JP6636486B2 - ヒト化ジペプチジルペプチダーゼiv(dpp4)動物 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年5月30日出願の米国仮特許出願第62/005,476号、2014年9月17日出願の同第62/051,626号、及び2014年10月30日出願の同第62/072,692号に対する優先権を主張し、これらの各々の開示はそれらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。
ヒト配列を含むジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)タンパク質をコードする核酸配列を含む非ヒト動物。全体的に又は部分的にヒトであるDPP4遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物。ヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現する非ヒト動物。ヒト又はヒト化DPP4核酸配列を含む非ヒト動物を作製及び使用するための方法。
更に、非ヒト動物疾患モデルにおけるヒトDPP4特異的小分子、ペプチド、又はタンパク質(すなわち、生物学的)拮抗薬のインビボ治療有効性の評価は、種特異的拮抗薬が内在性Dpp4と相互作用しないある特定の非ヒト動物においては問題である。更に、ヒトDPP4タンパク質と特異的に相互作用する分子を標的とする小分子、ペプチド、又はタンパク質(すなわち、生物学的)拮抗薬のインビボ治療有効性の評価も、治療標的分子自体が内在性Dpp4タンパク質と相互作用しないある特定の非ヒト動物においては問題である。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
内在性げっ歯類Dpp4遺伝子のヒト化を含むげっ歯類であって、前記ヒト化が、改変DPP4遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座での、Dpp4遺伝子のエクソンをコードするげっ歯類遺伝子の、ヒトDPP4遺伝子の少なくとも1個のエクソンをコードする核酸配列での置換を含み、前記改変DPP4遺伝子の発現が、前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座でげっ歯類調節エレメントの制御下にある、げっ歯類。
(項目2)
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目1に記載のげっ歯類。
(項目3)
ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子が、前記ヒトDPP4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、項目1に記載のげっ歯類。
(項目4)
前記ヒト化DPP4タンパク質が、前記ヒトDPP4タンパク質の細胞外ドメインを含む、項目3に記載のげっ歯類。
(項目5)
前記ヒト化DPP4タンパク質が、マウスDpp4タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む、項目4に記載のげっ歯類。
(項目6)
前記げっ歯類が、マウスDpp4タンパク質を発現することができないマウスである、項目1に記載のげっ歯類。
(項目7)
前記げっ歯類がマウスであり、マウスDpp4のエクソン2からエクソン26をコードするマウスDpp4配列の連続したゲノム断片が、ヒトDPP4のエクソン2からエクソン26をコードするヒトDPP4配列の連続したゲノム断片で置換されている、項目1に記載のげっ歯類。
(項目8)
前記げっ歯類が、T細胞の表面上にヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現するマウスであり、血中に存在するT細胞の量が、機能的内在性マウスDpp4タンパク質を発現するが、前記置換を含まない同齢のマウスの血中に存在するT細胞の量の少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、又は200%である、項目1に記載のげっ歯類。
(項目9)
前記げっ歯類が、T細胞の表面上にヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現するマウスであり、血中に存在するT細胞の量が、機能的内在性Dpp4タンパク質を発現するが、前記置換を含まない同齢のマウスの血中に存在するT細胞の量の約20%〜約200%、約40%〜約160%、又は約80%〜約120%である、項目1に記載のげっ歯類。
(項目10)
前記げっ歯類が、機能的内在性マウスDpp4タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスのT細胞の表面上に存在するマウスDpp4タンパク質のレベルの少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、又は200%のレベルで、T細胞の表面上にヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現するマウスである、項目1に記載のげっ歯類。
(項目11)
前記げっ歯類が、機能的内在性Dpp4タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスのT細胞の表面上に存在するマウスDpp4タンパク質のレベルの約20%〜約200%、約40%〜約160%、又は約80%〜約120%のレベルで、T細胞の表面上にヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現するマウスである、項目1に記載のげっ歯類。
(項目12)
