시키고, 4℃에서 15분 동안 3,000 x g에서 회전시켰다. 이후 혈청을 -20℃에서 즉시 동결시킨 다음, 장기간 저장을 위해 -80℃로 옮겼다. 순환 글루코스의 측정은 글루코스 측정기로 측정되었다. 순환 인슐린은 토론토 종합 병원 (TGH) 핵심 실험실의 Abbott Architect i2000 시스템에서 Elisa를 통해 측정되거나 제조업체의 지침에 따라 EMD Millipore로부터 HI-14K | 인간 인슐린-특정 방사성 면역 분석법 (Etobicoke, ON, Canada)에 의해 측정되었다. TGH의 코어 실험실은 나열된 모든 순환 혈액 파라미터를 분석했다. 연구에 포함된 대상체는 인슐린 또는 인슐린 증감제를 복용하지 않았다. 인슐린 저항성 (HOMA-IR) 점수의 항상성 모델 평가는 HOMA2 모델을 사용하여 결정되었다 (Levy et al., 1998).
miR -1983 억제제의 비강 내 투여 또는 생체 내( in vivo ) 대조군
순응 기간 후, 마우스를 대조군 식이 또는 60% HFD에 2주 동안 두었다. 2주 기간의 마지막 날에, 마우스에 맞춤 생체 내(in vivo) 잠금 핵산 (LNA) miR-1983 억제제 (5’-3’, A*C*A*T*G*C*T*C*C*A*G*G*T*G*A) (서열번호: 2), 또는 음성 대조군 (5’-3’, A*C*G*T*C*T*A*T*A*C*G*C*C*C*A) (서열번호: 3)을 투여하였으며, 이는 멸균 0.9% 식염수(saline)에 1 nmol/ul의 농도로 용해된 Exiqon (Woburn, MA, USA)에 의해 합성된다. 상기 기술된 바와 같이 마우스를 이소플루란을 통해 마취시키고, 흉골 위치에 놓고 총 10 mmol의 miR-1983 억제제 또는 음성 대조군을 총 10 ul 부피로 비강내에 투여하였다. 마우스의 호흡에 대한 영향을 최소화하기 위해, 비강에서의 치료의 보유를 최대화하면서, 2.5 ul의 억제제 또는 음성 대조군을 마우스 쌍으로 투여하고 각 액적 사이에 2 분씩 투여하였다. 마우스를 마취 상태에서 흉골 위치에 두었다. 그 후 마우스를 마취로부터 회복시키고 깨끗한 가정 케이지로 돌려 보내고 그들의 식이 요법을 계속하게 하였다. 처리 후 1주 및 2주 후, 마우스는 복강 내 인슐린 내성 시험(IpITT)을 받았다. 식이 요법의 총 5주 후, 마우스를 안락사시키고 (상기 상세히 설명된 바와 같이) 조직 및 혈청을 수집하고 -80℃에서 저장하였다.
복강내 인슐린 내성 시험(IpITT)
인슐린 내성 시험 및 혈당 측정 전에 마우스를 4시간 동안 단식시켰다. EMLA 크림 (리도카인 2.5% 및 프리로카인 2.5%, AztraZeneca)을 꼬리 끝에 바르고 꼬리로부터 ≤1 mm를 자르기 전 효과가 나타나도록 하고 혈액 방울 수집을 하게 하였다. 기저 혈당 샘플을 꼬리를 착유하고, 혈당 측정기 (Bayer Contour USB)에 삽입된 글루코스 스트립에 한 방울의 혈액을 적용함으로써 수득하였다. 이어서 마우스에 kg 체중 당 1 국제 단위 (IU)의 인슐린 (Humulin R, Eli-lily)을 주사하였다. 또한, 후속 시점 (10, 20, 30, 60 및 120분)에서 혈당 측정을 수행하였다. 필터 멸균된(0.22 μm) 0.1% 유리 지방산, 소 혈청 알부민(BSA)이 없는 0.9% 식염수로 stock Humulin을 희석하여 인슐린을 제조하였다. 마우스에 대한 혈당 측정 및 인슐린 내성 시험을 위한 공복의 개시는 모든 실험에 대해 대략 하루 중 동일한 시간에 수행하였다.
