JP2020531542A - インスリン抵抗性を検出し治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願はPCT出願であり、2018年7月13日に出願された米国仮特許出願番号62/697,935及び2017年8月25日に出願された米国仮特許出願番号62/550,233の優先権をもとに米国特許第119条の利益を主張し、それぞれは本明細書全体に参照として組み込まれる。
コンピューター可読形式の配列表、「SequeceListing.txt」(9782バイト)、2018年8月23日作成、をここに参照として組み込む。
複数の研究は、個々にまたは互いに共同して、代謝性疾患におけるmiRNAに関係して行われている(Feng et al., 2016; Hashimoto and Tanaka, 2016; Vienberg et al., 2016)。いくつかの研究は、視床下部組織におけるインスリン感受性の媒介にmiRNA調節が関与していることを示している。例えば、ob/obレプチン欠損マウスの視床下部におけるmiR‐200aのサイレンシングは、レプチン受容体とInsR基質2(IRS-2)の両方の発現レベルを増加させることによって、レプチンおよびインスリンシグナル伝達を改善するのに十分であった(Crepin et al., 2014)。また、miRNA生合成の必須成分の一つであるDicer(ダイサー)の視床下部ノックダウンは、miR‐103のミミック(Vinnikov et al.,2014)の脳室内(ICV)輸送により逆転された可能性のある摂食亢進性肥満を生じる。複数の研究は、中枢神経系(CNS)のmiRNAが全身エネルギーホメオスタシスの調節に重要な役割を果たしている可能性があり、視床下部が特有で特異的代謝状態のmiRNA特異的特徴を表す可能性があることを示唆している。そのような特徴は、ヒト疾患の治療における診断ツールまたは治療標的として機能し得る。インスリンシグナル伝達が代謝ホメオスタシスにとって極めて重要であり、視床下部ニューロンがこのバランスを達成する上で重要な役割を果たしているといえる。本発明者らは、確立されたインビトロ細胞を用いて、高脂肪食(HFD)を与えたマウスにおいて同時に起こるインスリン抵抗性の誘導により、神経細胞が特徴的なmiRNA発現プロファイルを示すかどうかを調べた。
(a) 隣接するA残基の配列を有するポリアデニル化miRNAを形成するようにmiRNAをATPおよびポリ(A)ポリメラーゼでポリアデニル化、 (b) 以下を含む反応混合物中でcDNAを形成するためのポリアデニル化miRNAの逆転写。(i) miRNAの少なくとも二つの3’末端ヌクレオチドとポリアデニル化miRNAの隣接するA残基の配列と相補性を有し、それとともにハイブリダイズし、ポリアデニル化miRNAに相補的なcDNAの合成を開始する、長さが40ヌクレオチド以下のファーストプライマー、(ii)逆転写酵素、(iii) 4種すべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸。 (c) 以下を含む反応混合物中でのcDNAを含むDNA分子の増幅。(i)cDNA、(ii)ファーストプライマー、(iii)cDNAの3’ヌクレオチドに十分に相補的で、それとハイブリダイズし、伸長産物の合成を開始するセカンドプライマー、(iv) DNAポリメラーゼ、(v)4種すべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および (d) 増幅されたDNAの存在および/または量がmiRNAの存在および/または量に対応する、増幅されたDNA分子の検出および/または定量。
さらなる実施形態では、miRNAレベルの測定中に使用されるプライマーは、Balcells et al., 2018に記載された方法を使用して設計される。別の実施形態では、増幅されたcDNA分子の検出および/または定量は、リアルタイムRT-PCRを利用することを含む。さらなる実施形態では、増幅されたcDNAの検出および/または定量は、ゲル電気泳動を利用することを含む。
マウスmHypoE‐46(雄)、mHypoA‐NPY/GFP(雌)、mHypoA‐POMC/GFP‐2(雄)細胞株を、以前に述べられている(Belsham et al., 2004; Dhillon et al., 2011; Mayer and Belsham, 2009, 2010a; Nazarians-Armavil et al., 2014; Wellhauser et al., 2016)ように、5%ウシ胎児血清 (FBS、Gibco、Thermofisher Scientific、Waltham, MA)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を添加した5.5 mMグルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;Sigma-Aldrich、St. Louis MO, USA)で、37°C、5% CO2で培養した。