前記げっ歯類が、機能的内在性マウスDpp4タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスの胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び膵臓からなる群から選択される1つ以上の組織の表面上に存在するマウスDpp4タンパク質のレベルの少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、又は200%のレベルで、前記1つ以上の組織の細胞の表面上にヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現するマウスである、項目1に記載のげっ歯類。
(項目13)
前記げっ歯類が、機能的内在性Dpp4タンパク質を発現するが前記置換を含まない同齢のマウスの胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び膵臓からなる群から選択される1つ以上の組織の表面上に存在するマウスDpp4タンパク質のレベルの約20%〜約200%、約40%〜約160%、又は約80%〜約120%のレベルで、前記1つ以上の組織の細胞の表面上にヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現するマウスである、項目1に記載のげっ歯類。
(項目14)
前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子の前記ヒト化がヘテロ接合性である、項目1から13のいずれか一項に記載のげっ歯類。
(項目15)
前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子の前記ヒト化がホモ接合性である、項目1から13のいずれか一項に記載のげっ歯類。
(項目16)
げっ歯類Dpp4タンパク質をコードするげっ歯類Dpp4遺伝子配列を、ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードするヒトDPP4遺伝子配列の1個以上のエクソンを含む前記ヒトDPP4遺伝子配列で置換することを含む、ヒト化げっ歯類を作製するための方法であって、前記置換が、内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子配列の1個以上のエクソンを含む前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座でげっ歯類調節エレメント又は配列に作動可能に連結されている、方法。
(項目17)
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記げっ歯類調節エレメント又は配列が、マウス又はラット由来である、項目16に記載の方法。
(項目19)
前記げっ歯類調節エレメント又は配列が、前記げっ歯類Dpp4遺伝子座での内在性げっ歯類調節エレメント又は配列である、項目16に記載の方法。
(項目20)
前記げっ歯類Dpp4遺伝子配列を置換する前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記ヒトDPP4遺伝子配列の少なくとも1個のエクソンを含む、項目16に記載の方法。
(項目21)
前記げっ歯類Dpp4遺伝子配列を置換する前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記ヒトDPP4遺伝子配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20、21、22、23、24、又は25個のエクソンを含む、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記げっ歯類Dpp4遺伝子配列を置換する前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記ヒトDPP4遺伝子配列の26個全てのエクソンを含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記げっ歯類Dpp4遺伝子配列を置換する前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記ヒトDPP4タンパク質の細胞外ドメインをコードする前記ヒトDPP4遺伝子配列の少なくとも1個のエクソンを含む、項目16に記載の方法。
(項目24)
前記げっ歯類Dpp4遺伝子配列を置換する前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記ヒトDPP4タンパク質の前記細胞外ドメインをコードする前記ヒトDPP4遺伝子配列の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20、21、22、又は23個のエクソンを含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記げっ歯類Dpp4遺伝子配列を置換する前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記ヒトDPP4タンパク質の前記細胞外ドメインをコードする前記ヒトDPP4遺伝子配列の24個全てのエクソンを含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記置換が内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子配列の1個以上のエクソンを含む前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座で内在性げっ歯類調節エレメント又は配列に作動可能に連結されている、項目17に記載の方法。
(項目27)
前記げっ歯類が、前記ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子配列の1個以上のエクソンを含む前記ヒトDPP4遺伝子配列についてヘテロ接合性である、項目16から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記げっ歯類が、前記ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子配列の1個以上のエクソンを含む前記ヒトDPP4遺伝子配列についてホモ接合性である、項目16から26のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
