CN114174513A - 慢病毒载体的优化生产 - Google Patents

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Abstract

一种经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1 snRNA被修饰以结合慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列。

Description

慢病毒载体的优化生产
技术领域
本发明涉及在真核细胞中生产慢病毒载体。更具体地，本发明涉及在慢病毒载体的生产过程中设计并共表达经修饰的U1 snRNA以增加输出滴度。
背景技术
在过去的几十年中，在科学期刊和专利中详细记载了用于疫苗和人类基因治疗的病毒载体的开发和制造。使用工程改造的病毒递送转基因以达到治疗效果的用途十分广泛。基于RNA病毒和DNA病毒的现代基因治疗载体已经在越来越多的人类疾病适应症中显示出前景，其中RNA病毒例如为γ-逆转录病毒和慢病毒(Muhlebach,M.D.et al.,2010,Retroviruses:Molecular Biology,Genomics and Pathogenesis,13:347-370；Antoniou,M.N.,Skipper,K.A.&Anakok,O.,2013,Hum.Gene Ther.,24:363-374)，而DNA病毒例如为腺病毒(Capasso,C.et al.,2014,Viruses,6:832-855)和腺相关病毒(AAV)(Kotterman,M.A.&Schaffer,D.V.,2014,Nat.Rev.Genet.,15:445-451)。这些方法包括针对血液病对患者细胞进行的离体修饰(Morgan,R.A.&Kakarla,S.,2014,Cancer J.,20:145-150；Touzot,F.et al.,2014,Expert Opin.Biol.Ther.,14:789-798)以及针对眼科(Balaggan,K.S.&Ali,R.R.,2012,Gene Ther.,19:145-153)、心血管(Katz,M.G.et al.,2013,Hum.GeneTher.,24:914-927)、神经退行性疾病(Coune,P.G.,Schneider,B.L.&Aebischer,P.,2012,Cold Spring Harb.Perspect.Med.,4:a009431)进行的体内治疗、以及肿瘤疗法(Pazarentzos,E.&Mazarakis,N.D.,2014,Adv.Exp.Med Biol.,818:255-280)。随着这些方法在临床试验中的成功开始朝着监管批准和商业化方向发展，人们的注意力集中在优良制造规范(GMP)级载体材料的大规模生产中出现的瓶颈(Van der Loo JCM,Wright JF.,2016,Human Molecular Genetics,25(R1):R42–R52)。
克服这一挑战的一种方式是寻找在病毒载体生产过程中产生最大滴度的新方式。因此，本领域需要提供生产病毒载体的可替代方法，其有助于解决与GMP级载体材料的大规模生产相关的已知问题。
病毒载体制造的常见方法包括用载体DNA组分转染原代细胞或哺乳动物/昆虫细胞系，接着经历有限的孵育期，然后从培养基和/或细胞中收获粗制载体(Merten,O-W.,Schweizer,M.,Chahal,P.,&Kamen,A.A.,2014,Pharmaceutical Bioprocessing,2:183-203)。在其他情况下，在不依赖转染的方法中使用生产者细胞系(PrCL；其中所有必需的载体组分表达盒都稳定地整合到生产细胞DNA中)，这在更大范围内是有利的。慢病毒载体制造的效率通常受“上游阶段”的几个因素影响，包括[1]采用的病毒血清型/假型、[2]转基因序列组成和大小、[3]培养基组成/气体处理/pH、[4]转染试剂/转染过程、[5]化学诱导和载体收获时间控制、[6]细胞脆性/活性、[7]生物反应器剪切力和[8]杂质。显然，在“下游”纯化/浓缩阶段还有其他因素需要考虑(Merten,O-W.et al.,2014,PharmaceuticalBioprocessing,2:237-251)。
优化的一个重要方面是在生产的上游阶段中慢病毒载体组分的相对丰度，所述慢病毒载体组分为GagPol、包膜、rev和载体基因组RNA(vRNA)。对于需要瞬时转染编码这些组分的质粒DNA的方法，通常在优化过程中确定这些质粒的最佳“质量”比。通过筛选许多包含所有稳定地整合到宿主DNA中的组分的PrCL，也有效地解决了最佳比；那些具有最大输出的PrCL是在基因座处包含表达盒的克隆，这使每个单独组分以最佳组分比或接近最佳组分比表达。本发明人注意到，通常基因组vRNA组分可能是PrCL中的限制因素；PrCL克隆的高滴度输出与载体基因组盒的高拷贝数相关的报道支持了这一点(Sheridan,P.L.et al.,2000,Mol.Ther,2(3):262-275)。通常，在瞬时转染方法中，即使考虑到质粒的大小，最大比例的质粒DNA处于组分质粒的最佳比。这表明慢病毒载体制造过程中基因组vRNA的生产是产生高效慢病毒载体制造方法的关键因素。
剪接和聚腺苷酸化是mRNA成熟的关键过程，特别是在大多数蛋白质编码转录物含有多个内含子的高等真核生物中。剪接所需的mRNA内元件包括5'剪接供体信号、分支点周围的序列和3'剪接受体信号。与这三个元件相互作用的是剪接体，它由五种小核RNA(snRNA)形成，包括U1 snRNA和相关的核蛋白(snRNP)。U1 snRNA由聚合酶II启动子表达，并且存在于大多数真核细胞中(Lund et al.,1984,J.Biol.Chem.,259:2013-2021)。人U1snRNA(小核RNA)长164nt，具有由四个茎环构成的明确结构(West,S.,2012,BiochemicalSociety Transactions,40:846-849)。U1 snRNA在其5'端包含一个短序列，其与外显子-内含子连接处的5'剪接供体位点广泛互补。U1 snRNA通过与5'剪接供体位点的碱基配对参与剪接位点选择和剪接体组装。除剪接之外，U1 snRNA的一个已知功能是调节3'端mRNA加工：它响应于早期聚腺苷酸化(polyA)信号以抑制过早的polyA(特别是在内含子内)。
通过募集内源性U1 snRNA对细胞基因内的内含子序列内的polyA位点的阻遏已得到很好的表征(Kaida,D.et al.,2010,Nature,468:664-8)。其他人也使用经修饰的U1snRNA作为研究工具来剖析HIV-1复制期间5'LTR处过早聚腺苷酸化的抑制机制(Ashe,M.P.,Pearson,L.H.&Proudfoot N.J.,1997,EMBO J.,16:5752-63；Ashe,M.P.,Furger,A.&Proudfoot,N.J.,2000,RNA,6:170-7；Furger,A.,Monks,J.&Proudfoot,N.J.,2001,J.Virol.,75:11735-46)。
HIV-1在5'LTR和3'LTR的R区内编码相同的polyA信号；3'LTR polyA具有活性，并且可用于终止所有前体mRNA的转录事件。为了避免5'LTR中polyA位点的过早终止(即，在转录起始后立即终止)，内源性U1 snRNA与主要剪接供体(下游约200个碱基)的结合抑制了该polyA位点的活性，从而允许转录继续到原病毒盒的末端。结果表明，主要剪接供体的突变激活了5'LTR中的polyA位点，但如果共表达经修饰的U1 snRNA(靶向与主要剪接供体相邻的序列)，则可以重新启动这种抑制。然而，polyA位点的抑制取决于U1 snRNA与polyA位点的接近程度，因此大部分工作是在人工“迷你基因”表达盒中进行的，该表达盒缺乏在野生型HIV-1或基于HIV-1的慢病毒载体中发现的许多其他RNA序列。
操作和使用U1 snRNA在本领域中称为“U1干扰”或“U1i”，并且已经将之用于开发抑制基因表达的方法(Beckley,S.A.et al.,2001,Mol.Cell Biol.,21:2815-25；Fortes,P.et al.,2003,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,100:8264-9)。U1i发挥作用的机制是通过抑制前体mRNA的聚腺苷酸化的正确位置和加工，使得产生不稳定的mRNA，从而引起蛋白质水平降低。聚腺苷酸化的抑制需要将经修饰的U1 snRNP颗粒定位到靶转录物的3'-末端外显子。U1 snRNA基因的核酸序列被修饰，使得U1 snRNA与选定序列结合而不是与用于启动靶基因剪接的5'剪接供体位点序列结合。通过将在相关RNP复合物中的经修饰的U1 snRNA的5'端与靶前体mRNA中选定的互补区域碱基配对从而实现聚腺苷酸化的抑制。它已被用作抗病毒方法(Bláquez,L.&Fortes,P.,2015,Adv.Exp.Med.Biol.,848:51-69)，包括HIV-1(Sajic,R.et al.,2007,Nucleic Acids Res.,35:247-55；Knoepfel,S.A.et al.,2012,Antiviral Res.,94:208-16)。
其他研究已经表明，内源性U1 snRNA或经修饰的U1 snRNA与HIV-1中共有或非共有5'剪接位点的结合可以改变病毒RNA的稳定性(Lützelberger,M.et al.,2006,J.Biol.Chem.,281:18644-51)。然而，该报道表明，这种效果是在HIV-1的pol区域内发现的一个短的、新颖的内含子所特有的。基于HIV-1慢病毒载体的载体基因组序列中完全没有这样的序列。
在本申请的申请日时，在慢病毒载体生产过程中操纵和使用U1 snRNA以增加慢病毒载体滴度的方法是未知的。
发明内容
本发明人惊奇地发现，通过共表达基于U1 snRNA的非编码RNA可以提高慢病毒载体的输出滴度，这些U1 snRNA已被修饰，因此它们不再靶向内源性序列(剪接供体位点)，现在转而靶向vRNA分子内的序列。本发明涉及这种经修饰的U1 snRNA和一种增加慢病毒载体生产滴度的新方法。该方法包括在载体生产过程中将经修饰的U1 snRNA与其他载体组分共表达。设计经修饰的U1 snRNA，使得通过用与载体基因组vRNA内的靶序列互补的异源序列替换它，从而去除与共有剪接供体位点的结合。本发明描述了经修饰的U1 snRNA的各种应用模式和最佳特性，包括靶序列和互补长度、设计和表达模式。
在一个方面中，本发明提供了一种经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1snRNA已被修饰以结合慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列。
在一个方面中，本发明提供了一种经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1snRNA已被修饰以互补于慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA被修饰以引入与所述核苷酸序列互补的异源序列。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA在5'端被修饰以在位置3-至11-处的九个核苷酸内引入所述异源序列。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA在5'端被修饰以在天然剪接供体退火序列内引入所述异源序列。
在一些实施方案中，天然剪接供体退火序列的1至9个核酸被所述异源序列替换。在一个方面中，用与所述核苷酸序列互补的异源序列替换包括天然剪接供体退火序列的核苷酸1至11。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA在5'端被修饰以用与所述核苷酸序列互补的异源序列替换包含天然剪接供体退火序列的序列。
在一些实施方案中，异源序列包含至少9个与所述核苷酸序列互补的核苷酸。
在一些实施方案中，异源序列包含15个与所述核苷酸序列互补的核苷酸。
在一些实施方案中，慢病毒载体基因组序列的包装区域是从5'U5结构域开始到源自gag基因的序列的末端。
在一些实施方案中，所述核苷酸序列位于5'U5结构域、PBS元件、SL1元件、SL2元件、SL3ψ元件、SL4元件和/或源自gag基因的序列内。
在一些实施方案中，核苷酸序列位于SL1、SL2和/或SL3ψ元件内。
在一些实施方案中，核苷酸序列位于SL1和/或SL2元件内。
在一些实施方案中，核苷酸序列位于SL1元件内。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA是经修饰的U1A snRNA或经修饰的U1AsnRNA变体。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA的5'端的前两个核苷酸不是AU。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2或EIAV。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体源自HIV-1。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体源自SIV。
在另一个方面中，本发明提供了一种表达盒，其包含编码本发明的经修饰的U1snRNA的核苷酸序列。
在又一个方面中，本发明提供了用于生产慢病毒载体的细胞，其包含编码载体组分的核苷酸序列、以及至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列，所述载体组分包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组。
在另一个方面中，本发明提供了一种细胞，其包含根据本发明的经修饰的U1snRNA。
在一些实施方案中，所述细胞还包含编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞进一步包含编码目的核苷酸(NOI)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述目的核苷酸产生治疗效果。
在一些实施方案中，所述目的核苷酸编码酶、辅因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、嵌合抗原受体、靶蛋白的跨结构域阴性突变体、毒素、条件性毒素、抗原、转录因子、结构蛋白、报告蛋白、亚细胞定位信号、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、受体、血管活性蛋白或肽、抗病毒蛋白或核酶、或其衍生物、或微RNA。
在一些实施方案中，所述目的核苷酸编码可用于治疗选自以下疾病的分子：
(i)能对以下作出响应的疾病：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治疗免疫缺陷(包括感染人免疫缺陷病毒)；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫疾病，和预防移植排斥或诱导肿瘤免疫性)；造血作用的调节(例如骨髓或淋巴疾病的治疗)；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长(例如用于愈合伤口，治疗烧伤、溃疡和牙周疾病和神经退化)；卵泡刺激激素的抑制或激活(生育力的调节)；趋化性/化学促进活性(例如用于将特定细胞类型调动到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如脓毒性休克或克罗恩病)；巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性、以及由此而来的抗炎活性；抗免疫活性(即，对细胞和/或体液免疫应答、包括与炎症不相关的应答的抑制作用)；抑制巨噬细胞和T细胞贴壁于胞外基质组分和纤连蛋白的能力、以及T细胞中的上调的fas受体表达；
(ii)恶性疾病，包括癌症；白血病；良性和恶性肿瘤生长、侵入和扩散、血管生成、转移；腹水和恶性胸腔积液；
(iii)自身免疫性疾病，包括关节炎(包括类风湿性关节炎)、过敏症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其他疾病；
(vi)血管疾病，包括动脉硬化症、动脉硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征、心血管效应、外周血管病、偏头痛和阿斯匹林依赖性抗血栓形成症、中风、大脑局部缺血、缺血性心脏病或其他疾病；
(v)胃肠道的疾病，包括消化性溃疡、溃疡性结肠炎、克罗恩病和其他疾病；
(vi)肝病，包括肝纤维化、肝硬化；
(vii)遗传性代谢障碍，包括苯丙酮尿症PKU、威尔逊病、有机酸血症、尿素循环障碍、胆汁淤积和其他疾病；
(viii)肾病和泌尿疾病，包括甲状腺炎或其他腺体疾病、血管球性肾炎或其他疾病；
(ix)耳、鼻和喉疾病，包括耳炎或其他耳鼻喉疾病、皮炎或其他皮肤疾病；
(x)牙齿和口腔疾病，包括牙周病、牙周炎、齿龈炎或其他牙齿/口腔疾病；
(xi)睾丸疾病，包括睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其他睾丸疾病；
(xii)妇科疾病，包括胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、子痫前期、子宫内膜异位和其他妇科疾病；
(xiii)眼科疾病，例如包括LCA10等的莱伯先天性黑蒙(LCA)；后葡萄膜炎；中间葡萄膜炎；前葡萄膜炎；结膜炎；脉络视网膜炎；葡萄膜视网膜炎；视神经炎；青光眼，包括开角型青光眼和青少年先天性青光眼；眼内炎症，例如视网膜炎或囊样黄斑水肿；交感性眼炎；巩膜炎；色素性视网膜炎；黄斑变性，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)和青少年黄斑变性，包括贝斯特病、贝斯特卵黄样黄斑变性、斯特格氏病；尤塞氏综合征；多恩氏蜂窝状视网膜营养失调；Sorby黄斑营养失调；青年性视网膜劈裂症；视锥-视杆营养失调；角膜营养失调；Fuch营养失调；莱伯氏先天性黑内障；莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)；艾迪综合征；小口氏病；退行性眼底病；视觉损伤；由感染引起的眼睛炎症；增殖性玻璃体-视网膜病变；急性局部缺血性视神经病变；过度疤痕，例如在青光眼滤过手术后，对眼睛植入物的反应、角膜移植物移植排斥；和其他眼科疾病，例如糖尿病黄斑性水肿、视网膜静脉阻塞、RLBP1相关的视网膜营养失调、无脉络膜和色盲；
(xiv)神经疾病和神经退行性疾病，包括帕金森病、治疗帕金森病引起的并发症和/或副作用、AIDS相关痴呆综合症、HIV相关脑病、德维克病、西德纳姆舞蹈病、阿尔兹海默病和其他退行性疾病、CNS的病症或失调、中风、脊髓灰质炎后综合征、精神疾病、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、法布里病、戈谢病、胱氨酸病、庞贝氏病、异染性脑白质营养不良、Wiscott Aldrich综合征、肾上腺脑白质营养不良、β-地中海贫血、镰状细胞贫血病、格林-巴利综合征、西德纳姆舞蹈病、重症肌无力、大脑假性肿瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病、CNS压缩或CNS创伤或CNS的感染、肌肉萎缩和营养失调、中枢神经系统和外周神经系统的疾病、病症或失调、运动神经元疾病，包括肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、脊髓和撕裂损伤；以及
(xv)囊性纤维化；粘多糖贮积症，包括Sanfilipo综合征A、Sanfilipo综合征B、Sanfilipo综合征C、Sanfilipo综合征D、亨特综合征、Hurler-Scheie综合征、莫尔丘综合征；ADA-SCID；X相关的SCID；X相关的慢性肉芽肿病；卟啉症；血友病A；血友病B；外伤后炎症、出血、血凝固和急性期应答；恶病质；厌食症；急性感染；脓毒性休克；传染性疾病；糖尿病；手术的并发症或副作用；骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用；基因治疗的并发症和副作用，例如由于感染病毒载体、或者AIDS；以压制或抑制体液和/或细胞免疫应答，从而在天然或人工细胞、组织和器官如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织的移植的情况中用于预防和/或治疗移植排斥。
在另一方面中，本发明提供了用于生产慢病毒载体的稳定或瞬时生产细胞，其包含至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
在另一方面中，本发明提供了一种生产如本文所述的慢病毒载体的方法，包括以下步骤：
a.将编码载体组分的核苷酸序列、以及至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞中，所述载体组分包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组；
b.任选地选择包含所述编码载体组分的核苷酸序列和至少一个经修饰的U1snRNA的细胞；
c.在所述载体组分与所述经修饰的U1 snRNA共表达并且生产慢病毒载体的条件下培养细胞。
在另一方面中，本发明提供了通过本发明的方法生产的慢病毒载体。
在另一方面中，本发明提供了本发明的经修饰的U1 snRNA或本发明的表达盒用于生产慢病毒载体的用途。
在另一方面中，本发明提供在本发明的经修饰的U1 snRNA存在下生产的慢病毒载体，其中该慢病毒载体在慢病毒载体的RNA基因组中包含失活的主要剪接供体位点。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2或EIAV。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体源自HIV-1。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体源自SIV。
在如本文所述的一些实施方案中，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活。
在一些实施方案中，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点和主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。
在一些实施方案中，所述慢病毒载体是第三代慢病毒载体。
在一些实施方案中，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖tat的慢病毒载体。
在一些实施方案中，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列是在不存在tat的情况下产生的。
在一些实施方案中，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已不依赖tat转录。
在一些实施方案中，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖U3的慢病毒载体。
在一些实施方案中，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已不依赖U3启动子转录。
在一些实施方案中，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已被异源启动子转录。
在一些实施方案中，隐蔽剪接供体位点是主要剪接供体位点3'的第一个隐蔽剪接供体位点。
在一些实施方案中，所述隐蔽剪接供体位点在主要剪接供体位点的6个核苷酸内。
在一些实施方案中，主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点突变或缺失。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中该核苷酸序列在剪接位点失活前包括如SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一个所示的序列。核苷酸序列可包括相对于SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一个所示的序列具有突变或缺失的序列。在一个方面中，序列包括SEQ ID NO:13。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则该位点将在主要剪接供体区域(SEQ ID NO:13)的核苷酸1的紧邻上游具有切割位点。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点和失活的隐蔽剪接供体位点，否则它们将在主要剪接供体区域(SEQ ID NO:13)的核苷酸1的紧邻上游、以及对应于核苷酸的核苷酸4和5之间具有切割位点。
在一些实施方案中，编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则该位点将在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸13和14的核苷酸之间具有切割位点。
在一些实施方案中，主要剪接供体位点失活前的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:4中所示的序列。
在一些实施方案中，隐蔽剪接供体位点失活前的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:10中所示的序列。
在一些实施方案中，编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列包含失活的隐蔽剪接供体位点，否则该位点将具有对应于SEQ ID NO:1的核苷酸17和18的核苷酸之间的切割位点。
在一些实施方案中，编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列包括如SEQ IDNO:2、5、6、7、8、11、12和/或14中任一个所示的序列。
在优选的方面中，核苷酸序列包括如SEQ ID NO:14所示的序列。
在一些实施方案中，编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列不包括如SEQ IDNO:9中所示的序列。
在一些实施方案中，来自慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性被抑制或去除。
在一些实施方案中，来自慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性在转染细胞或转导细胞中被抑制或去除。
在一些实施方案中，编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列能够连接至编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
在一个方面中，编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列与编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列在不同的核苷酸序列上，例如在不同的质粒上。
在一个方面中，根据本发明的核苷酸序列用于不依赖tat的慢病毒载体系统。在一个方面中，慢病毒载体系统可以是第三代慢病毒载体系统。
在一个方面中，核苷酸序列可适用于在用于载体生产的不依赖tat的系统中的慢病毒载体。如本文所述，第三代慢病毒载体不依赖tat，并且根据本发明的核苷酸序列可用于第三代慢病毒载体的情况中。为清楚起见，术语“不依赖tat”是指用于驱动载体基因组盒转录的HIV-1U3启动子被异源启动子取代。在本发明的一个方面中，慢病毒载体生产系统中不提供tat，例如不以反式提供tat。在一个方面中，如本文所述的细胞或载体或载体生产系统不包含tat蛋白。
附图说明
图1：U1 snRNA分子的示意图以及如何修饰用于本发明的靶向序列的实例。内源性非编码RNA U1 snRNA在内含子剪接的早期阶段中通过5'-(AC)UUACCUG-3'(灰色突出显示)天然剪接供体靶向序列与共有剪接供体位点(5'-MAGGURR-3')结合。茎环I与U1A-70K蛋白结合，该蛋白已被证明对polyA抑制很重要。茎环II与U1A蛋白结合，并且5'-AUUUGUGG-3'序列与茎环IV一起与Sm蛋白结合，Sm蛋白对U1 snRNA加工很重要。在本发明中，经修饰的U1snRNA被修饰以在天然剪接供体靶向序列的位点处引入与载体基因组vRNA分子内的靶序列互补的异源序列；在该图中，给出的实例将经修饰的U1 snRNA定向至标准HIV-1慢病毒载体基因组的15个核苷酸(相对于载体基因组分子的第一个核苷酸为256-270，256U1)(如果是包装信号，则位于SL1环中)。
图2：由经修饰的U1 snRNA介导的慢病毒载体滴度的增加与载体基因组5'LTR中polyA位点的抑制无关。[A]设计了GFP-polyA-GLuciferase报告基因盒来评估两种polyA信号突变体(pAM1＝AAUAAA>AACAAA；pAKO＝AAUAAA缺失)和野生型polyA信号(wt pA＝AAUAAA)对转录通读HIV-1polyA位点的影响。通过荧光素酶活性可测定通读HIV-1polyA信号，其通过GFP表达进行标准化。[B]在不存在(NegCtrl)或存在经修饰的U1 snRNA(256_U1，在生产过程中平行提供)的情况下，使用一个标准慢病毒载体基因组(STD-LV)和两个含有不同5'LTR polyA信号突变体(Δ5'pA-LV pAM1或pAM2)的慢病毒载体基因组制备载体颗粒，然后进行滴定。
图3：由经修饰的U1 snRNA介导的慢病毒载体滴度的增加不需要功能性U1A-70K或U1A蛋白结合环。[A]U1 snRNA被修饰为靶向LV基因组的256-270区域或lacZ序列(阴性对照)中的两个位点。经修饰的U1A snRNA由已知能破坏U1A-70K蛋白、U1A蛋白或sm蛋白结合的突变制成(序列已示出)。还制备了经修饰的U1A5、U1A6和U1A7 snRNA变体。[B]在生产过程中以反式提供的各种经修饰的U1 snRNA对LV-GFP滴度的影响。
图4：使用经修饰的U1 snRNA改变长度和靶向序列的效果。在不存在(黑色条)或存在经修饰的U1 snRNA的情况下生产编码GFP的标准慢病毒载体，该经修饰的U1 snRNA具有针对沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的位点的靶向序列，该靶向序列包括15个核苷酸(深灰色条)或9个核苷酸(浅灰色条)靶向互补长度。根据沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA。每个经修饰的U1 snRNA的数据条在载体基因组vRNA的5'端内每个已知功能性序列的大致标记位置下方对齐(非按比例的)。
图5：在不存在(黑色条)或存在经修饰的U1 snRNA的情况下生产编码GFP的标准慢病毒载体，该经修饰的U1 snRNA具有针对沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的位点的靶向序列，该靶向序列包括15个核苷酸(深灰色条)靶向互补长度。根据沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA。每个经修饰的U1snRNA的数据条在载体基因组vRNA的5'端内每个已知功能性序列的大致标记位置下方对齐(非按比例的)。
图6：使用经修饰的U1 snRNA增加编码不同转基因的慢病毒载体滴度。在不存在(-)或存在经修饰的U1 snRNA的情况下，生产编码GFP(pHIV-EF1a-GFP)或CD19嵌合抗原受体(pHIV-EF1a-CD19)的标准慢病毒载体，所述经修饰的U1 snRNA靶向慢病毒载体包装区域内的位点(256U1或305U1)或LacZ对照(LacZU1)中的任一者。根据慢病毒载体包装区域内靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA。以两种不同的剂量提供经修饰的U1snRNA表达构建体：1x或4x。
图7：基于HIV-1的慢病毒载体内主要剪接供体位点(MSD)的异常剪接的影响。A.示出第三代(自失活(SIN))慢病毒载体表达盒的典型构造以及在慢病毒载体生产过程中产生的mRNA类型的示意图，该表达盒包含嵌入包装信号的茎环(SL2)内的功能性主要剪接供体。图中示出由“标准”慢病毒载体(LV)DNA盒和(a)在MSD区域具有抑制或去除来自MSD的混杂活性的功能性突变的慢病毒载体DNA盒(“MSD-KOLVDNA盒”)产生的mRNA的类型。对于这两个盒，全长(“未剪接的”)载体RNA(vRNA)由与rev应答元件(RRE)结合的rev的共表达产生，并且通常认为抑制MSD对RRE序列内包括的剪接受体7(sa7)的剪接。对于标准慢病毒载体DNA盒，在不存在rev的情况下，通常认为所有内含子的剪出都能有效地发生(“经剪接的”)。然而，在慢病毒载体生产过程中可能产生“异常”剪接产物，其中MSD高效地剪接剪接受体位点或隐蔽剪接受体位点(经“异常”剪接的)，通常“忽略”含有RRE的内含子，使得rev对MSD的这种活性的影响最小。也可以通过重新定向到MSD突变的慢病毒载体DNA盒的包装区域的经修饰的U1snRNA的共表达进行慢病毒载体的生产。(图例：Pro，启动子；从5'R到gag的区域包含包装元件{Ψ}；msd，主要剪接供体；cppt，中央多嘌呤束；Int，内含子；sd/sa，剪接供体/受体；GOI，目的基因；灰色箭头指示用来评估在第三代慢病毒载体生产过程中产生的未剪接的vRNA的占比的正向{f}和反向{r}引物的位置。为清楚起见，未显示转录后调节元件{PRE})。B.在+/-rev的HEK293T细胞中进行标准第三代慢病毒载体生产，并从生产后的细胞中提取的总RNA。使用两个引物组(A中标记的位置)对总RNA进行qPCR(SYBR绿色)：f+rT扩增了由慢病毒载体表达盒产生的总转录物，并且f+rUS扩增了未剪接的转录物；因此，计算了未剪接的vRNA转录物在总vRNA转录物中的占比并进行了绘制。数据表明在标准第三代慢病毒载体生产过程中未剪接的vRNA相对于总数的占比是适中的，并且根据内部转基因盒(在该例中包含不同的启动子和GFP基因)而变化；此外，这个占比在rev的作用下只是最低限度地增加。
图8：包含三种不同启动子-GFP表达盒(EF1a、EFS和CMV)的HIV-1慢病毒载体基因组被修饰以在功能上突变MSD，从而产生“MSD-2KO”慢病毒载体基因组或骨架(用于突变的描述参见图15A)。在标准方案下在HEK293T细胞中产生载体并进行滴定。数据显示MSD的功能性突变(“MSD-2KO”)导致慢病毒载体滴度降低100倍。
图9：A示出编码EF1a-GFP内部表达盒的标准慢病毒载体表达盒或MSD突变的慢病毒载体表达盒的构造以及慢病毒载体生产过程中生产的mRNA类型的示意图。(图例：Pro，启动子；从5'R到gag的区域包含包装元件{Ψ}；msd，主要剪接供体；cppt，中央多嘌呤束；Int，内含子；sd/sa，剪接供体/受体；GOI，目的基因；灰色箭头指示用于评估在第三代慢病毒载体生产过程中产生的未剪接的vRNA的占比的正向{f}和反向{r}引物的位置。为清楚起见，未显示转录后调节元件{PRE})。B i在+/-tat、或179U1或305U1的HEK293T细胞中生产标准慢病毒载体或MSD-2KO慢病毒载体，并进行滴定。ii从生产后的细胞中提取总细胞质mRNA并通过RT-PCR/凝胶电泳使用引物(f+rG)进行分析，该引物可以检测从SL2剪接区域到EF1a剪接受体的主要“异常”剪接产物。数据表明，重新定向至MSD-2KO慢病毒载体基因组(vRNA)的5'包装区域的经修饰的U1 snRNA能够以类似于tat的方式增加标准慢病毒载体和MSD-2KO慢病毒载体的滴度。MSD-2KO突变消除了对从SL2剪接区域到EF1a剪接受体的“异常”剪接产物的检测(参见图9A)。重要的是，与使用tat相比，通过经修饰的U1 snRNA产生的滴度的增加伴随着维持几乎检测不到的“异常”剪接产物。
图10：在+/-256U1的HEK293T细胞中生产编码由EF1a、EFS或CMV启动子驱动的GFP内部盒的标准慢病毒载体或MSD突变的慢病毒载体，并进行滴定。通过使用重新定向到5'包装区域的经修饰的U1 snRNA得到的加强的慢病毒载体滴度与转基因盒中采用的启动子无关。数据表明，MSD-2KO突变的减毒表型在很大程度上被经修饰的U1 snRNA的共表达所挽救，因此，与标准慢病毒载体基因组相比，这令人惊讶地以不成比例的方式提高了MSD突变的慢病毒载体基因组的滴度。
图11：通过使用重新定向到5'包装区域的经修饰的U1 snRNA得到的MSD突变的慢病毒载体滴度的加强与5'LTR内5'polyA信号的潜在活性的抑制无关。先前的报道表明，MSD的突变能够激活HIV-1原病毒的5'LTR的5'R序列内的polyA信号和“迷你报告基因”盒，从而导致转录过早终止；内源性U1 snRNA甚至重新定向的U1snRNA的结合可以阻断这种polyA活性。A将GFP-polyA-GLuciferase报告基因盒设计为用于评估两种polyA信号突变体(pAM1＝AAUAAA>AACAAA；pAKO＝AAUAAA缺失)和野生型polyA信号(wt pA＝AAUAAA)对转录通读HIV-1polyA位点的影响。通过荧光素酶活性可测定通读HIV-1polyA信号，荧光素酶活性能够通过GFP表达进行标准化。B为了测试经修饰的U1snRNA是否以类似方式起作用，将5'polyA信号中的功能性polyA突变(pAm1)引入到携带EF1a-GFP或CMV-GFP表达盒的MSD突变的慢病毒载体基因组中。还使用了携带EF1a-GFP或CMV-GFP表达盒的标准慢病毒载体基因组和MSD突变的慢病毒载体基因组。在+/-305U1的HEK293T细胞中生产慢病毒载体，并进行滴定。数据显示5'polyA信号的功能性去除仅引起慢病毒载体滴度的不太多的增加，因此观察到的由经修饰的U1 snRNA、特别是MSD-2KO/polyA-突变的慢病毒载体基因组提供的慢病毒载体滴度的增加不能归因于5'polyA活性的抑制。
图12：在305U1和256U1经修饰的U1 snRNA中引入了几个突变，已知这些突变会去除U1-70K蛋白与SL1的结合、U1A蛋白与SL2的结合或Sm蛋白与载体基因组的SL4的结合/接近。在这些突变的经修饰的U1 snRNA存在下生产编码EF1a-GFP内部盒的标准慢病毒载体或MSD-2KO慢病毒载体，并进行滴定，并且相对于不使用经修饰的U1 snRNA生产的标准慢病毒载体对滴度值进行标准化处理。数据表明，通过经修饰的U1 snRNA得到的MSD-2KO慢病毒载体滴度的提高不取决于U1-70K蛋白或U1A蛋白结合，而是取决于Sm蛋白结合位点。因此，通过使用重新定向到5'包装区域的经修饰的U1 snRNA得到的MSD-2KO慢病毒载体滴度的加强与U1 snRNA的任何已知功能无关。
图13：通过使用含有不同长度靶向序列的经修饰的U1 snRNA提高MSD突变的慢病毒载体滴度。在存在靶向“305”区域的经修饰的U1 snRNA的情况下，在HEK293T细胞中生产含有EF1a-GFP盒的MSD-2KO慢病毒载体，其中经修饰的各U1 snRNA包含具有不同互补性长度的重新靶向序列。当使用含有7到15个核苷酸的互补性长度的经修饰的U1 snRNA时观察到滴度增加，在10个或更多核苷酸时观察到最大效果。
图14：当将经修饰的U1 snRNA靶向载体基因组RNA的包装区域时，观察到MSD突变的慢病毒载体的最大滴度恢复/增长。在存在经修饰的U1 snRNA的情况下生产包含EF1-GFP盒的MSD-2KO慢病毒载体，其中该经修饰的U1 snRNA具有结合沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的位点的靶向序列，该靶向序列包括15个核苷酸(或所述的9个核苷酸)靶向互补长度。根据沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA。每个经修饰的U1 snRNA的数据条在载体基因组vRNA的5'端内每个已知功能性序列的大致标记位置下方对齐(非按比例的)。
图15：关于功能性主要剪接供体突变、它们对慢病毒载体滴度的影响以及经修饰的U1 snRNA的回收的描述。A在顶部示出了“野生型”HIV-1的茎环2(SL2)区域的序列(NL4-3；当前慢病毒载体基因组中的“标准”序列)。该序列包括主要剪接供体位点(MSD：共有序列＝CTGGT)和隐蔽剪接供体位点(当MSD位点自身发生突变时使用(crSD：共有序列＝TGAGT)。当使用剪接供体位点时剪接位置的核苷酸以粗体和箭头标识。描述了四种功能性MSD突变，它们去除了MSD和crSD位点这两者的剪接活性：MSD-2KO，其使来自MSD和crSD位点的两个“GT”基序发生突变(并且广泛用于大多数实施例中)；MSD-2KOv2，其也包括去除MSD和crSD位点的突变；MSD-2KOm5，其引入了一种全新的没有任何剪接供体位点的茎环结构；和ΔSL2，其完全删除了SL2序列。在MSD-2KO、MSD-2KOv2和MSD-2KOm5突变体的SL2序列中引入的置换碱基以小写斜体显示。B用EFS-GFP内部盒克隆四种包含功能性MSD突变的慢病毒载体基因组变体(在图15A中描述)，并且另外用EF1a-、CMV-或huPGK-GFP内部盒克隆MSD-2KO或MSD-2KOm5变体。在+/-256U1的HEK293T细胞中生产标准LV和MSD突变LV，并进行滴定。数据表明，慢病毒载体滴度的减弱程度可根据具体突变而变化，并且MSD-2KOm5变体通常产生减弱程度较低的表型。当在生产过程中共表达时，经修饰的U1 snRNA能够增加四种包括功能性MSD突变的慢病毒载体基因组变体的慢病毒载体滴度。当256U1与携带MSD-2KOm5序列的MSD突变的LV基因组一起表达时，滴度增加最大。
图16：经修饰的U1 snRNA表达盒可以位于慢病毒载体基因组质粒骨架上，以便于在瞬时转染方案中使用。在慢病毒载体的生产中，许多实施例使用单独的经修饰的U1snRNA表达质粒与慢病毒载体组分质粒共转染。为了识别慢病毒载体基因组质粒骨架上的“许可”位点，以便能够在瞬时转染期间以顺式提供经修饰的U1 snRNA盒，克隆了三种变体。A慢病毒载体基因组变体示意图，该慢病毒载体基因组在瞬时转染过程中以顺式(cis)提供经修饰的U1 snRNA盒。版本1(“[cis]ver1”)和版本3(“[cis]ver3”)将经修饰的U1 snRNA盒放置在抗性标记和复制起点之间，这样经修饰的U1 snRNA盒相对于慢病毒载体基因组盒是反向的(ver1和ver3之间的抗性标记方向不同)，而版本2(“[cis]ver2”)将经修饰的U1snRNA盒置于慢病毒载体基因组盒的上游且处于相同的方向。(图例：Pro，启动子；从5'R到gag的区域包含包装元件{Ψ}；msd，主要剪接供体{此处显示为MSD-2KO}；RRE，rev应答元件；cppt，中央多嘌呤束；转基因，包含治疗有效载荷的异源序列；U1-Pro，U1启动子；Term[3'box]，U1转录终止子)。B在HEK293T细胞中三个“顺式”版本的包含EF1a-GFP盒的MSD-2KO慢病毒载体基因组质粒用于与“反式”版本平行的方法生产慢病毒载体，其中在供应或不供应经修饰的U1snRNA的情况下，通过与单独的质粒共转染生产相同的MSD-2KO慢病毒载体基因组(在骨架中没有插入经修饰的U1 snRNA盒)。数据表明，与单独的编码质粒的经修饰的U1 snRNA共转染类似，可以通过使用“顺式”慢病毒载体基因组增加MSD-2KO慢病毒载体滴度。