마이크로어레이 실험: 분석 및 검증
mHypoE-46 세포주는 멸균된 1X 포스페이트 완충 식염수 (PBS, 비히클 대조군) 또는 100 nM 인슐린 (Novorapid Insulin, Novonordisk, Mississauga, Canada, Canada)으로 4시간 및 24시간 동안 처리한 후, 제조사의 지침에 따라 miRNA를 수확하고 Mirvana miRNA 분리 키트(Ambion, Thermofisher Scientific, MA, Waltham, MA)로 분리하였다. mHypoA-NPY/GFP 및 mHypoA-POMC/GFP-2 세포주를 또한 16시간 동안 100 nM 인슐린으로 처리하여 miR-1983 발현, 이전 작업에 기초하여 이들 세포주에서 인슐린 저항성을 유발하기에 충분한 시점을 조사하였다. 620 프로브를 포함하는 miRBase v15를 기반으로, 마우스 miRNA 및 마우스 관련 바이러스 miRNA용 나노스트링 n카운터 분석 시스템(Nanostring nCounter analysis system)으로 miRNA 분석을 위해 Princess Margaret Genomics Center에 제출하기 전에 Nanodrop 2000c 분광 광도계 (Thermofisher Scientific)에서 총 RNA의 수량 및 품질에 대해 평가하였다. 품질의 초기 평가 및 데이터의 표준화는 Nanostring Technologies에 의해 nSolver Analysis software NanoString v1.0을 사용하여 MicroArray Center에서 수행하였다(Seattle, WA). 정규화 인자를 계산하기 위해 기하 평균 방법을 사용하여 코드 수(Code counts)를 양성 대조군으로 정규화하였다. 다음으로, 상위 100개의 유전자 및 기하 평균 방법을 사용하여 코드세트 함량 정규화(CodeSet content normalization)를 수행하여 정규화 인자를 계산하였다. 정규화된 코드 수는 통계 분석을 위해 log2 값으로 변환되었다. 마이크로어레이 결과의 수령시, mHypoE-46 세포에서의 실험을 반복하고 Purelink Mini RNA 분리 컬럼 (Ambion, Thermofisher Scientific, Waltham, MA)을 사용하여 RNA 분리를 수행하였다. DNase 처리는 제조사 (Thermofisher Scientific)의 지시에 따라 온-컬럼 Purelink DNase를 사용하여 RNA 분리 동안 수행되었다. RNA를 정량하고 Nanodrop 2000c 분광 광도계 (Thermofisher Scientific)로 순도를 평가하였다.
miRNA 표적 동정
miRNA 표적은 Mirwalk 2.0 software를 사용하여 확인하였다 (Dweep and Gretz, 2015; Dweep et al., 2011). 네 가지 알고리즘 (mirWalk, miRanda (Betel et al., 2010; Betel et al., 2008), RNA22 (Miranda et al., 2006) 및 Targetscan (Lewis et al., 2005))에 모두 나타날 수 있는 잠재적 표적은 pantherdb.org를 사용하여 관심있는 경로로 분류하기 위해 선택되었다 (Mi et al., 2013; Mi et al., 2016). 인슐린 신호 전달 경로에 관여하는 것으로 밝혀진 mRNA 표적은 추가 조사를 위해 선택되었다. 허용된 문헌에 따라 miRNA 표적이 양호한 miRSVR 점수를 갖는 것으로 확인되었고 (Betel et al., 2010), Targetscan 마우스를 사용하여 인간과 마우스 mRNA 서열 사이의 유사한 표적 부위를 동정하였다 (Agarwal et al., 2015; Lewis et al., 2005).
mRNA 분석을 위한 역전사 (RT), 정량적 PCR (qPCR) 및 프라이머 디자인
mRNA 분석을 위해, 500 ng 내지 1 ㎍의 총 RNA는 제조자의 지시에 따라 ABI 고용량 cDNA 아카이브 키트를 통해 제1 가닥 cDNA 합성에 이용되었다. qPCR은 Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG w/ROX (Thermofisher Scientific), 및 Primer Quest online tool (Integrated DNA Technologies (IDT), IA Coralville)을 사용하여 설계된 프라이머를 사용하여 수행되었다. 프라이머 서열은 표 2를 참조한다. 모든 세포주에 대해, 12.5 또는 25 ng의 cDNA의 샘플을 qPCR에 대한 10 ul 반응에서 3회 로딩하고 25, 12,5, 6.25, 3.125 ng의 용량 곡선을 사용하여 절대 RNA 값을 계산하였다. 모든 동물 조직에 대해 25 ng의 cDNA의 샘플을 3회 반응에 로딩하고 델타 델타 CT 방법 (Livak and Schmittgen, 2001)을 사용하여 동물 그룹 사이의 상대적인 배수 변화를 계산하였다. 분석을 위해 모든 유전자의 총 mRNA 수준을 히스톤 3a로 정규화하였다. 샘플을 384-웰 플레이트에 로딩하고 광학 접착 커버로 밀봉하였다(Applied Biosystems (ABI, Foster City, CA로 부터 둘 다). 플레이트는 다음 조건 하에서 ABI 7900HT 열 순환기를 실행하였다; 2분 동안 50℃, 2분 동안 95℃, 그런 다음 95℃ 15초의 40 사이클 및 1분 동안 60℃ 이어서 15초 동안 95℃, 15초 동안 60℃ 및 15초 동안 95℃에서 용융 곡선. ABI 7900HT 열 순환기의 출력를 ABI Prism 7000 SDS 2.4 소프트웨어 (ABI)를 사용하여 분석하였다.