C57Bl/6、CD-1およびMKR株の雌雄マウスを7週齢でCharles River Laboratories(Montreal, QC, Canada)から購入し、実験開始前の一週間順化させた。マウスは12:12の明暗スケジュール(午前7時から午後7時)で飼育した。動物実験はすべてトロント大学の動物愛護委員会の承認を得て行われた。CD‐1およびC57BL/6マウスに、60% kcalを脂肪から得る食(60% 高脂肪食)またはコントロール食(7%スクロース、高脂肪食とカロリー一致) (D12492およびD12450J、Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ,USA)をそれぞれ、与えた。MKRマウスにTeklad Diet8664(Envigo,Madison, WI, USA)を与えた。必要に応じて、マウスの体重を週1回測定し、5週間の餌投与期間中の体重増加を追跡した。すべての動物をイソフルランで安楽死させ、4から16時間絶食させた後(図の凡例に示されているように)、組織および血液を採取し、分析用に処理するまで-80°Cで保存した。インスリンレベルを分析するために収集した血液を、ヘパリンコーティングシリンジを用いて収集し、その後、試料を4°Cで10分間6,000×gで回転し、血漿を単離し、-80°Cで保存した。血清サンプルを、麻酔下で心臓穿刺により回収し、氷上で1時間凝固させ、次いで、3,000×gで10分間遠心分離し(Hsieh et al.,2015)、その後、サンプルを-80°Cで保存した。CD‐1(雄)およびC57(雌雄)マウスの初期集団から視床下部組織を得た。これらのマウスからの代謝パラメーターのさらなる詳細は発表されている(Liu et al., 2016; Prentice et al., 2014)。
ヒト患者試験は、the University Health Network Research Ethics Boardにより承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。様々なボディマス指数(BMI)およびインスリン感受性を有する被験者を募集した。合計24人の被験者を本研究に含めた。全体では、11人の男性 (m) と13人の女性 (f) をBMIで分類し、25未満(m=2、f=4)、25から29(m=6、f=3)および30以上(m=3、f=6)であった。血清を一晩絶食させた状態で非コーティングチューブに採取し、凝固させ、4°Cで15分間、3,000×gで回転した。血清は直ちに-20°Cで凍結し、長期保存のために-80°Cに移動した。血中グルコースの測定はグルコースメーターで測定した。血中インスリンは、トロント総合病院(TGH)コア実験室のAbbott Architect i2000システム上のElisaを介して、またはHI-14K|ヒトインスリン特異的ラジオイムノアッセイ(EMD Millipore、Etobicoke, ON, Canada)によって製造元の指示に従って測定した。TGHのコア実験室にて、記載されている他のすべての血中血液パラメーターを分析した。インスリン抵抗性指数(HOMA-IR)はHOMA2モデル(Levy et al.,1998)を用いて決定した。
順化期間後、マウスを2週間、コントロール食または60%高脂肪食で飼育した。2週間の最終日、Exiqon(Woburn, MA, USA)によって合成され、滅菌済み0.9%生理食塩水に1 nmol/ulの濃度で溶解した、注文のインビボロックド核酸(LNA) miR-1983阻害剤(5’-3’, A*C*A*T*G*C*T*C*C*A*G*G*T*G*A)(配列番号2)またはネガティブコントロール(5’-3’, A*C*G*T*C*T*A*T*A*C*G*C*C*C*A) (配列番号3)をマウスに投与した。上述したように、マウスをイソフランで麻酔し、腹ばいに置き、10 nmolトータルのmiR-1983阻害剤またはネガティブコントロールを総量10 ulで鼻腔内投与した。マウスの呼吸への影響を最小にするために、鼻腔内での処理の保持を最大にしながら、阻害剤またはネガティブコントロールを、マウスの対において単回投与2.5μl、各小滴の間隔を二分で投与した。マウスを麻酔下で腹ばいに置いた。その後、マウスを麻酔から回復させ、清潔なホームケージに戻し、食餌療法を継続させた。投与一週間および二週間後、マウスに腹腔内インスリン負荷試験(IpITT)を行った。合計5週間の食餌療法後、マウスを安楽死させ(上記詳細のように)、組織および血清を採取し、-80°Cで保存した。