图17：使用经修饰的U1 snRNA增加编码治疗性转基因的标准慢病毒载体的滴度的进一步证明。标准慢病毒载体包含EF1a驱动的转基因盒，该转基因盒编码通过T2A肽或与癌抗原5T4的嵌合抗原受体(CAR)而与GFP融合的密码子优化的或野生型人α1-抗胰蛋白酶，在无血清、+/-经修饰的U1 snRNA(256U1)的悬浮HEK293T细胞的条件下进行生产，并通过整合试验和GFP-FACS试验(如所示)进行滴定。数据表明，在生产过程中提供经修饰的U1 snRNA时，载体滴度增加了约3倍。
图18：稳定地表达能够增加标准慢病毒载体或MSD-2KO慢病毒载体的经修饰的U1snRNA的HEK293T细胞的成功分离表明，可以将经修饰的U1 snRNA盒引入慢病毒载体包装和生产者细胞系。在HEK293T或HEK293T.305U1(9nt变体)细胞+/-额外的305U1质粒中生产包含EFS-GFP盒的标准慢病毒载体基因组或MSD-2KO慢病毒载体基因组。数据显示，表达经修饰的U1 snRNA的稳定盒能够无毒性地被引入细胞。
图19：在MSD-2KO慢病毒载体中去除了慢病毒载体生产过程中表达转基因的经异常剪接的mRNA，从而减少了在利用TRiP系统时被TRAP靶向所需的转基因mRNA的量。A编码EF1a-GFP转基因盒的“TRiP”慢病毒载体基因组示意图，其中TRAP结合位点(tbs)位于盒的5'UTR内(在载体生产期间提供TRAP降低了转基因表达水平)。在MSD-2KO慢病毒载体的生产过程中，全长、未剪接的可包装vRNA和转基因mRNA是由慢病毒载体盒产生的主要RNA形式(i)(当在生产过程中转基因启动子处于活性状态时)。然而，标准慢病毒载体基因组中MSD的混杂活性导致额外的经“异常”剪接的产物，这些产物可能编码转基因(ii)；这可以独立于内部转基因启动子(即，组织特异性启动子)发生。(图例：Pro，启动子；从5'R到gag的区域包含包装元件{Ψ}；msd，主要剪接供体；cppt，中央多嘌呤束；Int，内含子；sd/sa，剪接供体/受体；GOI，目的基因；灰色箭头指示用于评估在第三代慢病毒载体生产过程中产生的未剪接vRNA的占比的正向{f}和反向{r}引物的位置。为清楚起见，未显示转录后调节元件{PRE})。B在HEK293T细胞中使用包含EF1a-GFP盒的标准慢病毒载体基因组质粒或MSD-2KO慢病毒载体基因组质粒生产慢病毒载体，并生成GFP表达分数(％GFP x MFI)。相对于标准慢病毒载体生产过程中培养物中产生的GFP总量，即使在不存在TRAP的情况下，MSD-2KO也具有降低产生的GFP的量的显著效果。因此，通过使用MSD-2KO慢病毒载体基因组增强了TRAP的阻遏效果，使得培养物中GFP的水平低得多。
图20：通过使用经修饰的U1 snRNA得到的慢病毒载体滴度的加强与增加的载体RNA包装成病毒颗粒相关。从实施例5中生产的载体的RNAse处理的粗制载体上清液中提取总RNA(参见图6)。使用针对载体基因组RNA中HIV-1包装信号的引物对纯化的RNA进行RT-qPCR。在针对vRNA定向的经修饰的U1 snRNA存在下生产的粗制载体收获物中的vRNA信号的增加与图6中报告的载体滴度增加的幅度相似。
图21：通过使用经修饰的U1 snRNA提高编码α1-抗胰蛋白酶(α1AT)的VSVG假型化慢病毒载体的滴度，同时伴随生产过程中转基因表达的抑制。在不存在或存在256U1的情况下，在HEK293T无血清悬浮细胞中生产基于HIV-1的编码密码子优化型(co)或野生型(wt)α1AT蛋白的LV，这些蛋白与GFP表达翻译相关(通过T2A肽)。[A]通过转导贴壁HEK293T和流式细胞术滴定澄清的载体收获物。[B]对生产后的细胞裂解物进行转基因蛋白和β-肌动蛋白的免疫印迹。在用256U1表达质粒共转染的细胞中，转基因表达的不太多但可观察到的降低是明显的。
图22：通过使用经修饰的U1 snRNA提高编码α1-抗胰蛋白酶(α1AT)的仙台病毒(SeV)包膜假型慢病毒载体的滴度，并伴随生产过程中转基因表达的抑制。在不存在或存在256U1的情况下，在贴壁或悬浮(无血清)的HEK293T细胞中产生基于HIV-1的编码与GFP表达(通过T2A肽)翻译相关的α1AT蛋白的LV。SeV-F/HN假型LV需要在转导前通过胰蛋白酶处理激活。[A]通过转导贴壁HEK293T和流式细胞术滴定澄清的载体收获物。[B]对生产后的细胞裂解物进行转基因蛋白和β-肌动蛋白的免疫印迹。在用256U1表达质粒共转染的细胞中，转基因表达的不太多但可观察到的降低是明显的。由于在生产过程中表达的α1-抗胰蛋白酶减少，与VSVG-假型载体相比，SeV F/HN-假型载体由256U1介导的LV滴度的增加更显著(图21)。SeV F蛋白在转导之前需要通过胰蛋白酶激活，因此粗制载体中α1AT的存在可能会抑制该激活步骤。
图23：使用经修饰的U1 snRNA提高含有反向转基因盒的慢病毒载体的滴度。[A]LV基因组表达盒的示意图，该表达盒编码由LCR-β-珠蛋白启动子驱动的反向β-珠蛋白基因(包含在原代细胞中有效表达所需的外显子/内含子)。[B]在不存在或存在所述经修饰的U1snRNA的情况下，在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中生产LV制备物。然后通过转导贴壁HEK293T随后通过整合试验，从而滴定澄清的载体收获物。
图24：在浓缩载体材料以及粗制载体材料中观察到通过使用经修饰的U1 snRNA使慢病毒载体的滴度增加。在不存在或存在256U1的情况下，在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中生产编码EF1a启动子驱动的萤火虫荧光素酶/GFP双报告基因盒的基于HIV-1的慢病毒载体。通过离心浓缩大部分澄清的载体收获物，从而达到约20倍的浓缩系数。通过转导贴壁HEK293T细胞然后通过流式细胞术测定GFP阳性细胞，从而滴定澄清的载体收获物和浓缩载体。
图25：开发基于Taqman的RT-qPCR试验，用于检测经修饰的U1 snRNA以评估表达水平和残留。[A]显示256U1 snRNA分子以及正向/反向引物和FAM/TAMRA偶联探针的结合位置的示意图。内源性U1 snRNA和本发明中描述的经修饰的U1 snRNA之间的主要区别在于分子的5'端；用靶向序列替换天然剪接供体退火序列，从而使经修饰的U1 snRNA能够与载体基因组RNA退火。由于使用反向引物进行cDNA合成步骤(使用逆转录酶)的必然需求，内源性U1snRNA和经修饰的U1 snRNA都将有助于细胞RNA和(可能)从载体颗粒中提取的RNA的cDNA合成过程中产生的cDNA池。因此，为了区分内源性U1 snRNA和经修饰的U1 snRNA，将正向引物设计为与5'端的vRNA靶向序列退火。[B]从使用或不使用p256U1转染得到的细胞裂解物中提取的总RNA的Taqman qPCR(+/-RT步骤)绘制的Ct阈值。由p256U1样品(每个反应2x107个拷贝，连续10倍稀释)生成的标准曲线(黑色圆圈)具有良好的范围和线性。未转染的细胞样品和经p256U1转染的细胞(无RT步骤)之间约2倍的循环差异表明与样品相关的残留p256U1DNA的可能水平，即使样品在RT步骤后用DNAse处理。来自经p256U1转染的细胞的+RT和-RT处理样品之间Cts的平均差异为19.4个循环，在样品稀释80倍(即每个反应大约105个拷贝)时，这种差异为20个循环。
图26：在慢病毒载体生产的瞬时转染方法中，将经修饰的U1 snRNA表达质粒添加到转染混合物中的剂量效应。在不存在或存在增加量的共转染p256U1的情况下，在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中通过瞬时转染生产基于HIV-1的LV-CAR载体(编码表达靶向CD19的CAR的EF1a启动子驱动的盒)。[A]对生产后的细胞进行总RNA提取，并通过RT-qPCR量化载体基因组RNA(vRNA)或256U1 snRNA的水平。所有数据均根据针对内源性转录物(RPH1)进行的对照RT-qPCR进行调整。[B]通过转导贴壁HEK293T细胞然后进行整合试验，从而滴定澄清的LV-CAR载体上清液(使用vRNA引物对提取的宿主细胞DNA进行qPCR)。数据表明生产细胞内的256U1 snRNA和vRNA水平之间存在相关性，从而引起载体输出滴度的类似增加。
图27：应用多方差建模(通过“实验设计”[DoE])优化经修饰的U1 snRNA和LV组分质粒的比率，用于生产编码治疗性转基因的慢病毒载体的实例。在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中以40mL摇瓶规模生产HIV-EF1a-5T4CAR载体。GagPol和rev输入水平固定，并改变基因组、VSVG和256U1质粒水平。通过转导贴壁HEK293T细胞然后通过使用抗CAR抗体进行免疫流式细胞术，从而滴定澄清粗制载体收获物(浅灰色条；“测试”T1-28)。DoE实验产生的滴度值能够预测最佳的p256U1输入水平，然后使用该输入水平(“DoE预测”D1-3)或不使用p256U1(“空白形式”P1-3)进一步生产载体制备物。该优化实验使p256U1得以应用，从而使HIV-EF1a-5T4CAR输出滴度增加约10倍。
图28：+/-256U1的HIV-EF1a-5T4CAR载体的生产和浓缩，以产生用于原代T细胞转导和残留256U1 snRNA分析的浓缩载体。通过瞬时转染250mL摇瓶规模的悬浮(无血清)的HEK293T细胞，并进行离子交换层析，用盐活性核酸酶(SAN)进行DNAse处理，然后进行低速离心，从而生产HIV-EF1a-5T4CAR(“LV-CAR”)载体。通过转导HEK293T细胞然后进行整合试验，从而滴定载体制备物。
图29：载体制备物中残留的265U1 snRNA的检测和量化。在对载体相关RNA进行RT-qPCR分析以量化vRNA和256U1残留DNA水平/比率之前，对来自+/-256U下生产的HIV-EF1a-5T4CAR(“LV-CAR”)(参见图28)生产的载体样品进行总RNA提取。数据表明，最初在澄清的载体收获物中检测到的高水平256U1 snRNA主要是由于“游离”256U1 snRNA，其可以通过用Benzonase处理进行清除(在纯化过程中未使用Benzonase处理澄清的载体收获物)。这种处理将256U1:vRNA的比率降低到1:20，在下游加工/浓缩过程中用盐活性核酸酶(SAN)处理后，该比率进一步降低到1:32。
图30：通过质谱法对+/-256U生产的HIV-EF1a-5T4CAR的浓缩/纯化制备物的蛋白比较分析。通过质谱法对用于转导原代T细胞(参见表IV)的浓缩/纯化LV-CAR制备物(参见图28和29)进行分析以评估在LV生产过程中可能由经256U1修饰的U1 snRNA分子的表达引起的蛋白含量的任何主要差异。对于在256U1(LV-CAR[+256U1])存在下生产的载体，基于作为总百分率的相对丰度将前400种蛋白命中物(hit)排名为1至400，并且将在LV-CAR或LV-CAR[+256U1]内的这些命中物的相对丰都绘制在y轴上。在这400种蛋白中，前100种蛋白占总蛋白丰度的约70％，而前10种蛋白占总蛋白丰度的约30％。丰度最高的前两个命中物都是用于LV制备物的Gag和VSV-G，并且已知在HIV-1病毒颗粒中以高水平掺入的其他细胞因子包括基础免疫球蛋白(Basigin)、HSPc-71K、焦聚蛋白和亲环蛋白A，亲环蛋白A特异性结合至病毒衣壳。比较表明，两种LV制备物的蛋白组成之间的差异很小。对于两种LV制备物，映射到Gag与Pol的肽丰度的比率为约16，与HIV-1的预期比率约20一致，表明数据质量良好。
图31：使用+/-256U生产的HIV-EF1a-5T4CAR载体产生CAR-T细胞。来自三个健康供体的大约1.5x106外周血单核细胞(PBMC)与CD3/CD28 T细胞扩增剂微珠一起培养，并与IL-2一起孵育。用浓缩载体样品“LV-CAR”和“LV-CAR[+256U1](参见图28至30和表IV)以MOI1.25转导活化的T细胞，并且另外用LV-CAR[+256U1]以MOI 0.3进行转导。[A]在制备冷冻活细胞库(1x107 vc/小瓶)之前，监测转导后第13天(D13)的总活细胞计数。CAR-T细胞复苏并扩增5天(R+5)，从而为细胞杀伤和细胞因子释放试验做好准备(参见图32和33)。[B]在转导后第8天(D8)和从冷冻原液中复苏时测定转导百分率。
图32：评估使用在有或没有256U1存在时生产的LV-CAR载体所产生的CAR-T细胞的功能；细胞因子释放。复苏的CAR-T细胞再扩增5天，并且存活率均>97％。将约1x105 CAR-T细胞与相同数量的靶细胞系共培养：THP-1、Kasumi-1和SKOV-3(均为5T4阳性)和AML-193(5T4阴性细胞系)。24小时后，使用细胞计数微珠分析培养物上清液的颗粒酶-B[A]和干扰素-γ活性[B]。
图33：评估使用在有或没有256U1下生产的LV-CAR载体所产生的CAR-T细胞的功能；靶细胞杀伤效果。复苏的CAR-T细胞再扩增5天，并且存活率均>97％。将约1x105 CAR-T细胞与相同数量的靶细胞系共培养：THP-1、Kasumi-1和SKOV-3(均为5T4阳性)和AML-193(5T4阴性细胞系)。靶细胞用荧光细胞示踪染料标记，以便随后通过流式细胞术进行识别。40小时后收获细胞并用荧光活性染料染色。通过流式细胞术测量每个实验孔中的非活靶细胞的百分率，并与仅靶细胞培养物(未添加CAR-T)的存活率进行比较。
图34：用存在256U1时生产的HIV-EF1a-5T4CAR转导后，CAR-T扩增培养物中残留的载体相关RNA的分析。在使用HIV-EF1a-5T4CAR(+256U1；参见图31)以两种不同MOI转导后的CAR-T细胞扩增期间，在第8天和第13天收获细胞团。提取总RNA并针对RPH1 mRNA、vRNA(Psi)和256U1 snRNA进行RT-qPCR。通过ΔCt方法计算内源性RPH1转录物和残留256U1snRNA的丰度差异。
图35：通过在摇瓶和生物反应器中瞬时转染带有或不带有p256U1的慢病毒载体包装细胞系，从而生产HIV-EF1a-CAR(CD19)载体。将HIV-EF1a-CAR_CD19或HIV-EF1a-CAR_CD19-T2A-GFP基因组质粒转染到有或没有p256U1的悬浮、适应无血清的慢病毒载体包装细胞系(PAC)中。在40mL摇瓶或250mL生物反应器中进行生产。悬浮、适应无血清的HEK293T细胞用作对照，其中所有载体组分质粒DNA也被共转染。
图36：由用256U1 snRNA表达盒稳定转染的悬浮、适应(无血清)的HEK293T细胞系增进慢病毒载体生产。用能够连接至潮霉素B抗性标记盒的256U1 snRNA表达盒稳定转染HEK293T细胞，然后从该HEK293T细胞中分离出悬浮、适应(无血清)的HEK293T细胞系“256U1c39”。在10周内、有或没有选择压力的条件下，与亲本HEK293T细胞系相比，评估说明HIV-EF1a-5T4CAR滴度提高。数据表明，256U1c39克隆稳定地产生了与瞬时转染的HEK293T亲本细胞接近或相同水平的256U1 snRNA。
图37：测试经修饰的U1 snRNA的重新靶向序列的长度。存在靶向vRNA的LV包装区域内位置305的经修饰的U1 snRNA的情况下，在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中生产HIV-EF1a-GFP、HIV-EF1a-CARCD19或HIV-EF1a-5T4CAR载体。测试的每个305U1变体都包含不同长度的靶向序列：5、7、9至15个核苷酸，并与未经修饰的U1和256U1(15nt)进行比较。通过转导贴壁HEK293T细胞，然后进行流式细胞术[A]或整合试验[B]，从而滴定澄清的载体上清液。
图38：经修饰的U1 snRNA对慢病毒载体滴度的提高似乎与报道的U1 snRNA在产生剪接定型复合物中的“AU”二核苷酸依赖性的能力无关。在具有所述二核苷酸变体的256U1snRNA的情况下，在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中生产HIV-EF1a-GFP载体(参见表V)，并在贴壁HEK293T细胞中进行滴定。根据Yeh等(2017)的描述，绘制了相对滴度(相对于无256U1)并将对滴度的影响(13nt变体；浅灰色条)以及预测的CBP20结合分数从最高到最低排序。虚线表示256U1_13_aT对照变体的滴度增加。每个二核苷酸变体的CAP结合评分的预测能力与载体滴度的提高之间似乎没有相关性。
图39：经修饰的U1靶向位点的微调。基于由256U1 snRNA确定的明显“热点”(参见图4和5)设计了包含13个核苷酸靶退火长度的经修饰的U1 snRNA(表VI)。这些经修饰的U1snRNA经设计使得靶位点在基于HIV-1的LV基因组中以大约2nt的增量向nt256靶位点的上游或向下游移动。在不存在或存在每个指示的变异体修饰的U1 snRNA的情况下，通过瞬时转染，在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中生产HIV-EF1a-GFP载体。通过转导贴壁HEK293T细胞然后通过流式细胞术进行分析，从而滴定澄清的载体上清液。
图40：通过将生产细胞与定向EIAV vRNA的5'包装区域的经修饰的U1 snRNA共转染，加强基于EIAV的慢病毒载体滴度。在有或没有指定的经修饰的U1 snRNA表达质粒的情况下，用pEIAV-CMV-GFP或pEIAV-EF1a-GFP基因组质粒和pGagPol、pRev和pVSVG转染悬浮(无血清)的HEK293T细胞(参见表VI)。通过转导贴壁HEK293T细胞然后进行流式细胞术，从而滴定澄清的载体上清液。相比于不存在经修饰的U1 snRNA表达质粒(条纹条)的情况下生产的载体绘制了相对滴度。
图41：通过将生产细胞与定向SIVagm vRNA的5'包装区域的经修饰的U1 snRNA共转染，提高基于SIVagm的慢病毒载体滴度。用SIV载体组分，并且在有或没有指定的经修饰的U1 snRNA表达质粒的情况下转染悬浮(无血清)的HEK293T细胞(参见表VIII)。通过转导贴壁HEK293T细胞然后进行整合试验，从而滴定澄清的载体上清液。
具体实施方式
一般定义
除非另有说明，否则本发明的实施将使用化学、分子生物学、微生物学免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。所述技术在文献中解释。参见，例如：J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements)Current Protocols in MolecularBiology,Ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,NY；B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn(1996)DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee(1990)In Situ Hybridization:Principles andPractice；Oxford University Press；M.J.Gait(ed.)(1984)OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach,IRL Press；和D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg(1992)Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and PhysicalAnalysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press。这些文献的全部内容以引用方式并入本文。
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常的理解相同的含义。除非另有说明，否则“rev”和“gag-pol”指慢病毒载体的蛋白质和/或基因。
如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物，在所述复合物中，各个组成多肽通过共价方式或非共价方式连接。如本文所用，术语“多肽”和“肽”指其中单体为氨基酸并通过肽键或二硫键连接在一起的聚合物。
如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
如本文所用，术语“核苷酸序列”与术语“多核苷酸”和/或术语“核酸序列”同义。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，与本文描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。数字范围包括限定范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均按5'到3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。
应当理解，在提供数值范围的情况下，除非上下文另有明确规定，否则该区间也具体公开了该范围的上限和下限之间的各中间值，直至下限单位的十分之一。任何规定值或规定范围内的中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围都包括在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或在该范围内将其排除，并且每个范围的两个极限值中的一个、两个都不或两个都包括在较小的范围内，也包括在本公开内容中，受到规定范围中的任何具体排除的极限值的限制。在规定范围包括一个或两个极限值的情况下，排除这些包括的极限值之一或两者的范围也包括在本公开中。
必须注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。
如本文所用的术语“包含(comprising、comprises、comprised of)”、与“包括(including、includes)”或“含有(containing、contains)”同义，并且是包含式的或开放式的，因此不排除额外的、非列举的构件、元件或方法步骤。术语“包含(comprising、comprises、comprised of)”还包括术语“由……组成(consisting of)”。
经修饰的U1 snRNA
本发明人惊奇地发现，通过共表达基于已修饰的U1 snRNA的非编码RNA可以提高慢病毒载体的输出滴度，U1 snRNA已被修饰，因此它们不再靶向内源性序列(剪接供体位点)，转而靶向vRNA分子内的序列。本发明涉及这种经修饰的U1 snRNA和一种新的增加慢病毒载体生产滴度的新方法。该方法包括在载体生产过程中将经修饰的U1 snRNA与其他载体组分共表达。的U1 snRNA经设计使得其与保守剪接供体位点结合，该保守剪接供体位点通过将之替换为与载体基因组vRNA内的靶序列互补的异源序列而被去除。本发明描述了经修饰的U1 snRNA的各种应用模式和最佳特性，包括靶序列和互补长度、设计和表达模式。
人U1 snRNA(小核RNA)长164nt，具有由四个茎环组成的明确结构(参见图1)。内源性非编码RNA(U1 snRNA)通过天然剪接供体退火序列(例如，5'-ACUUACCUG-3')在内含子剪接的早期阶段与共有5'剪接供体位点(例如，5'-MAGGURR-3'，其中M为A或C并且R为A或G)结合。茎环I与U1A-70K蛋白结合，该蛋白已被证明对polyA抑制很重要。茎环II与U1A蛋白结合，并且5'-AUUUGUGG-3'序列与茎环IV一起与Sm蛋白结合，Sm蛋白对U1 snRNA加工很重要。在本发明中，经修饰的U1 snRNA被修饰以在天然剪接供体靶向序列的位点处引入与载体基因组vRNA分子内的靶序列互补的异源序列(参见图1)。
如本文所用，术语“经修饰的U1 snRNA”、“重新定向的U1 snRNA”、“重新靶向的U1snRNA”、“重新设计的U1 snRNA”和“突变的U1 snRNA”是指已经对U1 snRNA进行修饰使其不再结合用于启动靶基因的剪接过程的共有5'剪接供体位点序列(例如5'-MAGGURR-3')。因此，经修饰的U1 snRNA是基于供体位点序列与U1 snRNA的5'端的天然剪接供体退火序列的互补性而进行修饰以使其不再与剪接供体位点序列(例如5'-MAGGURR-3')结合。作为替代，经修饰的U1 snRNA经设计使其结合具有在慢病毒载体基因组分子的包装区域内的独特RNA序列的核苷酸序列(靶位点)，即与基因剪接无关的序列。可以预先选择慢病毒载体基因组分子的包装区域内的核苷酸序列。因此，经修饰的U1 snRNA是经过修饰以使其5'端结合慢病毒载体基因组分子的包装区域内的核苷酸序列的U1snRNA。作为结果，经修饰的U1 snRNA基于靶位点序列与经修饰的U1 snRNA的5'端的短序列的互补性而与靶位点序列结合。
慢病毒载体的5'包装区域可具有本领域已知的序列。例如，慢病毒载体的5'包装区域可以是以下中的任一者：
SEQ ID NO:67–HIV-1(HxB2)[GenBank:K03455.1]：
Gggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaaga
SEQ ID NO:68–HIV-2[NCBI参考序列：NC_001722.1]：
Cagtcgctctgcggagaggctggcagatcgagccctgagaggttctctccagcactagcaggtagagcctgggtgttccctgctggactctcaccagtacttggccggtactgggcagacggctccacgcttgcttgcttaaagacctcttcaataaagctgccagttagaagcaagttaagtgtgtgttcccatctctcctagtcgccgcctggtcattcggtgttcatctgagtaacaagaccctggtctgttaggacccttctcgctttgggaatccaaggcaggaaaatccctagcaggttggcgcccgaacagggacttgaagaggactgagaagccctggaactcggctgagtgaaggcagtaagggcggcaggaacaaaccacgacggagtgctcctagaaaggcgcgggccgaggtaccaaaggcggcgtgtggagcgggagtgaaagaggcctccgggtgaaggtaagtacctacaccaaaaactgtagccagaaaaggcttgttatcctacctttagacaggtagaagattgtgggagatgggcgcgagaaactccgtcttgagagggaaaaaagcagacgaattagaaaaagttaggttacggcccggcggaaagaaaaagtacaggttaaaacatattgtgtgggcagcgaatgaattggataaattcggattggcagagagcctgttggagtcaaaagaaggttgccaaaagattctcagagttttagatccattagtaccaacagggtcagaaaatttaaaaagcctttttaataccgtctgcgtcatttggtgcttgcacgcagaagagaaagtgaaagatactgaggaagcaaagaaactagcacagagacatctagtggcagaaactggaactgcagagaaaatgccaaatacaagtagaccaacagcaccacctagtgggaaaagaggaaactaccccgtgcaacaagcgggtggcaactatgtccatgtgccactga
SEQ ID NO:69–EIAV(SPEIAV-19菌株)[GenBank:U01866.1]：
Gggactcagattctgcggtctgagtcccttctctgctgggctgaaaaggcctttgtaataaatataattctctactcagtccctgtctctagtttgtctgttcgagatcctacagttggcgcccgaacagggacctgagaggggcgcagaccctacctgttgaacctggctgatcgtaggatccccgggacagcagaggagaacttacagaagtcttctggaggtgttcctggccagaacacaggaggacaggtaagatgggagaccctttgacatggagcaaggcgctcaagaagttagagaaggtgacggtacaagggtctcagaaattaactactggtaactgtaattgggcgctaagtctagtagacttatttcatgataccaactttgtaaaagaaaaggactggcagctgagggatgtcattccattgctggaagatgtaactcagacgctgtcaggacaagaaagagaggcctttgaaagaacatggtgggcaatttctgctgtaaagatgggcctccagattaataatgtagtagatggaaaggcatcattccagctcctaagagcgaaatatgaaaagaagactgctaataaaaagcagtctgagccctctgaagaatatc
SEQ ID NO:70–SIVagm(TYO-1菌株)[GenBank:AB253736.1]：
Cagtctcttactaggagaccagcttgagcctgggtgttcgctggttagcctaacctggttggccaccaggggtaaggactccttggcttagaaagctaataaacttgcctgcattagagcttatctgagtcaagtgtcctcattgacgcctcactctcttgaacgggaatcttccttactgggttctctctctgacccaggcgagagaaactccagcagtggcgcccgaacagggacttgagtgagagtgtaggcacgtacagctgagaaggcgtcggacgcgaaggaagcgcggggtgcgacgcgaccaagaaggagacttggtgagtaggcttctcgagtgccgggaaaaagctcgagcctagttagaggactaggagaggccgtagccgtaactactctgggcaagtagggcaggcggtgggtacgcaatgggggcggctacctcagcactaaataggagacaattagaccaatttgagaaaatacgacttcgcccgaacggaaagaaaaagtaccaaattaaacatttaatatgggcaggcaaggagatggagcgcttcggcctccatgagaggttgttggagacagaggaggggtgtaaaagaatcatagaagtcctctaccccctagaaccaacaggatcggagggcttaaaaagtctgttcaatcttgtgtgcgtactatattgcttgcacaaggaacagaaagtgaaagacacagaggaagcagtagcaacagtaagacaacactgccatctagtggaaaaagaaaaaagtgc
SEQ ID NO:71-SIVmac(Mm251菌株)[GenBank:M19499.1]：
Cagtcgctctgcggagaggctggcagattgagccctgggaggttctctccagcactagcaggtagagcctgggtgttccctgctagactctcaccagcacttggccagtgctgggcagagtggctccacgcttgcttgcttaaagacctcttcaataaagctgccattttagaagtaagccagtgtgtgttcccatctctcctagtcgccgcctggtcaactcggtactcggtaataagaagaccctggtctgttaggaccctttctgctttgagaaaccgaagcaggaaaatccctagcagattggcgcccgaacaggacttgaaggagagtgagagactcctgagtacggctgagtgaaggcagtaagggcggcaggaaccaaccacgacggagtgctcctataaaggcgcgggtcggtaccagacggcgtgaggagcgggagaggaggaggcctccggttgcaggtaagtgcaacacaaaaaagaaatagctgtcttgttatccaggaagggataataagatagagtgggagatgggcgcgagaaactccgtcttgtcagggaagaaagcagatgaattagaaaaaattaggctacgacccggcggaaagaaaaagtacatgttgaagcatgtagtatgggcagcaaatgaattagatagatttggattagcagaaagcctgttggagaacaaagaaggatgtcaaaaaatactttcggtcttagctccattagtgccaacaggctcagaaaatttaaaaagcctttataatactgtctgcgtcatctggtgcattcacgcagaagagaaagtgaaacacactgaggaagcaaaacagatagtgcagagacacctagtggtg
SEQ ID NO:72–FIV(Petaluma菌株，克隆：34TF10)
[GenBank:M25381.1]：
gagtctctttgttgaggacttttgagttctcccttgaggctcccacagatacaataaatatttgagattgaaccctgtcgagtatctgtgtaatcttttttacctgtgaggtctcggaatccgggccgagaacttcgcagttggcgcccgaacagggacttgattgagagtgattgaggaagtgaagctagagcaatagaaagctgttaagcagaactcctgctgacctaaatagggaagcagtagcagacgctgctaacagtgagtatctctagtgaagcggactcgagctcataatcaagtcattgtttaaaggcccagataaattacatctggtgactcttcgcggaccttcaagccaggagattcgccgagggacagtcaacaaggtaggagagattctacagcaacatggggaatggacaggggcgagattggaaaatggccattaagagatgtagtaatgttgctgtaggagtaggggggaagagtaaaaaatttggagaagggaatttcagatgggccattagaatggctaatgtatctacaggacgagaacctggtgatataccagagactttagatcaactaaggttggttatttgcgatttacaagaaagaagagaaaaatttggatctagcaaagaaattgatatggcaattgtgacattaaaagtctttgcggtagcaggacttttaaatatgacggtgtctactgctgctgcagctgaaaatatgtattctcaaatgggattagacactag
可以设计合适的经修饰的U1 snRNA以结合特定载体类型的包装区域。例如，可以通过遵守以下一般程序以实现使用经修饰的U1snRNA增加慢病毒载体的输出滴度：
1.应当获得慢病毒载体基因组序列，并在载体基因组RNA分子的5'包装序列区域内鉴定出一组靶序列。广义的5'包装序列区域从载体基因组RNA分子的第一个核苷酸到余下的野生型gag序列的3'核苷酸，野生型gag序列通常作为包装序列的一部分保留。
2.建议在初始靶筛选中识别一组长度为15个核苷酸的靶序列，并首先识别15至20个不同(非重叠)的序列。这些序列应该均匀分布在从vRNA的第一个核苷酸到gag区域的约第50个核苷酸的包装序列中，在保留的gag区域内识别的序列较少。
3.载体基因组RNA(5'-3')中存在的这些靶序列应反向互补，以提供15个核苷酸的靶退火序列，该序列将在经修饰的U1 snRNA分子的第一个核苷酸内编码(5'-3')。
4.将靶退火序列插入U1 snRNA表达盒(包含U1启动子和终止区域)，从而替换天然U1 snRNA核苷酸3到11，即“AT”二核苷酸(天然U1 snRNA的核苷酸1和2[snRNA分子中的“AU”])应保留在靶退火序列的上游，“A”是转录起始位点。这可以通过标准分子克隆/基因合成技术来实现。
5.然后应当通过生产编码目的转基因序列的慢病毒载体来筛选一组经修饰的U1snRNA表达构建体，其中每个经修饰的U1 snRNA表达构建体都用载体组分单独表达。这最容易通过与载体组分一起的瞬时共转染进行，但也可以在包装或生产者细胞系中进行。然后对输出载体上清液进行滴定以凭经验确定引起最大滴度增加的主要靶区域。
6.可以通过产生包含靶退火序列的变体，从而进一步改进经修饰的U1 snRNA，这些变体递增地靶向初始的、经验确定的靶位点的上游和下游的载体基因组RNA。可以通过在初始的、经验确定的靶位点的上游或下游，可能继续到先前(初始)筛选中测试的靶位置，将靶退火序列按照每个变体逐步移动一个、两个、三个或四个或更多个核苷酸，从而实现增量扫描。这可以确定载体基因组RNA内的最佳靶位点。
7.可以通过产生包含不同长度的靶退火序列的变体，从而进一步改进经修饰的U1snRNA。建议采用从先前筛选中识别的经修饰的U1 snRNA(这可以具有15个核苷酸的靶退火序列)并设计变体，其中靶退火序列逐渐减少或增加，以便产生一组新的变体，其中每个变体的靶退火序列的核苷酸长度可以是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个。然后可以如前所述对这个新的经修饰的U1 snRNA变体组进行筛选。
8.可以通过在位置1和2处产生含有替代核苷酸的变体，从而进一步改进经修饰的U1 snRNA。具体而言，可以将“AT”二核苷酸(snRNA分子中的“AU”)改变为避开这种共有，例如变为“GA”。然后可以如前所述对这个新的经修饰的U1 snRNA变体组进行筛选。
9.经修饰的U1 snRNA表达构建体可以在与慢病毒载体组分分离的DNA分子(例如质粒DNA)内编码，或者可以与编码载体基因组或gagpol或与载体组分共转染的其他DNA组分(例如表达TRAP的质粒)的DNA有效连接。
10.经修饰的U1 snRNA表达构建体可以经稳定转染以产生可用于通过瞬时转染产生慢病毒载体的细胞系。例如，细胞系也可以用转录阻遏物(如tetR)和/或翻译阻遏物(如TRAP)、或这两种类型的表达控制蛋白进行稳定转染。
11.经修饰的U1 snRNA表达构建体可以与其他慢病毒载体组分一起稳定转染，以产生包装或生产者细胞系。
12.获得上述稳定细胞系的另一种方法是将经修饰的U1snRNA表达盒插入自失活的逆转录病毒或慢病毒载体中，产生编码所述经修饰的U1 snRNA表达盒的载体病毒颗粒，并以受控的感染复数(MOI)转导细胞以分离更可能含有所述经修饰的U1 snRNA表达盒的靶拷贝数的稳定细胞系。所述自失活的逆转录病毒或慢病毒载体还可包含选择标记盒。
13.为了评估慢病毒载体生产细胞或慢病毒载体制品中的经修饰的U1 snRNA序列的RNA或DNA拷贝数，可以开发一种RT-qPCR试验方法，其中正向引物退火到经修饰的U1snRNA的特定的靶退火序列，以便明确检测经修饰的U1 snRNA而非内源性/天然U1 snRNA。
如本文所用，术语“天然剪接供体退火序列”和“天然剪接供体靶向序列”是指内源性U1 snRNA的5'端的短序列，其与内含子的共有5'剪接供体位点广泛互补。天然剪接供体退火序列可以为5'-ACUUACCUG-3'。
如本文所用，术语“共有5'剪接供体位点”是指用于剪接位点选择的内含子5'端的共有RNA序列，例如具有序列5'-MAGGURR-3'。
如本文所用，术语“慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列”、“靶序列”和“靶位点”是指具有在慢病毒载体基因组分子的包装区域内的特定RNA序列的位点，其被预选为结合经修饰的U1 snRNA的靶位点。
如本文所用，术语“慢病毒载体基因组分子的包装区域”和“慢病毒载体基因组序列的包装区域”是指慢病毒载体基因组的5'端的从5'U5结构域开始到源自gag基因的序列的末端的区域。因此，慢病毒载体基因组分子的包装区域包括5'U5结构域、PBS元件、茎环(SL)1元件、SL2元件、SL3ψ元件、SL4元件和源自gag基因的序列。在本领域中，在慢病毒载体生产期间向基因组以反式提供完整的gag基因以能够生产复制缺陷型病毒载体颗粒是常见的。以反式提供的gag基因的核苷酸序列不需要由野生型核苷酸编码，但可以是密码子优化的；重要的是，以反式提供的gag基因的主要特性是它编码并定向gag和gagpol蛋白的表达。因此，本领域技术人员将理解，如果在慢病毒载体生产期间以反式提供完整的gag基因，则术语“慢病毒载体基因组分子的包装区域”可以指慢病毒载体基因组分子的5'端的从5'U5结构域开始、通过SL3ψ元件处的“核心”包装信号以及来自ATG密码子(存在于SL4中)的天然gag核苷酸序列、到存在于载体基因组上的保留的gag核苷酸序列的末端的区域。
如本文所用，术语“源自gag基因的序列”是指可能存在于(例如保留在)载体基因组中的源自ATG密码子的gag基因至核苷酸688的任何天然序列(Kharytonchyk,S.et.al.,2018,J.Mol.Biol.,430:2066-79)。
如本文所用，术语“在包含天然剪接供体退火序列的U1 snRNA的前11个核苷酸内引入异源序列”、“在位置3至11处的九个核苷酸内引入所述异源序列”和“在U1 snRNA的5'端的前11个核苷酸内引入异源序列”包括用所述异源序列替换U1 snRNA的前11个核苷酸或位置3至11处的九个核苷酸的全部或一部分，或对U1 snRNA的前11个核苷酸或位置3至11处的九个核苷酸进行修饰以使其具有与所述异源序列相同的序列。
如本文所用，术语“在天然剪接供体退火序列中引入异源序列”和“在U1 snRNA的5'端的天然剪接供体退火序列中引入异源序列”包括用所述异源序列替换天然剪接供体退火序列的全部或一部分，或修饰天然剪接供体退火序列以使其具有与所述异源序列相同的序列。
如本文所用，术语“提高慢病毒载体滴度”包括“增加慢病毒载体滴度”和“改进慢病毒载体滴度”。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种经修饰的U1 snRNA，该经修饰的U1 snRNA已被修饰以结合慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA在相对于内源性U1 snRNA的5'端被修饰，以引入与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA在相对于内源性U1 snRNA的5'端被修饰，以在天然剪接供体退火序列内引入与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。
经修饰的U1 snRNA可以在相对于内源性U1 snRNA的5'端被修饰，以用与所述核苷酸序列互补的异源序列替换包含天然剪接供体退火序列的序列。
经修饰的U1 snRNA可以是经修饰的U1 snRNA变体。根据本发明的经修饰的U1snRNA变体可以是天然存在的U1 snRNA变体、在茎环I区域内包含去除U1-70K蛋白结合的突变的U1 snRNA变体、或在茎环II区域内包含去除U1A蛋白结合的突变的U1 snRNA变体。在茎环I区域内包含去除U1-70K蛋白结合的突变的U1 snRNA变体可以是U1_m1或U1_m2，优选U1A_m1或U1A_m2。
在一些实施方案中，本发明的经修饰的U1 snRNA包含与如本文所述的U1_256序列的主要U1 snRNA序列[三叶草叶](nt 410-562)具有至少70％同一性(适宜地为至少75％、至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的经修饰的U1 snRNA包含如本文所述的U1_256序列的主要U1 snRNA序列[三叶草叶](nt 410-562)。U1_256序列(SEQ ID NO:15)的主要U1 snRNA序列[三叶草叶](nt 410-562)如下：
GCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTG(SEQ ID NO:66)。
在一些实施方案中，本发明的经修饰的U1 snRNA包括如下核苷酸序列：
(N[0-2])XGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCA CTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTG CGTTCGCGCTTTCCCCTG(其中X是未定义长度的靶退火序列；N是A、C、G或T中的任何一个；N[0-2]是长度为0至2个核苷酸的核苷酸序列；并且用下划线示出主要U1 snRNA序列[三叶草叶](SEQ ID NO:66))。
在一些实施方案中，本发明的经修饰的U1 snRNA包括如下核苷酸序列：
ATXGCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGG ATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCG CGCTTTCCCCTG(其中X是未定义长度的靶退火序列，并且用下划线示出主要U1 snRNA序列[三叶草叶](SEQ ID NO:66))。
在一些实施方案中，本发明的经修饰的U1 snRNA包括如下核苷酸序列：
AT(N[9-15])GCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTG CACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGAC TGCGTTCGCGCTTTCCCCTG(其中N是A、C、G或T中的任何一个；N[9-15]是长度为9至15个核苷酸的靶退火序列；并且用下划线示出主要U1 snRNA序列[三叶草叶](SEQ ID NO:66))。
在一些优选的实施方案中，包含天然剪接供体退火序列的U1snRNA的前11个核苷酸可以全部或部分被替换为与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。适宜地，U1snRNA的前11个核苷酸的核酸1至11(适宜地为2至11、3至11、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)被替换为与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。
在一些实施方案中，天然剪接供体退火序列可以全部或部分被异源序列替换，该异源序列与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补。适宜地，天然剪接供体退火序列的核酸1至11(适宜地为2至11、3至11、5至11、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)被替换为与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。在一个优选的实施方案中，整个天然剪接供体退火序列被替换为与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列，即根据本发明的异源序列完全替换了天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')。
在一些实施方案中，包含与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列的经修饰的U1 snRNA将在所述异源序列的5'端的第一个核苷酸处编码A，无论A是否参与对靶序列的退火。
在一些实施方案中，包含与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列的经修饰的U1 snRNA将在所述异源序列的5'端的前两个核苷酸处编码AU，无论A或U是否参与对靶序列的退火。
在一些实施方案中，包含与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列的经修饰的U1 snRNA不会在所述异源序列的5'端的前两个核苷酸处编码AU，并且第一个核苷酸可能参与或不参与对靶序列的退火。
在一些实施方案中，与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列包括至少7个与所述核苷酸序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列包括至少9个与所述核苷酸序列互补的核苷酸。优选地，用于本发明的异源序列包括15个与所述核苷酸序列互补的核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括7至25(适宜地为7至20、7至15、9至15、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括7个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括8个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括9个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括10个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括11个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括12个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括13个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括14个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括15个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括16个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括17个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括18个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括19个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括20个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括21个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括22个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括23个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括24个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包括25个核苷酸。
在一些实施方案中，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列位于5'U5结构域、PBS元件、SL1元件、SL2元件、SL3ψ元件、SL4元件和/或源自gag基因的序列内。适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列位于SL1、SL2和/或SL3ψ元件内。在一些优选的实施方案中，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列位于SL1和/或SL2元件内。在一些特别优选的实施方案中，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列位于SL1元件内。
在一些实施方案中，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括至少7个核苷酸。在一些实施方案中，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括至少9个核苷酸。适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括7至25(适宜地为7至20、7至15、9至15、7、8、9、10、11、12、13、14或15)个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括7个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括8个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括9个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括10个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括11个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括12个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括13个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括14个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括15个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括16个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括17个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括18个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括19个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括20个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括21个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括22个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括23个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括24个核苷酸。
适宜地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括25个核苷酸。
优选地，慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列包括15个核苷酸。
相对于在不存在本发明的经修饰的U1 snRNA的情况下的慢病毒载体生产，本发明的经修饰的U1 snRNA与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列的结合可以在慢病毒载体生产过程中提高慢病毒载体滴度。因此，相对于在不存在本发明的经修饰的U1snRNA的情况下的慢病毒载体生产，在本发明的经修饰的U1 snRNA存在下生产慢病毒载体提高了慢病毒载体滴度。用于测量慢病毒载体滴度的适宜的试验方法如本文所述。适宜地，慢病毒载体生产涉及所述经修饰的U1 snRNA与包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组的载体组分的共表达。在一些实施方案中，慢病毒载体滴度的提高发生在功能性5'LTRpolyA位点存在或不存在的情况下。在一些实施方案中，由本发明的经修饰的U1 snRNA介导的慢病毒载体滴度的提高与载体基因组的5'LTR中的polyA位点抑制无关。
在一些实施方案中，相对于在不存在本发明的经修饰的U1 snRNA的情况下的慢病毒载体生产，本发明的经修饰的U1 snRNA与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列的结合可在慢病毒载体生产期间使慢病毒载体滴度增加至少30％。适宜地，相对于在不存在本发明的经修饰的U1 snRNA的情况下的慢病毒载体生产，本发明的经修饰的U1snRNA与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列的结合可在慢病毒载体生产期间使慢病毒载体滴度增加至少35％(适宜地为至少40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％)。
本发明的经修饰的U1 snRNA可以通过以下步骤进行设计：(a)在慢病毒载体基因组的包装区域中选择用于结合经修饰的U1 snRNA的靶位点(预选核苷酸位点)；(b)在U1snRNA的5'端的天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')中引入异源序列，该异源序列与在步骤(a)中选择的预选核苷酸位点互补。
使用分子生物学中的常规技术在内源性U1 snRNA的5'端的天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')中引入与靶位点互补的异源序列、或用与靶位点互补的异源序列代替天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')在本领域普通技术人员的能力范围内。一般而言，适宜的常规方法包括定向诱变或经由同源重组进行替换。
使用分子生物学中的常规技术在内源性U1 snRNA的5'端修饰天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')，使其具有与靶位点互补的异源序列相同的序列在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，适宜的方法包括定向诱变或随机诱变，然后选择提供根据本发明的经修饰的U1 snRNA的突变。
本发明的经修饰的U1 snRNA可以根据本领域公知的方法制造。例如，经修饰的U1snRNA可以通过化学合成或重组DNA/RNA技术制造。
使用常规分子和细胞生物学技术将编码本发明的经修饰的U1snRNA的核苷酸序列引入细胞在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可以如下所述使用表达盒。
因此，在另一方面中，本发明提供了一种包含本发明的经修饰的U1 snRNA的细胞。适宜的细胞如下所述。
在另一方面中，如本发明的实施例中所证明的，如本文所述的根据本发明的经修饰的U1可以有益地引起转基因表达的阻遏。因此，如本文所述，本发明还包括使用经修饰的U1进行转基因阻遏的方法、或其方法或用途。
核苷酸序列
在另一方面中，本发明提供了编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
与本发明相关的术语“核苷酸序列”可以是双链或单链分子，并且包括基因组DNA、cDNA、合成DNA、RNA和嵌合DNA/RNA分子。优选地，核苷酸序列是指编码本发明的经修饰的U1snRNA的DNA，更优选为cDNA序列。
通常，本发明范围所涵盖的核苷酸序列使用重组DNA技术(即，重组DNA)制备，如本文所述。
在一个优选的实施方案中，编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列是表达盒。
通过提取总RNA，然后使用DNA引物进行RT-PCR或RT-qPCR(定量)，可以在载体生产细胞提取物或载体病毒颗粒中量化经修饰的U1 snRNA分子的存在/丰度。重要的是，将正向引物设计成使其与经修饰的U1 snRNA分子的靶向序列具有互补性，因此在qPCR过程中仅扩增经修饰的U1 snRNA而不是内源性U1 snRNA。
在一个方面中，本发明提供了一种包含如本文所述的根据本发明的经修饰的U1的载体病毒颗粒。
载体/表达盒
载体是一种工具，其允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境。根据本发明，并以举例的方式，在重组核酸技术中使用的一些载体使得实体，如核酸区段(例如，异源性DNA区段，如异源性cDNA区段)，转移到靶细胞中并由靶细胞表达。载体可促进整合编码本发明的经修饰的U1 snRNA(或病毒载体组分)的核苷酸序列，以维持编码本发明的经修饰的U1snRNA(或病毒载体组分)的核苷酸序列和其在靶细胞内的表达。
载体可以是表达盒或可以包括表达盒(也称为表达构建体)。如本文所述的表达盒包含含有能够被转录的序列的核酸区域。因此，编码mRNA、tRNA和rRNA的序列包括在该定义中。
载体可包含一种或以上可选择的标记基因(例如，新霉素抗性基因)和/或可追踪的标记基因(例如，编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因)。载体可用于例如感染和/或转导靶细胞。载体还可包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的核苷酸序列。
术语“盒”，与诸如“偶联物”、“构建体”和“杂交体”之类的术语同义，包括直接或间接连接到启动子的多核苷酸序列。本发明的表达盒包含用于表达编码本发明的经修饰的U1snRNA的核苷酸序列的启动子和任选的编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列的调节子。用于本发明的表达盒包含用于表达编码病毒载体组分的核苷酸序列的启动子和任选的编码病毒载体组分的核苷酸序列的调节子。优选地，所述盒至少包含能够连接至启动子的多核苷酸序列。
表达盒可用于在体外相容的靶细胞中复制编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。因此，本发明提供了一种体外制备经修饰的U1 snRNA的方法，该方法通过将本发明的表达盒体外引入相容的靶细胞并在引起经修饰的U1 snRNA表达的条件下使靶细胞生长。可以通过本领域公知的方法从靶细胞中回收经修饰的U1 snRNA。适宜的靶细胞包括哺乳动物细胞系和其他真核细胞系。
表达盒(例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体)的选择通常取决于待引入的宿主细胞。表达盒可以是DNA质粒(超螺旋、切口或线形化)、小环DNA(线形或超螺旋)、通过限制酶消化和纯化去除质粒骨架而仅包含目的区域的质粒DNA、使用酶促DNA扩增平台生成的DNA，例如doggybone DNA(dbDNATM)，其中使用的最终DNA处于闭合连接形式，或该DNA已被制备(例如限制酶消化)成具有开放切割末端。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种包含编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列的表达盒。
在本发明的一方面中，如本文所述的经修饰的U1表达盒可通过慢病毒载体或逆转录病毒载体递送至如本文所述的细胞。
使用常规分子和细胞生物学技术将本发明的表达盒引入细胞在本领域普通技术人员的能力范围内。
在另一方面中，本发明提供了包含本发明的表达盒的细胞。适宜的细胞描述如下。
慢病毒载体生产系统和细胞
慢病毒载体生产系统包含一组核苷酸序列，其编码生产慢病毒载体所需的组分。因此，载体生产系统包含一组核苷酸序列，其编码产生慢病毒载体颗粒所必需的病毒载体组分。
“病毒载体生产系统”或“载体生产系统”或“生产系统”应理解为包含慢病毒载体生产所需组分的系统。
在一个方面中，核苷酸序列可适用于在不依赖tat的载体生产系统中的慢病毒载体。如本文所述，第三代慢病毒载体是U3依赖性的(并采用异源启动子驱动转录)，并且根据本发明的核苷酸序列可用于第三代慢病毒载体的情况中。在本发明的一个方面中，慢病毒载体生产系统中不提供tat，例如不以反式提供tat。在一个方面中，如本文所述的细胞或载体或载体生产系统不包含tat蛋白。
在一个方面中，本发明提供了一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖于tat的慢病毒载体。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列是在不存在tat的情况下产生的。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已经独立于tat而转录。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖U3的慢病毒载体。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已经独立于U3启动子而转录。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已被异源启动子转录。
在一个方面中，如本文所述的核苷酸序列的转录不依赖于U3的存在。核苷酸序列可以源自不依赖U3的转录事件。核苷酸序列可以源自异源启动子。如本文所述的核苷酸序列可不包含天然U3启动子。
在一个实施方案中，病毒载体生产系统包含编码Gag和Gag/Pol蛋白以及Env蛋白和载体基因组序列的核苷酸序列。生产系统可任选地包含编码Rev蛋白或其功能替代物的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，至少一个转基因组分可以是反向的或处于相反方向。
在一个实施方案中，至少一个转基因组分可以是反向的或具有相对于载体基因组RNA的5'到3'方向性相反的方向。可以使用慢病毒载体基因组，其中转基因盒是反向的，即转录单位与驱动载体基因组盒的启动子相反。此外，可能存在转基因盒的一个组分可能反向而另一个处于正向的情况，例如使用双向转基因盒或多个单独的盒。
在一个实施方案中，病毒载体生产系统包含模块化核酸构建体(模块化构建体)。模块化构建体是包含两个或以上用于生产慢病毒载体的核酸的DNA表达构建体。模块化构建体可以是包含两个或以上用于生产慢病毒载体的核酸的DNA质粒。质粒可以是细菌质粒。核酸可以编码例如gag-pol、rev、env、载体基因组。此外，设计用于生成包装和生产者细胞系的模块化构建体可能还需要编码转录调节蛋白(例如TetR、CymR)和/或翻译阻遏蛋白(例如，TRAP)和可选择的标记(例如，ZeocinTM、潮霉素、杀稻瘟素、嘌呤霉素、新霉素抗性基因)。用于本发明的适宜的模块化构建体在EP 3502260中进行了描述，该专利的全部内容通过引用并入本文。
由于根据本发明使用的模块化构建体包含在一个构建体上编码两个或以上逆转录病毒组分的核酸序列，因此考虑了这些模块化构建体的安全性，并将额外的安全特征直接设计到构建体中。这些特征包括将绝缘子用于逆转录病毒载体组分的多个开放阅读框和/或在模块化构建体中使用逆转录病毒基因的特定方向和排列。据信，通过使用这些特征，将防止直接通读以生成具有复制能力的病毒颗粒。
在模块化构建体中，编码病毒载体组分的核酸序列可以处于反向和/或交互的转录方向。因此，编码病毒载体组分的核酸序列不是以相同的5'到3'方向呈现，使得病毒载体组分不能由相同的mRNA分子产生。反向可能意味着不同载体组分的至少两个编码序列以“头对头”和“尾对尾”转录方向存在。这可以通过在模块化构建体的一条链上提供一个载体组分(例如env)的编码序列并在模块化构建体的另一条链上提供另一个载体组分(例如rev)的编码序列来实现。优选地，当模块化构建体中存在多于两个载体组分的编码序列时，至少两个编码序列以逆转录方向存在。因此，当模块化构建体中存在多于两个载体组分的编码序列时，每个元件可以定向为使得它以与相邻的其他载体组分的所有相邻编码序列相反的5'到3'方向存在，即每个编码序列可采用交互的5'到3'(或转录)方向。
根据本发明使用的模块化构建体可以包含编码以下载体组分中的两种或以上的核酸序列：gag-pol、rev、env、载体基因组。模块化构建体可以包含编码载体组分的任何组合的核酸序列。在一个实施方案中，模块化构建体可以包含编码以下组分的核酸序列：
i)逆转录病毒载体的RNA基因组和rev或其功能替代物；
ii)逆转录病毒载体的RNA基因组和gag-pol；
iii)逆转录病毒载体的RNA基因组和env；
iv)gag-pol和rev或其功能替代物；
v)gag-pol和env；
vi)env和rev或其功能替代物；
vii)逆转录病毒载体的RNA基因组、rev或其功能替代物以及gag-pol；
viii)逆转录病毒载体的RNA基因组、rev或其功能替代物以及env；
ix)逆转录病毒载体的RNA基因组、gag-pol和env；或者
x)gag-pol、rev或其功能替代物以及env，
其中核酸序列处于反向和/或交互方向。
在一个实施方案中，用于生产逆转录病毒载体的细胞可包含编码上述i)至x)组合中任一种的核酸序列，其中所述核酸序列位于同一遗传基因座并处于反向和/或交互方向。同一遗传基因座可以指细胞中的单个染色体外基因座，例如细胞基因组中的单个质粒或单个基因座(即单个插入位点)。细胞可以是用于生产逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)的稳定或瞬时细胞。
DNA表达构建体可以是DNA质粒(超螺旋、切口或线形化)、小环DNA(线形或超螺旋)、通过限制酶消化和纯化去除质粒骨架而仅包含目的区域的质粒DNA、使用酶促DNA扩增平台产生的DNA，例如doggybone DNA(dbDNATM)，其中使用的最终DNA处于闭合连接形式，或者该DNA已被制备(例如限制酶消化)成具有开放切割末端。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒。
“病毒载体生产细胞”、“载体生产细胞”或“生产细胞”应理解为能够生产慢病毒载体或慢病毒载体颗粒的细胞。慢病毒载体生产细胞可以是“生产者细胞”或“包装细胞”。病毒载体系统的一种或以上DNA构建体可以稳定整合或以游离体保持在病毒载体生产细胞内。或者，可以将病毒载体系统的所有DNA组分瞬时转染到病毒载体生产细胞中。在另一个替代方案中，稳定表达一些组分的生产细胞可用载体生产所需的剩余组分瞬时转染。
如本文所述，在本发明的一方面，将U1表达盒稳定整合到如本文所述的根据本发明的细胞中。
如本文所用，术语“包装细胞”是指含有生产慢病毒载体颗粒所必需的元件但缺乏载体基因组的细胞。任选地，此类包装细胞含有一种或以上能够表达病毒结构蛋白(例如gag、gag/pol和env)以及通常的rev的表达盒。
生产者细胞/包装细胞可以是任何适宜的细胞类型。生产者细胞通常是哺乳动物细胞，但也可以是(例如)昆虫细胞。
如本文所用，术语“生产者细胞”或“载体生产细胞/载体生产者细胞”是指包含生产慢病毒载体颗粒所需的所有元件的细胞。生产者细胞可以是稳定生产者细胞系或瞬时衍生的，或者可以是稳定的包装细胞，其中逆转录病毒基因组是瞬时表达的。
载体生产细胞可以是体外培养的细胞，例如组织培养细胞系。适宜的细胞系包括但不限于哺乳动物细胞，例如鼠成纤维细胞衍生的细胞系或人类细胞系。优选地，载体生产细胞源自人类细胞系。
细胞和生产方法
本发明的另一方面涉及生产慢病毒载体的方法，该方法包括将本文所述的核苷酸序列引入细胞(例如生产细胞)并在适合生产慢病毒载体的条件下培养细胞。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种生产慢病毒载体的方法，包括以下步骤：
a)将编码载体组分的核苷酸序列和至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞中；
b)任选地选择包含所述编码载体组分的核苷酸序列和至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列的细胞；
c)在所述载体组分与所述经修饰的U1 snRNA共表达并且生产慢病毒载体的条件下进一步培养细胞；和
d)任选地分离慢病毒载体。
在另一方面中，本发明提供了一种生产慢病毒载体的方法，包括以下步骤：
a)将编码载体组分的核苷酸序列和至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞中；
b)选择包含所述编码载体组分的核苷酸序列和至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列的细胞；
c)任选地将与编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列不同的核酸载体引入所选细胞中；
d)在生产慢病毒载体的条件下进一步培养细胞；和
e)任选地分离慢病毒载体。
在本发明的方法中，载体组分可以包括慢病毒载体的gag、env、rev和/或RNA基因组。编码载体组分的核苷酸序列和至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列可以同时或以任何顺序依次引入细胞。可以在引入至少一个编码本发明的经修饰的U1snRNA的核苷酸序列之前将编码载体组分的核苷酸序列引入细胞。可以在引入编码载体组分的核苷酸序列之前将至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞。
在一些实施方案中，慢病毒载体可以是复制缺陷型的。
在另一方面中，本发明提供了通过本发明的任何方法生产的慢病毒载体。
在另一方面中，本发明提供了本发明的经修饰的U1 snRNA或编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列或本发明的生产细胞用于生产慢病毒载体的用途。
慢病毒载体生产可涉及本发明的经修饰的U1 snRNA与载体组分在如本文所述的适宜的生产细胞中的共表达。
在另一方面中，本发明提供了一种产生用于生产慢病毒载体的生产细胞的方法，包括以下步骤：
a)将编码载体组分的核苷酸序列、以及至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞中，所述载体组分包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组；和
b)任选地选择包含所述编码载体组分的核苷酸序列和至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列的细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种产生用于生产慢病毒载体的稳定生产细胞的方法，包括以下步骤：
a)将编码载体组分的核苷酸序列、以及至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞中，所述载体组分包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组；和
b)选择包含所述编码载体组分的核苷酸序列或至少一个编码至少一个本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列的细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种产生用于生产慢病毒载体的瞬时生产细胞的方法，包括将编码载体组分的核苷酸序列、以及至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞中，所述载体组分包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组。
在另一方面中，本发明提供了一种用于生产通过本发明的任何方法生产的慢病毒载体的细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种用于生产通过本发明的任何方法生产的慢病毒载体的稳定生产细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种用于生产通过本发明的任何方法生产的慢病毒载体的瞬时生产细胞。
在另一方面中，本发明提供了一种用于生产慢病毒载体的细胞，该细胞包含至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
在另一方面中，本发明提供了一种用于生产慢病毒载体的稳定生产细胞，该稳定生产细胞包含至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
在另一方面中，本发明提供了一种用于生产慢病毒载体的瞬时生产细胞，该瞬时生产细胞包含至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
在一些实施方案中，用于生产慢病毒载体的稳定或瞬时生产细胞包含1、5、10、15、20或30个稳定整合的编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
在本发明的方法和用途的一些实施方案中，相对于在不存在本发明的经修饰的U1snRNA的情况下的慢病毒载体生产，本发明的经修饰的U1 snRNA与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列的结合在慢病毒载体生产期间提高了慢病毒载体滴度。因此，相对于在不存在本发明的经修饰的U1 snRNA的情况下的慢病毒载体生产，在本发明的经修饰的U1 snRNA存在下生产慢病毒载体提高了慢病毒载体滴度。用于测量慢病毒载体滴度的适宜的试验方法如本文所述。适宜地，慢病毒载体生产涉及所述经修饰的U1 snRNA与包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组的载体组分的共表达。在一些实施方案中，慢病毒载体滴度的提高发生在功能性5'LTR polyA位点存在或不存在的情况下。在一些实施方案中，由本发明的经修饰的U1 snRNA介导的慢病毒载体滴度的提高与载体基因组5'LTR中的polyA位点抑制无关。
在本发明的方法和用途的一些实施方案中，相对于不存在本发明的经修饰的U1snRNA的慢病毒载体生产，本发明的经修饰的U1 snRNA与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列的结合可在慢病毒载体生产期间使慢病毒载体滴度增加至少30％。适宜地，相对于在不存在本发明的经修饰的U1 snRNA的情况下的慢病毒载体的生产，本发明的经修饰的U1 snRNA与慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列的结合可在慢病毒载体生产期间使慢病毒载体滴度增加至少35％(适当地为至少40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％或1000％)。
在本发明的方法和用途的一些实施方案中，适宜的生产细胞或用于生产慢病毒载体的细胞是在适当条件下培养时能够生产病毒载体或病毒载体颗粒的细胞。因此，细胞通常包含编码载体组分的核苷酸序列，载体组分可包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组。适宜的细胞系包括但不限于哺乳动物细胞，例如鼠成纤维细胞衍生的细胞系或人类细胞系。它们通常是哺乳类，包括人类细胞，例如HEK293T、HEK293、CAP、CAP-T或CHO细胞，但也可以是(例如)昆虫细胞，例如SF9细胞。优选地，载体生产细胞源自人类细胞系。因此，此类适宜的生产细胞可用于本发明的任何方法或用途中。
将核苷酸序列引入细胞的方法是本领域众所周知的并且之前已经描述过。因此，使用在本领域技术人员能力范围内的分子和细胞生物学中的常规技术，将编码包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组的载体组分的核苷酸序列、以及至少一个编码本发明的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列或至少一个本发明的表达盒引入细胞中。
稳定生产细胞可以是包装细胞或生产者细胞。为了从包装细胞产生生产者细胞，可以稳定地或瞬时地引入载体基因组DNA构建体。可以通过用逆转录病毒载体转导适宜的细胞系，从而产生包装细胞/生产者细胞，所述逆转录病毒载体表达载体组分(即基因组、gag-pol组分和的包膜)之一，如WO 2004/022761中所述。
可选地，可以将核苷酸序列转染到细胞中，然后偶尔随机地整合到生产细胞基因组中。转染方法可以使用本领域公知的方法进行。例如，稳定的转染过程可以使用已经被工程改造以帮助串联(concatemerisation)的构建体。在另一个例子中，转染过程可以使用磷酸钙或市售可得的制剂如LipofectamineTM 2000CD(Invitrogen，CA)、
Figure BDA0003484958400000551
HD或聚乙烯亚胺(PEI)。或者，可以通过电穿孔将核苷酸序列引入生产细胞。技术人员将知晓促进核苷酸序列整合到生产细胞中的方法。例如，如果核酸构建体是天然环状的，则将该核酸构建体线形化可能会有所帮助。较少随机整合的方法可能涉及这样的核酸构建体，该核酸构建体包含与哺乳动物宿主细胞的内源性染色体具有共享同源性的区域，以指导整合到内源性基因组内的选定位点。此外，如果构建体上存在重组位点，则这些位点可用于靶向重组。例如，核酸构建体可包含loxP位点，当与Cre重组酶结合时(即，使用源自P1噬菌体的Cre/lox系统)，该位点允许进行靶向整合。可选地或另外地，重组位点是att位点(例如，来自λ噬菌体)，其中att位点允许在存在λ整合酶的情况下进行位点定向整合。这将允许逆转录病毒基因靶向宿主细胞基因组内的基因座，从而允许较高和/或稳定的表达。
靶向整合的其他方法是本领域公知的。例如，诱导基因组DNA靶向切割的方法可用于促进在选定的染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用方法或系统来诱导双链断裂(DSB)，例如，在内源性基因组中的切口，以通过非同源端连接(NHEJ)等生理机制诱导断裂修复。可以通过使用特异性核酸酶，如工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，使用利用工程改造的crRNA/tracr RNA(“单向导RNA”)以引导特异性切割的CRISPR/Cas9系统，和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热链球菌(T.thermophilus))进行切割。
可以通过使用仅慢病毒转导或仅核酸转染的方法整合核苷酸序列，或者使用两者的组合，从而产生包装细胞系/生产者细胞系。
WO 2009/153563中描述了从生产细胞产生逆转录病毒载体的方法，特别是逆转录病毒载体的加工。
在一个实施方案中，生产细胞可包含RNA结合蛋白(例如色氨酸RNA结合减弱蛋白，TRAP)和/或Tet阻遏蛋白(TetR)蛋白或其他调节蛋白(例如，CymR)。
从生产细胞生产慢病毒载体可以通过转染方法，从稳定细胞系生产可以包括诱导步骤(例如强力霉素诱导)或通过两者的组合。可以使用本领域公知的方法进行转染方法，并且此前已经描述了实例。
生产细胞，无论是包装细胞系或生产者细胞系，还是用慢病毒载体编码组分瞬时转染的细胞，都可以进行培养以增加细胞和病毒数量和/或病毒滴度。进行细胞培养以使其能够代谢、和/或生长和/或分裂和/或生产根据本发明的目的病毒载体。这可以通过本领域技术人员公知的方法完成，包括但不限于例如在适当的培养基中为细胞提供营养。所述方法可包括贴壁于表面上生长、悬浮生长或它们的组合。例如，可以使用分批、补料分批、连续系统等在组织培养瓶、组织培养多孔板、培养皿、滚瓶、波浪袋或生物反应器中进行培养。为了通过细胞培养实现病毒载体的大规模生产，本领域优选具有能够悬浮生长的细胞。培养细胞的适宜条件是已知的(参见例如Tissue Culture,Academic Press,Kruse andPaterson,editors(1973),和R.I.Freshney,Culture of animal cells:A manual ofbasic technique,fourth edition(Wiley-Liss Inc.,2000,ISBN 0-471-34889-9))。
优选地，细胞最初在组织培养瓶或生物反应器中“堆积”并且随后在多层培养容器或大型生物反应器(大于50L)中生长，以产生本发明的载体生产细胞。
优选地，细胞以贴壁模式生长，以产生本发明的载体生产细胞。
优选地，细胞以悬浮模式生长，以产生本发明的载体生产细胞。
主要剪接供体
已经证明病毒载体的RNA基因组的包装区域中主要剪接供体位点的突变对载体生产滴度有害，并额外激活紧邻MSD的隐蔽剪接供体(crSD)。MSD或CrSD的异常剪接会导致产生无法包装到载体病毒颗粒中的经剪接的RNA。也有报道称，从MSD到来自由转导细胞中的整合载体衍生的转录通读产物的细胞转录物的剪接，引起了安全问题。本发明人描述了MSD剪接区域内的新突变，其引起载体滴度(在不存在经修饰的U1 snRNA的情况下)不明显的降低，从而使得在经修饰的U1 snRNA存在下，滴度进一步增加。相对于本文所述的作用，主要剪接供体位点的这种突变或缺失对载体滴度具有额外的改进作用，并可与本文所述的本发明的任何其他方面组合使用。
RNA剪接由被称为剪接体的大型RNA蛋白质复合物催化，剪接体由五个小核核糖核蛋白(snRNP)组成。内含子和外显子之间的边界由前体mRNA内的特定核苷酸序列标记，它描述了剪接发生的位置。这种边界被称为“剪接位点”。术语“剪接位点”是指能够被真核细胞的剪接机制识别为适合切割和/或连接到另一个剪接位点的多核苷酸。
剪接位点允许切除存在于前体mRNA转录物中的内含子。通常，5'剪接边界被称为“剪接供体位点”或“5'剪接位点”，3'剪接边界被称为“剪接受体位点”或“3'剪接位点”。剪接位点包括，例如，天然存在的剪接位点、工程改造或合成的剪接位点、标准的或共有剪接位点和/或非典型剪接位点，例如，隐蔽剪接位点。
剪接受体位点通常由三个独立的序列元件组成：分支点或分支位点、聚嘧啶束和受体共有序列。真核生物中的分支点共有序列是YNYTRAC(其中Y是嘧啶，N是任意核苷酸，R是嘌呤)。3'受体剪接位点共有序列是YAG(其中Y是嘧啶)(参见例如Griffiths et al.,eds.,Modern Genetic Analysis,2nd edition,W.H.Freeman and Company,New York(2002))。3'剪接受体位点通常位于内含子的3'端。
因此，在用于本发明的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列中的主要剪接供体位点可为失活的。
在一个方面中，本发明还提供了如本文所述的根据本发明的细胞，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，例如突变或缺失。
在一个方面中，提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，例如突变或缺失。
术语“典型剪接位点”或“共有剪接位点”可以互换使用，指的是跨物种保守的剪接位点。
