JP2023510289A - ワクチン送達のための自己組織化自己アジュバント系 - Google Patents

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Abstract

Figure 2023510289000001
本発明は、アジュバント特性を有する免疫原性複合体への複数の免疫原性剤の自己組織化を促進する少なくとも１つの抗原分子に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性ペプチドを含む免疫原性剤に関する。本発明は、対象において免疫応答を誘発する方法であって、少なくとも１つの免疫原性剤又は少なくとも１つの免疫原性複合体を対象に投与し、それによってその対象において免疫応答を誘発する工程を含む方法にも関する。
【選択図】図２６

Description

関連出願
本願は、２０２０年１月９日出願のオーストラリア仮特許出願第２０２０９０００５８号の優先権を主張する。この出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、免疫原性剤に関する。より具体的には、本発明は、アジュバント特性を有する免疫原性複合体への複数の免疫原性剤の自己組織化を促進する少なくとも１つの抗原分子に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性ペプチドを含む免疫原性剤に関する。
ペプチド及びタンパク質に基づくワクチンは、それらの最適な有効性のために、安全であるが強力なアジュバント（佐剤）の助けを必要とする。多くの現在利用可能なアジュバントは、ペプチド及びタンパク質に対する強力な免疫応答を刺激するには弱すぎる。対照的に、細菌由来及び油性のアジュバントは、典型的には、ペプチドに対する免疫応答を誘発するのに充分に強いが、アレルギー応答及び過剰の炎症を含む望ましくない反応を引き起こすことがある。ポリマーに基づく自己組織化及び自己アジュバント性送達系は、最近、運搬されるペプチド抗原に対する免疫応答の刺激において、有害作用を生じさせることなく高い効率を実証した。残念ながら、そのような系は、通常、生分解性ではなく、それらの化学組成及び立体化学は決して完全に明確というわけではない。従って、このような従来技術の送達系の欠点の１つ以上を克服するペプチド及びタンパク質ベースのワクチンのための送達系又はアジュバント系が依然として必要とされている。
上記のような、従来技術の１つ以上の欠点に少なくとも部分的に対処し克服するために、本発明は、１つ以上の実施形態において、疎水性アミノ酸（ＨＡＡ）から構築された完全に明確な生分解性ポリマーに基づくペプチドベースのワクチン送達系を提供する。
本発明は、１つ以上の実施形態において、対象への送達のために免疫原性複合体へと自己組織化し、免疫応答を誘発することができる免疫原性剤を広く提供する。好適には、この免疫原性複合体は、アジュバント又は他の一般的な免疫賦活剤を同時投与する必要性をなくす「自己アジュバント」特性を有する。
本発明は、１つ以上の実施形態において、対象への送達のために免疫原性複合体へと自己組織化し、免疫応答を誘発することができる免疫原性剤を広く提供する。好適には、この免疫原性複合体は、アジュバント又は他の一般的な免疫賦活剤を同時投与する必要性をなくす「自己アジュバント」特性を有する。
本発明の第１の態様によれば、対象への投与に適した免疫原性剤であって、少なくとも１つの抗原分子に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性ペプチドを含む免疫原性剤が提供される。
本発明の第２の態様によれば、［抗原分子］ｎ－［担体／リンカー］ｍ－［疎水性ペプチド］の構造を有する免疫原性剤が提供される。
上記式中、ｎは１、２、３又はそれ以上の数であり、ｍは０、１、２、３又はそれ以上の数であり、「－」は共有結合又はコンジュゲーションを表す。
本発明の第３の態様によれば、免疫原性剤を製造する方法であって、疎水性ペプチドを少なくとも１つの抗原分子に共有結合又はコンジュゲートし、それによって免疫原性剤を生成する工程を含む方法が提供される。
本発明の第４の態様によれば、第３の態様に係る方法によって製造される場合の免疫原性剤が提供される。
本発明の第５の態様によれば、複数の第１、第２又は第４の態様に係る免疫原性剤を含む免疫原性複合体であって、複数の疎水性ペプチドが当該免疫原性複合体中で相互作用する免疫原性複合体が提供される。
本発明の第６の態様によれば、免疫原性複合体を製造する方法であって、複数の第１、第２又は第４の態様の免疫原性剤を組み合わせる工程を含み、この複数の免疫原性剤は上記免疫原性複合体へと自己組織化する方法が提供される。
本発明の第７の態様によれば、第６の態様の方法によって製造される場合の免疫原性複合体が提供される。
本発明の第８の態様によれば、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、並びに／又は少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体を含む組成物が提供される。
本発明の第９の態様によれば、対象において免疫応答を誘発する方法であって、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物を対象に投与し、それによってその対象において免疫応答を誘発する工程を含む方法が提供される。
本発明の第１０の態様によれば、対象を免疫する方法であって、少なくとも１つの第１、第２、及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物を対象に投与し、それによってその対象を免疫する工程を含む方法が提供される。
本発明の第１１の態様によれば、対象において疾患、障害若しくは状態を治療又は予防する方法であって、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物を対象に投与する工程を含む方法が提供される。
本発明の第１２の態様によれば、対象において免疫応答を誘発するための医薬の調製における、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物の使用が提供される。
本発明の第１３の態様によれば、対象を免疫するための医薬の調製における、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物の使用が提供される。
本発明の第１４の態様によれば、対象において疾患、障害若しくは状態を治療又は予防するための医薬の調製における、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物の使用が提供される。
本発明の第１５の態様によれば、対象において免疫応答を誘発することに使用するための、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物が提供される。
本発明の第１６の態様によれば、対象を免疫することに使用するための、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物が提供される。
本発明の第１７の態様によれば、対象において疾患、障害若しくは状態を治療又は予防することに使用するための、少なくとも１つの第１、第２及び第４の態様のいずれか１つの免疫原性剤、少なくとも１つの第５若しくは第７の態様の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの第８の態様の組成物が提供される。
好ましくは、当該免疫原性剤は単一分子実体である。好ましくは、当該免疫原性剤は両親媒性である。
いくつかの実施形態では、上記免疫原性複合体は、いずれの外部アジュバントの助けも借りずにオプソニン性エピトープ特異的抗体の産生を誘導することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性複合体は強力な体液性アジュバントとして作用する。
上記疎水性ペプチドは、任意の適切な長さであることができ、任意の適切な数及びタイプ（複数可）のアミノ酸残基からなることができる。疎水性ペプチドは、複数の疎水性の天然の、非天然の、Ｄ－及び／又はＬ－アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、複数の疎水性天然アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ペプチドは、２～約５０の間（２、３、４、５等を含む２～５０の間のすべての整数を含む）の数のアミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はその中の任意の範囲の数の連続する疎水性アミノ酸を含む。例として、疎水性ペプチドは、１０～１５個の連続するアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、約５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、又は１５個以下の連続する疎水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、２～３０、３～２５、４～２０、５～２０、７～１８、５～１５又は１０～１５個の連続する疎水性アミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、１０個若しくは１５個のアミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる。
いくつかの実施形態では、上記疎水性ペプチドは同じアミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、２つ、３つ又はそれ以上の異なるアミノ酸（例えばフェニルアラニン－ロイシン－アラニン）からなる。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸はアラニン、プロリン、グリシン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン及び／又はメチオニンを含むことができる。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、以下からなる群から選択することができる：グリシン、プロリン、バリン、アラニン、フェニルアラニン及びロイシン。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、１０個のバリン残基、１０個のフェニルアラニン残基、１０個のロイシン残基、１５個のロイシン残基、１５個のグリシン残基、１５個のプロリン残基、１５個のアラニン残基、２５個のアラニン残基、又は５個のフェニルアラニン－ロイシン－アラニン反復からなる。
いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、リポソーム膜、又はミセル若しくはナノ粒子等の他の親油性表面への免疫原性剤の固定（つなぎ止め、ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）を可能にする。天然タンパク質膜貫通ドメインはしばしばロイシンに富むので、疎水性ペプチドがポリロイシンからなるか又はポリロイシンを含む実施形態では、疎水性ペプチドは、免疫原性剤のリポソーム膜への固定を可能にする可能性がある。
理論に拘束されることを望まないが、上記疎水性ペプチドの長さ及び特定の疎水性アミノ酸組成は、当該免疫原性剤の特定の少なくとも１つの抗原分子を考慮して最適化されてもよい。例として、親水性抗原分子は通常、より長い疎水性ペプチドを必要とするが、親水性ではない（例えば、ある程度の疎水性を有する）抗原分子は、より短い疎水性ペプチドを必要とする可能性がある。このような最適化は、沈殿のリスクを最小限にするか、又は排除するであろう。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、αヘリックス及び／又はβシートの形成を誘導することができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子（エピトープ）の立体構造は、疎水性ペプチドのアミノ酸配列及び／又は長さを変化させることによって制御される。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤の溶解度は、疎水性ペプチドのアミノ酸配列及び／又は長さを変化させることによって制御される。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、上記疎水性ペプチド及び少なくとも１つの抗原分子が直接又は間接的に共有結合又はコンジュゲートされる少なくとも１つの担体又はリンカーをさらに含むことができる。当該免疫原性剤は、１、２、３、４、５又はそれ以上の数（種）の担体又はリンカーを含むことができる。これらは、互いに同じであってもよいし異なっていてもよい。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、本質的に直鎖状であることができる。いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、構造が分枝状又は樹状であることができる。複数の抗原分子を用いる実施形態では、担体又はリンカーは、連続若しくは分枝状の形態又は様式でそれらの抗原分子を共に結合又は連結するために利用されてもよい。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの担体又はリンカーはスペーサとして機能する。いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤／少なくとも１つの抗原分子の適切な立体構造、及び／又は免疫原性剤の溶解度を補助するために、少なくとも１つの担体又はリンカーは、免疫原性剤の疎水性：親水性比のバランスをとることができる。いくつかの実施形態では、担体又はリンカーは、αヘリックス及び／又はβシートの形成を誘導することができる。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの担体又はリンカーは、直鎖構造を有する免疫原性剤を提供することができる。言及したように、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体又はリンカーは、分枝状又は樹状の構造を有する免疫原性剤を提供することができる。
上記少なくとも１つの担体又はリンカーは、以下のうちの１つ以上を含むことができる：アミノ酸、ペプチド、炭水化物及び／又はポリマー分子。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体又はリンカーは、１つ以上の同じ又は異なる上記のアミノ酸又は他の適切な分子を含むことができる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体又はリンカーは、疎水性ペプチドへの結合（取り付け、ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）のために、分枝鎖を形成することができる少なくとも１つのアミノ酸を含む。リシン又はシステイン等の任意の適切なアミノ酸を使用することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体又はリンカーのアミノ酸（複数可）は、１つ以上の遊離アミノ基を含む。適切には、アミノ酸担体又はリンカーは、少なくとも２つの遊離アミノ基を含む。この実施形態の特定の形態では、アミノ酸は、単一のリシン残基又は１つ以上のセリン残基を含むか若しくは含まない分枝鎖ポリリシンである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体又はリンカーアミノ酸（複数可）は、１つ以上の遊離チオール基を有する１つ以上のシステイン残基を含む。適切には、アミノ酸担体又はリンカーは、遊離チオール基を有する１つのシステイン残基を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの担体又はリンカーは１つ以上の酸性アミノ酸を含み、酸性アミノ酸は、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸であるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの担体又はリンカーは、ペプチドリシン－リシン－リシン－リシン－セリン－セリン（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体又はリンカーは、ペプチドセリン－リシン－リシン－リシン－リシン（配列番号６）を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの担体又はリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリオール又はポリエーテルを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤の任意の又はすべてのＮ末端をアセチル化することができる（例えば、少なくとも１つの抗原分子及び／又は疎水性ペプチド）。同様に、当該免疫原性剤の任意の又はすべてのＣ末端をアミド化に供することができる（例えばリンカー）。これらの修飾は、免疫原性剤の総電荷及び溶解度を低下させることができる。
上記少なくとも１つの抗原分子は、少なくとも当該免疫原性剤中に存在するとき、対象への投与時に免疫応答を誘発することができる任意の分子であってもよい。例として、抗原分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質若しくはこれらの組み合わせ、例えば糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質、グリコリポタンパク質又はそれらの断片、変異体又は誘導体であってもよい。
任意の適切な数の抗原分子を使用することができる。これには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の数の抗原分子が含まれる。２つ以上の抗原分子が使用される場合、これらは互いに同じであってもよいし互いに異なっていてもよい。抗原分子は親水性又は疎水性であることができる。
概して、断片は、抗原分子の一部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）、セグメント、サブユニット、部分（ｍｏｉｅｔｙ）、モノマー、サブ配列、領域又はドメインであってもよい。タンパク質の特定の文脈において、「断片」は、抗原分子タンパク質のアミノ酸配列の１００％未満を構成するタンパク質のセグメント、ドメイン、一部分又は領域である。断片は、単一の断片であってもよく、又は単独で若しくは他の断片と共に繰り返されてもよいことが理解されるであろう。抗原分子のペプチド断片は、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２５個、３０個、３５個若しくはそれ以上の連続するアミノ酸を含んでもよく、本質的にそれからなってもよく、又はそれからなってもよい。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、ペプチド若しくはタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、少なくとも１つのエピトープを含むペプチド抗原であるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、上記抗原分子は、特定の病原体に由来しない、又はそれに向けられない合成エピトープであるか、又はそれを含む。このような合成エピトープは、特定の病原体由来のエピトープと結合するか、又はそれとともに投与される場合、広域免疫応答（例えば、ヘルパーＴ細胞応答又はメモリーＴ細胞応答）を誘発する「ユニバーサル」エピトープであってもよい。非限定的な例は、本明細書中で以下に記載されるもののような非天然Ｐａｎ－ＤＲヘルパー細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ；アミノ酸配列：ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；配列番号７）又はＰ２５（アミノ酸配列：ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬ；配列番号８）である。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、Ｂ細胞エピトープからなるか、又はＢ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、Ｔ細胞（メモリー又はヘルパー）エピトープからなるか、又はＴ細胞エピトープを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの両方を含む。
本明細書で一般的に使用する場合の「エピトープ」は、例えば、ペプチド、タンパク質若しくは炭水化物若しくは他の分子、又はこれらの組み合わせ、例えば糖タンパク質若しくはプロテオグリカンの抗原性断片又は好ましくは免疫原性断片である。エピトープは連続的であっても不連続的であってもよく、後者は特にＢ細胞エピトープに関連することが理解されるであろう。
１つの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子又はその断片は、病原体又は病原体の分子成分のものである。本明細書で一般的に使用する場合、分子（タンパク質等）が病原体「の」もの又は「由来」であると言及される場合、その分子が少なくとも部分的に又は完全に病原体に存在するか又はそれに由来することを意味する。
上記病原体は、ウイルス、細菌、真菌、酵母、原生生物、虫及び／又は対象において疾患、障害若しくは状態を引き起こすことができる任意の他の生物を含んでもよい。例としてのみ示すと、これらの病原体は、以下を含んでもよい：スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、ヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（レンサ球菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属及び赤痢菌（シゲラ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属等の細菌（これらに限定されない）；コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、ヘンドラ（Ｈｅｎｄｒａ）ウイルス、フラビウイルス及びヘルペスウイルス等のウイルス（これらに限定されない）；プラスモジウム属（マラリア原虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）（マラリアを引き起こす）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）及びバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）寄生虫等の原生生物；並びに住血吸虫、吸虫、線虫（例えば、鉤虫）及び他の蠕虫等の虫（これらに限定されない）。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）主要病原因子Ｍタンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、Ｍタンパク質のＣ反復領域に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）主要病原因子Ｍタンパク質に由来するＪ８ペプチド（ＱＡＥＤＫＶＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＬＥＤＫＶＱ；配列番号９）からなるか、又はそれを含む。Ｊ８は、ＧＣＮ４ ＤＮＡ結合タンパク質配列に隣接するＭ１ ＧＡＳ株のＭタンパク質のアミノ酸３４４～３５５に由来する。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、ＧＡＳ株Ｍ５４のＭタンパク質のＮ末端に由来するＰＬ１ Ｂ細胞エピトープ（ＥＶＬＴＲＲＱＳＱＤＰＫＹＶＴＱＲＩＳ；配列番号１０）からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、ＧＡＳ株８８／３０のＭタンパク質のＮ末端に由来する８８／３０Ｂ細胞エピトープ（ＤＮＧＫＡＩＹＥＲＡＲＥＲＡＬＱＥＬＧＰ；配列番号１１）からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８（配列番号９）及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８（配列番号９）及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた、好ましくはポリロイシンからなる疎水性１０アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた、好ましくはポリロイシンからなる疎水性１５アミノ酸ペプチドを含み、このユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）は次に、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８（配列番号９）に結合又はコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、図１の化合物５の構造を有する。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、図２２ｂ）の化合物７の構造（配列番号２６）を有する。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＰＬ１（配列番号１０）及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、図２２ｂ）の化合物８の構造（配列番号２７）を有する。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープ８８／３０（配列番号１１）及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、図２２ｂ）の化合物９の構造（配列番号２８）を有する。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８（配列番号９）、ＰＬ１（配列番号１０）及び８８／３０（配列番号１１）、並びにユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、図２２ｂ）の化合物１４の構造を有する。
いくつかの実施形態では、図２２ｂ）の化合物７、８及び９が組み合わされて、上記免疫原性複合体が形成される。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、以下のうちの１つの構造を有する：
Ａｃ－Ｊ８－Ｋ（Ａｃ－（Ｌｅｕ）１５）ＰＡＤＲＥ、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表し、「Ｋ」はリシンを表す、
Ａｃ－（Ｌｅｕ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｋ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表し、「Ｋ」はリシンを表す（配列番号２９）、
Ａｃ－（Ｌｅｕ）１５－Ｊ８－Ｋ－ＰＡＤＲＥ、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表し、「Ｋ」はリシンを表す（配列番号３０）、
Ａｃ－（Ｌｅｕ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３１）、
Ａｃ－（Ｇｌｕ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３２）、
Ａｃ－（Ｇｌｙ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３３）、
Ａｃ－（Ｓｅｒ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３４）、
Ａｃ－（Ｐｒｏ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３５）、
Ａｃ－（Ａｌａ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３６）、又は
Ａｃ－（Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｌａ）５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３７）。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、図２６の化合物２及び３～１１のいずれか１つの構造（配列番号２９～３７）を有する。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、コロナウイルスのスパイクタンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、ＡＣＥ２－ＲＢＤ決定的結合（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ）アミノ酸残基、Ｓ１／Ｓ２切断／プライミング部位若しくはその付近のアミノ酸残基、ＲＢＤの受容体結合モチーフにおけるアミノ酸残基、又は受容体結合ドメインのＮＴＤにあるがＡＣＥ２と直接接触していないアミノ酸残基からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧ（Ｓ６２３～６３９）（配列番号１５）からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ（Ｓ４６９～５０８）（配列番号１６）からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（Ｓ４４５～４８３）（配列番号１７）からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴ（Ｓ５５９～５７２）（配列番号１８）からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶ（Ｓ３６６～３９５）（配列番号１９）からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープ、好ましくは本明細書に記載のエピトープに共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープ及びＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープ及びペプチド又はタンパク質等の少なくとも１つの担体又はリンカーに共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（配列番号１７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン－ロイシン－アラニントリペプチド反復残基、又はこれらの任意の組み合わせからなる。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（化合物（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３；配列番号３８）である。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、ユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、免疫原性剤は、ユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０ロイシンアミノ酸ペプチド（ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；化合物（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ；配列番号３９）を含む。
いくつかの実施形態では、化合物（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３（配列番号３８）及び（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ（配列番号３９）が組み合わされて、免疫原性複合体が形成される。
いくつかの実施形態では、上記免疫原性剤又は免疫原性複合体は、リポソームを含む組成物中で送達することができる（本明細書において後述）。
いくつかの実施形態では、上記免疫原性剤又は免疫原性複合体は、上記疎水性ペプチドによってリポソーム中に固定する（つなぐ、ａｎｃｈｏｒｅｄ）ことができる。
いくつかの実施形態では、上記免疫原性剤又は免疫原性複合体は、リポソーム及びそのリポソームに組み込まれたマンノース標的化部分を含む組成物中で送達することができる（本明細書において後述）。
さらに別の実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、腫瘍抗原若しくはその断片であるか、又はそれを含む。本明細書中で使用する場合、「腫瘍抗原」は、タンパク質、糖タンパク質（若しくは炭水化物含有断片）、リポタンパク質又は腫瘍細胞によって発現される他の分子であってもよい。これは、腫瘍細胞による「独特の」発現（例えば、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）等によるウイルス感染の結果としてのもの）、例えば、その細胞型によって通常発現されない分子の発現による正常細胞若しくは非腫瘍細胞と比較した内因性分子の異常な発現、腫瘍細胞による内因性分子の過剰発現、及び／又は腫瘍細胞による修飾分子若しくは変異分子の発現（例えば、変異癌遺伝子若しくは腫瘍抑制遺伝子に起因する）を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、癌（腫瘍性）タンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、ＨＰＶ癌タンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、Ｅ７と呼ばれるＨＰＶ癌タンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、ＣＤ８＋ペプチドからなるか、又はそれを含み、ＣＤ８＋ペプチドは細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することができ、次いでこの細胞傷害性Ｔ細胞は腫瘍細胞を破壊することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、単一配列においてＣＴＬエピトープ（ＣＤ８＋ ＣＴＬ）及びＴヘルパー（ＣＤ４＋）エピトープの両方を有するＨＰＶ－１６ Ｅ７癌タンパク質に由来する８Ｑｍ（Ｅ７４４～５７、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号１４）からなるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、８Ｑｍ（配列番号１４）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ロイシンポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、図１４ｂ）の化合物Ｌｅｕ－８Ｑｍの構造（ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号２５）を有する。
いくつかの実施形態では、上記免疫原性剤又は免疫原性複合体は、リポソームを含む組成物中で送達することができる（本明細書において後述）。いくつかの実施形態では、上記免疫原性剤又は免疫原性複合体は、疎水性ペプチドによってリポソーム内に固定することができる。いくつかの実施形態では、免疫原性剤又は免疫原性複合体は、リポソーム及びそのリポソームに組み込まれたマンノース標的化部分を含む組成物を含む組成物中で送達することができる（本明細書において後述）。
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの抗原分子は、鉤虫に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、Ａ２９１Ｙと呼ばれるＮａ－ＡＰＲ－１に由来するネカトール・アメリカヌス（アメリカ鉤虫、Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）ペプチドからなるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原分子は、ｐ３と呼ばれるＢ細胞エピトープ（ＴＳＬＩＡＧＰＫＡＱＶＥＡＩＱＫＹＩＧＡＥＬ；配列番号１２）からなるか、又はそれを含む。
言及したように、いくつかの実施形態では、上記抗原分子は、特定の病原体に由来しないか、若しくはそれに向けられない合成エピトープであるか、又はそれを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、エピトープｐ３（配列番号１２）及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号８）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、エピトープｐ３（配列番号１２）及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号８）に共有結合又はコンジュゲートされた、好ましくはポリロイシンからなる疎水性１０アミノ酸ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、少なくとも１つの担体又はリンカー、好ましくは疎水性ペプチドに結合したリシン分岐スペーサ、並びに／又は溶解度を増加させ、エピトープの自己組織化を可能にするためのリシン及びセリンから構築された親水性部分をさらに含む。
いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、図１８の化合物３の構造を有する。
いくつかの実施形態では、上記免疫原性剤又は免疫原性複合体は、対象への経口投与に適している。この場合、上記組成物は、上記免疫原性剤及び／若しくは免疫原性複合体を含有する液体賦形剤又は担体を含むことができる。
本発明は、複数の、本明細書に開示される同じ及び／又は異なる免疫原性剤を含んでもよい免疫原性複合体を提供することも理解されるであろう。従って、免疫原性複合体は、それぞれが同じＢ細胞エピトープ及び／若しくはＴ細胞エピトープを有する複数の免疫原性剤を含んでもよく、又は免疫原性複合体中に複数の異なるＴエピトープ及び／若しくはＢエピトープが存在する免疫原性剤の異種混合物を含んでもよい。免疫原性複合体中の異なるＴエピトープ及び／又はＢエピトープは、同じ病原体由来の異なるエピトープであってもよいし、又は異なる病原体由来の異なるエピトープであってもよく、後者は、複数の異なる病原体に対して免疫するために使用することができる多価免疫原性複合体を提供することが理解される。
エピトープは人工的に改変されてもよいし、又は天然の対立遺伝子変異が種の個体間若しくは種の間でエピトープにばらつきをもたらすことも理解されるであろう。例として、これは、ペプチドエピトープ及び炭水化物エピトープ等の非ペプチドエピトープに関連してもよい。
上記少なくとも１つの抗原分子は、配列表に列挙される（例えば、Ｊ８）か、又は図に示される関連配列のいずれか１つを含む、本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド又はポリペプチドの配列のいずれか１つの変異体であってもよい。本明細書中で具体的に使用する場合、タンパク質又はペプチドの「変異体」は、参照アミノ酸配列と定義可能なアミノ酸配列関係を共有する。「変異体」タンパク質は、参照アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸を欠失させるか、又は異なるアミノ酸で置換したものであってもよい。いくつかのアミノ酸は、免疫原性断片の免疫原性に悪影響を及ぼすことなく置換又は欠失されてもよい（保存的置換）ことが当該技術分野においてよく理解されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列の修飾は、免疫原性を改善する可能性がある。好ましくは、タンパク質又はペプチドの変異体は、参照アミノ酸配列と少なくとも７０％若しくは７５％、好ましくは少なくとも８０％若しくは８５％、又はより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を共有する。
それぞれのタンパク質と核酸との間の配列関係を記載するために本明細書において一般的に使用される用語は、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」及び「実質的な同一性」を含む。それぞれの核酸／タンパク質はそれぞれ、（１）核酸／タンパク質によって共有される完全な核酸／タンパク質配列の１つ以上の部分のみ、及び（２）核酸／タンパク質間で相違する１つ以上の部分を含んでもよいため、配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を特定して比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、参照配列と比較される、典型的には６、９又は１２個の連続する残基の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、それぞれの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ（インテリジェネティクス）によるＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラム；米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、サイエンスドライブ（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ） ５７５のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ジェネティクス・コンピュータ・グループ）のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０の中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（参照により本明細書に組み込まれる））のコンピュータ化された実装品によって、又は選択された様々な方法のいずれかによって生成された検査及び最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高い相同性のパーセンテージをもたらす）によって行われてもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ ３３８９によって開示されたプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照されてもよい。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ、ＮＹ、１９９５－１９９９）のユニット１９．３に見出すことができる。
「配列同一性」という用語は、本明細書では、標準的なアルゴリズムを使用する適切なアラインメントを考慮して、配列が比較ウィンドウにわたって同一である程度を考慮して、正確なヌクレオチド又はアミノ酸のマッチの数を含むように最も広い意味で使用される。従って、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較のウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）が両方の配列において生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。例えば、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５ ｆｏｒ ｗｉｎｄｏｗｓ；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）、米国、カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）から入手可能）によって計算される「マッチパーセンテージ」を意味すると理解されてもよい。
本明細書中で使用する場合、「誘導体」は、当該技術分野において理解されているとおり、例えば、他の化学的部分とのコンジュゲーション又は複合体形成によって、翻訳後修飾（例えば、リン酸化、アセチル化、アミド化等）、グリコシル化の修飾（例えば、グリコシル化の付加、除去又は改変）、脂質化（脂質修飾）及び／又はさらなるアミノ酸配列の包含によって改変されたタンパク質、その断片又は改変体等の分子である。
さらなるアミノ酸配列は、融合タンパク質を作製する融合パートナーアミノ酸配列を含んでもよい。例として、融合パートナーアミノ酸配列は、単離された融合タンパク質の検出及び／又は精製を支援してもよい。非限定的な例としては、金属結合（例えばポリヒスチジン）融合パートナー、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、蛍光タンパク質配列（例えばＧＦＰ）、エピトープタグ、例えばｍｙｃ、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンタグが挙げられる。
