KR101737432B1 - 인간화된 다이펩티딜 펩티다제 iv (dpp4) 동물 - Google Patents

인간화된 다이펩티딜 펩티다제 iv (dpp4) 동물 Download PDF

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Abstract

인간 또는 인간화된 DPP4 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다. 내인성 Dpp4 유전자의 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자로의 대체를 포함하는 비-인간 동물, 또는 내인성 Dpp4 유전자에 더하여 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자를 포함하는 비-인간 동물이 기재된다. 내인성 비-인간 Dpp4 좌에서의 비-인간 Dpp4-인코딩 서열의 인간 DPP4-인코딩 서열로의 대체를 갖는 비-인간 동물을 포함하는, 인간 또는 비-인간 DPP4 조절 요소의 제어 하에 있는 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자를 포함하는 비-인간 동물이 또한 제공된다. 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공되고, 비-인간 동물은 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트이다. 비-인간 동물의 제조 및 사용 방법이 기재된다.

Description

인간화된 다이펩티딜 펩티다제 IV (DPP4) 동물{HUMANIZED DIPEPTIDYL PEPTIDASE IV (DPP4) ANIMALS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2014년 5월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/005,476호, 2014년 9월 17일자로 출원된 미국 가출원 제62/051,626호, 및 2014년 10월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/072,692호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
인간 서열을 포함하는 다이펩티딜 펩티다제 IV (DPP4) 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물. 전체적으로 또는 부분적으로 인간인 DPP4 유전자를 포함하는 유전자도입(transgenic) 비-인간 동물. 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 비-인간 동물. 인간 또는 인간화된 DPP4 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물을 제조하고 사용하기 위한 방법.
다이펩티딜 펩티다제 IV (DPP4)는, 예를 들어, 고혈당증 (예를 들어, 문헌[Gerich (2013) Pathogenesis and Management of Postpandrial Hyperglycemia: Role of Incretin-Based Therapies, Intl. J. Gen. Med. 6:877-895] 참조) 및 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV) 감염 (예를 들어, 문헌[Raj et al. (2013) Dipeptidyl Peptidase 4 is a Functional Receptor for the Emerging Human Coronovirus-EMC, Nature 495(7440):251-254] 참조)을 포함하는 다양한 인간 질환, 장애 및 상태의 치료를 위한 치료 표적이다.
인간 DPP4 단백질을 특이적으로 표적화하는 치료 분자의 약물동력학 (PK) 및 약물역학 (PD)의 평가는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서 관례적으로 수행된다. 그러나, 그러한 분자의 PD는, 이러한 치료 분자가 또한 내인성 Dpp4 단백질을 표적화하지 않는다면 소정의 비-인간 동물에서는 적절하게 결정되지 않을 수 있다.
더욱이, 질환의 비-인간 동물 모델에서의 인간 DPP4-특이적 소분자, 펩티드 또는 단백질 (즉, 생물학적) 길항제의 생체내(in vivo) 치료 효능의 평가는 종-특이적 길항제가 내인성 Dpp4 단백질과 상호작용하지 않는 소정의 비-인간 동물에서 문제가 있다. 게다가, 인간 DPP4 단백질과 특이적으로 상호작용하는 분자를 표적화하는 소분자, 펩티드 또는 단백질 (즉, 생물학적) 길항제의 생체내 치료 효능의 평가는 치료 표적 분자 자체가 내인성 Dpp4 단백질과 상호작용하지 않는 소정의 비-인간 동물에서 또한 문제가 있다.
따라서, 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자를 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 필요하다. 예를 들어, 비-인간 동물의 Dpp4 유전자가 (예를 들어, 내인성 비-인간 좌(locus)에서) 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 인간 DPP4 유전자로 대체되거나 전체적으로 또는 부분적으로 인간화된 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 필요하다.
DPP4 유전자가, 예를 들어, DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역(flanking region), 예를 들어, 프로모터 및 인핸서(들)에서, 또는 3' 비번역 영역에서 비-인간 조절 요소 (예를 들어, 내인성 조절 요소)의 제어 하에 있는 (예를 들어, 인간 또는 인간화된) DPP4 유전자를 포함하는 비-인간 동물이 또한 필요하다.
DPP4 유전자가, 예를 들어, 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서(들)에서, 또는 3' 비번역 영역에서 인간 조절 요소의 제어 하에 있는 (예를 들어, 인간 또는 인간화된) DPP4 유전자를 포함하는 비-인간 동물이 또한 필요하다.
기능적 Dpp4 단백질을 발현하지만 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자를 포함하지 않는 동일 연령(age-matched) 비-인간 동물의 면역세포, 예를 들어, T 세포 표면에서, 및/또는 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장의 세포 표면에서의 Dpp4 단백질과 유사한 수준으로 면역세포, 예를 들어, T 세포의 표면에서, 및/또는 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장의 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 인간화된 비-인간 동물이 또한 필요하다.
부가적으로, 기능적 Dpp4 단백질을 발현하지만 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자를 포함하지 않는 동일 연령 비-인간 동물의 면역세포, 예를 들어, T 세포 표면에서, 및/또는 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장의 세포 표면에서의 Dpp4 단백질보다 높거나 낮은 수준으로 면역세포, 예를 들어, T 세포의 표면에서, 및/또는 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장의 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 인간화된 비-인간 동물이 필요하다.
본 명세서에 걸쳐, 다양한 특허, 특허 출원 및 다른 유형의 간행물 (예를 들어, 학술지 논문, 전자 데이터베이스 항목 등)이 참조된다. 본 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 기타 간행물의 개시내용은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
인간 서열을 포함하는 DPP4 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.
전체적으로 또는 부분적으로 인간인 DPP4 유전자를 포함하는 유전자도입 비-인간 동물이 제공된다.
인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 비-인간 동물이 제공된다.
내인성 비-인간 동물 Dpp4 유전자의 (전체적으로의 또는 부분적으로의) 대체를 갖는 비-인간 동물이 제공된다.
내인성 비-인간 Dpp4 좌에서 (전체적으로의 또는 부분적으로의) DPP4 인간화를 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.
인간 또는 인간화된 DPP4 유전자를 갖는 비-인간 동물이 제공되고, 비-인간 동물은 내인성 Dpp4 단백질을 발현하지 않고, 비-인간 동물은 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하지만 대체를 포함하지 않는 동일 연령 비-인간 동물의 면역세포, 예를 들어, T 세포 표면에서, 및/또는 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장을 포함하는 하나 이상의 조직의 세포 표면에 존재하는 Dpp4 단백질과 유사한 수준으로 면역세포, 예를 들어, T 세포의 표면에서, 및/또는 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장을 포함하는 하나 이상의 조직의 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다.
일 태양에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.
일 태양에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 내인성 Dpp4 유전자를 인코딩하는 유전자의 내인성 Dpp4 좌에서의 대체를 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 내인성 Dpp4 좌에서 내인성 Dpp4 유전자의 인간 DPP4 유전자로의 대체를 포함하는 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공된다. 일 실시 형태에서, 설치류는 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 내인성 Dpp4 유전자의 내인성 Dpp4 좌에서의 대체에 대해 이형접합성(heterozygous)이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 내인성 Dpp4 유전자의 내인성 Dpp4 좌에서의 대체에 대해 동형접합성(homozygous)이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 태양에서, 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되고, 본 설치류는 내인성 설치류 Dpp4 유전자의 인간화를 포함하고, 인간화는 내인성 설치류 Dpp4 좌에서 Dpp4 유전자의 엑손을 인코딩하는 설치류 유전자를 변형된 DPP4 유전자를 형성하도록 인간 DPP4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 인코딩하는 핵산 서열로 대체하는 것을 포함하고, 변형된 DPP4 유전자의 발현은 내인성 설치류 Dpp4 좌에 있는 설치류 조절 요소의 제어 하에 있다.
일 실시 형태에서, 설치류는 변형된 DPP4 유전자를 형성하도록 인간 DPP4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 인코딩하는 핵산 서열에 대해 이형접합성이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 변형된 DPP4 유전자를 형성하도록 인간 DPP4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 인코딩하는 핵산 서열에 대해 동형접합성이다.
일 실시 형태에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자는 인간 DPP4 유전자의 엑손 2 내지 엑손 26을 포함한다.
일 실시 형태에서, 인간화된 DPP4 단백질은 인간 DPP4 단백질의 세포외 도메인을 포함한다.
일 실시 형태에서, 인간화된 DPP4 단백질은 마우스 Dpp4 단백질의 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다.
일 실시 형태에서, 설치류는 마우스 Dpp4 단백질을 발현할 수 없는 마우스이다.
일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이고, 마우스 Dpp4의 엑손 2 내지 엑손 26을 인코딩하는 마우스 Dpp4 서열의 인접한 게놈 단편이 인간 DPP4의 엑손 2 내지 엑손 26을 인코딩하는 인간 DPP4 서열의 인접한 게놈 단편으로 대체된다.
일 태양에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되고, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 설치류는 정상 면역 시스템을 포함하고, 즉, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 설치류의 면역세포, 예를 들어, 혈액, 혈장 또는 혈청에서의 T 세포의 수는 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하는 설치류의 면역세포, 예를 들어, 혈액, 혈장 또는 혈청에서의 T 세포의 수와 유사하다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 설치류의 혈액은 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하는 설치류, 예를 들어, 야생형 마우스 또는 래트와 대략 동일한 수의 면역세포, 예를 들어, T 세포를 갖는다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, T 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4를 발현하는 마우스의 혈액에 존재하는 T 세포의 양은, 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 내인성 Dpp4 유전자의 인간 DPP4 유전자로의 대체를 포함하지 않는 동일 연령 마우스의 혈액에 존재하는 T 세포의 양의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%이다.
일 실시 형태에서, T 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 마우스의 혈액 중 T 세포의 양은, 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 내인성 Dpp4 유전자의 인간 DPP4 유전자로의 대체를 포함하지 않는 동일 연령 마우스의 혈액에 존재하는 T 세포의 양의 약 20% 내지 약 200%, 약 40% 내지 약 160%, 또는 약 80% 내지 약 120%이다.
일 태양에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되고, 설치류는 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하는 동일 연령 설치류의 면역세포, 예를 들어, T 세포 표면, 및/또는 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장에서의 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 설치류의 면역세포, 예를 들어, T 세포는 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하는 설치류, 예를 들어, 야생형 마우스 또는 래트의 면역세포, 예를 들어, T 세포와 대략 동일한 수준의 DPP4 단백질을 그의 표면에 갖는다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 마우스는, 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 내인성 Dpp4 유전자의 인간 DPP4 유전자로의 대체를 포함하지 않는 동일 연령 마우스의 면역세포, 예를 들어, T 세포 표면에서의 Dpp4 단백질의 수준의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 수준으로 면역세포, 예를 들어, T 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다.
일 실시 형태에서, 마우스는, 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 내인성 Dpp4 유전자의 인간 DPP4 유전자로의 대체를 포함하지 않는 동일 연령 마우스의 면역세포, 예를 들어, T 세포 표면에 존재하는 마우스 Dpp4 단백질 수준의 약 20% 내지 약 200%, 약 40% 내지 약 160%, 또는 약 80% 내지 약 120%의 수준으로 면역세포, 예를 들어, T 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다.
일 실시 형태에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 설치류의 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장에서의 세포는 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하는 설치류, 예를 들어, 야생형 마우스 또는 래트의 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장에서의 세포와 대략 동일한 수준의 DPP4 단백질을 그의 표면에 갖는다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 마우스는, 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 내인성 Dpp4 유전자의 인간 DPP4 유전자로의 대체를 포함하지 않는 동일 연령 마우스의 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장에서의 세포 표면에서의 Dpp4 단백질 수준의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 수준으로 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장에서의 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다.
일 실시 형태에서, 마우스는, 기능적 내인성 Dpp4 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 내인성 Dpp4 유전자의 인간 DPP4 유전자로의 대체를 포함하지 않는 동일 연령 마우스의 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장에서의 세포 표면에 존재하는 마우스 Dpp4 단백질 수준의 약 20% 내지 약 200%, 약 40% 내지 약 160%, 또는 약 80% 내지 약 120%의 수준으로 하나 이상의 조직, 예를 들어, 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌 및/또는 췌장에서의 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다.
일 태양에서, 유전적으로 변형된 설치류가 제공되고, 본 설치류는 설치류 Dpp4 세포외 도메인-인코딩 서열의 인간 DPP4 세포외 도메인-코딩 서열로의 대체를 포함하는 인간화된 DPP4 유전자를 포함하고, 인간화된 DPP4 유전자는 설치류 Dpp4 막관통 서열 및 설치류 Dpp4 세포질 서열을 포함하고, 인간화된 DPP4 유전자는 내인성 Dpp4 좌에 있는 내인성 설치류 Dpp4 조절 요소의 제어 하에 있다.
일 실시 형태에서, 설치류는 인간화된 DPP4 유전자에 대해 이형접합성이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 인간화된 DPP4 유전자에 대해 동형접합성이다.
일 실시 형태에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 마우스는 마우스 Dpp4 단백질을 발현할 수 없다.
일 실시 형태에서, 내인성 설치류 Dpp4 좌에 있는 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스 또는 래트 유래이다.
일 실시 형태에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스 또는 래트 유래의 설치류 Dpp4 좌에 있는 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열이다.
일 태양에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되고, 비-인간 동물은 내인성 비-인간 Dpp4 좌로부터 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다. 일 실시 형태에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 내인성 비-인간 Dpp4 좌에 대해 이형접합성이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 내인성 비-인간 Dpp4 좌에 대해 동형접합성이다.