マウスDpp4タンパク質をコードするマウスDpp4遺伝子配列を、ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードするヒトDPP4遺伝子で置換することを含む、ヒト化DPP4マウスを作製するための方法。
(項目30)
前記置換が内在性マウスDpp4遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子がマウス調節配列に作動可能に連結されている、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記置換が内在性マウスDpp4遺伝子座においてであり、ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子が内在性マウス調節配列に作動可能に連結されている、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記マウスが、前記ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子についてヘテロ接合性である、項目29から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記マウスが、前記ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする前記ヒトDPP4遺伝子についてホモ接合性である、項目29から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
ヒトDPP4遺伝子又はその断片を含む核酸配列を含むげっ歯類であって、前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片が、前記ヒトDPP4遺伝子の少なくとも1個のエクソンを含み、前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片が、ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする、げっ歯類。
(項目35)
前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片が、前記ヒトDPP4遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20、21、22、23、24、又は25個のエクソンを含む、項目34に記載のげっ歯類。
(項目36)
前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片が、前記ヒトDPP4遺伝子の26個全てのエクソンを含む、項目34に記載のげっ歯類。
(項目37)
前記核酸配列が、前記ヒトDPP4遺伝子の5’隣接領域を更に含む、項目34に記載のげっ歯類。
(項目38)
前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片が、前記ヒトDPP4遺伝子の前記5’隣接領域に作動可能に連結されている、項目37に記載のげっ歯類。
(項目39)
前記ヒトDPP4遺伝子の前記5’隣接領域が、長さで少なくとも10kbを含む、項目38に記載のげっ歯類。
(項目40)
前記ヒトDPP4遺伝子の前記5’隣接領域が、長さで少なくとも40kbを含む、項目39に記載のげっ歯類。
(項目41)
前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片の発現が、前記ヒトDPP4遺伝子の前記5’隣接領域の制御下にある、項目38に記載のげっ歯類。
(項目42)
前記ヒト又はヒト化DPP4タンパク質が、配列番号24のアミノ酸配列又はその断片を含む、項目34に記載のげっ歯類。
(項目43)
前記げっ歯類が、機能的内在性げっ歯類Dpp4タンパク質を発現するが、前記ヒトDPP4遺伝子もその断片も含まない同齢のげっ歯類のT細胞の表面上に存在するげっ歯類Dpp4タンパク質のレベルの少なくとも約20%のレベルで、T細胞の表面上に前記ヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現する、項目38に記載のげっ歯類。
(項目44)
前記げっ歯類が、機能的内在性げっ歯類Dpp4タンパク質を発現するが、前記ヒトDPP4遺伝子もその断片も含まない同齢のげっ歯類の胎盤、腎臓、肺、肝臓、骨格筋、心臓、脳、及び膵臓からなる群から選択される1つ以上の組織の表面上に存在するげっ歯類Dpp4タンパク質のレベルの少なくとも約20%のレベルで、前記1つ以上の組織の細胞の表面上に前記ヒト又はヒト化DPP4タンパク質を発現する、項目38に記載のげっ歯類。
(項目45)
前記げっ歯類が、機能的内在性げっ歯類Dpp4タンパク質を発現する、項目34に記載のげっ歯類。
(項目46)
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目34に記載のげっ歯類。
(項目47)
前記げっ歯類が、前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片についてヘテロ接合性である、項目34から46のいずれか一項に記載のげっ歯類。
(項目48)
前記げっ歯類が、前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片についてホモ接合性である、項目34から46のいずれか一項に記載のげっ歯類。
(項目49)
ヒトDPP4遺伝子配列の1個以上のエクソンを含む核酸配列をげっ歯類の染色体に組み込むことを含む、ヒト化トランスジェニックげっ歯類を作製するための方法であって、前記ヒトDPP4遺伝子配列の前記1個以上のエクソンが、ヒト又はヒト化DPP4タンパク質をコードする、方法。
(項目50)