本発明によって企図される他の誘導体としては、側鎖への修飾、ペプチド又はタンパク質の合成中の非天然アミノ酸及び／又はそれらの誘導体の組み込み、及び架橋剤の使用、並びに本発明の免疫原性タンパク質、断片及び変異体に立体構造的制約を課す他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドはまた、例えばそのヘリシティを維持するために、特定のペプチド配列に隣接してもよく、その例は、ヘリシティを促進するＧＣＮ４ペプチド配列を含むＪ８ペプチド（配列番号９）である。これに関して、タンパク質の化学修飾に関するより広範な方法論については、当業者は、Ｃｏｌｉｇａｎら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９５－２００８）の第１５章を参照されたい。
上述のように、本発明の一態様は、免疫原性剤を製造する方法であって、疎水性ペプチドを少なくとも１つの抗原分子に共有結合して、それによって免疫原性剤を製造する工程を含む方法を提供する。
好適には、当該免疫原性剤は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、ＳＰＰＳとアジドアルキン環化付加の組合せ、又は抗原分子（１つ以上のエピトープ等）と複数の疎水性アミノ酸とを結合することができる任意の他の化学合成方法によって製造されてもよい。好適には、いくつかの実施形態では、上記疎水性ペプチドは、担体又はリンカー、例えば１つ以上のリシン残基を含むもの、を介して各エピトープに結合される。図１を参照して本明細書中で以下により詳細に記載されるように、ペプチド免疫原性剤は、マイクロ波支援Ｂｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法によって合成されてもよい。いくつかの実施形態では、当該免疫原性剤は、古典的固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して合成される。
上述のように、本発明の一態様は、免疫原性複合体を製造する方法であって、上述の態様の複数の免疫原性剤を提供する工程を含み、この複数の免疫原性剤は免疫原性複合体へと自己組織化する方法を提供する。
特定の実施形態では、疎水性ペプチド配列との共有結合又はコンジュゲーションの際に、親水性抗原分子は、両親媒性特性を有し、それゆえ自己組織化してナノ粒子又は微粒子（マイクロ粒子）等の粒子を形成することができる部分／コンジュゲートを形成する。自己組織化は、任意の好適な環境（例えば、好適なｐＨ、塩濃度、温度、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であるがこれに限定されない）で起こってもよい。自己組織化は、動的光散乱（ＤＬＳ）、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、又はナノメートル若しくはマイクロメートルサイズ範囲の粒子（すなわち、ナノ粒子若しくは微粒子）の検出を容易にする任意の他の方法論によって調べられてもよい。
いくつかの実施形態では、自己組織化は、ナノ粒子の鎖状凝集体（ＣＬＡＮ）又は微粒子の形成を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、疎水性ペプチドは、αヘリックス及び／又はβシートの形成を誘導することができる。
いくつかの実施形態では、担体又はリンカーは、αヘリックス及び／又はβシートの形成を誘導することができる。
上述のように、本発明の一態様は、対象において１つ以上の病原体に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。好ましくは、免疫応答は防御免疫応答であって、目的の病原体によるその後の感染は、少なくとも部分的に予防されるか又は最小限に抑えられる。
上述のように、本発明の一態様は、１つ以上の病原体に対して対象を免疫する方法を提供する。
本明細書で一般に使用する場合、「免疫原性」は、対象への投与時等に、免疫応答を誘発又は誘導することができることを意味する。誘発又は誘導された免疫応答は、ＮＫ細胞、樹状細胞等の抗原提示細胞、骨髄単球細胞（例えば、マクロファージ、好酸球、好中球、顆粒球等）、Ｔ細胞及びＢ細胞を含むリンパ球、抗体及び他の細胞表面分子（例えば、接着分子、サイトカイン受容体、共刺激分子、例えばＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ等）等の免疫受容体、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子及び／又は補体を含む自然免疫系及び適応免疫系の分子要素及び／又は細胞要素を含んでもよいが、それらに限定されない。
本明細書で一般的に使用する場合、「抗原性」は、免疫系の１つ以上の要素に結合する、それと複合体形成する、又はそれによって検出若しくは応答することができることを意味する。いくつかの実施形態では、抗原分子はまた、上記のように「免疫原性」であってもよい。
本発明の目的のために、「単離された」とは、その天然の状態から取り出されたか、又はそうでなければ人間の操作に供された材料を意味する。単離された材料は、天然の状態で通常それに付随する成分を実質的に若しくは本質的に含まなくてもよく、又は天然の状態で通常それに付随する成分と共に人工的状態であるように操作されてもよい。単離された材料は、天然形態、化学合成形態又は組換え形態であってもよい。
「タンパク質」とは、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当該技術分野でよく理解されているように、天然又は非天然アミノ酸、Ｄ－アミノ酸又はＬ－アミノ酸であってもよい。
用語「タンパク質」は、「ペプチド」を含み、包含する。「ペプチド」は、典型的には、５０個以下のアミノ酸を有するが、必ずしもそうである必要はない。「タンパク質」は、典型的には５０個を超えるアミノ酸を有するが、必ずしもそうである必要はない。「ポリペプチド」という用語は、典型的には、１００個を超えるアミノ酸を有するタンパク質を記載するために使用されるが、そうである必要はない。
本明細書で一般に使用する場合、「免疫する」、「ワクチン接種する」及び「ワクチン」という用語は、対象への投与時に防御免疫応答を誘発する方法及び／又は組成物を指す。免疫応答は、例えば、病原体によるその後の感染に対して防御的であってもよいし、又は感染が起こった後に少なくとも部分的な治療効果を有してもよい。
上述のように、本発明の別の態様は、対象において疾患、障害若しくは状態を治療又は予防する方法を提供する。
本明細書中で使用する場合、「治療すること」、「治療する」又は「治療」は、疾患、障害又は状態の症状又は病理学的徴候を、それが発症し始めた後に、少なくとも部分的に改善する、排除する又は低減する治療的介入を指す。治療は、対象にとって絶対的に有益である必要はない。有益な効果は、当業者に公知の任意の方法又は規格を使用して決定することができる。
本明細書中で使用する場合、「予防すること」、「予防する」又は「予防」は、感染を予防するため、及び／又は症状若しくは病理学的徴候を低減するために、疾患の発症（例えば、病原体又はその分子成分による感染若しくはそれへの曝露）の前、及び／又は疾患、障害若しくは状態の症状若しくは病理学的徴候の発症の前に開始される作用の過程を指す。そのような予防は、対象にとって絶対的に有益である必要はないことを理解されたい。「予防的」治療は、疾患、障害若しくは状態の症状若しくは病理学的徴候を発症するリスクを低下させる目的で、疾患、障害若しくは状態の徴候を示さないか、又は初期徴候のみを示す対象に投与される治療である。
１つの実施形態では、疾患、障害又は状態は、対象における１つ以上の病原体による感染に関連するか、又はそれによって引き起こされる。病原体は、本明細書において先に記載したようなものであってもよい。
別の実施形態では、疾患、障害又は状態は癌である。いくつかの癌は、１つ以上の同じ又は異なる腫瘍抗原又はその断片を含む免疫原性剤の投与によって癌免疫療法に応答しうることが理解されるであろう。非限定的な例としては、乳癌等の転移性癌のためのＭＵＣ１、鼻咽頭癌のためのＥＢＶ、子宮頸癌のためのＨＰＶ、肝臓癌のためのＢ型肝炎及び／又はＣ型肝炎、肺癌のためのＷＴ－１、黒色腫のためのＭＡＧＥ－１、並びに前立腺癌のためのＰＳＡが挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍抗原特異的癌治療の非限定的な概説は、Ｔａｇｌｉａｍｏｎｔｅら、２０１４、Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １０ ３３３２に見出すことができる。
上述のように、本発明の別の態様は、本明細書中でこれまでに記載された免疫原性剤及び／又は免疫原性複合体を含む組成物を提供する。
好ましい形態では、本明細書に開示される組成物は、許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含む。
「許容できる担体、希釈剤又は賦形剤」は、全身投与において安全に使用されてもよい固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当該技術分野で周知の様々な担体、希釈剤及び賦形剤が使用されてもよい。これらは、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、流動促進剤、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、皮膚軟化剤、乳化剤、流動促進剤、等張食塩水、並びに塩酸塩、臭化物及び硫酸塩を含む鉱酸塩等の塩、酢酸、プロピオン酸及びマロン酸等の有機酸、水及び発熱物質を含まない水を含む群から選択されてもよい。
許容できる担体、希釈剤及び賦形剤を記載する有用な参考文献は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、米国ニュージャージー州、１９９１）である。
当該組成物は、アジュバントを含んでもよいし含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、アジュバントは、免疫原性剤の「自己アジュバント」特性のために必要でない場合がある。いくつかの実施形態では、当該方法は、アジュバントを対象に投与することをさらには含まない。いくつかの実施形態では、当該方法／組成物は、アジュバントを対象に投与することをさらに含む。アジュバントの非限定的な例としては、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム（ミョウバン（アラム））、リン酸アルミニウム、スクアレン、ＩＬ－１２、ＣｐＧ－オリゴヌクレオチド、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０、イミキモド、ＳＢＡＳ２、ＳＢＡＳ４、ＭＦ５９、ＭＰＬ、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ２１及びＩＳＣＯＭが挙げられる。
任意の適切な手順が、ワクチン製剤等の組成物を生成するために企図される。例示的な手順には、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＮｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９７、Ｌｅｖｉｎｅら、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、バーゼル、香港）に記載されている手順が含まれる。
鼻腔内、経口、直腸、非経口、舌下、口腔内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、局所、粘膜及び経皮の投与を含むがこれらに限定されない任意の安全な投与経路が採用されてもよい。
特定の実施形態では、当該組成物は、所望の抗原分子を粘膜上皮を越えて送達するために、経口投与等による、免疫原性剤及び／又は免疫原性複合体の粘膜上皮への送達に適している。従って、本態様の組成物は、粘膜免疫応答及び／又は全身免疫応答を誘導するために、腸上皮組織、肺上皮組織、並びに鼻表面、膣表面、眼表面及び結腸表面を含む他の粘膜表面を越えて１つ以上の抗原分子を送達するために使用されてもよい。
剤形には、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、鼻スプレー剤（点鼻剤）、坐剤、エアロゾル剤、経皮パッチ剤等が含まれる。これらの剤形は、制御放出の目的のために特別に設計された制御放出デバイス又は制御放出の様式でさらに作用するように改変されたインプラントの他の形態の注射又は移植も含んでもよい。制御放出は、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース等の特定のセルロース誘導体を含む疎水性ポリマーでコーティングすることによってもたらされてもよい。
組成物は、それぞれが所定量の１つ以上の本発明の治療剤を含有するカプセル剤、サシェ剤、機能性食品／飼料又は錠剤等の別個の単位として、粉末若しくは顆粒として、又は水性液体、非水性液体中の溶液若しくは懸濁液、脂質粒子若しくは小胞、例えばリポソーム、ミセル若しくはミニセル（ｍｉｎｉｃｅｌｌ）、水中油型エマルション若しくは油中水型液体エマルションとして提供されてもよい。このような製剤は、任意の薬学的方法によって調製されてもよいが、すべての方法は、１つ以上の必要な成分を構成する担体と上記の１つ以上の薬剤を会合させる工程を含む。一般に、製剤は、本発明の薬剤を液体担体若しくは微細固体担体又はその両方と均一かつ密接に混合し、次いで、必要に応じて、生成物を所望の提示形態に成形することによって調製される。
いくつかの実施形態では、当該組成物は、リポソーム製剤又はワクチンとして製剤化される。「リポソーム」は、対象への薬物（例えば、本明細書に開示される免疫原性剤及び／又は免疫原性複合体等）の送達に有用な様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、通常、生物学的膜の脂質配置と同様に、二重層形成で配置される。リポソーム製剤は、当該技術分野で公知の任意の手段によって調製されてもよい。
本発明はさらに、リポソーム又は他の輸送ビヒクルに（共有結合又は非共有結合のいずれかで）結合されて、特定の標的細胞又は標的組織（例えば、免疫細胞）におけるそのようなリポソーム又は輸送ビヒクルの局在化を促進し得る、本明細書において「標的化リガンド」と呼ばれるさらなる賦形剤の使用を伴う能動的な標的化を企図する。例えば、標的化は、標的細胞又は標的組織への分布を促進するために、１つ以上の内因性標的化リガンド（例えば、マンノース又はその断片若しくは誘導体）をリポソーム又は輸送ビヒクルの中又は上に含めることによって媒介されてもよい。標的組織による標的化リガンドの認識は、標的細胞及び標的組織における輸送ビヒクル及び／又はその内容物の組織分布及び細胞取り込みを積極的に促進する（例えば、リポソーム又は輸送ビヒクル中又はその上にマンノース標的化リガンドを含めることは、本明細書中で以下に記載されるように、免疫細胞、例えば抗原提示細胞によって発現されるマンノース受容体への輸送ビヒクルの認識及び結合を促進する）。この目的のために、マンノシル化リポソームは、本明細書に開示される組成物、免疫原性剤及び／又は免疫原性複合体等の治療剤の標的送達のための有望な非生物ベクターとみなすことができる。
上記の製剤は、剤形と適合する様式で、有効な量で投与されてもよい。本発明の文脈において患者に投与される用量は、適切な期間にわたって患者において有益な応答をもたらすのに充分であるべきである。投与される薬剤（複数を含む）の量は、治療される対象の年齢、性別、体重及び全身の健康状態を含めて治療される対象、医師の判断に依存する因子に依存してもよい。
対象は、任意の適切なタイプの動物であってもよい。例えば、対象は、魚類、鳥類、両生類、爬虫類又は哺乳動物であってもよい。対象は脊椎動物であってもよい。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。本明細書で一般的に使用する場合、「患者」、「個体」、及び「対象」という用語は、本明細書に開示される治療剤又は製剤の任意の動物レシピエントの文脈で使用される。従って、本明細書に開示される方法及び製剤は、ヒト、パフォーマンス動物（ウマ、ラクダ及びグレイハウンド犬等）、家畜（ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ及びニワトリ等）、鳥類及び家禽類（ニワトリ等）、コンパニオン動物（ネコ及びイヌ等）、並びに実験動物（マウス、ラット、ウサギ及び霊長類等）等における医学的並びに／又は獣医学的用途を有してもよい。好ましい形態において、哺乳動物はヒトである。
本発明の好ましい実施形態は、以下のパラグラフに記載されている。
１． 対象への投与に適した免疫原性剤であって、少なくとも１つの抗原分子に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性ペプチドを含む免疫原性剤。
２． ［抗原分子］ｎ－［担体／リンカー］ｍ－［疎水性ペプチド］の構造を有し、
上記式中、ｎは１以上の数であり、
ｍは０以上の数であり、
「－」は共有結合又はコンジュゲーションを表す免疫原性剤。
３． 免疫原性剤を製造する方法であって、疎水性ペプチドを少なくとも１つの抗原分子に共有結合して、それによって免疫原性剤を製造する工程を含む方法。
４． パラグラフ３に記載の方法によって製造される場合の免疫原性剤。
５． 複数のパラグラフ１、パラグラフ２及びパラグラフ４のいずれか１つに記載の免疫原性剤を含む免疫原性複合体であって、複数の疎水性ペプチドが免疫原性複合体中で相互作用する免疫原性複合体。
６． 免疫原性複合体を製造する方法であって、複数のパラグラフ１、パラグラフ２及びパラグラフ４のいずれか１つに記載の免疫原性剤を組み合わせる工程を含み、この複数の免疫原性剤は上記免疫原性複合体へと自己組織化する方法。
７． パラグラフ６に記載の方法によって製造される場合の免疫原性複合体。
８． 少なくとも１つのパラグラフ１、パラグラフ２及びパラグラフ４のいずれか１つに記載の免疫原性剤並びに／又は少なくとも１つのパラグラフ５若しくはパラグラフ７に記載の免疫原性複合体を含む組成物。
９． 対象において免疫応答を誘発する方法であって、少なくとも１つのパラグラフ１、パラグラフ２及びパラグラフ４のいずれか１つに記載の免疫原性剤、少なくとも１つのパラグラフ５若しくはパラグラフ７に記載の免疫原性複合体、又は少なくとも１つのパラグラフ８に記載の組成物を対象に投与し、それによってその対象において免疫応答を誘発する工程を含む方法。
１０． 対象を免疫する方法であって、少なくとも１つのパラグラフ１、パラグラフ２及びパラグラフ４のいずれか１つに記載の免疫原性剤、少なくとも１つのパラグラフ５若しくはパラグラフ７に記載の免疫原性複合体、又は少なくとも１つのパラグラフ８に記載の組成物を対象に投与し、それによってその対象を免疫する工程を含む方法。
１１． 対象において疾患、障害若しくは状態を治療又は予防する方法であって、少なくとも１つのパラグラフ１、パラグラフ２及びパラグラフ４のいずれか１つに記載の免疫原性剤、少なくとも１つのパラグラフ５若しくはパラグラフ７に記載の免疫原性複合体、又は少なくとも１つのパラグラフ８に記載の組成物を対象に投与する工程を含む方法。
文脈によっては、上述した本発明は、以下の特徴を有する。
上記疎水性ペプチドが複数の疎水性天然アミノ酸を含む上記の発明。
上記疎水性ペプチドが、２～約５０個の任意の数のアミノ酸を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる上記の発明。
上記疎水性アミノ酸が、グリシン、プロリン、バリン、アラニン、フェニルアラニン及びロイシンからなる群から選択される上記の発明。
上記疎水性ペプチドが、１０個のバリン残基、１０個のフェニルアラニン残基、１０個のロイシン残基、１５個のロイシン残基、１５個のグリシン残基、１５個のプロリン残基、１５個のアラニン残基、２５個のアラニン残基、又は５個のフェニルアラニン－ロイシン－アラニントリペプチド残基からなる上記の発明。
上記疎水性ペプチドがポリロイシンからなるか又はポリロイシンを含む場合、上記疎水性ペプチドが、リポソーム膜への上記免疫原性剤の固定を可能にする上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子（エピトープ）の立体構造が、上記疎水性ペプチドのアミノ酸配列及び／又は長さを変化させることによって制御される上記の発明。
上記免疫原性剤の溶解度が、上記疎水性ペプチドのアミノ酸配列及び／又は長さを変化させることによって制御される上記の発明。
上記免疫原性剤が、上記疎水性ペプチド及び少なくとも１つの抗原分子が直接又は間接的に共有結合又はコンジュゲートされる少なくとも１つの担体又はリンカーをさらに含む上記の発明。
上記免疫原性剤が本質的に直鎖状である（分枝状ではない）上記の発明。
上記免疫原性剤が、構造が分枝状又は樹状である上記の発明。
上記免疫原性剤が複数の抗原分子を含む場合、上記担体又はリンカーが、連続若しくは分枝状の形態又は様式で上記抗原分子を共に結合又は連結するために利用される上記の発明。
上記免疫原性剤／少なくとも１つの抗原分子の適切な立体構造、及び／又は上記免疫原性剤の溶解度を補助するために、上記少なくとも１つの担体又はリンカーが、上記免疫原性剤の疎水性：親水性比のバランスをとる上記の発明。
上記担体又はリンカーが、αヘリックス及び／又はβシートの形成を誘導する上記の発明。
上記少なくとも１つの担体又はリンカーが上記免疫原性剤に直鎖構造を提供する上記の発明。
上記少なくとも１つの担体又はリンカーが上記免疫原性剤に分枝状又は樹状の構造を提供する上記の発明。
上記少なくとも１つの担体又はリンカーは、上記疎水性ペプチドへの結合のために、分枝鎖を形成することができる少なくとも１つのアミノ酸を含む上記の発明。
上記分枝鎖を形成することができる少なくとも１つのアミノ酸がリシン又はシステインである上記の発明。
上記少なくとも１つの担体又はリンカーがペプチドリシン－リシン－リシン－リシン－セリン－セリン（配列番号５）を含む上記の発明。
上記少なくとも１つの担体又はリンカーがペプチドセリン－リシン－リシン－リシン－リシン（配列番号６）を含む上記の発明。
上記免疫原性剤の任意の又はすべてのＮ末端がアセチル化されている上記の発明。
上記免疫原性剤の任意の又はすべてのＣ末端がアミド化されている上記の発明。
上記抗原分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質若しくはこれらの組み合わせ、例えば糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパク質、グリコリポタンパク質、又はその断片又は誘導体である上記の発明。
複数の抗原分子を含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ペプチド又はタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる上記の発明。
上記抗原分子が、特定の病原体に由来しない、又はそれに向けられない合成エピトープであるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、Ｂ細胞エピトープからなるか、又はＢ細胞エピトープを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、Ｔ細胞エピトープからなるか、又はＴ細胞エピトープを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの両方を含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、非天然Ｐａｎ－ＤＲヘルパー細胞エピトープ（ＰＡＤＲＥ；アミノ酸配列：ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；配列番号７）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、Ｐ２５（アミノ酸配列：ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬ；配列番号８）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子又はその断片が病原体のものである上記の発明。
上記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、酵母、原生生物又は虫から選択される上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）主要病原因子Ｍタンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、上記Ｍタンパク質のＣ反復領域に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）主要病原因子Ｍタンパク質に由来するＪ８ペプチド（ＱＡＥＤＫＶＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＬＥＤＫＶＱ；配列番号９）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＧＡＳ株Ｍ５４のＭタンパク質のＮ末端に由来するＰＬ１ Ｂ細胞エピトープ（ＥＶＬＴＲＲＱＳＱＤＰＫＹＶＴＱＲＩＳ；配列番号１０）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＧＡＳ株８８／３０のＭタンパク質のＮ末端に由来する８８／３０Ｂ細胞エピトープ（ＤＮＧＫＡＩＹＥＲＡＲＥＲＡＬＱＥＬＧＰ；配列番号１１）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、特定の病原体に由来しないか、若しくはそれに向けられない合成エピトープ、及び特定の病原体由来のエピトープからなるか、又はそれらを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに共有結合又はコンジュゲートされた、好ましくはポリロイシンからなる疎水性１０アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、ユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに共有結合又はコンジュゲートされた、好ましくはポリロイシンからなる疎水性１５アミノ酸ペプチドを含み、このユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥは次に、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８に結合又はコンジュゲートされる上記の発明。
上記免疫原性剤が図１の化合物５の構造を有する上記の発明。
Figure 2023510289000002
上記免疫原性剤が、図２２ｂ）の化合物７の構造（配列番号２６）を有する上記の発明。
上記免疫原性剤が、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＰＬ１及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、図２２ｂ）の化合物８の構造（配列番号２７）を有する上記の発明。
上記免疫原性剤が、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープ８８／３０及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、図２２ｂ）の化合物９の構造（配列番号２８）を有する上記の発明。
上記免疫原性剤が、ＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８、ＰＬ１及び８８／３０、並びにユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥに共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、図２２ｂ）の化合物１４の構造を有する上記の発明。
Figure 2023510289000003
図２２ｂ）の化合物７、８及び９が組み合わされて、上記免疫原性複合体が形成される上記の発明。
Figure 2023510289000004
上記免疫原性剤が、以下のうちの１つの構造を有する上記の発明。
Ａｃ－Ｊ８－Ｋ（Ａｃ－（Ｌｅｕ）１５）ＰＡＤＲＥ、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表し、「Ｋ」はリシンを表す、
Ａｃ－（Ｌｅｕ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｋ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表し、「Ｋ」はリシンを表す（配列番号２９）、
Ａｃ－（Ｌｅｕ）１５－Ｊ８－Ｋ－ＰＡＤＲＥ、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表し、「Ｋ」はリシンを表す（配列番号３０）、
Ａｃ－（Ｌｅｕ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３１）、
Ａｃ－（Ｇｌｕ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３２）、
Ａｃ－（Ｇｌｙ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３３）、
Ａｃ－（Ｓｅｒ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３４）、
Ａｃ－（Ｐｒｏ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３５）、
Ａｃ－（Ａｌａ）１５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３６）、又は
Ａｃ－（Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ａｌａ）５－ＰＡＤＲＥ－Ｊ８、式中、「Ａｃ」はアセチル化を表す（配列番号３７）。
上記免疫原性剤が、化合物２の構造
Figure 2023510289000005
 又は図２６の化合物３～１１のいずれか１つの構造（配列番号２９～３７）を有する上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、コロナウイルスのスパイクタンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＡＣＥ２－ＲＢＤ決定的結合アミノ酸残基、Ｓ１／Ｓ２切断／プライミング部位又はその付近のアミノ酸残基、ＲＢＤの受容体結合モチーフにおけるアミノ酸残基、又は受容体結合ドメインのＮＴＤにあるがＡＣＥ２と直接接触していないアミノ酸残基からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧ（Ｓ６２３～６３９）（配列番号１５）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ（Ｓ４６９～５０８）（配列番号１６）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（Ｓ４４５～４８３）（配列番号１７）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴ（Ｓ５５９～５７２）（配列番号１８）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶ（Ｓ３６６～３９５）（配列番号１９）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープに共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープ及びＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
いくつかの実施形態では、上記免疫原性剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープ及び少なくとも１つの担体又はリンカー、好ましくはペプチド又はタンパク質に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む。
上記免疫原性剤が、ＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（配列番号１７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記疎水性ペプチドが、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン－ロイシン－アラニントリペプチド反復残基、又はこれらの任意の組み合わせからなる上記の発明。
上記免疫原性剤が、ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（化合物（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３；配列番号３８）である上記の発明。
上記免疫原性剤が、ユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（配列番号７）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、ユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（化合物（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ）（配列番号３９）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０ロイシンアミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
化合物（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３（配列番号３８）及び（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ（配列番号３９）が組み合わされて上記免疫原性複合体が形成される上記の発明。
上記免疫原性剤又は免疫原性複合体が、リポソームを含む組成物中で送達される上記の発明。
上記免疫原性剤又は免疫原性複合体が、上記疎水性ペプチドによってリポソームに固定される上記の発明。
上記免疫原性剤又は免疫原性複合体が、リポソーム及びそのリポソームに組み込まれたマンノース標的化部分を含む組成物中で送達される上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、腫瘍抗原若しくはその断片であるか、又はそれを含む上記の発明。
上記腫瘍抗原が、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物含有断片、リポタンパク質、又は腫瘍細胞によって発現される他の分子である上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、癌タンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＨＰＶ癌タンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、Ｅ７と呼ばれるＨＰＶ癌タンパク質に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＣＤ８＋ペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ＨＰＶ－１６ Ｅ７癌タンパク質に由来する８Ｑｍ（Ｅ７４４～５７、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号１４）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、８Ｑｍ（配列番号１４）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ロイシンポリペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、図１４ｂ）の化合物Ｌｅｕ－８Ｑｍの構造（ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号２５）を有する上記の発明。
上記免疫原性剤又は免疫原性複合体が、リポソームを含む組成物中で送達される上記の発明。
上記免疫原性剤又は免疫原性複合体が、上記疎水性ペプチドによってリポソームに固定される上記の発明。
上記免疫原性剤又は免疫原性複合体が、リポソーム及びそのリポソームに組み込まれたマンノース標的化部分を含む組成物中で送達される上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、鉤虫に由来するペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、Ａ２９１Ｙと呼ばれるＮａ－ＡＰＲ－１に由来するネカトール・アメリカヌスペプチドからなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ｐ３と呼ばれるＢ細胞エピトープ（ＴＳＬＩＡＧＰＫＡＱＶＥＡＩＱＫＹＩＧＡＥＬ；配列番号１２）からなるか、又はそれを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、エピトープｐ３（配列番号１２）及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号８）に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性１０～１５アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、エピトープｐ３（配列番号１２）及びユニバーサルＴヘルパーエピトープＰ２５（配列番号８）に共有結合又はコンジュゲートされた、好ましくはポリロイシンからなる疎水性１０アミノ酸ペプチドを含む上記の発明。
上記免疫原性剤が、少なくとも１つの担体又はリンカー、好ましくは疎水性ペプチドに結合したリシン分岐スペーサ、並びに溶解度を増加させ、エピトープの自己組織化を可能にするためのリシン及びセリンから構築された親水性部分をさらに含む上記の発明。
上記免疫原性剤が図１８の化合物３の構造を有する上記の発明。
Figure 2023510289000006
上記免疫原性剤又は免疫原性複合体が、対象への経口投与に適している上記の発明。
上記免疫原性剤が、古典的固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して合成される上記の発明。
疎水性ペプチド配列との共有結合又はコンジュゲーションの際に、上記親水性抗原分子が、両親媒性特性を有しそれゆえ自己組織化してナノ粒子又は微粒子等の粒子を形成することができる部分／コンジュゲートを形成する上記の発明。
自己組織化がナノ粒子の鎖状凝集体（ＣＬＡＮ）又は微粒子の形成を含む上記の発明。
上記疎水性ペプチドが、αヘリックス及び／又はβシートの形成を誘導することができる上記の発明。
上記担体又はリンカーが、αヘリックス及び／又はβシートの形成を誘導する上記の発明。
上記疎水性ペプチドが、リポソーム膜、又はミセル若しくはナノ粒子等の他の親油性表面への上記免疫原性剤の固定を可能にする上記の発明。
上記疎水性アミノ酸が、好ましくは、以下の、ポリグリシン、ポリプロリン、ポリバリン、ポリアラニン、ポリフェニルアラニン及びポリロイシンからなる群から選択される上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子が、ペプチド、タンパク質若しくは炭水化物、又はその断片又は誘導体を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる上記の発明。
上記少なくとも１つの抗原分子及び上記疎水性ペプチドが、免疫原性剤の反対側の（対向する両側の）末端に位置する上記の発明。
上記免疫原性剤が複数の抗原分子を含む場合、担体又はリンカーが、連続した、分枝状若しくは樹状の形態又は様式で抗原分子を共に結合又は連結するために利用される上記の発明。
上記組成物がさらに、
リポソーム、ミセル若しくはナノ粒子、又は
リポソーム、ミセル若しくはナノ粒子、及びマンノース標的化部分
を含む上記の発明。
上記動物が、哺乳動物、鳥類、ブタ又はヒトであり、かつ／又は上記方法が、アジュバント若しくは他の一般的な免疫賦活剤の同時投与を必要としない上記の発明。
アミノ酸配列の文脈における「本質的に…からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、列挙されたアミノ酸配列が、Ｎ又はＣ末端におけるさらなる１つ、２つ又は３つのアミノ酸を伴うことを意味する。
文脈と矛盾する場合を除いて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、又は同様の用語は、要素又は特徴の記載されたリストが、記述された又は列挙された要素のみを含むのではなく、列挙又は記述されていない他の要素又は特徴を含んでもよいように、非排他的な包含を意味することが意図される。
本明細書で使用する場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、単数若しくは複数の要素若しくは特徴を指すか、又は包含するために使用され、「１つの」若しくは「単一の」要素若しくは特徴を意味又は定義すると解釈されるべきではない。