マウスはインスリン負荷試験および血糖測定前に4時間絶食させた。マウスはインスリン負荷試験および血糖測定前に4時間絶食させた。それらの尾から1mm以下の血液滴の収集を可能にするために、EMLAクリーム(リドカイン2.5%、プリロカイン2.5%、AztraZeneca)をそれらの尾の先端に塗布し、血液収集前に効果を生じさせた。基礎となる血糖サンプルは、尾部を絞ることで得、血糖計(Bayer Contour USB )に挿入したグルコースストリップに血液の液滴を注いだ。マウスにはkg体重あたり1国際単位(IU)のインスリン(Humulin R, Eli-lily)を注射した。さらに、次のタイムポイント(10、20、60、30、および120分)で血糖測定を行った。インスリンは、保存Humulinを濾過滅菌(0.22μm)した0.9%生理食塩水中の0.1%遊離脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン(BSA)で希釈することによって調製した。マウスの血糖測定のための絶食とインスリン負荷試験の開始は、全ての実験でほぼ同じ時間に行った。
miR-1983発現を調べるため、mHypoA-NPY/GFPおよびmHypoA-POMC/GFP-2細胞株を、以前の実験からこれらの細胞株がインスリン抵抗性を引き起こすのに十分な時間である16時間、100 nM insulinで処理した。miR-1983発現を調べるため、以前の実験をもとにこれらの細胞株がインスリン抵抗性を引き起こすのに十分な時間である16時間、100 nM insulinでmHypoA-NPY/GFPおよびmHypoA-POMC/GFP-2細胞株を処理した。620プローブを含むmiRBase v15に基づくマウスmiRNAとマウス関連ウイルスmiRNAへのNanostring nCounter AnalysisSystemでのmiRNA分析のため、the Princess Margaret Genomics Centreに提出する前に、トータルRNAは、Nanodrop 2000c分光光度計(Thermofisher Scientific)で量と質を評価した。コードカウントは、ノーマライゼーションファクターを計算するために幾何平均法を用いてポジティブコントロールに対してノーマライズした。次に、ノーマライゼーションファクターを計算するために、上位100遺伝子と幾何平均法を用いてCodeSetコンテントノーマライゼーションを行った。ノーマライズしたコードカウントを統計解析のためにlog2値に変換した。マイクロアレイの結果を受けて、mHypoE-46細胞での実験を繰り返し、Purelink Mini RNA単離カラム(Ambion、Thermofisher Scientific、Waltham, MA)を用いてRNA単離を行った。デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)処理は、製造業者(サーモフィッシャー・サイエンティフィック)の指示に従ってon-column Purelink DNaseを用いてRNA単離中に行った。RNAを定量し、Nanodrop2000c分光光度計(Thermofisher Scientific)で純度を評価した。
miRNA標的は、Mirwalk 2.0ソフトウェア(Dweep and Gretz, 2015; Dweep et al., 2011)を用いて同定した。関心のある経路に分類するために、pantherdb.org(Mi et al., 2013; Mi et al., 2016)を用いて、四つのアルゴリズムすべて(mirWalk、miRanda(Betel et al., 2010; Betel et al., 2008)、RNA22(Miranda et al., 2006)、Targetscan(Lewis et al., 2005))に現れる潜在的標的を選択した。インスリンシグナル伝達経路に関与することが見出されたmRNA標的を、さらなる研究のために選択した。受け入れられている文献(Betel et al., 2010)に従い、よいmiRSVRスコアを有するとしてmiRNA標的は確証され、ヒトとマウスのmRNA配列間で類似した標的部位はTargetscanマウス(Agarwal et al., 2015; Lewis et al., 2005)を用いて同定された。
mRNA分析のために、500ngから1μgのトータルRNAを、製造業者の説明に従ってABI high capacity cDNA archive kitを介し一本鎖cDNA 合成のために利用した。qPCRは、Platinum(R)SYBR(R)Green qPCR SuperMix-UDG w/ROX(Thermofisher Scientific)およびPrimer Quest online tool(Integrated DNA Technologies(IDT)、Coralville、IA)を用いて設計したプライマーを用いて実施した。プライマー配列については表2を参照のこと。すべての細胞系について、12.5または25ngのcDNAのサンプルを、3つずつ、qPCRのための10ul反応に加え、25、125、6.25、3.125 ngの用量曲線を用いて、絶対RNA値を計算した。全ての動物組織サンプルの25ng cDNAをトリプリケートで反応させ、delta delta CT法(Livak and Schmittgen, 2001)を用いて動物群間の相対倍率変化を計算した。分析のために、全遺伝子のトータルmRNAレベルをヒストン3a(Histone 3a)でノーマライズした。プレートは、以下の条件下でABI7900HT Thermal Cycler上で以下の条件で作動させた。50°C2で2分間、95°Cで2分間、40°Cで95秒および15°Cで1分間の60サイクル後、メルトカーブ95°Cで15秒、60°Cで15秒および95°Cで15秒。ABI7900HT Thermal Cyclerからのデータを、ABI Prism 7000SDS 2.4ソフトウェア(ABI)を用いて分析した。