일 태양에서, 내인성 마우스 Dpp4 좌로부터 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 내인성 마우스 Dpp4 유전자는 전체적으로 또는 부분적으로 인간 DPP4 유전자로 대체되었다.
일 실시 형태에서, 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 엑손 2 내지 엑손 26에서의 정지 코돈을 포함하는 약 78.8 kb가 결실되고, 인간 DPP4 유전자의 엑손 2 내지 엑손 26 및 3' 비번역 서열의 일부를 포함하는 인간 DPP4 유전자 서열의 약 81.8 kb로 대체된다. 특정 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자는 인간 BAC RP11-68L22의 인간 DPP4 유전자의 엑손 2 내지 엑손 26 및 3' 비번역 서열의 일부를 포함한다. 특정 실시 형태에서, DPP4 유전자는 마우스 Dpp4 유전자 5' 조절 요소, 마우스 Dpp4 단백질의 처음 2개의 아미노산, Met 및 Lys을 포함하는 마우스 Dpp4 엑손 1, 및 마우스 Dpp4 3' 조절 요소 (예를 들어, 3' 비번역 영역), 및 마우스 Dpp4 엑손 1로부터 유래한 처음 2개의 아미노산을 제외한, 인간 DPP4 유전자 엑손 2 내지 엑손 26, 즉, 인간 DPP4 단백질 코딩 서열을 포함한다.
일 태양에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되고, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 마우스 Dpp4 단백질을 인코딩하는 내인성 뉴클레오티드 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 대체한다.
일 실시 형태에서, 마우스는 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합성이다. 일 실시 형태에서, 마우스는 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 동형접합성이다.
일 태양에서, 인간화된 DPP4 설치류의 제조 방법이 제공되고, 본 방법은 설치류 Dpp4 단백질을 인코딩하는 설치류 Dpp4 유전자 서열을 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 DPP4 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함하고, 대체는 내인성 설치류 Dpp4 좌에서 행해지고, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 DPP4 유전자 서열은 내인성 설치류 Dpp4 좌에 있는 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결된다.
일 실시 형태에서, 설치류는 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합성이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대해 동형접합성이다.
일 실시 형태에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스로부터 유래한다. 일 실시 형태에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 래트로부터 유래한다.
일 실시 형태에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 Dpp4 좌에 있는 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 인간 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 인간 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4 유전자 서열의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 또는 적어도 25개의 엑손을 포함한다. 일 실시 형태에서, 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 인간 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4 유전자 서열의 26개의 엑손 모두를 포함한다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4와 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 99% 동일한 단백질을 인코딩한다.
일 실시 형태에서, 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 인간 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열의 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 또는 적어도 23개의 엑손을 포함한다. 일 실시 형태에서, 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 인간 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4 단백질의 세포외 도메인을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열의 24개의 엑손 모두를 포함한다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 실시 형태에서, 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 인간 또는 인간화된 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4 단백질의 세포외 도메인과 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 99% 동일한 DPP4 단백질의 세포외 도메인을 인코딩한다.
일 실시 형태에서, 대체는 내인성 설치류 Dpp4 좌에서 행해지고, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 DPP4 유전자 서열은 내인성 설치류 Dpp4 좌에 있는 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결된다.
일 태양에서, 마우스 Dpp4 단백질을 인코딩하는 마우스 Dpp4 유전자 서열을 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함하는, 인간화된 DPP4 마우스의 제조 방법이 제공된다.
일 실시 형태에서, 대체는 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 행해지고, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자는 내인성 마우스 Dpp4 좌에 있는 마우스 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결된다.
일 실시 형태에서, 대체는 내인성 마우스 Dpp4 좌에서 행해지고, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자는 내인성 마우스 Dpp4 좌에 있는 내인성 마우스 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결된다.
다양한 태양에서, 본 명세서에 기재된 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트는 그의 생식세포 계열에서의 유전적 변형을 포함한다.
일 태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트의 배아가 제공된다.
일 태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전자 변형을 포함하는 공여 세포를 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트의 숙주 배아가 제공된다.
일 태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 만능 또는 전능 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트의 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 세포는 설치류 세포이다. 일 실시 형태에서, 세포는 마우스 세포이다. 일 실시 형태에서, 세포는 설치류 배아 줄기 (ES) 세포이다. 일 실시 형태에서, 세포는 마우스 ES 세포이다.
일 태양에서, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트의 난자(egg)가 제공되고, 비-인간 동물 난자는 이소성(ectopic) 비-인간 동물 염색체를 포함하고, 이소성 비-인간 동물 염색체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 유전적 변형을 포함한다. 일 실시 형태에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
일 태양에서, 인간 DPP4 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 마우스 배아, 난자, 또는 세포는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택되는 C57BL 계통의 마우스의 것이다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들어, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 129 계통이다 (예를 들어, 문헌[Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836]을 참조하고, 또한 문헌[Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines]을 참조한다). 특정 실시 형태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 상기 언급된 129 계통과 상기 언급된 C57BL/6 계통의 혼합이다. 다른 특정 실시 형태에서, 마우스는 상기 언급된 129 계통의 혼합, 또는 상기 언급된 BL/6 계통의 혼합이다. 특정 실시 형태에서, 129 계통의 혼합은 129S6 (129/SvEvTac) 계통이다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다. 또 다른 실시 형태에서, 마우스는 BALB 계통과 상기 언급된 다른 계통의 혼합이다. 일 실시 형태에서, 마우스는 스위스(Swiss) 또는 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스이다.
다양한 태양에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물은 포유류 및 조류로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 비-인간 동물은 포유류이다. 일 실시 형태에서, 포유류는 설치류이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다.
일 태양에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 설치류가 제공되고, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 적어도 하나의 엑손을 포함하고, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩한다.
일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개의 엑손을 포함한다.
일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 26개의 엑손 모두를 포함한다.
일 실시 형태에서, 핵산 서열은 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역에 작동가능하게 연결된다. 일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역은 적어도 1 kb의 길이 (예를 들어, 적어도 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 또는 그 초과의 길이)를 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역은 적어도 10 kb의 길이를 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역은 적어도 40 kb의 길이를 포함한다.
일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편의 발현은 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역의 제어 하에 있다.
일 실시 형태에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질은 서열 번호 24의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
일 실시 형태에서, 설치류는, 기능적 내인성 설치류 Dpp4 단백질을 발현하지만 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 포함하지 않는 동일 연령 설치류의 T 세포 표면에 존재하는 설치류 Dpp4 단백질 수준의 적어도 약 20% (예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 그 초과)인 수준으로 T 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다.
일 실시 형태에서, 설치류는, 기능적 내인성 설치류 Dpp4 단백질을 발현하지만 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 포함하지 않는 동일 연령 설치류의 하나 이상의 조직의 표면에 존재하는 설치류 Dpp4 단백질 수준의 적어도 약 20% (예를 들어, 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 또는 그 초과)인 수준으로 태반, 신장, 폐, 간, 골격근, 심장, 뇌, 및 췌장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 조직의 세포 표면에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현한다.
일 실시 형태에서, 설치류는 기능적 내인성 설치류 Dpp4 단백질을 발현한다.
일 실시 형태에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다.
일 태양에서, 인간화된 유전자도입 설치류의 제조 방법이 본 명세서에 제공되고, 본 방법은 인간 DPP4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 핵산 서열을 설치류의 염색체 내로 혼입하는 단계를 포함하고, 인간 DPP4 유전자 서열의 하나 이상의 엑손은 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩한다.
일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개의 엑손을 포함한다.
일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 26개의 엑손 모두를 포함한다.
일 실시 형태에서, 핵산 서열은 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역을 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 서열은 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역에 작동가능하게 연결된다.
일 실시 형태에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질은 서열 번호 24의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함한다.
일 실시 형태에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다. 추가 태양에서, 본 명세서에 기재된 인간화된 DPP4 설치류 중 어느 하나에서 인간-특이적 DPP4 길항제의 생체내 치료 효능을 결정하는 방법이 제공되고, 본 방법은 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)로 감염된 설치류에 DPP4 길항제를 투여하는 단계; 및 DPP4 길항제가 투여되지 않은, MERS-CoV로 감염된 대조군 설치류와 비교하여, DPP4 길항제가 MERS-CoV 감염의 하나 이상의 증상을 치료 또는 예방하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, DPP4 길항제는 소분자, 펩티드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시 형태에서, DPP4 길항제는 MERS-CoV 단백질에 대한 항체이다.
일 실시 형태에서, MERS-CoV 단백질은 MERS-CoV 스파이크(spike) 단백질이다.
일 실시 형태에서, 설치류는 Al-Hasa_1, Al-Hasa_2, Al-Hasa_3, Al-Hasa_4, Al-Hasa_12, Al-Hasa_15, Al-Hasa_16, Al-Hasa_17, Al-Hasa_18, Al-Hasa_19, Al-Hasa_21, Al-Hasa_25, Buraidah_1, EMC/2012, FRA/UAE, Hafr-Al-Batin_1, Hafr-Al-Batin_2, Hafr-Al-Batin_6, Jeddah_1, Jordan-N3/2012, Munich, Riyadh_3, Riyadh_4, Riyadh_5, Riyadh_14, Taif_1, Wadi-Ad-Dawasir_1, Riyadh_9, KFU-HKU 1, KFU-HKU 13, Qatar3, Qatar4, England 1, England-Qatar/2012, Bisha_1, Riyadh_1, 및 Riyadh_2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 MERS-CoV 균주로 감염된다.
일 실시 형태에서, 길항제는 MERS-CoV 감염 전에 투여된다. 일 실시 형태에서, 길항제는 MERS-CoV 감염 후에 투여된다.
일 실시 형태에서, 길항제는 MERS-CoV 감염과 동시에 투여된다.
일 실시 형태에서, MERS-CoV 감염의 증상은 바이러스 역가(viral titer) 또는 RNA 수준이다.
일 실시 형태에서, 바이러스 역가 또는 RNA 수준은 qPCR, 노던 블롯(Northern Blot), 플라크 검정법, 및 동소 교잡법(in situ hybridization)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 평가된다.
일 실시 형태에서, MERS-CoV 감염의 증상은 폐 염증이다.
일 실시 형태에서, 폐 염증은 조직화학적으로 평가된다.
일 실시 형태에서, MERS-CoV 감염의 증상은 체중 감소이다.
일 실시 형태에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다.
본 명세서에 기재된 각각의 태양 및 실시 형태는 그 실시 형태 또는 태양의 문맥으로부터 명백하게 또는 분명히 배제되지 않는 한, 함께 사용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 Dpp4 좌의 인간화를 위한 전략의 축적대로 그려지지 않은 도해를 제공한다. 도 1a는, 표시된 바와 같이, 엑손 2 내지 엑손 26에서의 정지 코돈에 걸친 마우스 Dpp4 유전자의 78.8 kb (위)가 결실되고 엑손 2 내지 엑손 26 및 3' 비번역 영역의 일부에 걸친 인간 DPP4 유전자의 81.7 kb (아래)로 대체되는 것을 나타내는 개략도이다. 도 1b는 인간화된 DPP4 마우스가, 표시된 바와 같이, (i) 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 및 전사 시작 부위를 포함하는 마우스 Dpp4 유전자 5' 플랭킹 영역, 및 개시 ATG 코돈을 포함하는 엑손 1, (ii) 엑손 2 내지 정지 코돈을 포함하는 엑손 26, 및 loxP 부위를 포함하는 3' 비번역 영역의 일부에 걸친 인간 DPP4 유전자, 및 (iii) 바로 3'부터 시작하여 정지 코돈에 이르기까지의 마우스 Dpp4 유전자 3' 비번역 영역을 포함하는 것을 나타내는 개략도이다.
도 2는 인간화된 DPP4 마우스에서 발현된 인간화된 DPP4 단백질의 아미노산 서열 (서열 번호 17)을 보여준다.
도 3은 감염 후 4일째의 모의(mock) (PBS)-감염된, 또는 MERS-CoV (Jordan 균주)-감염된, F0 인간화된 DPP4 마우스로부터의 폐 조직으로부터 얻어진 RNA에서 수행된 실시간(real-time) PCR의 결과를 보여준다.
도 4는 감염 후 4일째의 모의 (PBS)-감염된, 또는 MERS-CoV (Jordan 균주)-감염된, F0 인간화된 DPP4 마우스의 폐로부터의 기도 (10X 및 40X 배율) 및 폐포 (40X 배율)의 H&E 염색을 보여준다.
도 5는 마우스 Dpp4 (mDpp4) 아미노산 서열 (서열 번호 25)의 유전자도입 MAID 7326/7327 마우스 (서열 번호 26)에 의해 인코딩된 인간 DPP4 (hDPP4) 단백질과의 서열 정렬이다. 서열간 상이한 비-상동 잔기는 밑줄이 쳐져 있고, 서열간 상이한 상동 잔기는 굵은 글씨 및 이탤릭체로 표시되어 있고, 갭은 하이픈으로 표시되어 있다. 2개의 서열 사이에 동일한 잔기는 서식없는 텍스트로 나타나 있다.
도 6은 인간 DPP4에 대한 유전자, 서열, 및 염색체 정보를 보여주는 표이다.
도 7은 BAC, 즉 BAC RP11-345J9 및 BAC RP11-68L22 각각에 대한 인간 DPP4 유전자 및 플랭킹 게놈 서열의 범위를 보여주는 개략도이다. 인간 태크맨(TaqMan)TM 프라이머-프로브 세트가 어닐링하는 인간 DPP4 유전자 및 프로모터 영역 내 위치가 또한 나타나 있다 (상류 세트에 대한 7333hTU 및 하류 세트에 대한 7333hTD).