化合物１～５の模式的構造。ワクチン候補は、３つの一般的な構築ブロックを使用して構築された：Ｂ細胞エピトープ（Ｊ８；配列番号９）；Ｔヘルパーエピトープ（ＰＡＤＲＥ；配列番号７）；及びポリ疎水性アミノ酸（ｐＨＡＡ）単位（すなわち、（Ｖａｌ）１０、（Ｐｈｅ）１０、（Ｌｅｕ）１０又は（Ｌｅｕ）１５）。単独のリシン（Ｌｙｓ）残基を含む分枝状担体も示されている。Ｎ末端はアセチル化されている（「Ａｃ」）。 化合物２～５の物理化学的特性評価。ワクチン化合物（ａ）２、（ｂ）３、（ｃ）４及び（ｄ）５の透過型電子顕微鏡写真（バー２００ｎｍ）。（ｅ）化合物１～５の円二色性スペクトル。 ワクチン候補２～５による刺激に応答したＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（「ＤＣ」）及びＦ４／８０＋マクロファージ上のＡＰＣ成熟マーカーＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ４０の発現。バーは、ＣＤ１１ｃ／Ｆ４／８０及びＣＤ４０／ＣＤ８６／ＭＨＣ－ＩＩ二重陽性細胞の平均蛍光強度を表す。（ａ）ＣＤ４０発現についての単離ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞及びＦ４／８０＋マクロファージの平均蛍光強度（ＭＦＩ（±ＳＤ））；（ｂ）ＭＨＣ－ＩＩ発現についての単離ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞及びＦ４／８０＋マクロファージの平均蛍光強度（ＭＦＩ（±ＳＤ））。統計解析は、二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＰＢＳと比較したテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定を用いて行い、結果を示した（ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 実験マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、ｎ＝１０）は、化合物１～５で（０日目、２１日目、２８日目及び３５日目に）皮下にワクチン接種を受けた。（ａ）～（ｃ）の各三角形は、個々のマウスを表し、平均Ｊ８特異的力価をバーとして表す。（ａ）血清中のＪ８特異的ＩｇＧの力価；（ｂ）唾液中のＪ８特異的ＩｇＡの力価；及び（ｃ）最終免疫化後に採取した唾液中のＪ８特異的ＩｇＧの力価。（ｄ）ＧＡＳ株２００２の平均オプソニン化パーセンテージ；（ｅ）ａ Ｄ２６１２；（ｆ）Ｄ３８４０；（ｇ）ＧＣ２２０３；（ｈ）５２３０；（ｉ）５１９９。ＰＢＳ：陰性対照群、リン酸緩衝生理食塩水で免疫したマウス；１／ＣＦＡ：陽性対照群、ＣＦＡで乳化した化合物１。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＰＢＳと比較したテューキーの事後検定を用いて行い、結果を示した（ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１０／群）におけるＭ１ ＧＡＳ株での鼻腔内抗原接種（抗原投与）後の細菌負荷。細菌負荷の結果は、１０匹のマウス／群についての平均ＣＦＵ±ＳＥＭとして表される。（ａ）鼻排泄物；（ｂ）咽喉スワブ；（ｃ）ＮＡＬＴのコロニー形成；及び（ｄ）脾臓。ＰＢＳ：陰性対照群、リン酸緩衝生理食塩水で免疫したマウス；１／ＣＦＡ：陽性対照群、ＣＦＡで乳化した化合物１。統計解析は、二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＰＢＳと比較したテューキーの事後検定を用いて行い、結果を示した（ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。 化合物１の（ａ）ＭＳ及び（ｂ）ＨＰＬＣスペクトル。 化合物２の（ａ）ＭＳ及び（ｂ）ＨＰＬＣスペクトル。 化合物３の（ａ）ＭＳ及び（ｂ）ＨＰＬＣスペクトル。 化合物４の（ａ）ＭＳ及び（ｂ）ＨＰＬＣスペクトル。 化合物５の（ａ）ＭＳ及び（ｂ）ＨＰＬＣスペクトル。 一次免疫の５５日後のマウス尾部の写真。Ａ．ＣＦＡアジュバント添加ペプチドエピトープを注射した陽性群からのマウスの尾部；Ｂ．ワクチン候補１９を注射した群からのマウスの尾部。注射部位の瘢痕（炎症）は、ＣＦＡ免疫化の５５日後でさえ見えた（図４及び図５）。 抗原接種実験から収集した細菌のラテックス凝集試験結果。Ａ、Ａ群レンサ球菌；Ｂ、Ｂ群レンサ球菌；Ｃ、Ｃ群レンサ球菌；Ｄ、Ｄ群レンサ球菌；Ｆ、Ｆ群レンサ球菌；Ｇ、Ｇ群レンサ球菌；＋、Ａ群レンサ球菌。点在スポット（濃密ではない）の存在により、Ａ群レンサ球菌の存在が確認された。 免疫原性剤の一般化構造。 本研究で使用したワクチン候補の模式図：（ａ）Ｄ－８Ｑ；（ｂ）Ｌｅｕ－８Ｑ；（ｃ）ＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノース；（ｄ）Ｌ１；（ｅ）Ｌ２；及び（ｆ）Ｌ２Ｍ。 ＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノース（１０）の合成を示すスキーム。 ２％酢酸ウラニルで染色した（ａ）Ｌ１、（ｂ）Ｌ２、及び（ｃ）Ｌ２Ｍの透過型電子顕微鏡像（バー＝２００ｎｍ）。 インビボ腫瘍処置実験及びＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝８マウス／群）は、ＴＣ－１腫瘍細胞で皮下接種され（０日目）、７日目に異なる免疫原でワクチン接種を受けた。ａ）生存率がモニターされ、死亡までの時間がカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）生存曲線にプロットされた。腫瘍体積がモニターされ、Ｌ２（ｂ）及びＬ２Ｍ（ｃ）で免疫した各個々のマウスについてプロットされた。ｄ）ワクチン接種に対するＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の評価。マウスは、両方の側腹部においてワクチン候補で皮下免疫された。１０日後、脾臓が回収され、短いＥ７４９～５７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号１３）ペプチドに応答したＩＦＮ－γ産生がＥＬＩＳＰＯＴによって決定された（ｎ＝６マウス／群）。Ｌ３群は、ポリロイシンに結合されリポソームに封入されたＧＡＳに由来するＪ８であった（無関係の対照）。データは２つの独立の実験からプールされ、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの事後多重比較検定を用いて解析された（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。 ワクチンペプチド１（ａ）、２（ｂ）及び３（ｃ）の模式図。ワクチン候補は、鉤虫由来のＮａ ｐ３ペプチド（配列番号１２）及びＴヘルパーＰ２５（配列番号８）（ａ）、親水性リンカーとしてＫＫＫＫＳＳペプチド（配列番号５）を用いてＬＣＰ送達系にコンジュゲートされたＮａ ｐ３ペプチド（配列番号１２）及びＴヘルパーＰ２５（配列番号８）（ｂ）、又は類似の親水性リンカー（ＳＫＫＫＫ；配列番号６）を伴いポリロイシン送達系にコンジュゲートされたＮａ ｐ３ペプチド（配列番号１２）及びＴヘルパーＰ２５（配列番号８）（ｃ）であった。 ２％酢酸ウラニルで染色したペプチド２（ａ）及びペプチド３（ｂ）の透過型電子顕微鏡像。 ＥＬＩＳＡを用いて分析された、抗原接種前の血液（４８日目）及びＮ．ブラシリエンシス（Ｎ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）での抗原接種の７日後（５６日目）からの経口免疫後のｐ３特異的Ｎａ－ＡＰＲ－１及びＮｂｒ ＥＳＰ ＩｇＧ抗体価。（ａ）４８日目のｐ３特異的血清ＩｇＧ力価、（ｂ）４８日目のＮａ－ＡＰＲ－１特異的血清ＩｇＧ力価、（ｃ）４８日目のＮｂｒ ＥＳＰ特異的血清ＩｇＧ力価、（ｄ）５６日目のｐ３特異的血清ＩｇＧ力価、（ｅ）５６日目のＮａ－ＡＰＲ－１特異的血清ＩｇＧ力価、及び（ｆ）５６日目のＮｂｒ ＥＳＰ特異的血清ＩｇＧ力価。尾部出血（抗原接種前）から、又は抗原接種後（安楽死時）に心臓穿刺から血液が採取された。各点は、個々の近交系ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝１０）を表す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くＰＢＳと比較したテューキーの事後検定を用いて行い、結果を示した（ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。 ペプチド１、２及び３は、Ｎ．ブラシリエンシスでの抗原接種後に寄生生物負荷の非常に有意な減少を誘導する。小腸における虫の数（ａ）及び結腸から収集された糞便の中の卵の数（ｂ）は、ＰＢＳを投与された対照マウスと比較して有意に減少した。卵負荷は、糞便のグラム中の卵の量に基づいて計算した。水平バーは各群の平均を表す。統計解析は、ノンパラメトリックなマンホイットニー（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定を用いて行った（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。統計解析は、ペプチド抗原で免疫したマウスをＰＢＳ処置マウスと比較した。 コンジュゲーション（１４）対混合戦略（７～８）を比較するために使用された、ペプチドエピトープ（１～６）及びｐＨＡＡ－抗原コンジュゲートの構造。 ＴＥＭ（バー５００ｎｍ）によって捕捉された化合物４～６（混合物）、７～９（混合物）並びに個々の化合物７～９及び化合物１４の粒子撮像及びモルホロジー（形態）。個々の化合物４～６は多分散ナノ粒子を形成し、これは主にペプチド自体をＴＥＭなしで検出した（ＤＬＳ）。他方、化合物４～６の混合物は、より大きい多分散性ナノ粒子（１２０及び７００ｎｍ）を形成し、ＴＥＭからは小さなナノ粒子及びＣＬＡＮのより明確な組み合わせを伴っていた。化合物７は、ＤＬＳからの粒子サイズ（粒径）（３２０ｎｍ）を有する小さなナノ粒子及びＣＬＡＮ（ＴＥＭ像）に自己組織化した。同様の粒子サイズが、化合物９についてＤＬＳによって測定された。しかしながら、化合物９のＴＥＭ像は、より大きい粒子サイズ（５３０ｎｍ）を有する化合物８と同様の形態を有する化合物７と比較して、わずかに大きく、より目に見える凝集体を有する小さいナノ粒子を示す。化合物７～９の混合物は、ＤＬＳによって測定される３５０ｎｍの凝集体を有するマルチエピトープコンジュゲート（化合物１４）よりも６００ｎｍのサイズの大きい粒子を形成した。ＴＥＭ結果は、混合化合物及びマルチエピトープ化合物の生理化学的特性及び形態に関する完全な評価に必要とされる。 ＥＬＩＳＡによって分析した、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける化合物４～６（混合物）＋ＣＦＡ（陽性対照）、２～３（混合物）及び１４での免疫化後の最終出血中に存在するＪ８特異的血清ＩｇＧ抗体価、ＰＬ１特異的血清ＩｇＧ抗体価及び８８／３０特異的血清ＩｇＧ抗体価。各点は個々のマウスを表し、バーは平均抗原特異的血清ＩｇＧ抗体価を表す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて行った（（＊）Ｐ＜０．０５、（＊＊）Ｐ＜０．０１、（＊＊＊）Ｐ＜０．００１、（＊＊＊＊）Ｐ＜０．０００１）。 分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ（ａ）及びＥＳＩ－ＭＳ（ｂ）による精製化合物１～１４の分析。これらの化合物は、Ｒｔ５分から３０分までの溶媒Ｂ濃度勾配２５～４５％（１～３及び１０～１１）、３０～５０％（４～６）、５５～７５％（７～９）、及び７０～９０％（１３）を用いる分取ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて精製した。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣグラフは、単一ピークとして純粋な化合物を示す。これらのピークからの質量は、ＥＳＩ－ＭＳにおいて所望の化合物にマッチした。 図２５（１）の続きである。 図２５（１）及び図２５（２）の続きである。 （ａ）ペプチドエピトープ；（ｂ）異なるエピトープ配置を有するワクチン構築物；及び（ｃ）異なるｐＨＡＡ配列の構造。 ＴＥＭによって捕捉された化合物２～８及び１０～１１の粒子像（バー２００ｎｍ；２％ホスホタングステン酸からの陰性染色が暗い領域として見える）。 ＥＬＩＳＡによって決定された、化合物１＋ＣＦＡ及び２～４での免疫化後のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＪ８特異的血清ＩｇＧ抗体価。各点は個々のマウスを表し、バーは平均抗原特異的血清ＩｇＧ抗体価を表す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて行った（（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１）。 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＰＢＳ（陰性対照）、化合物１、１＋ＣＦＡ、１＋ミョウバン、１＋ＭＦ５９、１＋ＡＳＯ４（アジュバント添加対照）及び５～１１の皮下注射後の免疫応答。（ａ）ＥＬＩＳＡによって分析したＪ８特異的血清ＩｇＧ抗体価及び（ｂ）Ｊ８特異的唾液ＩｇＧ抗体価。各点は個々のマウスを表し、バーは平均抗原特異的ＩｇＧ抗体価を表す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて行った（（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１）。（ｃ）ｐＨＡＡコンジュゲート５～１１及び対照によるＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）の一次免疫後４９日目に採取された血清による異なるＧＡＳ株（Ｄ３８４０及びＧＣ２２０３）の平均オプソニン化パーセンテージ。 分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ（ａ）及びＥＳＩ－ＭＳ（ｂ）による精製化合物１～１１の分析。これらの化合物は、Ｒｔ５分から３０分までの溶媒Ｂ濃度勾配２５～４５％（１）、３５～５５％（９及び１１）、４０～６０％（７～８）、６５～８５％（２～５）、並びに８０～１００％（６及び１０）を用いる分取ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、Ｃ１８（１）、Ｃ４（２～９）又はＣ８（１１）カラムを用いて精製した。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣグラフは、単一ピークとして純粋な化合物を示す。これらのピークからの質量は、ＥＳＩ－ＭＳにおいて所望の化合物にマッチした。 図３０（１）の続きである。 化合物１～１１の強度（上）及び数（下）による粒子サイズのＤＬＳスペクトル。 図３１（１）の続きである。 化合物１及び５～１１の二次構造、並びにそれらのαヘリックス、β鎖及びランダムコイル含有率の分析。 ＥＬＩＳＡによって分析された、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）におけるＰＢＳ、化合物１（陰性対照）、１＋ＣＦＡ、１＋ミョウバン、１＋ＭＦ５９、１＋ＡＳＯ４（アジュバント添加対照）及び５～１１の皮下注射後のｐ１４５特異的血清ＩｇＧ抗体価。各点は個々のマウスを表し、バーは平均抗原特異的血清ＩｇＧ抗体価を表す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて行った（（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１）。 免疫応答の特異性。ＰＢＳ、ＰＡＤＲＥ－８８／３０＋ＣＦＡ及び５でワクチン接種を受けたマウス（ｎ＝５）からの血清（１：２００希釈）が、（Ｌｅｕ）１５－ＰＡＤＲＥ－８８／３０でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上で使用された。コンジュゲート５は、ＰＡＤＲＥ及びポリロイシンに対する抗体産生を誘導しなかった。各点は個々のマウスを表し、バーは平均抗原特異的血清ＩｇＧ抗体光学密度を表す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて行った（＊＊＊＊；ｐ＜０．０００１）。 免疫、血清及び唾液採取日が記入された皮下免疫スケジュール。 ＯＤ４５０値として提示された、ＲＢＤ、又はＣＦＡでアジュバント添加されたエピトープによるＢＡＬＢ／ｃマウスの単回皮下免疫後の抗ＲＢＤ ＩｇＧ応答。免疫化した群はＰＢＳと比較され、統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を用いて行った；＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１。 Ａ）Ｂ３免疫マウス血清の存在下、Ｂ）ＲＢＤ免疫マウス血清の存在下でのＲＢＤ／ＡＣＥ２結合阻害アッセイ、及びＣ）様々な血清希釈における平均群阻害パーセント。血清は、４倍希釈から開始して連続希釈された。 ＯＤ４５０値として提示された、ＣＦＡ又はＭＦ５９でアジュバント添加されたＲＢＤ又はＢ３並びにワクチン候補Ｌ１及びＬ２による３回の皮下免疫後の抗ＲＢＤ ＩｇＧ応答。統計解析は、一元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定を用いて行った；＊＊＊＊ ｐ＜０．０００１。 Ａ）ＣＦＡ＋ＲＢＤ、Ｂ）Ｂ３＋ＰＡＤＲＥ＋ＭＦ５９、Ｃ）Ｌ１、Ｄ）Ｌ２、及びＥ）ＰＢＳの存在下でのＲＢＤ／ＡＣＥ２結合阻害アッセイ。血清は、１０倍希釈から開始して連続希釈された。 分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ（ａ）及びＥＳＩ－ＭＳ（ｂ）による精製化合物（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３の分析。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣグラフは、単一ピークとして純粋な化合物を示す。 分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ（ａ）及びＥＳＩ－ＭＳ（ｂ）による精製化合物（ＬＥＵ）１０－ＰＡＤＲＥの分析。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣグラフは、単一ピークとして純粋な化合物を示す。
Figure 2023510289000007
Figure 2023510289000008
Figure 2023510289000009
Figure 2023510289000010
当該免疫原性剤の任意の又はすべてのＮ末端は、アセチル化されていてもよいしアセチル化されていなくてもよい。当該免疫原性剤の任意の又はすべてのＣ末端は、アミド化に供されてもよく供されなくてもよい。配列表の配列は、修飾末端及び非修飾末端の両方を表すことができる。
本発明が完全に理解され、実用的な効果へつなげられうるように、以下の非限定的な実施例が参照される。
実施例１
ワクチンは、感染性疾患と戦うための最も強力なツールの１つである。全病原体及びタンパク質ベースのワクチンは、病原体に対する非常に効率的な防御を提供することができるが、それらは必ずしも完全に安全であるとは限らず、望ましくない免疫応答を誘導する可能性がある。このような場合、選択されたエピトープに対する非常に特異的な免疫応答のみを誘導するように設計されたペプチドベース及びタンパク質ベースのワクチンは、天然の代替物である［１、２］。例えば、臨床試験に入ったＡ群レンサ球菌（ＧＡＳ）に対する最近のワクチンはすべて、ＧＡＳ主要病原因子であるＭタンパク質に由来するペプチドに基づくが、タンパク質自体には基づかない［３］。ＧＡＳは、様々な軽度感染の原因であり、またリウマチ熱（ＲＦ）及びリウマチ性心疾患（ＲＨＤ）等の生命を脅かす自己免疫疾患の原因であり［４］、これらの自己免疫疾患は、世界中で年間１４０万人々を死に至らしめると推定されている［５］。Ｍタンパク質は、これらの自己免疫応答の誘発に関与する主要な抗原であると予想される［６］。これにもかかわらず、安全であり、膨大な数のＧＡＳ血清型の間で保存されているＭタンパク質ベースのペプチド抗原を特定することが可能である［７］。このような抗原は、何らかの免疫応答を誘導するために、アジュバント及び／又は適切な送達系と同時投与される必要がある。しかしながら、ペプチドエピトープに対する免疫応答を刺激することができる安全かつ高効率のアジュバントの選択は限られている［８］。一般に、ミョウバンは、市販のワクチンの製剤に広く使用される唯一のアジュバントであるが、少数の他のアジュバントが、特定のワクチン製剤についてのみ承認されている。しかしながら、ミョウバンは、ペプチドに対する強力な免疫応答を刺激するにはアジュバントとして弱すぎる［９］。免疫系によるペプチド抗原認識の誘発に有効な「至適基準（ゴールドスタンダード）」の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）等の強力なアジュバントは、しばしば毒性であり、化学的にあまり明確ではない細菌又は毒素の断片を含有することが多い［１０］。それゆえ、とりわけ、弱い免疫原性抗原のための新規アジュバントの開発がまだ満たされていない臨床的必要性であることは明らかである［１１］。
疎水性樹状ポリ（アクリル酸ｔｅｒｔ－ブチル）は、ＧＡＳ由来のペプチドエピトープを含む様々なペプチドエピトープにコンジュゲートされて、コンジュゲートを自己組織化させ粒子を形成している［１２］。生成された粒子は、有害作用の徴候なしに、組み込まれたペプチド抗原に対する強力な体液性及び細胞性の免疫応答を誘導した［１２、１３、１４、１５、１６］。しかしながら、生分解性の欠如、明確ではない立体化学及び再現性は、そのようなアジュバント／ワクチン組成物において深刻な制限であり、これは、商業的適用の成功の可能性を制限する。
本実施例では、本発明者らは、天然疎水性アミノ酸から構築した完全に明確な生分解性ポリマーに基づく強力なペプチドベースのワクチン送達系を設計した。
材料及び方法
試薬、細胞及び機器。すべての化学物質は、いかなる精製もなしに、入手したままで使用した。ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ノババイオケム）（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（メルク・ケミカルズ）（ドイツ、ダルムシュタット））及びＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（ミモトープス）（オーストラリア、メルボルン）から購入した。メタノール、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、及びジクロロメタン（ＤＣＭ）はＭｅｒｃｋ（メルク）（ドイツ、ホーエンブルン（Ｈｏｈｅｎｂｒｕｎｎ））から購入した。４－メチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）樹脂は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ペプチド・インターナショナル）（米国、ケンタッキー州）から購入した。２－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）はＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（オーストラリア、メルボルン）から購入した。ｐ－クレゾールはＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（メルクミリポア）（オーストラリア、ベイズウォーター（Ｂａｙｓｗａｔｅｒ））から得た。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ（ＩｇＧ－ＨＲＰ）コンジュゲートはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア）（米国、カリフォルニア州、テメクラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ））から入手し、ヤギ抗マウスＩｇＡはＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（インビボジェン）（米国、サンディエゴ）から入手し、分析グレードのＴｗｅｅｎ２０、（トリス－ヒドロキシメチル）アミノメタン及びグリシンは、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ブイダブリューアール・インターナショナル）（オーストラリア、クイーンズランド州（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ））から入手した。フェノールを含まないＩＭＤＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地は、Ｇｉｂｃｏ（ギブコ）（米国、カリフォルニア州）から購入した。Ｓｔｒｅｐｔｅｘ（商標） Ｌａｔｅｘ Ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔキット及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモサイエンティフィック）（オーストラリア、ビクトリア州）から購入した。ＰＥ／ＣＹ７抗マウスＣＤ１１ＣはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（イーバイオサイエンス）（米国、カリフォルニア州）から購入し、ＢＶ４２１抗マウスＭＨＣ－ＩＩ、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ４０及びＢＶ６０５抗マウスＦ４／８０はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（バイオレジェンド）（米国、カリフォルニア州）から購入した。ＦｃブロックはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国、カリフォルニア州）から得た。酵母エキスはＭｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ドイツ、ダルムシュタット）から購入した。トッド・ヒューイット（Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ）ブロス（ＴＨＢ）はＯｘｏｉｄ（オクソイド）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、オーストラリア、南オーストラリア州）から購入し、ウマ血液はＳｅｒｕｍ ａｕｓｔｒａｌｉｓ（セラム・オーストラリス）から得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ（動物資源センター）（オーストラリア、西オーストラリア州）から購入した。ＧＡＳ鼻腔内抗原接種で使用したＧＡＳ株５４４８ＡＰは、Ｍａｒｋ Ｗａｌｋｅｒ（マーク・ウォーカー）教授の研究室から入手した。ＧＡＳ株ＡＣＭ－２００２は、Ｒｏｙａｌ Ｂｒｉｓｂａｎｅ ｈｏｓｐｉｔａｌ（ロイヤル・ブリスベン病院）（ヒト膿瘍－リンパ腺）から、ＡＣＭ－５１９９（ＡＴＣＣ １２３４４、ＮＣＩＢ １１８４１、猩紅熱）、ＡＣＭ－５２０３（ＡＴＣＣ １９６１５、子供の咽頭、続いて咽頭痛）、ＧＣ２２０３（創傷スワブ）、Ｄ３８４０（鼻咽頭スワブ）及びＤ２６１２（鼻咽頭スワブ）も得た。すべての他の化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）（オーストラリア、ビクトリア州）から購入した。
分析用ＲＰ－ＨＰＬＣは、島津製作所（日本、京都）の装置で、１ｍＬ／分の流量で行い、２１４ｎｍで化合物を検出した。分取ＲＰ－ＨＰＬＣは、直線勾配モードで島津製作所（日本、京都）の装置（ＬＣ－２０ＡＴ、ＳＩＬ－１０Ａ、ＣＢＭ－２０Ａ、ＳＰＤ－２０ＡＶ、ＦＲＣ－１０Ａ又はＬＣ－２０ＡＰ×２、ＣＢＭ－２０Ａ、ＳＰＤ－２０Ａ、ＦＲＣ－１０Ａのいずれか）を用いて達成した。流量は１０ｍＬ／分又は２０ｍＬ／分であり、化合物は２３０ｎｍで検出した。分離は、溶媒Ａ（１００％Ｈ２Ｏ及び０．１％ＴＦＡ）と溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％Ｈ２Ｏ及び０．１％ＴＦＡ）とを用いて、Ｖｙｄａｃ ２１４ＴＰ１０２２分取カラム（Ｃ４、１０μｍ、２２ｍｍ×２５０ｍｍ）上で達成した。Ａｎａｌｙｓｔ １．４ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（アプライド・バイオシステムズ）／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ（エムディーエス・サイエックス）、カナダ、トロント）を備えたＰｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ－Ｓｃｉｅｘ（パーキンエルマー・サイエックス） ＡＰＩ３０００装置をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）に使用した。粒子サイズ及び形態は、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（マルバーン・インスツルメンツ）、英国）を用いて、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を用いて使い捨てキャピラリーキュベットでＤＬＳにより、及びＪＥＭ－１０１０顕微鏡（日本電子、日本）を用いてＴＥＭにより分析した。化合物１～５の二次構造は、１ｍｍセル（Ｓｔａｒｎａ（スターナ））を備えた円形二色性（ＣＤ）装置（ＪＡＳＣＯ Ｊ７１０分光偏光計、日本分光、日本）によって室温で分析した。細胞傷害性分析における各ウェルの吸光度は、Ｂｉｏ－Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．（バイオ・テク・インスツルメンツ）（バーモント州、ウィヌースキ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ））製のＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＸＳ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを用いて５８０ｎｍで測定した。ＬＳＲ ＩＩフローサイトメトリー装置（ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ビーディー・バイオサイエンシーズ）、米国、カリフォルニア州）をＡＰＣ成熟研究に適用した。ＲＳ－ＶＡ １０ボルテックスミキサー（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（フェニックス・インスツルメント）、ドイツ）をワクチン接種溶液の調製に使用した。ＥＬＩＳＡプレートは、Ｖｉｃｔｏｒ３ １４２０マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（パーキンエルマー・ライフアンドアナリティカルサイエンシーズ）、米国、シェルトン（Ｓｈｅｌｔｏｎ））で分析した。
ｐＨＡＡ－ペプチドコンジュゲートの合成及び精製。マイクロ波支援標準Ｂｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法［１７］によってペプチド１～５（図１）を合成した。簡潔に述べると、Ｂｏｃ基の脱保護をニートＴＦＡで２回（１×２分及び１×３分）行い、アミノ酸の二重カップリングを適用した（１×５分及び１×１０分、２０Ｗ、７０℃）。アミノ酸は、ＤＩＰＥＡ及びＨＡＴＵによって活性化した。ペプチドを、スカベンジャーとしてｐ－クレゾールを添加して無水フッ化水素（ＨＦ）により切断した。化合物１～５をＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。
化合物１。収率：３４％。分子量：４８２３．６３。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １６０８．６（計算値１６０８．９）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １２０６．８（計算値１２０６．９）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ９６５．８（計算値９６５．７）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ８０４．９（計算値８０４．９）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ６９０．１（計算値６９０．１）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ６０３．９（計算値６０４．０）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ５３７．０（計算値５３７．０）。ｔＲ＝１９．１分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ４カラム）、純度≧９９％。
化合物２。収率：２３％。分子量：５８１４．９６。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １９３８．６（計算値１９３９．３）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １４５５．０（計算値１４５４．７）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １１６４．０（計算値１１６４．０）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ９６９．９（計算値９７０．１）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ８３１．５（計算値８３１．７）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ７２８．０（計算値７２７．９）。ｔＲ＝２４．１分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ４カラム）、純度≧９９％。
化合物３。収率：２８％。分子量：６２９５．４０。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １５７４．７（計算値１５７４．９）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １２６０．０（計算値１２６０．０）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０５０．３（計算値１０５０．２）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ９００．４（計算値９００．３）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ７８８．０（計算値７８７．９）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ７００．７（計算値７００．５）。ｔＲ＝２４．５分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ４カラム）、純度≧９９％。
化合物４。収率：２８％。分子量：５９５５．２３。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １９８５．２（計算値１９８６．１）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １４８９．６（計算値１４８９．８）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １１９２．０（計算値１１９２．０）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ９９３．５（計算値９９３．５）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ８５１．８（計算値８５１．７）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ７４５．４（計算値７４５．４）。ｔＲ＝２５．６分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ４カラム）、純度≧９９％。
化合物５。収率：２６％。分子量：６５２１．０３。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １６３１．８（計算値１６３１．３）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １３０５．６（計算値１３０５．２）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０８８．０（計算値１０８７．８）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ９３２．９（計算値９３２．６）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ８１６．３（計算値８１６．１）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ７２５．６（計算値７２５．６）。ｔＲ＝３０．９分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ４カラム）、純度≧９９％。
粒子サイズ測定。化合物２～５をＰＢＳ中で自己組織化させて０．５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。次いで、生成したナノ構造体の平均粒子サイズ（ｎｍ）を２５℃でＤＬＳにより測定した。非侵襲的後方散乱法を用いてサイズを分析し、１７３°の散乱角で測定を行った。相関時間は、実行あたり１０秒に基づき、１回の測定あたり少なくとも１０回の連続実行を行った。各測定を５回繰り返した。同じ化合物溶液をＴＥＭによっても分析した。
二次構造分析。化合物１～５（ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬ）の二次構造をＣＤによって分析した。スペクトルを以下のパラメータで試験した：５ｎｍの帯域幅；走査速度５０ｎｍ／分；応答時間２秒；及び窒素雰囲気中、波長範囲１９５～２６０ｎｍにわたって１ｎｍ間隔。報告するデータは６回の累積の平均である。平均残基モル楕円率（ｄｅｇ．ｃｍ２．ｄｍｏｌ－１）を、式［θ］＝ｍｄｅｇ／（ｌ×ｃ×ｎ）＊１０００を用いて計算した。式中、ｌは光路長（０．１ｃｍ）であり、ｃはペプチド濃度（ｍＭ）であり、ｎはペプチド中の残基の数である。
倫理上の記述。使用したすべての動物プロトコルは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（グリフィス大学動物実験委員会）、ＧＵ整理番号：ＧＬＹ／０７／１４によって承認された。この研究は、ＮＨＭＲＣ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ，ｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｃａｒｉｎｇ ｆｏｒ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｕｒｐｏｓｅｓ（科学的目的のために遺伝子改変及びクローン化動物を作製、育種、ケア及び使用することについてのオーストラリアＮＨＭＲＣガイドライン）（２００７）に従って実施した。訓練を受けた動物ケアスタッフによってマウスを毎日観察し、マウスに対する疼痛及び苦痛を最小限に抑えるための方法を選択した。マウスは、ＣＯ２吸入チャンバーを用いて殺処分した。
細胞傷害性結果研究。３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）細胞傷害性アッセイを、ＳＷ６２０及びＨＥＫ２９３接着細胞株を用いて行った。ＳＷ６２０及びＨＥＫ２９３を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したフラスコ中で、接着単層として、５％ＣＯ２を供給した加湿３７℃インキュベーター中で、それぞれＲＰＭＩ－１６４０培地及びダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。次いで、細胞をトリプシンで回収し、この２つの細胞株について２，０００細胞／ウェルで９６ウェルマイクロタイターアッセイプレートに分注し、５％ＣＯ２で３７℃で１８時間インキュベートした（細胞を付着させた）。化合物２～５をＰＢＳ中の５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）に溶解し、アリコート（１０μＬ）を１０ｎＭ～３０μＭの範囲の一連の最終濃度にわたって試験した。対照ウェルを５％ＤＭＳＯ水溶液で処理した。５％ＣＯ２と共に３７℃で６８時間インキュベートした後、ＰＢＳ中のＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）のアリコート（１０μＬ）を各ウェルに添加し（０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度）、マイクロタイタープレートを５％ＣＯ２と共に３７℃でさらに４時間インキュベートした。この最終インキュベーション後、培地を吸引し、沈殿したホルマザン結晶をＤＭＳＯ（１００μＬ／ウェル）に溶解した。次いで、各ウェルの吸光度を測定した。ビンブラスチンを陽性対照（Ｈ２Ｏ中２０ｍｇ／ｍＬ）として使用した。すべての実験は２回行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（グラフパッド・ソフトウェア）、米国、カリフォルニア州）を使用して、最大半量阻害濃度（５０％阻害濃度、ＩＣ５０）値を計算した。
抗原提示細胞成熟研究。脾臓を物理的に破壊し、破壊した脾臓をステンレス鋼メッシュに通すことによって、単細胞脾臓懸濁液をナイーブスイスマウスから回収した。赤血球溶解緩衝液を使用して赤血球を溶解した。次いで、９６ウェルプレートに、１０％ウシ胎仔血清、５０ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したフェノールフリーＩＭＤＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地中の２×１０５細胞／ウェルを充填した。プレートの各ウェルについて、１０μＭの化合物２～５を添加し、プレートを３７℃で６時間インキュベートした。ウェルに接着した細胞をまず掻き取り、次いでＦｃ－ブロックを添加した。この後、プレートをインキュベーターに４℃で３０分間入れた。細胞を遠心分離し、ＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＭＨＣ－ＩＩ抗体を含有する緩衝液に４℃で３０分間再懸濁した。インキュベーション後、プレートを遠心分離し、再度洗浄した。次いで、この細胞を０．５ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．５％ＢＳＡ）に再懸濁した。ＣＤ１１Ｃ又はＦ４／８０細胞並びに活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０及びＭＨＣ－ＩＩについての蛍光陽性パーセンテージ及び平均蛍光強度の両方を使用して、樹状細胞又はマクロファージの成熟を特定した。
ワクチン接種及び細菌感染。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスは、一次免疫、並びに０日目、２１日目、２８日目及び３５日目に化合物２～５による３回の追加免疫を受けた。化合物２～５／ＰＢＳ溶液及び化合物１／ＣＦＡエマルションを、各免疫化の前に新たに調製した。化合物２～５をＰＢＳに直接溶解し、次いで２分間ボルテックスした。各群のマウス（１０匹のマウス／群）を、５０～１００μＬのＰＢＳ中の１５０μｇの化合物で尾の基部で皮下免疫した。
すべての免疫化マウス及び対照マウスに、一次免疫後６１日目に所定用量でＧＡＳ株Ｍ１を鼻腔内で抗原接種した。マウスをＧＡＳ細菌で抗原接種した後１～３日目に咽喉スワブを得た。２％脱線維化ウマ血液を含有するコロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）ベース寒天プレートをまず調製した。すべての咽頭スワブをこれらのプレート上に画線し、３７℃でインキュベートした。プレートを、後のＧＡＳコロニー形成の決定のために４℃の冷却室に保存した。抗原接種後１～３日目に、調製したコロンビア血液寒天（ＣＢＡ）プレートの表面に各マウスの鼻孔を１０回（３連のＣＢＡプレート／マウス／日）押し付けることによって鼻排泄物を決定し、吐き出した粒子を画線した。抗原接種後２日目及び３日目に、各群の５匹のマウスを犠牲にして、鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）及び脾臓試料を採取した。ＮＡＬＴ及び脾臓試料を最初にＰＢＳ中でホモジナイズし、次いで、細菌負荷を評価するために、２％脱線維化ウマ血液を含有するコロンビアベース寒天プレート上に連続希釈でプレーティングした。
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による抗体価の評価。各免疫化後に免疫化Ｃ５７ＢＬ／６マウスから採取したマウス血清／唾液中のＪ８特異的ＩｇＧ及びマウス唾液中のＪ８特異的ＩｇＡをＥＬＩＳＡにより測定した。ポリカーボネートプレートをＪ８ペプチド（ｐＨ９．６、炭酸塩コーティング緩衝液中０．５ｍｇ／ｍＬ）で１００μＬ／ウェル量でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液で５回洗浄した後、１５０μＬの５％脱脂乳ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０を添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄した。血清試料（２００μＬの１：１００希釈）又は唾液試料（１００μＬの１：２希釈）をプレートに加え、続いて０．５％脱脂乳ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液中でプレートを段階希釈した。次いで、すべてのプレートを３７℃のインキュベーター中で１．５時間インキュベートした。プレートを５回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１：３０００希釈ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（０．５％脱脂乳ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０中）又は５０μＬ／ウェルの１：１０００希釈ヤギ抗マウスＩｇＡ（０．５％脱脂乳ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０中）を添加し、プレートを３７℃で１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを再度洗浄し、１００μＬ／ウェルのＯＰＤ基質を添加した。プレートを暗所で室温にて３０分間インキュベートした後、染色したＪ８特異的ＩｇＧ又はＩｇＡのλ４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
殺菌性評価。免疫したマウスから採取した血清を用いてオプソニン化アッセイを実施して、殺菌効力を評価した。以下の臨床分離株を調べた：ＡＣＭ－２００２、ＡＣＭ－５１９９、ＡＣＭ－５２０３、ＧＣ２２０３、Ｄ３８４０、Ｄ２６１２。細菌をまず調製し、５％酵母エキス寒天プレートを補充したＴＨＢ上に画線した。次いで、プレートを３７℃のインキュベーターに２４時間置いた。この後、細菌から得られた１つの単一コロニーを５％酵母エキスを補充したＴＨＢ（５ｍＬ）に移し、次いでプレートを３７℃で２４時間インキュベートした。細菌が約４．６×１０６ｃｃ／ｍｌに複製すると、培養物をＰＢＳ中で１０－２に連続希釈し、アリコート（１０μＬ）を、免疫したマウスから一次免疫後４９日目に採取した熱不活化試験血清（１０μＬ）及びウマの血液（８０μＬ）と混合した。この不活化血清は、５０℃の水浴中で３０分間加熱することによって調製した。９６ウェルプレート中、３７℃で３時間、血清の存在下で細菌インキュベーションを行った。次いで、５％酵母エキス及び５％ウマ血液を補充したトッド・ヒューイット寒天プレート上に１０μＬの培養材料を播種した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。細菌生存率を、インキュベートしたトッド・ヒューイット寒天プレートから計数したコロニー形成単位（ＣＦＵ）に基づいて分析した。このアッセイは、３つの独立した培養物から３連で行った。