정량적 PCR , 클로닝(Cloning) , 및 시퀀싱 프라이머 서열
qPCR 프라이머 Forward 5' → 3' Reverse 5' → 3'
AgRP CGGAGGTGCTAGATCCACAGA (서열번호: 22) AGGACTCGTGCAGCCTTACAC (서열번호: 23
히스톤 3a CGCTTCCAGAGTGCAGCTATT (서열번호: 24) ATCTTCAAAAAGGCCAACCAGAT (서열번호: 25)
인슐린 수용체 TCCCATCAAATATTGCCAAAATT (서열번호: 26) CAGAAATAGATAAATACTTCCAATCAC (서열번호: 27)
NPY CAGAAAACGCCCCCAGAA (서열번호: 28) AAAAGTCGGGAGAACAAGTTTCATT (서열번호: 29)
POMC CCCGCCCAAGGACAAGCGTT (서열번호: 30) CTGGCCCTTCTTGTGCGCGT (서열번호: 31)
클로닝 프라이머 　 　
Insr 3'UTR + SacI
위치 (굵은 글씨)		 Forward 5' → 3' 　
TTGTCTGCATGAGCTCTCAGAAGTCTTGCTCAGGTG (서열번호: 32)
Insr 3'UTR + SalI
위치 (굵은 글씨)		 Reverse 5' → 3' 　
CGGTCTGACCCGTCGACACCATCATTCATTTACCAAG (서열번호:33)
시퀀싱 프라이머 Forward 5' → 3' Reverse 5' → 3'
pmirGLO GATCGCCGTGTAATTCTAGT (서열번호: 34) CCAACTCAGCTTCCTTTCGG (서열번호: 35)
miR-1983 결합 위치 영역 ATGTTGCCAGGGAACTCAAT (서열번호: 36) 　
miRNA 분석을 위한 RT-PCR
miRNA 분석을 위해, miR-1983 (ID:121204_mat), miR-20a-3p (ID:002491), miR-296-5p (ID:000527) 및 Let-7d-5p (ID:002283)에 대한 RT 및 qPCR 반응용 Taqman® miRNA 역전사 키트 (Thermofisher Scientific) 및 Taqman® miRNA 분석 특이적 프라이머를 사용하고 100-250 ng의 총 RNA를 사용하여 cDNA를 생성하였다. qPCR은 Taqman® Fast Advanced Master mix (Thermofisher Scientific)로 3회 10 ul 반응으로 25 ng의 cDNA를 로딩함으로써 수행되었다. 플레이트는 ABI 7900HT 열 순환기를 다음 조건하에서 수행하였다: 2분 동안 50℃, 20초 동안 95℃, 1초 동안 95℃ 및 20초 동안 60℃ 40회 사이클. 델타-델타 CT 방법을 사용하여 그룹들 간의 상대적인 폴드 변화를 계산하였다. miRNA 수준을 내부 대조군으로서 snoRNA202 (ID:001232) 수준으로 정규화하였다 (Livak and Schmittgen, 2001).