도 8은 대립유전자 검정법의 인간 태크맨TM 획득(gain)에 사용되는 프라이머-프로브 세트를 보여주는 표이고, 여기서 7333 hTU는 상류 세트를 말하고 7333 hTD는 하류 세트를 말한다.
도 9는 유전자도입 MAID 7333 및 7334 마우스 (서열 번호 24)에 의해 인코딩된 인간화된 DPP4 단백질의 아미노산 서열이다.
도 10a는 감염 후 일수(days post-infection (dpi)) 2 및 4에서의 감염된 마우스에서의 MERS-CoV 게놈 (UpE RNA)의 정량적 PCR 측정치를 보여주는 막대 그래프이다. 도 10b는 2 dpi 및 4 dpi에서의 감염된 마우스에서의 MERS-CoV mRNA 전사체 (리더 RNA)의 정량적 PCR 측정치를 보여주는 막대 그래프이다. 도 10c는 2 dpi 및 4 dpi에서의 감염된 마우스 폐의 MERS-CoV 바이러스 역가를 정량화한 막대 그래프이다. 균질화된 마우스 폐에서의 MERS-CoV 수준은 50% 조직 배양 감염량(50% Tissue Culture Infective Dose) (TCID50) 검정법으로 정량화하고 mL 당 플라크 형성 단위 (pfu)로 표시하였다. 도 10d는 MERS-CoV 감염된 마우스로부터의, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 폐 조직 이미지의 패널이다. 기도 (10X), 혈관계 (10X) 및 간질 (40X)이 PBS, 2 dpi, 및 4 dpi 마우스에 대해 나타나 있다.
도 11a는 바이러스 감염 전에 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체 (Ab 2 또는 Ab 4)로 전처리된 마우스의 폐로부터의 MERS-CoV 게놈 (UpE RNA)의 정량적 PCR 측정치를 보여주는 막대 그래프이다. 도 11b는 바이러스 감염 전에 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체로 전처리된 마우스의 폐로부터의 MERS-CoV mRNA 전사체 (리더 RNA)의 정량적 PCR 측정치를 보여주는 막대 그래프이다. RNA를 MERS-CoV 게놈에 대항하는 프라이머를 사용하여 정량화하고 hIgG1 아이소타입 대조군 처리된 마우스와 비교하였다. 모든 샘플은 100%로 설정된 hIgG1 대조군과 비교하였다. 도 11c는 바이러스 감염 전에 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체로 전처리된 마우스의 폐에서의 바이러스 역가를 보여주는 막대 그래프이다. 바이러스 역가는 플라크 검정법으로 정량화하고 pfu/mL로 기록하였다.
도 12a는 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체 (Ab 2 또는 Ab 4)로 전처리된 MERS-CoV 감염된 B6/hDPP4 마우스의 폐 조직 이미지의 패널이다. 헤마톡실린 및 에오신 염색된 마우스 폐의 절편은 각 그룹으로부터의 대표 마우스의 기도, 혈관계 및 간질을 보여준다. 도 12b는 도 12a에 나타낸 마우스 폐의 조직학적 스코어링(histological scoring)을 보여주는 막대 그래프이다. 스코어는 각 실험 그룹 및 시점에서의 모든 마우스의 평균 스코어였다.
도 13a는 감염된 폐로부터의 MERS-CoV 게놈 (UpE RNA)의 정량적 PCR 측정치를 보여주는 막대 그래프이다. 바이러스 감염 1일 전 또는 1일 후에 주입된 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체 (Ab 2 또는 Ab 4)의 효과를 비교하였다. 도 13b는 감염된 폐로부터의 MERS-CoV mRNA 전사체 (리더 RNA)의 정량적 PCR 측정치를 보여주는 막대 그래프이다. 바이러스 감염 1일 전 또는 1일 후에 주입된 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체 (Ab 2 또는 Ab 4)의 효과를 비교하였다. 도 13a 및 도 13b의 경우, RNA를 MERS-CoV 게놈에 대항하는 프라이머를 사용하여 정량화하고 hIgG1 아이소타입 대조군 처리된 마우스와 비교하였다. 모든 샘플은 100%로 설정된 hIgG1 대조군과 비교하였다. 도 13c는 바이러스 감염 후에 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체 (Ab 2 또는 Ab 4)로 처리된 마우스의 폐에서의 바이러스 역가를 보여주는 막대 그래프이다. 바이러스 역가는 플라크 검정법으로 정량화하고 PFU/mL 폐로 기록하였다. 바이러스 감염 1일 전 또는 1일 후에 주입된 항체의 효과를 비교하였다.
도 14a는 감염 1일 후에 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 Ab 2 항체로 처리된 MERS-CoV 감염된 B6/hDPP4 마우스로부터의 폐 조직 이미지의 패널이다. 헤마톡실린 및 에오신 염색된 마우스 폐의 절편은 각 그룹으로부터의 대표 마우스의 기도, 혈관계 및 간질을 보여준다. 도 14b는 도 14a의 마우스 폐의 조직학적 스코어링을 보여주는 막대 그래프이다.
도 15는 인간화된 DPP4 마우스에서 MERS-CoV 감염 후 시간의 함수로서 체중에 대한 용량-반응 연구를 묘사한다. 그룹당 4 마리 또는 5 마리의 마우스를 사용한다.
도 16은 이형접합성 및 동형접합성 인간화된 DPP4 마우스에서 MERS-CoV (1 × 106 pfu/마우스; 그룹당 4 마리 또는 5 마리의 마우스) 감염 후 시간의 함수로서 체중에 대한 용량-반응 연구를 묘사한다.
도 17은 고용량의 바이러스 (1 × 106 pfu/마우스)에 노출된 인간화된 DPP4 마우스 대 PBS-처리된 대조군에서 7일째에 조직학적 검사에 의해 보여지는 병리 (염증)를 묘사한다.
DPP4 유전자 및 단백질
DPP4 유전자는 타입 II 막관통 단백질, 트라이펩티딜 펩티다제 IV (DPP4) (CD26, 아데노신 데아미나제 복합 단백질-2 (ADCP2), 아데노신 데아미나제 결합 단백질 (ADABP), 및 TP103으로도 알려짐)를 인코딩하는데, 이 단백질은 세린 엑소펩티다제 활성을 갖고, 몇몇 다른 세포 유형에서 세포내 신호 전달 캐스케이드에서 그리고 T 세포의 활성화에서 중요한 역할을 한다.
인간 DPP4. NCBI 유전자 ID: 1803; 1차 소스(source): HGNC:3009; 참조 서열 전사체: NM_001935.3; 유니프롯(UniProt) ID: P27487; 게놈 어셈블리: GRCh38; 위치: 2번 염색체:162,848,755-162,931,052 - 가닥. (도 6 참조).
인간 DPP4 유전자는 2번 염색체 상의 2q24.3에 위치한다. 인간 DPP4 유전자는 26개의 엑손을 갖고, N-말단 6개 아미노산 세포질 도메인, 22개 아미노산 막관통 도메인, 및 C-말단 738개 아미노산 세포외 도메인을 포함하는, 766개 아미노산 길이의 타입 II 막관통 폴리펩티드를 인코딩한다. 인간 DPP4 단백질의 세포외 도메인 (즉, 엑토도메인)은 인간 DPP4 유전자의 코딩 엑손 3 내지 26에 의해 인코딩된다.
마우스 Dpp44. NCBI 유전자 ID: 13482; 1차 소스: MGI:94919; 참조 서열 전사체: NM_010074.3; 유니프롯 ID: P28843; 게놈 어셈블리: GRCm38; 위치: 2번 염색체:62,330,073-62,412,591 ― 가닥.
마우스 Dpp4 유전자는 2번 염색체 상의 2 35.85 cM에 위치한다. 마우스 Dpp4 유전자는 26개의 엑손을 갖고, N-말단 6개 아미노산 세포질 도메인, 22개 아미노산 막관통 도메인, 및 C-말단 732개 아미노산 세포외 도메인을 포함하는, 760개 아미노산 길이의 타입 II 막관통 폴리펩티드를 인코딩한다. 마우스 Dpp4 단백질의 세포외 도메인 (즉, 엑토도메인)은 마우스 Dpp4 유전자의 코딩 엑손 3 내지 26에 의해 인코딩된다.
DPP4 단백질의 종 특이성
아래 실시예 2에서 논의된 바와 같이, 인간 - 그러나 마우스는 아님 - DPP4 단백질은 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV) 감염에 대한 기능적 수용체이다.
종-특이적 방식으로 인간 DPP4 단백질을 표적으로 하는 후보 치료 분자, 또는 종-특이적 방식으로 인간 DPP4 단백질과 상호작용하는 표적 분자, 예컨대 MERS-CoV는 전형적으로 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서의 약물동력학 (PK) 및 약물역학 (PD)에 대해 평가된다. 그러한 치료 분자는 또한, DPP4가 역할을 하는 인간 질환, 장애 및 상태의 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트 모델에서 생체내 치료 효능에 대해 시험된다.
그러나, 인간 DPP4 단백질에 특이적인 치료 분자, 예를 들어, 인간-특이적 DPP4 억제제는 설치류, 특히 마우스에서는 이러한 치료 분자의 표적이 손실되었기 때문에 PD 및/또는 생체내 치료 효능에 대해 적절히 평가될 수 없다.
더욱이, 인간 DPP4 단백질과 특이적으로 상호작용하는 표적, 예를 들어, 인간 DPP4-특이적 MERS-CoV에 특이적인 치료 분자는 설치류, 특히 마우스에서는 이러한 치료 표적 분자의 표적 (예를 들어, 수용체, 상호작용 파트너)이 손실되었기 때문에 생체내 치료 효능에 대해 적절히 평가될 수 없다.
따라서, 다양한 실시 형태에서, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서 인간-특이적 DPP4 단백질 길항제 또는 억제제의 PD 및/또는 생체내 치료 효능을 평가하기 위해, 내인성 Dpp4 단백질을 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질로 대체하는 것이 바람직하다. 다양한 실시 형태에서, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서 인간 DPP4 단백질과 특이적으로 상호작용하는 표적 분자의 소분자, 펩티드 또는 생물학적 길항제 또는 억제제의 생체내 치료 효능을 평가하기 위해, 내인성 Dpp4 단백질을 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질로 대체하는 것이 바람직하다.
또한, 다양한 실시 형태에서, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질의 과발현 또는 저발현, 및/또는 내인성 Dpp4 단백질이 정상적으로 발현되지 않는 세포 또는 조직에서의 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질의 부적절한 발현의 잠재적인 문제를 피하기 위해, 인간 DPP4 유전자를, 전체적으로 또는 부분적으로, 내인성 Dpp4 유전자 좌에서 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트의 게놈 내로 삽입하고, 적어도 부분적으로는 내인성 Dpp4 조절 요소의 제어 하에서 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 발현하는 것이 바람직하다.
일부 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편에 의한 내인성, 예를 들어, 마우스 또는 래트, Dpp4 유전자의 표적화된 대체가 바람직하다.
다른 실시 형태에서, 내인성 Dpp4 유전자를 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편으로 대체하는 대신에, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트의 게놈 내로 무작위적으로 삽입한다. 일부 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편이 게놈 내로 무작위적으로 삽입된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서, 내인성 설치류 Dpp4의 발현은 보존된다.
본 명세서에서는 내인성 Dpp4 좌에서 (즉, 대체), 또는 하나 이상의 다른 좌에서 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공된다. 본 명세서에서는 또한 내인성 Dpp4 좌에서 (즉, 대체), 및 추가의 좌/좌들에서 이들 둘 다에서 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공된다.
일부 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자의 단편은 200 킬로베이스 (kb) 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어, 180 kb, 160 kb, 140 kb, 120 kb, 100 kb, 80 kb, 70 kb, 60 kb, 50 kb, 40 kb, 30 kb, 20 kb, 10 kb, 5 kb, 2.5 kb, 1 kb 또는 그 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어, 1000개, 800개, 600개, 400개, 200개, 또는 그 미만의 뉴클레오티드를 함유한다.
인간 DPP4 를 갖는 세포 및 비-인간 동물의 생성
내인성 비-인간 Dpp4 유전자 또는 단편의 인간 DPP4 유전자 또는 단편으로의 표적화된 대체를 위해, 표적화 작제물(targeting construct)이 생성된다. 예를 들어, 문헌[Valenzuela et al. Nature Biotech, 21.6(2003):652-659]; 미국 특허 제6,586,251호; 및 미국 특허 제8,759,105호를 참조한다. 예를 들어, 표적화 작제물은 대체 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 플랭킹하는 상동성 아암(arm)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 대체 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자 전체를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 대체 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 일부를 포함한다. 예를 들어, 대체 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 하나 이상의 엑손, 예를 들어, 인간 DPP4 유전자의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 또는 26개의 엑손을 포함한다. 예를 들어, 대체 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 엑손 1 내지 26을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 대체 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 엑손 2 내지 26을 포함한다. 예를 들어, 대체 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 엑손 2의 상류 인트론 1 내지 엑손 26을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대체 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 조절 요소(들), 예를 들어, 인간 DPP4 유전자 하류의 인간 3' 비번역 영역 (UTR)의 일부, 예를 들어 하류 영역의 적어도 1 kb (예를 들어, 적어도 1 Kb, 2 Kb, 3 Kb, 4 Kb, 5 Kb, 10 Kb, 20 Kb, 30 Kb, 40 Kb, 또는 그 초과), 및/또는 인간 DPP4 유전자 상류의 인간 프로모터 또는 인핸서 영역, 예를 들어, 상류 영역의 적어도 10 kb (예를 들어, 적어도 10 Kb, 20 Kb, 30 Kb, 40 Kb, 50 Kb, 또는 그 초과)를 추가로 포함한다.