統計解析。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７ソフトウェアをすべての統計解析に使用した。ＡＰＣ成熟の結果について、平均蛍光強度を記録した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（登録商標） ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、米国、カリフォルニア州）を用いた統計解析中に、二元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの多重比較検定を適用し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。Ｊ８特異的ＩｇＧ又はＩｇＡの力価は、陰性対照ウェル（ＰＢＳで免疫したマウス由来の血清でコーティングしたウェル）の平均吸光度を上回る＞３ＳＤの吸光度を提供する最低希釈として記載した。一元配置ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキーの事後検定を抗体価統計解析に適用し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。抗体（抗ペプチド）血清のオプソニン活性（平均ＣＦＵの減少％）は、［１－（抗ペプチド血清の存在下でのＣＦＵ）／（ＰＢＳの存在下での平均ＣＦＵ）］×１００として計算した。二元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後検定をオプソニン化統計解析に適用し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。ＣＦＵの細菌感染抗原接種評価を記録し、二元配置ＡＮＯＶＡによって分析し、続いてテューキーの事後検定を適用し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
結果
ｐＨＡＡ－ペプチドコンジュゲートの合成。Ｂ細胞エピトープＪ８及びＴヘルパーＰＡＤＲＥを、標準的なＢｏｃ－ＳＰＰＳ法［１７］を使用して、スペーサ及びｐＨＡＡの結合のための分岐部分としてのリシンを用いて樹脂上にコンジュゲートさせて、ペプチド１を生成した（図１）。ペプチド１を１０単位のバリン、１０単位のフェニルアラニン、１０単位のロイシン、又は１５単位のロイシンで修飾して、それぞれ化合物２、３、４、５を得た。すべての化合物をそれらのＮ末端でアセチル化した。１５個のロイシンを有する化合物５は成功裏に生成されたが、水に溶解すると１．５ｍｇ／ｍＬを超える濃度で沈殿した。
ｐＨＡＡ－ペプチドナノ粒子の自己組織化及び特性評価。親水性ペプチドエピトープ１は、疎水性ｐＨＡＡ配列とコンジュゲートすると、両親媒性特性を有し、それゆえ自己組織化して粒子を形成することができるコンジュゲートを形成する。従って、化合物（２～５）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）及び透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって調べたところ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で自己組織化した。すべての化合物は、ＤＬＳ（表１及び図６）及びＴＥＭ（図２ａ～ｄ）によれば、小さいナノ粒子（１０～３０ｎｍ）と大きい凝集体との混合物に自己組織化し、高い多分散指数を有していた。ＴＥＭ像では、とりわけ化合物５（図示せず）について、明確なナノ粒子並びにナノ粒子の鎖状凝集体（ＣＬＡＮ）が明確に見える（図２ａ）。
Figure 2023510289000011
コンジュゲート２～５の細胞傷害性。本明細書で提案されるように、ワクチン送達系／アジュバントは、天然アミノ酸に完全に基づいて構築され、本発明者らは、ｐＨＡＡコンジュゲートのいかなる毒性も予想しなかった。実際に、すべての化合物は、３０μＭまでの濃度でＳＷ６２０（ヒト結腸癌）及びＨＥＫ２９３（ヒト胎児由来腎臓細胞株）に対して何らの細胞傷害性も示さなかった。
樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージを成熟させるコンジュゲートの能力。ＡＰＣ（マウス脾細胞由来のＣＤ１１ｃ＋ ＤＣ及びＦ４／８０＋マクロファージ）の成熟を、２～５による処置に続くインビトロでのＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ４０共刺激分子の発現の分析により決定した（図３）。すべてのコンジュゲートは、陰性対照と比較してＭＨＣ－ＩＩのより高い発現を誘導したが、化合物５のみが、ＤＣ及びマクロファージの両方においてＣＤ４０の有意により高い発現を誘導した（それぞれｐ＝０．０１１及び０．００２７）。
化合物２～５によって誘導される全身及び粘膜の免疫応答。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスは、尾の基部の皮下免疫、並びに０日目、２１日目、２８日目及び３５日目に化合物２～５による３回の追加免疫を受けた。すべての化合物は、最終免疫化後に有意なレベルのＪ８特異的ＩｇＧ力価を誘発した（図４ａ）。化合物５は、フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した１を含む他のすべての化合物よりも有意に強い応答を誘導した（ｐ＝０．０２１９）。
皮下免疫化時に粘膜免疫応答を誘導する化合物１～５の能力も調べた。コンジュゲート２及び５並びにＣＦＡで乳化したペプチド１は、マウスにおいてＪ８特異的ＩｇＡの産生を誘導することができた（図４ｂ）。ＩｇＡ力価は比較的低かったが、ＰＢＳで処置したマウスで観察されたものよりも有意に高かった。同様に、コンジュゲートによる免疫によって誘導された唾液のＩｇＧ力価（図４ｃ）は、陽性対照群（１／ＣＦＡ）のものよりも有意に高い（ｐ＜０．０００１）唾液ＩｇＧ産生を誘導する化合物５を除いて、非常に低かった（２）か、低かった（３、４）か、又は同程度であった（１／ＣＦＡ）。
産生された抗体の質を、種々のＧＡＳ臨床分離株に対するオプソニン化アッセイにおいて試験した（図４ｄ～ｉ）。ロイシンベースのｐＨＡＡ単位を有する化合物（４及び５）並びに１／ＣＦＡで免疫したマウスから採取した血清は、ＰＢＳで処置したマウス由来の血清と比較して、すべてのＧＡＳ株の高レベルのオプソニン化を誘導した。とりわけ、化合物５で免疫したマウスから採取した血清は、ほとんどの場合、１／ＣＦＡ（図４ｉ）を含む他の群（図４ｄ～ｉ）より有意に良好な細菌死滅能力を示した。化合物４は、５よりも効力が低かったとはいうものの、２及び３よりも良好なオプソニン応答を生成した。
Ｍ１ ＧＡＳ細菌による免疫後鼻腔内抗原接種。鼻腔内細菌接種後に、細菌のレベルを、鼻排泄物、咽喉スワブ、鼻腔関連リンパ組織（ＮＡＬＴ；ヒト扁桃腺に対するマウスの機能的ホモログ）［２４］及び脾臓において評価した（図５）。１日目、２日目及び３日目に１０匹のマウス群を用いて鼻排泄物及び咽喉スワブの両方を分析した。両方の粘膜領域において、化合物５は、ＧＡＳ細菌のクリアランスにおいて最も高い有効性を示し、ＧＡＳ細菌は、３日目にこのコンジュゲートで免疫したマウスにおいて実際には検出可能ではなかった（図５ａ、ｂ）。これらの器官の両方において、粘膜領域表面と同様に、５は、ＣＦＡアジュバント添加ペプチド１を含む任意の他の化合物よりも３日目に細菌負荷の最も強い低減を誘導した。
考察
アジュバントは、現代のワクチンにおいて重要な役割を果たす［１１］。いくつかの安全性の懸念にもかかわらず、多くの現在利用可能なアジュバントは完全には明確ではなく、脂質、多糖類、ポリマー及び様々な微生物成分の混合物を含む可能性がある。従って、保有する抗原に対する免疫応答の刺激を助けることができる化学的に明確な単一化合物は、既存のアジュバントよりも有益であろう。ナノ粒子は有望な自己アジュバント特性を有することが公知であるので［２５］、自己組織化する両親媒性物質がペプチドワクチン送達においてしばしば使用される［２６、２７］。本明細書において、本発明者らは、抗原へのコンジュゲーション時にナノ粒子の形成を刺激するｐＨＡＡを含むユニバーサルペプチドベースのプラットフォームを提案する。ｐＨＡＡ単位の特性（例えば、水溶性及び立体構造等）は、その長さ及びアミノ酸組成を変更することによって容易に改変することができる。本発明者らは、３種の疎水性アミノ酸（バリン、フェニルアラニン及びロイシン）を選択して、ペプチドエピトープにコンジュゲートした場合にそれらのポリマー配置がナノ粒子に自己組織化できるかどうかを調べた。ユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥにコンジュゲートしたＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８（１）をワクチン抗原として選択し、１０コピー又は１５コピーのＨＡＡで修飾した（図１）。上述の長さを有するｐＨＡＡは、水性条件下でコンジュゲートの凝集を誘導することが予想された。フェニルアラニン及びバリンの１５リピートを有する化合物は水溶性が低く、それゆえさらなる研究から除外した。１５個のロイシンを有する化合物は、１．５ｍｇ／ｍＬより高い濃度で沈殿したが、免疫学的評価には依然として実用的であった。このように、ペプチド抗原を送達するために使用することができるｐＨＡＡ配列の最大長は、本質的に化合物の水溶性によって制限された。他の化合物２～５は容易に水溶性であった。しかしながら、それらは、高度に疎水性のｐＨＡＡ単位及び親水性ペプチド抗原（１）の存在に起因して両親媒性特性を有するので、水性条件下で迅速に自己組織化した。化合物２～５はすべて、小さなナノ粒子及びナノ粒子の鎖状凝集体（ＣＬＡＮ）を形成した。同様の凝集体は無機ナノ粒子について以前に報告された［２８、２９］。すべての化合物の凝集能は、疎水性の性質に起因してＣＬＡＮを形成する傾向がより高い化合物５を除いて、ほぼ同様であった（図２ａ～ｄ、表１、図７）。興味深いことに、この同じ化合物は、最も異なる二次構造を採っていた。古典的な二重最小（ｄｏｕｂｌｅ－ｍｉｎｉｍｕｍ）αヘリックスＣＤスペクトルが５について観察されたが、そのより短い類似体４及びペプチド抗原１のスペクトルは、ランダムコイルに向かう螺旋曲線のシフトを示した（図２ｅ）。対照的に、化合物２及び３は、βシートを形成する傾向を示した。Ｊ８エピトープに対して誘導される抗体は、親螺旋Ｍタンパク質を認識する必要があり、従って、ワクチンの立体構造特性は、その抗菌効力において重要な役割を有する。実際、５による免疫化後、マウスによって生成された抗体は、インビトロでＧＡＳ臨床分離株をオプソニン化する最も強い能力を示した（図４）。同時に、βシートリッチの化合物２及び３は、ＧＡＳ細菌を死滅させることができなかった非防御抗体の産生を誘導するようであった。化合物５はまた、Ｍ１ ＧＡＳ抗原接種実験においてマウスを保護する優れた能力を示した（図５）。ＧＡＳ細菌のクリアランスは、４で免疫されたマウスでは観察されず、これは、オプソニン能力だけでなく、抗体の量が防御において重要な役割を果たすことを示唆した。化合物５は、他の化合物よりも有意に高いＪ８特異的な全身及び粘膜のＩｇＧ力価を誘導した。比較的低いＩｇＡ力価が、非粘膜免疫化後に観察され（予想通り）、それゆえ、ＩｇＡ産生のレベルは、候補のワクチン性能に影響を及ぼさなかった。ＡＰＣの抗原提示及び成熟は有効な体液性免疫の誘導に重要であるので、ＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ４０の発現を調べた。ＭＨＣ－ＩＩは、Ｔｈ細胞へのペプチド抗原提示、それゆえ適応免疫の誘導に必要とされるＡＰＣ受容体であり［３０］、ＣＤ４０発現レベルは、典型的にはマウスにおけるＤＣ成熟のマーカーとして使用される［３１］。予想通り、すべての化合物が両方のタンパク質の過剰発現を刺激した。しかしながら、ＣＤ４０の統計的に有意な過剰発現は、化合物５で処置したマウスにおいてのみ認められた。従って、化合物５は、調べたすべてのｐＨＡＡベースの免疫原の中で最も有望な特性を明らかに実証する。
化合物５によって誘発される免疫応答の質は、ポリロイシン単位の存在に起因する螺旋状立体構造をとる能力によって説明することができるのに対して、応答の大きさ（例えば、高い抗体価）は、エピトープの立体構造によって説明することができず、代わりに化合物のより高い疎水性から生じた。同じサイズ及び電荷の金ナノ粒子を調べたところ、より疎水性の基で修飾されたものは、より強い免疫系活性化を誘導した［３２］。重要なことに、ｐＨＨＡ単位中のアミノ酸の種類及び数を変更することによって、疎水性特性及び立体構造を容易に改変することができ、それゆえ、この系は、異なるエピトープに対して容易にカスタマイズすることができる。さらに、多くの他の自己組織化系と比較して、外部アジュバントは、強力な免疫応答を誘発するために必要とされなかった［３３］。
本明細書全体にわたって、その目的は、本発明を任意の１つの実施形態又は特徴の特定の集合に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することであった。本発明の広範な精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に説明及び図示される実施形態に種々の変更及び改変が行われてもよい。
本明細書で言及されるすべてのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許及び科学文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施例２
毎年５０万人が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染によって誘発される子宮頸癌と診断され、死亡は２０１８年のみで２５万人超に達する［１］。過去数十年間にわたって、特に発展途上国において、ＨＰＶの症例が上昇している。包括的な子宮頸部スクリーニングプログラムを使用する早期特定は、子宮頸癌の有病率を減少させているが、発展途上国における経済性は、これらのスクリーニングに必要な資源を提供するのに充分ではない。子宮頸癌に対して利用可能な現在の治療には、化学療法、放射線療法及び手術が含まれる。しかしながら、治療は、疾患における高い再発及び薬物耐性の発達に起因して、高い失敗率を有する。ＨＰＶ感染に対する予防的ワクチンが開発されている。このワクチンは、子宮頸癌の全体的な割合を減少させるはずである。しかしながら、これは、集団に影響を及ぼすのに２０年超かかる可能性が高い［２］。世界の大部分は既にＨＰＶに感染しているので、これらの人々が子宮頸癌を発症するリスクは依然として高い。それゆえ、ＨＰＶ感染細胞を標的とすることができる治療用ワクチンの開発は、子宮頸癌を治療するために重要である。
癌を治療するために設計されたワクチンは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を刺激して、特定の腫瘍抗原を有する異常細胞を排除する必要がある。抗原としてのＨＰＶ全体又はＨＰＶ癌タンパク質の使用は、発癌性変化をもたらす可能性があり、従って、ペプチドベースのワクチンの開発が示唆されている［３］。Ｅ７と呼ばれるＨＰＶ癌タンパク質は、ＨＰＶ感染細胞において見出され、ＨＰＶ関連腫瘍細胞増殖の維持に関与する。Ｅ７タンパク質、特にＣＤ８＋ペプチドに基づくワクチン候補の特定及び開発は、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することができ、細胞傷害性Ｔ細胞は次に腫瘍細胞を破壊することができる。８Ｑｍ（Ｅ７４４～５７、ＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号１４）は、マウスにおいて子宮頸癌に対して治療効果を有することが示されているＨＰＶ－１６ Ｅ７癌タンパク質に由来するエピトープである［４］。それはＣＤ４＋及びＣＤ８＋エピトープの両方を有する。しかしながら、単独では、８Ｑｍ等のペプチドは、それらの低い免疫原性及び低いインビボ安定性のため、免疫応答を刺激することができない。
送達系へのペプチドの組み込み又はアジュバントとの同時投与は、有効なワクチンを生成するために必要とされる。現在利用可能なアジュバントの使用に関連する典型的な問題としては、毒性、低い有効性、及びヒトへの使用に適したアジュバントの選択の制限が挙げられる［５、６］。それゆえ、治療用量で有害な毒性を伴わずに、自然免疫系、適応免疫系及び調節免疫系の細胞に対する強力な免疫調節活性を有する新規アジュバント（又は送達系）を開発することは、癌免疫療法の分野において、特に抗癌ワクチンを開発するために重要である。以前に、本発明者らは、８Ｑｍがポリアクリレートとコンジュゲートすると自己組織化して微粒子を形成することができることを実証した。単回免疫化の際の微粒子は、マウスからの若い腫瘍（３日）の根絶を誘発することができる［４、７、８］。しかしながら、ワクチン接種を腫瘍移植の７日後に遅らせた場合、追加（ブースト）免疫化を使用した場合でさえ、マウスの生存率は有意に低下した［９］。
リポソーム中の８Ｑｍ－ポリマーコンジュゲートの製剤は、腫瘍移植の２ヶ月後に５匹のマウスのうち３匹が腫瘍なしであり、腫瘍根絶効力を向上させた［１０］。これらの以前に報告されたポリアクリレート系は、しばしば生分解性ではなく、典型的には明確ではない立体化学を有し、各ポリマー中に可変数の単位を含有するため、商業的応用に関して深刻な制限に直面している。これは古典的なポリマーに典型的であるが、バッチ間のばらつきは、インビトロ及びインビボの結果に影響を及ぼし、それらを臨床試験に不適切なものにする。
ｐＨＡＡ系は依然としてポリマー系として分類されるが、ワクチン送達に使用される任意の他のポリマー系とは大きく異なる。モノマーとしての役割を果たす完全に定義されたポリマー系又は天然疎水性アミノ酸の適用は、古典的なポリマー系の送達系のすべての欠点を克服しうる。天然タンパク質の膜貫通ドメインはしばしばロイシンに富むので、本発明者らは、このような送達系においてポリロイシンを使用することにより、リポソーム膜へのコンジュゲートの固定が可能になりうると仮定する。
この実施例では、新しいｐＨＡＡを８Ｑｍペプチドに結合させ、二次送達系であるリポソーム中に固定した（図１４参照）。ｐＨＡＡ－８Ｑｍコンジュゲートと共にマンノース標的化部分もリポソームに組み込んで、ワクチン候補が、ｐＨＡＡペプチドのみを含有するリポソームと比較してより効率的に免疫細胞によって取り込まれるかどうかを判定した。実際、マンノシル化リポソームは、抗原提示細胞によって効率的に取り込まれ、成熟を誘導し、モデルＴＣ－１腫瘍に対して７日齢の腫瘍細胞を完全に根絶した。
材料及び方法
材料
本研究で使用したすべての化学物質は、特段の記載がない限り、分析グレードであった。保護されたＦｍｏｃアミノ酸及び［（１－ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム ３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）は、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（オーストラリア、メルボルン）から購入した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジエチルエーテル、ピペリジン及びトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペリジン、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル及びメタノールは、Ｍｅｒｃｋ（ドイツ、ダルムシュタット）から購入した。トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、無水酢酸、低分子量キトサン（５０～１９０ＫＤａ）、アルギン酸ナトリウム（低粘度）、赤血球溶解緩衝液、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、ピロカルピン、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、フェニルメチル－スルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ及びＩｇＡは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国、セントルイス）から購入した。ＩＣ固定緩衝液及びフェノールを含まないＩＭＤＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ培地は、Ｇｉｂｃｏ（登録商標） Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ライフ・テクノロジーズ）（米国、カリフォルニア州）から得た。ウシ血清アルブミン、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２、ＰＥ／ＣＹ７－ＣＤ１１Ｃ、ＢＶ６０５－Ｆ４／８０、ＦＩＴＣ－ＣＤ４０、ＰＥ－ＣＤ８０及びＡＰＣ－ＣＤ８６は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国、カリフォルニア州）から得た。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール及び臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、Ａｖａｎｔｉミニ押出機、ＰＣ膜及びフィルタ支持体は、Ａｖａｎｔｉｓ ｐｏｌａｒ，Ｉｎｃ．（アバンティ・ポーラ）（Ａｕｓｐｅｐ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．（オースペップ株式会社、オーストラリア、ビクトリア州）から購入した。他のすべての試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、キャッスルヒル（Ｃａｓｔｌｅ Ｈｉｌｌ））から購入した。ＣｕワイヤはＡｌｄｒｉｃｈ（アルドリッチ）（ドイツ、シュタインハイム（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ））から購入した。すべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、キャッスルヒル）から入手可能な最高純度で得た。Ｌｅｕ１０－Ｊ８ペプチドは、この実施例の他の箇所に記載されるように合成した。ＥＳＩ－ＭＳは、Ａｎａｌｙｓｔ １．４ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ、カナダ、トロント）を備えたＰｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ－Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３０００装置を用いて行った。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣは、島津製作所（日本、京都）の装置（ＤＧＵ－２０Ａ５、ＬＣ－２０ＡＢ、ＳＩＬ－２０ＡＣＨＴ、ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰ）を１Ｌ ｍｉｎ－１流量で使用して行い、２１４ｎｍ及び／又は蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）で検出した。分離は、溶媒Ａとして０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ及び溶媒Ｂとして９０％ＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏを用いる４０分間にわたる溶媒Ｂの０～１００％直線勾配を使用して、Ｖｙｄａｃ分析用Ｃ４カラム（２１４ＴＰ５４；５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）又はＶｙｄａｃ分析用Ｃ１８カラム（２１８ＴＰ５４；５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）のいずれかで達成した。分取ＲＰ－ＨＰＬＣは、島津製作所（日本、京都）の装置（ＬＣ－２０ＡＴ、ＳＩＬ－１０Ａ、ＣＢＭ－２０Ａ、ＳＰＤ－２０ＡＶ、ＦＲＣ－１０Ａ又はＬＣ－２０ＡＰ×２、ＣＢＭ－２０Ａ、ＳＰＤ－２０Ａ、ＦＲＣ－１０Ａのいずれか）で、直線勾配モードで、５～２０ｍＬ／分の流量を使用して行い、２３０ｎｍで検出した。分離は、溶媒Ａ及び溶媒Ｂを用いて、Ｖｙｄａｃ分取Ｃ１８カラム（２１８ＴＰ１０２２；１０μｍ、２２ｍｍ×２５０ｍｍ）、Ｖｙｄａｃ半分取Ｃ１８カラム（２１８ＴＰ５１０；５μｍ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ）又はＶｙｄａｃ半分取Ｃ４カラム（２１４ＴＰ５１０；５μｍ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ）で行った。粒子サイズ分布及び平均粒子サイズの測定は、動的光散乱（ＤＬＳ）（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国、イングランド）を使用して分析した。多重測定を行い、平均粒子サイズを表わした。
ペプチドの合成
Ｄ－８Ｑｍ及び８Ｑｍは、以前に報告されたように［１０］合成した。
Ｌｅｕ－８Ｑｍの合成
Ｌｅｕ－８Ｑｍを、ＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡ Ｆｍｏｃ化学を使用して、ｒｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（置換比：０．５２ｍｍｏｌ／ｇ、０．１ｍｍｏｌスケール、０．１９２ｇ）上で手動による段階的ＳＰＰＳにより合成した。生成物を、３０分間にわたる５０～８０％溶媒Ｂ勾配を用いるＲＰ－ＨＰＬＣ Ｃ－４カラムで精製した。ｔＲ＝３２分、純度＞９５％。収率：３２％。ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ １４１７．７（計算値１４１７．２４）［Ｍ＋２Ｈ］２＋；９４５．７（計算値９４５．１６）［Ｍ＋３Ｈ］３＋；ＭＷ＝２８３２．４８。
ＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－アルキン（４）の合成
ＤＯＰＥ（１、１１．４ｍｇ、４５６μＬ、クロロホルム中２５ｍｇ／ｍＬストック、１５μｍｏｌ、１当量）及びトリエチルアミン（１１．６ｍｇ、１６μＬ、１１４μｍｏｌ、７．６当量）の混合物を、無水クロロホルム（３ｍＬ）中のＮＰＣ－ＰＥＧ３．４Ｋ－ＮＰＣ（２、２５０ｍｇ、７３．５μｍｏｌ、４．９当量）の溶液に滴下した。この混合物を窒素雰囲気下、室温で１４時間撹拌した。次いで、プロパルギルアミン（４７μＬ、４０．４ｍｇ、７３５μｍｏｌ、４９当量）及びトリエチルアミン（３０７μＬ、２２３ｍｇ、２．２０５ｍｍｏｌ、１４７当量）の混合物を反応混合物に添加し、窒素雰囲気下、室温でさらに１４時間撹拌した。反応混合物を真空中で蒸発させ、残渣を窒素ガスでフラッシュし、凍結乾燥機で一晩乾燥させた。残渣を水（１ｍＬ）に溶解し、ボルテックスし、次いでサイズ排除セファロースカラムクロマトグラフィーＣＬ－４Ｂによって精製した（５０ｃｍカラム、２ｍＬ／画分を脱気ＭｉｌｌｉＱ水で溶出し、画分をクロロホルム中３０％メタノールのＴＬＣで検出し、ドラーゲンドルフ（Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆｆ）染色で検出した）。凍結乾燥後、生成物ＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－アルキン（４）を褐色固体として得た（５６ｍｇ、８７％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ ６．７０（ｓ，１Ｈ），５．３７（ｓ，１Ｈ），５．３５－５．２６（ｍ，３Ｈ），５．１８（ｓ，１Ｈ），４．３９－４．３０（ｍ，１Ｈ），４．２６－４．１６（ｍ，２Ｈ），４．１６－４．１０（ｍ，１Ｈ），３．９６－３．９１（ｍ，２Ｈ），３．７７－３．７３（ｍ，１Ｈ），３．７３－３．５３（ｍ，１５２Ｈ），３．５０－３．４４（ｍ，１Ｈ），３．３４（ｓ，１Ｈ），２．３１－２．２３（ｍ，６Ｈ），２．２２（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），１．９７（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，６Ｈ），１．６１－１．５１（ｍ，３Ｈ），１．３３－１．１８（ｍ，４０Ｈ），０．８５（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δ １７３．４，１３０．０，１２９．７，７９．８，７１．４，７０．８，７０．５，６９．９，６９．４，６４．３，３４．２，３４．０，３１．９，３０．７，２９．７２，２９．７０，２９．５，２９．３，２９．２４，２９．２１，２９．１３，２９．１０，２９．０８，２７．１８，２７．１６，２４．８７，２４．８２，２２．６，１４．１。生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析により検出した（ｍ／ｚ＝約４１００）。
１－アジド－３，６－ジオキサオクタ－８－イル ２，３，４，６－テトラ－Ｏ－アセチル α－Ｄ－マンノピラノシド（８）の合成
この分子をプロトコル［１１］に従って合成した。乾燥丸底フラスコ（２５ｍＬ）中で、窒素雰囲気下、０℃で、マンノースペンタアセテート（５、６５４ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、１当量）及び２－［２－（２－クロロエトキシ）エトキシ］エタノール（６、４８７μＬ、５６５ｍｇ、３．３５ｍｍｏｌ、２当量）の無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（６２１μＬ、７１４ｍｇ、５．０３ｍｍｏｌ、３当量）を滴下した。反応混合物を５０℃に加熱し、２２時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ×２）、ブライン（１００ｍＬ×２）で洗浄し、無水Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥し、次いで濃縮して、クロロ誘導体７の褐色の粗油状物を得た。ＴＬＣ Ｒｆ：０．４３（１：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、モリブデンブルーで染色した）。この化合物を自動フラッシュカラムクロマトグラフィー（１２Ｇシリカ；３６ｍＬ／分；５０分にわたって０～５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製した。生成物７を高粘性の淡黄色の油状物として得た（５４０ｍｇ、６５％）。
次いで、単離した生成物７（４２５ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１当量）を無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、これにアジ化ナトリウム（２６７ｍｇ、４．２５ｍｍｏｌ、５当量）及びヨウ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＩ）（３１４ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ、１当量）の混合物を添加し、次いで窒素雰囲気下、８７℃で１７時間撹拌した。溶媒を除去し、残渣を自動フラッシュカラムクロマトグラフィー（１２Ｇシリカ；３６ｍＬ／分；５０分にわたって０～５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して、アジド化合物８（３５７ｍｇ、８３％）を無色油状物として得た；Ｒｆ：０．４１（１：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）は、Ｇｕｏ［１１］によって報告されたものと一致している。
１－アジド－３，６－ジオキサオクタ－８－イル α－Ｄ－マンノピラノシド（９）の合成
ナトリウム金属（触媒量）を、無水ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中のアセチル化マンノース－アジド８（３５７ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。窒素雰囲気下、室温で３時間撹拌した後、反応混合物をＭｅＯＨで希釈し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標） ＩＲ－１２０Ｈイオン交換樹脂で中和し、濾過し、次いで濃縮し、凍結乾燥して、生成物９（１７０ｍｇ、７１％）を無色油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）は、Ｇｕｏ［１１］によって報告されたものと一致している。
ＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノース（１０）の合成
マンノース－アジド－トリエチレングリコール９（８．３ｍｇ、２５μｍｏｌ）及びＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－アルキン４（５ｍｇ、１．２μｍｏｌ、１当量）の混合物をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、銅ワイヤ（４２ｍｇ）を加えた。反応混合物中の空気を、３０秒間の窒素バブリングによって除去した。反応混合物を覆い、アルミニウム箔で光から保護し、窒素雰囲気下、５０℃で３時間撹拌した。ＴＬＣ Ｒｆ：０．２（２０％ＭｅＯＨ及びＣＨＣｌ３、ＵＶによって可視化し、モリブデンブルーで染色した）。ワイヤを温かい溶液から濾別し、１ｍＬのＤＭＦで洗浄した。このＤＭＦ溶液を４ｍＬの水にゆっくりと添加した（０．００５ｍＬ／分）。ミセルが自己組織化プロセスによって生成し、これを水（１Ｌ）に対して２ＫＤａ透析バッグ中で１４時間透析した。凍結乾燥後、純粋なＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノース（１０）を非晶質白色粉末として得た（２ｍｇ、３７％）。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ） δ ７．７７（１Ｈ，ｄ，Ｊ １０Ｈｚ），６．９４－６．８２（２Ｈ，ｍ），５．３２（２Ｈ，ｂｒＳ），５．１８－５．１４（１Ｈ，ｍ），４．８７－４．７１（３Ｈ，ｍ），４．５１－４．３５（３Ｈ，ｍ），４．２５－４．２０（２Ｈ，ｍ），４．１４－４．０９（１Ｈ，ｍ），４．０５（１Ｈ，ｓ），３．９５－３．９２（２Ｈ，ｍ），３．８６－３．８４（２Ｈ，ｍ），３．８０－３．５０（９４Ｈ，ｂｒＳ），３．４９－３．４６（１Ｈ，ｍ），３．３６－３．３０（１Ｈ，ｍ），２．５０－２．４５（４Ｈ，ｍ），２．３２－２．２４（８Ｈ，ｍ），２．０２－１．９８（４Ｈ，ｍ），１．２６－１．２３（２８Ｈ，ｄ），０．８６－０．８４（６Ｈ，ｔ，Ｊ ７．５Ｈｚ）。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（ｍ／ｚ＝約４５５０）。
抗原負荷ナノリポソーム製剤
リポソームは、均一なサイズの粒子を形成するために、脂質水和法、続いて押出又は超音波処理を用いて製剤化した。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）及びコレステロールを、それぞれ５：２：１の重量比で、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬの最終濃度までクロロホルムに溶解した。すべての成分を、１ｍｇ／１ｍＬのＤ－８Ｑｍ又はＬｅｕ－８Ｑｍ又はＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノース及びメタノールに溶解した凍結乾燥抗原と共に丸底フラスコ中で混合した。有機溶媒を、ロータリーエバポレーターを用いてゆっくりと蒸発させ、一晩凍結乾燥させて溶媒除去を完了させた。リポソームフィルムを９００μＬのＭｉｌｌｉｐｏｒｅエンドトキシンフリー水で再水和した。次いで、Ｌ１をマイクロソニケートプローブ（４０％の出力、２０秒のパルサーを２分間）で４回超音波処理して、均質なリポソームを得た。Ｌ２及びＬ２Ｍを、２００ｎｍの孔径のポリカーボネート膜を通して押し出した。Ｌｅｕ－８Ｑｍペプチドもナノ粒子に自己組織化した。注射前に、１００μＬの１０×ＰＢＳをこの製剤に添加して、１ｍｇ／ｍＬの濃度を生成した。
ナノリポソームの特性評価
ワクチン候補の粒子サイズ、ゼータ電位及び多分散性を、ゼータサイザー（Ｎａｎｏ ＺＸ、Ｍａｒｖｅｒｎ（マルバーン）、イングランド）を用いて動的光散乱（ＤＬＳ）により測定した。ワクチン候補の粒子形態を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（ＨＴ７７００ Ｅｘａｌｅｎｓ、日立製作所、日本）を用いて真空乾燥後に調べた。簡潔には、試料を純粋な蒸留水で希釈し（１：１００）、グロー放電炭素被覆銅グリッド上に直接滴下し、次いで２％酢酸ウラニルで染色した。この試料を２００．０ｋＸの倍率で観察した。
マウス及び細胞株ＴＣ－１
ＴＣ－１細胞（ＨＰＶ－１６ Ｅ６／Ｅ７及びｒａｓ癌遺伝子で形質転換したマウスＣ５７ＢＬ／６肺上皮細胞）はＴＣ Ｗｕから入手した。ＴＣ－１細胞を培養し、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃／５％ＣＯ２で維持した。雌Ｃ５７ＢＬ／６（６～８週齢）マウスをこの研究に使用し、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ（西オーストラリア州、パース（Ｐｅｒｔｈ））から購入した。動物実験は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＨＭＲＣ） ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａのガイドラインに従って、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（クイーンズランド大学動物実験委員会）によって承認された（ＵＱＤＩ／ＴＲＩ／３５１／１５）。
インビボ腫瘍処置実験
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８匹／群）に、２×１０５／マウスのＴＣ－１腫瘍細胞、１×１０５／マウスのＴＣ－１腫瘍細胞を両側腹部に皮下抗原接種した。７日後、マウスの側腹部にワクチン候補を注射した。各マウスに、１００μｇのペプチド、又は１００μｇの抗原を含有するリポソーム製剤を投与した。Ｌ２Ｍワクチン接種マウスに、１００μｇのＬｅｕ－８Ｑｍ抗原を２μｇのＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノース標的化リガンドと共に投与した。Ｌ１を陽性対照として使用した。陰性対照群には１００μＬのＰＢＳを投与した。マウスはワクチンの単回投与を受けた。腫瘍のサイズを２日毎に触診及びキャリパーによって測定し、５匹のマウスの群にわたる平均腫瘍サイズとして、又は個々のマウスにおける腫瘍サイズとして報告した。式Ｖ（ｃｍ３）＝３．１４×［最大直径×（直交方向の直径）２］／６を用いて腫瘍体積を計算した。腫瘍が１ｃｍ３に達したとき、又は不必要な苦痛を回避するために出血を開始したときにマウスを安楽死させた。Ｃ５７／ＢＬ６マウスの別の新しいセット（６匹／群）を、上記のように抗原を用いて免疫化した。
ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＥＬＩＳＰＯＴプレートをＰＢＳ中の５μｇ ｍＬ－１ ＩＦＮ－ｇ捕捉抗体（クローン）で４℃で一晩コーティングした。次いで、プレートを室温で３時間、ＲＰＭ／２０％ＦＣでブロッキングした。Ｃ５７／ＢＬ／６マウス由来の脾細胞を、ナイーブマウス及び免疫化マウスの脾臓から回収した。赤血球溶解緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中の０．１５５Ｍ塩化アンモニウム、Ｓｉｇｍａ（シグマ））を用いて赤血球を枯渇させた。次いで、２０％ＦＡＣ（１００ＵｍＬ－１ペニシリン及び１００μｇ ｍＬ－１ストレプトマイシン及び５０μＭ ｂ－メルカプトエタノール）を補充したＲＰＭＩ（ｓｉｇｍａ）に脾細胞を再懸濁した。細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートに１ウェルあたり５×１０５細胞で三連でプレーティングした。Ｅ７ペプチド（１０μｇ ｍＬ－１）を１０ｎｇ ｍＬ－１ ｒｈＩＬ－２と共に１ウェルあたり２００μＬの最終体積まで添加した。プレートを３７℃で８時間インキュベートし、洗浄し、１％ＢＳＡ中のビオチン化ＩＦＮ－ｇ検出抗体を室温で添加し、プレートを再度洗浄し、結合したサイトカインを３－アミノ－９エチルカルバゾールで可視化した。スポットをＥＬＩＳＰＯＴリーダーで計数した。
統計解析
すべてのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを用いて解析した。腫瘍処置実験についてのカプラン・マイヤー生存曲線を適用した。生存処置の差を、ログランク（マンテル・コックス（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ））検定を用いて決定し、ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。ＥＬＩＳＰＯＴ統計解析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定を用いて行った（ｎｓ、ｐ＞０．０５；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。
結果
合成及び特性評価
Ｌｅｕ１０－８Ｑｍペプチドを、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ化学を用いて高純度（＜９５％）に合成した。ポリアクリレートＤ８を、銅触媒アルキン－アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応を使用して８Ｑｍにコンジュゲートさせ、以前に報告されたような溶媒置換法［４、１０］によって粒子に自己組織化させた。透析を水中で３日間行って、残留ペプチド、銅及び有機溶媒を除去した。このコンジュゲートはポリアクリレート単独と比較してより高い窒素／炭素比を含有したので、元素分析を使用して生成物の形成を確認した。理論的及び観察された（Ｎ／Ｃ）比を使用して、ペプチドエピトープによるポリマーコアの正確な置換を計算した。Ｄ－８Ｑｍについて観察された窒素対炭素比（Ｎ／Ｃ＝０．０７）は、ポリマー単独（Ｎ／Ｃ＝０．０１７）よりも高い。ＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋマンノースは成功裏に合成された。ワンポット反応において、アルキン誘導体４を２工程で合成した（スキーム１）。トリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で、大過剰のニトロフェニルカルボニル－ＰＥＧ３．４Ｋ－ニトロフェニルカルボニル（ＮＰＣ－ＰＥＧ３．４Ｋ－ＮＰＣ、２）をＤＯＰＥ（１）で処理して、モノＮＰＣ誘導体３を生成した。反応混合物を過剰のプロパルギルアミンとＴＥＡとの混合物で処理することにより、すべてのＮＰＣ基をプロパルギル部分で置換し、副生成物としてのプロパルギル－ＰＥＧ３．４Ｋ－プロパルギルと共に化合物４を得た。クロロホルム中３０％メタノールを使用し、生成物をドラーゲンドルフ染色により検出するＴＬＣにより反応をモニターした。生成物４は、２のジプロパルギル誘導体ではなく４のミセルを形成する能力に起因して、サイズ排除セファロースカラムクロマトグラフィー（ＣＬ－４Ｂ）によって２の過剰のジプロパルギル誘導体から分離した。純粋な生成物４を褐色固体として優れた収率（８７％）で回収し、ＮＭＲ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって特性評価した（ｍ／ｚ＝約４１００）。
マンノース－アジド－トリエチレングリコール９を、Ｇｕｏら、（スキーム１）に従って３工程で合成した。簡潔に言えば、アセチル化マンノース５を、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラートの存在下で２－［２－（２－クロロエトキシ）エトキシ］エタノール６で処理して、クロロ誘導体７を６５％で生成した。７をアジ化ナトリウムと共に加熱すると、アジド誘導体８が収率８３％で得られた。メタノール中のナトリウム金属を使用してアセチル基の除去を行い、続いてＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標） ＩＲ－１２０Ｈイオン交換を使用して中和して、生成物９を収率７１％で得た。
９とＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－アルキン（４）とのコンジュゲーションにより、ＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノース（１０）が得られ（スキーム１）、このＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノース（１０）を本発明者らの送達系においてマンノース受容体標的化リガンドとして使用して、ワクチン送達効率の標的化及び取り込みを改善した。生成物１０（ｍ／ｚ＝約４５００）をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析（ｍ／ｚ＝約４５００）によって特性評価した。
薄膜脂質製剤中に、Ｄ－８Ｑｍ、Ｌｅｕ－８Ｑｍ及びＤＯＰＥ－ＰＥＧ３．４Ｋ－マンノースをリポソーム二重層に組み込んだ。脂質薄膜を、以前に報告されたように水和し、超音波処理し（Ｌ１）、又は２００ｎｍの孔の膜で押し出して（Ｌ２、Ｌ２Ｍ）、均一なサイズのナノ粒子を形成した。Ｌｅｕ－８Ｑｍも、親水性ペプチド及びｐＨＡＡ特性のため、水の存在下で自己組織化して、比較のためにリポソーム内容物を含まない粒子を生成した。