前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片が、前記ヒトDPP4遺伝子の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、18、20、21、22、23、24、又は25個のエクソンを含む、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記ヒトDPP4遺伝子又はその断片が、前記ヒトDPP4遺伝子の26個全てのエクソンを含む、項目49に記載の方法。
(項目52)
前記核酸配列が、前記ヒトDPP4遺伝子の5’隣接領域を更に含む、項目49に記載の方法。
(項目53)
前記ヒトDPP4遺伝子配列が、前記ヒトDPP4遺伝子の前記5’隣接領域に作動可能に連結されている、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記ヒト又はヒト化DPP4タンパク質が、配列番号24のアミノ酸配列又はその断片を含む、項目49に記載の方法。
(項目55)
前記げっ歯類がマウス又はラットである、項目49に記載の方法。
(項目56)
前記げっ歯類が、ヒトDPP4遺伝子配列の1個以上のエクソンを含む前記核酸配列についてヘテロ接合性である、項目49から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記げっ歯類が、ヒトDPP4遺伝子配列の1個以上のエクソンを含む前記核酸配列についてホモ接合性である、項目49から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
項目1から15又は34から48のいずれか一項に記載のげっ歯類におけるヒト特異的DPP4拮抗薬のインビボ治療有効性を決定するための方法であって、
(a)前記げっ歯類にDPP4拮抗薬を投与することであって、前記げっ歯類が中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS−CoV)に感染している、投与することと、
(b)前記DPP4拮抗薬が、前記DPP4拮抗薬が投与されていないMERS−CoVに感染している対照げっ歯類と比較して、MERS−CoV感染の1つ以上の症状を治療又は予防するかを決定することと、を含む、方法。
(項目59)
前記DPP4拮抗薬が、小分子、ペプチド、及び抗体からなる群から選択される、項目58に記載の方法。
(項目60)
前記DPP4拮抗薬が、MERS−CoVタンパク質に対する抗体である、項目58又は59に記載の方法。
(項目61)
前記MERS−CoVタンパク質が、MERS−CoVスパイクタンパク質である、項目60に記載の方法。
(項目62)
前記げっ歯類が、Al−Hasa_1、Al−Hasa_2、Al−Hasa_3、Al−Hasa_4、Al−Hasa_12、Al−Hasa_15、Al−Hasa_16、Al−Hasa_17、Al−Hasa_18、Al−Hasa_19、Al−Hasa_21、Al−Hasa_25、Buraidah_1、EMC/2012、FRA/UAE、Hafr−Al−Batin_1、Hafr−Al−Batin_2、Hafr−Al−Batin_6、Jeddah_1、Jordan−N3/2012、Munich、Riyadh_3、Riyadh_4、Riyadh_5、Riyadh_14、Taif_1、Wadi−Ad−Dawasir_1、Riyadh_9、KFU−HKU 1、KFU−HKU 13、Qatar3、Qatar4、England 1、England−Qatar/2012、Bisha_1、Riyadh_1、及びRiyadh_2からなる群から選択されるMERS−CoVの1つ以上の株に感染している、項目58から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記拮抗薬が、MERS−CoV感染前に投与される、項目58から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記拮抗薬が、MERS−CoV感染後に投与される、項目58から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
前記拮抗薬が、MERS−CoV感染と同時に投与される、項目58から62のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
MERS−CoV感染の前記症状が、ウイルス力価又はRNAレベルである、項目58から65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
ウイルス力価又はRNAレベルが、qPCR、ノーザンブロット、プラークアッセイ、及びインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される1つ以上の方法により査定される、項目66に記載の方法。
(項目68)
MERS−CoV感染の前記症状が、肺の炎症である、項目58から65のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
肺の炎症が、組織化学的に評価される、項目68に記載の方法。
(項目70)
MERS−CoV感染の前記症状が、体重減少である、項目58から65のいずれか一項に記載の方法。
DPP4遺伝子は、セリンエキソペプチダーゼ活性を有し、T細胞の活性化及びいくつかの他の細胞型における細胞内情報伝達カスケードにおいて重要な役割を果たす、II型膜貫通タンパク質、トリペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)(別名、CD26、アデノシンデアミナーゼ複合タンパク質−2(ADCP2)、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質(ADABP)、及びTP103)をコードする。
以下の実施例2に論じられるように、マウスではないヒトDPP4タンパク質は、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS−CoV)感染の機能的受容体である。