마우스 혈청 RT-qPCR로부터 miRNA 분리
혈청 샘플을 Ambion174® PARIS 키트 (Thermofisher Scientific)를 사용하여 분리하였다. 간단히, 샘플을 얼음에서 해동시키고, 200 ul의 각 샘플을 2X 변성 용액과 합하고 얼음에서 5분 동안 배양하였다. 그 후, IDT에 의해 합성된, 25 fmol의 cel-miR-39-3p RNA (서열 5' → 3 '; UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG (서열번호: 37)를 각각의 샘플에 첨가하여 miRNA 수준을 정규화하기 위한 내부 대조군으로 사용하였다 (Li and Kowdley, 2012). cDNA는 TaqMan Advanced miRNA cDNA 합성 키트를 사용하여 합성되었고, qPCR은 miR-1983 (표 3) 및 cel-mir-39 (ID:478293_mir)용 TaqMan Advanced miRNA 분석 및 제조사 프로토콜의 사양에 따른 Taqman Fast Advanced 마스터 믹스을 사용하여 10 ul 반응에서 3회 수행되었다. 또한 알려진 순환 인간 microRNA (Villard et al., 2015) miR-142-3p (TaqMan ID:477910) 및 miR-222-3p (Taqman ID:477982)의 존재에 대해 인간 혈청 샘플을 분석하였다(데이터 미첨부). 샘플을 플레이트에 로딩하고 (상기 지시된 바와 같이) 다음 조건하에 ABI 7900HT 열 순환기를 다음 조건하에서 실행하였다; 20초 동안 95℃, 1초 동안 95℃에서 40사이클, 및 20초 동안 60℃. 실험군의 비교는 델타-델타 CT 방법을 통해 수행되었다 (Livak and Schmittgen, 2001).
마우스 miR -1983 및 인간 miR -1983의 뉴클레오티드 서열
종(Species) 뉴클레오티드 서열 5' 내지 3'
마우스 miR-1983 CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)
인간 miR-1983 CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)
인간 miR-1983은 염색체 6에서 발견되고 마우스 miR-1983은 염색체 13에서 발견된다. 붉은 털 원숭이(Rhesus Macaques)는 동일한 miRNA-1983 서열을 가지고 있다 (염색체 4에서 발견됨).
mHypoE -46 세포에서의 miRNA -1983 미믹 트랜스펙션
mHypoE-46 세포를 100 mm 조직 배양 접시에서 70-75%의 컨플루언시(confluency)로 배양하고, 25 nM의 miRNA-1983 미믹 또는 음성 대조군 (Thermofisher Scientific)을 5 ug/ml의 Dharmafect 3(Dharmacon, GE, location)를 사용하여 제조사의 사양에 따라 24시간 또는 48시간 동안 mHypoE-46 세포로 트랜스펙션시켰다. 이어서, 세포를 1X PBS로 세척하고 15분 동안 10 nM의 인슐린으로 재-챌린지하기 전에 1 시간 동안 무혈청 5.5 mM DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)에 넣었다. 세포를 빙냉 1X PBS로 세척한 다음, 제조사의 사양에 따라 Ambion® PARIS 키트를 사용하여 총 단백질 및 RNA (miRNA 포함)의 분리를 수행하였다.
pmirGLO로의 Insr 3'UTR의 클로닝 및 mHypoE-46 세포에서 구조체(construct) 및 miRNA-1983 미믹의 공동-트랜스펙션(co-transfections)
Insr 유전자의 3'UTR을 pmirGLO 벡터(Promega corporation, Madison WI)의 다중 클로닝 사이트에 상보적인 제한 효소 사이트를 첨가하도록 설계된 프라이머를 사용하여 마우스 게놈 DNA(Genomic DNA Purification Kit, Thermofisher Scientific)로부터 증폭시켰다. 벡터 및 3'UTR 둘 다의 제한 다이제스트(restriction digest) 후, 둘은 결찰되고 HB101 적격 세포로 변형되었다. 암피실린 저항성인 박테리아 콜로니를 선택하고 성장시켜 DNA를 분리하여 올바른 방향으로 삽입물의 존재를 확인하였다. 제한 효소 및 완충액은 Cell Signaling Technology Inc.(Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다. 3'UTR Insr 삽입물을 함유하는 벡터 DNA를 Centre for Applied Genomics (TCAG, Toronto, ON, Canada)에서 시퀀싱(프라이머의 경우 표 2 참조)하기 위해 보냈다. 트랜스펙션을 위해, mHypoE-46 세포를 6개의 웰 플레이트 (Sarstedt, Montreal, QC, Canada)에서 70-75%의 컨플루언시로 배양하였다. 그런 다음 25nM의 miRNA-1983 미믹 또는 음성 대조군(위에서 사용됨) 및 5 ug의 pmiRGLO-Empty 또는 3'UTR Insr을 웰당 6 ul의 Turbofect(Dharmacon, GE, location)을 사용하여 제조사의 사양에 따라 48시간 동안 트랜스펙션시켰다. 세포를 빙냉 1 x PBS로 1회 세척한 후 세포를 제조사의 지시에 따라 웰당 450 ul 패시브 용해 완충액(passive lysis buffer) (Biotium Inc., Fremont, CA, USA)에 용해시켰다.