候補のサイズ、表面電荷及び形態を、動的光散乱（ＤＬＳ）（表１ａ）及びＴＥＭ（図１６）を使用して分析した。Ｌ１は、超音波処理後に、低いＰＤＩ（０．１５）及び＋６０ｍＶの電荷を有する１２０ｎｍのサイズの粒子を形成した。Ｌ２及びＬ２Ｍは、それぞれ０．３及び０．２３のＰＤＩを有する、同様のサイズの１４０ｎｍ及び２００ｎｍの粒子を形成した。両方とも、＋４７ｍＶの類似の表面電荷を有していた。Ｌｅｕ－８Ｑｍペプチド単独は、高いＰＤＩ０．６及び－１０ｍＶの負電荷を有する大きい粒子又は凝集体を形成した。ＴＥＭは、ＤＬＳによって観察されたのと同様に、溶液中でサイズが均一である典型的なリポソーム球状構造を示した。
Figure 2023510289000012
インビボ
確立されたＨＰＶ腫瘍に対するコンジュゲートの治療効果を、８週齢の雌Ｃ５７／ＢＬ６マウスのマウスモデルにおいて評価した。平均腫瘍増殖は速く、２１日目にＰＢＳで処置したマウスの生存率はわずか２５％であった。腫瘍増殖速度は、１０個のロイシンアミノ酸及びリポソーム成分を含有するｐＨＡＡ送達系で免疫したマウスにおいて有意に低かった。Ｌｅｕ－８Ｑｍは、単独では、５７日目に１ｃｍ３を超えるすべてのマウスで腫瘍細胞を破壊するのに充分ではなかったが、リポソームＬ２に固定した場合、すべてのマウスは６４日間生存した。Ｌ２も、既存の腫瘍の収縮を誘発したが、２匹のマウスは、３４日目及び５６日目に腫瘍細胞の再増殖を開始した。さらに、Ｌ２Ｍは、既存の腫瘍の有意な縮小を誘発し、視覚的腫瘍増殖を引き起こさなかった。６４日後、マウスは後退せず、全期間にわたって腫瘍細胞再増殖を示さなかった。Ｌ２及びＬ２Ｍで免疫したマウスは、Ｌｅｕ－８Ｑｍ、陽性Ｌ１及び陰性対照ＰＢＳよりも有意に高いＩＦＮレベルをもたらした（図１７）。
考察
ナノ粒子は有望な自己アジュバント特性を有することが示されているので、ナノ粒子に自己組織化する両親媒性物質は、ペプチドワクチン送達においてしばしば使用される。リポソームは通常、病原体の特性を模倣するナノ粒子として製剤化され、細胞媒介性免疫応答を誘導する能力を有する。リポソームは、水の存在下で粒子に自己組織化することができる天然脂質からなる。この自己組織化プロセスの間、他の疎水性部分は、ナノ粒子の疎水性成分中にそれら自体を埋め込むことができ、リポソームの表面上に親水性ペプチドを提示する。ここで、本発明者らは、新しい完全に天然のペプチド送達系の、マウスにおいて７日齢の癌を治療する能力を調べる。
本発明者らは、完全に天然のペプチドベースのコンジュゲートを設計及び合成し、それらをリポソームに封入した。ＨＰＶ－１６ Ｅ７タンパク質に由来する８Ｑｍエピトープは、単一配列中にＣＴＬエピトープ（ＣＤ８＋ ＣＴＬ）及びＴヘルパー（ＣＤ４＋）エピトープを含有する。このペプチドは、腫瘍細胞に対する免疫応答の刺激における抗原として有望であることが示されている。Ｄ－８Ｑｍは、マウスにおける腫瘍根絶において限定的な成功を示した［４、７、８］。リポソームＬ１へのＤ－８Ｑｍの組み込みは、７日齢の腫瘍の治療のための抗癌ワクチンとしての効率的な自己アジュバント送達系であった［１０］。以前、Ｌ１は、マウスの生存を、比較される０％から８０％のマウス生存へと有意に増加させ、６０％のマウスは、腫瘍移植の６０日後に無腫瘍であった。８Ｑｍと混合した通常使用される強力なアジュバント不完全フロイントアジュバントは、Ｌ１よりも有意に低い生存率を有し、従って、この研究において陽性対照として使用した。しかしながら、今回の研究では、Ｌ１は、同様のサイズ（１２０ｎｍ）及びＰＤＩ（０．１５）を有するが以前に報告されたもの［１０］よりもはるかに高い電荷（＋５６．６ｍＶ）を有するナノ粒子を形成した。ペプチドエピトープに対するポリマーコアの置換率を計算し、ポリアクリレート上の８つのアームのうち４つだけが８Ｑｍのペプチドで置換されたことを示した。ポリマーコアへのＤ－８Ｑｍのより低い置換率は、Ｌ１中の負に荷電した８Ｑｍペプチドの数を減少させ、従って、以前の研究と比較して表面電荷を増加させることが示唆される。Ｌ１で免疫したマウスは、６２日以内に１ｃｍ３を超える腫瘍を示した。従って、Ｌ１のより高い電荷及びより低い有効性は、ポリマーに対するペプチドの置換率の減少に起因している可能性がある。ポリマー単位は各合成間でばらつきがあるため、非生分解性ポリマーを用いた作業は、実験データの反復にとって困難である可能性がある。実験間の腫瘍増殖の不整合及びＴＣ－１腫瘍に対するＣ５７／ＢＬ６マウスの感受性のばらつきも、腫瘍増殖に影響を与えた可能性がある。
従って、天然のペプチドベースの送達系の開発は、古典的なポリマーベースの送達系のすべての欠点を克服する可能性がある。Ｄ－８Ｑｍ及びＬ１によって示される同時のデータ、リポソームへのペプチドの包含は、有意な腫瘍根絶に必須であった。Ｌｅｕ－８Ｑｍは、単独で、腫瘍感染マウスの生存率を増加させたが、すべてのマウスは５７日目までに癌に敗北した。Ｌｅｕ－８Ｑｍのリポソーム（Ｌ２）への固定は、腫瘍を縮小させ、マウスの生存を延長させた。すべてのマウスは６４日生存したが、マウスの２５％が３４日目及び５６日目以降に腫瘍細胞を再増殖し始めた。マンノース標的化部分（Ｌ２Ｍ）の組み込みは、Ｌ２の性能を改善し、既存の腫瘍の有意な縮小を誘発し、目に見える腫瘍増殖を引き起こさなかった。
従って、ｐＨＡＡ系のリポソーム製剤は、マンノース標的化部分とともに、ＨＰＶ関連癌に対するワクチン候補の治療特性を改善するのに重要であった。さらに、本発明者らは、ＥＬＩＳＰＯＴによって、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｅ７ペプチド再刺激に応答した免疫マウス由来のＣＤ８＋ Ｔ細胞によるリコールＩＦＮ－γ産生を調べた。Ｌｅｕ－８Ｑｍ免疫マウスは、ペプチド単独、リポソーム送達系又はさらなるマンノース標的化受容体を用いたかにかかわらず、ＩＦＮレベルを有意に産生した。
本明細書において、リポソームに固定された、完全に明確な天然のアミノ酸ベースのペプチドエピトープは、マウスモデルにおいて腫瘍増殖を減少させるために使用することができることが実証された。標的化マンノース受容体を組み込んだ製剤は、腫瘍接種の７日後に投与した場合、マウスから癌を根絶することができた。重要なことに、ＨＰＶに対するこの多成分系ペプチドベースのワクチン候補は、追加のアジュバントを使用することなく、単回用量免疫において腫瘍細胞を効果的に破壊することができた。
実施例３
ペプチドベースのワクチンは、古典的な全病原体ベースのワクチンの制限、例えばアレルギー応答及び自己免疫応答並びに必須の生物学的物質の産生における困難、を克服する可能性を有する［１］。ペプチドワクチンは、免疫応答を誘導することができる特定の標的病原体に由来する短い、明確な合成エピトープからなる。これらは、大規模に容易に合成及び精製することができる。しかしながら、これらの小ペプチドは、単独では、インビボで安定ではなく、免疫原性が低く、免疫系による認識に必要とされる危険シグナルを欠いている。従って、小ペプチドは、リポソーム又はポリマー等の保護送達／アジュバント系に組み込まれる必要がある［２～４］。
現在、ほとんどの市販のワクチンは、侵襲的かつ不便な技術によって投与されており、これは、とりわけ、無視される熱帯疾患が優勢である遠隔地において、低い患者コンプライアンスをもたらしうる。経口送達は、投与の容易さ、簡素化された生産及び貯蔵、並びに胃腸管（ＧＩＴ）病原体に対する改善された有効性等の、他のより侵襲的な送達方法に勝る多くの利点を有することが示されている［５、６］。しかしながら、経口ワクチンは、細菌、酵素、及び低ｐＨから構成されるＧＩＴに曝露され、これら細菌、酵素、及び低ｐＨはすべてワクチンペプチドを分解することができる。成功するワクチンは、上皮層を通過し、感知免疫細胞に曝露される必要もある。最後に、抗原の経口送達は、通常、複数回投与を必要とし、これは、経口寛容を誘導し、コンプライアンスを低下させる可能性がある。それゆえ、とりわけ不安定なペプチドのための、抗原の経口送達のための特別な送達系が必要とされる。
ネカトール・アメリカヌスは、ヒトの鉤虫の中で最も優勢であり、４億超の人々に感染している。腸内寄生生物は、小腸の粘膜に、その歯又は歯板を介して付着し、ヒト粘膜組織及び血液を常食とする。これは、長期の病理学的結果、例えば、慢性的に感染した乳児における神経学的機能及び認知機能の障害等の重篤な衰弱性状態をもたらす鉄欠乏性貧血を引き起こす可能性がある。世界的に、鉤虫感染症は、最も一般的な熱帯性疾患の１つであり、障害調整生存年（ＤＡＬＹ）の観点から、デング熱、住血吸虫症及びハンセン病よりも重要視されている［７］。流行地域における鉤虫の防除は、アルベンダゾール等の駆虫薬の学童期の小児への大量投与に依存する。化学療法は概して有効であるが、薬物有効性の低下、連続的な再感染及び鉤虫の広範な分布は、ワクチン接種等の、感染を制御するための代替戦略の必要性を促している［７］。興味深いことに、鉤虫感染への生涯にわたる曝露は強固な防御免疫を刺激せず、しばしば高齢者は最も重い虫負荷を有する［８］。Ｎａ－ＡＰＲ－１、この虫が栄養素として使用するヒトヘモグロビンの分解に関与するカテプシンＤ様アスパラギン酸プロテアーゼ、に基づいて有望な抗鉤虫ワクチンペプチドが報告されている。スケールアップ生産及びタンパク質凝集に関する問題［９］は、親Ｎａ－ＡＰＲ－１タンパク質のタンパク質分解活性を中和するモノクローナル抗体の標的である、Ａ２９１Ｙと呼ばれるＮａ－ＡＰＲ－１由来の合成可能なペプチドの発見を促した［１０］。最近、本発明者らは、ｐ３と呼ばれるＡ２９１Ｙに由来する２２量体ペプチドが、脂質化されるか又はアジュバントと混合されると、皮下免疫化の際にＮａ－ＡＰＲ－１タンパク質分解中和抗体の産生を刺激することを実証した［１１、１２］。
疎水性アミノ酸（ＨＡＡ）から構築された完全に明確な分解性天然ポリマーの使用は、自己アジュバント送達系として利用することができる。ポリ－ＨＡＡ（ｐＨＡＡ）の合成は、古典的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法を使用し、これは、単一の手順で１つの分子へペプチドエピトープを組み込むことを可能にする。この系の重要な利点は、改善された生分解性及び生体適合性、並びに組み込まれるＨＡＡの種類及び数を変更することによって必要とされるｐＨＡＡ単位の特性（溶解性、立体構造等）を調整する能力である。本発明者らは最近、ｐＨＡＡ系が鎖状ナノ粒子凝集体に自己組織化し、Ａ群レンサ球菌に対する注射用ワクチンとして役立ちうることを実証したが、このような系の抗原を経口送達する能力はまだ調査されていない。
天然アミノ酸とは対照的に、リポアミノ酸（ＬＡＡ）等の非天然アミノ酸は、脂質コアペプチド（ＬＣＰ）系において、鉤虫［１１、１２］を含む様々な病原体に対する免疫応答を生成するために広く使用されている［１３～１８］。ＬＣＰは、ペプチドエピトープ、分岐部分、及び単一のワクチンペプチドに共に連結されたＬＡＡからなる。両親媒性物質としてのＬＣＰは、ナノ粒子に自己組織化する能力を有する［１９］。本発明者らは、ＬＣＰナノ粒子が、ＧＡＳ感染に対する高い抗体価の産生を誘導するのに有効であることを示した［２０、２１］。ナノ粒子は、抗原提示細胞によって効果的に取り込まれ、適応免疫を刺激し、改善された経口安定性を有することができるので［６、２５、２６］、ワクチン設計において特に魅力的である［２２～２４］。
本実施例の目的は、鉤虫感染に対する単分子ベースの自己アジュバント化経口ワクチンを作製することであった。本発明者らは、非天然脂質ＬＡＡ単位及び天然ｐＨＡＡ単位にそれぞれコンジュゲートされたペプチド抗原を有する２つのワクチン候補を設計した。この目的のために、リシン分岐スペーサを用いてｐ３鉤虫Ｂ細胞エピトープをＴヘルパーペプチド（Ｐ２５；配列番号８）に結合させ（１）、２－アミノ－ｄ，ｌ－エイコサン酸を含有するＬＣＰ系［２０］に結合させてリポペプチド２を生成し、ポリロイシンを含有するｐＨＡＡ送達系に結合させてペプチド３を生成した（図１８）。
リシン及びセリンから構築された親水性部分をペプチド２及び３に導入して、溶解度を増加させ、ペプチドの自己組織化を可能にした。これは、Ｐ２５及びｐ３の両方が比較的疎水性であるからである。この部分は、Ｐａｍ３Ｃｙｓアジュバント及びその誘導体ペプチドにおいて使用される伝統的な可溶化単位と同一である［２７］。同様のアプローチは、ＧＡＳに対するペプチドベースのワクチンとしての自己組織化ＬＣＰベースのナノ粒子（１５～２０ｎｍ）の設計において有効であることが証明されている［２８］。標準的なＢｏｃ－ＳＰＰＳ手順［２９］を用いてペプチド１～３を合成した。
ペプチド２及び３を水性条件下で自己組織化させ、それらの特性を動的光散乱（ＤＬＳ）及び透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて測定した（図１９）。ペプチド２は、約１１５ｎｍ及び３４０ｎｍのサイズの粒子を形成し、０．４という高い多分散性指数を有し、これは、ＬＣＰベースの系において以前に見られたようなランダムな凝集体と類似している。ペプチド３は、０．４という高いＰＤＩを有するある範囲の粒子サイズ（１００～５０００ｎｍ）を示したが、１００ｎｍのナノ粒子がＴＥＭで主に観察された（図１９）。粒子のサイズは、それらがＧＩ管を通してどのように吸収され、続いて抗原提示細胞によって認識及びプロセシングされるかに影響を及ぼすことができ、５００ｎｍ未満の粒子は、より大きい粒子よりも効率的に取り込まれる［６、３０］。
次に、コンジュゲートの抗原性及びワクチン有効性を決定するために、ヒト鉤虫感染の動物モデルを用いた。ヒト鉤虫であるＮ．アメリカヌス（Ｎ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）は、実験動物に自然には感染しない。他方、Ｎ．ブラシリエンシスは、一般に「齧歯類の鉤虫（ｒｏｄｅｎｔ ｈｏｏｋｗｏｒｍ）」と呼ばれる土壌伝播性線虫である。Ｎ．ブラシリエンシスはヒト鉤虫と類似のライフサイクル及び形態を有し、そのセクレトームはＮ．アメリカヌスと高度に保存されている［３１］。さらに、Ｎａ－ＡＰＲ－１のｐ３ペプチドは、２つの寄生生物の間で完全に保存されている。鉤虫に対する体液性応答を誘発するワクチンペプチドの能力を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹のマウス／群）を、１００μｇ／用量のペプチド２又は３で経口免疫した。陽性対照群には、他の動物種におけるその潜在的な毒性副作用のためにマウス研究にのみ承認されている強力な粘膜アジュバントであるコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）１０μｇと共に製剤化した１００μｇのペプチド１を投与した。陰性対照群には、１００μＬのＰＢＳを投与した。合計６週間の毎週の経口投与後、免疫化マウスを、５００のＮ．ブラシリエンシス第３期幼虫（Ｌ３）で皮下抗原接種し（５０日目）、７日間放置した。血液及び唾液の試料を、抗原接種前の４８日目、最終追加免疫を投与した７日後の、抗原接種後５６日目に採取した（図２０）。ペプチドベースのワクチンは、ｐ３ペプチドに対する抗体の産生を誘導する必要があるだけでなく、それらの抗体もまた、親Ｎ．アメリカヌス及びＮ．ブラシリエンシスのタンパク質、それぞれＮａ－ＡＰＲ－１及びＮｂ－ＡＰＲ－１を認識する必要がある。組換えＮａ－ＡＰＲ－１は本発明者らに利用可能であったが［３２］、組換えＮｂ－ＡＰＲ－１は発現されていないが、Ｎ．ブラシリエンシス排泄／分泌産物（Ｎｂｒ ＥＳＰ）中にその天然形態で存在する［３１］。
ｐ３、Ｎａ－ＡＰＲ－１及びＮｂｒ ＥＳＰに対する同様のＩｇＧ抗体価が、それぞれペプチド２、３及び陽性対照ＣＴＢ＋１で処置したマウスにおいて検出された（図２０）。抗原接種後（５６日目）、ペプチド２及び３で免疫したすべてのマウスは、ＣＴＢ＋１で処置した陽性対照マウスと同様の力価で、そのペプチド及び親タンパク質に対する抗体を産生した（図２０）。ｐ３特異的ワクチン接種群と比較して、ＰＢＳ陰性対照は、Ｎ．ブラシリエンシス抗原接種感染後７日以内にマウスにおけるペプチドに対する天然の免疫応答の定量可能な誘導がないことによって実証されるように、免疫応答の前活性化を示さなかった。天然の免疫応答が発達する場合、それは２週間までの時間を要する可能性があるが、ワクチン接種群は、わずか７日後により高い抗体価を産生した。
感染後（５６日目）、成体の虫を小腸から採取し、別所に記載されているように３３糞便試料から卵を計数した。成体虫負荷は、ワクチン接種群２（８５％）、３（８９％）及びＣＴＢ＋１（９８％）において、ＰＢＳを受けた群と比較して有意に減少した（図２１）。糞便卵負荷も、ＰＢＳ陰性対照群と比較して、すべてのワクチン接種群２（８４％）、３（７５％）及びＣＴＢ＋１（９８％）において有意に低かった。非天然及び天然アミノ酸ベースの送達系であるペプチド２対３を受けたマウスの間で虫負荷に有意差はなかったが、ｐＨＡＡベースのワクチン候補３は、容易に入手可能な天然アミノ酸から構成される天然代謝産物に完全に生分解性であり、ラセミ部分を含まない完全に明確な単一分子であるため、重要な利点を有する。
ペプチドを成功裏に経口でかつ実用的に送達することができるワクチンのための非毒性かつ有効なアジュバント送達系は存在しない。従って、ユニバーサルアジュバントの開発は、粘膜ワクチン接種を改善するために極めて重要である。ここで、本発明者らは、マウスをモデル鉤虫感染から保護する単一成分、自己組織化ナノ粒子送達系を生成した。この単分子ベースの送達系は、ポリマー［３４］又はリポソーム［２６］等の古典的に使用される多成分送達マトリクスを必要とすることなく、経口投与で有効であった。全体として、ｐＨＡＡ送達系は、容易かつ安価に製造することができ、アジュバントなしの自己アジュバント送達系になることに有望であることが示されている。本発明者らが知る限りでは、本明細書において提示されるｐＨＡＡに基づく送達系は、天然アミノ酸から構築されたペプチドに基づき、ワクチンの経口ペプチド送達に有効であった最初の系である。
実験
ペプチド１
プロトコル［３５］に従ってＦｍｏｃ－ＳＰＰＳを使用して、ｒｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂上で０．１ｍｍｏｌでペプチド１を合成した。要約すると、樹脂（置換比：０．７９ｍｍｏｌ／ｇ、０．１ｍｍｏｌスケール、０．１２７ｇ）をＮ’Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で一晩膨潤させた。マイクロ波支援Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ、ＳＰＳモードＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ反応器を用いて合成を行った。２０％ピペリジン／ＤＭＦを用いてＦｍｏｃ基を７０℃で２分間及び５分間除去した。アミノ酸を、ＤＭＦ中の０．５Ｍ １－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム ３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（４当量、０．８ｍＬ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５．２当量、９１μＬ）で活性化し、加えて、５分間及び１０分間カップリングさせた。未反応樹脂を無水酢酸、ＤＩＰＥＡ及びＤＭＦ（５：５：９０）で、７０℃で２回（５分及び１０分）アセチル化した。このリポペプチドを溶媒Ｂ（アセトニトリル／水（９０：１０））に溶解した後、凍結乾燥した。生成物を、３０分間にわたる４５～６５％溶媒Ｂの溶媒勾配を用いるＣ１８ Ｖｙｄａｃカラムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。分析用分析は、島津製作所装置（Ｃ４カラム）を使用して行った：ｔＲ＝分、純度＞９５％。収率：３２％。ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ １４２３．６（計算値１４２３．３）［Ｍ＋３Ｈ］３＋；１０６７．８（計算値１０６７．７）［Ｍ＋４Ｈ］４＋；８５４．３（計算値８５４．４）［Ｍ＋５Ｈ］５＋；７０１．８（計算値７０１．８）［Ｍ＋６Ｈ］６＋。ＭＷ＝４２６７．１。
ペプチド２
ペプチド２を、上記と同様の方法で、ＭＢＨＡ樹脂上でｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）ＳＰＰＳ技術を使用して０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。樹脂（置換比：０．５９ｍｍｏｌ／ｇ、０．２ｍｍｏｌスケール、０．３４ｇ）をＤＭＦ及びＤＩＰＥＡ（５．２当量、９１μＬ）中で２時間膨潤させた。ＬＡＡ及びアミノ酸をＤＭＦ中のＨＡＴＵ（４当量、０．８ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（５．２当量、９１μＬ）で活性化し、樹脂に加えて、５分間及び１０分間カップリングさせた。４，４－ジメチル－２，６－ジオキシシクロヘキシリデン－２－アミノ－ｄ，ｌ－エイコサン酸（Ｄｄｅ－Ｃ２０－ＯＨ）を、室温で２回の１時間のカップリングを用いて樹脂にカップリングした。ヒドラジン一水和物（５％）を用いて室温で１０分間、１０分間及び２０分間Ｄｄｅ保護基を樹脂から除去した。残りのアミノ酸を同じ様式でカップリングした。Ｂｏｃ保護基を、ＴＦＡを用いて２回、それぞれ１分間、室温で撹拌しながら除去した。ペプチド分岐を可能にするＰ２５配列の合成前にＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）ＯＨを導入した。Ｐ２５配列の完成時に２０％ピペリジンを使用してＦｍｏｃ基を除去して、ｐ３ペプチドの分岐を可能にした。ペプチドを、５％（ｖ／ｖ）ｐ－クレゾール及び５％（ｖ／ｖ）ｐ－チオクレゾールの存在下、－８℃でフッ化水素酸（ＨＦ）（１０ｍＬ ＨＦ／ｇ樹脂）を用いて樹脂から切断した。このリポペプチドをアセトニトリル／水（９０：１０）に溶解した後、凍結乾燥した。生成物を、３０分間にわたる４５～６５％溶媒Ｂ勾配を用いて、Ｃ４カラムを用いるＲＰ－ＨＰＬＣを使用して精製した。ｔＲ＝４１．１分、純度＞９５％。収率：１３％。ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ １８８６．３（計算値１８８６．６）［Ｍ＋３Ｈ］３＋；１４１５．６（計算値１４１５．２）［Ｍ＋４Ｈ］４＋；１１３２．５（計算値１１３２．４）［Ｍ＋５Ｈ］５＋；９４４．０（計算値９４３．８）［Ｍ＋６Ｈ］６＋；８０９．３（計算値８０９．１）［Ｍ＋７Ｈ］７＋。ＭＷ＝５６５７．０。
ペプチド３
ペプチド３を、ペプチド２について記載したものと同じ方法で、ＭＢＨＡ樹脂上でＢｏｃ ＳＰＰＳ技術を用いて０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。ｐ３及びＰ２５配列を使用する最初のペプチドをまず合成し、続いてｐＨＡＡ鎖を結合させた。Ｐ２５の合成後にＢｏｃ－Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）ＯＨを導入し、ペプチド分岐を可能にした。リシン－Ｐ２５配列へのｐ３の合成後、２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃ側鎖を除去し、標準的なカップリング手順を用いてポリロイシン部分を結合させた。生成物を、３０分間にわたる４０～７０％溶媒Ｂ勾配を用いて、Ｃ４カラムを用いるＲＰ－ＨＰＬＣを使用して精製した。ｔＲ＝３０．２分、純度＞９５％。収率：１６％。ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ １５２２．０（計算値１５２１．６）［Ｍ＋４Ｈ］４＋；１２１７．６（計算値１２１７．５）［Ｍ＋５Ｈ］５＋；１０１４．９（計算値１０１４．７）［Ｍ＋６Ｈ］６＋。ＭＷ＝６０８２．５。
特性評価
ゼータサイザー３０００ＴＭ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を用いた光子相関分光法を用いて、自己組織化粒子のサイズを測定した。ワクチンペプチドの形態を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）（ＨＴ７７００ Ｅｘａｌｅｎｓ、日立製作所、日本）を用いて真空乾燥後に評価した。簡潔には、試料を純粋な蒸留水で希釈し（１：１００）、グロー放電炭素被覆銅グリッド上に直接滴下し、次いで２％酢酸ウラニルで染色した。試料を２０００００の倍率で観察した。
ワクチン接種スキーム及び鉤虫抗原接種モデル
１０週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ、オーストラリア、西オーストラリア州、パース）を無作為に１０群に分け、新たに調製したワクチン製剤で経口免疫した。マウスは、ペレット化された食物及び水を自由に摂取した。ペプチドは、０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目及び３５日目に、２０ゲージ経口強制飼養チューブを使用して、マウスあたり１００μＬの水中に１００μｇの２及び３の用量で与えた。陰性対照群には、マウスあたり１００μＬのＰＢＳを投与し、陽性対照群には、マウスあたり１００μｇの対照ペプチド１及び１０μｇのＣＴＢを同じ投与日に投与した。４９日目の最終免疫化の２週間後、マウスに、２００μＬのＰＢＳ中の５００個の感染性ニッポストロンジラス・ブラジリエンシス（ブラジル鉤虫、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｓｅｎｓｉｓ）幼虫（Ｌ３）を、首筋で皮下に感染させた。スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラット（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ、オーストラリア、西オーストラリア州、パース）において、Ｎ．ブラシリエンシスを以前に記載されたように維持した［３３、３６］。感染性Ｌ３は、２週齢のラット糞便培養物から新たに調製した。感染の７日後、マウスをＣＯ２で安楽死させ、血液（抗原接種後）、小腸由来の成体寄生生物及び大腸由来の計量糞便試料を収集した。
血清及び唾液の収集
４８日目及び５６日目に血液試料を採取した。採血は、尾動脈を介して分離Ｚ－Ｇｅｌマイクロチューブに行い、この血液を室温で１時間放置し、１０，０００ｇで５分間遠心分離した。マウスをＣＯ２ガスで安楽死させた後、心臓穿刺を介して最終出血を回収した。血清を取り出し、分析まで－２０℃で保存した。
抗体応答の評価
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を実施して、血清及び唾液の試料中の抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ抗体価を決定した。すべての反応は１００μＬ／ウェルで行った。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｍｉｃｒｏｌｏｎ（登録商標） ６００）の各ウェルを、５μｇ／ｍＬのｐ３ペプチド、成熟組換えＮａ－ＡＰＲ－１（親切にもＰｅａｒｓｏｎら［３７］により提供された）又は０．１Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６）に希釈したＮ．ブラシリエンシス排泄／分泌タンパク質（Ｎｂｒ ＥＳＰ；Ｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒら［３８］に記載される通りである）のいずれかで、３７℃で２時間コーティングした。プレートをＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、非特異的結合を減少させるための５％脱脂乳で、４℃で一晩ブロックした。血清中のＩｇＧについて１：１００希釈、及び唾液中のＩｇＡについて１：４希釈の試料を３７℃で１時間添加した。すべての反応性試料を２倍連続希釈で終点まで滴定した。プレートを３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（ＰＢＳＴ中１：４０００の抗ＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン） ＃６２－６及びＰＢＳＴ中１：２０００の抗ＩｇＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃６２－６７２０）を３７℃で１時間添加した。プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ００－４２０１－５６）と共に室温で２０分間インキュベートした。異なる群の試料からの抗体価を、陰性対照マウスからの平均吸光度の３標準偏差の吸光度を超えた最低希釈で得た。
統計解析
群間の抗体価の統計解析を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くテューキーの多重比較検定を用いて行った。成体の虫及び糞便の卵負荷の差を、ノンパラメトリックなマンホイットニーのＵ検定によって解析した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、米国、カリフォルニア州）を統計解析に使用した。ｐ＜０．０５の場合、差は有意であった。
実施例４
Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）細菌は、喉又は皮膚にコロニー形成することが知られているグラム陽性病原体である。ＧＡＳ感染は、様々な程度の重症度を有する様々な化膿性疾患をもたらす。これらの細菌の主要な標的領域は、粘膜、皮膚、扁桃腺及びそれらの周囲の組織である。一般に、ＧＡＳは、咽頭炎、膿痂疹、肺炎、髄膜炎、猩紅熱及び蜂巣炎を引き起こすことが知られている。しかしながら、この細菌は、レンサ球菌毒素ショック症候群（ＳＴＳＳ）、壊死性（「人食い」）筋膜炎及び敗血症等の致命的な侵襲性疾患も引き起こす可能性があり、急性リウマチ熱、リウマチ性心疾患（ＲＨＤ）、反応性関節炎及びレンサ球菌感染後糸球体腎炎を含むレンサ球菌感染後（非化膿性）後遺症を引き起こす可能性がある。この感染の有名な性質に起因して、ＧＡＳは、ヒトにおける感染関連死の上位１０の主な原因として列挙され、年間８００万患者の全世界的な負担（２０１３年データ）及び３３４０万のＲＨＤ症例のみからでも３１９，４００人の死亡が推定された（２０１５年及び２０１７年のデータ）。
この問題に対処するために、ワクチン接種が最良の予防であり費用効果の高い医学的介入である（例えば、天然痘を全世界的に根絶する能力）ため、ＧＡＳに対するワクチンが広範に研究されている。全生物（生の、生弱毒化した又は不活化した病原体）を使用する伝統的なワクチンは、長期間持続する免疫という利点を有する。しかしながら、それらは、自己免疫又はアレルギー応答、並びにワクチンとしてのその有効性を低下させうる余計な生物学的物質を誘導する可能性もある。１９２０年代に、成人及び小児に静脈内注射した加熱殺傷ＧＡＳ株を用いてヒト試験が行われた。この試みは、粗ワクチン設計の発熱性外毒素の存在による高い反応源性により失敗した。サブユニットワクチンは、これらの伝統的なワクチンの代用物として導入された。それらは、微生物の一部、例えば炭水化物、タンパク質及びペプチドのみをワクチン抗原として使用する。それにもかかわらず、精製された全Ｍタンパク質（ＧＡＳの主要病原因子）又はＭタンパク質の断片を使用するタンパク質ベースのサブユニットワクチン戦略は、その効力にもかかわらず、ヒト組織交差反応性の存在を依然として示した。代わりに、最近のＧＡＳワクチン開発は、ペプチドベースのサブユニットワクチンを使用し、このワクチンでは、選択された抗原に由来するアミノ酸の短い配列を用いて、免疫応答を誘発する。エピトープＪ８（Ｍタンパク質のＣ反復領域に由来する２８アミノ酸ペプチド）は、多くの研究並びにヒト臨床研究においてワクチン抗原として使用されている。ペプチドベースのワクチンは、その安全性プロファイル、化学合成を用いた純粋な合成ワクチンの容易な製造、並びに貯蔵及び輸送におけるその安定性を含む、その複数の利点のために注目を得ている。しかしながら、そのような最小限の生物学的成分の使用は、ペプチドを貧弱な免疫原にし、それらの免疫原性を克服するために免疫賦活剤（アジュバント又は送達系）を必要とする。
本実施例では、本発明者らは、ポリ疎水性アミノ酸（ｐＨＡＡ）を送達系として使用する、ＧＡＳに対するマルチエピトープワクチンを設計及び製剤化する。このペプチドベースの自己アジュバントｐＨＡＡは、ＧＡＳエピトープにコンジュゲートされた場合に高い有効性及び効力を有し［１］、これは、ｐＨＡＡ－抗原コンジュゲートの小さいナノ粒子及び鎖状凝集ナノ粒子（ＣＬＡＮ）への自己組織化に起因するものであった。ナノ粒子は、疎水性ｐＨＡＡが親水性エピトープにコンジュゲートした場合に形成されるｐＨＡＡ－抗原コンジュゲートの両親媒性特性に起因して形成される。このマルチエピトープワクチン設計は、以下の成分を組み込む：ＧＡＳ Ｍタンパク質由来の異なるＢ細胞エピトープ（Ｊ８、ＰＬ１及び８８／３０）、長期記憶免疫応答を提供するための汎ヒト白血球抗原－抗原Ｄ関連（ＨＬＡ－ＤＲ）結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）Ｔヘルパー細胞エピトープ、及びｐＨＡＡ部分としてのポリロイシン。Ｂ細胞エピトープは、自己免疫配列を除外するＭタンパク質の保存された（Ｊ８）及び超可変（ＰＬ１及び８８／３０）領域から選択した。Ｊ８（ＱＡＥＤＫＶＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＬＥＤＫＶＱ；配列番号９）は、ＧＣＮ４ ＤＮＡ結合タンパク質配列に隣接するＭ１ ＧＡＳ株のＭタンパク質のアミノ酸３４４～３５５に由来し、一方、ＰＬ１（ＥＶＬＴＲＲＱＳＱＤＰＫＹＶＴＱＲＩＳ；配列番号１０）及び８８／３０（ＤＮＧＫＡＩＹＥＲＡＲＥＲＡＬＱＥＬＧＰ；配列番号１１）は、それぞれＧＡＳ株Ｍ５４及び８８／３０（オーストラリア、ノーザンテリトリー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｔｅｒｒｉｔｏｒｙ）のアボリジニから最初に単離された株）のＭタンパク質由来の型特異的Ｎ末端に由来した。このマルチエピトープワクチンの効率は、１６種の共通ＨＬＡ－ＤＲ型（主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ細胞表面受容体）のうち１５種に対して高い親和性を有するユニバーサル合成ＰＡＤＲＥ Ｔヘルパーエピトープ（ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；配列番号７）を含めることによって増強することができる。ポリロイシンは、他のポリアミノ酸（本明細書に記載されるバリン及びフェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン酸、セリン、プロリン及びフェニルアラニン－ロイシン－アラニン）及び市販のアジュバント（本明細書に記載されるＣＦＡ、ミョウバン、ＡＳ０４、ＭＦ５９）と比較して最も有効なｐＨＡＡ系としてロイシンを示した以前の研究に基づいて選択した。ＰＡＤＲＥ及び１０コピーのロイシンにコンジュゲートした個々のＪ８、８８／３０及びＰＬ１エピトープの物理的混合物を、ナノ粒子を形成し免疫応答を刺激するそれらの能力に関して、ポリロイシンにコンジュゲートしたエピトープ（Ｊ８、８８／３０、ＰＬ１、ＰＡＤＲＥ）と比較した（図２２）。
材料及び方法
材料
ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護Ｌ－アミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（メルク・ケミカルズ）（ドイツ、ダルムシュタット）及びＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（オーストラリア、メルボルン）から購入した。４－メチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）樹脂は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（米国、ケンタッキー州）から入手した。１－［６－ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム－３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）は、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ（オーストラリア、メルボルン）から購入した。アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ｐ－クレゾール、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Ｍｅｒｃｋ（ドイツ、ホーエンブルン）から入手した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国、カリフォルニア州）から得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ’ｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（クイーンズランド大学生物資源、ＵＱＢＲ）（オーストラリア、クイーンズランド州）から購入した。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）は、サーモサイエンティフィック（オーストラリア、ビクトリア州）から購入した。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ（ＩｇＧ ＨＲＰ）コンジュゲートは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国、カリフォルニア州、テメクラ）から購入した。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及びヤギ抗マウスＩｇＡはＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（米国、サンディエゴ）から購入した。分析グレードのＴｗｅｅｎ２０は、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（オーストラリア、クイーンズランド州）から購入した。クロロホルム、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質、ピロカルピンＨＣＬ、及びすべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（オーストラリア、ビクトリア州）から購入した。
化学合成は、ＣＭＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（シーエムイー・コーポレーション）（米国、ノースカロライナ州）製のＳＰＳ ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ反応器上でマイクロ波支援Ｂｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して行った。ペプチドの分析は、ＬＣＭＳ－２０２０ 島津製作所（日本、京都）の装置（ＤＧＵ－２０Ａ３、ＬＣ－２０Ａｄ×２、ＳＩＬ－２０ＡＨＴ、ＳＴＯ－２０Ａ）又はＡｎａｌｙｓｔ １．４ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ、カナダ、トロント）（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ－Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３０００）でのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）、及び２１４ｎｍで化合物を検出する、Ｖｙｄａｃ分析用Ｃ１８（２１８ＴＰ５４；５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）又はＣ４（２１４ＴＰ５４；５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）カラムを用いる島津製作所（日本、京都）の装置（ＤＧＵ－２０Ａ５、ＬＣ－２０ＡＢ、ＳＩＬ－２０ＡＣＨＴ、ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰ）での分析用逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用して行った。精製は、島津製作所分取ＲＰ－ＨＰＬＣ（日本、京都）装置（ＬＣ－２０ＡＰ×２、ＣＢＭ－２０Ａ、ＳＰＤ－２０Ａ、ＦＲＣ－１０Ａ）で、Ｃ１８（２１８ＴＰ１０２２；１０μｍ、２２×２５０ｍｍ）又はＣ４（２１４ＴＰ１０２２；１０μｍ、２２×２５０ｍｍ）を用いて２０．０ｍｌ／分の流量で実施した。ナノ粒子のサイズ及び多分散性は、Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＰ機器（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を用いて、Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を用いて使い捨てキャピラリーキュベットで動的光散乱（ＤＬＳ）によって決定した。ナノ粒子のサイズ及び形態のさらなる分析は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ；ＨＴ７７００ Ｅｘａｌｅｎｓ、日立製作所、日本電子、日本）を使用して捕捉された粒子画像化を介して、２％ホスホタングステン酸及び炭素被覆銅グリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ（テッド・ペラ）、２００メッシュ）を使用する陰性染色技術によって行った。二次構造は、Ｊａｓｃｏ Ｊ－７１０円二色性分光計を用いて１ｍｍキュベット中で分析した。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（モレキュラーデバイス）、米国）を用いて測定したプレート読み取り吸光度を用いてプレート上で行った。ＥＬＩＳＡデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、米国）を使用して分析した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を使用して多重比較を実施した。データは、検討した群間で（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１で有意に異なるとみなした。
化合物１～１４の合成
化合物１～１１及び１３（図２２）を、ｐＭＢＨＡ樹脂・ＨＣｌ（０．５９ｍｍｏｌ／ｇ置換）上でＢｏｃ化学によるマイクロ波支援ＳＰＰＳ（７０℃、２０Ｗ）法を用いて、０．１ｍｍｏｌスケールで合成した［２、３］。樹脂（０．０１７ｇ）を秤量し、ＤＭＦ及びＤＩＰＥＡ（６．２当量）中で２時間予備膨潤させた。カップリングサイクルは、Ｂｏｃ基の脱保護（ニートＴＦＡで２分間処理、室温で２回）、ＤＭＦ洗浄、並びに０．５Ｍ ＨＡＴＵ（１．６ｍＬ、４当量）及びＤＩＰＥＡ（０．１８ｍＬ、５．２当量）でのアミノ酸（０．８４ｍｍｏｌ／ｇ、４．２当量）活性化、並びに二重カップリング（５分及び１０分）を用いた樹脂へのカップリングを含む。特別なアミノ酸カップリング条件をアスパラギン酸に適用し、５０℃で１５分間の二重カップリングを行った。所望のペプチドが達成されるまで、これらの手順を繰り返した。アセチル化は、第１のアミノ酸及び最終アミノ酸の添加後に、９０％ＤＭＦ、５％ＤＩＰＥＡ及び５％無水酢酸を使用することによって行った。トリプトファンアミノ酸からのホルミル基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて２分間及び５分間脱保護した。完成した化合物をＤＭＦ（３回）、ＤＣＭ（３回）及びメタノールで洗浄した後、デシケーター中で一晩乾燥させた。乾燥後、ペプチドを、無水フッ化水素（ＨＦ）及びスカベンジャーとしてのｐ－クレゾールを用いて樹脂から切断した［４］。これらの化合物を沈殿させ、冷ジエチルエーテルで洗浄した。次いで、沈殿した化合物を溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％ミリＱ（ｍｉｌｌｉ－Ｑ）水、０．１％ＴＦＡ）を用いて溶解し、次いで濾過した。これらの化合物を、島津製作所分取ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて、Ｃ１８又はＣ４ Ｖｙｄａｃカラム上で溶媒Ｂ勾配（各化合物についての特定の勾配）を用い、化合物を２１４ｎｍで検出して２５分間精製した。次いで、精製した化合物を、ＥＳＩ－ＭＳ及び分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、Ｃ１８又はＣ４ Ｖｙｄａｃカラム上で溶媒Ｂの０～１００％勾配を４０分間使用し、化合物を２１４ｎｍで検出して分析した。
追加の反応を行って、化合物１２及び１４を作製した。純粋な化合物１０（５．４５ｍｇ）を、チオール－マレイミド「クリック」反応を１：１．２のモル比で使用して、純粋な化合物１１（８．４５ｍｇ）にコンジュゲートさせて、化合物１２を生成した。化合物１０及び１１の両方を２．５μＬのＤＭＳＯに別々に溶解した。グアニジン緩衝液（１００μＬ；６Ｍグアニジン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％アセトニトリル水溶液；ｐＨ７．３）を各化合物に加えた後、それらを混合した。５％水酸化ナトリウムを用いてｐＨを約７．２～７．５に調整した。フラスコを窒素で３回洗浄することによって酸素を除去した。試料（３０μＬ）を毎時間収集し、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラムを用いた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して分析して、反応の進行をモニターした（反応物質ピークが減少し、生成物ピークが成長した）。反応が終了した後、混合物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて精製して純粋な化合物１２を単離し、これをＥＳＩ－ＭＳ及びＣ４ Ｖｙｄａｃカラムでの分析ＲＰ－ＨＰＬＣにより分析した。