상동성 아암은, 원하는 유전자 변형/대체를 플랭킹하는, 예를 들어, 대체될 내인성 Dpp4 유전자 또는 단편을 플랭킹하는 내인성 염색체 핵산 서열에 상동인 서열이다. 상동 핵산 서열은, 서로 혼성화하거나 분자간 교환을 수행할 수 있도록 충분히 동일하거나 유사한 2개 이상의 핵산 서열일 수 있다. 상동성 아암과 상응하는 내인성 서열 사이의 상동성에 의해, 상동성 아암은 표적화 작제물을 게놈 내 특이적 염색체 위치, 예를 들어, 내인성 Dpp4 유전자 좌로 안내한다. 예를 들어, 문헌[Valenzuela et al. Nature Biotech, 21.6(2003):652-659]; 미국 특허 제6,586,251호; 및 미국 특허 제8,759,105호를 참조한다.
선택적으로, 표적화 작제물은, 예를 들어 2개의 상동성 아암들 사이에, 선택 마커를 추가로 포함한다. 예시적인 선택 마커는 항생제 내성 마커 (예를 들어, 네오마이신 또는 카나마이신) 및 형광 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 선택 마커는 플록싱(floxing)되며, 즉, 2개의 loxP 부위에 의해 플랭킹된다. 플록싱된 선택 마커는, 예를 들어, 선택 마커를 포함하는 플록싱된 분절의 절제를 촉매하는 Cre 재조합효소의 첨가에 의해 제거될 수 있다.
벡터/작제물
본 발명의 유전자도입 비-인간 동물 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트)은 다양한 벡터 및/또는 작제물을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표적화 작제물은 이중-가닥 DNA의 원형 조각, 예를 들어, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 플라스미드, 또는 P1-유래 인공 염색체 (PAC)의 형태이다.
내인성 Dpp4 좌의 표적화된 대체를 포함하는 비-인간 세포를 생성하기 위해, 본 명세서에 기재된 인간 DPP4 유전자 또는 단편을 함유하는 표적화 작제물은 비-인간 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포, 예를 들어, 배아 줄기 (ES) 세포 내로 도입된다.
게놈 내로 무작위적으로 삽입된 인간 DPP4 유전자 또는 단편을 포함하는 비-인간 세포를 생성하기 위해, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 함유하는 원형 DNA 작제물, 예를 들어, BAC는 비-인간 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포, 예를 들어, ES 세포 내로 도입된다. 일부 경우에서, 원형 DNA 작제물, 예를 들어, BAC는 인간 DPP4 조절 요소, 예를 들어, 인간 DPP4 유전자의 상류 및/또는 하류의 인간 프로모터 또는 인핸서 영역을 추가로 함유한다. 예를 들어, 원형 DNA 작제물은 인간 DPP4 유전자의 ATG 시작 코돈 상류의 프로모터/인핸서 영역의 적어도 10 kb (예를 들어, 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb 또는 그 초과)를 함유한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 원형 DNA 작제물은 인간 DPP4 유전자 하류의 비번역 영역의 적어도 1 kb (예를 들어, 적어도 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb 또는 그 초과)를 함유한다. 예를 들어, 인간 DPP4 유전자 또는 단편은 인간 DPP4 조절 요소에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시 형태에서, 원형 DNA 작제물 (예를 들어, BAC)에서의 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자 전체를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 일부를 포함한다. 예를 들어, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 하나 이상의 엑손, 예를 들어, 인간 DPP4 유전자의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 또는 26개의 엑손을 포함한다. 예를 들어, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 엑손 1 내지 26을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 엑손 2 내지 26을 포함한다. 예를 들어, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편은 인간 DPP4 유전자의 엑손 2의 상류 인트론 1 내지 엑손 26을 포함한다.
예를 들어, 세포로의 도입 단계는 전기천공 또는 지질-매개 형질감염에 의해 수행된다.
선택적으로, 원형 DNA 작제물, 예를 들어, BAC는 세포로 도입되기 전에 선형화된다. 예를 들어, 선형화는 희귀-절단 제한 효소, 예를 들어, SgrDI, SfiI, NotI, PacI, 또는 SwaI로 수행된다.
표적화 작제물이 항생제 선택 마커 (예를 들어, 네오마이신)를 포함하는 경우, 표적화 작제물을 받아들인 세포는 선택적으로 네오마이신/G418-함유 배지에서 선택된다. 네오마이신/G418-함유 배지에서 생존 및/또는 증식하는 세포가 선택되고 이는 표적화 작제물에 대해 양성이다.
일부 실시 형태에서, 세포 집단은, 게놈 내로 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편이 혼입된, 예를 들어, 게놈 내로 무작위적으로 삽입되거나 내인성 Dpp4 좌로 (예를 들어, 표적화 작제물에 의해) 표적화된 세포에 대해 스크리닝된다.
스크리닝을 위한 방법은 정량적 PCR 및 형광 동소 교잡법을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,586,251 B2호 및 미국 특허 제8,759,105 B2호를 참조한다. 예를 들어, 스크리닝 방법은 인간 DPP4 유전자 또는 단편의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스크리닝 방법은 내인성 Dpp4 유전자 또는 단편의 카피 수의 손실 및/또는 인간 DPP4 유전자 또는 단편의 카피 수의 획득에 대해 검출하는 단계를 포함한다. 스크리닝의 예시적인 방법이 실시예 1 내지 실시예 3에 기재되어 있다.
표적화 작제물이 플록싱된 선택 마커를 포함하는 일부 실시 형태에서, 올바르게 표적화된 세포는, 플록싱된 선택 마커를 제거하기 위해, 예를 들어, 일시적으로 Cre 재조합효소를 발현하는 Cre-발현 벡터와 함께 선택적으로 추가로 전기천공된다.
유전자도입 동물을 생성하기 위해, 인간 DPP4 유전자 또는 그의 단편을 함유하고, 예를 들어, 플록싱된 선택 마커가 없는, 양성 ES 세포 클론이 설치류 배아, 예를 들어, 마우스 또는 래트 배아, 예컨대 8-세포기 마우스 배아로 도입된다. 예를 들어, 도입 단계는 배반포 주입 기술, 응집 기술, 핵 이식 및 클로닝, 및/또는 벨로시마우스(VelociMouse)® 방법에 의해 수행된다. 예를 들어, 미국 특허 제8,759,105 B2호, 미국 특허 제7,294,754호, 미국 특허 제7,576,259호, 및 미국 특허 제7,659,442호를 참조한다. 예를 들어, ES 세포 클론은 DNA의 도입 및 후속 선택 후에 ES 세포 집단의 단일 세포로부터 유래된 세포의 아집단이다.
일부 경우에서, 생식세포 계열을 통한 인간 DPP4 유전자/단편의 전달을 확인하기 위해, 유전자도입 비-인간 동물로부터의 DNA가 위에 기재된 바와 유사한 방식으로 스크리닝된다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 인간화된 DPP4 설치류는 인간 DPP4 대립유전자에 대해 이형접합성이다. 그렇기 때문에, 이러한 설치류는 1개의 인간 DPP4 대립유전자 및 1개의 야생형 설치류 DPP4 대립유전자를 갖는다. 다른 실시 형태에서, 인간화된 DPP4 설치류는 인간 DPP4 대립유전자에 대해 동형접합성이다.
인간화된 DPP4 설치류의 용도
인간화된 DPP4 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트는 고혈당증의 치료에 유용한 인간-특이적 DPP4 길항제, 예를 들어, 소분자, 펩티드 또는 생물학적 억제제의 약물역학 (PD)을 평가하는 데 유용하다.
인간화된 DPP4 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서의 약물동력학 (PK) 및 PD 검정법은 본 기술분야에 알려진 표준 과정에 따라 수행된다.
인간화된 DPP4 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트는 고혈당증의 치료에서 인간-특이적 DPP4 길항제, 예를 들어, 소분자, 펩티드 또는 생물학적 억제제의 생체내 치료 효능을 평가하는 데 유용하다.
인간화된 DPP4 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트는, MERS-CoV 감염의 치료 또는 방지 (또는 예방)에서, 인간 DPP4와 특이적으로 상호작용하는, 표적 분자, 예를 들어, MERS-CoV (예를 들어, MERS-CoV의 스파이크 단백질 (S), 예를 들어, MERS-CoV의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인)에 특이적인 길항제, 예를 들어, 소분자, 펩티드 또는 생물학적 억제제, 예를 들어, 중화 항체의 생체내 치료 효능을 시험하는 데 유용하다. 일부 실시 형태에서, 인간 DPP4 대립유전자에 이형접합성인 설치류가 MERS-CoV 감염의 치료 또는 방지 (또는 예방)에서 하나 이상의 길항제의 생체내 치료 효능을 시험하는 데 사용된다. 다른 실시 형태에서, 인간 DPP4 대립유전자에 동형접합성인 DPP4 설치류가 MERS-CoV 감염의 치료 또는 방지 (또는 예방)에서 하나 이상의 길항제의 생체내 치료 효능을 시험하는 데 사용된다.
예시적인 MERS-CoV 균주는 MERS-CoV Jordan 균주 (진뱅크(GenBank) 수탁 번호 KC776174.1, MERS-CoV- Hu/Jordan-N3/2012) 및 MERS-CoV EMC/2012 균주 (진뱅크 수탁 번호 JX869059.2)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 MERS-CoV 바이러스는 MERS-CoV 임상 단리물을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 MERS-CoV 바이러스는 본 명세서에 기재된 임상 단리물과 동일한 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인 (RBD) 서열을 포함하는 균주를 포함한다. 예시적인 임상 단리물이 아래 표에 나타나있다. 표는 몇몇 MERS-CoV 임상 단리물의 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD) 내 아미노산 서열 변이를 보여준다. MERS-CoV 임상 단리물의 미국 국립 생물공학 정보 센터 (NCBI)-기탁 서열을 아미노산 367-606에서 정렬하고 EMC/2012 균주의 아미노산 서열과 비교하였다. A431P, S457G, S460F, A482V, L506F, D509G, 및 V534A 치환 (여기서, 숫자 앞의 아미노산 (단일 문자 표기)은 EMC/2012 균주의 것이고, 숫자 뒤의 아미노산 (단일 문자 표기)은 임상 단리물의 것임)을 갖는 임상 단리물이 표에 나타나있다.
[표 I]
Figure 112016111006875-pct00001
일부 실시 형태에서, 길항제는 설치류에서 MERS-CoV 감염 전 (예를 들어, 적어도 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일, 또는 그보다 더 전)에 투여된다. 다른 실시 형태에서, 길항제는 설치류에서 MERS-CoV 감염 후 (예를 들어, 적어도 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일, 또는 그보다 더 후)에 투여된다.
길항제가 MERS-CoV 감염 후에 설치류에 투여되는 일부 실시 형태에서, 대조군 수준과 비교하여, 길항제의 투여 후 설치류에서의 더 낮은 바이러스 역가 또는 RNA 수준 (예를 들어, 바이러스 UpE 또는 리더 서열 RNA 수준), 예를 들어, 적어도 5배 (예를 들어, 적어도 5배, 10배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 104배, 105배, 106배, 107배 또는 그 초과) 더 낮은 바이러스 역가 또는 RNA 수준은 길항제가 MERS-CoV 감염을 치료하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다. 예를 들어, 대조군 수준은 길항제 투여 전 설치류에서의 바이러스 역가 또는 RNA 수준이다. 다른 예에서, 대조군 수준은 길항제로 처리되지 않은 바이러스-감염 설치류에서의 바이러스 역가 또는 RNA 수준이다.
길항제가 MERS-CoV 감염 전에 설치류에 투여되는 일부 실시 형태에서, 대조군 수준과 비교하여, 길항제의 투여 후 설치류에서의 더 낮은 바이러스 역가 또는 RNA 수준 (예를 들어, 바이러스 UpE 또는 리더 서열 RNA 수준), 예를 들어, 적어도 5배 (예를 들어, 적어도 5배, 10배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 104배, 105배, 106배, 107배 또는 그 초과) 더 낮은 바이러스 역가 또는 RNA 수준은 길항제가 MERS-CoV 감염을 예방하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다. 예를 들어, 대조군 수준은 길항제로 처리되지 않은 MERS-CoV로 감염된 설치류의 바이러스 역가 또는 RNA 수준이다.