miRNA分析のために、100から250ngのトータルRNAを用いて、Taqman(登録商標)miRNA逆転写キット(Thermofisher Scientific)およびTaqman(登録商標)miRNAアッセイ専用プライマーを用いてcDNAを作製し、miR‐1983(ID:121204_mat)、miR‐20a‐3p(ID:002491)、miR‐296‐5p(ID:000527)およびLet‐7d‐5p(ID:002283)のRTおよびqPCR反応を行った。qPCRは、25ngのcDNAを10 μl Taqman(登録商標)Fast Advanced Master mix(Thermofisher Scientific)に入れ、トリプリケートで行った。プレートをABI7900HTサーマルサイクラーにいれ、以下の条件下で反応させた。50°Cで2分間、95°Cで20秒、40サイクルの95°Cで1秒間および60°Cで20秒。デルタ‐デルタCT法を用いて、群間の相対的な倍率変化を計算した。miRNAレベルをsnoRNA202(ID:001232)レベルでノーマライズした(Livak and Schmittgen, 2001)。
Ambion(登録商標)PARIS Kit(Thermofisher Scientific)を用いて血清サンプルを単離した。簡単に述べれば、サンプルを氷上で解凍し、200μlの各サンプルを2X変性溶液と組み合わせ、氷上で5分間インキュベートした。その後、miRNA レベルをノーマライズするための内部コントロールとして、25 fmol のIDTで合成されたcel-miR-39-3p RNA (配列 5’−3’; UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG (配列番号37) をそれぞれのサンプルに加えた。cDNAはTaqMan Advanced miRNA cDNA合成キットを用いて合成し、製造業者のプロトコールの仕様に従って、miR-1983(表3)およびcel-mir-39(ID:478293_mir)用TaqMan Advanced miRNAアッセイおよびTaqman Fast Advancedマスターミックスを用いて、10ul反応液、トリプリケートでqPCRを行った。データは示さないが、ヒト血清サンプルをまた、既知のヒト血中microRNA(Villard et al., 2015)、miR-142-3p(TaqMan ID: 477910)およびmiR-222-3p (Taqman ID: 477982)の存在下で分析した。サンプルをプレート(上記のように)に入れ、ABI7900HTサーマルサイクラーで95°Cで20秒、95°Cで1秒および60°Cで20秒を40サイクルでPCR反応させた。実験群の比較はデルタ‐デルタCT法(Livak and Schmittgen, 2001)により行った。
Insr遺伝子の3’ UTRを、pmirGLOベクター(Promega corporation, Madison WI, USA)のマルチプルクローニングサイトに相補的な制限酵素部位を付加するように設計されたプライマーを用いて、マウスゲノムDNA(Genomic DNA Purification Kit、Thermofisher Scientific)から増幅した。ベクターおよび3’ UTRの両方の制限消化後、2つをライゲーションし、HB101コンピテントセルに形質転換した。正しい配置で挿入されことを調べるため、アンピシリン耐性バクテリアコロニーを選択し、増殖させてDNAを単離した。制限酵素および緩衝液は、Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)から購入した。3’非翻訳領域 Insr挿入物を含有するベクターDNAを、Center for Applied Genomics(TCAG,Toronto, ON, Canada)で配列決定(プライマーについては表2参照)のために送った。トランスフェクションのために、mHypoE-46細胞を6ウェルプレート中(Sarstedt, Montreal, QC, Canada)で70から75%コンフルエントまで培養した。次いで、25nMのmiRNA-1983ミミックまたはネガティブコントロール(上記で使用したように)および5ugのpmiRGLO-Emptyまたは3’ UTR Insrを、ウェル当たり6ulのTurbofect(Dharmacon, GE, location)を用いて、製造業者の説明書に従って、48時間トランスフェクトした。細胞を氷冷した1×PBSで一回洗浄し、その後、細胞を製造業者の説明書に従って、ウェル当たり450μlのPassive Lysis Buffer (Biotium Inc., Fremont, CA, USA)で溶解した。