단백질 분리, SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅
단백질을 전술한 바와 같이 분리하거나(Nazarians-Armavil et al., 2014) 또는 제조사의 사양에 따라 Ambion174® PARIS 키트를 사용하여 분리하였고, 비신코 닌산(BCA) 단백질 분석 키트 (Pierce, Thermofisher Scientific)를 사용하여 정량화하였다. 웨스턴 블로팅의 경우, 각 샘플에 대해 15-25 ug의 단백질 (sample buffer Biorad, TCEP bond breaker solution) (비등을 위해 Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 10% 비스-아크릴아미드-트리스 겔상에서 분석하고 iBlot 2 건식 블로팅 시스템 (Thermofisher Scientific)을 사용하여 0.2 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 면역-블롯 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 옮겼다. 래빗 2차 항체 IgG, 및 Signalfire elite ECL 시약과 함께, InsRβ-서브유닛, α-튜블린, 인산화 AKT 및 총 AKT에 대한 항체(래빗 항-마우스)를 cell signaling technology Inc.(Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다. 로딩 대조군으로서 사용된 β-액틴 항체는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 모든 1차 항체 (1:1000)를 0.1% Tween-20 (TBS-T)과 함께 트리스-버퍼 식염수에서 5% 탈지유(non-fat milk)로 4℃로 밤새 배양하였다. 이어서 항-래빗 2차 항체 (1:7500)를 사용하고, 1X TBS-T에서 5% 탈지유로 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 블롯을 0.1% TBS-T로 30분 동안 세척하고 Kodak Imaging 3000 station Eastman Kodak Company, Rochester, NY에서 이미지화하였다. 총 AKT 검출을 위해, 지시된 바와 같이 restore plus stripping buffer(Thermofisher Scientific)를 사용하여 블롯을 제거하고, 재-프로브(re-pobed)하였다. 마우스의 시상 하부 조직에 대한 웨스턴 블로팅을 수행하여 모든 그룹을 처리하고, 겔상에서 작동시키고, 항체와 함께 배양하고 동시에 이미지화시켰다. 밀도 측정은 Image J Software (Image J software, NIH, Bethesda, MD, USA, http://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 수행하였다.
mHypoE -46 세포주의 팔미트산염 처리
mHypoE-46 세포주FMF 멸균수 또는 50 μM의 팔미트산 나트륨 (Sigma-Aldrich)으로 24시간 동안 처리하였다. 분말 및 멸균수를 혼합하고 완전히 용해될 때까지 혼합물을 65℃로 가열함으로써 팔미트산 나트륨 용액을 제조하였다. 이어서, 용액을 따뜻한(37℃) 세포 배양 배지에 직접 첨가하고 세포를 즉시 처리하였다. miR-1983 수준의 평가를 위에서 설명한 바와 같이 완료하였다.
통계 분석
모든 데이터를 GraphPad Prism Version 6.0c를 사용하여 분석하였다. 설명 된 바와 같이, 스튜던트 t-테스트(students t-test), 일 또는 이-원 ANOVA에 이어 Bonferroni 또는 Fisher의 LSD post-hoc 분석을 수행하였다. p-value가 p<0.05인 경우 데이터는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 데이터는 ± SEM으로 표시된다.