用于真核RNA剪接的5'供体剪接位点和3'受体剪接位点的共有序列是本领域公知的。这些共有序列在内含子的每一端包括几乎不变的二核苷酸：内含子的5'端的GT、以及内含子3'端的AG。
典型剪接供体位点共有序列可以是(对于DNA)AG/GTRAGT(其中A是腺苷，T是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，C是胞嘧啶，R是嘌呤以及“/”表示切割位点)。这符合本文所述的更通用的剪接供体共有序列MAGGURR。本领域众所周知，剪接供体序列可能偏离该共有序列，尤其是在病毒基因组中，其中其他限制因素影响同一序列，例如在vRNA包装区域内的二级结构。非典型剪接位点在本领域中也是众所周知的，尽管与典型剪接供体共有序列相比，它们很少出现。
“主要剪接供体位点”是指病毒载体基因组中的第一个(显性)剪接供体位点，其编码并嵌入通常位于病毒载体核苷酸序列的5'区域的天然病毒RNA包装序列中。
在一个方面中，核苷酸序列不包含活性主要剪接供体位点，即所述核苷酸序列中的主要剪接供体位点不发生剪接，并且去除了主要剪接供体位点的剪接活性。
主要剪接供体位点位于慢病毒基因组的5'包装区域。
对于HIV-1病毒，主要的剪接供体共有序列是(对于DNA)TG/GTRAGT(其中A是腺苷，T是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，C是胞嘧啶，R是嘌呤以及“/”表示切割位点)。
在本发明的一个方面中，剪接供体区域，即突变前的包含主要剪接供体位点的载体基因组区域可以具有以下序列：
GGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAAT(SEQ ID NO：1)
在本发明的一个方面中，突变的剪接供体区域可包含以下序列：
GGGGCGGCGACTGCAGACAACGCCAAAAAT(SEQ ID NO：2-MSD-2KO)
在本发明的一个方面中，突变的剪接供体区域可包含以下序列：
GGGGCGGCGAGTGGAGACTACGCCAAAAAT(SEQ ID NO：11-MSD-2KOv2)
在本发明的一个方面中，突变的剪接供体区域可包含以下序列：
GGGGAAGGCAACAGATAAATATGCCTTAAAAT(SEQ ID NO：12-MSD-2KOm5)
在本发明的一个方面中，在修饰之前，剪接供体区域可以包含以下序列：
GGCGACTGGTGAGTACGCC(SEQ ID NO：9)
该序列在本文中也称为“茎环2”区(SL2)。该序列可在载体基因组的剪接供体区域形成茎环结构。在本发明的一个方面中，该序列(SL2)可能已经从如本文所述的本发明的核苷酸序列中删除。
因此，本发明包括不包含SL2的核苷酸序列。本发明包括不包含根据SEQ ID NO：9的序列的核苷酸序列。
在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点可以具有以下共有序列，其中R是嘌呤,“/”是切割位点：
TG/GTRAGT(SEQ ID NO：3)
在一个方面中，R可以是鸟嘌呤(G)。
在本发明的一个方面中，主要剪接供体和隐蔽剪接供体区域可具有以下核心序列，其中“/”是主要剪接供体和隐蔽剪接供体位点处的切割位点：
/GTGA/GTA(SEQ ID NO：13)。
在本发明的一个方面中，MSD突变的载体基因组可以在主要剪接供体和隐蔽剪接供体“区域”(SEQ ID NO：13)中具有至少两个突变，其中第一个和第二个“GT”核苷酸分别紧邻主要剪接供体和隐蔽剪接供体核苷酸的3'端。
在本发明的一个方面中，主要剪接供体共有序列是CTGGT(SEQ ID NO：4)。主要剪接供体位点可能包含序列CTGGT。
在一个方面中，在剪接位点失活之前，核苷酸序列包括如SEQ ID NO：1、3、4、9、10和/或13中的任一者所示的序列。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则该位点将在对应于SEQ ID NO：1的核苷酸13和14的核苷酸之间具有切割位点。
根据本文所述的本发明，核苷酸序列还包含无活性的隐蔽剪接供体位点。在一个方面中，核苷酸序列不包含与主要剪接供体位点(3')相邻的活性隐蔽剪接供体位点，也就是说，不从相邻的隐蔽剪接供体位点发生剪接，并且去除了从隐蔽剪接供体位点的剪接。
术语“隐蔽剪接供体位点”是指这样的核酸序列，该核酸序列通常不作为剪接供体位点发挥作用或由于相邻序列的情况(例如，附近存在“优选的”剪接供体)而作为剪接供体位点利用效率较低，但可以通过相邻序列的突变(例如，附近“优选的”剪接供体的突变)而被激活，从而变成更有效的功能性剪接供体位点。
在一个方面中，隐蔽剪接供体位点是主要剪接供体3'的第一个隐蔽剪接供体位点。
在一个方面中，隐蔽剪接供体位点在主要剪接供体位点3'侧的主要剪接供体位点的6个核苷酸内。优选地，隐蔽剪接供体位点在主要剪接供体切割位点的4或5个核苷酸以内，优选4个核苷酸以内。
在本发明的一个方面中，隐蔽剪接供体位点具有共有序列TGAGT(SEQ ID NO：10)。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的隐蔽剪接供体位点，否则该位点将在对应于SEQ ID NO：1的核苷酸17和18的核苷酸之间具有切割位点。
在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点和/或相邻的隐蔽剪接供体位点包含“GT”基序。在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点均含有突变的“GT”基序。突变的GT基序可能会使主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点的剪接活性失活。这种突变的一个实例在本文中称为“MSD-2KO”。
在一个方面中，剪接供体区域可包含以下序列：
CAGACA(SEQ ID NO：5)
例如，在一个方面中，突变的剪接供体区域可以包含以下序列：
GGCGACTGCAGACAACGCC(SEQ ID NO：6)
失活突变的另一个实例在本文中称为“MSD-2KOv2”。
在一个方面中，突变的剪接供体区域可包含以下序列：
GTGGAGACT(SEQ ID NO：7)
例如，在一个方面中，突变的剪接供体区域可以包含以下序列：
GGCGAGTGGAGACTACGCC(SEQ ID NO：8)
例如，在一个方面中，突变的剪接供体区域可以包含以下序列：
AAGGCAACAGATAAATATGCCTT(SEQ ID NO：14)
在一个方面中，如上所述的茎环2区域可以从剪接供体区中删除，从而引起主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点的失活。这种缺失在本文中称为“ΔSL2”。
可以将多种不同类型的突变引入核酸序列，以使主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点失活。
在一个方面中，突变是去除或抑制剪接区域中的剪接活性的功能性突变。如本文所述的核苷酸序列可以在SEQ ID NO：1、3、4、9、10和/或13任一者中的任何核苷酸中包含突变或缺失。适宜的突变是本领域技术人员已知的，并在此进行了描述。
例如，可以在核酸序列中引入点突变。如本文所用，术语“点突变”是指对单个核苷酸的任何改变。点突变包括例如缺失、转变和颠换；当存在于蛋白质编码序列中时，这些突变可以被分类为无义突变、错义突变或沉默突变。“无义”突变产生终止密码子。“错义”突变产生编码不同氨基酸的密码子。“沉默”突变产生的密码子编码相同的氨基酸、或不改变蛋白质功能的不同氨基酸。可以将一个或以上点突变引入包含隐蔽剪接供体位点的核酸序列。例如，包含隐蔽剪接位点的核酸序列可以通过在其中引入两个或以上点突变来产生突变。
可以在包含主要剪接供体和隐蔽剪接供体位点的核酸序列内的几个位置中引入至少两个点突变，以实现剪接供体区域剪接的减弱。在一个方面中，突变可以在剪接供体切割位点的四个核苷酸内；在典型剪接供体共有序列中，这是A1G2/G3T4，其中“/”是切割位点。本领域众所周知，剪接供体切割位点可能偏离这种共有，尤其是在病毒基因组中，其中其他限制对同一序列产生影响，例如在vRNA包装区域内的二级结构。众所周知，G3T4二核苷酸通常是典型剪接供体共有序列中可变性最小的序列，因而对G3和/或T4的突变最有可能实现最大的减弱效果。例如，对于HIV-1病毒载体基因组中的主要剪接供体位点，这可以是T1G2/G3T4，其中“/”是切割位点。例如，对于HIV-1病毒载体基因组中的隐蔽剪接供体位点，这可以是G1A2/G3T4，其中“/”是切割位点。此外，可以在剪接供体位点附近引入一个或多个点突变。例如，可以在剪接供体位点的上游或下游引入点突变。在核酸序列包含通过在其中引入多个点突变来产生突变的主要和/或隐蔽剪接供体位点的实施方案中，可以将点突变引入隐蔽剪接供体位点的上游和/或下游。
剪接位点突变体的构建
可以使用多种技术构建本发明的剪接位点突变体。例如，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸从而在特定基因座处引入突变，突变序列的侧翼是能够与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得的重建序列包含具有所需核苷酸插入、置换或缺失的衍生物。
允许改变DNA序列的其他已知技术包括重组方法，例如Gibson组装、Golden-gate克隆和In-fusion。
或者，可以使用寡核苷酸定向的位点特异性(或区段特异性)诱变程序来根据所需的置换、缺失或插入提供改变的序列。也可以通过利用与所需缺失相邻的方便的限制性内切核酸酶位点来构建剪接位点突变体的缺失或截断衍生物。
在限制之后，可以填充突出端，并重新连接DNA。
Sambrook等人公开了进行上述改变的示例性方法。(Molecular cloning:ALaboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
剪接位点突变体也可以利用PCR诱变、化学诱变、通过强制核苷酸错误掺入(例如，Liao和Wise，1990)或通过使用随机诱变的寡核苷酸(Horwitz等，1989)的化学诱变(Drinkwater和Klinedinst，1986)技术进行构建。
本发明还提供了一种用于生产慢病毒载体核苷酸序列的方法，包括以下步骤：
(i)提供编码如本文所述的慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列；和
(ii)使所述核苷酸序列中的如本文所述的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点突变。
慢病毒载体
慢病毒是较大一类的逆转录病毒的一部分。慢病毒的详细列表可以参见Coffin等(1997)(“Retroviruses”Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,SMHughes,HE Varmus pp 758-763)。简言之，慢病毒可以分为灵长类动物类和非灵长类动物类。灵长类动物慢病毒的实例包括，但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)，即人类自身免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类动物慢病毒类包括原型“慢病毒”绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血症病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、梅迪维斯纳病病毒(Maedi Visna virus，MVV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。在一个实施方案中，慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒(Visna lentivirus)。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自HIV-1。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自HIV-2。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自EIAV。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自SIV。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自FIV。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自BIV。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自CAEV。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自维斯纳慢病毒。
慢病毒科和逆转录病毒之间的区别是慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞这两者的能力(Lewis et al(1992)EMBO J 11(8):3053-3058和Lewis and Emerman(1994)JVirol 68(1):510-516)。相反，其它逆转录病毒(如MLV)不能感染非分裂的或缓慢分裂的细胞，例如组成诸如肌肉、脑、肺和肝组织的那些细胞。
如本文所用，慢病毒载体是包含至少一个可源自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染或转导靶细胞以及表达NOI的生物学机制。
慢病毒载体可用于在体外的相容靶细胞中复制NOI。因此，本文描述了通过将本发明的载体引入体外相容的靶细胞，并在引起NOI表达的条件下使靶细胞生长以体外制备蛋白质的方法。可以通过本领域公知的方法从靶细胞回收蛋白质和NOI。适宜的靶细胞包括哺乳动物细胞系和其他真核细胞系。
在一些方面，载体可以具有“绝缘子”，即，阻断启动子和增强子之间的相互作用并充当屏障以减少从相邻基因通读的基因序列。
在一个实施方案中，绝缘子存在于一个或以上慢病毒核酸序列之间以防止启动子干扰和从相邻基因通读。如果绝缘子存在于一个或以上慢病毒核酸序列之间的载体中，则这些绝缘基因中的每一个都可以排列为单独的表达单位。
逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同特征，如5'LTR和3'LTR，在它们之间或内部具有使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、使得能够整合到靶细胞基因组中的整合位点、和编码包装组分的gag/pol和env基因，所述包装组分是病毒颗粒组装所需的多肽。慢病毒具有其他的特征，如HIV中的rev基因和RRE序列，它们使得整合的原病毒的RNA转录物能够有效地从受感染靶细胞的细胞核输出到细胞质。
在原病毒中，这些基因的两端的侧翼是称作长末端重复(LTRs)的区域。LTR负责原病毒整合和转录。LTR也作为增强子-启动子序列，并且能够控制病毒基因的表达。
LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，称作U3、R和U5。U3源自RNA的3'端特有的序列。R源自在RNA的两端重复的序列，并且U5源自RNA的5'端特有的序列。在不同的逆转录病毒中，三种元件的大小可以显著不同。
在如本文所述的典型逆转录病毒载体中，可以从病毒中除去一种或以上编码复制所必需的区域的蛋白的至少一部分；例如，可以不存在gag/pol和env基因或者这些基因是功能丧失的。这使病毒载体成为复制缺陷型病毒。
慢病毒载体可以源自灵长类慢病毒(例如HIV-1)或非灵长类慢病毒(例如EIAV)。
一般地，典型的逆转录病毒载体生产系统涉及从必要的病毒包装功能体中分离病毒基因组。这些元件通常以单独的DNA表达盒(或者被称为质粒、表达质粒、DNA构建体或表达构建体)的方式被提供给生产细胞。
载体基因组包含NOI。载体基因组通常需要包装信号(ψ)、含有NOI的内部表达盒、(任选的)后转录元件(PRE)、常规的中央多嘌呤束(cppt)、3'-ppu和自失活(SIN)LTR。R-U5区域是载体基因组RNA和NOI mRNA进行正确的多腺苷酸化、以及逆转录加工所必需的。载体基因组可选地包括开放阅读框，如在WO2003/064665中有所描述，这允许在没有rev的情况下生产载体。
包装功能体包括gag/pol和env基因。这些基因是生产细胞产生载体颗粒所必需的。以反式向基因组提供这些功能体有利于产生复制缺陷型病毒载体。
γ逆转录病毒载体的生产系统通常是需要基因组、gag/pol和env表达构建体的3组分系统。基于HIV-1的慢病毒载体的生产系统还可以需要提供辅助基因rev，并且对于载体基因组而言，要包括rev-应答元件(RRE)。如果基因组中存在开放阅读框(ORF)，则不需要以反式向基于EIAV的慢病毒载体提供rev(参见WO2003/064665)。
通常来说，在载体基因组盒内编码的“外部”启动子(其驱动载体基因组盒)和“内部”启动子(其驱动NOI盒)是强的真核或病毒启动子，就像驱动其他载体系统元件的那些启动子一样。这类启动子的实例包括CMV、EF1α、PGK、CAG、TK、SV40和泛素启动子。强“合成”启动子，如由DNA文库产生的那些启动子(例如，JeT启动子)，还可以用于驱动转录。或者，可以使用组织特异性启动子来驱动转录，这些启动子例如视紫红质(Rho)、视紫红质激酶(RhoK)、含视锥-视杆同源框基因(CRX)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)、卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、Flt-1启动子、INF-β启动子、Mb启动子、SP-B启动子、SYN1启动子、WASP启动子、SV40/hAlb启动子、SV40/CD43、SV40/CD45、NSE/RU5'启动子、ICAM-2启动子、GPIIb启动子、GFAP启动子、纤连蛋白启动子、内皮糖蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、CD68启动子、CD14启动子和B29启动子。
逆转录病毒载体的生产涉及利用这些DNA组分对生产细胞的瞬时共转染，或者稳定生产细胞系的使用，其中所有这些组分稳定整合到生产细胞基因组内(例如，StewartHJ,Fong-Wong L,Strickland I,Chipchase D,Kelleher M,Stevenson L,Thoree V,McCarthy J,Ralph GS,Mitrophanous KA and Radcliffe PA.(2011).Hum GeneTher.Mar；22(3):357-69)。可替代的途径是使用稳定的包装细胞(其中已经稳定地整合有包装组分)，然后根据需要在载体基因组质粒中进行瞬时转染(例如，Stewart,H.J.,M.A.Leroux-Carlucci,C.J.Sion,K.A.Mitrophanous and P.A.Radcliffe(2009).GeneTher.Jun；16(6):805-14)。可以产生可供选择的、不完整的包装细胞系(仅将一个或两个包装组分稳定整合至细胞系中)，并将所产生的缺失组分的载体瞬时转染，这也是可行的。生产细胞还可以表达调节蛋白，如转录调节子的tet阻遏物(TetR)蛋白组的成员(例如，T-Rex、Tet-On和Tet-Off)、转录调节子的4-异丙基苯甲酸(cumate)诱导型开关系统组的成员(例如，4-异丙基苯甲酸阻遏物(CymR)蛋白)或者RNA结合蛋白(例如，TRAP-色氨酸激活的RNA结合蛋白)。
在本发明的一个实施方案中，病毒载体源自EIAV。EIAV具有慢病毒的最简单的基因组结构，因此特别优选用于本发明。除了gag/pol和env基因之外，EIAV还编码其他三种基因：tat、rev和S2。Tat充当病毒LTR的转录激活物(Derse and Newbold(1993)Virology194(2):530-536和Maury et al(1994)Virology 200(2):632-642)，以及rev通过rev-应答元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达(Martarano et al.(1994)J Virol 68(5):3102-3111)。据认为这两种蛋白质的作用机制大体上相似于灵长类动物病毒中的类似机制(Martarano et al.(1994)J Virol 68(5):3102-3111)。S2的功能未知。另外，已鉴定了称为Ttm的EIAV蛋白，它由在跨膜蛋白起始处被剪接到env编码序列的tat的第一个外显子编码。在本发明一个可选的实施方案中，病毒载体源自HIV：HIV与EIAV的差异在于它不编码S2，但是与EIAV不同，它编码vif、vpr、vpu和nef。
术语“重组逆转录病毒或慢病毒载体”(RRV)指这样的载体，其具有足够的逆转录病毒遗传信息，以让RNA基因组在包装组分的存在下得以包装到能够转导靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的转导可包括逆转录、以及整合到靶细胞基因组中。RRV携带着要通过载体递送到靶细胞的非病毒编码序列。RRV不能够进行独立复制以在靶细胞中产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，RRV缺乏复制所必需的功能性gag/pol基因和/或env基因和/或其他基因。
优选地，本发明的RRV载体具有最低限度的病毒基因组。
本文所用的术语“最低限度的病毒基因组”意指病毒载体已经过操作，从而去除非必需元件而保留必需元件，以提供感染、转导和递送NOI到靶细胞所需的功能性。这个策略的更多细节可参见WO 1998/17815和WO 99/32646。最低限度EIAV载体缺少tat、S2基因，以及任选的rev，并且这些基因也都没有以反式出现在生产系统中。最低限度HIV载体缺少vif、vpr、vpu、tat和nef。
用于在生产细胞内生产载体基因组的表达质粒可包括能够连接于逆转录病毒基因组的转录调控序列，从而在生产细胞/包装细胞内直接转录基因组。所有第3代慢病毒载体都在5'U3增强子-启动子区域中被删除，并且载体基因组RNA的转录由例如另一个病毒启动子等的异源启动子驱动，例如CMV启动子，如下所述。此特征能够使载体生产不依赖tat。一些慢病毒载体基因组为了有效的产生病毒，因此需要额外的序列。例如，特别在HIV的情况中，可以包括RRE序列。然而，可以通过GagPol ORF的密码子优化以减少或消除(独立的)GagPol盒对于RRE的需求(以及对以反式提供的rev的依赖性)。这一策略的进一步细节可以参见WO 2001/79518。
与rev/RRE系统执行相同功能的可替代的序列也是已知的。例如，在Mason Pfizer猴病毒中发现了rev/RRE系统的功能性类似物。这被称为组成型转运元件(CTE)，并且在基因组内包括据信与被感染的细胞中的因子相互作用的RRE型序列。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可被用作rev/RRE系统的替代。Rev蛋白的任何已知的或者可获得的其他功能性等价物都可以与本发明相关。例如，还已知，HTLV-I的Rex蛋白能够功能性地代替HIV-1的Rev蛋白。在本发明方法中使用的载体中，Rev和RRE可以不存在或者是无功能的；在可替代的方案中，可以存在rev和RRE或功能性等价系统。
如本文所用，术语“功能性替代物”是指具有替代序列的蛋白质或序列，该替代序列执行与另一蛋白质或序列相同的功能。术语“功能性替代物”在本文中与具有相同含义的“功能性等同物”和“功能性类似物”可互换使用。
SIN载体
如本文所使用的慢病毒载体可用于自失活(SIN)结构中，其中已经删除了病毒增强子和启动子序列。SIN载体可以在体内、离体或体外以类似于非SIN载体的效率产生并转导非分裂靶细胞。SIN原病毒的长末端重复(LTR)的转录失活将会抑制vRNA的代谢，并且是进一步降低形成具有复制能力的病毒的可能性的特征。这通过去除LTR的任意顺式作用效果，还能够调节由内部启动子启动的基因表达。
举例来说，自失活的逆转录病毒载体系统已经被构建为删除了转录增强子或3'LTR的U3区域内的增强子或启动子。在载体逆转录和整合一轮之后，这些变化将被拷贝到产生无转录活性的“原病毒”的5'LTR和3'LTR中。然而，在这种载体中的LTR的任意内部启动子将仍然保持转录活性。这一策略已被用来去除病毒LTR内的增强子和启动子对由内部放置的基因的转录的影响。这些影响包括增加转录或抑制转录。这种策略也可用于去除从3'LTR下游转录成基因组DNA。在人类基因治疗中，这是受到特别关注的，在该治疗中，重要的是防止任何内源致癌基因的外来激活。Yu et al.,(1986)PNAS 83:3194-98；Marty et al.,(1990)Biochimie 72:885-7；Naviaux et al.,(1996)J.Virol.70:5701-5；Iwakuma etal.,(1999)Virol.261:120-32；Deglon et al.,(2000)Human Gene Therapy 11:179-90。SIN慢病毒载体在US6,924,123和US 7,056,699中有所描述。
复制缺陷型慢病毒载体
在复制缺陷型慢病毒载体的基因组中，gag/pol和/或env的序列可以突变和/或没有功能。
在如本文所述的典型慢病毒载体中，可以从载体中除去病毒复制所必需的蛋白质的一个或以上编码区的至少一部分。这使得病毒载体为复制缺陷型。病毒基因组的部分也可以由NOI替换，以产生包含NOI的载体，该NOI能够转导非分裂靶细胞和/或将它的基因组整合到靶细胞基因组中。
在一个实施方案中，如WO 2006/010834和WO 2007/071994中所描述的那样，慢病毒载体是非整合型载体。
在另一实施方案中，载体具有递送没有或缺少病毒RNA序列的能力。在另一实施方案中，位于待递送的RNA上的异源结合域(与gag异源)和位于Gag或GagPol上的同源结合域可以被用来确保待递送RNA的包装。这些载体在WO 2007/072056中有所描述。
NOI和多核苷酸
本发明的多核苷酸可包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。技术人员会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可以编码同一多肽。另外，应理解，技术人员可使用常规技术进行核苷酸置换，以反映在其中表达本发明多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用，该置换不会影响由本发明的多核苷酸所编码的多肽序列。
多核苷酸可通过本领域可获得的任何方法进行修饰。可进行这种修饰以提高本发明的多核苷酸的体内活性或寿命。
多核苷酸如DNA多核苷酸可用重组法产生、合成法产生或本领域技术人员可获得的任何方法产生。它们还可通过标准的技术进行克隆。
通常使用重组方法来产生较长的多核苷酸，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术。这涉及到制备一对能侧接于需要克隆的靶序列的引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与从动物细胞或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在能引起所需区域扩增的条件下进行PCR，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)和回收扩增的DNA。可将引物设计成含有适宜的限制酶识别位点，使得扩增的DNA可被克隆到适宜的载体中。
常见的逆转录病毒载体元件
启动子和增强子
可以使用控制序列控制NOI和多核苷酸的表达，所述控制序列例如为转录调节元件或翻译阻遏元件，包括启动子、增强子和其他表达调节信号(例如tet阻遏物(TetR)系统)或载体生产细胞中的转基因阻遏系统(TRIP)或本文描述的NOI的其他调节子。
可以使用原核生物启动子和在真核细胞中发挥功能的启动子。可以使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。还可使用包含来自两种或以上不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
适宜的启动序列是强启动子，包括那些源自病毒(如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒和猿猴病毒40(SV40))的基因组的启动子，或者源自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子、EF1α、CAG、TK、SV40、泛素、PGK或核糖体蛋白启动子)的启动子。可选地，可以使用以下组织特异性启动子来驱动转录，如视紫红质(Rho)、视紫红质激酶(RhoK)、含视锥-视杆同源框基因(CRX)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)、卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、Flt-1启动子、INF-β启动子、Mb启动子、SP-B启动子、SYN1启动子、WASP启动子、SV40/hAlb启动子、SV40/CD43、SV40/CD45、NSE/RU5'启动子、ICAM-2启动子、GPIIb启动子、GFAP启动子、纤连蛋白启动子、内皮糖蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、CD68启动子、CD14启动子和B29启动子。
可通过将增强子序列插入到载体中进一步提高NOI的转录。增强子相对地不依赖于取向和位置；但是，可以采用来自真核细胞病毒的增强子，如SV40增强子和CMV早期启动子增强子。增强子可在相对于启动子的5'或3'的位置处、但优选位于相对于启动子的5'位点被剪接到载体中。
启动子可另外包括用以确保或提高在适宜的靶细胞中表达的特征。例如，所述特征可以是保守区域，例如Pribnow框或TATA框。启动子可含有用以影响(如维持、提高或降低)核苷酸序列的表达水平的其他序列。适宜的其他序列包括Sh1内含子或ADH内含子。其他序列包括可诱导元件，如温度、化学、光和应激可诱导元件。还可存在用以提高转录或翻译的适宜元件。
NOI的调节子
在产生逆转录病毒包装/生产者细胞系和逆转录病毒载体生产中的复杂因素是某些逆转录病毒载体组分和NOI的组成型表达具有细胞毒性从而导致表达这些组分的细胞的死亡，因而不能生产载体。因此，必须调节这些组分(例如，gag-pol和包膜蛋白，如VSV-G)的表达。还可以调节其他非细胞毒性载体组分(例如rev)的表达以使细胞的代谢负担最小化。因此，如本文所述的模块化构建体或编码载体组分的核苷酸序列和/或细胞可以包含与至少一种调节元件结合的细胞毒性载体组分和/或非细胞毒性载体组分。如本文所用，术语“调节元件”指能够影响(增加或减少)相关基因或蛋白的表达的任何元件。调节元件包括基因开关系统、转录调节元件和翻译阻遏元件。
很多原核调节系统已被用于在哺乳动物细胞中产生基因开关。很多逆转录病毒包装和生产者细胞系已使用基因开关系统(例如，四环素和4-异丙基苯甲酸诱导型开关系统)进行控制，因此能够在载体生产时开启一种或以上逆转录病毒载体组分的表达。基因开关系统包括转录调节子(TetR)蛋白组的那些(例如，T-Rex、Tet-On和Tet-Off)、以及转录调节子的4-异丙基苯甲酸诱导型开关系统组的那些(例如，CymR蛋白)和涉及RNA结合蛋白的那些(例如，TRAP)。
一种此类四环素诱导型系统是基于T-RExTM系统的四环素阻遏物(TetR)系统。举例来说，在此类系统中，将四环素操纵子(TetO2)置于这样的位置，以使得第一个核苷酸距离人巨细胞病毒主要即时早期启动子(hCMVp)的TATATAA元件最后一个核苷酸的3'端10bp，如此TetR能够独自作为阻遏物起作用(Yao F,Svensjo T,Winkler T,Lu M,Eriksson C,Eriksson E.,1998,Hum Gene Ther；9:1939-1950)。在此类系统中，NOI的表达能够由CMV启动子控制，CMV启动子已串联插入TetO2序列的两个拷贝。在缺乏诱导剂(四环素或其类似物多西环素[dox])的情况下，TetR同型二聚体与TetO2序列结合并物理阻断来自上游CMV启动子的转录。当存在诱导剂时，诱导剂与TetR同型二聚体结合，引起变构变化，使其不再与TetO2序列结合，从而引起基因表达。TetR基因可以进行密码子优化，因为发现其可以改进翻译效率，从而可以更严格地控制TetO2控制的基因表达。
在WO 2015/092440中描述了TRIP系统，并提供了在载体生产期间阻遏NOI在生产细胞中表达的另一种方法。当需要组成型和/或强启动子(包括组织特异性启动子)驱动转基因时，且特别地当在生产细胞中表达转基因蛋白导致载体滴度降低和/或由于转基因来源蛋白的病毒载体递送在体内激发免疫应答时，TRAP结合序列(例如，TRAP-tbs)相互作用形成用于生产逆转录病毒载体的转基因蛋白阻遏系统的基础(Maunder et al,NatCommun.(2017)Mar 27；8)。
简言之，TRAP-tbs相互作用形成了翻译阻断，从而阻遏转基因蛋白的翻译(Maunder et al,Nat Commun.(2017)Mar 27；8)。翻译阻断仅在生产细胞中有效，因此不会阻碍基于DNA或RNA的载体系统。当从组成型和/或强启动子，包括来自单顺反子或多顺反子mRNA的组织特异性启动子表达转基因蛋白时，TRiP系统能够阻遏翻译。已经证明，转基因蛋白的表达不能调节会降低载体滴度并影响载体产品质量。对于瞬时和稳定的PaCL/PCL载体生产系统，在下述情况下，转基因蛋白的阻遏对于生产细胞防止载体滴度降低是有利的：当毒性或分子负荷问题可能导致细胞应激时；由于转基因来源蛋白的病毒载体递送，使转基因蛋白在体内激发免疫应答时；使用基因编辑转基因可能导致影响靶点开/关时；转基因蛋白可能会影响载体和/或包膜糖蛋白排斥时。
包膜和假型化
在一个优选的方面，如本文所述的慢病毒载体已经被假型化。在这一点上，假型化可以赋予一个或以上优点。例如，基于HIV的载体的env基因产物将限制这些载体，使其仅仅感染表达称作CD4的蛋白的细胞。但如果这些载体中的env基因被来自其他有包膜病毒的env序列置换，那么它们可能具有更宽的感染谱(Verma and Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。举例来说，工作者已经用来自VSV的糖蛋白对基于HIV的载体进行了假型化(Verma and Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。
在另一种可选的方案中，Env蛋白可以是经修饰的Env蛋白，如突变的或工程改造的Env蛋白。可以进行修饰或对修饰进行选择，以引入靶向能力或减少毒性或用于其他它目的(Valsesia-Wittman et al1996J Virol 70:2056-64；Nilson et al(1996)Gene Ther 3(4):280-286；和Fielding et al(1998)Blood 91(5):1802-1809；及其中引用的参考文献)。
可以用任何选择的分子使载体假型化。
如本文所用，“env”应指如本文所述的内源性慢病毒包膜或异源包膜。
VSV-G
水疱性口腔炎病毒(VSV，一种棒状病毒)的包膜糖蛋白(G)是已被证实能够对某些包膜病毒和病毒载体病毒颗粒进行假型化的包膜蛋白。
Emi et al.(1991)Journal of Virology 65:1202-1207首先证明了在不存在任何逆转录病毒包膜蛋白的情况下，它对基于MoMLV的逆转录病毒载体进行假型化的能力。WO1994/294440教导了逆转录病毒载体可成功地用VSV-G进行假型化。这些经假型化的VSV-G载体可用于转导广范围的哺乳动物细胞。最近，Abe et al.(1998)J Virol 72(8)6356-6361教导了可通过添加VSV-G使非感染性逆转录病毒颗粒变成感染性。
Burns et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-7成功地用VSV-G对逆转录病毒MLV进行假型化，这产生了与天然形式的MLV相比改变了宿主范围的载体。已经证实VSV-G假型化的载体不仅感染哺乳动物细胞，而且还感染源自鱼类、爬行动物和昆虫的细胞系(Burns et al.(1993)，出处同上)。还证实了它们对于多种细胞系而言比传统的兼嗜性包膜更有效(Yee et al.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9564-9568；Emi et al.(1991)Journal of Virology 65:1202-1207)。VSV-G蛋白可用于对某些逆转录病毒进行假型化，因为它的胞质尾巴能够与逆转录病毒核心发生相互作用。
提供非逆转录病毒假型化包膜(如VSV-G蛋白)可产生这样的优点，即载体颗粒能被浓缩至高滴度而不损失感染性(Akkina et al.(1996)J.Virol.70:2581-5)。逆转录病毒包膜蛋白显然不能够承受超离心过程中的剪切力，这很可能是因为它们由两个非共价连接的亚单位组成。离心可破坏亚单位之间的相互作用。相比之下，VSV糖蛋白由单一单位组成。因此，VSV-G蛋白假型化可以为有效的靶细胞感染/转导和制造过程提供潜在的优势。
WO 2000/52188描述了由具有水疱性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)作为膜结合性病毒包膜蛋白的稳定生产者细胞系产生假型化的逆转录病毒载体，并提供了VSV-G蛋白的基因序列。
罗斯河病毒
用罗斯河病毒包膜对非灵长类动物慢病毒载体(FIV)进行假型化，随后为主要转导肝的系统施用(Kang et al.,2002,J.Virol.,76:9378-9388)。据报道，效率比用VSV-G假型化载体获得的效率高20倍，并且通过测量提示肝中毒的肝酶血清水平得知，所产生的毒性更低。
杆状病毒GP64
已经证明了杆状病毒GP64蛋白是VSV-G的替代方案，其用于在临床和商业应用所需的高滴度病毒的大规模生产中使用的病毒载体(Kumar M,Bradow BP,Zimmerberg J(2003)Hum Gene Ther.14(1):67-77)。与VSV-G假型化载体相比，GP64假型化载体具有相似的广泛嗜性和相似的天然滴度。由于GP64的表达不杀死细胞，因此可以制备组成型表达GP64的基于HEK293T的细胞系。
可供选择的包膜
当用于假型化EIAV时，提供适宜的滴度的其他包膜包括莫科拉病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒和LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)。向小鼠体内静脉输注利用4070A进行假型化的慢病毒引起在肝脏内具有最大的基因表达。
包装序列
在本发明的语境中所使用的术语“包装信号”可与“包装序列”或“psi”互换使用，其用来指在病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链的衣壳化作用所需的非编码、顺式作用序列。在HIV-1中，该序列已被定位于从主要剪接供体位点(SD)上游至少延伸到gag起始密码子(可以包括部分或全部gag到核苷酸688的5'序列)的基因座。在EIAV中，包装信号包括R区域到Gag的5'编码区域。
本文所使用的术语“延伸的包装信号”或“延伸的包装序列”指在psi序列的周围使用进一步延伸到gag基因中的序列。包含这些额外的包装序列可增加载体RNA插入到病毒颗粒中的效率。
已经证明猫免疫缺陷病毒(FIV)RNA的衣壳化作用决定簇是离散的、非连续的，其包括位于基因组mRNA的5'端的一个区域(R-U5)和定位在gag的大约311nt中的另一个区域(Kaye et al.,J Virol.Oct；69(10):6588-92(1995))。
内部核糖体进入位点(IRES)
RES元件的插入允许由单一启动子启动多个编码区域的表达(Adam et al(同上)；Koo et al(1992)Virology 186:669-675；Chen et al 1993J.Virol 67:2142-2148)。IRES元件首次发现于小核糖核酸病毒的非翻译5'端，在此它们促进病毒蛋白的不依赖于帽的翻译(Jang et al(1990)Enzyme 44:292-309)。当在RNA中位于开放阅读框之间时，IRES元件通过促进在IRES元件处的核糖体进入，随后启动下游翻译，从而允许下游开放阅读框的有效翻译。
Mountford和Smith介绍了关于IRES的综述(TIG May 1995vol11,No 5:179-184)。许多不同的IRES序列是已知的，包括来自脑心肌炎病毒(EMCV)(Ghattas,I.R.,et al.,Mol.Cell.Biol.,11:5848-5859(1991))；BiP蛋白[Macejak and Sarnow,Nature 353:91(1991)]；果蝇触角足基因(外显子d和e)[Oh,et al.,Genes&Development,6:1643-1653(1992)]的那些，以及在脊髓灰质炎病毒(PV)[Pelletier and Sonenberg,Nature 334:320-325(1988)；还参见Mountford and Smith,TIG 11,179-184(1985)]中的那些序列。
来自PV、EMCV和猪水疱病病毒的IRES元件之前被用于逆转录病毒载体中(Coffin等，如上述)。
术语“IRES”包括发挥IRES功能或改进IRES功能的任何序列或序列的组合。IRES可以是病毒来源的(如EMCV IRES、PV IRES或FMDV 2A样序列)或细胞来源的(如FGF2 IRES、NRF IRES、Notch 2IRES或EIF4 IRES)。
为了使IRES能够启动每个多核苷酸的翻译，它应该位于模块化构建体中的多核苷酸之间或之前。
用于开发稳定细胞系的核苷酸序列需要添加选择性标记物，以选择发生稳定整合的细胞。这些选择性标记物可以表达为核苷酸序列中的单个转录单位，或者可能更优选的是使用IRES元件启动多顺反子信息中选择性标记物的翻译(Adam et al 1991J.Virol.65,4985)。
基因方向和绝缘子
众所周知，核酸是有方向性的，这最终会影响细胞中诸如转录和复制等的机制。因此，当作为同一核酸构建体的一部分时，基因可以相对于彼此具有相对的方向。
在本发明的某些实施方案中，存在于细胞或构建体中相同基因座上的至少两个核酸序列可以处于反向和/或交互方向。换言之，在本发明的某些实施方案中，在这个特定基因座上，连续基因对将不具有相同方向。当该区域在宿主细胞的同一物理位置内表达时，这可以帮助防止转录和翻译通读。
当载体生产所需的核酸是基于细胞内相同的遗传基因座时，交互方向有利于逆转录病毒载体的生产。这转而也能够改进所得构建体的安全性，以防止产生具有复制能力的逆转录病毒载体。
当核酸序列处于相反和/或交互方向时，使用绝缘子能够防止NOI在其遗传环境中表达不当或沉默。