タンパク質を、以前述べられたように(Nazarians-Armavil et al., 2014)、または製造業者の説明に従ってAmbion(登録商標)PARISキットを使用して、単離し、BCA protein assay kit (Pierce,Thermofisher Scientific)を使用して定量した。ウェスタンブロッティングは、各サンプルあたり15から25ugのタンパク質(サンプルバッファー、Biorad、TCEP bond breaker solution)(Thermofisher Scientific,Waltham,MA,USA 煮沸用)を10%ビス-アクリルアミド-トリスゲル上で分離し、そしてiBlot2ドライブロッティングシステム(Thermofisher Scientific)を用いて0.2μmポリフッ化ビニリデン(PVDF) Immun-Blot メンブレン(Bio-Rad,Hercules,CA,USA )上に移した。InsRβサブユニット、α-チューブリン、リン酸化AKTおよびトータルAKTに対する抗体(抗マウス、ウサギ抗体)、ならびにウサギ二次抗体IgG、およびSignalfire elite ECL試薬を、Cell Signaling Technology Inc.(Danvers, MA, USA)から購入した。ローディングコントロールとして使用するβ-アクチン抗体は、Sigma-Aldrichから購入した。全ての一次抗体(1:1000)を、5%ノンファットミルク含有0.1% Tween-20を含むトリス緩衝生理食塩水(TBS-T)中、4°Cにて一晩インキュベートした。次いで、抗ウサギ二次抗体(1:7500)を使用し、5%ノンファットミルク含有1×TBS-T中で室温で2時間インキュベートした。次に、ブロットを0.1% TBS-Tで30分間洗浄し、Kodak Imaging3000ステーション(Eastman Kodak Company、Rochester, NY) 上で映し出した。トータルAKT検出のために、Restore PLUS Stripping Buffer (Thermofisher Scientific)を用いて抗体をはがし、再プローブした。マウス視床下部組織に対するウェスタンブロッティングは、全ての群を処理し、ゲル上に流し、抗体とインキュベートし、同時にイメージングする、というように行った。デンシトメトリーはImage J Software (Image J software,NIH,Bethesda,MD,USA,http://imagej.nih.gov/ij/)を用いて行った。
mHypoE‐46細胞株を滅菌水または50μMのパルミチン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich)で24時間処理した。パルミチン酸ナトリウム溶液は、粉末と滅菌水を混合し、完全に溶解するまで混合物を65°Cに加熱することによって調製した。次いで、溶液を温かい(37°C)細胞培養培地に直接添加し、細胞を直ちに処理した。miR‐1983レベルの評価は上記のように完了した。
GraphPad Prism Version 6.0 cを用いて全データを分析した。記載のように、スチューデントt検定、一元または二元配置分散分析(one or two-wayANOVA)、その後にBonferroniまたはFisherのLSD post-hoc 解析を実施した。p値が0.05以下(p<0.05)の場合、データは統計的に有意であると考えられる。すべてのデータは±標準偏差として示されている。
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Claims (35)
- miR-1983阻害剤であって、
CTCACCTGGAGCATGTTTTCT(配列番号1)の少なくとも一部分と相補的な抗miR-1983オリゴヌクレオチドを含み、
前記部分はCTCACCTGGAGCATGTTTTCT(配列番号1)の少なくとも2から8ヌクレオチドを含む、
miR-1983阻害剤。 - 前記部分がTCACCTGGAGCATGT(配列番号4)である、請求項1に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドはRNAを含む、請求項1または2に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが化学的に修飾されている、請求項1から3のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記化学的修飾が2’位での修飾である、請求項4に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記修飾が2’Oメチル(2’O-Me)、2’-O-メトキシエチル(2’-O-MOE)、2’フルオロ(2’F)およびロックド核酸モノマー(LNAM)から