일부 실시 형태에서, 설치류 폐에서의 바이러스 RNA 수준은 페놀을 함유하는 용액, 예를 들어, 페놀 및 구아니디늄 아이소티오시아네이트를 함유하는 용액 (예를 들어, 트리졸(Trizol)® (라이프 테크놀로지즈, 인크(Life Technologies, Inc)))에서의 균질화에 의해 설치류 폐로부터 RNA를 추출함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 폐는 제조사의 사용설명서에 따라 마그날라이저(Magnalyzer) (로체(Roche))를 사용하여 균질화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, MERS-CoV RNA의 수준은 MERS-CoV 게놈을 표적으로 하는 프라이머 및/또는 MERS-CoV mRNA 전사체를 표적으로 하는 프라이머를 사용하여 정량적 PCR (qPCR)을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 태크맨® 고속 바이러스 1-단계 마스터 믹스(Fast virus one-step master mix) (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))가, 라이프 테크놀로지즈로부터 입수된, 외피(envelope) 유전자 상류의 게놈의 영역을 표적화하는 프라이머 (UpE) 또는 뉴클레오캡시드 메신저 RNA의 리더 서열을 표적화하는 프라이머 (리더 프라이머)의 이중가닥(duplex)을 사용하여 제조사의 사용설명서에 따라 qPCR에 사용되고, 내인성 대조군, 예컨대 설치류 (예를 들어, 마우스) 18S rRNA와 비교될 수 있다. 예를 들어, 마이크로앰프(Microamp)® 고속 광학 반응 플레이트(fast optical reaction plate) (어플라이드 바이오시스템즈)에서의 qPCR 반응은 7500 고속 DX 실시간 PCR 장치 (어플라이드 바이오시스템즈)에서 판독될 수 있다. 일부 예에서, qPCR 데이터는 델타 Ct 방법을 사용하여 분석될 수 있으며, 이때 감염되지 않은 대조군은 1로 설정된다. 예를 들어, 검출된 MERS-CoV RNA 퍼센트는 대조군 길항제, 예를 들어, 길항제가 MERS-CoV에 대한 항체인 경우, 동일 아이소타입(isotype-matched) 대조군 항체로 처리된 감염된 마우스에서 검출된 RNA의 수준에 대해 상대적으로 표시될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 설치류 폐에서의 바이러스 역가는 설치류 폐를 완충액 (예를 들어, 인산 완충 식염수 (PBS))에서 균질화하고 (예를 들어, 10,000 rpm으로) 원심분리하여 결정될 수 있다. 상청액을 포유류 세포, 예컨대 베로(Vero) 세포 (예를 들어, 베로 E6 세포)에서 플라크 검정법으로 분석하여, 길항제 처리 후 남아있는 바이러스의 수준을 정량할 수 있다. 표준 플라크 검정법, 예를 들어, 문헌[Page et al. (2012) Induction of alternatively activated macrophages enhances pathogenesis during severe acute respiratory syndrome coronavirus infection, J Virol 86:13334―13349]에 기재된 플라크 검정법이 사용될 수 있다. 일부 예에서, 페이지(Page) 등의 플라크 검정법은 변형될 수 있는데, 이러한 변형은 플라크가 나타나도록 3일 동안 플레이트를 둠으로써 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 대조군 폐 샘플과 비교하여, MERS-CoV 감염 전 또는 후에 길항제로 처리된 설치류의 폐 샘플에서, 예를 들어, 조직학적 분석에 의해 결정된, 더 적은 염증 (예를 들어, 간질 또는 혈관주위 염증), 더 적은 염증 세포, 및/또는 더 적은 세기관지 세포침윤(cuffing)은 길항제가 MERS-CoV 감염을 치료하거나 예방하는 데 효과적임을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 대조군 폐 샘플은, 길항제로 처리되지 않은, 예를 들어, 감염 전 및/또는 후에 처리되지 않은, MERS-CoV로 감염된 설치류로부터 유래된 것일 수 있다.
본 명세서에 기재된 설치류는, 예를 들어, 인간에서 임상 시험 전에 안전성 및 효능을 입증하기 위한, MERS-CoV에 대한 약물 및 백신의 효율적인 시험에 유용하다. 그들은, 예를 들어 시험 수주 이내의, 치료제/예방제의 신속한 확인 및/또는 검증을 가능하게 한다.
정의
상동 아미노산 잔기는 유사한 특징 또는 특성을 공유하는 잔기이다. 아미노산 잔기의 특징 또는 특성은, 예를 들어, 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들어, 시트 또는 나선 형태, 잔기의 전하 또는 소수성, 및/또는 측쇄(들)의 벌크(bulk)를 기초로 한다. 예를 들어, 상동 잔기는 측쇄 특성, 예를 들어, 극성, 전하, 크기, 방향족성, 및/또는 소수성에서 유사하다.
용어, "약"은 명시된 값에서 플러스 또는 마이너스한 다른 양을 말하고; 따라서 값의 범위를 설정한다. 소정의 실시 형태에서, "약"은 기준 (또는 중심(core) 또는 참조) 값 또는 양에 대하여 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25% 또는 0.1%까지 플러스 또는 마이너스한 범위를 말한다. 예를 들어, 약은 나열된 수, 예를 들어, 뉴클레오티드 염기의 수의 위 및 아래로 +/- 5% 범위를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 구성요소들, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열들의 위치가 그들의 의도된 방식으로 그들이 기능하도록 허용하는 관계에 있는 것을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩티드, 펩티드, 폴리펩티드의 단편, 및 융합 폴리펩티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "핵산"은 단일 또는 이중-가닥 형태로 함께 공유적으로 결합된 2개 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 말한다.
유전자 대체와 관련하여, 용어 "대체"는 외인성(exogenous) 유전 물질을 내인성 유전자 좌에 위치시켜, 이종상동(orthologous) 또는 상동 핵산 서열로 내인성 유전자의 전체 또는 일부를 대체하는 것을 말한다. 일례로, 내인성 비-인간 유전자 또는 그의 단편이 상응하는 인간 유전자 또는 그의 단편으로 대체된다. 상응하는 인간 유전자 또는 그의 단편은, 구조 및/또는 기능에 있어서, 대체된 내인성 비-인간 유전자 또는 그의 단편의 오르토로그이거나, 그의 호모로그이거나, 또는 그와 실질적으로 동일하거나 같은 인간 유전자 또는 단편이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "설치류"는 설치목(order Rodentia)의 임의의 구성원을 말한다. 설치류의 예는, 제한 없이, 마우스, 래트, 다람쥐, 프레리 도그, 호저, 비버, 기니피그, 및 햄스터를 포함한다. 일 실시 형태에서, 설치류는 래트이다. 다른 실시 형태에서, 설치류는 마우스이다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 단수형은 복수의 지시대상을 포함한다.
본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 한정은, 마치 더 낮은 수치 한정이 본 명세서에 명확히 기재되어 있는 것처럼, 모든 그러한 더 낮은 수치 한정을 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 한정은, 마치 더 높은 수치 한정이 본 명세서에 명확히 기재되어 있는 것처럼, 모든 그러한 더 높은 수치 한정을 포함할 것이다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는, 마치 그러한 더 넓은 수치 범위에 들어가는 모든 더 좁은 수치 범위가 모두 본 명세서에 명확히 기재되어 있는 것처럼, 그러한 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다.
하기 실시예는 단지 설명을 목적으로 제공되고 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1
인간 DPP4 유전자로의 내인성 마우스 Dpp4 유전자의 대체
인간 DPP4 유전자의 엑손 2 내지 엑손 26 및 3' 비번역 영역의 일부를 함유하는 81.8 kb 인간 DPP4 유전자가 엑손 2 내지 엑손 26에서의 정지 코돈에 걸친 뮤린 Dpp4 유전자 좌의 78.8 kb를 대체하였다. 도 1a 및 도 1b를 참조한다.
벨로시진(VelociGene)® 유전자 조작 기술을 사용하여, 단일 표적화 단계로 인간 DPP4 유전자로 마우스를 대체하기 위한 표적화 작제물을 작제하였다 (문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659] 참조). 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론 RP23-362N15 및 RP11-68L22 각각으로부터 마우스 및 인간 DPP4 DNA를 얻었다. 간략히 말하면, 엑손 2의 상류 인트론 1 내지 정지 코돈을 포함하는 엑손 26 및 3' 비번역 영역의 일부에 걸친 인간 DPP4 서열 (인간 DPP4 유전자 전체의 유전자 좌표: GRCh38: chr2:162,848,755-162,931,052 (- 가닥))의 82 kb를 플랭킹하는 마우스 Dpp4 상류 및 하류 상동성 아암, 및 플록싱된 네오 선택 카세트를 함유하도록 갭 리페어 클로닝(gap repair cloning)으로 생성된 SgrDI 선형화된 표적화 작제물을 VGB6 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 (C57BL/6N 마우스로부터 유래됨) 내로 전기천공하였다. 올바르게 표적화된 ES 세포 (MAID 7326)를 일시적 Cre-발현 벡터와 함께 추가로 전기천공하여 약물 선택 카세트를 제거하였다. 약물 카세트가 없는 표적화된 ES 세포 클론 (MAID 7327)을 벨로시마우스® 방법으로 8-세포기 SW 마우스 배아 내로 도입하였다 (미국 특허 제7,294,754호, 제7,576,259호, 제7,659,442호, 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조). 인간화된 DPP4 유전자를 함유하는 벨로시마이스(VelociMice)® (공여 ES 세포로부터 전적으로 유래된 F0 마우스)를 대립유전자 검정법의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및 인간 대립유전자의 획득에 대한 유전자형 결정(genotyping)으로 확인하였다 (문헌[Valenzuela et al. (2003)] 참조).
올바르게 표적화된 ES 세포 클론을 천연-대립유전자의-손실(loss-of-native-allele) (LONA) 검정법으로 확인하였는데 (문헌[Valenzuela et al. 2003]), 여기서는 천연의 비변형된 Dpp4 유전자의 카피 수를, 결실에 대해 표적화된 마우스 Dpp4 유전자에서의 서열에 특이적인 2개의 태크맨™ 정량적 중합효소 연쇄 반응 (qPCR)으로 결정하였다. qPCR 검정법은 하기 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 작성됨)를 포함하였다: 상류 정방향 프라이머, TCGCCACTGT GCCTAACATA G (서열 번호 1); 상류 역방향 프라이머, CCGGGACTAA ACTGGAACAT TC (서열 번호 2); 상류 프로브, FAM-TCAGTCAACT TCTTCTGGGT TGTTTCC-BHQ (서열 번호 3); 하류 정방향 프라이머, CAGCTCTGGT GGAGAACTAG AC (서열 번호 4); 하류 역방향 프라이머, GGAGGTCCTC GGTCTTTAGA AG (서열 번호 5); 하류 프로브, FAM-TCACACTTAG GCTTATAAAC CATTCCCGT-BHQ (서열 번호 6); 여기서, FAM은 5-카르복시플루오레세인 형광 프로브를 말하고 BHQ는 블랙 홀 퀀처 유형(black hole quencher type)의 형광 퀀처(바이오서치 테크놀로지즈(Biosearch Technologies))를 말한다. 표적화 벡터를 받아들이고 게놈 내에 혼입된 ES 세포 클론으로부터 정제된 DNA를 제조자의 제안사항에 따라 384-웰 PCR 플레이트 (마이크로앰프™ 광학 384-웰 반응 플레이트, 라이프 테크놀로지즈)에서 태크맨™ 유전자 발현 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지즈)와 합하고, 어플라이드 바이오시스템즈 프리즘 7900HT에서 순환시켰는데, 이는 PCR 과정 동안 형광 데이터를 수집하고, 축적된 형광이 미리-설정된 역치에 도달하는 분획 PCR 주기인 역치 주기 (Ct)를 결정한다. 상류 및 하류 DPP4-특이적 qPCR 및 비-표적화된 참조 유전자에 대한 2개의 qPCR을 각각의 DNA 샘플에 대해 실행시켰다. 각각의 DPP4-특이적 qPCR과 각각의 참조 유전자 qPCR 사이의 Ct 값의 차이 (ΔCt)를 계산한 후, 검정된 모든 샘플에 대한 각각의 ΔCt와 ΔCt 중간값 사이의 차이를 계산하여 각각의 샘플에 대한 ΔΔCt 값을 얻었다. 각각의 샘플에서의 DPP4 유전자의 카피 수를 하기 식으로부터 계산하였다: 카피 수=2×2-ΔΔCt. 천연 카피들 중 하나를 상실한, 올바르게 표적화된 클론은 그 하나와 동일한 Dpp4 유전자 카피 수를 가질 것이다. 인간 DPP4 유전자 서열이, 인간화된 대립유전자 내의 결실된 마우스 Dpp4 유전자 서열을 대체하였음에 대한 확인은 하기 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 작성됨)를 포함하는 태크맨™ qPCR 검정법으로 확인하였다: 인간 상류 정방향 프라이머, GCGGTCTCCC TCTTCTAACG (서열 번호 7); 인간 상류 역방향 프라이머, GCAAGCCGAG CAGATCAAG (서열 번호 8); 인간 상류 프로브, FAM-ACTCCCACCT GCAAATCCTG CTGC-BHQ (서열 번호 9); 인간 하류 정방향 프라이머, AACCGCACTG GCATATGGA (서열 번호 10); 인간 하류 역방향 프라이머, TACAAGGTAG TCTGGGATTA CTAACAAAA (서열 번호 11); 인간 하류 프로브, FAM-ACATTTATCT AGAAAGGCTC-BHQ (서열 번호 12).
동일한 LONA 검정법을 사용하여, 표적화된 ES 세포로부터 유래된 마우스에 대한 꼬리 생검(biopsy)으로부터 정제된 DNA를 검정하여 그의 DPP4 유전자형을 결정하고 인간화된 DPP4 대립유전자가 생식세포 계열을 통해 전달되었는지를 확인한다. 대체에 대해 이형접합성인 2마리의 새끼를 교배하여, 내인성 마우스 Dpp4 유전자의 인간 DPP4 유전자에 의한 대체에 대해 동형접합성인 마우스를 생성한다. 대체에 대해 동형접합성인 새끼를 표현형 분석에 사용한다.