术语“绝缘子”是指当与绝缘子结合蛋白结合时具有保护基因免受周围调节子信号影响能力的一类DNA序列元件。有两种类型的绝缘子：增强子阻断功能和染色质屏障功能。当绝缘子位于启动子和增强子之间时，绝缘子的增强子阻断功能使启动子免受增强子的加强转录的影响(Geyer和Corces 1992；Kellum和Schedl 1992)。染色质屏障绝缘子通过阻止附近浓缩染色质的前进而起作用，其会引起转录活性染色质区域变成转录无效染色质区域并导致基因表达沉默。抑制异染色质扩散从而抑制基因沉默的绝缘子会募集参与组蛋白修饰的酶，以阻止这一过程(Yang J,Corces VG.2011；110:43-76；Huang,Li etal.2007；Dhillon,Raab et al.2009)。绝缘子可以具有这两种功能中的一种或两种，并且鸡β-珠蛋白绝缘子(cHS4)就是一个这样的实例。这种绝缘子是研究最广泛的脊椎动物绝缘子，富含G+C，并且具有增强子阻断和异染色质屏障功能(Chung J H,Whitely M,Felsenfeld G.Cell.1993；74:505–514)。具有增强子阻断功能的其他此类绝缘子不限于但包括下述：人β-珠蛋白绝缘子5(HS5)、人β-珠蛋白绝缘子1(HS1)和鸡β-珠蛋白绝缘子(cHS3)(Farrell CM1,West AG,Felsenfeld G.,Mol Cell Biol.2002Jun；22(11):3820-31；J Ellis et al.EMBO J.1996Feb 1；15(3):562–568)。除了减少不需要的远端相互作用以外，绝缘子还有助于防止临近逆转录病毒核酸序列之间的启动子干扰(即，来自一个转录单位的启动子损害相邻转录单位的表达)。如果在每个逆转录病毒载体核酸序列之间使用绝缘子，则直接通读的减少将有助于防止具有复制能力的逆转录病毒载体颗粒的形成。
绝缘子可以存在于每个逆转录病毒核酸序列之间。在一个实施方案中，使用绝缘子可以防止来自一个NOI表达盒的启动子-增强子相互作用与编码载体组分的核苷酸序列中的另一个NOI表达盒发生相互作用。
载体基因组和gag-pol序列之间可以存在绝缘子。因此，这限制了产生具有复制能力的逆转录病毒载体和类似“野生型”DNA转录物的可能性，从而改进了构建体的安全性性质。Moriarity et al,Nucleic Acids Res.2013Apr；41(8):e92中引用了使用绝缘子元件改进稳定整合的多基因载体表达的方法。
载体滴度
技术人员将理解的是，存在很多不同的确定病毒载体滴度的方法。通常将滴度描述为转导单位/mL(TU/mL)。可以通过增加载体颗粒的数量和通过增加载体制备物的比活性来增加滴度。
治疗用途
如本文所述的慢病毒载体或用如本文所述的慢病毒载体转导的细胞或组织可用于医药。
此外，本文所述的慢病毒载体、本发明的生产细胞或用本文所述的慢病毒载体转导的细胞或组织可用于制备药物，以将目的核苷酸递送至有此需要的靶位点。如前所述，本发明的慢病毒载体或转导细胞的此类用途可用于治疗或诊断目的。
因此，提供了由如本文所述的慢病毒载体转导的细胞。
“由病毒载体颗粒转导的细胞”应理解为是一种已经转入了由病毒载体颗粒携带的核酸的细胞，特别是靶细胞。
在优选的实施方案中，目的核苷酸产生治疗效果。
“靶细胞”应理解为是这样的细胞，期望的是其能表达NOI。利用本发明的病毒载体将NOI引入到靶细胞中。递送至靶细胞可以在体内、离体(ex vivo)或体外进行。
NOI可具有治疗或诊断应用。适宜的NOI包括但不限于编码以下物质的序列：酶、辅因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、嵌合抗原受体、靶蛋白的跨结构域负突变体、毒素、条件性毒素、抗原、转录因子、结构蛋白、报告蛋白、亚细胞定位信号、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、受体、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶，以及它们的衍生物(如带有相关报告基团的衍生物)。NOI还可以编码微RNA。不愿受到理论的束缚，认为微RNA的加工受到TRAP的抑制。
在一个实施方案中，NOI可用于治疗神经退行性疾病。
在另一个实施方案中，NOI用于治疗帕金森病。
在另一个实施方案中，NOI可以编码一种或多种参与多巴胺合成的酶。例如，该酶可以是以下之一者或多者：酪氨酸羟化酶、GTP环式水解酶I和/或芳族氨基酸多巴脱羧酶。所有这三个基因的序列是可得的(
Figure BDA0003484958400000791
登录号分别是X05290、U19523和M76180)。
在另一个实施方案中，NOI可以编码囊泡单胺转运子2(VMAT2)。在一个可选的实施方案中，病毒基因组可以包含编码芳族氨基酸多巴脱羧酶的NOI和编码VMAT2的NOI。这种基因组可用于治疗帕金森病，特别是联合外周施用L-DOPA。
在另一个实施方案中，NOI可以编码治疗性蛋白或治疗性蛋白的组合。
在另一个实施方案中，NOI可以编码选自由以下组成的组中的一种或多种蛋白：神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经营养因子-3(NT-3)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、胰岛素生长因子-2、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C/VEGF-2、VEGF-D、VEGF-E、PDGF-A、PDGF-B、PDFG-A和PDFG-B的异源二聚体和同源二聚体。
在另一个实施方案中，NOI可以编码选自由以下组成的组中的一种或多种抗血管生成蛋白：血管生成抑制素、内皮抑素、血小板因子4、色素上皮衍生因子(PEDF)、胎盘生长因子、列斯蛋白(restin)、干扰素-α、干扰素诱导蛋白、gro-β和tubedown-1、白细胞介素-1(IL-1)、IL-12、视黄酸、抗VEGF抗体或其片段/变体、例如阿柏西普、血小板反应蛋白、VEGF受体蛋白(如US 5,952,199和US 6,100,071中描述的那些)和抗VEGF受体抗体。
在另一个实施方案中，NOI可以编码选自由以下组成的组中的抗炎蛋白、抗体或蛋白质或抗体的片段/变体：NF-kB抑制剂、IL1β抑制剂、TGFβ抑制剂、IL-6抑制剂、IL-23抑制剂、IL-18抑制剂、肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β、淋巴毒素α和淋巴毒素β、LIGHT抑制剂、α突触核蛋白抑制剂、Tau抑制剂，β淀粉样蛋白抑制剂、IL-17抑制剂。
在另一个实施方案中，NOI可以编码囊性纤维化跨膜传导调节子(CFTR)。
在另一个实施方案中，NOI可以编码通常在视觉细胞中表达的蛋白。
在另一个实施方案中，NOI可以编码通常在光感受器细胞和/或视网膜色素上皮细胞中表达的蛋白。
在另一个实施方案中，NOI可以编码选自包含以下物质的组中的蛋白质：RPE65、芳基烃相互作用受体蛋白样1(AIPL1)、CRB1、卵磷脂视网膜乙酰转移酶(LRAT)、光受体特异性同源盒(CRX)、视网膜鸟苷酸环化酶(GUCY2D)、RPGR相互作用蛋白1(RPGRIP1)、LCA2、LCA3、LCA5、抗肌萎缩蛋白、PRPH2、CNTF、ABCR/ABCA4、EMP1、TIMP3、MERTK、ELOVL4、MYO7A、USH2A、VMD2、RLBP1、COX-2、FPR、harmonin、Rab护卫蛋白1、CNGB2、CNGA3、CEP 290、RPGR、RS1、RP1、PRELP、谷胱甘肽途径酶和opticin。
在其他实施方案中，NOI可以编码人凝血因子VIII或因子IX。
在其他实施方案中，NOI可以编码一种或多种参与代谢的蛋白质，选自包括以下物质的组：苯丙氨酸羟化酶(PAH)、甲基丙二酰辅酶A变位酶、丙酰辅酶A羧化酶、异戊酰辅酶A脱氢酶、支链酮酸脱氢酶复合物、戊二酰辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、丙酰辅酶A羧化酶、3甲基巴豆酰辅酶A羧化酶、丙酮酸羧化酶、氨甲酰磷酸合成酶氨、鸟氨酸转氨甲酰酶、葡糖神经酰胺酶β、α半乳糖苷酶A、葡糖神经酰胺酶β、胱氨酸、葡萄糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶、N-磺基氨基葡萄糖磺基水解酶、半乳糖胺-6硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶A、细胞色素B-245β、ABCD1、鸟氨酸氨基甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶1、丙氨酸乙醇酸氨基转移酶(alanine glycoxhylate aminotransferase)、ATP结合盒和亚族B成员。
在其他实施方案中，NOI可以编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一个实施方案中，CAR是抗5T4 CAR。在其他实施方案中，NOI可以编码B细胞成熟抗原(BCMA)、CD19、CD22、CD20、CD47、CD138、CD30、CD33、CD123、CD70、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、LewisY抗原(LeY)、酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)、粘蛋白1、细胞表面相关蛋白(Muc1)、上皮细胞贴壁分子(EpCAM)、内皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素、蛋白酪氨酸磷酸酶、非受体型22、白细胞介素2受体α、解旋酶C结构域1诱导的干扰素、人表皮生长因子受体(HER2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、二唾液酸神经节苷脂(GD2)、间皮素(mesiothelin)、囊泡内皮生长因子受体2(VEGFR2)。
在一个实施方案中，NOI编码BCMA。
在一个实施方案中，NOI编码CD19。
在一个实施方案中，NOI编码CD22。
在一个实施方案中，NOI编码CD20。
在一个实施方案中，NOI编码CD47。
在一个实施方案中，NOI编码CD138。
在一个实施方案中，NOI编码CD30。
在一个实施方案中，NOI编码CD33。
在一个实施方案中，NOI编码CD123。
在一个实施方案中，NOI编码CD70。
在一个实施方案中，NOI编码PSMA。
在一个实施方案中，NOI编码LeY。
在一个实施方案中，NOI编码ROR1。
在一个实施方案中，NOI编码粘蛋白1。
在一个实施方案中，NOI编码Muc1。
在一个实施方案中，NOI编码EpCAM。
在一个实施方案中，NOI编码EGFR。
在一个实施方案中，NOI编码胰岛素。
在一个实施方案中，NOI编码蛋白酪氨酸磷酸酶。
在一个实施方案中，NOI编码非受体型22。
在一个实施方案中，NOI编码白细胞介素2受体α。
在一个实施方案中，NOI编码解旋酶C结构域1诱导的干扰素。
在一个实施方案中，NOI编码HER2。
在一个实施方案中，NOI编码GPC3。
在一个实施方案中，NOI编码GD2。
在一个实施方案中，NOI编码间皮素。
在一个实施方案中，NOI编码VEGFR2。
在其他实施方案中，NOI可以编码针对NKG2D配体的嵌合抗原受体(CAR)，NKG2D配体选自由ULBP1、ULBP2、ULBP3、H60、Rae-1a、Rae-1b、Rae-1g、Rae-1d、MICA、MICB组成的组。
在另一实施方案中，NOI可以编码SGSH、SUMF1、GAA、常见的γ链(CD132)、腺苷脱氨酶、WAS蛋白、球蛋白、α半乳糖苷酶A，δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)、羟甲基胆色烷(HMB)合酶、尿卟啉原(URO)合酶、尿卟啉原(URO)脱羧酶、粪卟啉原(COPRO)氧化酶、原卟啉原(PROTO)氧化酶、亚铁螯合酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素磺酰胺酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、3N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰基半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶和透明质酸酶。
除了NOI以外，载体还可包含或编码siRNA、shRNA或者经调节的shRNA(Dickins etal.(2005)Nature Genetics 37:1289-1295；Silva et al.(2005)Nature Genetics 37:1281-1288)。
适应症
根据本发明的载体(包括逆转录病毒和AAV载体)可用于递送一种或以上可用于治疗WO 1998/05635、WO 1998/07859、WO 1998/09985中列举的疾病的NOI。目的核苷酸可以是DNA或RNA。这类疾病的例子给出如下：
能对以下作出响应的疾病：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如，用于治疗包括感染人免疫缺陷病毒之类的免疫缺陷；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫疾病，和预防移植排斥或诱导肿瘤免疫性)；造血作用的调节(例如骨髓或淋巴疾病的治疗)；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长(例如用于愈合伤口，治疗烧伤、溃疡和牙周疾病，以及神经退化)；卵泡刺激激素的抑制或激活(生育力的调节)；趋化性/化学促进活性(例如用于将特定细胞类型调动到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如脓毒性休克或克罗恩病)；巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性、以及由此而来的抗炎活性；抗免疫活性(即，对细胞和/或体液免疫应答、包括与炎症不相关的应答的抑制作用)；抑制巨噬细胞和T细胞贴壁于胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及T细胞中的上调的fas受体表达。
恶性疾病，包括癌症；白血病；良性和恶性肿瘤生长、侵入和扩散、血管生成、转移；腹水和恶性胸腔积液。
自身免疫性疾病，包括关节炎(包括类风湿性关节炎)、过敏症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其他疾病。
血管疾病，包括动脉硬化症、动脉硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征、心血管效应、外周血管病、偏头痛和阿斯匹林依赖性抗血栓形成症、中风、大脑局部缺血、缺血性心脏病或其他疾病。
胃肠道的疾病，包括消化性溃疡、溃疡性结肠炎、克罗恩病和其他疾病。
肝病，包括肝纤维化、肝硬化。
遗传性代谢障碍，包括苯丙酮尿症PKU、威尔逊病、有机酸血症、尿素循环障碍、胆汁淤积和其他疾病。
肾病和泌尿疾病，包括甲状腺炎或其他腺体疾病、血管球性肾炎或其他疾病。
耳、鼻和喉疾病，包括耳炎或其他耳鼻喉疾病、皮炎或其他皮肤疾病。
牙齿和口腔疾病，包括牙周病、牙周炎、齿龈炎或其他牙齿/口腔疾病。
睾丸疾病，包括睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其他睾丸疾病。
妇科疾病，包括胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、子痫前期、子宫内膜异位和其他妇科疾病。
眼科疾病，例如包括LCA10等的莱伯先天性黑蒙(LCA)；后葡萄膜炎；中间葡萄膜炎；前葡萄膜炎；结膜炎；脉络视网膜炎；葡萄膜视网膜炎；视神经炎；青光眼，包括开角型青光眼和青少年先天性青光眼；眼内炎症，例如视网膜炎或囊样黄斑水肿；交感性眼炎；巩膜炎；色素性视网膜炎；黄斑变性，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)和青少年黄斑变性，包括贝斯特病、贝斯特卵黄样黄斑变性、斯特格氏病；尤塞氏综合征；多恩氏蜂窝状视网膜营养失调；Sorby黄斑营养失调；青年性视网膜劈裂症；视锥-视杆营养失调；角膜营养失调；Fuch营养失调；莱伯氏先天性黑内障；莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)；艾迪综合征；小口氏病；退行性眼底病；视觉损伤；由感染引起的眼睛炎症；增殖性玻璃体-视网膜病变；急性局部缺血性视神经病变；过度疤痕，例如在青光眼滤过手术后，对眼睛植入物的反应、角膜移植物移植排斥；和其他眼科疾病，例如糖尿病黄斑性水肿、视网膜静脉阻塞、RLBP1相关的视网膜营养失调、无脉络膜和色盲。
神经疾病和神经退行性疾病，包括帕金森病、治疗帕金森病引起的并发症和/或副作用、AIDS相关痴呆综合症、HIV相关脑病、德维克病、西德纳姆舞蹈病、阿尔兹海默病和其他退行性疾病、CNS的病症或失调、中风、脊髓灰质炎后综合征、精神疾病、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、法布里病、戈谢病、胱氨酸病、庞贝氏病、异染性脑白质营养不良、Wiscott Aldrich综合征、肾上腺脑白质营养不良、β-地中海贫血、镰状细胞贫血病、格林-巴利综合征、西德纳姆舞蹈病、重症肌无力、大脑假性肿瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病、CNS压缩或CNS创伤或CNS的感染、肌肉萎缩和营养失调、中枢神经系统和外周神经系统的疾病、病症或失调、运动神经元疾病，包括肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、脊髓和撕裂损伤。
其他的疾病和病症，例如囊性纤维化；粘多糖贮积症，包括Sanfilipo综合征A、Sanfilipo综合征B、Sanfilipo综合征C、Sanfilipo综合征D、亨特综合征、Hurler-Scheie综合征、莫尔丘综合征；ADA-SCID；X相关的SCID；X相关的慢性肉芽肿病；卟啉症；血友病A；血友病B；外伤后炎症、出血、血凝固和急性期应答；恶病质；厌食症；急性感染；脓毒性休克；传染性疾病；糖尿病；手术的并发症或副作用；骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用；基因治疗的并发症和副作用，例如由于感染病毒载体、或者AIDS，以压制或抑制体液和/或细胞免疫应答，从而在天然或人工细胞、组织和器官如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织的移植的情况中用于预防和/或治疗移植排斥。
siRNA、微RNA和shRNA
在某些其他的实施方案中，NOI包含微RNA。微RNA是生物体中天然产生的非常大的一组小RNA，其中至少一些能调节靶基因的表达。微RNA家族的基础成员是let-7和lin-4。let-7基因编码小的、高度保守的RNA种类，该RNA种类在蠕虫发育过程中调节内源蛋白编码基因的表达。该活性RNA种类最初被转录为约70nt的前体，该前体在转录后被加工为成熟的约21nt的形式。let-7和lin-4两者都被转录成发夹RNA前体，所述前体由Dicer酶加工成它们的成熟形式。
除了NOI之外，所述载体还可包含或编码siRNA、shRNA或者经调节的shRNA(Dickins et al.(2005)Nature Genetics 37:1289-1295；Silva et al.(2005)NatureGenetics 37:1281-1288)。
由双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默(PTGS)是控制外来基因表达的保守的细胞防御机制。据认为，元件(例如转座子)或病毒的随机整合会引起dsRNA的表达，该dsRNA能激活同源单链mRNA或病毒基因组RNA的序列特异性降解。这种沉默作用称为RNA干扰(RNAi)(Ralph et al.(2005)Nature Medicine 11:429-433)。RNAi的机制涉及将长的dsRNA加工成大约21至25个核苷酸(nt)的RNA的双链体。这些产物称为小干扰RNA或沉默RNA(siRNA)，它们是mRNA降解的序列特异性媒介物。在分化的哺乳动物细胞中，已发现＞30bp的dsRNA能激活干扰素应答，从而导致蛋白质合成的停止和非特异性的mRNA降解(Stark etal.,Annu Rev Biochem67:227-64(1998))。但是，可用21nt siRNA双链体来绕过该应答(Elbashir et al.,EMBO J.Dec 3；20(23):6877-88(2001)；Hutvagner et al.,Science.Aug 3,293(5531):834-8.Eupub Jul 12(2001))，使得可以在培养的哺乳动物细胞中分析基因功能。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物，其包括本文所述的慢病毒载体或者用本文所述的病毒载体转导的细胞或组织，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开提供了用于通过基因疗法治疗个体的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的慢病毒载体。该药物组合物可用于人或动物用途。
所述组合物可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预定的给药途径和标准的药物实践来进行。所述药物组合物可以包含、或除了载体、赋形剂或稀释剂之外还包含：任何适宜的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和可以辅助或增加载体进入靶位点的其他载体试剂(诸如脂质递送系统)。
在适宜的情况下，所述组合物可以通过以下任何一种或以上方式施用：吸入；栓剂或阴道栓剂形式；以洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒布粉剂(dusting powder)形式局部施用；通过使用皮肤贴剂；口服，为含赋形剂(诸如淀粉或乳糖)的片剂形式、或单独的或与赋形剂混合的胶囊剂或胚珠剂(ovule)形式、或含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或悬浮剂形式；或它们可以胃肠外注射，例如经阴茎海绵体内、静脉内、肌内、颅内、眼内、腹腔内或皮下注射。对于胃肠外施用，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，所述无菌水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或单糖，从而使得溶液与血液等渗。对于口腔或舌下给药，所述组合物可以用常规方法配制的片剂或锭剂形式施用。
本文所述的慢病毒载体可用于离体转导靶细胞或靶组织，然后将所述靶细胞或靶组织转移到需要治疗的患者体内。这种细胞的实例可以为自体T细胞，并且这种组织的实例可以是供体角膜。
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖使用它们的变体、衍生物、类似物、同源物和片段。
在本发明的情况中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列以这样的方式进行了修饰：所涉及的多肽或多核苷酸保持了其内源功能中的至少一种。可通过对天然蛋白质中存在的至少一个残基进行添加、缺失、置换、修饰、替换和/或改变，来获得变体序列。
与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用的术语“衍生物”包括对序列的一个(或以上)氨基酸残基进行的任何置换、改变、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所产生的蛋白质或多肽能保持其内源功能中的至少一种即可。
与多肽或多核苷酸相关的本文所用的术语“类似物”包括任何模仿物，即这样的化合物，它具有其所模仿的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种。
通常，可进行(例如)1、2或3至10或20个置换以进行氨基酸置换，只要被修饰的序列能保持所需的活性或能力即可。氨基酸置换可包括非天然类似物的使用。
用于本发明的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或置换，即缺失、插入或置换能产生沉默的变化并产生功能上等同的蛋白质。还可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的性质相似性的基础上做出谨慎的氨基酸置换，只要内源性功能得以保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的含有无电荷极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
例如可按照下表做出保守置换。第二列同一格中的氨基酸、优选第三列同一行中的氨基酸可互相置换：
Figure BDA0003484958400000881
术语“同源物”意指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有特定同源性的实体。术语“同源性”可以与“同一性”等同。
在本文中，同源序列包括可与题述序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的氨基酸序列，优选与题述序列具有至少95％、97％或99％的同一性。通常，同源性包括与题述氨基酸序列相同的活性位点等。虽然还可根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本发明的情况中，优选根据序列同一性来表示同源性。
在本发明的情况中，同源序列包括可与题述序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选与题述序列具有至少95％、97％、98％或99％的同一性。虽然还可根据相似性来考虑同源性，但在本文中，优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可以借助眼睛来进行，或更通常借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售可得的计算机程序可以计算出两个或以上序列之间的同源性或同一性百分率。
同源性百分率可以对连续的序列进行计算，即将一个序列与另一序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“没有空位的(ungapped)”比对。通常，这种没有空位的比对仅对相对短数目的残基进行。
虽然这是一种非常简单而相容的方法，但它没有考虑到例如在其他方面相同的一对序列中，核苷酸序列中的一个插入或缺失将引起随后的密码子不能对齐，从而当进行全序列比对时，潜在地导致同源性百分率大大降低。因此，大多数的序列比较方法被设计为产生最佳比对，最佳比对考虑到可能的插入和缺失，而不会过多地扣除整体同源性分值。通过在序列比对中插入“空位”以尝试使局部同源性最大化，来实现这一点。
然而，这些更为复杂的方法为在比对中发生的每个空位指定“空位处罚”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位并反映出两个比较序列之间较高相关性的序列比对将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。“Affine空位罚分”通常用来对存在空位处以相对高的罚分，而对该空位中的每种后来残基的处罚较低。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位处罚会产生具有较少空位的最佳比对。大多数的比对程序允许对空位处罚进行修改。然而，当使用这类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位处罚为：一个空位为-12，每个延长为-4。
因此，最大同源性百分率的计算首先需要考虑空位处罚，产生最佳比对。用于进行这种比对的适宜计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University ofWisconsin,U.S.A.；Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Research 12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel et al.(1999)出处同上–Ch.18)、FASTA(Atschul et al.(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具程序组。BLAST和FASTA都可用于线下和在线搜索(参见Ausubel et al.(1999)，出处同上，第7-58页至第7-60页)。然而，对于一些应用而言，优选使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST 2序列的工具也可用来比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett(1999)174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett(1999)177(1):187-8)。
虽然可以根据同一性测量最终的同源性百分率，但比对过程本身通常不基于全或无的成对比较。而是，通常用绘制的相似性分值矩阵，该分值矩阵根据化学相似性或进化距离，为每个成对比较指定分值。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般或者使用公共默认值，或者使用用户符号比较表(如果提供的话)(有关进一步的细节，参见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或在其他软件的情况中，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，则可以计算出同源性百分率，优选序列同一性百分率。软件通常将此作为序列比较的一部分来进行，并且产生数值结果。
“片段”也是变体，并且这个术语通常指在功能上或者在(例如)试验中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此“片段”指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
这类变体可用标准的重组DNA技术如定点诱变来制备。在要进行插入的情况中，可以制备合成DNA，其编码该插入以及对应于该插入位点任一侧的天然序列的5'和3'侧翼区域。所述侧翼区域含有对应于天然序列中的位点的便利的限制位点，使得该序列可用适宜的酶进行切割，并且所述合成DNA可连接到该切口中。然后按照本发明表达DNA以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是举例说明许多本领域已知的用于操作DNA序列的标准技术，其他已知的技术也可使用。
适合用于本发明的细胞和/或模块化构建体的调节蛋白的所有变体、片段或同源物将保留结合NOI的同源结合位点的能力，从而在病毒载体生产细胞中阻遏或阻止NOI的翻译。
结合位点的全部变体、片段或同源物将保留结合同源RNA结合蛋白的能力，从而在病毒载体生产细胞中阻遏或阻止NOI的翻译。
密码子优化
本发明中所用的多核苷酸(包括NOI和/或载体生产系统的组分)可经过密码子优化。之前，密码子优化在WO 1999/41397和WO2001/79518中已有描述。不同的细胞在它们对具体密码子的使用上存在差异。这种密码子偏好对应于特定tRNA在该细胞类型中的相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，将它们定制成匹配相应的tRNA的相对丰度，可以增加表达。同样地，通过有意选择相应的tRNA已知在特定细胞类型中稀有的密码子，可以减少表达。因此，可以更大程度地进行翻译控制。
许多病毒(包括逆转录病毒)使用大量的稀有密码子，并且通过改变这些密码子以对应于常用的哺乳动物密码子，可实现目的基因(例如NOI或包装组分)在哺乳动物生产细胞中的表达增加。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子用法表。
病毒载体组分的密码子优化具有许多其他优点。对于编码在生产者细胞/包装细胞中病毒颗粒的装配所必需的病毒颗粒包装组分的核苷酸序列，由于它们的序列的改变，可使RNA不稳定性序列(INS)从中去除。同时，保留了包装组分的氨基酸序列编码序列，从而使得由所述序列编码的病毒组分保持相同或至少充分相似，从而使包装组分的功能不受损害。在慢病毒载体中，密码子优化还能克服输出对Rev/RRE的需要，从而使得经优化的序列不依赖于Rev。密码子优化还能减少载体系统中的不同构建体之间(例如gag-pol开放阅读框和env开放阅读框的重叠区域之间)的同源重组。因此，密码子优化的总体效果是病毒滴度明显增加和安全性改进。
在一个实施方案中，仅对与INS相关的密码子进行密码子优化。但是，在更为优选和实用的实施方案中，对序列全部都进行密码子优化，但有一些例外，例如包含gag-pol的移码位点的序列(参见下文)。
慢病毒载体的gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达都依赖于翻译过程中的移码。该移码是因为核糖体在翻译过程中“滑动”而产生的。这个滑动据认为至少部分地由核糖体停靠(ribosome-stalling)RNA二级结构造成。这种二级结构存在于gag-pol基因中的移码位点的下游。对于HIV，重叠区域从gag起始端下游的核苷酸1222(其中核苷酸1为gag ATG的A)延伸至gag的末端(nt 1503)。因此，横跨两个阅读框的移码位点和重叠区域的281bp片段优选不进行密码子优化。保留此片段将使得能够更有效地表达Gag-Pol蛋白。对于EIAV，据认为重叠的起始端是nt 1262(其中核苷酸1为gag ATG的A)，并且重叠的末端是nt 1461。为了确保保留移码位点和gag-pol重叠，已保留了野生型序列的nt1156至1465。
可作出与最佳密码子用法的偏差以(例如)适应便利的限制位点，并且可将保守氨基酸变化引入到Gag-Pol蛋白中。
在一个实施方案中，密码子优化基于轻表达的(lightly expressed)哺乳动物基因。可改变第三个碱基，有时可改变第二和第三个碱基。
由于遗传密码的简并性，应理解，技术人员可获得许多种gag-pol序列。另外，有许多所描述的逆转录病毒变体可用作用于产生经密码子优化的gag-pol序列的起始点。慢病毒基因组可以是十分可变的。例如，存在着许多仍能发挥功能的HIV-1类似物质。对于EIAV情况也是一样。这些变体可用于增强转导过程的特定部分。HIV-1变体的例子可在LosAlamos National Security公司运营的HIV数据库(http://hiv-web.lanl.gov)中找到。有关EIAV克隆的细节可在地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov的美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中找到。
用于经密码子优化的gag-pol序列的策略可针对任意逆转录病毒使用。这将适用于所有的慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1和HIV-2。另外，这个方法可用于增加来自HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV和人内源逆转录病毒(HERV)、MLV及其他逆转录病毒的基因的表达。
密码子优化可使gag-pol表达不依赖于Rev。但是，为了使得能够在慢病毒载体中使用抗rev或RRE因子，有必要使病毒载体生产系统完全不依赖于Rev/RRE。因此，基因组还需要加以修饰。这通过优化载体基因组组分来实现。有利地，这些修饰还导致在生产者细胞和被转导的细胞中产生了不存在所有额外蛋白的更安全的系统。
在本发明的实施例中证明，如本文所述的本发明的经修饰的U1和相关方法和用途可以有利地产生可接受的或有利的安全性特征。
提供本文讨论的出版物仅为它们在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容均不应被解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
一般分子/细胞生物学技术和试验
经修饰的U1 snRNA表达构建体
用于经修饰的U1 snRNA的基于DNA的表达构建体包含驱动RNA转录和终止的内源性U1 snRNA基因中的保守序列，在以下256U1(也称为U1_256)snRNA的非限制性实例中突出显示：
Figure BDA0003484958400000931
Figure BDA0003484958400000941
图例：仅大写＝U1 PolII启动子(nt1-392)；小写＝重新定向区域(nt393-409)；小写粗体＝重新定向序列[在本例中针对野生型HIV-1包装信号的nt256-270](nt395-409)；大写斜体＝主要U1 snRNA序列[三叶草叶](nt410-562)；大写下划线＝转录终止区域(nt563-652)
下表列出了研究中使用的初始经修饰的U1 snRNA和对照的小结，指出了新的退火序列和靶位点序列(序列以5'到3'方向表示)。
表I.描述测试用经修饰的U1 snRNA和对照U1 snRNA中的靶退火序列(与靶序列互补的异源序列)，以及在初始研究中使用的它们的靶序列的序列列表。核苷酸以DNA形式呈现，因为它们将在“重新定向区域”的各自表达盒中进行编码。(AT)基序存在于所有初始构建体中，在每种情况下形成U1 snRNA分子的前两个核苷酸。靶序列号指的是HIV-1的NL4-3(GenBank：M19921.2)或HXB2(GenBank：K03455.1)菌株中指出的靶，因为本研究中的慢病毒载体基因组包含由这两个高度保守的菌株组成的混合包装信号(本研究中使用的包装序列与GenBank：MH782475.1中的载体序列最相似)。
Figure BDA0003484958400000942
Figure BDA0003484958400000951
*相对于载体基因组RNA序列编号
**小写靶序列用于(HXB2)，下划线靶序列是gag ORF(U1 376)中的AA>CGCG移码。
贴壁细胞培养、转染和慢病毒载体生产
使HEK293T细胞保持在37℃、5％CO2条件下的完全培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Sigma)中，该培养基补充有10％热灭活(FBS)(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)和1％非必需氨基酸(NEAA)(Sigma))。
在以下条件下在10cm培养皿中进行贴壁模式的HIV-1载体的标准规模生产(在以其他规格进行时，所有条件均按面积缩放)：HEK293T细胞以3.5×105细胞/mL接种在10mL完全培养基中，并且约24小时后，使用以下质粒/10cm板的质量比转染细胞：4.5μg基因组、1.4μg Gag-Pol、1.1μg Rev、0.7μg VSV-G以及0.01μg和2μg之间的经修饰的snRNA质粒。
根据制造商的方案(Life Technologies)，通过在Opti-MEM中将DNA与Lipofectamine 2000CD混合来介导转染。约18小时后，添加丁酸钠(Sigma)至终浓度为10mM，保持5至6小时，然后使用10ml新鲜无血清培养基替换转染培养基。通常，20至24小时后收获载体上清液，然后过滤(0.22μm)并在-20/-80℃冷冻。作为核酸酶处理的阳性对照，通常在过滤前1小时将
Figure BDA0003484958400000961
以5U/mL添加到收获物中。
悬浮细胞培养、转染和慢病毒载体生产
使HEK293T.1-65s悬浮细胞在37℃、5％CO2条件下于Freestyle+0.1％CLC(Gibco)中在振荡培养箱(25mm轨道设置为190RPM)中生长。所有使用悬浮液的载体生产均在24孔板(1mL体积，在振动平台上)、25mL摇瓶或生物反应器(≤5L)中进行。HEK293Ts细胞以8×105个细胞/ml接种在无血清培养基中，并在整个载体生产过程中在37℃、5％CO2中振荡培养。接种后约24小时，使用以下质粒质量/转染时有效最终培养体积之比来转染细胞：0.95μg/mL基因组、0.1μg/mL Gag-Pol、0.6μg/mL Rev、0.7μg/mL VSV-G，以及0.01μg/mL至0.2μg/mL之间的经修饰的U1 snRNA质粒。
根据制造商的方案(Life Technologies)，通过在Opti-MEM中将DNA与Lipofectamine 2000CD混合来介导转染。约18小时后，添加丁酸钠(Sigma)至终浓度为10mM。通常，20至24小时后收获载体上清液，然后过滤(0.22μm)并在-20/-80℃冷冻。作为核酸酶处理的阳性对照，通常在过滤前1小时将
Figure BDA0003484958400000971
以5U/mL添加到收获物中。
慢病毒载体滴定试验
对于通过含有GFP标记的盒进行慢病毒载体滴定，HEK293T细胞以1.2×104个细胞/孔接种在96孔板中。使用编码GFP的病毒载体在含有8mg/ml聚凝胺和1x青霉素链霉素的完全培养基中转导细胞约5至6小时，然后添加新鲜培养基。将转导的细胞在37℃、5％CO2中培养2天。然后使用Attune-NxT(Thermofisher)为流式细胞术准备培养物。测定GFP表达百分率，并使用转导时2×104个细胞的预测细胞计数(基于典型的生长速率)、载体样品的稀释倍数、阳性GFP群体百分率和转导时的总体积计算载体滴度。
通过整合试验(integration-assay)进行慢病毒载体滴定
对于通过整合试验进行慢病毒载体滴定，在8μg/mL聚凝胺存在下，使用0.5mL体积的纯载体上清液至1:5稀释的载体上清液以12孔规模转导1×105HEK293T细胞。在从1×106细胞团中提取宿主DNA之前，将培养物传代10天(每2至3天1:5分裂)。使用设置为HIV包装信号(ψ)和RRP1的FAM引物/探针进行双重定量PCR，并使用以下因素计算载体滴度(TU/mL)：转导体积、载体稀释度、每个反应检测到的RRP1标准化的HIV-1ψ拷贝。
SDS-PAGE和免疫印迹
主要在载体收获后的载体完成(End-of-vector)生产细胞上进行标准SDS-PAGE和免疫印迹实验方案。对于载体颗粒的免疫印迹分析，将约2mL的经过滤的载体上清液在微量离心机中以21,000rpm在4℃离心1至2小时，然后将“细胞团”重新悬浮在20μL至30μLPBS中。通过PERT试验(如下)和载体上样到每孔SDS-PAGE凝胶的7×104PERT预测的TU对这些浓缩的载体制备物进行量化。在200μL分级缓冲液中裂解约1×106载体完成生产细胞，并通过离心去除细胞核。通过BioRad试验对蛋白质样品进行定性，并且通常将5μg蛋白上样到预成型的12至15孔4％至20％丙烯酰胺凝胶。在冰上以45V电压转移蛋白3小时。印迹在5％牛奶PBS/吐温-20中在4℃封闭过夜。用通常在封闭缓冲液中以1:100稀释的一抗和HRP-二抗对印迹进行探针标记。通过ECL检测和随后的X射线胶片曝光分析免疫印迹。
RNA提取和RT-qPCR试验
使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN)从细胞或LV样品中提取并纯化总RNA。将1微克的RNA在灭活前用DNAse I(Ambion)处理1小时。使用QuantStudioTM6(Life Technologies)在标准化学RT-PCR循环条件下，将50ng的经DNAase I处理的RNA用于qRT-PCR反应，该反应包含