内因性非ヒトDpp4遺伝子又は断片のヒトDPP4遺伝子又は断片での標的置換の場合、標的構築物が生成される。例えば、Valenzuela et al.Nature Biotech,21.6(2003):652〜659、米国特許第6,586,251号、及び同第8,759,105号を参照されたい。例えば、標的構築物は、置換ヒトDPP4遺伝子又はその断片に隣接する相同アームを含む。
本発明のトランスジェニック非ヒト動物(例えば、げっ歯類、例えば、マウス又はラット)は、様々なベクター及び/又は構築物を使用して作製することができる。いくつかの実施形態では、標的構築物は、二本鎖DNAの円形片、例えば、細菌人工染色体(BAC)、プラスミド、又はP1誘導人工染色体(PAC)の形態である。
ヒト化DPP4げっ歯類、例えば、マウス又はラットは、高血糖症の治療に有用なヒト特異的DPP4拮抗薬、例えば、小分子、ペプチド、又は生物学的阻害剤の薬力動態(PD)の評価に有用である。
相同アミノ酸残基は、同様の特徴又は特性を共有する残基である。アミノ酸残基の特徴又は特性は、例えば、ポリペプチド主鎖の構造、例えば、シート若しくはらせん状立体構造、残基の電荷若しくは疎水性、及び/又は側鎖(複数可)のバルクに基づく。例えば、相同残基は、側鎖特性、例えば、極性、電荷、サイズ、芳香性、及び/又は疎水性が類似している。
内因性マウスDpp4遺伝子のヒトDPP4遺伝子での置換
ヒトDPP4遺伝子のエクソン2からエクソン26及び3’非翻訳領域の一部を含有する81.8kbのヒトDPP4遺伝子を、エクソン2からエクソン26の終止コドンまでの78.8kbのマウスDpp4遺伝子座で置換した。図1A及び1Bを参照されたい。
MERS−CoVによるヒト化DPP4マウスの感染
中東呼吸器症候群−コロナウイルス(MERS−CoV)は、重症急性呼吸器疾患を引き起こす新たに出現したウイルスである。MERS−CoVの受容体は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)である(Raj et al.(2013)Dipeptidyl Peptidase 4 is a Functional Receptor for the Emerging Human Coronavirus−EMC,Natuere 495(7440):251〜254を参照のこと)。抗ウイルス分子のインビボ試験は、MERS−CoV感染にかかりやすい動物モデル、例えば、げっ歯類(例えば、マウス又はラット)等の小動物モデルを必要とする。しかしながら、最近の研究では、マウスDpp4がMERS−CoV感染を支持することができないことが示されているが(例えば、Cockrell et al.(2014)Mouse Dipeptidyl Peptidase is Not a Functional Receptor for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus(MERS−CoV)Infection,J.Virol.88(9):5195〜5199、及びColeman et al.(2014)Wild−Type and Innate Immune−Deficient Mice are Not Susceptible to the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,J.Gen.Virol.95(2):408〜412を参照のこと)、これは、少なくとも一部には、MERS−CoVスパイクタンパク質がマウスDPP4ではなくヒトDPP4と相互作用するためである(例えば、Coleman et al.(2013)、及びRaj et al.(2013)を参照のこと)。マウスDPP4配列とヒトDPP4配列との配列比較により、以前はMERS−CoVスパイク(S)タンパク質とその受容体との間の接触部位と特定されていたアミノ酸がこれらの2つの種間で異なることが明らかになった。加えて、マウス細胞におけるヒトDPP4の発現により、MERS−CoVウイルスの侵入及び増殖が可能になり、ウイルスの侵入がマウス細胞感染の限定的段階であり、マウスDPP4とMERS−CoV糖タンパク質との間の相互作用の欠如がインビトロでの種指向性を定義することを示す。例えば、Lu et al.(2013)Molecular basis of binding between novel human coronavirus MERS−CoV and its receptor CD26,Nature.500(7461):227〜31、及びCockrell et al.(2014)Mouse Dipeptidyl Peptidase is Not a Functional Receptor for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus(MERS−CoV)Infection,J.Virol.88(9):5195〜5199を参照されたい。
BACのランダム挿入を使用したヒトDPP4遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの生成
ヒトDPP4遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを生成し、その配列及びゲノム情報を図6に示す。ヒトDPP4遺伝子を含有する2つの異なる重複BAC:BAC RP11−68L22及びBAC RP11−345J9(図7)を使用した。両BACは、ヒトDPP4遺伝子のコード領域、並びにDPP4遺伝子のATG開始コドン上流の40kbを超えるプロモーター領域及びDPP4遺伝子の終止コドンの数キロベース下流の領域を含有した(図7)。
MERS−CoVウイルスに感染したヒト化DPP4マウスの処理
ヒト化DPP4遺伝子及び隣接プロモーター領域を有するトランスジェニックマウスを、MERS−CoVに感染する能力及びMERS−CoVを治療又は予防するための治療分子の査定用のモデルとしての役割を果たす能力について試験した。
ヒト化DPP4マウスにおけるMERS−CoV感染への抗MERS−CoV抗体の予防効果