뮤린 Dpp4 좌 및 인간 DPP4 유전자를 함유하는 서열의 상류 연결부는 5'-AGGAGAGAAG CCAACAAGAT CATAAGATCA TGCTCAGGGC CAAAATTCAA GGGCTTCTGC (CGTCGACG) GCCTTAGAGA ACTCCAACTG GCGCACTCCA GACGCCACCC CCACCCCCAG CCCGCGGTCT CCCTCTTCTA ACGCACTCCC ACCTGCAAAT (서열 번호 13) 내에 존재하도록 설계되며, 여기서 인간 DPP4 서열은 이탤릭체로 쓰여 있고, SgrDI 제한 부위는 괄호로 묶여 있다. 인간 DPP4 유전자를 함유하는 서열 및 플록싱된 네오 선택 카세트의 하류 연결부는 5'-TTATTCCAGG GAACTATGAT GAGGCTTATA TAAGAACGAA TAAGATCAGA AATATCATTC TGGCAGTTCT TATGGCTCAG ctcgag(ataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat) atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg (서열 번호 14) 내에 존재하도록 설계되며, 여기서 인간 DPP4 서열은 이탤릭체로 쓰여 있고, 네오 카세트 서열은 소문자이고, loxP 부위는 괄호로 묶여 있다. 플록싱된 네오 선택 카세트의 서열 및 뮤린 Dpp4 좌의 하류 연결부는 5'-atgtctgga(a taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tat)gctagta actataacgg tcctaaggta gcgagctagc CAGCATAGCT CTCCATAGCT TATTTAAGAC CACATTTGTT CTCATTATCT CAAAAGTGCA CTGTTAAGAT GAAGATCTTA (서열 번호 15) 내에 존재하도록 설계되며, 여기서 네오 카세트 서열은 소문자이고, loxP 부위는 괄호로 묶여 있다. 네오 선택 카세트의 제거 후, 인간 DPP4 유전자를 함유하는 서열, 네오 선택 카세트의 제거 후에 남은 loxP 부위, 및 뮤린 Dpp4 좌의 연결부는 5'- TATTCCAGGG AACTATGATG AGGCTTATAT AAGAACGAAT AAGATCAGAA ATATCATTCT GGCAGTTCTT ATGGCTCAG ctcgag(ataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat) gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagcCA GCATAGCTCT CCATAGCTTA TTTAAGACCA CATTTGTTCT CATTATCTCA AAAGTGCACT GTTAAGATGA AGATCTTAAT AATGTTGCAT TGAGACATTT CAGGCTGCTT TCTCCAGTTT TACACCTGCA ATCCTAACTA AGGATGCCTG TCCCCAGAAC (서열 번호 16) 내에 존재하도록 설계되며, 여기서 인간 DPP4 서열은 이탤릭체로 쓰여 있고, 네오 카세트 서열은 소문자이며, loxP 부위는 괄호로 묶여 있다.
도 2는 MAID 7326/7327에서 인간화된 DPP4 핵산 서열에 의해 인코딩된 DPP4의 아미노산 서열 (서열 번호 17)이 인간 DPP4와 동일하다는 것을 보여주는데, 마우스 Dpp4 코돈 1이 DPP4의 처음 2개의 아미노산, Met 및 Lys만을 인코딩하며, 이들 아미노산은 인간 DPP4 코돈 1에 의해 인코딩된 것과 동일하기 때문이다.
실시예 2
MERS-CoV에 의한 인간화된 DPP4 마우스의 감염
중동 호흡기 증후군 ― 코로나바이러스 (MERS-CoV)는 중증 급성 호흡기 질환을 야기하는 새롭게 등장한 바이러스이다. MERS-CoV에 대한 수용체는 다이펩티딜 펩티다제 IV (DPP4)이다 (문헌[Raj et al. (2013) Dipeptidyl Peptidase 4 is a Functional Receptor for the Emerging Human Coronavirus-EMC, Natuere 495(7440):251-254] 참조). 항-바이러스 분자의 생체내 시험은 MERS-CoV 감염에 취약한 동물 모델, 예를 들어, 소동물 모델, 예컨대 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트)를 필요로 한다. 그러나, 최근 연구는, MERS-CoV 스파이크 단백질은 인간 DPP4와는 상호작용하지만 마우스는 그렇지 않다는 적어도 부분적인 이유로 (예를 들어, 문헌[Coleman et al. (2013)]; 및 문헌[Raj et al. (2013)] 참조), 마우스 Dpp4는 MERS-CoV 감염을 지지할 수 없다는 것을 보여주었다 (예를 들어, 문헌[Cockrell et al. (2014) Mouse Dipeptidyl Peptidase is Not a Functional Receptor for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) Infection, J. Virol. 88(9):5195-5199]; 및 문헌[Coleman et al. (2014) Wild-Type and Innate Immune-Deficient Mice are Not Susceptible to the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, J. Gen. Virol. 95(2):408-412] 참조). 마우스 및 인간 DPP4 서열의 서열 비교는, MERS-CoV 스파이크 (S) 단백질과 그의 수용체 사이의 접촉 부위로서 이전에 확인된 아미노산이 2개의 종들 사이에서 상이하다는 것을 밝혔다. 부가적으로, 마우스 세포에서의 인간 DPP4의 발현은 MERS-CoV 바이러스 진입 및 전파를 허용하는데, 이는 바이러스의 진입은 마우스 세포의 감염에서의 제한 단계이고, 마우스 DPP4와 MERS-CoV 당단백질 사이의 상호작용의 결여는 시험관내(in vitro)에서 종 친화성을 규정한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 문헌[Lu et al. (2013) Molecular basis of binding between novel human coronavirus MERS-CoV and its receptor CD26, Nature. 500(7461):227-31]; 및 문헌[Cockrell et al. (2014) Mouse Dipeptidyl Peptidase is Not a Functional Receptor for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) Infection, J. Virol. 88(9):5195-5199]을 참조한다.
그 결과, 정상 마우스 계통은 치료제 표적화 MERS-CoV의 효능을 측정하는 데 사용될 수 없다. 문헌[Zhao et al. (2014) Rapid Generation of a Mouse Model for Middle East Respiratory Syndrome, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111(13):4970-4975]은 아데노바이러스 형질도입에 의해 마우스에서 인간 DPP4를 발현하였고, 따라서 MERS-CoV 감염을 허용하였다. 그러나, 이러한 아데노바이러스 모델은 다음을 포함하는 몇 가지 제한을 갖는다: (a) 바이러스는 감염된 마우스로부터 신속하게 제거됨; (b) 시간이 지남에 따라 인간 DPP4 발현이 손실됨; (c) 바이러스에 의해 형질도입된 DPP4의 조직 분포는 마우스 또는 인간에서 보여지는 발현을 반영하지 않음; 및 (d) 아데노바이러스 감염은 인터페론 반응을 유도함.
MERS-CoV 감염에 대한 마우스 모델을 생성하기 위해, 인간화된 DPP4 마우스를 실시예 1에서 상기된 바와 같이 생성하였다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 마우스 Dpp4의 엑손 2 내지 엑손 26을 상응하는 인간 DPP4의 서열로 대체하였다. 남은 마우스 Dpp4 코딩 엑손 1은 Dpp4의 처음 2개의 아미노산, Met 및 Lys - 이들은 상응하는 인간 DPP4 엑손 1에 있는 것과 동일함 - 만을 인코딩하기 때문에, 인간화된 DPP4 마우스에서 발현되는 DPP4 단백질은 완전히 인간이다 (도 2, 서열 번호 17 참조). 따라서, 인간화된 DPP4 마우스는 내인성 마우스 조절 서열, 즉, 5' 플랭킹 영역 (프로모터 및 인핸서(들)), 및 3' 비번역 영역 서열의 제어 하에서 완전한 인간 DPP4를 발현한다. 인간화된 DPP4는, 마우스 Dpp4가 인간 DPP4핵산 서열이 결여된 야생형 마우스에서 발현되는 것과 동일한 세포 및 조직에서 동일하거나 유사한 수준으로 발현될 것으로 예상된다.
2 마리의 F0 인간화된 DPP4 마우스를 MERS-CoV (Jordan 균주)로 비강내로 감염시키거나 또는 PBS로 모의 처리하였다. 감염 후 4일째에, MERS-CoV RNA를 MERS-CoV 게놈의 복제형에 특이적인 프라이머를 사용하여 실시간 PCR로 폐에서 정량화하였다. 데이터를 모의-감염된 마우스의 폐로부터 얻어진 PCR 산물의 양 (임의로 1로 설정함)에 대해 정규화하였다. 도 3은 MERS-CoV RNA가 MERS-CoV-감염된 인간화된 DPP4 마우스의 폐로부터 증폭될 수 있다는 것을 보여준다. 모의- 및 MERS-CoV-감염된 마우스로부터의 폐 조직을 사용하여 H&E 염색을 또한 수행하였다. 도 4는 인간화된 DPP4 마우스의 MERS-CoV 감염이 기도에는 영향을 주지 않았지만, 폐포 벽을 비후화하고 폐포 세포들 사이의 공간을 좁게 한다는 것을 보여주는데, 이는 폐에서의 염증이 MERS-CoV 감염과 관련되었음을 나타낸다.
부가적으로, 6 내지 8주령 마우스에 MERS-CoV, 예를 들어, 2 × 105 pfu의 MERS-CoV (Jordan)를 비강내로 접종하였다. 사망 또는 질환의 임상 징후는 접종 후 4일까지 관찰되지 않았다. 접종 후 2일째 및 4일째에, 마우스를 안락사시키고 그의 폐를 절개하였다. 바이러스 RNA 수준을 얻기 위해, 폐를 트리졸®에서 균질화하고, RNA를 추출하고, MERS-CoV에 특이적인 프라이머를 사용하여 실시간 PCR로 분석하였다 (도 10a 및 도 10b). 한 프라이머 세트는 외피 유전자 상류의 바이러스 게놈의 영역에 특이적이었고 (UpE), 다른 프라이머 세트는 뉴클레오캡시드 mRNA의 리더 서열에 특이적이었다 (리더 프라이머). 마우스 18S rRNA를 내인성 대조군으로서 사용하였다.
바이러스 역가를 얻기 위해, 폐를 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 균질화하고, 원심분리로 청징화하고, 베로 E6 세포에서 적정하였다 (도 10c). 예를 들어, 상청액을 베로E6 세포에서 플라크 검정법으로 분석하여 폐에 존재하는 바이러스의 수준을 정량하였다. 예를 들어, 문헌[Page et al. (2012) Induction of alternatively activated macrophages enhances pathogenesis during severe acute respiratory syndrome coronavirus infection, J Virol 86:13334―13349]에 기재된 바와 같이 플라크 검정법을 수행하였으며, 이때 플라크가 나타나도록 3일 동안 플레이트를 두었다.
폐에서의 강력한 MERS-CoV 복제는 감염 후 2일째 및 4일째에 명백하였다. 복제 중인 MERS-CoV만을 증폭하도록 설계된 MERS-CoV 리더에 특이적인 프라이머 세트를 사용하는 RNA 정량화는, 2일째에 수집된 폐에서 고수준의 MERS-CoV 복제 RNA를 보여주었고, 이러한 수준은 감염 후 4일까지 유지되었다 (도 10a 및 도 10b). 베로 E6 세포에서의 폐 균질화물의 플라크 검정법은 감염 후 2일째에 약 7.27×104 pfu/mL 폐의 그리고 감염 후 4일째에 약 3.75×105 pfu/mL 폐의 MERS-CoV (Jordan) 수준을 정량하였고 (도 10c), 이는 감염된 인간화된 DPP4 마우스의 폐에서의 MERS-CoV의 활발한 복제를 보여준다.
또한, MERS-CoV (Jordan 균주) 또는 PBS (모의 감염)를 비강내로 접종한 인간화된 DPP4 마우스로부터의 폐를 병리학적 변화에 대해 분석하였다 (도 10d). 감염 후 2일째에, 세기관지 세포 구조에서의 변화가 폐 도처에서 발견됨에 따라 세기관지-주위 염증이 명백하였다. 최소한의 혈관-주위 염증 또는 폐포 구조에 대한 영향이 이 시점에서 관찰되었다. 감염 후 4일째에, 혈관-주위 세포침윤 및 광범위한 폐포 비후와 함께 간질 침윤이 관찰되었다. 세기관지 변화도 존재하였다. 도 10d를참조한다. 이러한 병리는 MERS-CoV를 보유하는 인간에서 보여지는 간질성 폐렴 및 중대한 폐 질환의 발달의 방사선 투과(radiographic) 결과와 일치한다.
상기 데이터는 인간화된 DPP4 마우스, 예컨대 본 명세서에 기재된 것이 MERS-CoV 감염에 취약하다는 것을 보여준다. 이 데이터는 또한 본 명세서에 기재된 인간화된 DPP4 마우스가 인간의 MERS-CoV 감염에서 보여지는 병리, 예를 들어, 병적 후유증을 개괄하는 MERS-CoV 감염의 생체내모델이라는 것을 보여준다.
따라서, 인간화된 DPP4 마우스는 생체내 MERS-CoV 치료를 평가하는 데 유용한 MERS-CoV의 강력한 모델이다. 예를 들어, 인간화된 DPP4 마우스는 MERS-CoV를 표적으로 하는 치료 분자의 약물동력학, 약물역학 및 치료 효능을 측정하기에 적절한 숙주 동물이다.
도 5는 마우스 Dpp4 (서열 번호 25) 및 인간 DPP4 (7326/7327 유전자도입 마우스에 의해 인코딩됨) (서열 번호 26)의 단백질 서열 정렬을 보여준다.