純粋な化合物１２（６ｍｇ）を、銅（Ｉ）触媒アジド－アルキンＨｕｉｓｇｅｎ（ヒュスゲン）環化付加（ＣｕＡＡＣ）「クリック」反応［２］を１：１．７のモル比で使用して、純粋な化合物１３（３．２ｍｇ）にコンジュゲートさせて、化合物１４を生成した。化合物１２及び１３の両方をフラスコ中で０．５ｍＬのＤＭＦを用いて溶解した後、２０ｍｇの銅ワイヤ及び磁気撹拌子を添加した。セプタム栓を用いてフラスコを覆い、フラスコを窒素で３回洗浄することによって酸素を除去した。このフラスコを５０℃の油浴に入れ、混合物を２００ｒｐｍで撹拌した。混合物が青緑色に変わると、試料（１５μＬ）を１時間ごとに収集した。化合物１４の反応の進行、精製及び分析は、化合物１２と同様に行った。
化合物１（純粋）収率：２０％。純度：９９％。分子量：３２８１．７７。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ １６４１．５（計算値：１６４１．８９）、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １０９５．１（計算値：１０９４．９２）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ ８２１．５（計算値：８２１．４４）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ６５７．５（計算値：６５７．３５）、Ｒｔ：１８．４分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物２（純粋）収率：１６％。純度：９９％。分子量：２３０３．６１。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ １１５２．６（計算値：１１５２．８１）、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ ７６８．５（計算値：７６８．８７）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ ５７７．１（計算値：５７６．９０）。Ｒｔ：１７．７分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物３（純粋）収率：１６％。純度：９９％。分子量：２２８５．５６。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ １１４３．３（計算値：１１４３．７８）、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ ７６２．６（計算値：７６２．８５）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ ５７２．４（計算値：５７２．３９）。Ｒｔ：２０．４分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物４（純粋）収率：１８％。純度：９９％。分子量：４６５３．４２。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １５５２．４（計算値：１５５２．１４）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １１６４．３（計算値：１１６４．３６）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ９３１．７（計算値：９３１．６８）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ７７６．６（計算値：７７６．５７）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ６６５．９（計算値：６６５．７７）。Ｒｔ：２５．０分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物５（純粋）収率：１６％。純度：９９％。分子量：３６７５．２６。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ １８３８．６（計算値：１８３８．６３）、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １２２６．０（計算値：１２２６．０９）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ ９１９．９（計算値：９１９．８２）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ７３５．８（計算値：７３６．０５）。Ｒｔ：２０．２分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物６（純粋）収率：１５％。純度：９７％。分子量：３６５７．２１。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １２２０．２（計算値：１２２０．０７）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ ９１５．３（計算値：９１５．３０）。Ｒｔ：１８．３分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物７（純粋）収率：１５％。純度：９８％。分子量：５７８５．０２。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １４４７．４（計算値：１４４７．２６）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １１５８．２（計算値：１１５８．００）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ９６５．０（計算値：９６５．１７）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ８２７．５（計算値：８２７．４３）。Ｒｔ：３０．９分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物８（純粋）収率：２２％。純度：９９％。分子量：４８０６．８６。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １６０３．５（計算値：１６０３．２９）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １２０３．０（計算値：１２０２．７２）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ９６２．２（計算値：９６２．３７）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ８０２．２（計算値：８０２．１４）。Ｒｔ：３７．９分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物９（純粋）収率：１５％。純度：９８％。分子量：４７８８．８１。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １５９７．３（計算値：１５９７．２７）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １１９８．２（計算値：１１９８．２０）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ９５８．９（計算値：９５８．７６）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ７９９．２（計算値：７９９．１４）。Ｒｔ：３０．５分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物１０（純粋）収率：１５％。純度：９６％。分子量：４７５８．３３。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １１９０．６（計算値：１１９０．５８）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ９５２．６（計算値：９５２．６７）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ７９４．３（計算値：７９４．０６）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ６８０．８（計算値：６８０．７６）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ５９６．０（計算値：５９５．７９）。Ｒｔ：１９．５分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物１１（純粋）収率：１５％。純度：９８％。分子量：３４７４．９７。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ ８７０（計算値：８６９．７４）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ６９６（計算値：６９５．９９）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ５８０（計算値：５８０．１６）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ４９８（計算値：４９７．４２）。Ｒｔ：１９．２分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物１２（純粋）収率：４３％。純度：９９％。分子量：８２３３．３０。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ １０３１（計算値：１０３０．１６）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ９１６（計算値：９１５．８１）、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ ｍ／ｚ ８２５（計算値：８２４．３３）、［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ ｍ／ｚ ７５０（計算値：７４９．３０）、［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ ｍ／ｚ ６８７（計算値：６８７．１１）、［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ ｍ／ｚ ６３５（計算値：６３４．３３）。Ｒｔ：１８．４分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物１３（純粋）収率：２０％。純度：９８％。分子量：２７８５．５９。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ ９３０（計算値：９２９．５３）。Ｒｔ：４２．９分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物１４（純粋）収率：２２％。純度：９５％。分子量：１１０１８．８９．［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ ｍ／ｚ １１０３（計算値：１１０２．８９）、［Ｍ＋１１Ｈ］１１＋ ｍ／ｚ １００３（計算値：１００２．７２）、［Ｍ＋１２Ｈ］１２＋ ｍ／ｚ ９２０（計算値：９１９．２４）、［Ｍ＋１３Ｈ］１３＋ ｍ／ｚ ８４９（計算値：８４８．６１）、［Ｍ＋１４Ｈ］１４＋ ｍ／ｚ ７８８（計算値：７８８．０６）、［Ｍ＋１５Ｈ］１５＋ ｍ／ｚ ７３６（計算値：７３５．５９）、［Ｍ＋１６Ｈ］１６＋ ｍ／ｚ ６９１（計算値：６８９．６８）。Ｒｔ：２６．５分。（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
二次構造分析
溶液中のペプチドの二次構造をＣＤ分光法によって分析した。化合物７～９及び１４（ＰＢＳ中０．１ｍｇ／ｍＬ）を石英キュベットに入れた。ＣＤスペクトル測定を２３℃で１ｍｍの光路長で行い、データを１９８～２６０ｎｍの間で収集した［５］］。
インビボモデルにおける皮下免疫化
６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ’ｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＵＱＢＲ）（オーストラリア、クイーンズランド州）から購入した。マウスをＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（オーストラリア生物工学ナノテクノロジー研究所、ＡＩＢＮ）のＡｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（動物施設）に収容した。あらゆる実験を行う前に、マウスを７日間順化させた。マウスに、０日目、２１日目、２８日目及び３５日目に尾の基部に５０μＬの化合物４～６（混合物）及び１４を皮下注射により与えた。各化合物の抗原の量は、表２ｂに基づいて変化した。陽性対照マウスにはＣＦＡ（１：１体積比）でアジュバント添加した化合物１～３溶解混合物を与えたが、陰性対照マウスには５０μＬのＰＢＳを与えた。
血清の収集
免疫化後の２０日目、２７日目、３４日目及び４９日目に血清試料を採取して、抗原特異的ＩｇＧ抗体価を測定した。尾部先端（２０日目、２７日目及び３４日目に９０μＬのＰＢＳで希釈した１０μＬ）及び心臓穿刺（４９日目に採取した１ｍＬの血液）を介して血液を採取した。採取した血液試料を３，６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を上清から回収し、さらなる分析まで－８０℃に保った。
ＥＬＩＳＡによる抗体価検出
抗原特異的抗体ＩｇＧ力価を、以前に公開された（ＥＬＩＳＡ）アッセイを使用して検出した。プレートをＪ８、ＰＬ１、又は８８／３０（それぞれ化合物１～３）のいずれかでコーティングした。２倍連続希釈を、１：１００濃度の血清から開始して、抗原被覆プレート上で行った。ナイーブマウス血清を対照として使用した。二次抗体をプレートに添加した後にＯＰＤ基質を添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。ＩｇＧ抗体価は、対照ウェルの平均吸光度を上回る標準偏差の３倍を超える吸光度を有する最低可能希釈として表した。
結果
ワクチン候補の調製及び特性評価
皮下免疫化の際にマウスにおいて高度にオプソニン性の抗原特異的抗体産生を誘導する１５量体ロイシンのアジュバント化能力に基づいて、本実施例において新しいコンジュゲートを設計した。ＰＡＤＲＥユニバーサルＴヘルパーにコンジュゲートしたＧＡＳ Ｂ細胞エピトープ（Ｊ８、ＰＬ１、又は８８／３０のいずれか）（それぞれ化合物４～６）を、抗体産生を誘導するための抗原として設計した。免疫化研究において混合物として使用した直鎖状化合物７～９は、抗原保有ＰＬ１及び８８／３０（化合物８及び９）の疎水性によるこれらのペプチドに関する水溶性の問題に適応するためにロイシンの１０回の反復のみを保有していた。同様に、化合物１４は、ＰＡＤＲＥ、Ｊ８、ＰＬ１、及び８８／３０抗原にコンジュゲートした１０コピーのロイシンを含んでいた。
化合物１～１１及び１３は、Ｂｏｃ－ＳＰＰＳを使用して成功裏に合成され、それらの構造及び純度は、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳを使用して確認した。ＥＳＩ－ＭＳスペクトルで観察された質量は、所望の化合物の計算された質量と一致した。さらなる反応を行って、マルチエピトープ化合物１４を合成した。純粋な化合物１０及び１１を、チオール－マレイミド「クリック」反応を使用して共にコンジュゲートして化合物１２を生成し、これを精製し、ＣｕＡＡＣ「クリック」反応を使用して化合物１３にコンジュゲートして化合物１４を生成した。これらのクリック反応の進行を、分析用ＲＰ－ＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳを用いてモニターした。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣでの反応物のピークは減少したが、生成物のピークは成長した。化合物１～１４を分取ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて精製し、９５％を超える純度の化合物を得た（図２５）。
化合物７～９の混合物及び個々の化合物１４を自己組織化して、ＰＢＳ中でナノ粒子を形成した。化合物のサイズ、サイズ分布（ＰＤＩ）、及び形態を、ＤＬＳ及びＴＥＭを使用して特性評価した（表１ｂ、図２３）。概して、化合物のほとんどは、以前の研究において示されたのと同様に、小さいナノ粒子と鎖状凝集ナノ粒子（ＣＬＡＮ）との混合物を形成した。すべての化合物は、ＰＤＩ＞０．１を有した。
Figure 2023510289000013
化合物７は、ＤＬＳからは、小さなナノ粒子及び粒子サイズ（３２０ｎｍ）のＣＬＡＮ（ＴＥＭ像）に自己組織化した。同様の粒子サイズが、化合物９についてＤＬＳによって測定された。しかしながら、化合物９のＴＥＭ像は、より大きい粒子サイズ（５３０ｎｍ）を有する化合物８と同様の形態を有する化合物７と比較して、わずかに大きくかつより目に見える凝集体を有する小さいナノ粒子を示した。化合物７～９の混合物は、ＤＬＳによって測定すると３５０ｎｍの凝集体であったマルチエピトープコンジュゲート化合物１４よりも大きい６００ｎｍのサイズの粒子を形成した。
コンジュゲートの免疫学的評価
ポリＨＡＡ－抗原コンジュゲートの免疫学的評価を、一次－追加（プライム－ブースト）ワクチン接種戦略を用いてＣ５７ＢＬ／６に対して行った。マウスを、化合物４～６混合物＋ＣＦＡ（陽性対照）、７～９混合物、及びマルチエピトープコンジュゲート１４で皮下免疫した。投与量は、各群において同量の抗原を送達するために分子量に基づいて計算した。陰性対照群はＰＢＳで処置した。すべてのワクチンコンジュゲートは、最終追加免疫後に同様のレベルのＪ８特異的、ＰＬ１特異的、及び８８／３０特異的ＩｇＧ免疫応答を誘導することができた（図２４）。予想通り、ＣＦＡアジュバント添加ペプチド抗原混合物は、一次免疫後でさえ、試験群間で最も有意な抗体価を誘導した。さらなる追加免疫は、化合物１４及び混合物７～９に必要であり、抗体価は、第２の追加免疫後にのみ可視であった。全体として、物理的混合物は、マルチエピトープコンジュゲート（１４）よりもわずかに高い抗体価を誘発することができた。しかしながら、この差は有意ではなかった。これは、化合物１４の複雑な合成が標的抗原に対する免疫応答を誘導するのに不必要であることを示した。
Figure 2023510289000014
考察
本研究において使用した自己組織化ペプチドの開発の背後にある考えは、非常に単純な設計及び合成の容易さで、ＧＡＳに対する有効な免疫応答を誘発するワクチン候補を作製することであった。上記化合物は、特異的抗体産生、メモリーＴ細胞産生及び送達系を説明するために、それぞれ成功したワクチンに必要な最小限の成分 － Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ及びアジュバントを使用して作製した。最小限の設計は、自己免疫疾患、アレルギー性及び／又は発熱性応答、並びにヒト組織間反応を誘導する機会等の全生物及び全タンパク質ワクチンに関連する欠点のほとんどを回避するのに役立つ。ｐＨＡＡ部分としてポリロイシンを使用する以前に報告されたデータは、本研究のベンチマークとして役立った。１５アミノ酸反復を有するポリロイシンは、他のｐＨＡＡ、並びに１０残基及び１５残基を有するポリロイシンと比較して、より良好なアジュバント能力を示した。しかしながら、本研究では、８８／３０及びＰＬ１ペプチド（Ｊ８よりも疎水性が高い）の疎水性の性質のために、わずか１０アミノ酸反復を有するポリロイシンをｐＨＡＡ部分として使用した。ｐＨＡＡをペプチド抗原にコンジュゲートして、この送達系のアジュバント特性を評価した。上記ｐＨＡＡ－抗原コンジュゲートは、ナノ粒子を形成して免疫応答を刺激する能力に対する構造パラメータの影響を調べるように設計された。従って、マルチエピトープコンジュゲート１４を化合物７～９の物理的混合物と比較した。
すべての化合物を成功裏に合成し、精製した（純度＞９５％）。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣでは、ポリロイシン尾部が寄与する高い疎水性のために、広いピークが観測された。特に、精製された化合物６は３つのピークを示し、それらはすべてＡｃ－ＰＡＤＲＥ－８８３０の予想質量に一致した。８８／３０エピトープは、そのＣ末端にプロリンを有し、複数のピークは、溶液中にその２つの異なる異性体、シス及びトランスとして存在するプロリンの結果であると思われた。化合物９（同じく８８／３０エピトープを含有する）について多重ピークは、１０個のロイシン残基の存在により観察されず、この１０個のロイシン残基は化合物の疎水性を大幅に増加させ、その結果、広いシグナルが観察された。
興味深いことに、ＤＬＳは化合物１４について３５０ｎｍの凝集体サイズを示し、これは７～９混合物（６００ｎｍ）よりも小さかった。ＴＥＭにおける化合物７～９の混合物及び化合物１４の形態は、測定された凝集体がＣＬＡＮの形成を示すかどうかを調べるために必要である。化合物１４及び混合物７～９の免疫学的評価は、これらのコンジュゲートがすべての抗原（Ｊ８、ＰＬ１及び８８／３０）に対するＩｇＧ抗体の産生を誘導できることを実証した。異なるエピトープを有するポリロイシンコンジュゲートの物理的混合物は、単一の構築物におけるすべてのワクチン成分の組み込みに起因してより有効であると予想されたマルチエピトープコンジュゲート１４と比較して、同様の又はより高いレベルの抗体価を誘導した。これらの結果は、混合物７～９及び化合物１４の構造と相関している可能性があり、これらをさらに評価する必要がある。
ナノ粒子範囲、すなわち１～１０００ｎｍの粒子は、投与後に容易に生物学的障壁を透過し、身体を通過することができるので、標的送達に好ましい。しかしながら、ワクチンの理想的な粒子サイズについては議論が進んでいる。樹状細胞による取り込みの増強のために、５００ｎｍ未満の粒子サイズが好ましいことが報告されている。別の研究は、２００ｎｍ未満のサイズの粒子は、通常、エンドサイトーシスを介してＡＰＣによって取り込まれ、細胞ベースの免疫応答をもたらすが、５００ｎｍ～５０００ｎｍのサイズの粒子は、食作用又はミクロピノサイトーシス（微飲作用）によって取り込まれ、体液性免疫を促進するのに役立つことを報告している（Ｏｙｅｗｕｍｉら、２０１０）。ワクチンの理想的なサイズ範囲は、抗原、用量及び粒子を調製するために使用される材料にも依存する。
結び
本研究は、抗原性ペプチドＪ８、ＰＬ１及び８８／３０、Ｔヘルパー細胞エピトープＰＡＤＲＥ及びポリロイシン送達系を組み込む、ＧＡＳに対するワクチン候補の合成、特性評価、及び免疫学的評価を示す。異なるエピトープを有するポリロイシンコンジュゲートの物理的混合物は、単一の構築物におけるすべてのワクチン成分の組み込みに起因して、より有効であると予想されたマルチエピトープコンジュゲートと比較して、同様の又はより高いレベルの抗体価を誘導した。
実施例５
概要
ペプチド抗原は、ワクチン、とりわけ自己免疫誘導病原体及び癌に対するワクチンの開発において広く使用されている。しかしながら、ペプチドベースのワクチンは、所望の免疫応答を刺激するためにアジュバント及び／又は送達系を必要とする。本実施例で、本発明者らは、自己アジュバント性ポリ（疎水性アミノ酸）（ｐＨＡＡ）がＡ群レンサ球菌（ＧＡＳ）に対するペプチドベースのワクチンを送達する可能性を調査した。本発明者らは、体液性免疫応答を誘導する系の能力に対する構造配置及びｐＨＡＡ特性の効果を評価するために、ペプチド抗原（Ｊ８－ＰＡＤＲＥ）及び重合した疎水性アミノ酸を有する様々なコンジュゲートを有する自己組織化ナノ粒子を設計及び合成した。開発したコンジュゲートの免疫原性も市販のヒトアジュバントと比較した。本発明者らは、Ｊ８－ＰＡＤＲＥ及び１５コピーのロイシンを有する直鎖状コンジュゲートが、市販のアジュバントと同等に有効な、又はそれより大きい免疫応答を誘導することを見出した。本発明者らの完全に明確な、アジュバントを含まない単一分子系ワクチンは、ＧＡＳ細菌を死滅させることができる抗体の産生を誘導した。
緒言
ワクチン接種は感染性疾患を制御及び予防するための最も有効な戦略であるので、ワクチンの発見は、人類の歴史における重要なマイルストーンとみなされている［１、２］。分子生物学、化学及び免疫学の発展と並行して、ワクチンは、過去２００年間にわたり顕著な変化を受けてきた。弱毒化又は死滅した全生物に依存する代わりに、現在の研究は、高度に精製され、より安全であるサブユニットワクチンの開発により焦点を当てている。サブユニットワクチンは、病原体の必須の抗原部分（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物等）のみを含有し、従って、生物学的不純物を全く含有しないか、又はわずかしか含まず、アレルギー応答又は自己免疫応答を誘導する機会が低い［３、４］。しかしながら、最小抗原成分の使用は、これらのワクチンの免疫原性が低いことも意味する。この問題に対処するために、アジュバントが補完的免疫賦活剤としてこれらのワクチン製剤に添加されている。現在、すべての市販のサブユニットワクチンは、改善された有効性のためにアジュバント及び／又は送達系を利用する［５～７］。
アジュバントは、天然の病原体関連危険シグナルを模倣して、ヒト自然免疫系による認識を獲得し、かつワクチン抗原と同時投与された場合に特異的適応免疫応答を増強及び／又は調整（改変）する。いくつかのアジュバントがワクチン設計のために市販されているが、それらのほとんどは、あるレベルの毒性を有するか、又は注射部位における局所有害反応（例えば、炎症、発赤、腫脹、疼痛）若しくは全身反応（例えば、倦怠感、発熱、アジュバント関節炎、前部ブドウ膜炎）等の副作用を誘発する可能性がある［５、８］。さらに、これらのアジュバントは、調製プロセスの複雑さ及び高コストのために適用が制限される。それゆえ、新世代のアジュバントに注意が向けられている。ナノ材料としてのナノアジュバントは、概して安全であり、合成及び修飾が容易であり、化学的に明確であることができ、高い免疫賦活能力を有する［９、１０］。
自己組織化両親媒性物質から形成されるナノ粒子は、有望な自己アジュバント特性を有することが示されており［９、１１］、ペプチドワクチン送達においてしばしば使用される［１２～１４］。例えば、疎水性樹状ポリ（ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート）［１５］又はリポアミノ酸（例えば、２－アミノ－Ｄ，Ｌ－ヘキサデカン酸）［１６］は、様々なペプチドベースの抗原にコンジュゲートされており、生成されたコンジュゲートは、マイクロ／ナノ粒子に自己組織化した［１７、１８］。これらの粒子は、取り込まれた抗原に対する強力な免疫応答（体液性及び細胞性の両方）を刺激した［１９～２４］。しかしながら、これらの化合物、とりわけポリアクリレートは、ラセミ体であり、生分解性ではなく、（ポリマーの場合）不明確な数の単位を有するので、潜在的な商業的応用にとって基本的な不都合を有していた。従って、バッチ間のばらつきは、インビトロ及びインビボでのワクチン効力に影響を及ぼす可能性があり、それらを臨床試験に不適切なものにする可能性がある。
最近の研究では、本発明者らは、ポリ（疎水性アミノ酸）（ｐＨＡＡ）を、ペプチド抗原のための完全に明確な有効な自己アジュバント送達系として導入した［２５］。親水性ペプチド抗原にコンジュゲートされる場合、ｐＨＡＡ配列は、ｐＨＡＡ－抗原コンジュゲートの小さいナノ粒子及びナノ粒子の鎖状凝集体（ＣＬＡＮ）への自己組織化を可能にする自己アジュバント部分として機能する。Ａ群レンサ球菌（ＧＡＳ）Ｍタンパク質由来抗原１のポリロイシンへのコンジュゲーションは、コンジュゲート２を生成し（図２６）、これはＣＬＡＮに自己組織化し、マウスにおいて高レベルのオプソニン抗体の産生を誘導した。
免疫応答の質に対するペプチドワクチン成分における空間的配置の重要性は、以前に報告されている［２６～３０］。従って、ｐＨＡＡのアジュバント能力を最適化するために、本発明者らは、（ｉ）ＧＡＳ Ｍタンパク質由来の保存されたＢ細胞エピトープＪ８（ＱＡＥＤＫＶＫＱＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＫＱＬＥＤＫＶＱ；配列番号９）［３１］、（ｉｉ）ユニバーサルＴヘルパー細胞エピトープ（汎ＨＬＡ ＤＲ結合エピトープ、ＰＡＤＲＥ：ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；配列番号７）［３２］、及び（ｉｉｉ）異なる空間配置でコンジュゲートされたポリロイシン部分（図２６ｂ）から構成されるワクチン構築物を設計した。ＰＡＤＲＥは、体液性免疫応答の質及び寿命を増強するために一般に使用される［３２］。Ｊ８及びＰＡＤＲＥの両方が臨床試験で試験されており、一貫した安全性プロファイルを有する［３３、３４］。ｐＨＡＡタイプの変動も検討して、ｐＨＡＡ部分のアジュバント活性をさらに最適化した（図２６ｃ）。次いで、ワクチン候補を市販のアジュバントと比較して、それらの有効性を評価した。
材料及び方法
Ｂｏｃ保護ｌ－アミノ酸はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ドイツ、ダルムシュタット）及びＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（オーストラリア、メルボルン）から購入した。１－［６－ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム－３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）もＭｉｍｏｔｏｐｅｓから購入した。アセトニトリル、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノール、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペリジン、ｒｉｎｋ－アミドメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及びフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）は、Ｍｅｒｃｋ（ドイツ、ホーエンブルン）から入手した。Ｒｉｎｋアミドｐ－メチル－ベンズヒドリルアミン塩酸塩（ｐＭＢＨＡ・ＨＣｌ）樹脂（置換：０．５９ｍｍｏｌ／ｇ；１００～２００メッシュ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（米国、ケンタッキー州）から入手した。ＰＢＳはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国、カリフォルニア州）から得た。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＵＱＢＲ）（オーストラリア、クイーンズランド州）から購入した。Ｉｍｊｅｃｔ（商標） ミョウバンアジュバント（水性水酸化アルミニウム及び水酸化マグネシウム）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（オーストラリア、ビクトリア州）から購入した。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩｇＧ－ＨＲＰ）コンジュゲートは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国、カリフォルニア州、テメクラ）から購入した。ＡｄｄａＶａｘ（商標） アジュバント（ＭＦ５９；スクアレン系水中油型ナノエマルション）、ＣＦＡ（非代謝性油（パラフィン油及びモノオレイン酸マンニド）中の熱殺菌結核菌（コバクテリウム・ツベルクローシス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、ＭＰＬＡ－ＳＭ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標） アジュバント（ＡＳ０４；サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）Ｒ５９５リポ多糖由来のモノホスホリルリピドＡ誘導体）、並びにヤギ抗マウスＩｇＡ交差吸着済み二次抗体ＨＲＰ（ＩｇＡ－ＨＲＰ）コンジュゲートはＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（米国、サンディエゴ）から購入した。分析グレードのＴｗｅｅｎ２０は、ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（オーストラリア、クイーンズランド州）から購入した。クロロホルム、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質、ピロカルピン塩酸塩及びすべての他の試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（オーストラリア、ビクトリア州）から購入した。
化合物１～１１の合成。すべてのワクチン候補を、ＣＭＥ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国、ノースカロライナ州）製のＳＰＳ ＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ反応器上で０．１ｍｍｏｌスケールで実施したマイクロ波支援Ｂｏｃ－ＳＰＰＳ（７０℃、２０Ｗ）を用いて、以前に報告された方法［４９］に従って合成した。樹脂（０．１７０ｇ）を秤量し、ＤＭＦ及びＤＩＰＥＡ（６．２当量）中で２時間予備膨潤させた。カップリングサイクルは、Ｂｏｃ基の脱保護（ニートＴＦＡで２分間処理、室温で２回）、ＤＭＦ洗浄、０．５Ｍ ＨＡＴＵ（１．６ｍＬ、４当量）及びＤＩＰＥＡ（０．１８ｍＬ、６．２当量）でのアミノ酸（０．８４ｍｍｏｌ／ｇ、４．２当量）活性化、並びに樹脂へのその二重カップリング（５分及び１０分）を含んでいた。しかしながら、アスパラギン酸は５０℃で１５分間二重に結合させ、Ｂｏｃ－Ｇｌｎ（Ｘａｎ）－ＯＨは、グルタミンの環化を回避するために、ＴＦＡ処理の間に（ＤＭＦの代わりに）ＤＣＭを用いて脱保護した。所望のペプチドが達成されるまで、これらの手順を繰り返した。最終アミノ酸の添加後、アセチル化溶液（９０％ＤＭＦ、５％ＤＩＰＥＡ及び５％無水酢酸）を用いてアセチル化を行った。次いで、トリプトファンからのホルミル基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて２分間、次いで５分間除去した。生成したペプチド樹脂をＤＭＦ（３×）、ＤＣＭ（３×）及びメタノール（１×）で洗浄した後、デシケーター中で一晩乾燥させた。
乾燥後、ペプチドを、無水フッ化水素（ＨＦ）及びスカベンジャーとしてのｐ－クレゾールを用いて樹脂から切断した。ペプチド１～１１を沈殿させ、それぞれ親水性及び疎水性化合物について、冷ジエチルエーテル又は冷ジエチルエーテル：ｎ－ヘキサン（１：１）で洗浄した。次いで、沈殿した化合物を、溶媒Ａ（１００％ミリＱ水、０．１％ＴＦＡ）及び溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％ミリＱ水、０．１％ＴＦＡ）を１：１の比で用いて、又は親水性及び疎水性化合物についてそれぞれ純粋な溶媒Ａ若しくは溶媒Ｂを用いて溶解し、次いで濾過した。化合物を、島津製作所分取逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ；日本、京都）装置（ＬＣ－２０ＡＰ×２、ＣＢＭ－２０Ａ、ＳＰＤ－２０Ａ、ＦＲＣ－１０Ａ）を用いて、Ｃ１８（２１８ＴＰ１０２２；１０μｍ、２２×２５０ｍｍ）カラム、Ｃ８（２０８ＴＰ５４；５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）カラム又はＣ４（２１４ＴＰ１０２２；１０μｍ、２２×２５０ｍｍ）カラムで、２０．０ｍＬ／分の流量で２５分間の溶媒Ｂ勾配（各化合物について特有の勾配）を用いて、２１４ｎｍで化合物を検出して精製した。すべての化合物の純度（＞９５％）を、Ｃ１８（２１８ＴＰ５４；５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）、Ｃ８（２０８ＴＰ５４；５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）又はＣ４（２１４ＴＰ５４；５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）Ｖｙｄａｃカラムでの、４０分間の溶媒Ｂの０～１００％勾配を用いた、２１４ｎｍでの化合物検出を用いた分析用ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて決定した。ＥＳＩ－ＭＳは、ＬＣＭＳ－２０２０島津製作所（日本、京都）の装置（ＤＧＵ－２０Ａ３、ＬＣ－２０Ａｄ×２、ＳＩＬ－２０ＡＨＴ、ＳＴＯ－２０Ａ）及びＡｎａｌｙｓｔ １．４ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ、カナダ、トロント）（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ－Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ３０００）で行った。分析用ＲＰ－ＨＰＬＣは、島津製作所（日本、京都）の装置（ＤＧＵ－２０Ａ５、ＬＣ－２０ＡＢ、ＳＩＬ－２０ＡＣＨＴ、ＳＰＤ－Ｍ１０ＡＶＰ）で行った。
化合物１ 収率：１８％。純度：９９％。分子量：４６５３．４２ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １５５２．４（計算値：１５５２．１）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １１６４．３（ｃａｌｃｄ：１１６４．４）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ９３１．７（計算値：９３１．７）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ７７６．６（計算値：７７６．６）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ６６５．９（計算値：６６５．８）。Ｒｔ：２５．０分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ１８カラム）。
化合物２ 収率：１８％。純度：９８％：分子量：６５２１．０３ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １６３１．０（計算値：１６３１．３）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １３０５．３（計算値：１３０５．２）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０８７．６（計算値：１０８７．８）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ９３２．５（計算値：９３２．６）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ８１６．２（計算値：８１６．１）。Ｒｔ：２６．９分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物３ 収率：２０％。純度：９８％。分子量：６４７９．００ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １６２０．７（計算値：１６２０．８）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １２９６．９（計算値：１２９６．８）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０８１．０（計算値：１０８０．８）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ９２６．６（計算値：９２６．６）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ８１０．９（計算値：８１０．９）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ７２１．４（計算値：７２０．９）。Ｒｔ：３８．２分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物４ 収率：１６％。純度：９８％。分子量：６４７９．００ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １６２０．５（計算値：１６２０．８）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １２９６．９（計算値：１２９６．８）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０８１．０（計算値：１０８０．８）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ９２６．６（計算値：９２６．６）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ８１１．２（計算値：８１０．９）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ７２１．５（計算値：７２０．９）。Ｒｔ：２９．１分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物５ 収率：１７％。純度：９７％。分子量：６３５０．８２ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １２７２．０（計算値：１２７１．２）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０６０．０（計算値：１０５９．５）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ９０９．０（計算値：９０８．３）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ７９５．０（計算値：７９４．９）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ７０７．０（計算値：７０６．７）、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ ｍ／ｚ ６３６．０（計算値：６３６．１）。Ｒｔ：３８．６分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物６ 収率：１３％。純度：９５％。分子量：５５０９．２０ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １３７９．０（計算値：１３７８．３）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １１０３．０（計算値：１１０２．８）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ９１９．０（計算値：９１９．２）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ７８８．０（計算値：７８８．０）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ６９０．０（計算値：６８９．７）。Ｒｔ：２４．０分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物７ 収率：１０％。純度：９６％。分子量：５７１９．６１ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １１４５．０（計算値：１１４４．９）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ９５５．０（計算値：９５４．３）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ８１８．０（計算値：８１８．１）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ７１６．０（計算値：７１６．０）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ６３７．０（計算値：６３６．５）。Ｒｔ：２４．９分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物８ 収率：１８％。純度：９９％。分子量：６１１０．１８ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １２２３．０（計算値：１２２３．０）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０１９．０（計算値：１０１９．４）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ８７４．０（計算値：８７３．９）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ７６５．０（計算値：７６４．８）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ６８０．０（計算値：６７９．９）、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋ ｍ／ｚ ６１２．０（計算値：６１２．０）。Ｒｔ：２２．４分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物９ 収率：２０％。純度：９９％。分子量：６５９０．１５ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １６４８．５（計算値：１６４８．５）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １３１９．２（計算値：１３１９．０）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０９９．４（計算値：１０９９．４）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ９４２．５（計算値：９４２．５）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ８２４．９（計算値：８２４．８）。Ｒｔ：１８．７分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物１０ 収率：１６％。純度：９６％。分子量：５９５９．５９ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １１９３．０（計算値：１１９２．９）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ９９５．０（計算値：９９４．３）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ８５３．０（計算値：８５２．４）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ７４６．０（計算値：７４６．０）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ６６３．０（計算値：６６３．２）。Ｒｔ：２３．９分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ４カラム）。