本明細書に記載のヒト化DPP4マウスを使用して、これらの2つのモノクローナル抗体のインビボでの予防能力を評価した。マウスに、1×105pfuのMERS−CoV(Jordan株)への鼻腔内感染前の24時間時点で、以下の抗MERS−CoV抗体用量範囲:200μg、20μg、又は2μgの抗MERS−CoVスパイクタンパク質抗体2(Ab2)、抗MERS−CoVスパイクタンパク質抗体4(Ab4)、又は200μgのヒトIgG1(hIgG1)アイソタイプ対照抗体をip注入した。Ab2及びAb4は、完全ヒト抗MERS−CoVスパイクタンパク質抗体であった。RNAをマウス肺から抽出し、上述の定量PCRにより分析した。例えば、感染していない対照を1に設定してデルタCt法を使用してqPCRデータを分析した。検出されたパーセントMERS−CoV RNAを、アイソタイプ一致対照抗体で処理された感染マウスにおいて検出されたRNAのレベルに対して表した(図11A〜B)。また、マウス肺のウイルス力価を上述のように決定した。
MERS−CoVに感染したヒト化DPP4マウスの抗体処理
抗MERS−CoV抗体(例えば、Ab2又はAb4)の治療効果(例えば、感染後のMERS−CoV複製及び肺病変を阻害する能力)を決定するために、ヒト化DPP4マウスをMERS−CoVに感染させた。感染後24時間時点で、マウスに500μgのhIgG1アイソタイプ対照又は500μg若しくは200μgのAb2のいずれかをip注入した。感染後4日目に、マウスを安楽死させ、マウス肺をウイルスRNA、ウイルス力価、及び肺病変について分析した。Ab2の500μg用量及び200μg用量の両方が、対照抗体で処理されたマウスと比較して、マウス肺におけるウイルスRNAレベルを約10倍低下させた(図13A〜B)。同じマウスの肺力価は、肺におけるウイルスレベルの著しい低下を実証し、感染後4日目に2logを超えて低下した(図13C)。これらのデータは、感染後、例えば、感染から24時間後に、抗MERS−CoV抗体(例えば、Ab2)がウイルス複製を著しく阻害したことを実証する。
Claims (60)
- げっ歯類であって、前記げっ歯類のゲノムは、改変DPP4遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座での、げっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片のヒトDPP4遺伝子のゲノム断片での置換を含み、前記改変DPP4遺伝子は、前記ヒトDPP4遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Dpp4のエクソン1を含み、前記改変DPP4遺伝子は、ヒトDPP4タンパク質をコードし、前記改変DPP4遺伝子の発現は、前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座におけるげっ歯類調節エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類は、マウスまたはラットであり、前記げっ歯類は、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS−CoV)に感染した場合に肺の炎症を示す、げっ歯類。
- 前記ヒトDPP4遺伝子のゲノム断片が、前記ヒトDPP4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、請求項1に記載のげっ歯類。
- 置換される前記げっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片が、前記げっ歯類Dpp4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、請求項1または2に記載のげっ歯類。
- 前記げっ歯類がマウスである、請求項1から3のいずれか一項に記載のげっ歯類。
- 前記げっ歯類が、マウスDpp4タンパク質を発現することができないマウスである、請求項1から4のいずれか一項に記載のげっ歯類。
- 前記げっ歯類が、改変DPP4遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項1から5のいずれか一項に記載のげっ歯類。
- 前記げっ歯類が、改変DPP4遺伝子についてホモ接合性である、請求項1から5のいずれか一項に記載のげっ歯類。
- ヒト化げっ歯類を作製するための方法であって、内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座におけるげっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片を、ヒトDPP4遺伝子のゲノム断片で置換して、改変DPP4遺伝子を形成する工程を含み、前記改変DPP4遺伝子は、前記ヒトDPP4遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Dpp4のエクソン1を含み、前記改変DPP4遺伝子は、ヒトDPP4タンパク質をコードし、前記改変DPP4遺伝子の発現は、前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座におけるげっ歯類調節エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類は、マウスまたはラットであり、前記げっ歯類は、MERS−CoVに感染した場合に肺の炎症を示す、方法。
- ヒト化げっ歯類を作製するための方法であって、
(i)げっ歯類胚性幹細胞における内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座においてげっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片を、ヒトDPP4遺伝子のゲノム断片で置換して、改変DPP4遺伝子を形成する工程であって、前記改変DPP4遺伝子は、前記ヒトDPP4遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Dpp4のエクソン1を含み、前記改変DPP4遺伝子は、ヒトDPP4タンパク質をコードし、前記改変DPP4遺伝子の発現は、前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座におけるげっ歯類調節エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類は、マウスまたはラットである、工程、および