다음으로, MERS-CoV 감염 후 시간의 함수로서 체중에 대한 용량-반응 연구를 인간화된 DPP4 마우스에서 실시하였다. 위에 기재된 바와 같이, 마우스를 MERS-CoV (Jordan 균주) 또는 PBS (모의 감염됨)으로 감염시키고 7일의 기간에 걸쳐, 증식성 감염의 징후인 체중 감소에 대해 분석하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 인간화된 DPP4 마우스는, 감염 후 4일째에 체중 감소가 시작되면서, 증식성 감염 (즉, 현성(manifested) 질환 병리)을 나타내었다. 그룹당 4 마리 또는 5 마리의 마우스를 사용하였다. 도 15는 인간화된 DPP4 대립유전자에 이형접합성인 마우스가 동형접합체와 비교할 때 유사한 정도의 체중 감소를 나타낸 바와 같이 그것은 MERS-CoV에 의한 감염에 동등하게 취약하였음을 보여준다. 이러한 결과는, 이형접합성 마우스를 사용하여 연구를 실시할 수 있다는 것을 나타내기 때문에 유의하다. 부가적으로, 이형접합성 마우스의 사용은 동형접합성 인간화된 DPP4 마우스에 잠재적으로 존재할 수 있는, 기능적 마우스 Dpp4 녹아웃(knockout)에 관련된 임의의 잠재적인 이슈를 피한다.
이들 마우스의 폐를 또한 위에 기재된 방법에 따라 염증에 대해 조직학적으로 조사하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 고용량의 바이러스 (1 × 10exp6 pfu/마우스)에 노출된 hDPP4 마우스는 PBS 대조군에 비해 증가된 병리를 나타내었다.
실시예 3
BAC의 무작위 삽입을 사용한 인간 DPP4 유전자를 함유하는 유전자도입 마우스의 생성
인간 DPP4 유전자를 함유하는 유전자도입 마우스를 생성하였고, 이에 대한 서열 및 유전 정보가 도 6에 나타나 있다. 인간 DPP4 유전자를 함유하는 하기의 2개의 상이한 중첩되는 BAC들을 사용하였다: BAC RP11-68L22 및 BAC RP11-345J9 (도 7). 두 BAC 모두는 인간 DPP4 유전자의 코딩 영역, 및 DPP4 유전자의 ATG 시작 코돈 상류의 프로모터 영역의 40 kb 초과 및 DPP4 유전자의 정지 코돈 하류의 수 킬로베이스를 포함하였다 (도 7).
BAC 유전자도입 마우스를 생성하기 위해, 각각의 BAC DNA를 VGB6 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 (C57BL/6N 마우스로부터 유래됨) 내로 전기천공하였다. 인간 DPP4 유전자의 코딩 영역, 및 그 유전자의 프로모터 영역을 함유하는 ES 세포를 벨로시마우스® 방법으로 8-세포기 SW 마우스 배아 내로 도입하였다 (예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호, 제7,576,259호, 제7,659,442호, 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조).
대립유전자 검정법의 인간 획득을 사용하여, 인간 DPP4 유전자의 카피 및 그 유전자의 프로모터 영역을 함유한 것에 대하여 ES 세포 클론을 스크리닝하였다. 또한 대립유전자 검정법의 인간 획득을 사용하여, 인간화된 DPP4 유전자 및 그 유전자의 프로모터 영역을 보유하는 벨로시마이스® (공여 ES 세포로부터 전적으로 유래된 F0 마우스)를 확인하였다.
간략히 말하면, 표준 방법을 사용하여 ES 세포 클론으로부터 게놈 DNA를 추출하고, 인간 DPP4 코딩 서열 상류 (7333 hTU) 및 하류 (7333 hTD)의 인간 DNA 서열을 검출하기 위해 2 세트의 프라이머-프로브를 사용하여 태크맨™ 정량적 PCR (qPCR) 검정법에서 시험하였다 (도 8). 각각의 프라이머-프로브 세트가 어닐링된 인간 DPP4 유전자 및 플랭킹 영역 (예를 들어, 프로모터 영역) 내 위치가 도 7에 나타나 있다. 태크맨™ qPCR 검정법에서 백그라운드 위의 형광 판독은 유전자도입 마우스 게놈 내로 혼입된 인간 DPP4 유전자 및 적어도 40 kb의 인간 DPP4 유전자의 5' 플랭킹 영역의 존재를 나타내었다.
7333 hTU 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 쓰여짐)는 인간 상류 정방향 프라이머, TGGCTTATTCTCTATTCCTCACCTA (서열 번호 18); 인간 상류 프로브, FAM-TGCTTTCCCTCCTCCCTTCTGA-BHQ (서열 번호 19); 인간 상류 역방향 프라이머, GGCCTTAGCCCAGAAACTG (서열 번호 20)였다. 7333 hTD 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 쓰여짐)는 인간 하류 정방향 프라이머, TGCAGACTTGTCTTGACATTCATA (서열 번호 21); 인간 하류 프로브, CAL-AGCCTCTGCAGACACAGGAATGGC-BHQ (서열 번호 22); 및 인간 하류 역방향 프라이머, TCTGGGCACTGGTGTACTC (서열 번호 23)이었고; 여기서, FAM 및 CAL은 각각 5-카르복시플루오레세인 및 CAL 오렌지 형광 프로브를 말하고, BHQ는 블랙 홀 퀀처 유형의 형광 퀀처 (바이오서치 테크놀로지즈)를 말한다.
예를 들어, ES 세포 클론으로부터의 게놈 DNA를 제조자의 제안사항에 따라 384-웰 PCR 플레이트 (마이크로앰프™ 광학 384-웰 반응 플레이트, 라이프 테크놀로지즈)에서 태크맨™ 유전자 발현 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지즈)와 합하고, 어플라이드 바이오시스템즈 프리즘 7900HT에서 순환시켰는데, 이는 PCR 과정 동안 형광 데이터를 수집하고, 축적된 형광이 미리-설정된 역치에 도달하는 분획 PCR 주기인 역치 주기 (Ct)를 결정한다. 상류 및 하류 DPP4-특이적 qPCR 및 비-DPP4 참조 유전자에 대한 2개의 qPCR을 각각의 DNA 샘플에 대해 실행시켰다. 각각의 DPP4-특이적 qPCR과 각각의 참조 유전자 qPCR 사이의 Ct 값의 차이 (ΔCt)를 계산한 후, 검정된 모든 샘플에 대한 각각의 ΔCt와 ΔCt 중간값 사이의 차이를 계산하여 각각의 샘플에 대한 ΔΔCt 값을 얻었다. 각각의 샘플에서의 DPP4 유전자의 카피 수를 하기 식으로부터 계산하였다: 카피 수=2×2-ΔΔCt. 염색체 내로 혼입된 인간 DPP4 및 프로모터 영역의 하나 이상의 카피를 함유하는 클론은 1 이상의 DPP4 유전자 카피 수를 가졌다.
동일한 대립유전자 검정법의 인간 획득을 사용하여, ES 세포로부터 유래된 마우스의 꼬리 생검으로부터 정제된 DNA를 검정하여, 인간화된 DPP4 대립유전자가 인간 5' 플랭킹 영역과 함께 생식세포 계열을 통해 전달되었는지를 확인하였다.
본 명세서에 기재된 BAC 삽입 및 스크리닝 방법을 사용하여, 인간 DPP4를 인코딩하는 DNA를 갖는 2 마리의 유전자도입 마우스를 확인하였다. BAC RP11-68L22를 사용하여 ES 세포 클론 및 MAID 7333으로 지칭되는 유전자도입 마우스를 생성하였고, BAC RP11-345J9를 사용하여 ES 세포 클론 및 MAID 7334로 지칭되는 유전자도입 마우스를 생성하였다.
MAID 7333 및 7334 마우스에서 인간화된 DPP4 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질은, (전사체, NM_001935.3에 의해 인코딩된 바와 같은) 인간 DPP4와 동일한, 도 9에 나타낸 아미노산 서열 (서열 번호 24)을 가졌다.
실시예 4
MERS-CoV 바이러스로 감염된 인간화된 DPP4 마우스의 처리
인간화된 DPP4 유전자 및 플랭킹 프로모터 영역을 갖는 유전자도입 마우스를 MERS-CoV에 의해 감염되는 그의 능력 및 MERS-CoV를 치료 또는 예방하기 위한 치료 분자를 평가하기 위한 모델로서 역할을 하는 그의 능력에 대해 시험하였다.
유전자도입 MAID 7333 마우스 (예를 들어, 실시예 3에 기재된 방법에 의해 생성됨)에 200 ㎍의 MERS-CoV 스파이크 단백질에 대한 항체 또는 아이소타입 대조군을 복강내 주사 (ip)로 처리하였다. 항체 주입 후 1일째에, 마우스를 MERS-CoV로 비강내로 감염시켰다. 감염 후 4일째에, 마우스의 폐를 회수하고, 바이러스 RNA 수준을 실시간 PCR (RT-PCR)을 사용하여 측정하였다. 특히, MERS-CoV의 게놈 RNA (UpE) 또는 복제 RNA (리더) (MERS-CoV 게놈의 복제형에 특이적임)의 수준을 측정하였다.
RT-PCR 데이터를 하기 표에 나타낸다.
Figure 112016111006875-pct00002
유전자도입 마우스의 항체 처리는 바이러스 RNA의 수준 (UpE 및 리더 둘 모두)을 약 50배 내지 약 500배로 감소시켰다.
본 명세서에 기재된 데이터는 인간 DPP4의 표적화된 혼입 방법 (실시예 1) 및 무작위 BAC 삽입 방법 (실시예 3)에 의해 생성된 유전자도입 마우스가 MERS-CoV에 의한 감염에 취약하였다는 것을 보여준다. 부가적으로, 항-MERS-CoV 항체는 생체내에서 유전자도입 마우스에서의 감염을 차단하였다. 따라서, 인간 DPP4를 갖는 유전자도입 마우스 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법으로 생성됨)는 MERS-CoV 바이러스를 표적으로 하는 치료제 (예를 들어, 항체)의 효능을 평가하는 데 유용하다.
실시예 5
인간화된 DPP4 마우스에서 MERS-CoV 감염에 대한 항-MERS-CoV 항체의 예방 효과
본 명세서에 기재된 인간화된 DPP4 마우스를 사용하여 생체내에서 2개의 단일클론 항체의 예방 능력을 평가하였다. 1×105 pfu의 MERS-CoV (Jordan 균주)로의 비강내 감염 전 24시간에, 일정 용량 범위의 항-MERS-CoV 항체―200 ㎍, 20 ㎍ 또는 2 ㎍의 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체 2 (Ab 2), 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체 4 (Ab 4), 또는 200 ㎍ 의 인간 IgG1 (hIgG1) 아이소타입 대조군 항체―를 마우스에 복강내 주사하였다. Ab 2 및 Ab 4는 완전한 인간 항-MERS-CoV 스파이크 단백질 항체였다. 마우스 폐로부터 RNA를 추출하고 정량적 PCR로 분석하였는데, 이는 위에 기재된 바와 같다. 예를 들어, 델타 Ct 방법을 사용하여 qPCR 데이터를 분석하였으며, 이때 감염되지 않은 대조군은 1로 설정하였다. 검출된 MERS-CoV RNA 퍼센트를 동일 아이소타입 대조군 항체로 처리된 감염된 마우스에서 검출된 RNA 수준에 대해 상대적으로 표시하였다 (도 11a 및 도 11b). 또한, 마우스 폐로부터의 바이러스 역가를 위에 기재된 바와 같이 결정하였다.
동일 아이소타입 대조군 항체와 비교하여, 두 항체 모두 폐에서 MERS-CoV 특이적 RNA 수준을 마우스당 200 ㎍ 용량에서 2 로그 초과로 유의하게 감소시켰다 (도 11a 및 도 11b). 동일 용량의 Ab 4와 비교하여, Ab 2는 20 ㎍ 용량에서 MERS-CoV RNA 수준을 감소시키는 데 더 효과적이었다. 아이소타입 대조군 처리된 마우스와 비교하여, 어느 항체도 2 ㎍ 용량에서는 바이러스 RNA 수준을 감소시키는 데 효과적이지 않았다. MERS-CoV 역가를 폐에서 분석하였을 때 (도 11c), Ab 2의 200 ㎍ 및 20 ㎍ 용량 둘 모두는 검정에서의 검출 수준 (2×103 pfu/ml) 부근까지 바이러스 수준을 감소시켰다. Ab 4는 200 ㎍ 용량에서 Ab 2와 동등하게 효율적이었으며, 한편 20 ㎍ 및 2 ㎍ 용량은 바이러스 억제의 용량 의존적 억제를 보여주었다. 이러한 데이터는 항-MERS-CoV 항체, 예를 들어, Ab 2 및 Ab 4가 생체내에서 MERS-CoV 감염을 효과적으로 차단하였음을 보여준다.