실시예 11
잠재적인 응용을 위한 중요한 고려사항은 이들이 두 성별에 적용되는지의 여부이다. C57Bl/6 암컷 마우스는 HFD에 노출된 후 뉴로펩타이드 수준에서 유사한 패턴이 나타났으며, 이는 12주 동안 35% HFD를 공급받은 암컷 C56Bl/6 마우스에 의해 관찰된 것과 방향 및 규모가 유사하였다 (Lee et al., 2010). CD-1 암컷 마우스는 HFD에 7-9주 노출된 후 암컷 C56B1/6 마우스에서 나타난 것과 매칭되는 5주 후 연구에서 그들의 수컷과 비교하여 NPY에서 동일한 변화를 나타냈다. 전반적으로, 이러한 연구에서 관찰된 Npy 및 Pomc mRNA 수준에서의 각 보상적 변경은 이전에 보고 된 것과 유사하다 (Bergen et al., 1999). 인슐린 노출 후 성체 암컷 mHypoA-NPY/GFP 세포 모델에서 miR-1983의 명확한 상향 조절이 관찰되었지만, HFD 공급 후 생체 내(in vivo)에서 동일한 변화는 관찰되지 않았다. 이 발견은 암컷 시상 하부 뉴런이 더 높은 인슐린 수준에 장기간 노출되면, miR-1983이 상향 조절될 수 있지만, 두 계통의 암컷 마우스가 분석된 기간 내에 고인슐린 혈증이 발생하지 않았기 때문에, miR-1983 수준의 변화가 관찰되지 않는다는 개념을 뒷받침한다. HFD 및 기타 생리학적 변화의 소비가 miR-1983을 바꿀 수 있는 가능성이 있었지만, 이는 사실이 아닌 것 같다.
순환 인슐린의 생체 내(in vivo) 변화가 시상 하부 miR-1983을 변경하는데 필요하다는 생각을 추가로 지지하며, HFD를 포함하는 가장 풍부한 포화 지방산을 갖는 mHypoE-46 세포, 24시간 동안 50 μM에서 팔미트산염의 처리는 인슐린으로 관찰되는 것과는 반대로 miR-1983 수준의 현저한 감소를 유발하는 것을 확인하였다. 이 발견은 또한 유사한 Npy/AgRP 뉴런 세포 모델을 사용하는 이전 데이터와 일치하며, 팔미트산염이 인슐린과 비교하여 대체 메커니즘을 통해 인슐린 저항성을 유도하는 것을 밝혔다 (Mayer and Belsham, 2010b). 이는 비만 및 HFD- 관련 T2DM 대 비만-독립적, 마른 및 과체중 사람 모두에서 고인슐린성 질병의 발달에 영향을 미칠 수 있다.
C57B1/6 및 CD-1 배경 둘 다의 암컷 마우스에 의한 HFD의 섭취는 상당한 체중 증가 및 공복 혈당 수준 둘 다를 초래하였다. 암컷 마우스는 HFD 식이에서 훨씬 오랜 시간까지 말초에서 인슐린 저항성이 되지 않는 것이 일반적으로 받아들여지지만 (Medrikova et al., 2012), 연구 기간 내에 수컷 마우스에서와 같이 주요 뉴로펩타이드 Npy, AgRP 및 Pomc의 mRNA 수준에서 이와 유사한 변화를 관찰한 것은 놀라운 일이었다. 이 발견은 연구에서 HFD를 사용하는 대부분의 연구는 수컷처럼 조기에 예상되는 말초 변화를 나타내기 않기 때문에 암컷 마우스를 배제하지만, 뇌의 수준에서 그들은 실제로 뉴로펩타이드 함량에 상당한 변화를 가질 수 있음을 암시하므로, 신진 대사 연구에서 수컷 상대와 병행하여 검사해야 한다.
miR-1983의 변화는 CD-1 수컷 마우스에서 뉴로펩타이드 수준의 조절 장애 이전에 나타나고, 마우스가 HFD에 10주 동안 방치될 때 사라진다. 이 생체 내(in vivo) 데이터는 miR-1983이 24시간 후에 증가하지만, 48시간 후에는 증가하지 않는 시험관 내(in vitro) 관찰과 일치한다. 이전의 연구는 58% HFD에서 8주 후에 회복성 저지방 식이요법을 할 때 C57Bl/6 마우스에서, 다른 많은 miRNA 중, miR-1983에서 거의 3배 감소한 것을 발견했지만, HFD 그룹에서 12주 후 miR-1983의 증가는 관찰되지 않았다 (Hsieh et al., 2015). 시상 하부에서의 miRNA 발현에 대한 타이밍의 영향은 또한 2주 동안 45% HFD를 공급받은 랫트에서 이전에 보여졌으며, 1개월 및 3개월 후의 miRNA 수준의 후속 검사는 시험된 각각의 miRNA 종에 대한 차등적인 효과를 나타냈다 (Sangiao-Alvarellos et al., 2014).