化合物１１ 収率：１９％。純度：９７％。分子量：６３１０．５０ｇ／ｍｏｌ。ＥＳＩ－ＭＳ：［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １２６３．０（計算値：１２６３．１）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ １０５３．０（計算値：１０５２．８）、［Ｍ＋７Ｈ］７＋ ｍ／ｚ ９０３．０（計算値：９０２．５）、［Ｍ＋８Ｈ］８＋ ｍ／ｚ ７９０．０（計算値：７８９．８）、［Ｍ＋９Ｈ］９＋ ｍ／ｚ ７０３．０（計算値：７０２．２）。Ｒｔ：４５．５分（０～１００％溶媒Ｂ、４０分、Ｃ８カラム）。
動的光散乱。個々の化合物１～４（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）及び５～１１（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）を、粒子サイズ（ゼータ強度）及びＰＤＩを測定するためにＤＬＳを使用して分析した。試料を超音波処理で３０分間処理し、次いで使い捨てキュベットに移した。測定は２５℃及び１７３°光散乱で行った。ＤＬＳ測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ａｎａｌｙｓｅｒ ６．２ソフトウェアを備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＰ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、英国）を用いて行った。
透過型電子顕微鏡法。粒子イメージングは、陰性染色を使用して、８０ｋＶで操作されるＪＥＭ－１０１０ ＴＥＭ（ＨＴ７７００ Ｅｘａｌｅｎｓ、日立製作所、日本電子、日本）を使用して撮影した。化合物１～１１の試料（ＤＬＳ分析のために調製した試料の１：２希釈）を、グロー放電炭素被覆銅２００メッシュグリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ）に塗布し、２％ホスホタングステン酸で陰性染色した。
二次構造分析。ペプチドの二次構造を、Ｊａｓｃｏ Ｊ－７１０ ＣＤ分光計（日本分光、日本）を用いて１ｍｍキュベット中で分析した。化合物１及び５～１１（ＰＢＳ中０．２ｍｇ／ｍＬ）を石英キュベットに入れた。ＣＤスペクトルを２３℃で１ｍｍの光路長で測定し、データを５０ｎｍ／分の連続走査速度で１９５～２７５ｎｍの間で収集した。
二次構造含有量の定量分析を、所与の化合物の複合スペクトルを解いて、報告されたポリ－Ｌ－リシンスペクトルから得られた純粋な個々の成分スペクトル、すなわち純粋なαヘリックス、βシート及びランダムコイルの寄与のそれぞれの寄与率を得ることによって、決定方法［５０］に従って測定した。
マウスの皮下免疫化。６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＩＢＮ）のＡｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。あらゆる実験を行う前に、マウスを７日間新しい環境に順化させた。次いで、これらのマウスを、０日目に化合物２～４（５０μＬのＰＢＳ中５０μｇ）で尾の基部で皮下免疫し、続いて２１日目、２８日目及び３５日目に同じ用量を３回追加免疫した（ｎ＝５；図３５；表２ｃ）。陽性対照マウスには、製造業者の指示に従って、１：１の体積比でＣＦＡアジュバントで乳化した化合物１を与えた。陰性対照マウスには５０μＬのＰＢＳを与えた。
Figure 2023510289000015
第２の動物研究について、同様の免疫化スケジュールに従った。化合物１及び５～１１（５０μＬのＰＢＳ中１００μｇ）をマウスの尾に皮下注射した（ｎ＝５；表２ｃ）。マウスに、アジュバント添加対照として、１：１の体積比で市販のアジュバント（ＣＦＡ、ミョウバン、ＭＦ５９及びＡＳ０４）と混合した化合物１を投与した。陰性対照マウスには５０μＬのＰＢＳを与えた。
Figure 2023510289000016
血清及び唾液の収集。血清試料を－１日目（ナイーブ血清）、２０日目、２７日目、３４日目、及び４９日目に採取して、抗原特異的ＩｇＧ抗体価を測定した（図３０）。尾部先端（０日目、２０日目、２７日目及び３４日目に９０μＬのＰＢＳで希釈した１０μＬ）及び心臓穿刺（４９日目に採取した１ｍＬの血液）から血液試料を採取した。この試料を３，６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を上清から回収し、さらなる分析まで－８０℃に保った。
唾液試料を－１日目（ナイーブ唾液）及び４２日目に採取して、Ｊ８特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ抗体価を測定した。５０μＬの０．１％ピロカルピンをマウスに腹腔内投与することによって唾液分泌を誘導した。１００μＬの唾液試料を、１００ｍＭ ＰＭＳＦ溶液（１００ｍＭ、１ｍＬエタノール中の１７．４ｍｇ ＰＭＳＦ）中の２μＬのプロテアーゼ阻害剤中に収集した。唾液試料をさらなる分析まで－８０℃に保った。
ＥＬＩＳＡによる抗体価検出。血清試料及び唾液試料からのそれぞれ抗原特異的抗体ＩｇＧ及びＩｇＡ力価を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して検出した。９６ウェルプレートを５０μｇの抗原Ｊ８又はｐ１４５（ＬＲＲＤＬＤＡＳＲＥＡＫＫＱＶＥＫＡＬＥ；配列番号４０）でコーティングした。１：１００濃度の血清及び１：２濃度の唾液から開始して、０．５％脱脂乳を用いて上記抗原被覆プレート上で２倍連続希釈を行った。ナイーブマウスの血清及び唾液（－１日目の試料）を対照として使用した。希釈した二次抗体（血清については１：３０００ ＩｇＧ－ＨＲＰ、唾液については１：１０００ ＩｇＧ－又はＩｇＡ－ＨＲＰ）をプレートに加えた後、ＯＰＤ基質を加えた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。抗体価は、対照ウェルの平均吸光度を上回る標準偏差の３倍を超える吸光度を有する最低可能希釈として表した。
データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、米国）を用いて分析した。一元配置ＡＮＯＶＡ及びテューキーの多重比較検定を使用して多重比較を実施した。データは、検討した群間で（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００１、及び（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００１で有意に異なるとみなした。
抗体オプソニン化アッセイ。オプソニン化アッセイは、Ｄ３８４０及びＧＣ２２０３ ＧＡＳ臨床分離株を使用して、以前に公開されたように［３９］実施した。細菌を、トッド・ヒューイットブロス（ＴＨＢ）寒天プレート（５％酵母エキスを補充した）上で画線することによって調製し、次いで３７℃で２４時間インキュベートした。各細菌からの単一コロニーを５ｍＬのＴＨＢ（５％酵母エキスを補充した）に移し、３７℃で２４時間インキュベートして、細菌を約４．６×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬまで複製した。この培養物を、ＰＢＳ中で連続希釈（２倍）し、１０μＬのアリコートを、８０μＬのウマ血液と共に、４９日目に採取した１０μＬの熱不活性化血清と混合した。５０℃の水浴中で３０分間加熱することによって血清試料を不活性化した。アッセイは、２つの独立した培養物から重複して行った。細菌を９６ウェルプレート中で３７℃で３時間、血清の存在下でインキュベートした後、１０μＬのアリコートをＴＨＢ寒天プレート（５％酵母エキス及び５％ウマ血液を補充した）上にプレーティングし、３７℃で２４時間インキュベートした。プレートから計数したＣＦＵに基づいて細菌生存率を分析した。抗体血清のオプソニン活性（平均ＣＦＵの減少％）は、［（１－抗体の存在下でのＣＦＵ平均）／ＰＢＳの存在下でのＣＦＵ］×１００％として計算した。
結果
ワクチン候補の調製。抗原１にコンジュゲートしたｐＨＡＡがＧＡＳに対する体液性免疫応答を誘導する能力が最近報告された［２５］。化合物２は、皮下免疫時にマウスにおいて高度にオプソニン性の抗原特異的抗体産生を誘導することができた。ｐＨＡＡ－抗原コンジュゲートの構造活性相関を調べるために、新しいコンジュゲートを設計した。ＰＡＤＲＥユニバーサルＴヘルパーにコンジュゲートしたＧＡＳ Ｂ細胞エピトープＪ８（化合物１）を、１５コピーのロイシンで修飾した。しかしながら、エピトープの配置は、親化合物２と比較して改変した（図２６ｂ）。すなわち、エピトープの直鎖状再編成によって構造を単純化し、化合物３及び４を形成した。化合物５～１０を、異なるタイプのｐＨＡＡとコンジュゲートしたＰＡＤＲＥ及びＪ８エピトープを組み込むように設計して、これらのポリマー単位のアジュバント能力を分析した（図２６ｃ）。化合物１～１１を、マイクロ波支援ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を用いて精製し、その構造及び純度（＞９５％）をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）及び分析ＲＰ－ＨＰＬＣを用いて確認した（図３０）。
ナノ粒子の形成及び分析。個々の化合物１～１１は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で自己組織化してナノ粒子を形成した。化合物の二次構造、粒子サイズ（ゼータ強度）、サイズ分布（ＰＤＩ）及び形態を、円二色性（ＣＤ）分光法、動的光散乱（ＤＬＳ）及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；図２７；表１ｃ；図３１、３２）を用いて特性評価した。ロイシンを含有するペプチドが螺旋構造をとる傾向が示唆されている［３５］。ペプチド抗原１は、それ自体でほとんどランダムコイル立体構造を採ったが、ポリロイシンで修飾されると（５）螺旋状になった［２５］。しかしながら、化合物６～１１におけるように、他のｐＨＡＡのいずれも、１の全体的なランダムコイル立体構造をαヘリックスに向かって有意にシフトさせることができなかった。特に、ポリグルタミン酸（９）は、抗原二次構造に限定的な影響しか及ぼさないか又はまったく影響を及ぼさず、ポリグリシン（６）及びポリセリン（１０）も同様であった（図３２）。アラニン（７）及びフェニルアラニン－ロイシン－アラニン（１１）ベースのコンジュゲートは、１と実質的に同じ立体構造を採った。
化合物１～１１を、ＰＢＳとの単純な混合（ボルテックス）によってナノ粒子に自己組織化させた。概して、化合物２について以前に示されたもの［２５］に匹敵して、上記化合物のほとんどは、ナノ粒子及び凝集体の混合物を形成した。興味深いことに、ペプチド１のＤＬＳ分析も粒子の存在を検出した：主に、ペプチド自体又は小さな凝集体（４ｎｍ）、及びサブミクロンサイズの凝集体（３００ｎｍ）（表１ｃ；図３１）。しかしながら、ＴＥＭ分析では粒子は見えなかった（データは示さず）。分枝状化合物２は、以前に見られたもの［２５］と同様に、ＣＬＡＮに似た目に見える凝集体を有する均等に分布した小さなナノ粒子（１０～２０ｎｍ）を形成した（ＴＥＭによる；図２７）。直鎖構造へのエピトープ再編成は、ある程度までコンジュゲート自己組織化に影響を及ぼした。直鎖状化合物３は分枝状化合物２と同様のＣＬＡＮを形成したが、化合物４は、ＴＥＭ像によればサイズが１００～３５０ｎｍ（図２７）及びＤＬＳ分析によれば５００ｎｍ（表１ｃ；図３１）の古典的なナノ粒子の球状凝集体に自己組織化した。化合物５は、化合物３の類似体として合成し、ＰＡＤＲＥとＪ８との間の余分の分岐リシンは排除した。リシンの欠失は粒子サイズに影響を及ぼさず、化合物３と比較して同一のＣＬＡＮが形成された。対照的に、５中のポリロイシンをポリグリシンで置換すると（６）、ナノ粒子（２０～３０ｎｍ）と並んで細長い棒状物（又は短いフィブリル）の形成がもたらされたが、ポリアラニン（７）は、ＴＥＭを通して見える見かけのＣＬＡＮがより少ないナノ粒子凝集体に自己組織化した。ポリプロリン－コンジュゲート８の自己組織化は、ＴＥＭによると小さなナノ粒子（２０～３０ｎｍ）の形成を誘導し、これはＤＬＳ（４００ｎｍ）によって凝集体として検出された。化合物９を形成するためのポリグルタミン酸のペプチド抗原１へのコンジュゲーションは、ペプチド抗原の水溶性又は多分散性を変化させなかった。化合物９のＤＬＳ分析は、凝集体（４０ｎｍ及び２３０ｎｍ）を伴うペプチド自体である可能性が最も高いもの（６ｎｍ）を検出したが、この凝集体はＴＥＭでは見えなかった（データは示さず）。ポリセリンを含有する化合物１０及びフェニルアラニン－ロイシン－アラニンｐＨＡＡの５反復を含有する化合物（１１）の自己組織化は、５と同様のＣＬＡＮを形成した。全体として、化合物５～１１は、凝集した小さなナノ粒子を形成した。
コンジュゲートの免疫学的評価。一次－追加ワクチン接種戦略を用いて、ポリＨＡＡ－抗原コンジュゲートの免疫学的評価をＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて行った。陰性対照マウスをＰＢＳで処置した。
コンジュゲート２～４（エピトープ配置の影響）。マウスを、化合物１＋完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；陽性対照）及び個々の化合物２～４で皮下免疫した。コンジュゲート３は、一次免疫後に有意な免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）力価を誘導し、すべてのワクチンコンジュゲートは、最終追加免疫後にＪ８特異的ＩｇＧ抗体の産生を誘導することができた（図２８）。コンジュゲート３は、各免疫化後に、以前に特定されたリードワクチン候補（２）［２５］よりも高い抗体価を生成した。化合物２及び化合物４によって誘導された抗体価の間に有意差はなかった。
コンジュゲート５～１１（ｐＨＡＡ種の影響）。マウスを、ペプチドエピトープ１、アジュバント添加対照としての異なるアジュバント（ＣＦＡ、Ｉｍｊｅｃｔ（商標）（ミョウバン）、ＡｄｄａＶａｘ（商標）（ＭＦ５９）、ＭＰＬＡ－ＳＭ ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ（商標）（ＡＳ０４））と組み合わせた１、及び個々の化合物５～１１で皮下免疫した。血清試料及び唾液試料を、Ｊ８及び天然Ｍタンパク質断片ｐ１４５に対する抗体の存在について、並びにＧＡＳをオプソニン化するそれらの能力について分析した。上記ワクチンコンジュゲートのすべては、最初の追加免疫の後でさえ、有意なＪ８特異的ＩｇＧ免疫応答を誘導することができた（図２９ａ）。ヒト用の市販のアジュバント（ミョウバン、ＭＦ５９及びＡＳ０４）でアジュバント添加した化合物１は、一次免疫化後に有意なＪ８特異的ＩｇＧ力価の産生を誘発した。実験室の「至適基準」ＣＦＡアジュバントは、さらにより強力であった。しかしながら、それは、１匹の死亡マウスをもたらす毒性副作用も引き起こした。化合物５は、３回目の追加免疫後に、他のｐＨＡＡコンジュゲートのいずれよりも有意に高いＩｇＧ抗体価を誘導した。第１の追加免疫後に化合物５によって誘導された抗体産生は、ＣＦＡアジュバント添加抗原よりも弱かったが、他の市販のアジュバントに匹敵した。第２の追加免疫後、化合物５によって誘導された抗体価はＣＦＡ及びＭＦ５９と同様であり、ミョウバン及びＡＳ０４よりも高かった。化合物６～１１は、Ｊ８特異的ＩｇＧ免疫応答の誘導においてあまり有効ではなく、これらの応答は、３回目の追加免疫の後でさえ、抗原１自体によって誘導されるものよりも有意に高くなかった。
唾液におけるＪ８特異的ＩｇＧ抗体の産生も試験した。唾液ＩｇＧは、１＋ＣＦＡ、１＋ＭＦ５９及び５で免疫したマウスにのみ存在した（図２９ｂ）。対照的に、ワクチン候補又は対照のいずれも、皮下免疫化時に唾液中でＪ８特異的免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体の産生を誘導することができなかった（データは示さず）。化合物５～１１で免疫したマウスによって産生された抗体がＭタンパク質の天然断片（ｐ１４５）を認識する能力も調べた（図３３）。化合物５及びアジュバント添加化合物１は、有意なｐ１４５特異的ＩｇＧ抗体の産生を誘導することもできた（ｐ＜０．０００１）。しかしながら、化合物６～１１及び抗原１単独での免疫化後に産生された抗体は、ｐ１４５を認識する効率が低かったか、又はｐ１４５を認識することがまったくできなかった。最後に、産生された抗体の質をさらに調べるために、殺菌アッセイを実施した（図２９ｃ）。１＋ＣＦＡ、１＋ＭＦ５９及び５で免疫したマウスの血清のみが、ＧＡＳ細菌を死滅させる能力を有していた。
考察
ＧＡＳは、最も有害なヒト病原体の１つである。ＧＡＳは身体のあらゆる部分に侵入することができ、軽度感染（例えば、レンサ球菌性咽頭炎、猩紅熱、膿痂疹）から侵襲性感染（例えば壊死性筋膜炎、毒性ショック症候群）及び致死的なレンサ球菌感染後の後遺症（例えば、急性リウマチ熱、リウマチ性熱疾患、急性糸球体腎炎、菌血症、肺炎）に及ぶ多種多様なヒト疾患の原因である［３６］。Ｍタンパク質は、ＧＡＳの主要病原因子であり、ワクチン開発の主な標的である。しかしながら、Ｍタンパク質は、ＧＡＳ感染の間の自己免疫応答の誘導に関与する主要な因子の１つであるとも考えられる。それゆえ、ＧＡＳワクチン開発は、ペプチド抗原に焦点を当てている［３６］。実際、臨床試験に到達したすべてのＧＡＳワクチン候補は、Ｍタンパク質由来ペプチド抗原に基づく。Ｍタンパク質保存Ｃ反復領域の断片、ｐ１４５ペプチドが、最初にＧＡＳワクチン設計に使用された。しかしながら、このエピトープは、ヒト心臓組織に対するその部分的類似性に起因して［３１］、後にキメラＪ８抗原に修飾され、これは、以来、臨床試験において安全であることが実証されている［３３］。このワクチンは、ジフテリアトキソイド担体タンパク質とＪ８との間のコンジュゲートとして設計され、ミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、２％水酸化アルミニウム）でアジュバント添加された。残念ながら、大量の産生された抗体は、ＧＡＳ抗原ではなく担体タンパク質に向けられた。このような望ましくない免疫応答を回避するために、担体タンパク質はユニバーサルＴヘルパー（例えば、ＰＡＤＲＥ）で置き換えられてもよいが、その後、適切なアジュバント又は／及び送達系を組み込む必要がある［３７］。
実験用アジュバント（例えばＣＦＡ、コレラ毒素、リピドＡ）及び臨床用アジュバント（例えばアルミニウム塩、ＭＦ５９エマルション、モノホスホリルリピドＡベースのＡＳ０４）を含むいくつかのアジュバントが市場で入手可能であるが、それらはかなり毒性があるか、効果がないか、又は特定のワクチン製剤についてのみ承認されているかのいずれかである。それらは高価でもある。それゆえ、ペプチド等の弱い抗原分子に対する防御応答を誘導することができる新しいアジュバントが依然として必要とされている。様々なそのようなアジュバント及びワクチン送達系が調べられている。これらの多くは、抗原とコンジュゲーションすればはるかに有効であることが証明されている。このようなコンジュゲートは、疎水性単位及び親水性ペプチド抗原から構築されることが多く、それゆえ、自己組織化して免疫賦活性ナノ粒子を生成することができる両親媒性物質を形成する［１２］。ワクチン開発におけるこれらの疎水性成分及びナノ粒子の広範な使用にもかかわらず、それらは（組成、立体化学又は使用されるモノマーの数に関して）完全に明確ではなく［１７］、完全に安全というわけではない。このことは、それらの商業的応用に深刻な制限を課し、これは、高い免疫原性、再現性、低い毒性、改善された安定性、生分解性、及び生体適合性を伴う、より良好な安全性プロファイルを提供する、ペプチドベースのサブユニットワクチンのための新規アジュバントに対する要求が依然として存在することを意味する。
本発明者らは最近、完全に明確な光学的に純粋な天然ｐＨＡＡが、ナノ粒子及びＣＬＡＮへの自己組織化のために抗原にコンジュゲートできることを報告した。その最初の研究では、異なる長さ（ＨＡＡコピー数）を有する試験したｐＨＡＡ（ポリバリン、ポリフェニルアラニン及びポリロイシン）のうち、１５コピーのロイシンが、ＧＡＳ感染に対する防御免疫応答を誘導するために最も有効な系を形成した［２５］。本研究では、種々のｐＨＡＡをペプチド抗原（Ｊ８及びＰＡＤＲＥ）に種々の配置でコンジュゲートさせて、送達系のアジュバント特性を更に最適化した。第１の化合物ミニシリーズにおいて、ｐＨＡＡ抗原コンジュゲートを、ナノ粒子を形成して免疫応答を刺激するコンジュゲート（２～４；図２６ｂ）の能力に対するｐＨＡＡ及びエピトープの構造配置の影響を調べるように設計した。
化合物３で免疫したマウスは、以前に研究された分枝状化合物２で免疫したマウスと比較して、一次免疫からより高いＪ８特異的全身性ＩｇＧ力価を産生することができた（図２８）。化合物３によって刺激されたより高い抗体価は、粒子サイズ又は形態に関連しなかった。というのも、分枝状化合物２及び直鎖状化合物３の両方が、同様のサイズ及び均等に分布したＣＬＡＮを有する明確なナノ粒子を形成したからである（図２７；図３１；表１ｃ）。代わりに、コンジュゲートの有効性は、親水性成分（Ｊ８）及び疎水性成分（ポリロイシン）がコンジュゲートの両方の末端に位置する、両親媒性構造の配列と相関していた。Ｂ細胞エピトープの末端位置は、免疫細胞へのより良好な曝露及び提示を可能にする可能性が最も高い。エピトープの配置は、形成された粒子の類似性にもかかわらず、免疫応答に大きい影響を有することが以前に見出されている［２６］。しかしながら、４の凝集挙動が２及び３の凝集挙動と異なっていた（図２７）ため、凝集挙動も考慮に入れる必要がある。
ｐＨＡＡ系の有効性をさらに調べるために、第１の研究から最も有望な化合物（４）を、様々なアミノ酸（疎水性アミノ酸：ロイシン、グリシン、アラニン、プロリン；酸性アミノ酸：グルタミン酸；親水性非荷電アミノ酸：セリン；及び疎水性アミノ酸の混合物：フェニルアラニン－ロイシン－アラニン；図２６ｃ）のポリマーを有するコンジュゲート、並びに実験的な「至適基準」アジュバント（ＣＦＡ）及び臨床試験されたアジュバント（ミョウバン、ＭＦ５９及びＡＳ０４）と比較した。全体として、ｐＨＡＡコンジュゲート（５～１１）のすべては、抗原１のみを含めて、Ｊ８特異的抗体価の産生を誘導することができた（図２９）。抗体産生を誘導する１の能力は、ＤＬＳ（表１ｃ；図３１）によって検出されるがＴＥＭによっては検出されない（データは示さず）、自己組織化するその能力（限定はされるが）によって説明することができる。化合物１は、高度に親水性のＪ８エピトープ及び比較的疎水性のＰＡＤＲＥエピトープから構築された弱両親媒性物質であった。１の低い凝集能力は、低い抗体価をもたらすか、又は抗体価をもたらさず（Ｊ８特異的及びｐ１４５特異的血清ＩｇＧ並びにＪ８特異的唾液ＩｇＧ；図２９；図３３）、その結果、マウス血清からのオプソニン化能の欠如をもたらした（図２９ｃ）。体液性免疫を刺激する同様の能力が、１と同じランダムコイル二次構造を有し（図３２ｂ）、ＰＢＳ中で優勢なナノ粒子を形成することができなかった（図３１；表１ｃ；ＴＥＭデータは示さず）化合物９から見られたが、これは、ポリグルタミン酸の親水性が、４．６を超えるｐＨで構造的凝集を防止する静電反発を形成したためである［３８］。ポリグルタミン酸－抗原コンジュゲートが追加のアジュバントの存在なしに有意な抗体価を刺激できないことも以前に報告された［３９］。
興味深いことに、自己組織化／凝集効力の違いは、コンジュゲート５と比較した場合、他の化合物の低い免疫賦活効力を説明できなかった。１５コピーのロイシンの１（５）へのコンジュゲーションは、ＰＢＳ中でＣＬＡＮに凝集した小さなナノ粒子の形成を誘導することが示されている（図２７）。疎水性アミノ酸アラニン（７）及びプロリン（８）、親水性非荷電アミノ酸セリン（１０）並びに疎水性アミノ酸の混合物（フェニルアラニン－ロイシン－アラニン；１１）の添加は、５と同様のナノ粒子パターンを示した。ポリセリンの、（その親水性にもかかわらず）他のペプチドにコンジュゲートされると凝集を引き起こす能力は、以前に報告されている［４０］。対照的に、ポリグリシン－コンジュゲート６は、わずかに大きいナノ粒子を形成し、これは、あまり明確ではないＣＬＡＮ及び長い棒状ナノ粒子に凝集した。ポリグリシン（９コピー超）は、細長い棒状物を形成する傾向を有することが報告された［４１］。それにもかかわらず、示された類似性及び相違にもかかわらず、コンジュゲート６～１１は、抗原１よりも高い抗体価をなお刺激しなかった（図２９ａ）。
Ｇｏｏｄ及び共同研究者らは、ペプチドエピトープのわずかな修飾でさえも立体構造及び免疫原性に大きく影響しうることを示した［４２］。Ｊ８はＭタンパク質の螺旋状立体構造を模倣すると予想されるので、本発明者らは、コンジュゲートの立体構造に対するｐＨＡＡの影響を調べた。ポリロイシン（５）は、すべての化合物の中で最も高い程度のαヘリシティを誘導した（図３２ａ）。予想通り、ポリグリシンは抗原１の立体構造に影響を及ぼさなかった（６；図３２ｂ）。しかし驚くべきことに、１６残基アラニンベースのペプチドが、アラニンの高いヘリックス形成能に起因して安定なαヘリックス形成を有することが以前に示されている［４３、４４］にもかかわらず、アラニンも影響を及ぼさなかった（図３２ａ）。代わりに、コンジュゲート７は、αヘリックス及びβシートの混合物を示し、ポリアラニンベースのペプチドがαヘリックスからβプリーツシート構造への立体構造変換を形成することを示した他の研究［４５、４６］と合致した。他方、ポリプロリンコンジュゲート（８）は、ポリプロリンＩＩ立体構造（２３０ｎｍ付近の特性吸収極小の欠如による）［４７］ではなく、ランダムコイルを採った（図３２ａ）。同様に、化合物９～１１は、主にランダムコイル立体構造を採った（図３２）。これは、粒子形成及び立体構造の両方がｐＨＡＡのアジュバント能力において重要な役割を果たすことを示唆する。最終的に、ポリロイシンは、試験したポリ（アミノ酸）配列の中で最も効果的であることが見出された。この系の有効性をさらに調べるために、コンジュゲート５を市販のアジュバントと比較した。
アジュバント添加化合物１及びポリロイシン－コンジュゲート５は、Ｊ８及びｐ１４５の両方に対する抗体応答を誘導することができた（それぞれ図２９ａ及び図３３）。化合物５は、すべての市販のアジュバントと同様に、ＰＢＳと比較して、第１の免疫化後にマウスにおいて有意なレベルの抗体価を誘導した。第２の追加免疫後、５によって刺激されたＩｇＧ力価は、「至適基準」アジュバントＣＦＡ及び最良性能のヒト用アジュバントＭＦ５９によって誘導されたものと同等であった。しかしながら、ＣＦＡ免疫群の１匹のマウスがアジュバント毒性のために死亡したことは注目に値する。ＣＦＡ免疫化後の腫脹、注射部位での壊死、及びマウスの身体活動の低下も観察された。対照的に、他の免疫化群では有害作用は全く検出されなかった。毒性ＣＦＡを除外すると、ｐＨＡＡ系は、単回追加免疫後のマウスにおける抗体産生の誘導において、市販のアジュバントと少なくとも同程度に有効であった。
試験したすべての化合物及びアジュバントの中で、ポリロイシンコンジュゲート５、ＣＦＡアジュバント添加抗原及びＭＦ５９アジュバント添加抗原のみが唾液中で粘膜ＩｇＧの産生を誘導することができた（図２９ｂ）。重要なことに、１＋ＣＦＡ、１＋ＭＦ５９及び５で免疫したマウスの血清中に存在する抗体のみが、オプソニン化実験においてＧＡＳ細菌を死滅させるのに充分な量及び質であった（図２９ｃ）。興味深いことに、１＋ミョウバン及び１＋ＡＳ０４によって生成された比較的高い抗体価にもかかわらず、これらの抗体はＧＡＳに対してオプソニン性ではなく、これは、アジュバントとしてのポリロイシンの能力をさらに実証した。高い抗体価は、高いオプソニン化能力と必ずしも相関しないことが以前に示されている［４８］。対照的に、本発明者らは、血清の高いオプソニン能力が、ＧＡＳで抗原接種したマウスにおける効率的な細菌クリアランスと直接相関することを実証した［２５］。特に、コンジュゲート５は、ポリロイシンに対する抗体の産生を誘導しなかった（図３４）。従って、ポリロイシンベースの自己アジュバント性ナノ粒子系は、すべての試験したポリ（アミノ酸）及び、同様の有効性を示した高価なアジュバントＭＦ５９を除いた、市販のアジュバントと比較して、プライムワクチン送達戦略であると判断された。
結び
本研究は、ＧＡＳに対するｐＨＡＡベースのワクチン候補の合成、特性評価、及び免疫学的評価について報告した。ｐＨＡＡコンジュゲート内のエピトープ配置は、粒子の形態ではなく、有効な免疫応答の生成において最も影響のある因子であると判断された。両親媒性ＰＡＤＲＥエピトープによって分離された疎水性ポリロイシン及び親水性Ｊ８を有する直鎖ワクチン構築物は、マウスにおいてＪ８特異的抗体の産生を、他の配置よりも効果的に誘導した。試験したｐＨＡＡの中で、１５コピーのロイシンを有する螺線状抗原コンジュゲートは、最も強い免疫応答を誘発した（最も高い抗体価及びオプソニン活性）。これらは、ＣＦＡを含む市販のアジュバントに匹敵した。これらの知見は、ワクチン設計のための自己アジュバント性ペプチド成分としてのポリロイシンの顕著な能力を実証する。
実施例６
緒言
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって引き起こされるＣＯＶＩＤ－１９パンデミックは、２０１９年後半のその発生以来、主要な世界的健康及び経済的災害を引き起こした［１、２］。数百ものワクチン候補が製造され、そのうちの５０を超えるワクチン候補が２０２０年の終わりまでに臨床試験に入っている［３］。しかしながら、それらのうちのいくつかは有効であるようであるが、ほとんどは深刻な副作用を有する可能性があり、極端な温度での輸送及び貯蔵条件を必要とする可能性がある［４～６］。
ＣＯＶＩＤ－１９感染は、感染患者による呼気から生じる汚染エアロゾルの吸入によって生じる［７］。吸入又は他の粘膜接触後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのスパイクタンパク質（ＳＡＲＳ－２－Ｓ）を介して、ＩＩ型肺胞上皮細胞、心筋細胞、腸細胞、腎細胞、及びマクロファージを含むヒト細胞によって発現されるアンジオテンシン変換酵素－２（ＡＣＥ２）に結合する。この結合は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が宿主細胞と融合することを可能にする［８］。次いで、ウイルスＲＮＡがポリタンパク質前駆体に翻訳され、これはさらに切断されて、ウイルスの複製を可能にする機能的な構造タンパク質及び非構造タンパク質を生じる［９］。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の回復期患者の血清において、９０％の抗体がスパイクタンパク質に対して生成され、「中和」抗体の９０％がスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対して向けられる［１０～１３］。これらの体液性免疫応答は、感染に対する防御を発達させるのに重要であることが見出された。残念ながら、ＳＡＲＳ－２－Ｓ又はＲＢＤを含むか又はコードするワクチンの使用は、自然感染後に起こるものと同様の免疫病理学的炎症誘発性応答のリスクに関連する［１４～１７］。さらに、抗Ｓタンパク質抗体のいくつかは、宿主細胞へのウイルス侵入を増強し、ウイルスに対して防御する代わりに感染を促進する可能性がある［１８、１９］。
ウイルスベース、タンパク質ベース及びＲＮＡベースのワクチンの欠点を回避するために、ＲＢＤ由来の最小エピトープをワクチン設計のために選択することができる。中和するエピトープベースのワクチンは、望ましくない免疫反応を引き起こすことなくヒト細胞へのウイルス侵入を防止する抗体を生成し、それゆえ安全性を損なうことなく有効性を保持する。しかしながら、そのようなペプチドベースのワクチンは、適切な送達系及び／又はアジュバントを必要とする［２０～２２］。
公知のＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープ［１２、１９、２３～２６］に基づいて設計された５つの有望なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープの配列は、以下の通りである。
ＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧ（Ｓ６２３～６３９、Ｂ１；配列番号１５）、
ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ（Ｓ４６９～５０８、Ｂ２；配列番号１６）、
ＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（Ｓ４４５～４８３、Ｂ３；配列番号１７）、
ＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴ（Ｓ５５９～５７２、Ｂ４；配列番号１８）、及び
ＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶ（Ｓ３６６～３９５、Ｂ５；配列番号１９）。
まず、抗体産生を誘導するエピトープの能力を、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）との同時投与時に調べた。次いで、最も有効なエピトープをポリロイシン部分で修飾し、リポソームに製剤化した。この製剤を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける抗ＲＢＤ抗体産生について調べた。産生された抗体を、ＲＢＤとＡＣＥ２との間の結合をインビトロで阻害するそれらの能力について試験した。
実験
Ｂ１～Ｂ５の合成及び精製
ペプチドＢ１～Ｂ５は、ＳＰＳモデルＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ反応器を使用するマイクロ波支援標準Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成［２７］によって合成した。簡潔に述べると、ペプチドを、ｒｉｎｋアミドＭＢＨＡ（置換比：０．５１ｍｍｏｌ／ｇ、１９６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌスケール）上で合成した。この樹脂をＮ’Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で一晩膨潤させた。Ｆｍｏｃ基を、２０％ピペリジン／ＤＭＦを用いて７０℃で２分間及び５分間除去した。アミノ酸をＤＭＦ中の０．５Ｍ １－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（４当量、０．８ｍＬ）及びＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５．２当量、９１μＬ）で活性化し、加えて、５分間及び１０分間カップリングさせた。未反応樹脂を無水酢酸、ＤＩＰＥＡ及びＤＭＦ（５：５：９０）で、７０℃で２回（５分及び１０分）アセチル化した。Ｆｍｏｃ脱保護、アミノ酸活性化及び樹脂へのカップリングを、所望のペプチドが達成されるまで繰り返した。完成したペプチドを、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％トリイソプロピルシラン及び２．５％水を用いて樹脂から切断した。この切断カクテルを真空を用いて除去した後、ペプチドを洗浄し、溶解し、濾過し、凍結乾燥した。これらのペプチドを溶媒Ｂ（アセトニトリル／水（５０：５０））に溶解した後、凍結乾燥した。生成物を、３０分にわたる４５～６５％溶媒Ｂの溶媒勾配を用いるＣ１８ Ｖｙｄａｃカラムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。分析用分析は、島津製作所機器（Ｃ１８カラム）を用いて行った。
Ｓ１／Ｓ２切断／プライミング部位におけるＢ１ペプチド（６２３ＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧ６３９）、収率：７５％。分子量：１９５７．１８。ＥＳＩ－ＭＳ、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ ９７９．６（計算値９７９．５）、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ ６５３．５（計算値６５３．３９）。ｔＲ＝１７．９７分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ１８カラム）；純度≧９９％。
ＲＢＤの受容体結合モチーフにおけるＢ２ペプチド（４６９ＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ５０８）、収率：４５％。分子量：４４２５．８。ＥＳＩ－ＭＳ［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １４７６．８（計算値１４７６．２７）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １１０８．０（計算値１１０７．４５）。ｔＲ＝２１．１５分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ１８カラム）；純度≧９９％。
ＲＢＤの受容体結合モチーフにおけるＢ３ペプチド（４４４ＧＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ４８３）。収率：５０％。分子量：４５９３．２。ＥＳＩ－ＭＳ、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １５３２．３（計算値１５３２．０７）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １１４９．１（計算値１１４９．３）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ ９１９．５（計算値９１９．６４）。ｔＲ＝２１．４９分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ１８カラム）；純度≧９９％。
Ｓ１／Ｓ２切断／プライミング部位付近のＢ４ペプチド（５５９ＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴ５７２）。収率：８０％。分子量：１６７５．８ ＥＳＩ－ＭＳ、［Ｍ＋１Ｈ］１＋ ｍ／ｚ １６７６．８（計算値１６７６．８）、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ ８３９．４（計算値８３９．９）、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ ５５９．９（計算値５５９．６）。ｔＲ＝１９．３５分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ１８カラム）；純度≧９９％。
ＡＣＥ２と直接接触していないが受容体結合ドメインのＮＴＤにおけるＢ５ペプチド（３６６ＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶ３９５）。収率：５５％。分子量：３３４８．６． ＥＳＩ－ＭＳ、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ １６７５．２（計算値１６７５．３）、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ １１１７．１（計算値１１１７．２）、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ ８３８．６（計算値８３８．１５）。ｔＲ＝１７．２分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ１８カラム）；純度≧９９％。
（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３及び（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥの合成及び精製
（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３を、１０個のロイシン部分がそのＮ末端にカップリングされ、続いて最終アセチル化された以外は上記のＢ３と同様に合成した。
（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３：（ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＧＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ）。収率：４０％。分子量：５７４７．４０。ＥＳＩ－ＭＳ、［Ｍ＋４Ｈ］４＋ ｍ／ｚ １４３７．２（計算値１４３７．８５）、［Ｍ＋５Ｈ］５＋ ｍ／ｚ １１４９．８（計算値１１５０．４８）、［Ｍ＋６Ｈ］６＋ ｍ／ｚ ９５８．９（計算値９５８．９０）。ｔＲ＝２５．６４分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ４カラム）；純度≧９９％。
（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥを、Ｂ３をユニバーサルＴヘルパーエピトープＰＡＤＲＥ（ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；配列番号７）で置き換えた以外は上記の（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３と同様に合成した。
（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ：収率４５％。分子量：２５２１．２７。ＥＳＩ－ＭＳ、［Ｍ＋２Ｈ］２＋ ｍ／ｚ １２６０．６（計算値１２６１．６４）、［Ｍ＋３Ｈ］３＋ ｍ／ｚ ８４１．０（計算値８４１．４２）。ｔＲ＝３７．１０分（０～１００％溶媒Ｂ；Ｃ４カラム）；純度≧９９％。
リポソーム製剤Ｌ１
ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、臭化ジドデシルジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）及びコレステロールを、それぞれ１ｍＬのクロロホルムに溶解し、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。ＤＰＰＣ（０．５ｍＬ）、ＤＤＡＢ（０．２ｍＬ）及びコレステロール（０．２ｍＬ）を、２ｍＬのクロロホルムを含有する丸底フラスコに添加した。（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ（０．６ｍｇ）及び（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３（０．６ｍｇ）を１ｍＬのメタノールに溶解し、上記フラスコに加えた。次いで、溶媒を、回転蒸発器を用いて減圧下でゆっくりと蒸発させた。すべての残留溶媒を真空下で一晩除去した。脂質薄膜を５６℃で１ｍＬのＰＢＳで徐々に再水和して、Ｌ１中の０．６ｍｇ／ｍＬ濃度の（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ及び０．６ｍｇ／ｍＬ濃度の（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３を生成した。次いで、このリポソームを３回超音波処理した（１０分、４０％出力、５０％パルス）。数によるサイズ分布 約１００ｎｍ；ＰＤＩ＝０．３８；電荷＝１５ｍＶ。
リポソーム製剤Ｌ２