選ばれる、請求項5に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが複数のヌクレオチドモノマーの化学修飾を含む、請求項6に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが複数のロックド核酸モノマー(LNAM)を含む、請求項7に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドがロックド核酸(LNA)またはLNA/DNAミックスマーである請求項8に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記LNAが配列5’-3’、A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A(配列番号2)を含む、請求項9に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記LNAが配列5’-3’, A*C*A*T*G*C*T*C*C*A*G*G*T*G*A(配列番号2)を含む、請求項10に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記LNAが配列5’-3’, A*C*A*U*G*C*U*C*C*A*G*G*U*G*A(配列番号2)を含む、請求項10に記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのミスマッチおよび四つまでのミスマッチを含む、請求項1から12のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが二本鎖である、請求項1から13のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項1から13のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
- 前記阻害剤が前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドである、請求項1から15のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
- 請求項1から16のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤と希釈剤を含む、組成物。
- 鼻腔内製剤として剤型された請求項17に記載の組成物。
- 前記希釈剤が生理食塩水を含む、請求項17または18に記載の組成物。
- 細胞がインスリン抵抗性であるかどうか検出する方法であり、
前記方法は、miR-1983のレベルを測定し、基準値またはコントロールと比較することを含み、
コントロールに比較して増加したレベルは、細胞がインスリン抵抗性であることを示す、
方法。 - 前記細胞は神経細胞であり、適宜視床下部細胞である、請求項20に記載の方法。
- 前記細胞はヒト細胞である、請求項20または21に記載の方法。
- 対象における前糖尿病または糖尿病発症の可能性の増加を検出する方法であって、
前記方法は対象からの生体サンプル中のmiR-1983のレベルを測定し、
基準値またはコントロールと比較して増加したレベルは、対象が糖尿病を発症している可能性が高いことを示唆する、
方法。 - 前記検出が視床下部での一以上の神経ペプチドの調節不全の前に起こる、請求項23に記載の方法。
- 前記一以上の神経ペプチドがNPY又はAgRPである、請求項24に記載の方法。
- 前記サンプルが血清サンプルである請求項23から25のいずれかに記載の方法。
- 前記miR-1983のレベルは定量PCR法で測定される、請求項23から26のいずれかに記載の方法。
- 前記定量PCR法は細胞又は生物サンプルから得たRNAからcDNAを作成し、前記cDNAを配列特異的プライマーを用いて増幅し、前記miR-1983のレベルを定量する、請求項27に記載の方法。
- 前記対象はヒトである請求項23から28のいずれかに記載の方法。
- 前記ヒト対象はボディマス指数が25未満である、請求項29に記載の方法。
- 前記ヒト対象はボディマス指数が25から29である、請求項29に記載の方法。
- 前記ヒト対象はボディマス指数が30以上である、請求項29に記載の方法。
- 対象におけるインスリン感受性の改善方法であって、miR-1983阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む方法。
- 前記miR-1983阻害剤は請求項1から16のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤、または、請求項17から19のいずれかに記載の組成物である、請求項33に記載の方法。
- 前記miR-1983阻害剤は鼻腔内投与される、請求項33または34のいずれかに記載の方法。
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