Figure BDA0003484958400000981
一步式RT-PCR master mix(Life Technologies)。采用靶特异性引物/探针组。阴性对照反应不含RT以对照DNA污染。
通过质谱法分析蛋白质
样品制备
通过溶液中胰蛋白酶消化然后进行肽净化制备用于MS分析的样品。简言之，在分别添加作为还原剂的二硫苏糖醇(DTT)和作为烷基化剂的碘乙酰胺之前，使用高摩尔浓度的尿素缓冲液使样品变性。蛋白质线形化后，在稀释后将胰蛋白酶添加到每个样品中以降低尿素浓度。通过在37℃孵育过夜完成蛋白质消化。然后通过添加三氟乙酸(TFA)通过酸性pH中和胰蛋白酶活性。消化后的肽经C18柱净化和脱盐。柱最初用乙腈(ACN)活化，并用0.1％TFA溶液彻底洗涤，然后上样消化后的肽。用0.1％TFA溶液进行额外洗涤后，用酸化的70％ACN溶液洗脱肽并收集在低结合管中。接下来，使用SpeedVac通过蒸发去除ACN，并将清洁、脱盐的干燥肽重新悬浮在含有2％ACN和0.1％甲酸(FA)的溶液中。
液相色谱和质谱。
在与Q ExactiveTMHF质谱仪(Thermo Fisher Scientific)在线耦联的UltiMate3000(Thermo Fisher Scientific)上分析肽。将肽以5μL/min的流量上样到μPACTM捕集柱(PharmaFluidics，根特，比利时)上3分钟，然后在50cmμPACTM柱(PharmaFluidics)上使用120分钟的从0.8％至78％的非线性梯度的乙腈的0.1％甲酸溶液进行分离。使用UltiMate3000柱温箱将柱温保持在50℃。Q ExactiveTMHF在350m/z至1,150m/z的范围内以数据无关(DIA)方式运行。使用3×106的自动增益控制(AGC)目标值和20ms的最大进样时间以120,000的分辨率记录全扫描谱。全扫描之后是使用0.5Th的重叠的8.5Th宽度的100个窗口。以30 000的分辨率记录DIA谱，使用2×105的AGC目标值，最大注射时间为60ms，并且固定的第一质量为200Th。将标准化碰撞能量(NCE)设置为28％，并将默认电荷状态设置为3。使用EASY-spray电喷雾发射器(Thermo Fisher Scientific)在2.0kV喷雾电压和250℃加热毛细管温度下电离肽。
使用DIA-NN进行数据分析。
将人uniprot参考蛋白质组的蛋白质序列与慢病毒蛋白质(GAG、POL)和常见污染物连结，以生成该项目的预测谱库。谱库预测了在350m/z至1,150m/z的范围内具有严格的胰蛋白酶特异性(KR而非P)的所有可能的肽，允许至多一个缺失的切割位点。质谱在DIA-NN(1.7版)中进行分析，使用MS1的5ppm的固定质量容差以及MS2谱的10ppm的质量容差，并使用“任何LC”量化策略启用“RT分析”。将前体鉴定的错误发现率设置为0.1％，并且根据其各自的基因对蛋白质进行分组。使用“normalised.unique”强度对蛋白质进行定量。
差异表达分析
使用BioConductor DEP包在R中进行差异表达分析。首先过滤具有缺失值的蛋白质，使得至少一个条件对所有复现物进行量化。使用BioConductor VSN包进行方差稳定标准化。然后使用左截尾数据的分位数回归插补(QRILC)对缺失值进行插补。使用具有经验贝叶斯统计的蛋白质线性模型(protein-wise linear model)进行差异表达分析。使用Benjamini&Hochberg方法针对多重检验调整P值。
CAR-T细胞的产生和功能评估
细胞转导
从商业供应商处获得来自三个健康人类捐献者的外周血单核细胞(PBMC)。在含有100IU/mL重组人IL-2的改良的T细胞培养基(12孔板)中将每孔1.5×106PBMC与4.5×106CD3/CD28 T细胞扩增剂珠一起培养。将LV-CAR/LV-CAR[+256U1]以所述的估计的感染复数(MOI)为1.25或0.3添加到相关孔中。通过增加含有100IU/mL重组人IL-2的改良T细胞培养基的体积，将细胞维持在1.0×105个活细胞/mL的浓度(根据需要增加培养容器的尺寸)。在培养13天后，培养细胞在细胞冷冻培养基中以每毫升1.0×107个活细胞的浓度冷冻。在初始扩增8天以及复苏后5天，通过流式细胞术测量转导的细胞百分率。
功能测试
用于测试CAR-T细胞反应的细胞系是SKOV-3(一种高水平表达5T4l的卵巢癌细胞系)和三种急性髓系白血病(AML)细胞系THP-1、Kasumi-1和AML-193，后者是5T4阴性细胞系。用荧光细胞示踪染料标记靶细胞系，以便随后通过流式细胞术进行鉴定。大约1×105CAR-T细胞与1×105的每种细胞系在96孔圆底板中一式三份共培养。24小时后，从每个孔中取出一定体积的培养上清液，用于通过细胞计数珠阵列分析干扰素γ和颗粒酶B。40小时后，收获细胞并用荧光活性染料染色。通过流式细胞术测量每个实验孔中非活靶细胞的百分率。
实施例1
GFP-polyA-GLuciferase报告基因盒经设计用以评估polyA信号突变体对HIV-1polyA位点转录通读的影响。报告基因编码上游GFP ORF(为了能够对转染效率标准化)、标准3'SIN-LTR序列(包括携带HIV-1polyA信号的RU5序列)、然后是IRES-Gluc序列和SV40polyA信号。因此，可以通过荧光素酶活性测量任何通读HIV-1polyA信号，而荧光素酶活性通过GFP表达进行标准化。测量了两个polyA信号突变体(pAM1＝AAUAAA>AACAAA；pAKO＝AAUAAAA缺失)和野生型polyA信号(wt pA＝AAUAAA)的影响(图2A)。
使用一个标准的慢病毒载体基因组和两个包含不同的5'LTR polyA信号突变体(pAM1或pAM2)的基因组，在不存在或存在经修饰的U1 snRNA(256_U1，在生产过程中并行提供)的情况下制造载体颗粒，然后进行滴定。存在经修饰的U1 snRNA时生产的载体是不存在经修饰的U1 snRNA时生产的载体的3到6倍，并且这与5'LTR中是否存在功能性polyA位点无关(图2B)。这表明经修饰的U1snRNA对抑制polyA的任何漏读(即，内源性U1 snRNA与主要剪接供体位点结合并完全抑制过早的聚腺苷酸化)没有作用，因此必须通过一些其他的新机制(可能通过改进vRNA稳定性/核输出)增加载体滴度。
实施例2
进行实验以评估本发明中可能需要的U1 snRNA分子的其他特征。构建了几个经修饰的U1 snRNA表达盒，所有表达盒的靶序列都位于HIV-1包装区域中的位置“256”(图3A)。两个变体在茎环I区域内包含已公开的突变，从而去除U1-70K蛋白结合(256_70K_m1和256_70K_m2)，两个变体在茎环II区域内包含已公开的突变，从而去除U1A蛋白结合(256_U1A_m1和256_U1A_m2)，并且一个变体包含突变的Sm蛋白结合基序(256_SM_m1)(Alexander,MR etal.,2010,Nucleic Acids Res.,38:3041-53；Ashe,MP et al.,2000,RNA,6:170-7)。还构建了其他三个表达天然U1 snRNA的盒(U1A5、U1A6和U1A7)，它们具有保守的Sm结合区，但在三叶草结构中的序列非常不同(因此不太可能结合U1-70K或U1A)。最后，产生两个靶向lacZ基因序列的对照U1 snRNA构建体作为阴性对照。
当这些经修饰的U1 snRNA与慢病毒载体组分(标记基因＝GFP)分别共转染到HEK293T生产细胞中时，256_U1和70K或U1A蛋白结合突变体U1而不是其他变体使载体滴度提高了2至4倍(图3A)。基于U1A的snRNA独立于功能性U1A-70K和U1A结合环而增加LV滴度，但滴度提高取决于Sm蛋白结合基序。snRNA变体U1A5、U1A6和U1A7没有增加LV滴度，从而表明U1A snRNA的一些结构特征是该效果所必需的。
实施例3
在贴壁HEK293T载体生产环境中进行的实验。在不存在或存在经修饰的U1 snRNA的情况下，生产编码GFP的标准慢病毒载体，该经修饰的U1 snRNA具有结合沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的位点的靶向序列，该靶向序列包括15个核苷酸或9个核苷酸靶向互补长度。根据沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA(参见表I)。数据表明，载体滴度提高幅度的增加与远离5'polyA位点的靶位点相关，具有在包装信号的SL1环内编码的理想靶区域(图4)。数据还表明，利用15个核苷酸而不是9个核苷酸(根据内源性U1 snRNA)靶向互补长度会产生更强劲的载体滴度增加。
实施例4
在悬浮、无血清的HEK293T载体生产环境中进行的实验。在不存在或存在经修饰的U1 snRNA的情况下，生产编码GFP的标准慢病毒载体，该经修饰的U1 snRNA具有结合沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的位点的靶向序列，该靶向序列包括15个核苷酸或9个核苷酸靶向互补长度。根据沿载体基因组vRNA分子的5'端长度的靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA。数据表明，载体滴度提高幅度的增加与远离5'polyA位点的靶位点相关，具有在包装信号的SL1环内编码的理想靶区域(图5)。
实施例5
在贴壁HEK293T载体生产环境中进行的实验。在不存在或存在经修饰的U1 snRNA情况下，生产编码GFP(pHIV-EF1a-GFP)或CD19*嵌合抗原受体(pHIV-EF1a-CD19)的标准慢病毒载体，所述经修饰的U1 snRNA靶向慢病毒载体包装区域内的位点(256U1或305U1)或LacZ对照(LacZU1)中的任一者。根据慢病毒载体包装区域内的靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA(参见表I)。以两种不同的剂量提供经修饰的U1 snRNA表达构建体：1x和4x。数据表明，本发明可以独立于载体基因组的有效载荷而应用(图6)。
*本实施例和本文提供的所有其他实施例中的CD19CAR使用基于公开可用序列的scFV：
重链-GenBank CAA67618.1：
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：191)
轻链(kappa)-GenBank AAB34430.1：
ELVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIKRRS(SEQ ID NO：192)
实施例6-来自MSD的混杂剪接、MSD-2KO慢病毒载体滴度的降低以及通过重新定向的U1 snRNA的滴度恢复/提高。
慢病毒载体基因组的一般结构在所有的三代载体系统中都保持一致(ToshieSAKUMA,Michael A.BARRY and Yasuhiro IKEDA.Biochem.J.(2012)443,603–618)，保留了HIV-1前病毒的5'区域，其中包含包装序列和转基因盒上游RRE的位置，但在其他方面与后代不同，变得独立于U3/tat，在3'LTR中自失活，并结合使用cppt和wPRE。在5'包装序列的工程改造中明显缺乏实例可能是由于其复杂的结构和其中编码的密集信息对于HIV-1复制的许多方面是必需的：转录、剪接平衡、GagPol的翻译、基因组二聚化、组装、逆转录和整合。在这个复杂区域内，主要剪接供体(MSD)嵌入介于SL1(二聚化环)和SL3(与Gag结合)之间的茎环2(SL2)区域。据认为，在慢病毒载体基因组中，将RRE序列(和在包膜区域内相关的剪接受体7(sa7))重新定位到紧邻包装区域的下游，从而在不存在rev的情况下为剪接受体(sa7)“提供”MSD。假设在慢病毒载体生产期间，rev的供应导致rev与RRE结合并抑制MSD对sa7的剪接，并因此产生未剪接的全长慢病毒载体基因组vRNA(图7A)。然而，本发明人(图9Bii)和其他人(例如Cui et al.(1999),J.Virol.,73:6171-6176)表明，来自MSD对转基因序列内的剪接受体位点的异常剪接可能是大量的，从而产生可用于包装成载体病毒颗粒的相对合适水平的未剪接vRNA(相对于总量-参见图7B)，在一些情况下低于5％。
由于大量载体基因组质粒递送至细胞，因此在瞬时转染方法中生产的慢病毒载体滴度中，并不总是直接观察到产生用于包装的vRNA的低效率；标准第3代载体的滴度通常可以高于1x107 TU/mL，即使发生这种类型的异常剪接也是如此。然而，本发明人预计，为了开发稳定生产者细胞系，其中可能存在的整合载体基因组盒的数量少得多，异常剪接的问题实际上可能会更加严重。实际上，本发明人通常发现基因组组分在稳定的生产者克隆中受到限制，并且假设MSD活性可能对这种限制有很大贡献。
将MSD产生的异常剪接的mRNA生成到转基因盒中还有一个可能不太明显的后果：在生产过程中转基因盒的(增加的)表达。此前，开发了TRIP系统以阻遏慢病毒载体生产过程中的转基因表达(描述于WO 2015/092440)，这使得载体滴度的恢复与特定转基因蛋白对载体生产的负面影响成比例相关。本发明人已发现有效的异常剪接(例如在包含EF1a驱动盒的标准慢病毒载体中，参见图9)产生通常编码转基因的mRNA。不希望受理论束缚，对于EF1a驱动的盒，MSD剪接强EF1a剪接受体，但对于其他启动子-UTR序列，MSD“选择”较弱的隐蔽剪接受体，即使存在rev亦是如此。MSD似乎“越过”RRE-sa7序列，而偏向于载体基因组的更中央的其他位点(即，在转基因启动子区域中)。这可能是HIV-1的5'包装区域的“残留”特性，因为在野生型HIV-1中，MSD通常剪接位于基因组中央和3'端的剪接受体。MSD可能在载体序列下游中的许多位置异常剪接，但只有通过无义介导的衰变规则的mRNA(即，它们似乎是合理的mRNA，因为它们编码蛋白[转基因蛋白])被运输到细胞质(和/或在细胞质中稳定)，然后在细胞质中被翻译。为了维持对编码转基因的mRNA的阻遏给TRIP系统带来了额外的负担，从而导致对更大的mRNA池的阻遏性控制较弱。此外，组织特异性启动子的使用(部分是为了避免慢病毒载体生产过程中的转基因表达)可能会被这种异常剪接机制带来的编码转基因的可翻译mRNA的细胞质外观“扰乱”。本质上，将由驱动载体基因组vRNA表达的(通常是强大的)组成型启动子驱动转基因表达。
因此，产生MSD突变的慢病毒载体的原因有很多，并且事实上，其他人已经尝试在U3/tat独立型慢病毒载体中这样做，但没有成功。本发明人已经发现，HIV-1中MSD的突变激活了SL2内相邻的隐蔽剪接供体位点，从而引起显著水平的剪接。为此，本发明人在MSD和附近的隐蔽剪接供体(crSD)中都采用了突变(参见图15)，并将这种修饰称为“MSD-2KO”或“MSD2KO”或“MSD的功能修饰”。如图9所示，这种双突变在去除慢病毒载体生产过程中SL2的剪接区(包括MSD和CrSD)对强EF1a剪接受体的异常剪接方面极为有效。图中还示出了包含三个不同的启动子-GFP转基因盒的MSD-2KO慢病毒载体基因组导致载体滴度降低(图8)，这与其他人报道的类似。在图9Bi中，还证明了以反式提供HIV-1tat能够挽救观察到的MSD-2KO慢病毒载体基因组的滴度降低，尽管“异常”剪接产物(来自SL4中的次要隐蔽剪接供体)的量增加(图9Bii)。重要的是，图中示出了重新定向到载体包装信号的不同区域的经修饰的U1snRNA增加了MSD-2KO慢病毒载体基因组滴度，并且没有增加次要剪接产物(图9和10)。
实施例7-MSD-2KO慢病毒载体滴度的提高不是由于载体基因组盒内5'polyA位点的抑制
为了评估本发明是否起到抑制5'polyA位点的作用，在包含EF1a或CMV驱动的GFP转基因盒的MSD-2KO慢病毒载体基因组中引入了5'polyA位点的功能性突变(图11)；pAm1polyA突变的描述在图2中(为了清楚起见，再次显示在图11A中)，这显示出完全去除了聚腺苷酸化活性。令人惊讶的是，本发明人发现5'polyA信号的突变仅部分增加了含有EF1a-GFP的MSD-2KO慢病毒载体基因组的滴度，而对CMV-GFP MSD2KO慢病毒载体基因组几乎没有影响，这似乎与MSD-2KO突变的减弱效果程度相称(对于含有EF1a的基因组，MSD2KO突变不太明显)。重要的是，本实验中305U1分子的供应增加了标准慢病毒载体基因组(其中内源性U1snRNA可能能够完全抑制任何残留的5'polyA活性)和MSD2KO/pAm1慢病毒载体基因组的滴度，后者没有可能具有5'polyA活性。这提供了令人信服的证据，证明所提供的用于恢复MSD突变慢病毒载体的滴度的经修饰的U1 snRNA在转录后的步骤中发生了作用，这在先前未曾报道过。
本发明人随后试图突变305U1和256U1的70K和U1A结合环，以评估这些突变是否影响观察到的MSD2KO慢病毒载体基因组的滴度的增加。图12表明，当在生产过程中共表达时，经修饰的U1 snRNA中SL1或SL2的功能性突变对这些分子增强MSD-2KO慢病毒载体滴度的能力没有影响；只有Sm蛋白结合突变阻止了这种活性。这表明在抑制polyA活性的过程中，重新定向的U1 snRNA的之前必要的70K结合特性在本发明中并不重要，并提供了进一步的证据，证明用于增加MSD突变的慢病毒载体滴度的经修饰的U1 snRNA正在通过一种新机制发挥作用。
为了评估当应用于MSD-2KO慢病毒载体时，与标准慢病毒载体相比，经修饰的U1snRNA介导的滴度增加是否在其“优选的”靶位点方面有所不同(参见图4和5)，筛选了一组靶向沿着MSD-2KO慢病毒载体基因组的5'区域的不同位点(参见表I)的经修饰的U1snRNA(图14)。该筛选表明，靶向包装区域是优选的(SL1-3)，可能在SL3内有一个“热点”。筛选是用经修饰的U1 snRNA进行的，该经修饰的U1 snRNA具有15个与靶位点互补的核苷酸(或如所述的9个核苷酸)，正如我们之前对标准慢病毒载体所证明的那样，当使用大于9个核苷酸的互补长度时，滴度的增加可能更加明显(参见图4)。事实上，我们进行了另一项实验，以表明对于MSD-2KO慢病毒载体，使用经修饰的U1 snRNA(靶向“305”序列)观察到的滴度提高仅可在7个核苷酸的互补性下观察到，但在优选使用中，使用10到15个核苷酸的互补性会更好，因为滴度提高有所增加(图13)，并且还因为这会使经修饰的U1 snRNA的任何可能的“脱靶”效应最小化。
实施例8-经修饰的U1 snRNA对MSD-2KO慢病毒载体滴度的提高不依赖于剪接供体突变的类型
图15A展示了对MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域的“MSD2KO”变体的SL2环的遗传修饰，该修饰使MSD和位于下游的隐蔽剪接供体这两者发生突变(本文中的许多非限制性的实例中已经使用了MSD2KO变体)。为了评估使用经修饰的U1 snRNA提高滴度的效果是否无论如何都取决于对MSD2KO变体所做的特定变化，我们制作了三种其他的剪接供体区域突变体：[1]“MSD2KOv2”，其在MSD和隐蔽供体序列内还引入了两个特定改变；[2]“MSD-2KOm5”，其用人工茎环代替整个SL2环；以及[3]完整的SL2缺失，从而去除了整个剪接供体区域(也称为剪接区域)。然后我们在+/-经修饰的U1 snRNA(256U1)的HEK293T细胞中生产标准的或MSD突变的慢病毒载体变体(包含EFS-GFP表达盒)，并滴定载体上清液(图15B)。结果表明，与标准载体相比，所有四种MSD突变的慢病毒载体变体都减弱了，但所有四种MSD突变的慢病毒载体都可以通过使用慢病毒载体生产期间提供的经修饰的U1snRNA而加强，从而表明由经修饰的U1 snRNA的剪接供体区域突变没有特定的序列依赖性。有趣的是，MSD-2KOm5变体的减弱程度最低，并且当在256U1分子存在的情况下生产时，输出滴度的增加最大，这与所采用的内部启动子的同一性无关(比较了EFS、EF1a、CMV和人PGK启动子)。
实施例9-在慢病毒载体基因组质粒DNA骨架内顺式编码的经修饰的U1 snRNA盒的用途。
本文之前的实施例已经公开了在用慢病毒载体组分质粒和经修饰的U1 snRNA编码质粒瞬时共转染HEK293T细胞中，在慢病毒载体生产过程中使用反式的经修饰的U1snRNA分子。为了评估MSD突变的慢病毒载体基因组盒和经修饰的U1 snRNA盒是否可以在同一质粒DNA分子内适当编码，克隆了三种变体构建体(图16A)。对MSD突变的慢病毒载体基因组盒(MSD-2KO变体)进行修饰，使得相对于慢病毒载体基因组盒和/或功能性质粒骨架序列，256U1表达盒以三种不同的构造插入。这些“顺式”版本质粒用于在HEK293T细胞中制造MSD突变的慢病毒载体，并与“反式”模式进行比较，其中经修饰的U1 snRNA质粒与未经修饰的MSD突变的慢病毒载体基因组共转染(图16B)。结果表明，这些“顺式”版本的质粒的滴度与共转染中提供的未经修饰的MSD突变慢病毒载体基因组+256U1相似。
实施例10-使用稳定表达经修饰的U1 snRNA的细胞系改善标准慢病毒载体或MSD-2KO慢病毒载体的生产
将305U1表达盒稳定地整合到HEK293T细胞中，并且通过瞬时转染+/-额外305U1质粒DNA生产标准慢病毒载体或MSD-2KO慢病毒载体。稳定细胞的成功产生首次揭示了经修饰的U1 snRNA可以在细胞内进行内源性表达而没有细胞毒性作用，从而表明经修饰的U1snRNA不会滴定出(titrate-out)参与U1 snRNA合成或剪接体的细胞因子，或者没有发生脱靶或脱靶效应不影响正常细胞活性。慢病毒载体的输出滴度表明，对于标准慢病毒载体和MSD-2KO慢病毒载体两者，在经修饰的U1 snRNA的稳定供应下，由经修饰的U1 snRNA介导的滴度增加都是可能的(图18)。这将使经修饰的U1 snRNA能够轻松整合到慢病毒载体包装和生产者细胞系中。
实施例11-使用经修饰的U1 snRNA提高编码治疗性转基因盒的标准慢病毒载体的滴度的其他实施例
我们在+/-256U1的无血清、悬浮HEK293T细胞中生产了标准慢病毒载体，其编码野生型或密码子优化的人α1-抗胰蛋白酶(与T2A-GFP报告基因融合)或嵌合抗原受体(针对5T4)，由EF1a启动子盒驱动。这些载体通过整合试验或通过流式细胞术进行滴定以评估靶细胞中的GFP表达(图17)。这些数据表明256U1增加了所有测试载体的滴度。
实施例12-MSD突变的慢病毒载体在生产过程中产生较少的转基因蛋白
在慢病毒载体生产过程中去除异常剪接的另一个优点是减少导致转基因蛋白生产的编码转基因的mRNA的数量。转基因表达可以显著影响慢病毒载体的生产，这使得我们之前开发了TRiP系统来抑制病毒载体生产过程中的转基因翻译(描述于WO 2015/092440)。简言之，细菌蛋白“TRAP”在载体生产过程中共表达，并与插入5'UTR内的转基因ORF上游的“TRAP结合序列”(tbs)结合，从而阻断核糖体扫描。
在这项工作的过程中，我们意外地发现，由于从SL2的主要供体剪接区域到内部剪接受体位点的剪接，驱动载体基因组盒的“外部”(CMV)启动子有效地产生了编码转基因的mRNA。这种情况发生的程度取决于cppt和转基因ORF之间的内部序列(即，启动子-5'UTR序列)。在转基因盒中使用EF1a启动子(包含非常强的剪接受体)，导致超过95％的来自外部启动子的总转录物中出现来自MSD的异常剪接(参见图7)。通过比较标准的或MSD-2KO慢病毒载体生产培养物中的总GFP表达(图19)，我们示出了在生产过程中表达的转基因蛋白中高达80％来自异常剪接产物。我们发现将MSD-2KO基因型与TRiP系统组合加强了所产生的转基因蛋白的减少。
实施例13
靶向慢病毒载体vRNA的经修饰的U1 snRNA的共表达使得载体颗粒样品中的vRNA增加。
在贴壁HEK293T载体生产环境中进行实验。在存在或不存在经修饰的U1 snRNA的情况下，生产编码GFP(pHIV-EF1a-GFP)或CD19的嵌合抗原受体(pHIV-EF1a-CD19)的标准慢病毒载体，该经修饰的U1 snRNA靶向慢病毒载体的包装区域内的位点(256U1或305U1)或LacZ对照(LacZU1)中的任一者。根据慢病毒载体包装区域内靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA(参见表I)。以两种不同的剂量提供经修饰的U1 snRNA表达构建体：1x和4x。在从载体颗粒中提取总RNA之前，用DNAase/RNAse处理载体上清液，然后针对vRNA的包装区域(Psi)进行RT-qPCR，以量化存在的总vRNA拷贝数(图20)。数据表明，经修饰的U1sRNA的共表达引起载体颗粒内vRNA的增加。
实施例14
靶向慢病毒载体vRNA的经修饰的U1 snRNA的共表达可引起载体生产过程中转基因表达降低。在悬浮、适应无血清的HEK293T载体生产环境中进行实验。在对经修饰的U1snRNA加强的编码α1-抗胰蛋白酶(α1AT)转基因(与GFP融合)的基于HIV-1的慢病毒载体生产进行评估期间(图21和22)，观察到使用Sendai包膜(F/HN)伪型化的载体中LV滴度的相对增加(约20倍)大于使用VSVG伪型化的载体(约3倍)。在悬浮的HEK293T细胞(和示出的贴壁HEK293T细胞)中生产载体，然后通过整合试验和流式细胞术在贴壁HEK293T细胞中进行滴定。对生产后的细胞裂解物进行转基因蛋白(和GFP)以及β-肌动蛋白的免疫印迹，揭示了当以反式形式提供256U1时，转基因表达受到不太多但持续的抑制。由于Sendai F蛋白在转导之前需要胰蛋白酶激活，因此该结果表明收获材料中α1AT的存在抑制了F蛋白的胰蛋白酶激活。因此，用p256U1转染的细胞中α1AT表达的明显抑制为活性载体滴度提供了额外的提高。不希望受到理论束缚，该结果与256U1的作用机制一致，由此vRNA不仅稳定(可能避免核降解)而且还可以逃避翻译，否则会导致转基因蛋白的产生。事实上，最近有报道称，非翻译、全长未剪接野生型HIV-1池被主动包装成病毒颗粒(Chen et al.(2020),PNAS；117(11):6145-6155)。在这种特定情况下，256U1的这两个令人惊讶的效果是累加的，使得载体输出/活性增加10倍。对于其他治疗性载体基因组，其中转基因表达可能对输出载体滴度有害，这种通过经修饰的U1 snRNA降低转基因表达的适度效果可能具有促进滴度增加的类似效果。
实施例15
使用经修饰的U1 snRNA增加含有反向转基因盒的慢病毒载体的滴度。
在一些情况下，有必要使用慢病毒载体基因组，其中转基因盒是反向的，即，转录单位与驱动载体基因组盒的启动子相反。例如，大多数开发用于治疗镰状细胞病或β-地中海贫血的慢病毒载体包含β-珠蛋白基因，其中内含子与三个外显子一起编码(这是因为终末分化的红细胞中内含子的外剪接是β-珠蛋白有效表达所必需的)。在大多数情况下，内含子可以保留在包含rev应答元件(RRE)的经包装的慢病毒载体vRNA中，因为rev与细胞核中的RRE结合导致输出含有内含子的vRNA；然而，β-珠蛋白基因并非如此，当转基因盒处于“正向”方向时，即使存在rev/RRE，这些vRNA也会丢失内含子。此外，可能存在转基因盒的一个组分可能处于反向而另一个处于正向方向的情况，例如使用双向转基因盒或多个单独的盒。
为了评估使用经修饰的U1 snRNA是否能够增加包含反向转基因盒的慢病毒载体，在不存在或存在靶向包装区域的四种不同的经修饰的U1 snRNA的情况下，在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中生产了含有β-珠蛋白基因的慢病毒载体(图23)。在悬浮、适应无血清的HEK293T载体生产环境中进行实验。数据表明，经修饰的U1 snRNA也能够加强这类慢病毒载体的滴度。
实施例16
经修饰的U1 snRNA对慢病毒载体滴度的加强在浓缩载体制备物中是可测量的。在悬浮、适应无血清的HEK293T载体生产环境中进行实验。在不存在或存在256U1的悬浮(无血清)的HEK293T细胞中生产编码萤火虫荧光素酶-GFP双报告转基因盒的慢病毒载体。澄清的载体收获物通过离心浓缩(约20倍浓缩因子)，然后通过转导贴壁HEK293T细胞然后进行流式细胞术，从而滴定浓缩前和浓缩后的载体样品(图24)。数据表明，在加工LV材料中观察到由经修饰的U1 snRNA引起的滴度增加，从而进一步证明了载体滴度的提高不是与粗制载体材料相关的人为现象。
实施例17
开发一种高度灵敏的定量检测经修饰的U1 snRNA的方法，用于测量生产后细胞的裂解物和载体材料中残留的经修饰的U1 snRNA。将前体snRNA(pre-snRNA)在细胞质中加工后，它作为剪接体的一部分被运回细胞核，剪接体是参与前体mRNA剪接的关键复合物。因此，预计本文所述的经修饰的U1 snRNA主要位于核位置，并且预计它们掺入病毒颗粒的潜力非常低。事实上，其他人已经表明，加工过的U1 snRNA不会主动包装到HIV-1病毒颗粒中，并且前体U1 snRNA的存在比病毒颗粒中检测到的最丰富的细胞RNA(例如7SL)低100倍(Eckwahl et al(2016)；RNA,22(8):1228–1238)。
然而，为了能够评估细胞内经修饰的U1 snRNA的表达并检测/量化源自载体产物中经修饰的U1 snRNA的残留RNA，开发了基于Taqman的RT-qPCR试验(图25)。为了对经修饰的U1 snRNA和高度表达的内源性U1 snRNA进行区分，设计了扩增子，使得正向引物与经修饰的U1 snRNA分子的5'末端的vRNA靶向序列同源(参见图25A)。因此，虽然反向引物将使内源性和经修饰的U1 snRNA的cDNA合成成为可能，但定量PCR步骤只会从源自经修饰的U1snRNA的cDNA中进行。在该非限制性实例中，设计了88bp的扩增子以扩增256U1 snRNA。为了评估引物/探针组的敏感性，用p256U1转染悬浮(无血清)的HEK293T细胞，并从用Benzonase处理的复现培养物中提取和纯化总RNA(以降解残留的p256U1 DNA)。对纯化的总RNA+/-逆转录酶步骤进行Taqman qPCR，以评估来自未消化的p256U1 DNA的信号(参见图25B)。p256U1质粒用作qPCR步骤的标准曲线，并显示出非常好的线性和范围。来自未转染的细胞RNA和经p256U1转染的细胞RNA(+RT处理)的稀释cDNA样品产生19至20个循环差异的Ct值，其中-RT处理的经p256U1转染的细胞RNA的Ct值仅比未转染的细胞RNA低约2倍。这表明RT-qPCR试验能够明确检测和量化经修饰的U1 snRNA而不是内源性U1 snRNA。
实施例18
经修饰的U1 snRNA剂量反应和使用多变量建模来优化经修饰的U1 snRNA质粒和LV组分质粒比率，以实现悬浮(无血清)的HEK293T细胞的最大瞬时转染。
为了评估瞬时转染期间输入经修饰的U1 snRNA质粒、所得的经修饰的U1 snRNA表达以及对载体基因组RNA(vRNA)和输出载体滴度的影响之间的关系，进行了一项简单的剂量反应研究。通过瞬时转染LV组分pDNA，在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中产生编码EF1a启动子驱动的CAR-CD19表达盒的LV，p256U1的输入量设置在0到600ng/mL的范围内(转染时的有效最终培养浓度)。所有LV pDNA比率/数量保持不变，而总pDNA通过填充pBlueScript保持不变。通过提取总RNA并量化256U1 snRNA和vRNA以及内源性转录物(RPH1；数据未显示)以在cDNA步骤中对总RNA进行标准化，从而对后期处理细胞进行分析(图26A)。此外，澄清的LV上清液通过整合试验进行滴定(图26B)。数据表明，输入p256U1量、256U1 snRNA的表达水平和vRNA的稳态水平之间存在线性相关性(以线性方式增加)。LV-CARCD19的输出滴度也与输入p256U1量(和生产细胞内的vRNA增加)呈线性关系，直至输入水平为300ng/mL，此时滴度增加最大。这表明实现最大滴度增加的p256U1的最小输入水平(在这些条件下并且对于该LV基因组)介于150ng/mL和300ng/mL之间。
实验设计(DoE)用于在40mL摇瓶规模下生成和测试28个条件，其中p256U1、pGenome(在本例中为pHIV-EF1a-5T4CAR)和pVSVG发生变化，并且pGagPol/pRev输入水平保持恒定(图27)。通过转导贴壁HEK293T细胞，然后使用针对5T4CAR的MAb进行免疫流式细胞术，从而滴定澄清的载体收获物。与没有p256U1相比，DoE确定的180ng/mL p256U1的最佳输入然后被应用于产生进一步的HIV-EF1a-5T4CAR载体制备物，从而使得LV输出滴度平均增加约10倍。p256U1的180ng/mL输入量与剂量反应实验的结果非常一致(参见图26)。
实施例19
案例研究：使用利用或不用256U1生产的浓缩/纯化慢病毒载体制备物生成并评估CAR-T细胞。为了评估应用经修饰的U1 snRNA对慢病毒载体基因治疗产品的影响，进行了一项小型案例研究，其中编码靶向5T4的嵌合抗原受体的慢病毒载体(HIV-EF1a-5TACAR/'LV-CAR')[1]使用或不使用256U1生产并纯化(图28)，[2]定量浓缩产物中的残留256U1 snRNA的量(图29)，[3]对两种浓缩载体制备物进行比较蛋白质分析(图30和表IV)，[4]从三个健康供体PBMC扩增的原代T细胞被转导并评估其对5T4阳性细胞的杀伤活性(图31至33)，以及[5]通过RT-qPCR评估CAR-T扩增培养物中的残留256U1和vRNA(图34)。
在悬浮(无血清)的HEK293T细胞培养物中以250mL摇瓶规模产生两种浓缩的HIV-EF1a-5TACAR载体制备物，分别添加p256U1质粒DNA(+256U1)或使用pBluescript作为阴性对照。然后将澄清的收获物(未用Benzonase处理)进行离子交换层析，使浓度因数为约125倍，然后进行核酸酶处理。最后，将载体制备物进行离心约45分钟，然后再悬浮在TSSM中，使总浓度达到250倍。通过转导贴壁HEK293T细胞，然后使用针对CAR转基因的抗体进行免疫流式细胞术，从而滴定澄清的收获物和浓缩的载体样品(图28)。这些数据证实了使用256U1snRNA介导的滴度增加。
然后对浓缩过程中的载体样品进行总RNA提取，在提取前用+/-Benzonase处理澄清的收获样品。然后通过RT-qPCR对vRNA和残留的256U1 snRNA进行定量(对于256U1RT-qPCR试验的开发，参见实施例17)。图29显示了此数据，其中显示[1]来自存在256U1的情况下制备的载体的所有载体样品中vRNA的增加，[2]与256U1 snRNA相比，核酸酶处理对vRNA丰度的影响，以及[3]与浓缩载体内的vRNA相比，256U1 snRNA信号的相对比率。该分析表明，在澄清的LV收获物中存在的256U1 snRNA信号主要是“游离”RNA，它可能源自生产过程中的渗漏/爆裂细胞，因为Benzonase处理显著降低了这种检测结果。在浓缩的LV材料中，256U1:vRNA信号的比率为1:32，这表明对于每16个含有vRNA的LV颗粒，存在单个256U1snRNA(或至少88bp扩增子)。这表明256U1 snRNA并未主动包装到LV颗粒中，并且在浓缩的LV材料中检测到的信号可能是由于颗粒外部存在残留的256U1 snRNA。这也表明，通过优化核酸酶处理和LV补齐步骤，可能进一步降低256U1 snRNA信号。
然后通过质谱法分析两种浓缩的LV-CAR载体制备物，以评估256U1 snRNA在LV-CAR生产过程中的表达对病毒颗粒蛋白质标记的任何主要影响。如本文所述制备样品(参见“一般分子/细胞生物学技术和试验”部分)，并在与Q ExactiveTMHF质谱仪在线耦合的UltiMate 3000上分析肽。在DIA-NN(版本1.7)中分析质谱。人uniprot参考蛋白质组的蛋白质序列与慢病毒蛋白质(gag、pol、rev)和VSV-G糖蛋白以及常见的污染物连结，以生成该项目的预测谱库。对LV-CAR[+256U1]载体样品中检测到的前400种蛋白质进行排序，并将它们的相对丰度绘制为前400种蛋白质的总谱丰度的百分率(图17，实心黑色圆圈)。还绘制了LV-CAR载体样品中相同蛋白质命中的相对丰度，以评估两种载体制备物的蛋白质谱的任何主要差异是否可以可视化(图17，空心圆圈)。这些数据证实了预期的慢病毒蛋白gag(排名#1)、VSV-G(排名#2)和pol(排名#37)的存在，其中rev出现在排名#400。比较gag与pol肽的比率的分布显示两个样品的比率非常相似，约为16:1，接近公认的20:1的gag/pol mRNA(在野生型HIV-1中)的差异翻译率(gag多蛋白是翻译的主要产物，但大约20次中有1次，移码事件会导致gagpol多蛋白的翻译)。还存在已知掺入基于HIV-1的慢病毒颗粒的细胞蛋白：基础免疫球蛋白(排名#3)、HSPc-71K(排名#5)和亲环蛋白A(排名#22；与衣壳特异性结合)。分析显示两种LV-CAR载体之间的差异很小，从而表明256U1 snRNA在LV生产过程中的过表达不会导致任何明显的上调/下调和/或将细胞蛋白掺入LV病毒颗粒。
使用BioConductor DEP包在R中对两个LV样品之间显著差异高达2倍的命中进行差异表达分析。表IV显示了从该分析中选出的主要命中。该统计分析显示，gag、pol、VSVG和亲环蛋白A的2倍增加非常显著，从而表明这些LV蛋白在LV-CAR[+256U1]载体中相对于其他背景(可能的污染)蛋白更为丰富。
表IV：在+/-256U下生产的HIV-EF1a-5T4CAR(LV-CAR)浓缩/纯化制备物的比较蛋白质分析中，在对于差异高达2倍的命中进行的统计分析中选择的蛋白质。使用BioConductor DEP包在R中进行差异表达分析。最初过滤具有缺失值的蛋白质，使得至少一个条件对所有复现物进行量化。使用BioConductor VSN包进行方差稳定标准化。然后使用左截尾数据的分位数回归插补(QRILC)对缺失值进行插补。使用具有经验贝叶斯统计的蛋白质线性模型进行差异表达分析。使用Benjamini&Hochberg方法针对多重检验调整P值。排名数字是在LV-CAR[+256U1]样品中检测到的前400种蛋白质。
Figure BDA0003484958400001161
两种浓缩的HIV-EF1a-5TACAR/LV-CAR载体制备物用于转导来自三个健康供体的外周血单核细胞(PBMC)，MOI为1.25(两种载体制备物)或MOI 0.3(仅HIV-EF1a-5TACAR+256U1)，然后扩增转导的T细胞并在第13天存储细胞。然后使细胞复苏并再扩增5至6天。在扩增期间和复苏后监测了总的活细胞和LV-CAR或LV-CAR[+256U1]载体的转导百分率(图31)。该分析表明，尽管对两种LV制备物使用匹配的MOI均为1.25，但LV-CAR[+256U1]载体通常比LV-CAR载体更有效地转导扩增的T细胞(这可能是由于LV CAR[+256U1]载体中的污染物较少，参见图30和表IV)。使用MOI 0.3的LV-CAR[+256U1]载体转导的百分率与使用LV-CAR载体(MOI 1.25)转导的百分率相似，因此进一步的比较集中在这些样品上。
然后通过与等量的5T4阳性细胞(THP-1、Kasumi-1、SKOV-3)或5T4阴性细胞(AML-193)共孵育，然后分析孵育后24小时的细胞因子释放(图32)和孵育后40小时的细胞杀伤(图33)，从而评估表达5T4CAR的T细胞的靶细胞杀伤活性。这些结果表明，在存在5T4阳性细胞的情况下，通过释放颗粒酶-B和干扰素-γ，用两种载体制备物中的任一种转导的CAR-T细胞同样能够被特异性激活，从而产生特异性细胞杀伤。
在转导后第8天和第13天，采集细胞样品并提取总RNA，以评估任何残留的256U1snRNA与用作细胞转录物上样对照的RPH1 mRNA相比的相对丰度。图34显示了这些数据，从而表明相对于每个时间点的RPH1转录物，残留的256U1 snRNA信号低4至5个对数，并且残留的vRNA低3至3.5个对数。在第8天和第13天之间残留的256U1 snRNA信号的减少是vRNA的约5倍，从而表明与vRNA(显然在衣壳内受到保护)相比，大部分残留的256U1 snRNA暴露(降解)，这可能反映了在扩增期间与T细胞相关联的完整LV病毒颗粒数量较少。总而言之，残留的RNA分析表明，虽然可以在低水平的处理过的LV材料中检测到经修饰的U1 snRNA(在这种研究级生产规模中，每16个完整病毒颗粒有1个)，但至少80％的这种信号可能存在于病毒颗粒的外部。这意味着通过优化核酸酶处理和纯化步骤可能会进一步减少这种残留。
鉴于HEK293T细胞系内的组成性、长期经修饰的U1 snRNA表达是可能的，而没有明显的一般细胞毒性(参见实施例21)，在LV转导期间将全长经修饰的U1 snRNA递送至一小部分靶细胞可能将对靶细胞活性没有影响。由于经修饰的U1 snRNA的设计，与宿主细胞RNA没有特异性相互作用被认为是可能的，并且与庞大的内源性U1 snRNA池相比，它在靶细胞中的相对丰度意味着它极不可能有效地竞争与RNP因素的相关性。
实施例20
使用经修饰的U1 snRNA增加悬浮(无血清)包装细胞的LV生产。在存在或不存在p256U1的情况下，在摇瓶或250mL生物反应器(AMBR250)中在慢病毒载体包装细胞系(PAC)中生产HIV-EF1a-CAR-CD19载体或GFP报告基因变体载体(HIV-EF1a-CAR-CD19-T2A-GFP)。用所有载体组分平行转染的HEK293T细胞作为对照。通过转导贴壁HEK293T，然后进行整合试验，从而滴定澄清的载体收获物；相对于“无256U1”绘制滴度(图35)。数据表明，与HEK293T细胞相比，PAC细胞系的载体滴度提高最大。
实施例21
用256U1表达盒稳定转染悬浮(无血清)的HEK293T细胞，从而提高慢病毒载体滴度。用256U1-HygR表达盒稳定转染悬浮(无血清)的HEK293T细胞并选择克隆；选择克隆256U1c39用于进行评估。在分离后第1、5和10周评估慢病毒载体滴度提高，并在+/-潮霉素-B中持续生长，并且在+/-p256U1的情况下，通过瞬时转染生产HIV-EF1a-5T4CAR载体，在每个时间点与亲本HEK293T细胞进行比较(图36)。数据表明，256U1c39克隆内的256U1 snRNA表达在有或没有潮霉素选择的情况下都是稳定的，从而表明这些经修饰的U1 snRNA的长期表达对HEK293T细胞没有毒性。此外，256U1c39细胞系中的载体滴度提高水平接近所有条件下观察到的最大滴度提高。
实施例22
经修饰的U1 snRNA对慢病毒载体的提高效果似乎不依赖于内源性U1 snRNA中存在的保守的5'二核苷酸“AU”。
在实施例1中表明经修饰的U1 snRNA的作用机制不是由于慢病毒载体的5'LTR区域内的5'polyA信号的polyA抑制(内源性U1 snRNA的已知特性)，因为经修饰的U1 snRNA仍然能够增加含有该polyA位点功能突变的LV的滴度。
其他人已经表征了U1 snRNA生物学的一个方面，该方面似乎对其在剪接中的作用很重要(Yeh et al(2017)Nucleic Acids Res.45(16):9679–9693)。内源性U1 snRNA将CAP结合复合物(CBC)募集到其5'末端，这对U1 snRNP在剪接中的功能很重要；作者发现，与其他二核苷酸相比，“AU”二核苷酸提供了与CBC的最佳结合，并为“AU”二核苷酸在真核生物中如此广泛保守的原因提供了有力的理由。
为了评估在靶向慢病毒载体基因组包装信号的经修饰的U1 snRNA的情况中保守的“AU”二核苷酸序列的重要性，产生了许多基于256U1 snRNA的变体(表V)。
表V：产生靶向HIV-1LV vRNA基因组位置256的变体经修饰的U1 snRNA，用以评估5'末端二核苷酸变化对载体滴度增加的影响。该表显示了vRNA中的15个核苷酸变体256U1靶序列和碱基配对，以及13个核苷酸变体靶向序列的比较。256U1_13变体设计为在可能的情况下与靶保持13个连续碱基对，以便计算出的T解链温度(Tm℃)为约46℃。标出了经修饰的U1 snRNA分子的5'端的二核苷酸，下划线的核苷酸代表根据Yeh等人(2017)的发现的可能的转录起始位点；标有星号的变体表明两个所述的二核苷酸中的第一个可能不是经修饰的snRNA的第一个核苷酸。还指出了U1启动子的转录起始位点，显示了带有“aa”和“cc”的变体可能的-1)TSS(灰色框“C”)。