(ii)工程(i)の前記げっ歯類胚性幹細胞からげっ歯類を生成する工程であって、前記げっ歯類が、MERS−CoVに感染した場合に肺の炎症を示す、工程
を含む、方法。 - 前記ヒトDPP4遺伝子のゲノム断片が、前記ヒトDPP4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、請求項8または9に記載の方法。
- 置換される前記げっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片が、前記げっ歯類Dpp4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、請求項8から10のいずれか一項に記載のげっ歯類。
- 前記げっ歯類がマウスである、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記げっ歯類が、マウスDpp4タンパク質を発現することができないマウスである、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記げっ歯類が、改変DPP4遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項8から13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記げっ歯類が、改変DPP4遺伝子についてホモ接合性である、請求項8から13のいずれか一項に記載の方法。
- げっ歯類において、ヒト特異的ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)拮抗薬のインビボ治療有効性を決定するための方法であって、
(a)DPP4拮抗薬を、請求項1から7のいずれか一項に記載のげっ歯類に投与する工程、および
(b)前記げっ歯類がMERS−CoVに感染した場合に、前記DPP4拮抗薬が、前記DPP4拮抗薬が投与されていないMERS−CoVに感染した対照げっ歯類と比較して、MERS−CoV感染の1つ以上の症状を治療又は予防するかを決定する工程
を含む、方法。 - 前記DPP4拮抗薬が小分子である、請求項16に記載の方法。
- 前記DPP4拮抗薬がペプチドまたは抗体である、請求項16に記載の方法。
- 前記DPP4拮抗薬が、MERS−CoVタンパク質に対する抗体である、請求項16または18に記載の方法。
- 前記MERS−CoVタンパク質が、MERS−CoVスパイクタンパク質である、請求項19に記載の方法。
- 前記拮抗薬が、MERS−CoV感染前に投与される、請求項16から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拮抗薬が、MERS−CoV感染後に投与される、請求項16から20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拮抗薬が、MERS−CoV感染と同時に投与される、請求項16から20のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)における決定する工程が、ウイルス力価またはRNAレベルを測定することを含む、請求項16から23のいずれか一項に記載の方法。
- ウイルス力価又はRNAレベルが、qPCR、ノーザンブロット、プラークアッセイ、及びインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される1つ以上の方法により査定される、請求項24に記載の方法。
- MERS−CoV感染の1つ以上の症状が、肺の炎症を含む、請求項16から23のいずれか一項に記載の方法。
- 肺の炎症が、組織化学的に評価される、請求項26に記載の方法。
- MERS−CoV感染の1つ以上の症状が、体重減少を含む、請求項16から23のいずれか一項に記載の方法。
- 遺伝子改変マウスであって、前記マウスのゲノムは、ヒト化DPP4遺伝子を形成するための、マウスDpp4遺伝子のエクソン2から26を含むマウスゲノム断片の、ヒトDPP4遺伝子のエクソン2から26を含むヒトゲノム断片による置換を含み、前記ヒト化DPP4遺伝子は、前記ヒトDPP4遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性マウスDpp4のエクソン1を含み、前記置換は、内在性マウスDpp4遺伝子座におけるものであり、前記ヒト化DPP4遺伝子は、前記内在性Dpp4遺伝子座における内在性マウスDpp4プロモーターの制御下にあり、前記マウスは、MERS−CoVに感染した場合に肺の炎症を示す、マウス。
- 前記マウスが、マウスDpp4タンパク質を発現することができない、請求項29に記載のマウス。
- 前記マウスが、前記置換についてヘテロ接合性である、請求項29または30に記載のマウス。
- 前記マウスが、前記置換についてホモ合性である、請求項29または30に記載のマウス。
- マウスにおいて、ヒト特異的ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)拮抗薬のインビボ治療有効性を決定するための方法であって、
(a)DPP4拮抗薬を、請求項29から32のいずれか一項に記載のマウスに投与する工程、および
(b)MERS−CoVに感染した場合の前記マウスにおいて、前記DPP4拮抗薬が投与されていないMERS−CoVに感染した対照マウスと比較して、MERS−CoV感染の1つ以上の症状を低減させる前記DPP4拮抗薬の効果を決定する工程
を含む、方法。 - 前記DPP4拮抗薬が小分子である、請求項33に記載の方法。
- 前記DPP4拮抗薬がペプチドまたは抗体である、請求項33に記載の方法。
- 前記DPP4拮抗薬が、MERS−CoVタンパク質に対する抗体である、請求項33または35に記載の方法。
- 前記MERS−CoVタンパク質が、MERS−CoVスパイクタンパク質である、請求項36に記載の方法。