또한, 감염 전 24시간에 Ab 2, Ab 4, 또는 hIgG1 아이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스로부터의 폐에 대하여 감염 후 4일째에 조직학적 분석을 수행하였다 (도 12a). 예를 들어, 간질, 세기관지주위, 및 혈관주위 염증의 정도를 0부터 5까지 스코어링하였다. 다른 조직학적 특징, 예컨대 세기관지 상피 및 폐포 손상의 존재, 흉막 변화 및 기관지혈관주위(peribronchovascular) 염증의 정도를 또한 분석하였다. 각각의 마우스에 대한 전체 염증 스코어를 각각의 실험 그룹에 대해 평균을 내었고, 스코어는 각각의 그룹 및 시점에서 모든 마우스의 평균 스코어로 표시되었다 (도 12b).
hIgG1 아이소타입 대조군 마우스로 전처리된 마우스로부터의 폐는 증가된 간질 염증, 혈관주위 세포침윤, 및 폐포 중격의 비후와 함께 유의한 폐 병리를 나타내었다. 200 ㎍의 Ab 2 또는 Ab 4로 처리된 마우스는, 간질에서의 염증 세포의 최소한의 병소, 작은 세기관지 세포침윤, 및 적은 폐포 벽 비후와 함께, 염증을 감소시켰다. 20 ㎍의 Ab 2 및 Ab 4로 전처리된 마우스에서, 더 높은 용량의 항체 그룹과 비교하여, 혈관주위 세포침윤 및 간질 염증은 중등도 수준이었다. 2 ㎍ 항체 전처리 그룹은 hIgG1 아이소타입 대조군과 유사한 병리를 가져서, 유의한 간질 염증 및 우세한 혈관주위 염증을 보였다. 맹검 조직학적 스코어링은 처리된 마우스에 대해 감소된 염증 스코어를 보였다 (도 12b). 이러한 결과는 항-MERS-CoV 항체, 예컨대 Ab 2 및 Ab 4가, 마우스에서 바이러스 RNA 수준 및 바이러스 역가를 입증하는 MERS-CoV 감염 후 폐 병리에서 용량-의존적 감소를 부여함을 보여준다.
따라서, 항-MERS-CoV 항체, 예컨대 Ab 2 및 Ab 4는 MERS-CoV 감염의 생체내 모델에서 효과적이었다―항체는 감염 전, 예를 들어, 감염 1일 전에 주입되었을 때 생체내에서 MERS-CoV 감염 및 질환을 차단하였다.
실시예 6
MERS-CoV로 감염된 인간화된 DPP4 마우스의 항체 처리
항-MERS-CoV 항체 (예를 들어, Ab 2 또는 Ab 4)의 치료 효과 (예를 들어, 감염 후 폐 병리 및 MERS-CoV 복제를 억제하는 능력)를 결정하기 위해, 인간화된 DPP4 마우스를 MERS-CoV로 감염시켰다. 감염 후 24시간째에, 500 ㎍의 hIgG1 아이소타입 대조군 또는 500 ㎍ 또는 200 ㎍의 Ab 2를 마우스에 복강내 주사하였다. 감염 후 4일째에, 마우스를 안락사시키고 바이러스 RNA, 바이러스 역가, 및 폐 병리에 대해 마우스 폐를 분석하였다. 대조군 항체로 처리된 마우스와 비교하여, Ab 2의 500 ㎍ 및 200 ㎍ 용량 둘 모두는 마우스의 폐에서 약 10배까지 바이러스 RNA 수준을 감소시켰다 (도 13a 및 도 13b). 동일한 마우스의 폐 역가는 폐에서의 바이러스 수준에서 유의한 감소를 보였는데, 감염 후 4일째에 2 로그 초과의 감소를 가졌다 (도 13c). 이러한 데이터는 감염 후에, 예를 들어, 감염 후 24 시간째에, 항-MERS-CoV 항체 (예를 들어, Ab 2)가 바이러스 복제를 유의하게 억제하였음을 보여준다.
또한, 감염 후 24시간째에 hIgG1 대조군 항체, 500 ㎍의 Ab 2, 또는 200 ㎍의 Ab 2로 처리된 마우스에 대해 조직학적 분석을 수행하였다 (도 14a 및 도 14b). 대조군 항체로 처리된 마우스는 실시예 2 및 실시예 5에서의 대조군과 유사한 병리를 보였는데, 유의한 간질 염증, 혈관주위 세포침윤, 및 폐포 중격의 비후를 가졌다. 200 ㎍ 또는 500 ㎍의 Ab 2로 처리된 마우스는 폐 도처에서 감소된 그리고 단지 병소성의 혈관주위 염증과 함께 최소한의 간질 염증을 가졌다. 맹검 조직학적 스코어링은 처리된 마우스에 대해 감소된 염증 스코어를 보였다 (도 14b). 이 데이터는 항-MERS-CoV 항체 (예를 들어, Ab 2)의 치료 용량이 감염 후에, 예를 들어, 감염 후 24시간째에 주어지더라도 MERS-CoV 유도 폐 병리를 감소시켰음을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. KYRATSOUS, Christos MUJICA, Alexander <120> Humanized Dipeptidyl-Peptidase IV (DPP4) Animals <130> 47206-501001WO <140> PCT/US2015/033024 <141> 2015-05-28 <150> 62/005,476 <151> 2014-05-30 <150> 62/051,626 <151> 2014-09-17 <150> 62/072,692 <151> 2014-10-30 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 tcgccactgt gcctaacata g 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 ccgggactaa actggaacat tc 22 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 tcagtcaact tcttctgggt tgtttcc 27 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 cagctctggt ggagaactag ac 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 ggaggtcctc ggtctttaga ag 22 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 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Claims (70)

  1. 설치류로서,
    내인성 설치류 Dpp4 유전자의 인간화를 포함하고, 상기 인간화는 내인성 설치류 Dpp4 좌(locus)에서 Dpp4 유전자의 엑손을 인코딩하는 설치류 유전자를 변형된 DPP4 유전자를 형성하도록 인간 DPP4 유전자의 엑손 2 내지 엑손 26을 인코딩하는 핵산 서열로 대체하는 것을 포함하고, 상기 변형된 DPP4 유전자의 발현은 내인성 설치류 Dpp4 좌에 있는 설치류 조절 요소의 제어 하에 있고, 상기 설치류는 마우스 또는 래트이고, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)로 감염될 때 하나 이상의 증상을 나타내는, 설치류.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 설치류는 마우스 Dpp4 단백질을 발현할 수 없는 마우스인, 설치류.
  3. 제1 항에 있어서, 상기 내인성 설치류 Dpp4 유전자의 인간화는 이형접합성(heterozygous)인, 설치류.
  4. 제1 항에 있어서, 상기 내인성 설치류 Dpp4 유전자의 인간화는 동형접합성(homozygous)인, 설치류.
  5. 인간화된 설치류의 제조 방법으로서,
    설치류 Dpp4 단백질을 인코딩하는 설치류 Dpp4 유전자 서열을 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열의 엑손 2 내지 엑손 26을 포함하는 인간 DPP4 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함하고, 상기 대체는 내인성 설치류 Dpp4 좌에서 행해지고, 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 인간 DPP4 유전자 서열의 엑손 2 내지 엑손 26을 포함하는 인간 DPP4 유전자 서열은 상기 내인성 설치류 Dpp4 좌에 있는 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동가능하게 연결되고, 상기 설치류는 마우스 또는 래트이고, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)로 감염될 때 하나 이상의 증상을 나타내는, 방법.
  6. 제5 항에 있어서, 상기 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스 또는 래트 유래인, 방법.
  7. 제5 항에 있어서, 상기 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 Dpp4 좌에 있는 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인, 방법.
  8. 제5 항에 있어서, 상기 설치류 Dpp4 유전자 서열을 대체하는 상기 인간 DPP4 유전자 서열은 상기 인간 DPP4 유전자 서열의 26개의 엑손 모두를 포함하는, 방법.
  9. 제5 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 상기 인간 DPP4 유전자 서열의 엑손 2 내지 엑손 26을 포함하는 상기 인간 DPP4 유전자 서열에 대해 이형접합성인, 방법.
  10. 제5 항에 있어서, 상기 설치류는 상기 인간 또는 인간화된 DPP4 단백질을 인코딩하는 상기 인간 DPP4 유전자 서열의 엑손 2 내지 엑손 26을 포함하는 상기 인간 DPP4 유전자 서열에 대해 동형접합성인, 방법.
  11. 하기 단계를 포함하는, 제1항의 설치류에서 인간-특이적 DPP4 길항제의 생체내(in vivo) 치료 효능을 결정하는 방법:
    (a) 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV)로 감염된 설치류에 DPP4 길항제를 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 DPP4 길항제가 투여되지 않은, MERS-CoV로 감염된 대조군 설치류와 비교하여, 상기 DPP4 길항제가 MERS-CoV 감염의 하나 이상의 증상을 치료 또는 예방하는지를 결정하는 단계.
  12. 제11 항에 있어서, 상기 DPP4 길항제는 소분자, 펩티드 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제11 항에 있어서, 상기 DPP4 길항제는 MERS-CoV 단백질에 대한 항체인, 방법.
  14. 제13 항에 있어서, 상기 MERS-CoV 단백질은 MERS-CoV 스파이크(spike) 단백질인, 방법.
  15. 제11 항에 있어서, 상기 길항제는 MERS-CoV 감염 전에 투여되는, 방법.
  16. 제11 항에 있어서, 상기 길항제는 MERS-CoV 감염 후에 투여되는, 방법.
  17. 제11 항에 있어서, 상기 길항제는 MERS-CoV 감염과 동시에 투여되는, 방법.
  18. 제11 항에 있어서, 상기 MERS-CoV 감염의 증상은 바이러스 역가(viral titer) 또는 RNA 수준인, 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 바이러스 역가 또는 RNA 수준은 qPCR, 노던 블롯(Northern Blot), 플라크 검정법, 및 동소 교잡법(in situ hybridization)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법으로 평가되는, 방법.
  20. 제11 항에 있어서, 상기 MERS-CoV 감염의 증상은 폐 염증인, 방법.
  21. 제11 항에 있어서, 폐 염증은 조직화학적으로 평가되는, 방법.
  22. 제11 항에 있어서, 상기 MERS-CoV 감염의 증상은 체중 감소인, 방법.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3701B1 (ar) * 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
EP2993977B1 (en) 2014-05-30 2018-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized dipeptidyl peptidase iv (dpp4) animals
CN111163633B (zh) * 2017-09-29 2022-09-09 瑞泽恩制药公司 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法
CN109022489B (zh) * 2018-08-09 2023-03-31 中国食品药品检定研究院 人dpp4基因敲入的小鼠模型、其产生方法和用途
BR112021016173A2 (pt) 2019-02-22 2021-11-03 Regeneron Pharma Roedor geneticamente modificado, métodos de produção de um roedor geneticamente modificado e de produção de um anticorpo anti-nav1.7, célula ou tecido isolado de roedor, linhagem celular imortalizada, embrião de roedor, construto de ácido nucleico de direcionamento, e, hibridoma
EP4096396A1 (en) * 2020-01-28 2022-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
KR102243416B1 (ko) * 2020-02-28 2021-04-22 대한민국(질병관리청장) 한국형 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염에 감수성을 가지는 인간 dpp4 유전자를 폐 조직 특이적으로 발현하는 형질전환마우스와 이의 용도
KR102207249B1 (ko) * 2020-02-28 2021-01-25 대한민국(관리청: 특허청장, 승계청: 질병관리청장) 한국형 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염에 감수성을 가지는 인간 dpp4 유전자를 전신에 발현하는 형질전환마우스와 이의 용도
CN113355325B (zh) * 2020-03-06 2023-07-14 中国科学院广州生物医药与健康研究院 人源化ace2基因改造小鼠胚胎干细胞模型制备方法及应用
WO2021263146A2 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004104216A2 (en) 2003-05-21 2004-12-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with dipeptidylpeptidase iv (dpp4)

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6368604B1 (en) * 1997-09-26 2002-04-09 University Of Maryland Biotechnology Institute Non-pyrogenic derivatives of lipid A
AU2002222951A1 (en) 2000-07-18 2002-01-30 Geoff D. Koch Apparatus and method for maintaining control of a drilling machine
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2006044962A1 (en) 2004-10-19 2006-04-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
EP1907566A4 (en) 2005-05-27 2008-12-10 Memory Pharm Corp ALZHEIMER TRANSGENIC MOUSE MODEL VECTORS AND USES THEREOF
JP5389665B2 (ja) * 2006-12-22 2014-01-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化ｖｅｇｆを発現するトランスジェニックマウス
WO2010110914A2 (en) * 2009-03-27 2010-09-30 Zirus, Inc. Mammalian genes involved in infection
US10765093B2 (en) 2010-11-27 2020-09-08 James Zhu Humanized transgenic animal
KR102109172B1 (ko) * 2011-02-15 2020-05-12 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ｍ－ｃｓｆ 마우스
MX358390B (es) * 2011-10-28 2018-08-17 Regeneron Pharma Interleucina 6 y receptor de interleucina 6, humanizados.
KR20150064104A (ko) 2012-09-23 2015-06-10 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담 사람 베타 코로나바이러스의 계통 c 및 이의 바이러스 수용체로서 n-말단 디펩티딜 펩티다아제의 확인
EP3561050B1 (en) 2013-02-20 2021-12-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
BR112015026197B1 (pt) 2013-04-16 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Método para modificação marcada de um lócus genômico de interesse em uma célula de rato pluripotente
CN103554235B (zh) * 2013-06-17 2015-06-24 清华大学 MERS-CoV病毒膜蛋白中的RBD片段及其编码基因和应用
CN103724406A (zh) * 2013-11-20 2014-04-16 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 一种具有中和活性的MERS-CoV合成肽疫苗及其应用
RU2685914C1 (ru) * 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
EP2993977B1 (en) 2014-05-30 2018-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized dipeptidyl peptidase iv (dpp4) animals

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004104216A2 (en) 2003-05-21 2004-12-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with dipeptidylpeptidase iv (dpp4)

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Human Immunology, Volume 63, Issue 9, September 2002, Pages 719-730
J Mol Endocrinol October 1, 2012 49 125-135
J. Virol. April 2015 vol. 89 no. 7 3659-3670

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Publication number Publication date
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