Figure BDA0003484958400001191
Figure BDA0003484958400001201
Yeh及其同事(2017年)还报道了当改变前1至2个核苷酸时对转录起始位点和U1snRNA丰度的影响。他们发现嘌呤比嘧啶更倾向于转录起始，因此当嘧啶-嘌呤或嘧啶-嘧啶二核苷酸位于位置1和2时，嘧啶被“跳过”而选择下一个嘌呤。该一般规则的例外是“UU”，其转录起始发生在下游19或29个核苷酸处)，或“AA”/“CC”，其转录起始发生在-1位置(即“C”)。“UU”变体不在256U1变体的测试组中。对于变体组，靶向序列长度从15个核苷酸减少到13个核苷酸，以便能够测试许多不同的二核苷酸变体，其中一个或两个核苷酸都不能参与与靶序列的碱基配对，这取决于预测的转录起始位点(根据Yeh等人(2017))。结果表明，携带9到15个核苷酸的靶向序列的经修饰的U1 snRNA都能够介导滴度增加(图37)。
因此，所有变体的连续靶向序列的总长度为13个核苷酸(尽管并非完全相同的13个核苷酸)，并且预测所有变体的T解链温度为约46℃。在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中以24孔规模生产HIV-EF1a-GFP载体，并且每个二核苷酸变体U1 snRNA分别与载体组分共转染。通过转导贴壁HEK293T细胞然后进行流式细胞术，从而滴定澄清的载体收获物。图38中显示的数据展示了相比于“无256U1”的相对载体滴度，表明除256_13_Gt之外的所有二核苷酸变体都能够增加载体滴度，大多数实现了与对照256_13_aTU1 snRNA相似的提高幅度。此外，每个二核苷酸变体的预测CBC结合评分(根据Yeh等(2017))与每个变体介导载体滴度增加的能力之间似乎没有相关性。这表明U1 snRNA在产生成熟的U1 snRNP剪接复合物方面的已知CAP结合特性对于本文所述的经修饰的U1 snRNA的载体滴度提高作用并不重要。鉴于变体256_13_gT(与256_13_Gt具有相同的二核苷酸)能够介导载体滴度增加，这也表明可能不一定需要避免二核苷酸(除了上面提到的“UU”)，应当注意这两个变体U1 snRNA的靶向序列有两个核苷酸(每个末端一个)不同。有趣的是，注意到256_13_ga变体显示出最大的载体滴度提高，因此这表明除了筛选慢病毒载体包装区域内的最佳靶序列外，还可以使用不同的二核苷酸优化经修饰的U1 snRNA。
实施例23
通过增量扫描微调U1 snRNA的靶位点修饰。本文的其他实施例利用256U1[15nt]经修饰的U1 snRNA变体来增加基于HIV-1的慢病毒载体的滴度，因为它通常会最大程度地增加LV滴度。为了评估是否更接近256-270靶区域的其他靶位点可以略微改进滴度增加，通过有效地将靶序列“窗口”从256-270靶区域向上或向下移动约2nt的增量，从而设计了一组变体经修饰的U1 snRNA(表VI)。所有变体都包含13个核苷酸的靶向长度，以便更好地准确了解该区域中靶序列微小变化的重要性(在别处表明，含有13或15个核苷酸的靶退火长度的经修饰的U1 snRNA在功能上是相似的；参见图37)。这些变体经修饰的U1 snRNA分别与基于HIV-1的LV-EF1a-GFP载体组分共转染(210ng/mL质粒输入-参见实施例18)到悬浮(无血清)的HEK293T细胞中，并对所得的澄清的载体上清液在贴壁HEK293T细胞中进行滴定(图39)。来自两个独立实验的平均结果表明，在该例中，与使用256U1-15nt相比，253U1-13nt、255U1-13nt和245U1-13nt变体经修饰的U1 snRNA能够略微改进滴度提高效果。数据表明，即使对于通过使用经修饰的U1 snRNA适度提高的LV基因组(例如在这种情况下的HIV-EF1a-GFP)，通过改变特定靶位点和靶退火长度，也可以微调精确的靶序列以最大限度地增加滴度。
表VI：描述变体经修饰的U1 snRNA中的靶退火序列(与靶序列互补的异源序列)及其用于微调研究的靶序列的序列列表。核苷酸以DNA形式呈现，因为它们将在“重新靶向区域”的各自表达盒中进行编码。(AT)二核苷酸存在于所有构建体中，在每种情况下形成U1snRNA分子的前两个核苷酸。所有变体都包含13个核苷酸的靶向长度，并且靶位点被有效地移动到256U1靶向位点的上游或下游(上下文以256U1_15nt序列显示)。两个变体中的粗体“T”核苷酸参与与靶标的碱基配对(对于所有变体，保持13个核苷酸长度)。靶序列号指的HIV-1的NL4-3(GenBank：M19921.2)或HXB2(GenBank：K03455.1)菌株中的靶标，因为本研究中的慢病毒载体基因组包含由这两个高度保守的菌株组成的混合包装信号(包装序列GenBank：MH782475.1所示的载体序列最相似)。
Figure BDA0003484958400001221
Figure BDA0003484958400001231
*相对于载体基因组RNA序列的编号
实施例24
使用靶向5'包装信号序列区域的经修饰的U1 snRNA提高非灵长类慢病毒载体的输出滴度。为了评估经修饰的U1 snRNA是否可以增加非灵长类慢病毒载体，针对EIAV载体基因组的5'包装区域设计了一组具有15nt靶向序列长度的经修饰的U1 snRNA(表VII)。这些变体靶向从R区域到包装序列保留的gag区域。在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中，在有或没有经修饰的eU1 snRNA表达构建体的情况下生产EIAV-CMV-GFP和EIAV-EF1a-GFP载体。通过转导贴壁HEK293T细胞然后进行流式细胞术，从而滴定澄清的载体收获物；与无U1 snRNA相比绘制了相对滴度(图40)。数据显示可以通过使用经修饰的U1 snRNA增加基于EIAV的LV的输出滴度(在这种情况下高达300％)，这与基于HIV-1的LV观察到的方式类似，从而表明了一般作用机制。筛选确定了引物结合位点区域(121U1e)上或附近并且在gag序列的第一个核苷酸(260U1e)内的最佳靶位点。
表VII：经修饰的U1 snRNA靶向基于EIAV的慢病毒载体基因组vRNA的5'包装区域。该表显示了EIAV载体基因组vRNA(SPEIAV-19菌株)中的经修饰的U1 snRNA(所有15nt重新靶向的序列)的名称和靶序列。下划线的核苷酸反映了EIAV包装区域的gag区域内的ATG突变。
Figure BDA0003484958400001241
Figure BDA0003484958400001251
*相对于载体基因组RNA序列的编号
实施例25
使用靶向5'包装信号序列区域的经修饰的U1 snRNA提高非人灵长类动物慢病毒载体(SIVagm)的输出滴度。为了评估经修饰的U1 snRNA是否可以增加非人灵长类动物慢病毒载体，针对SIV载体基因组的5'包装区域设计了一组具有15nt靶向序列长度的经修饰的U1 snRNA(表VIII)。这些变体靶向从R区域到包装序列保留的gag区域。在悬浮(无血清)的HEK293T细胞中，在有或没有包含表VIII中概述的靶退火序列的经修饰的U1snRNA表达构建体的情况下生产SIV载体。通过转导贴壁HEK293T细胞然后进行整合试验，从而滴定澄清的载体收获物；与无U1 snRNA相比绘制了滴度(图41)。数据表明，靶向5'包装信号序列区域的经修饰的U1 snRNA可以将SIV载体滴度增加2倍(参见386U1和415U1)。这似乎是用于靶向构成包装序列一部分的保留的gag序列的紧邻上游的序列的“热点”。
表VIII：经修饰的U1 snRNA靶向基于SIVagm的慢病毒载体基因组vRNA的5'包装区域。该表显示了SIVagm载体基因组vRNA(TYO-1菌株)中经修饰的U1 snRNA(所有15nt重新靶向的序列)的名称和靶序列。
Figure BDA0003484958400001252
Figure BDA0003484958400001261
*相对于载体基因组RNA序列的编号
上文说明书中提到的所有公开文献以引用方式并入本文。在不偏离本发明的范围和精神的前提下，对本发明所描述的方法和系统的各种改变和变化对本领域技术人员是显而易见的。
尽管参照特定的优选实施方案对本发明进行描述，应该理解，所要求保护的发明不应该不适宜地受限于此类特定实施方案。实际上，所附权利要求的范围旨在包括对所描述的实施本发明的方式进行的各种修改，这些修改对分子生物学或相关领域的技术人员来说是显而易见的。
SEQUENCE LISTING
<110> 牛津生物医学（英国）有限公司;
<120> 慢病毒载体的优化生产
<130> P116581PCT
<150> GB 1910518.8
<151> 2019-07-23
<150> GB 2001997.2
<151> 2020-02-13
<160> 192
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 剪接供体区域
<400> 1
ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 突变的剪接供体区域 (MSD-2KO)
<400> 2
ggggcggcga ctgcagacaa cgccaaaaat 30
<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 主要剪接供体位点共有序列
<400> 3
tggtragt 8
<210> 4
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 主要剪接供体共有序列
<400> 4
ctggt 5
<210> 5
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 剪接供体区域
<400> 5
cagaca 6
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 突变的剪接供体区域
<400> 6
ggcgactgca gacaacgcc 19
<210> 7
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 突变的剪接供体区域
<400> 7
gtggagact 9
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 突变的剪接供体区域
<400> 8
ggcgagtgga gactacgcc 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 剪接供体区域
<400> 9
ggcgactggt gagtacgcc 19
<210> 10
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 隐性剪接供体位点共有序列
<400> 10
tgagt 5
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 突变的剪接供体区域 (MSD-2KOv2)
<400> 11
ggggcggcga gtggagacta cgccaaaaat 30
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 突变的剪接供体区域 (MSD-2KOm5)
<400> 12
ggggaaggca acagataaat atgccttaaa at 32
<210> 13
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 主要剪接供体和隐蔽剪接供体区域核心序列
<400> 13
gtgagta 7
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 突变的剪接供体区域
<400> 14
aaggcaacag ataaatatgc ctt 23
<210> 15
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 示例性256U1 (U1_256) snRNA序列
<400> 15
taaggaccag cttctttggg agagaacaga cgcaggggcg ggagggaaaa agggagaggc 60
agacgtcact tccccttggc ggctctggca gcagattggt cggttgagtg gcagaaaggc 120
agacggggac tgggcaaggc actgtcggtg acatcacgga cagggcgact tctatgtaga 180
tgaggcagcg cagaggctgc tgcttcgcca cttgctgctt caccacgaag gagttcccgt 240
gccctgggag cgggttcagg accgctgatc ggaagtgaga atcccagctg tgtgtcaggg 300
ctggaaaggg ctcgggagtg cgcggggcaa gtgaccgtgt gtgtaaagag tgaggcgtat 360
gaggctgtgt cggggcagag gcccaagatc tcatttgccg tgcgcgcttg caggggagat 420
accatgatca cgaaggtggt tttcccaggg cgaggcttat ccattgcact ccggatgtgc 480
tgacccctgc gatttcccca aatgtgggaa actcgactgc ataatttgtg gtagtggggg 540
actgcgttcg cgctttcccc tggtttcaaa agtagactgt acgctaaggg tcatatcttt 600
ttttgttttg gtttgtgtct tggttggcgt cttaaatgtt aa 642
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 16
gaccagatct gagcc 15
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 17
atggctcaga tctggtc 17
<210> 18
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 18
tgggagctct ctggc 15
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 19
atgccagaga gctccca 17
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 20
taaagcttgc cttga 15
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 21
attcaaggca agcttta 17
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 22
tagagatccc tcaga 15
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 23
attctgaggg atctcta 17
<210> 24
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 24
gcagtggcg 9
<210> 25
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 25
atcgccactg c 11
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 26
agtggcgccc gaaca 15
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 27
attgttcggg cgccact 17
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 28
gggacttgaa agcga 15
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 29
attcgctttc aagtccc 17
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 30
aagggaaacc agagg 15
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 31
atcctctggt ttccctt 17
<210> 32
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 32
ggactcggct tgctg 15
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 33
atcagcaagc cgagtcc 17
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 34
aagcgcgcac ggcaa 15
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 35
atttgccgtg cgcgctt 17
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 36
gaggcgaggg gcggc 15
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 37
atgccgcccc tcgcctc 17
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 38
gactggtgag tacgc 15
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 39
atgcgtactc accagtc 17
<210> 40
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 40
aattttgact a 11
<210> 41
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 41
atgtcaaaat t 11
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 42
aattttgact agcgg 15
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 43
atccgctagt caaaatt 17
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 44
gcggaggcta gaagg 15
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 45
atccttctag cctccgc 17
<210> 46
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 46
agagagatgg gtgcg 15
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 47
atcgcaccca tctctct 17
<210> 48
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 48
agagcgtcgg tatta 15
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 49
attaatactg acgctct 17
<210> 50
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 50
agcgggggag aatta 15
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 51
attaattctc ccccgct 17
<210> 52
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 52
gatcgcgatg ggaaa 15
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 53
attttcccat cgcgatc 17
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 54
aaattcggtt aaggc 15
<210> 55
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 55
atgccttaac cgaattt 17
<210> 56
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 56
gatcttcaga cctgg 15
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 57
atccaggtct gaagatc 17
<210> 58
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 58
ttacacaagc ttaat 15
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 59
atattaagct tgtgtaa 17
<210> 60
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 60
tagtagacat aatag 15
<210> 61
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 61
atctattatg tctacta 17
<210> 62
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 对照U1 snRNA靶序列
<400> 62
ctacaggaa 9
<210> 63
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 63
atttcctgta g 11
<210> 64
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 对照U1 snRNA靶序列
<400> 64
tcatctgtg 9
<210> 65
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 65
atcacagatg a 11
<210> 66
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经修饰的U1 snRNA序列 (U1_256序列的主要U1 snRNA序列[三叶草叶]
(nt 410-562) )
<400> 66
gcaggggaga taccatgatc acgaaggtgg ttttcccagg gcgaggctta tccattgcac 60
tccggatgtg ctgacccctg cgatttcccc aaatgtggga aactcgactg cataatttgt 120
ggtagtgggg gactgcgttc gcgctttccc ctg 153
<210> 67
<211> 673
<212> DNA
<213> 1型人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus type 1）
<400> 67
gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60
ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120
tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180
agtggcgccc gaacagggac ctgaaagcga aagggaaacc agaggagctc tctcgacgca 240
ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc 300
caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta 360
agcgggggag aattagatcg atgggaaaaa attcggttaa ggccaggggg aaagaaaaaa 420
tataaattaa aacatatagt atgggcaagc agggagctag aacgattcgc agttaatcct 480
ggcctgttag aaacatcaga aggctgtaga caaatactgg gacagctaca accatccctt 540
cagacaggat cagaagaact tagatcatta tataatacag tagcaaccct ctattgtgtg 600
catcaaagga tagagataaa agacaccaag gaagctttag acaagataga ggaagagcaa 660
aacaaaagta aga 673
<210> 68
<211> 996
<212> DNA
<213> 2型人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus type 2）
<400> 68
cagtcgctct gcggagaggc tggcagatcg agccctgaga ggttctctcc agcactagca 60
ggtagagcct gggtgttccc tgctggactc tcaccagtac ttggccggta ctgggcagac 120
ggctccacgc ttgcttgctt aaagacctct tcaataaagc tgccagttag aagcaagtta 180
agtgtgtgtt cccatctctc ctagtcgccg cctggtcatt cggtgttcat ctgagtaaca 240
agaccctggt ctgttaggac ccttctcgct ttgggaatcc aaggcaggaa aatccctagc 300
aggttggcgc ccgaacaggg acttgaagag gactgagaag ccctggaact cggctgagtg 360
aaggcagtaa gggcggcagg aacaaaccac gacggagtgc tcctagaaag gcgcgggccg 420
aggtaccaaa ggcggcgtgt ggagcgggag tgaaagaggc ctccgggtga aggtaagtac 480
ctacaccaaa aactgtagcc agaaaaggct tgttatccta cctttagaca ggtagaagat 540
tgtgggagat gggcgcgaga aactccgtct tgagagggaa aaaagcagac gaattagaaa 600
aagttaggtt acggcccggc ggaaagaaaa agtacaggtt aaaacatatt gtgtgggcag 660
cgaatgaatt ggataaattc ggattggcag agagcctgtt ggagtcaaaa gaaggttgcc 720
aaaagattct cagagtttta gatccattag taccaacagg gtcagaaaat ttaaaaagcc 780
tttttaatac cgtctgcgtc atttggtgct tgcacgcaga agagaaagtg aaagatactg 840
aggaagcaaa gaaactagca cagagacatc tagtggcaga aactggaact gcagagaaaa 900
tgccaaatac aagtagacca acagcaccac ctagtgggaa aagaggaaac taccccgtgc 960
aacaagcggg tggcaactat gtccatgtgc cactga 996
<210> 69
<211> 630
<212> DNA
<213> 马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus）
<400> 69
gggactcaga ttctgcggtc tgagtccctt ctctgctggg ctgaaaaggc ctttgtaata 60
aatataattc tctactcagt ccctgtctct agtttgtctg ttcgagatcc tacagttggc 120
gcccgaacag ggacctgaga ggggcgcaga ccctacctgt tgaacctggc tgatcgtagg 180
atccccggga cagcagagga gaacttacag aagtcttctg gaggtgttcc tggccagaac 240
acaggaggac aggtaagatg ggagaccctt tgacatggag caaggcgctc aagaagttag 300
agaaggtgac ggtacaaggg tctcagaaat taactactgg taactgtaat tgggcgctaa 360
gtctagtaga cttatttcat gataccaact ttgtaaaaga aaaggactgg cagctgaggg 420
atgtcattcc attgctggaa gatgtaactc agacgctgtc aggacaagaa agagaggcct 480
ttgaaagaac atggtgggca atttctgctg taaagatggg cctccagatt aataatgtag 540
tagatggaaa ggcatcattc cagctcctaa gagcgaaata tgaaaagaag actgctaata 600
aaaagcagtc tgagccctct gaagaatatc 630
<210> 70
<211> 781
<212> DNA
<213> 猿猴免疫缺陷病毒（ Simian immunodeficiency virus）
<400> 70
cagtctctta ctaggagacc agcttgagcc tgggtgttcg ctggttagcc taacctggtt 60
ggccaccagg ggtaaggact ccttggctta gaaagctaat aaacttgcct gcattagagc 120
ttatctgagt caagtgtcct cattgacgcc tcactctctt gaacgggaat cttccttact 180
gggttctctc tctgacccag gcgagagaaa ctccagcagt ggcgcccgaa cagggacttg 240
agtgagagtg taggcacgta cagctgagaa ggcgtcggac gcgaaggaag cgcggggtgc 300
gacgcgacca agaaggagac ttggtgagta ggcttctcga gtgccgggaa aaagctcgag 360
cctagttaga ggactaggag aggccgtagc cgtaactact ctgggcaagt agggcaggcg 420
gtgggtacgc aatgggggcg gctacctcag cactaaatag gagacaatta gaccaatttg 480
agaaaatacg acttcgcccg aacggaaaga aaaagtacca aattaaacat ttaatatggg 540
caggcaagga gatggagcgc ttcggcctcc atgagaggtt gttggagaca gaggaggggt 600
gtaaaagaat catagaagtc ctctaccccc tagaaccaac aggatcggag ggcttaaaaa 660
gtctgttcaa tcttgtgtgc gtactatatt gcttgcacaa ggaacagaaa gtgaaagaca 720
cagaggaagc agtagcaaca gtaagacaac actgccatct agtggaaaaa gaaaaaagtg 780
c 781
<210> 71
<211> 865
<212> DNA
<213> 猿猴免疫缺陷病毒（ Simian immunodeficiency virus）
<400> 71
cagtcgctct gcggagaggc tggcagattg agccctggga ggttctctcc agcactagca 60
ggtagagcct gggtgttccc tgctagactc tcaccagcac ttggccagtg ctgggcagag 120
tggctccacg cttgcttgct taaagacctc ttcaataaag ctgccatttt agaagtaagc 180
cagtgtgtgt tcccatctct cctagtcgcc gcctggtcaa ctcggtactc ggtaataaga 240
agaccctggt ctgttaggac cctttctgct ttgagaaacc gaagcaggaa aatccctagc 300
agattggcgc ccgaacagga cttgaaggag agtgagagac tcctgagtac ggctgagtga 360
aggcagtaag ggcggcagga accaaccacg acggagtgct cctataaagg cgcgggtcgg 420
taccagacgg cgtgaggagc gggagaggag gaggcctccg gttgcaggta agtgcaacac 480
aaaaaagaaa tagctgtctt gttatccagg aagggataat aagatagagt gggagatggg 540
cgcgagaaac tccgtcttgt cagggaagaa agcagatgaa ttagaaaaaa ttaggctacg 600
acccggcgga aagaaaaagt acatgttgaa gcatgtagta tgggcagcaa atgaattaga 660
tagatttgga ttagcagaaa gcctgttgga gaacaaagaa ggatgtcaaa aaatactttc 720
ggtcttagct ccattagtgc caacaggctc agaaaattta aaaagccttt ataatactgt 780
ctgcgtcatc tggtgcattc acgcagaaga gaaagtgaaa cacactgagg aagcaaaaca 840
gatagtgcag agacacctag tggtg 865
<210> 72
<211> 764
<212> DNA
<213> 猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus）
<400> 72
gagtctcttt gttgaggact tttgagttct cccttgaggc tcccacagat acaataaata 60
tttgagattg aaccctgtcg agtatctgtg taatcttttt tacctgtgag gtctcggaat 120
ccgggccgag aacttcgcag ttggcgcccg aacagggact tgattgagag tgattgagga 180
agtgaagcta gagcaataga aagctgttaa gcagaactcc tgctgaccta aatagggaag 240
cagtagcaga cgctgctaac agtgagtatc tctagtgaag cggactcgag ctcataatca 300
agtcattgtt taaaggccca gataaattac atctggtgac tcttcgcgga ccttcaagcc 360
aggagattcg ccgagggaca gtcaacaagg taggagagat tctacagcaa catggggaat 420
ggacaggggc gagattggaa aatggccatt aagagatgta gtaatgttgc tgtaggagta 480
ggggggaaga gtaaaaaatt tggagaaggg aatttcagat gggccattag aatggctaat 540
gtatctacag gacgagaacc tggtgatata ccagagactt tagatcaact aaggttggtt 600
atttgcgatt tacaagaaag aagagaaaaa tttggatcta gcaaagaaat tgatatggca 660
attgtgacat taaaagtctt tgcggtagca ggacttttaa atatgacggt gtctactgct 720
gctgcagctg aaaatatgta ttctcaaatg ggattagaca ctag 764
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 73
agctctctcg acgca 15
<210> 74
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 74
attgcgtcga gagagct 17
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LV基因组中的靶标
<400> 75
ctgaagcgcg cacggcaaga g 21
<210> 76
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 76
atttgccgtg cgcgctt 17
<210> 77
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 77
atgccgtgcg cgct 14
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 78
aggccgtgcg cgctt 15
<210> 79
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 79
caagccgtgc gcgctt 16
<210> 80
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 80
acgccgtgcg cgctt 15
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 81
gggccgtgcg cgctt 15
<210> 82
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 82
gagccgtgcg cgctt 15
<210> 83
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 83
gtgccgtgcg cgct 14
<210> 84
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 84
gcgccgtgcg cgctt 15
<210> 85
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 85
tggccgtgcg cgctt 15
<210> 86
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 86
cggccgtgcg cgctt 15
<210> 87
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 87
cccgccgtgc gcgctt 16
<210> 88
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 88
gccgtgcgcg ctt 13
<210> 89
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 89
gacgtgcgcg cttc 14
<210> 90
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 90
gtcgtgcgcg cttc 14
<210> 91
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 变体 256U1靶序列
<400> 91
ggcgtgcgcg cttc 14
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1启动子转录起始位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(22)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 92
atctcatnnn nnnnnnnnnn nn 22
<210> 93
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 93
cagcaagccg agt 13
<210> 94
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 94
atactcggct tgctg 15
<210> 95
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 95
tcggcttgct gaa 13
<210> 96
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 96
attcagcaag ccga 14
<210> 97
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 97
ggcttgctga agc 13
<210> 98
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 98
atgcttcagc aagcc 15
<210> 99
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 99
cttgctgaag cgc 13
<210> 100
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 100
atgcgcttca gcaag 15
<210> 101
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 101
tgctgaagcg cgc 13
<210> 102
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 102
atgcgcgctt cagca 15
<210> 103
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 103