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Claims (35)

  1. CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)의 적어도 일부에 상보적인 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 일부가 CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (서열번호: 1)의 적어도 2 내지 8 뉴클레오티드를 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  2. 제1항에 있어서, 일부가 TCACCTGGAGCATGT (서열번호: 4)인 것인, miR-1983 억제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 RNA를 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  4. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 것인, miR-1983 억제제.
  5. 제4항에 있어서, 화학적 변형은 2'위치에서의 변형을 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  6. 제5항에 있어서, 변형은 2'O메틸(2'O-Me), 2'-O-메톡시에틸(2'O-MOE), 2'플루오로(2'F), 및 잠금 핵산 단량체(LNAM)로부터 선택되는 것인, miR-1983 억제제.
  7. 제6항에 있어서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 복수의 뉴클레오티드 단량체의 화학적 변형을 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  8. 제7항에 있어서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 복수의 잠금 핵산 단량체(LNAM)를 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  9. 제8항에 있어서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 잠금 핵산(LNA) 또는 LNA/DNA 믹스머(mixmer)인 것인, miR-1983 억제제.
  10. 제9항에 있어서, LNA는 서열 5'-3',A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A (서열번호: 2)를 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  11. 제10항에 있어서, LNA는 서열 5'-3', A*C*A*T*G*C*T*C*C*A*G*G*T*G*A (서열번호: 2)를 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  12. 제10항에 있어서, LNA는 서열 5'-3', A*C*A*U*G*C*U*C*C*A*G*G*U*G*A (서열번호: 2)를 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  13. 제1항 내지 제12항의 어느 한 항에 있어서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 미스매치 및 최대 4개의 미스매치를 포함하는 것인, miR-1983 억제제.
  14. 제1항 내지 제13항의 어느 한 항에 있어서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥인 것인, miR-1983 억제제.
  15. 제1항 내지 제13항의 어느 한 항에 있어서, 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥인 것인, miR-1983 억제제.
  16. 제1항 내지 제15항의 어느 한 항에 있어서, 억제제는 항-miR-1983 올리고뉴클레오티드인 것인, miR-1983 억제제.
  17. 제1항 내지 제16항의 어느 한 항의 miR-1983 억제제 및 희석제를 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 비강내 제형으로 제형화된 것인, 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 희석제는 염분(Saline)을 포함하는 것인, 조성물.
  20. miR-1983의 수준을 측정하는 것 및 역치 또는 대조군과 비교하는 것을 포함하는, 세포가 인슐린 저항성인지를 검출하는 방법으로서,
    여기서, 대조군과 비교하여 증가된 수준은 세포가 인슐린 저항성을 나타내는 것인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 세포는 뉴런 세포, 선택적으로 시상 하부 세포인 것인, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것인, 방법.
  23. 대상체의 생물학적 샘플에서 miR-1983의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대상체에서 당뇨병 전증 또는 당뇨병 발생의 증가 가능성을 검출하는 방법으로서,
    여기서, 역치 또는 대조군과 비교하여 증가된 수준은 대상체가 당뇨병 발생의 증가 가능성을 가지는 것을 나타내는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 검출은 시상 하부에서 하나 이상의 뉴로펩타이드의 조절장애 전에 일어나는 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 하나 이상의 뉴로펩타이드는 NP 또는 AgRP인 것인, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항의 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈청 샘플인 것인, 방법.
  27. 제23항 내지 제26항의 어느 한 항에 있어서, miR-1983의 수준은 정량적 PCR 방법에 의해 측정된 것인, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 정량적 PCR 방법은 세포 또는 생물학적 샘플로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 생성하는 것, 서열 특이적 프라이머를 사용하여 cDNA를 증폭시키는 것 및 miR1983의 수준을 정량화하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  29. 제23항 내지 제28항의 어느 한 항에 있어서, 대상체는 인간인 것인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 인간 대상체는 25 미만의 체질량 지수를 갖는 것인, 방법.
  31. 제29항에 있어서, 인간 대상체는 25 내지 29의 체질량 지수를 갖는 것인, 방법.
  32. 제29항에 있어서, 인간 대상체는 30 초과의 체질량 지수를 갖는 것인, 방법.
  33. miR-1983 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 인슐린 민감도를 개선시키는 방법.
  34. 제33항에 있어서, miR-1983 억제제는 제1항 내지 제16항의 어느 한 항의 miR-1983 억제제 또는 제17항 내지 제19항의 어느 한 항의 조성물인 것인, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항의 어느 한 항에 있어서, miR-1983 억제제는 비강내 투여되는 것인, 방법.
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