- 前記拮抗薬が、MERS−CoV感染前に投与される、請求項33から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拮抗薬が、MERS−CoV感染後に投与される、請求項33から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記拮抗薬が、MERS−CoV感染と同時に投与される、請求項33から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記決定する工程が、ウイルス力価またはRNAレベルを測定することを含む、請求項33から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の症状が肺の炎症を含む、請求項33から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記マウスが、体重減少をさらに示す、請求項29に記載のマウス。
- 肺の炎症が、組織化学的に評価される、請求項29に記載のマウス。
- 組織または細胞のゲノムが前記置換を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のげっ歯類の単離された組織または細胞。
- 改変DPP4遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座での、げっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片の、ヒトDPP4遺伝子のゲノム断片での置換を含む、単離されたげっ歯類胚性幹(ES)細胞であって、前記改変DPP4遺伝子は、前記ヒトDPP4遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Dpp4のエクソン1を含み、前記改変DPP4遺伝子がヒトDPP4タンパク質をコードし、前記改変DPP4遺伝子の発現は、内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座におけるげっ歯類制御エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類ES細胞がマウスまたはラットのES細胞である、げっ歯類ES細胞。
- 前記ヒトDPP4遺伝子のゲノム断片が、前記ヒトDPP4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、請求項46に記載のげっ歯類ES細胞。
- 置換される前記げっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片が、前記げっ歯類Dpp4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、請求項46または47に記載のげっ歯類ES細胞。
- 前記げっ歯類ES細胞がマウスES細胞である、請求項46から48のいずれか一項に記載のげっ歯類ES細胞。
- 前記げっ歯類ES細胞が、前記改変DPP4遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項46から49のいずれか一項に記載のげっ歯類ES細胞。
- 前記げっ歯類ES細胞が、前記改変DPP4遺伝子についてホモ接合性である、請求項46から49のいずれか一項に記載のげっ歯類ES細胞。
- 請求項46から51のいずれか一項に記載のげっ歯類ES細胞から生成される、げっ歯類胚。
- ヒト化DPP4げっ歯類胚であって、前記胚のゲノムは、改変DPP4遺伝子を形成するための、内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座での、内在性げっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片の、ヒトDPP4遺伝子のゲノム断片での置換を含み、前記改変DPP4遺伝子は、前記ヒトDPP4遺伝子の前記ゲノム断片に作動可能に連結される内在性げっ歯類Dpp4のエクソン1を含み、前記改変DPP4遺伝子は、ヒトDPP4タンパク質をコードし、前記改変DPP4遺伝子の発現は、前記内在性げっ歯類Dpp4遺伝子座における内在性げっ歯類調節エレメントの制御下にあり、前記げっ歯類胚は、マウス胚またはラット胚である、ヒト化DPP4げっ歯類胚。
- 前記ヒトDPP4遺伝子のゲノム断片が、前記ヒトDPP4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、請求項53に記載の胚。
- 置換される前記げっ歯類Dpp4遺伝子のゲノム断片が、前記げっ歯類Dpp4遺伝子のエクソン2からエクソン26を含む、請求項53または54に記載の胚。
- 前記げっ歯類胚がマウス胚である、請求項53から55のいずれか一項に記載の胚。
- 前記げっ歯類胚が、マウスDpp4タンパク質を発現することができないマウス胚である、請求項53から56のいずれか一項に記載の胚。
- 前記げっ歯類胚が改変DPP4遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項53から57のいずれか一項に記載の胚。
- 前記げっ歯類胚が改変DPP4遺伝子についてホモ接合性である、請求項53から57のいずれか一項に記載の胚。
- 前記げっ歯類胚がマウス胚であり、前記マウスが、
(a)C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、及びC57BL/Olaからなる群から選択されるC57BL系統、
(b)129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例えば129S1/SV、129S1/Svlm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2からなる群から選択される129系統、
(c)129系統とC57BL/6系統との混合物、
(d)129系統の混合、または
(e)BL/6系統の混合
である、請求項53から59のいずれか一項に記載の胚。
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