ctgaagcgcg cac 13
<210> 104
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 104
atgtgcgcgc ttcag 15
<210> 105
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 105
gaagcgcgca cgg 13
<210> 106
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 106
atccgtgcgc gcttc 15
<210> 107
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 107
aagcgcgcac ggcaa 15
<210> 108
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 108
atttgccgtg cgcgctt 17
<210> 109
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 109
cgcgcacggc aag 13
<210> 110
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 110
atcttgccgt gcgcg 15
<210> 111
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 111
cgcacggcaa gag 13
<210> 112
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 112
atctcttgcc gtgcg 15
<210> 113
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 113
cacggcaaga ggc 13
<210> 114
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 114
atgcctcttg ccgtg 15
<210> 115
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 115
cggcaagagg cga 13
<210> 116
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 116
atcgcctctt gccg 14
<210> 117
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 117
gcaagaggcg agg 13
<210> 118
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 118
atcctcgcct cttgc 15
<210> 119
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-1靶序列
<400> 119
aagaggcgag ggg 13
<210> 120
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 120
atcccctcgc ctctt 15
<210> 121
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 121
aattctctac tcagt 15
<210> 122
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 122
atactgagta gagaatt 17
<210> 123
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 123
agtttgtctg ttcga 15
<210> 124
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 124
attcgaacag acaaact 17
<210> 125
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 125
cgcccgaaca gggac 15
<210> 126
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 126
atgtccctgt tcgggcg 17
<210> 127
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 127
accctacctg ttgaa 15
<210> 128
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 128
atttcaacag gtagggt 17
<210> 129
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 129
cctggctgat cgtag 15
<210> 130
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 130
atctacgatc agccagg 17
<210> 131
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 131
gatccccggg acagc 15
<210> 132
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 132
atgctgtccc ggggatc 17
<210> 133
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 133
gaggagaact tacag 15
<210> 134
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 134
atctgtaagt tctcctc 17
<210> 135
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 135
aagtcttctg gaggt 15
<210> 136
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 136
atacctccag aagactt 17
<210> 137
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 137
ttcctggcca gaaca 15
<210> 138
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 138
attgttctgg ccaggaa 17
<210> 139
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 139
caggaggaca ggtaa 15
<210> 140
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 140
atttacctgt cctcctg 17
<210> 141
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 141
ttgggagacc ctttg 15
<210> 142
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 142
atcaaagggt ctcccaa 17
<210> 143
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> EIAV靶序列
<400> 143
gcgctcaaga agtta 15
<210> 144
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 144
attaacttct tgagcgc 17
<210> 145
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 145
cttggcttag aaagc 15
<210> 146
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 146
atgctttcta agccaag 17
<210> 147
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 147
ctgcattaga gctta 15
<210> 148
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 148
attaagctct aatgcag 17
<210> 149
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 149
aagtgtcctc attga 15
<210> 150
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 150
attcaatgag gacactt 17
<210> 151
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 151
tctcttgaac gggaa 15
<210> 152
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 152
atttcccgtt caagaga 17
<210> 153
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 153
ccttactggg ttctc 15
<210> 154
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 154
atgagaaccc agtaagg 17
<210> 155
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 155
gacccaggcg agaga 15
<210> 156
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 156
attctctcgc ctgggtc 17
<210> 157
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 157
gtggcgcccg aacag 15
<210> 158
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 158
atctgttcgg gcgccac 17
<210> 159
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 159
ggacttgagt gagag 15
<210> 160
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 160
atctctcact caagtcc 17
<210> 161
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 161
tgtaggcacg tacag 15
<210> 162
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 162
atctgtacgt gcctaca 17
<210> 163
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 163
tgagaaggcg tcgga 15
<210> 164
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 164
attccgacgc cttctca 17
<210> 165
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 165
cgaaggaagc gcggg 15
<210> 166
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 166
atcccgcgct tccttcg 17
<210> 167
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 167
tgcgacgcga ccaag 15
<210> 168
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 168
atcttggtcg cgtcgca 17
<210> 169
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 169
aaggagactt ggtga 15
<210> 170
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 170
attcaccaag tctcctt 17
<210> 171
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 171
aggcttctcg agtgc 15
<210> 172
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 172
atgcactcga gaagcct 17
<210> 173
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 173
aagctcgagc ctagt 15
<210> 174
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 174
atactaggct cgagctt 17
<210> 175
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 175
aggactagga gaggc 15
<210> 176
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 176
atgcctctcc tagtcct 17
<210> 177
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 177
gtagccgtaa ctact 15
<210> 178
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 178
atagtagtta cggctac 17
<210> 179
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SIVagm靶序列
<400> 179
gcaggcggtg ggtac 15
<210> 180
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA靶退火序列
<400> 180
atgtacccac cgcctgc 17
<210> 181
<211> 164
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> U1 snRNA分子
<400> 181
auacuuaccu ggcaggggag auaccaugau cacgaaggug guuuucccag ggcgaggcuu 60
auccauugca cuccggaugu gcugaccccu gcgauuuccc caaauguggg aaacucuacu 120
gcauaauuug ugguaguggg ggacugcguu cgcgcuuucc ccug 164
<210> 182
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 70K野生型序列
<400> 182
ugaucacgaa gu 12
<210> 183
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 70K m1序列
<400> 183
uugacacgaa uu 12
<210> 184
<211> 12
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 70K m2序列
<400> 184
acuagugcuu cc 12
<210> 185
<211> 10
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Sm野生型序列
<400> 185
auaauuugug 10
<210> 186
<211> 172
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经修饰的U1A5 snRNA变体序列
<400> 186
auggccaguu ggcagaguga ucagaacaca cauaacauuu auugaugaag uuugcuaccu 60
ugggcuuauc cauugcacuc uggaugugcu gaccccugca auuuuccaca aaugugagaa 120
acuugacugc auaauuuaug guagugggag gcugcguuug cacucucccc ug 172
<210> 187
<211> 166
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经修饰的U1A6 snRNA变体序列
<400> 187
augucuucgu ggcgggggag agacgcuguu gguccugaua aaguguuuuu cuugggggag 60
gguuuuuacu uuguguuugg gauguguuug cucccgcgau uuccccgaau gagaaaacuc 120
ggcugcauaa cuugugguag ugggggacug cuuuugcgcu uuucug 166
<210> 188
<211> 165
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经修饰的U1A7 snRNA变体序列
<400> 188
auacuuaacu ggcaagggaa auaacaugau cauuaaaggu ggauuuuuca gggugagguu 60
ugucucuugc auuguggaug ugcugacccc ugugguuuuc uacaaaugug ggaaacuuaa 120
uugcauaauu ugugguagug gggacuaugu ugguucucuc cccug 165
<210> 189
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 茎环 2序列突变，ΔSL2
<400> 189
ggggcgcaaa aat 13
<210> 190
<211> 170
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 256U1 snRNA分子序列
<400> 190
auuugccgug cgcgcuucua ggggagauac caugaucacg aaggugguuu ucccagggcg 60
aggcuuaucc auugcacucc ggaugugcug accccugcga uuuccccaaa ugugggaaac 120
ucgacugcau aauuuguggu agugggggac ugcguucgcg cuuuccccug 170
<210> 191
<211> 124
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 191
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 192
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 192
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Arg Ser

Claims (62)

1.一种经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1 snRNA被修饰以结合慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1 snRNA被修饰以引入与所述核苷酸序列互补的异源序列。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1 snRNA在5'端被修饰以在位置3至11处的九个核苷酸内引入所述异源序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1 snRNA在5'端被修饰以在天然剪接供体退火序列内引入所述异源序列。
5.根据权利要求4所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述天然剪接供体退火序列的1至9个核酸被替换为所述异源序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1 snRNA在5'端被修饰以将包含天然剪接供体退火序列的序列替换为与所述核苷酸序列互补的异源序列。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述异源序列包含至少9个与所述核苷酸序列互补的核苷酸。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述异源序列包含15个与所述核苷酸序列互补的核苷酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述慢病毒载体基因组序列的包装区域从5'U5结构域开始到源自gag基因的序列的末端。
10.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述核苷酸序列位于5'U5结构域、PBS元件、SL1元件、SL2元件、SL3ψ元件、SL4元件和/或源自gag基因的序列内。
11.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述核苷酸序列位于SL1、SL2和/或SL3ψ元件内。
12.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述核苷酸序列位于SL1和/或SL2元件内。
13.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述核苷酸序列位于SL1元件内。
14.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1snRNA是经修饰的U1A snRNA或经修饰的U1A snRNA变体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述经修饰的U1snRNA的5'端的前两个核苷酸不是AU。
16.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒。
17.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2或EIAV。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的经修饰的U1 snRNA，其中所述慢病毒载体源自SIV。
19.一种表达盒，其包含编码根据权利要求1至18中任一项所述的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
20.一种用于生产慢病毒载体的细胞，其包含编码载体组分的核苷酸序列、以及至少一个编码根据权利要求1至18中任一项所述的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列，所述载体组分包括慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组。
21.一种细胞，其包含根据权利要求1至18中任一项所述的经修饰的U1 snRNA的细胞。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞还包含编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的细胞，其中所述细胞进一步包含编码目的核苷酸的核苷酸序列。
24.根据权利要求23所述的细胞，其中所述目的核苷酸产生治疗效果。
25.根据权利要求24所述的细胞，其中所述目的核苷酸编码酶、辅因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、嵌合抗原受体、靶蛋白的跨结构域阴性突变体、毒素、条件性毒素、抗原、转录因子、结构蛋白、报告蛋白、亚细胞定位信号、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、受体、血管活性蛋白或肽、抗病毒蛋白或核酶、或其衍生物、或微RNA。
26.根据权利要求25所述的细胞，其中所述目的核苷酸编码可用于治疗选自以下疾病的分子：
(i)能对以下作出响应的疾病：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如，用于治疗包括感染人免疫缺陷病毒之类的免疫缺陷；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫疾病，以及预防移植排斥或诱导肿瘤免疫性)；造血作用的调节(例如骨髓或淋巴疾病的治疗)；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长(例如，用于愈合伤口，治疗烧伤、溃疡和牙周疾病，以及神经退化)；卵泡刺激激素的抑制或激活(生育力的调节)；趋化性/化学促进活性(例如用于将特定细胞类型调动到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如脓毒性休克或克罗恩病)；巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性、以及由此而来的抗炎活性；抗免疫活性(即，对细胞和/或体液免疫应答、包括与炎症不相关的应答的抑制作用)；抑制巨噬细胞和T细胞粘附于胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及T细胞中的上调的fas受体表达；
(ii)恶性疾病，包括癌症；白血病；良性和恶性肿瘤生长、侵入和扩散、血管生成、转移；腹水和恶性胸腔积液；
(iii)自身免疫性疾病，包括关节炎、过敏症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其他疾病，所述关节炎包括类风湿性关节炎；
(vi)血管疾病，包括动脉硬化症、动脉硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征、心血管效应、外周血管病、偏头痛和阿斯匹林依赖性抗血栓形成症、中风、大脑局部缺血、缺血性心脏病或其他疾病；
(v)胃肠道的疾病，包括消化性溃疡、溃疡性结肠炎、克罗恩病和其他疾病；
(vi)肝病，包括肝纤维化、肝硬化；
(vii)遗传性代谢障碍，包括苯丙酮尿症PKU、威尔逊病、有机酸血症、尿素循环障碍、胆汁淤积和其他疾病；
(viii)肾病和泌尿疾病，包括甲状腺炎或其他腺体疾病、血管球性肾炎或其他疾病；
(ix)耳、鼻和喉疾病，包括耳炎或其他耳鼻喉疾病、皮炎或其他皮肤疾病；
(x)牙齿和口腔疾病，包括牙周病、牙周炎、齿龈炎或其他牙齿/口腔疾病；
(xi)睾丸疾病，包括睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其他睾丸疾病；
(xii)妇科疾病，包括胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、子痫前期、子宫内膜异位和其他妇科疾病；
(xiii)眼科疾病，例如包括LCA10等的莱伯先天性黑蒙(LCA)；后葡萄膜炎；中间葡萄膜炎；前葡萄膜炎；结膜炎；脉络视网膜炎；葡萄膜视网膜炎；视神经炎；青光眼，包括开角型青光眼和青少年先天性青光眼；眼内炎症，例如视网膜炎或囊样黄斑水肿；交感性眼炎；巩膜炎；色素性视网膜炎；黄斑变性，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)和青少年黄斑变性，包括贝斯特病、贝斯特卵黄样黄斑变性、斯特格氏病；尤塞氏综合征；多恩氏蜂窝状视网膜营养失调；Sorby黄斑营养失调；青年性视网膜劈裂症；视锥-视杆营养失调；角膜营养失调；Fuch营养失调；莱伯氏先天性黑内障；莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)；艾迪综合征；小口氏病；退行性眼底病；视觉损伤；由感染引起的眼睛炎症；增殖性玻璃体-视网膜病变；急性局部缺血性视神经病变；过度疤痕，例如在青光眼滤过手术后，对眼睛植入物的反应、角膜移植物移植排斥；和其他眼科疾病，例如糖尿病黄斑性水肿、视网膜静脉阻塞、RLBP1相关的视网膜营养失调、无脉络膜和色盲；
(xiv)神经疾病和神经退行性疾病，包括帕金森病、治疗帕金森病引起的并发症和/或副作用、AIDS相关痴呆综合症、HIV相关脑病、德维克病、西德纳姆舞蹈病、阿尔兹海默病和其他退行性疾病、CNS的病症或失调、中风、脊髓灰质炎后综合征、精神疾病、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、法布里病、戈谢病、胱氨酸病、庞贝氏病、异染性脑白质营养不良、Wiscott Aldrich综合征、肾上腺脑白质营养不良、β-地中海贫血、镰状细胞贫血病、格林-巴利综合征、西德纳姆舞蹈病、重症肌无力、大脑假性肿瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病、CNS压缩或CNS创伤或CNS的感染、肌肉萎缩和营养失调、中枢神经系统和外周神经系统的疾病、病症或失调、运动神经元疾病，包括肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、脊髓和撕裂损伤；以及
(xv)囊性纤维化；粘多糖贮积症，包括Sanfilipo综合征A、Sanfilipo综合征B、Sanfilipo综合征C、Sanfilipo综合征D、亨特综合征、Hurler-Scheie综合征、莫尔丘综合征；ADA-SCID；X相关的SCID；X相关的慢性肉芽肿病；卟啉症；血友病A；血友病B；外伤后炎症、出血、血凝固和急性期应答；恶病质；厌食症；急性感染；脓毒性休克；传染性疾病；糖尿病；手术的并发症或副作用；骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用；基因治疗的并发症和副作用，例如由于感染病毒载体、或者AIDS，以压制或抑制体液和/或细胞免疫应答，从而在天然或人工细胞、组织和器官如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织的移植的情况中用于预防和/或治疗移植排斥。
27.一种用于生产慢病毒载体的稳定或瞬时生产细胞，其包含至少一个编码根据权利要求1至18中任一项所述的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的细胞，其中所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2或EIAV。
30.根据权利要求28所述的细胞，其中所述慢病毒载体源自SIV。
31.一种生产慢病毒载体的方法，包括以下步骤：
a.将编码载体组分的核苷酸序列、以及至少一个编码根据权利要求1至15中任一项所述的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞中，所述载体组分包括所述慢病毒载体的gag、env、rev和RNA基因组；
b.任选地选择包含所述编码载体组分的核苷酸序列和至少一个经修饰的U1 snRNA的细胞；
c.在所述载体组分与所述经修饰的U1 snRNA共表达并且生产慢病毒载体的条件下培养细胞。
32.一种通过根据权利要求37至53中任一项所述的方法生产的慢病毒载体。
33.根据权利要求32所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒。
34.根据权利要求33所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2或EIAV。
35.根据权利要求33所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体源自SIV。
36.根据权利要求1至18中任一项所述的经修饰的U1 snRNA或根据权利要求14所述的表达盒用于生产慢病毒载体的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中所述慢病毒载体在所述慢病毒载体的RNA基因组中包含失活的主要剪接供体位点。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的用途，其中所述慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒。
39.根据权利要求20、22至26或28至30中任一项所述的细胞，根据权利要求27至30中任一项所述的稳定或瞬时生产细胞、或根据权利要求31所述的方法，其中在所述慢病毒载体的所述RNA基因组中的主要剪接供体位点失活。
40.根据权利要求39所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求37或权利要求38所述的用途，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的所述主要剪接供体位点和所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。
41.根据权利要求39所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求37或权利要求38所述的用途，其中所述慢病毒载体是第三代慢病毒载体。
42.根据权利要求39所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求37或权利要求38所述的用途，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的所述主要剪接供体位点失活，并且其中所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖tat的慢病毒载体。
43.根据权利要求39所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求37或权利要求38所述的用途，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的所述主要剪接供体位点失活，并且其中所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列是在不存在tat的情况下产生的。
44.根据权利要求39所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求37或权利要求38所述的用途，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的所述主要剪接供体位点失活，并且其中所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已不依赖tat转录。
45.根据权利要求39所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求37或权利要求38所述的用途，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的所述主要剪接供体位点失活，并且其中所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖U3的慢病毒载体。
46.根据权利要求39所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求37或权利要求38所述的用途，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的所述主要剪接供体位点失活，并且其中所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已不依赖U3启动子转录。
47.根据权利要求39所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求37或权利要求38所述的用途，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的所述主要剪接供体位点失活，并且其中所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已被异源启动子转录。
48.根据权利要求40至47中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、所述的方法或所述的用途，其中所述隐蔽剪接供体位点是位于主要剪接供体位点3'的第一个隐蔽剪接供体位点。
49.根据权利要求40至48中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、所述的方法或所述的用途，其中所述隐蔽剪接供体位点在所述主要剪接供体位点的6个核苷酸内。
50.根据权利要求39至49中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或47至49中任一项所述的用途，其中所述主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点突变或缺失。
51.根据权利要求39至50中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或47至50中任一项所述的用途，其中所述编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列在剪接位点失活前包括如SEQ ID NO：1、3、4、9、10和/或13中任一个所示的序列。
52.根据权利要求39至51中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或47至51中任一项所述的用途，其中所述编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列包括相对于SEQ ID NO：1、3、4、9、10和/或13中任一个所示的序列具有突变或缺失的序列。
53.根据权利要求39至52中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或47至52中任一项所述的用途，其中编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则该位点将在对应于SEQ ID NO：1的核苷酸13和14的核苷酸之间具有切割位点。
54.根据权利要求39至53中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或40至46中任一项所述的用途，其中所述主要剪接供体位点失活前的核苷酸序列包括如SEQ ID NO：4中所示的序列。
55.根据权利要求40至54中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、所述的方法或所述的用途，其中所述隐蔽剪接供体位点失活前的核苷酸序列包括如SEQ ID NO：10中所示的序列。
56.根据权利要求40至55中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、所述的方法或所述的用途，其中所述编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列包含失活的隐蔽剪接供体位点，否则该位点将具有对应于SEQ ID NO：1的核苷酸17和18的核苷酸之间的切割位点。
57.根据权利要求39至56中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或47至56中任一项所述的用途，其中所述编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列包括如SEQ ID NO：2、5、6、7、8、11、12和/或14中任一个所示的序列。
58.根据权利要求39至57中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或47至57中任一项所述的用途，其中所述编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列不包括如SEQ ID NO：9中所示的序列。
59.根据权利要求39至58中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或47至58中任一项所述的用途，其中来自所述慢病毒载体的RNA基因组的所述主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性被抑制或去除。
60.根据权利要求39至59中任一项所述的细胞、所述的稳定或瞬时生产细胞、或所述的方法、或根据权利要求38或47至59中任一项所述的用途，其中来自所述慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性在转染细胞或转导细胞中被抑制或去除。
61.根据权利要求20、22至26、28至30或39至60中任一项所述的细胞、根据权利要求27或39至60中任一项所述的稳定或瞬时生产细胞、根据权利要求38或39至60中任一项所述的方法、或根据权利要求38或40至60中任一项所述的用途，其中所述编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列能够连接至所述编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
62.一种在根据权利要求1至18中任一项所定义的经修饰的U1snRNA存在下生产的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包括在慢病毒载体的RNA基因组中的失活的主要剪接供体位点。
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