Ｌ２は、０．６ｍｇの代わりに１．２ｍｇの（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３を１ｍＬのメタノールに溶解した以外はＬ１と同じ方法で調製した。従って、Ｌ２中の最終の０．６ｍｇ／ｍＬ濃度の（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ及び１．２ｍｇ／ｍＬ濃度の（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３を生成した。数によるサイズ分布 約１００ｎｍ；ＰＤＩ＝０．５４；電荷＝１６ｍＶ。
マウスにおける皮下免疫（実験１）
６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ’ｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＵＱＢＲ）（オーストラリア、クイーンズランド州）から購入した。マウスをＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＩＢＮ）のＡｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。あらゆる実験を行う前に、マウスを７日間順化させた。すべてのマウス（５匹／群）に、尾部の皮下に１回免疫した。陰性対照マウスには５０μＬのＰＢＳを与え、陽性対照マウスには２５μＬのＰＢＳに溶解し、２５μＬのＣＦＡで乳化したＲＢＤ（３０μｇ）を与えた。ワクチン候補群には、ＰＢＳ（２５μＬ）に溶解し、２５μＬのＣＦＡで乳化した化合物Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４又はＢ５（３０μｇ）を与えた。
血清の採取（実験１）
１４日目に心臓穿刺（１ｍＬ）によって血液を採取した。採取した血液試料を３，６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を上清から回収し、さらなる分析まで－８０℃に保った。
マウスにおける皮下免疫化（実験２）
６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＵＱＢＲ（オーストラリア、クイーンズランド州）から購入した。マウスをＡＩＢＮ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙに収容した。あらゆる実験を行う前に、マウスを７日間順化させた。０日目、１４日目及び２８日目に、すべてのマウス（５匹／群）に、尾部の皮下に３回免疫した。陰性対照マウスには５０μＬのＰＢＳを与え、陽性対照マウスにはＰＢＳ（２５μＬ）に溶解し、２５μＬのＣＦＡで乳化したＲＢＤ（３０μｇ）を与えた。３つの他のマウス群を、ＰＢＳ（２５μＬ）に溶解し、それぞれ２５μＬのＭＦ５９；Ｌ１（５０μＬ）及びＬ２（５０μＬ）で乳化したＢ３（３０μｇ）で免疫した。
血清の採取（実験２）
４１日目に心臓穿刺（１ｍＬ）によって血液を採取した。採取した血液試料を３，６００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を上清から回収し、さらなる分析まで－８０℃に保った。
ＥＬＩＳＡによる抗体価検出
抗原特異的抗体ＩｇＧ力価を、ＥＬＩＳＡを用いて検出した。ポリスチレン高親和性プレートを、ウェルあたり１００μＬの量のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、又はＲＢＤ（ｐＨ９．６、炭酸塩コーティング緩衝液１０ｍＬ中５０μｇ）でコーティングし、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、プレートの内容物を廃棄し、１５０μＬの５％脱脂乳（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液に溶解した）を各ウェルに添加した。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを蒸留水（４×）及びＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液（３×）で洗浄した。２μＬの希釈されていない血清試料を、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液中の０．５％脱脂乳１９８μＬを含有するプレートの第１の列に添加した（１：１００希釈）。すべてのプレートを３７℃のインキュベーター中で９０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ウェルあたり１００μＬの１：３０００希釈ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（０．５％脱脂乳中）を添加した。プレートを３７℃で９０分間インキュベートし、次いで洗浄した。１００μＬ量のｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質を各ウェルに添加した。プレートを暗所で室温にて２０分間インキュベートした後、５０μＬ量の停止溶液（１Ｎ Ｈ２ＳＯ４）をウェル毎に添加した。染色されたＲＢＤ特異的ＩｇＧの吸光度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。
競合ＥＬＩＳＡ試験
血清試料を、いくつかの改変を伴う報告された方法［２８、２９］と同様のアプローチにおいて、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗ＲＢＤ中和抗体について試験した。最初に、９６ウェル高親和性結合ポリスチレンプレートを、陰性対照群（ＰＢＳ免疫化群）及びＡＣＥ２検量線のための２つの追加のプレートを含めて、第１の実験のためにプレートあたり２５μｇのＲＢＤ及び第２の実験のために５μｇを含有する炭酸塩コーティング緩衝液でコーティングした。ウェルプレートに入れたＲＢＤに３７℃で９０分間ウェルをコーティングさせた。プレートを空にし、ウェル内に残っている高親和性部位をブロックするために２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でウェルをコーティングすることによってプレートをブロックし、結合を一晩放置して４℃で結合させた。プレートを空にし、蒸留水（５×）及びＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０緩衝液（４×）で洗浄した。２０μＬ量のニート血清試料を血清プレート（ＰＢＳ群を含む）に添加し、血清を、実験１及び実験２についてそれぞれ１：４及び１：１０希釈から開始し、０．５％ＢＳＡで希釈した。検量線プレートには血清を添加しなかった（０．５％ＢＳＡのみ）。ウェルプレートに入れた抗体（血清中で利用可能）を、ＲＢＤに３７℃で９０分間結合させた。プレートを空にし、（上述のように）洗浄した。ヒトＩｇＧ－Ｆｃにコンジュゲートしたヒトアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ２－Ｆｃ）２０μｇ量（１ｍｇを精製水１ｍＬに溶解）を０．５％ＢＳＡ１０ｍＬと混合し、次いでこの混合物１００μＬを各ウェル（検量線プレートを除く）に添加した。検量線プレートでは、ＡＣＥ２－Ｆｃを２ｎｇ／μＬ（２００ｎｇ／１００μＬ／ウェル）からさらに０．１ｎｇ／μＬ（１０ｎｇ／１００μＬ／ウェル）まで段階希釈した。ウェルプレートに入れたＡＣＥ２－Ｆｃを３７℃で９０分間結合させた。プレートを空にし、（上述のように）洗浄した。希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ－ＨＲＰ二次抗体（１０ｍＬの０．５％ＢＳＡ中の３．３３μＬの抗体）１００μＬをすべてのプレートの各ウェルに添加した。これらの二次抗体をＡＣＥ２－Ｆｃに３７℃で９０分間結合させた。次いで、プレートを空にし、（上述のように）洗浄した。ＯＰＤ基質を調製し、各ウェルあたり１００μＬを添加した。ＯＰＤ溶液を暗所で室温で２０分間反応させた後、５０μＬの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液を各ウェルに加えることによって反応を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダーを用いて測定した。各ウェルにおける結合及び非結合ＡＣＥ２の含有量を決定するために、検量線（第１の実験ではｎ＝４であり、第２の実験ではｎ＝８である）をロジスティック関数（Ｒ２＞０．９８）、式１にフィッティングした。ベストフィット（最良適合）方程式を各ウェルの吸光度（ｙ）値と共に使用して、補間（内挿）により結合ＡＣＥ２含量（ｘ）を決定した。阻害のパーセンテージは、ＡＣＥ２の非結合量のパーセントから、式２で決定される。
Figure 2023510289000017
上記式中、ｙは吸光度読み取り値であり、Ａ１及びＡ２はそれぞれ最小及び最大の吸光度読み取り値であり、ｘは式２で使用される結合ＡＣＥ２濃度の量（ｎｇ／１００μＬ／ウェル）であり、ｘ０はｘ軸（ＡＣＥ２濃度）中心点であり、ｐはべき指数であり、結合ＡＣＥ２の量の変化に伴う吸光度シグナルの変化率を表し、ＡＣＥ２合計は２００ｎｇ／１００μＬ／ウェルである。
この方法の妥当性を、適合性、バイアス及び精度、特異性、感度及び選択性について、よくフィット（適合）した検量線を構築すること、様々な既知のＡＣＥ２濃度に対し無関係な血清を添加すること、並びにＡＣＥ２の不存在下で異なる試験血清に二次抗体を添加することによって検定した。検量線吸光度の読み取り値は、１０～２００ｎｇ／１００μＬ／ウェルの範囲の、すなわち０～９５％の範囲の阻害に対応する無関係の動物血清の存在下で同じままであり、吸光度の読み取り値は、ＡＣＥ２の不存在下及び検量線＜１０ｎｇ／１００μＬ／ウェル内の非常に低いＡＣＥ２濃度において有意ではなかった（ｐ＜０．０５、ｎ＝４）。ＡＣＥ２濃度を調整して、プレート上にコーティングされたＲＢＤ量の飽和を達成した。
結果及び考察
公知のＳＡＲＳ－ＣｏＶエピトープ及びＡＣＥ２－ＲＢＤ決定的結合アミノ酸残基を考慮して、５つの有望なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２エピトープを設計及び合成した（Ｂ１～Ｂ５）。エピトープを、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて「至適基準」実験アジュバント（ＣＦＡ）と同時投与した。このマウスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のＲＢＤ領域に対する抗体の産生に関して調べた（図３６）。予想通り、ＣＦＡでアジュバント添加したＲＢＤは、それ自体に対して高い抗体価を生じた。エピトープ（Ｂ３）は、ＣＦＡと同時投与した場合、ＲＢＤに対する統計的に有意な抗体産生を誘発することができた。Ｂ１の配列はスパイクタンパク質ＲＢＤドメインの外側に位置するので、Ｂ１で免疫したマウスは予想通り抗ＲＢＤ ＩｇＧを生成しなかった。さらに、Ｂ１は、ＥＬＩＳＡによって調べた場合、それ自体に対しても有意な抗体価を生じなかった。
ＲＢＤ群とＢ３群との間の抗体応答の差にもかかわらず、ウイルスＲＢＤとＡＣＥ２との相互作用を阻害する血清の能力はほぼ同じであった（図３７）。すべてのＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｂ３群及びＲＢＤ群の両方）からの血清は、高い血清濃度でＡＣＥ２へのＲＢＤ結合を完全に阻害することができた。３２倍希釈では、５匹のマウスのうち３匹に由来するＲＢＤ血清は阻害能を維持したが、５匹のマウスのうち２匹に由来するＢ３血清は依然としてＲＢＤ結合をブロックする能力を有していた。この結果、Ｂ３をさらなる研究のための有望なエピトープとして選択した。
本発明者らは、ポリロイシン送達系が、試験したポリ（疎水性アミノ酸）系の中で、高い抗体価を生成するのに最も効率的であることを以前に実証した。それゆえ、Ｂ３をポリロイシン単位にコンジュゲートし、（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３を形成した。加えて、ユニバーサルヒトＴヘルパーＰＡＤＲＥ（ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ；配列番号７）もポリロイシン単位にコンジュゲートし、（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥを生成した。ＰＡＤＲＥは、体液性免疫応答の質及び寿命を増強するために一般に使用される［３０］。両方のコンジュゲートを（ポリロイシン部分を介して）リポソームに固定して、ワクチン効力をさらに増強した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を、５０μＬのＬ１（３０μｇの（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ及び３０μｇの（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３を保有する）及びＬ２（３０μｇの（Ｌｅｕ）１０－ＰＡＤＲＥ及び６０μｇの（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３を保有する）で皮下免疫した（図３８）。陽性対照として、ＣＦＡでアジュバント添加したＲＢＤ及びＭＦ５９でアジュバント添加したＢ３＋ＰＡＤＲＥを使用した。両方のワクチン候補は、ＲＢＤに対して高い抗体価を生成し、とりわけＬ２は、すべてのマウスについて陽性対照と同じレベルのＲＢＤ－ＩｇＧを産生した。
ウイルスＲＢＤとＡＣＥ２との相互作用を阻害する血清の能力を、すべての群について試験した：ＰＢＳ、ＣＦＡ＋ＲＢＤ、Ｂ３＋ＰＡＤＲＥ＋ＭＦ５９、Ｌ１及びＬ２（図３９）。しかしながら、第１の実験（図３７）よりも高い血清希釈を用いた。同様の希釈において、ＣＦＡ＋ＲＢＤで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスの血清は、同じアジュバント添加タンパク質断片（ＣＦＡ＋ＲＢＤ）で免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清よりも効果が低いようである。最高血清濃度の他のすべての群は、ほぼすべてのマウス血清について効率的にＲＢＤ／ＡＣＥ２結合を阻害した。しかしながら、希釈１／２０では、この阻害は減少し、１／１００希釈では事実上ゼロに低下した。興味深いことに、抗ＲＢＤ ＩｇＧ力価は、１／１００希釈で測定され、高いＯＤ値を示したが、これは、多数の産生された抗体が、陽性対照群（ＲＢＤ＋ＣＦＡ）においても、ＲＢＤ／ＡＣＥ２結合に対する阻害活性を有さないことを示唆していた。それゆえ、送達系のさらなる改善が必要とされ、これには以下が含まれうる：ａ）ＰＡＤＲＥのＢ３へのコンジュゲーション（Ｂ細胞エピトープへのＴヘルパーのコンジュゲーションは、しばしばワクチン設計に推奨される）；ｂ）Ｂ３の立体構造特性、及び他の疎水性アミノ酸（例えば、βシート誘導性のポリバリン配列）でのポリロイシンの置換によるその修飾の検討；ｃ）リポソーム製剤の最適化；並びにｄ）キャリアタンパク質によるＰＡＤＲＥ Ｔヘルパーの置換。
結び
本発明者らは、有望なペプチド抗原としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のいくつかのペプチド断片を調べた。そのうちＢ３のみが、ＣＦＡと共に投与された場合にスパイクタンパク質のＲＢＤ領域に対して高いＩｇＧ力価を生成した。さらに、これらの抗体は、ＲＢＤ／ＡＣＥ２結合を阻害することができた。リポソーム中でポリロイシンコンジュゲート（（Ｌｅｕ）１０－Ｂ３）として投与されると、この抗原は、高濃度でＲＢＤ／ＡＣＥ２結合を阻害することができる高いＩｇＧ力価を生成することもできた。
参考文献 － 実施例１
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２６． Ｚｈａｏ Ｇ、Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ Ｓ、Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ Ｍ、Ｔｏｔｈ Ｉ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｅｕｒ Ｐｏｌｙｍ Ｊ ９３、６７０－６８１（２０１７）．
２７． Ｎｅｇａｈｄａｒｉｐｏｕｒ Ｍ、Ｇｏｌｋａｒ Ｎ、Ｈａｊｉｇｈａｈｒａｍａｎｉ Ｎ、Ｋｉａｎｐｏｕｒ Ｓ、Ｎｅｚａｆａｔ Ｎ、Ｇｈａｓｅｍｉ Ｙ． Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ ３５、５７５－５９６（２０１７）．
２８． Ｌｉａｏ Ｊら、Ｌｉｎｅａｒ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌ． Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ ２２３、１７７－１８３（２００３）．
２９． Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ ＳＫ、Ｏｇａｗａ Ｋ、Ｕｌｌｍａｎｎ Ｍ． Ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｈａｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒ ｆｉｌｌｅｒｓ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏａｔｉｎｇｓ． Ｐｏｗｄｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ １１８、９０－９６（２００１）．
３０． Ｃｅｌｌａ Ｍ、Ｅｎｇｅｒｉｎｇ Ａ、Ｐｉｎｅｔ Ｖ、Ｐｉｅｔｅｒｓ Ｊ、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｉｍｕｌｉ ｉｎｄｕｃｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３８８、７８２－７８７（１９９７）．
３１． Ｍａ ＤＹ、Ｃｌａｒｋ ＥＡ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４０ ａｎｄ ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ ｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１、２６５－２７２（２００９）．
３２． Ｍｏｙａｎｏ ＤＦら、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ Ｄｉｃｔａｔｅｓ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３４、３９６５－３９６７（２０１２）．
３３． Ｒａｄ－Ｍａｌｅｋｓｈａｈｉ Ｍら、Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ １４、１４８２－１４９３（２０１７）．
参考文献 － 実施例２
［１］ Ｆ．Ｂｒａｙ、Ｊ．Ｆｅｒｌａｙ、Ｉ．Ｓｏｅｒｊｏｍａｔａｒａｍ、Ｒ．Ｌ．Ｓｉｅｇｅｌ、Ｌ．Ａ．Ｔｏｒｒｅ、Ａ．Ｊｅｍａｌ、Ｇｌｏｂａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２０１８：ＧＬＯＢＯＣＡＮ ｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｆｏｒ ３６ ｃａｎｃｅｒｓ ｉｎ １８５ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ，ＣＡ： ａ ｃａｎｃｅｒ ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ６８（６）（２０１８） ３９４－４２４．
［２］ Ｄ．Ｍａｉｎｅ、Ｓ．Ｈｕｒｌｂｕｒｔ、Ｄ．Ｇｒｅｅｓｏｎ、Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ２１ｓｔ ｃｅｎｔｕｒｙ：ｃｏｓｔ ｉｓ ｎｏｔ ｔｈｅ ｏｎｌｙ ｉｓｓｕｅ、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ １０１（９）（２０１１） １５４９－１５５５．
［３］ Ｔ．Ｙ．Ｌｉｕ、Ｗ．Ｍ．Ｈｕｓｓｅｉｎ、Ｉ．Ｔｏｔｈ、Ｍ．Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２（１４）（２０１２） １５８１－９２．
［４］ Ｔ．－Ｙ．Ｌｉｕ、Ｗ．Ｍ．Ｈｕｓｓｅｉｎ、Ｚ．Ｊｉａ、Ｚ．Ｍ．Ｚｉｏｒａ、Ｎ．Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｌｌａｎ、Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｉｒｏ、Ｉ．Ｔｏｔｈ、Ｍ．Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ、Ｓｅｌｆ－Ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １４（８）（２０１３） ２７９８－２８０６．
［５］ Ｓ．Ｇ．Ｒｅｅｄ、Ｓ．Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ、Ｒ．Ｎ．Ｃｏｌｅｒ、Ｍ．Ｆｒｉｅｄｅ、Ｎｅｗ ｈｏｒｉｚｏｎｓ ｉｎ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３０（１）（２００９） ２３－３２．
［６］ Ｒ．Ｊ．Ｎｅｖａｇｉ、Ｉ．Ｔｏｔｈ、Ｍ．Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ、１２ － Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｓ．Ｋｏｕｔｓｏｐｏｕｌｏｓ（編）、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ収載、Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ２０１８、３２７－３５８頁．
［７］ Ｔ．Ｙ．Ｌｉｕ、Ａ．Ｋ．Ｇｉｄｄａｍ、Ｗ．Ｍ．Ｈｕｓｓｅｉｎ、Ｚ．Ｊｉａ、Ｎ．Ａ．ＭｃＭｉｌｌａｎ、Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｉｒｏ、Ｉ．Ｔｏｔｈ、Ｍ．Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ、Ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅ ＣＤ８＋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ １２（１）（２０１５） ３－８．
［８］ Ｔ．－Ｙ．Ｌｉｕ、Ｗ．Ｍ．Ｈｕｓｓｅｉｎ、Ａ．Ｋ．Ｇｉｄｄａｍ、Ｚ．Ｊｉａ、Ｊ．Ｍ．Ｒｅｉｍａｎ、Ｍ．Ｚａｍａｎ、Ｎ．Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｌｌａｎ、Ｍ．Ｆ．Ｇｏｏｄ、Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｉｒｏ、Ｉ．Ｔｏｔｈ、Ｍ．Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ－Ｂａｓｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５８（２）（２０１５） ８８８－８９６．
［９］ Ｗ．Ｍ．Ｈｕｓｓｅｉｎ、Ｔ．Ｙ．Ｌｉｕ、Ｚ．Ｊｉａ、Ｎ．Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｌｌａｎ、Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｉｒｏ、Ｉ．Ｔｏｔｈ、Ｍ．Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ、Ｍｕｌｔｉａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４（１８）（２０１６） ４３７２－４３８０．
［１０］ Ｍ．Ｋｈｏｎｇｋｏｗ、Ｔ．－Ｙ．Ｌｉｕ、Ｓ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｗ．Ｍ．Ｈｕｓｓｅｉｎ、Ｒ．Ｎｅｖａｇｉ、Ｚ．Ｊｉａ、Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｉｒｏ、Ｊ．Ｗ．Ｗｅｌｌｓ、Ｕ．Ｒｕｎｇｓａｒｄｔｈｏｎｇ Ｒｕｋｔａｎｏｎｃｈａｉ、Ｍ．Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ、Ｉ．Ｔｏｔｈ、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｓ ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ １（３）（２０１８） １８３－１９３．
［１１］ Ｙ．Ｇｕｏ、Ｃ．Ｓａｋｏｎｓｉｎｓｉｒｉ、Ｉ．Ｎｅｈｌｍｅｉｅｒ、Ｍ．Ａ．Ｆａｓｃｉｏｎｅ、Ｈ．Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｗａｎｇ、Ｓ．Ｐｏｅｈｌｍａｎｎ、Ｗ．Ｂ．Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、Ｄ．Ｚｈｏｕ、Ｃｏｍｐａｃｔ，Ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ Ｍａｎｎｏｓｅ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ ａｓ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，Ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ＦＲＥＴ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｄ．ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ） ５５（１５）（２０１６） ４７３８－４７４２．
参考文献 － 実施例３
１． Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ａ．Ｗ．；ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｊ．；Ｒｏｓｓｊｏｈｎ，Ｊ． Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｒｅａｓｏｎ ｔｏ ｒｅｔｈｉｎｋ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ． Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２００７、６、４０４－４１４．
２． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６、７、８４２－８５４．
３． Ｎｅｖａｇｉ，Ｒ．Ｊ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ． １２ － Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｏｕｔｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．編収載 Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：２０１８；３２７－３５８頁．
４． Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２、７、１８７７－１８９３．
５． Ａｚｉｚｉ，Ａ．；Ｋｕｍａｒ，Ａ．；Ｄｉａｚ－Ｍｉｔｏｍａ，Ｆ．；Ｍｅｓｔｅｃｋｙ，Ｊ． Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｏｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｏｔｅｎｃｙ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｍ Ｃｅｌｌｓ． ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ２０１０、６、ｅ１００１１４７．
６． Ｍａｒａｓｉｎｉ，Ｎ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０１４、１３、１３６１－７６．
７． Ｌｏｕｋａｓ，Ａ．；Ｈｏｔｅｚ，Ｐ．Ｊ．；Ｄｉｅｍｅｒｔ，Ｄ．；Ｙａｚｄａｎｂａｋｈｓｈ，Ｍ．；ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｊ．Ｓ．；Ｃｏｒｒｅａ－Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｒ．；Ｃｒｏｅｓｅ，Ｊ．；Ｂｅｔｈｏｎｙ，Ｊ．Ｍ． Ｈｏｏｋｗｏｒｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｉｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ ２０１６、２、１６０８８．
８． Ｂｅｔｈｏｎｙ，Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｓ．；Ｘｉａｏ，Ｓ．；Ｚｈａｎ，Ｂ．；Ｌｉ，Ｓ．；Ｘｕｅ，Ｈ．；Ｘｉｎｇ，Ｆ．；Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ，Ｄ．；Ｙａｎ，Ｗ．；Ｃｈｅｎ，Ｇ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｖ．；Ｈａｗｄｏｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｈｏｔｅｚ，Ｐ．Ｊ． Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｈｏｏｋｗｏｒｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｇｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｃａｔｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００２、３５、１３３６－４４．
９． Ｓｅｉｄ，Ｃ．Ａ．；Ｃｕｒｔｉ，Ｅ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｍ．；Ｈｕｄｓｐｅｔｈ，Ｅ．；Ｒｅｚｅｎｄｅ，Ｗ．；Ｐｏｌｌｅｔ，Ｊ．；Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌ．；Ｖｅｒｓｔｅｅｇ，Ｌ．；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｓ．；Ｍｕｓｉｙｃｈｕｋ，Ｋ．；Ｙｕｓｉｂｏｖ，Ｖ．；Ｈｏｔｅｚ，Ｐ．Ｊ．；Ｂｏｔｔａｚｚｉ，Ｍ．Ｅ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ－１（Ｎａ－ＡＰＲ－１（Ｍ７４）） ａｎｔｉｇｅｎ，ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｖａｌｅｎｔ ｈｕｍａｎ ｈｏｏｋｗｏｒｍ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１５、１１、１４７４－１４８８．
１０． Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｄ．Ａ．；Ｔｒｉｂｏｌｅｔ，Ｌ．；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｌ．；Ｍｕｌｖｅｎｎａ，Ｊ．；Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｌ．Ｍ．；Ｂｅｔｈｏｎｙ，Ｊ．Ｍ．；Ｈｏｔｅｚ，Ｐ．Ｊ．；Ｌｏｕｋａｓ，Ａ． Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｏｏｋｗｏｒｍ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎａｓｅ Ｎａ－ＡＰＲ－１：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｏｏｋｗｏｒｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１０、２０１、１５６１－１５６９．
１１． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｄｏｕｇａｌｌ，Ａ．Ｍ．；Ｋｈｏｓｈｎｅｊａｄ，Ｍ．；Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ，Ｓ．；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｌｏｕｋａｓ，Ａ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｏｏｋｗｏｒｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１２、７、ｅ４６８７０－ｅ４６８７０．
１２． Ａｈｍａｄ Ｆｕａａｄ，Ａ．Ａ．Ｈ．；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｄ．Ａ．；Ｂｅｃｋｅｒ，Ｌ．；Ｚｈａｏ，Ｇ．；Ｌｏｕｋａｓ，Ａ．Ｃ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｏｏｋｗｏｒｍ Ｐａｒａｓｉｔｅ． ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ２０１５、１０、１６４７－１６５４．
１３． Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ｋ．；Ｅｂｅｎｓｅｎ，Ｔ．；Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ，Ｓ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ．；Ｏｌｉｖｅ，Ｃ．；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃ．Ａ． Ｂｉｖａｌｅｎｔ ｍｕｃｏｓａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＬＣＰ ｃａｒｒｉｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｎｏｍｅｄ．－Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ． ２０１７、１３、２４６３－２４７４．
１４． Ｓｅｄａｇｈａｔ，Ｂ．；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｅｓｋａｎｄａｒｉ，Ｓ．；Ａｐｔｅ，Ｓ．Ｈ．；Ｐａｔｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｍａｎｎｏｓｙｌａｔｅｄ Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２０１６、２７、５３３－５４８．
１５． Ａｈｍａｄ Ｆｕａａｄ，Ａ．Ａ．；Ｒｏｕｂｉｌｌｅ，Ｒ．；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｄ．Ａ．；Ｌｏｕｋａｓ，Ａ．Ｃ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ． Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５、２３、１３０７－１２．
１６． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｉｄ－ｃｏｒｅ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍａｒｋ，Ｓ．Ｓ．編収載 Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：２０１１；第７５１巻、２９７－３０８頁．
１７． Ｚｈｏｎｇ，Ｗ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｒｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ． ２００９、６２、９５６－９６７．
１８． Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｓ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｉｄｓ ａｓ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． ２０１８；第２５巻．
１９． Ｚｈａｏ，Ｇ．；Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ，Ｓ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ． ２０１７、９３、６７０－６８１．
２０． Ｃｈａｎ，Ａ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｇｈａｆｆａｒ，Ｋ．Ａ．；Ｍａｒａｓｉｎｉ，Ｎ．；Ｍｏｓｔａｆａ，Ａ．；Ｅｓｋａｎｄａｒｉ，Ｓ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｃｏｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ． Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６、２４、３０９５－３１０１．
２１． Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ，Ｓ．；Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｒｅｉｍａｎ，Ｊ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；ＭｃＰｈｕｎ，Ｖ．；Ｍｏｙｌｅ，Ｐ．Ｍ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ：ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅ ｔｏ ｓｉｚｅ，ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ． Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ） ２０１４、９、２６１３－２４．
２２． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｎａｎｏｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．） ２０１４、９、２６５７－２６６９．
２３． Ｇｈａｆｆａｒ，Ｋ．Ａ．；Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｎａｎｏｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２０１４、１４、１１９４－２０８．
２４． Ｎａｎｄｅｄｋａｒ，Ｔ．Ｄ． Ｎａｎｏｖａｃｃｉｎｅｓ：ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ． ２００９、３４、９９５－１００３．
２５． ｄｅｓ Ｒｉｅｕｘ，Ａ．；Ｆｉｅｖｅｚ，Ｖ．；Ｇａｒｉｎｏｔ，Ｍ．；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｙ．Ｊ．；Ｐｒｅａｔ，Ｖ． Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ． Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００６、１１６、１－２７．
２６． Ｍａｒａｓｉｎｉ，Ｎ．；Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｇｈａｆｆａｒ，Ｋ．Ａ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ． Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ－Ｕｋ ２０１６、１１、１２２３－１２３６．
２７． Ｒｅｉｔｅｒｍａｎｎ，Ａ．；Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｊ．；ＷｉｅｓｍＵＥＬｌｅｒ，Ｋ．－Ｈ．；Ｊｕｎｇ，Ｇ．；Ｂｅｓｓｌｅｒ，Ｗ．Ｇ． Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｏｒ Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｒ Ｈａｐｔｅｎ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｈｏｐｐｅ－Ｓｅｙｌｅｒ、１９８９；第３７０巻、３４３頁．
２８． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ａ．Ｋａｍａｒｕｚａｍａｎ，Ｋ．；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ，Ｓ．；Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ｌｉｎ，Ｉ．Ｃ．；Ｒ．Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．；Ｆ．Ｇｏｏｄ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｍ－Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ２０１３、１０、３９－４５．
２９． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｉｄ－Ｃｏｒｅ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｅｌｆ－Ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｍａｒｋ，Ｓ．Ｓ．編収載 Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２０１１；２９７－３０８頁．
３０． Ｗａｎｇ，Ｔ．；Ｊｉａｎｇ，Ｈ．；Ｚｈａｏ，Ｑ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．；Ｚｏｕ，Ｍ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｇ． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍｕｃｏｓａｌ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｏｒｏｕｓ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｏｒａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ： Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｉｌｉｃａ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１２、４３６、３５１－３５８．
３１． Ｓｏｔｉｌｌｏ，Ｊ．；Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｆｌｏｒｅｓ，Ａ．；Ｃａｎｔａｃｅｓｓｉ，Ｃ．；Ｈａｒｃｕｓ，Ｙ．；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｄ．；Ｂｏｕｃｈｅｒｙ，Ｔ．；Ｃａｍｂｅｒｉｓ，Ｍ．；Ｔａｎｇ，Ｓ．Ｃ．；Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐ．；Ｍｕｌｖｅｎｎａ，Ｊ．；Ｍｉｔｒｅｖａ，Ｍ．；Ｂｅｒｒｉｍａｎ，Ｍ．；ＬｅＧｒｏｓ，Ｇ．；Ｍａｉｚｅｌｓ，Ｒ．Ｍ．；Ｌｏｕｋａｓ，Ａ． Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２０１４、１３、２７３６－５１．
３２． Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｂｅｔｈｏｎｙ，Ｊ．Ｍ．；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｄ．Ａ．；ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｌ．Ｍ．；Ｊａｒｉｗａｌａ，Ａ．；Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｈ．；Ｍｉｌｅｓ，Ａ．Ｐ．；Ｚｈａｎ，Ｂ．；Ｊｉａｎｇ，Ｄ．；Ｒａｎｊｉｔ，Ｎ．；Ｍｕｌｖｅｎｎａ，Ｊ．；Ｔｒｉｂｏｌｅｔ，Ｌ．；Ｐｌｉｅｓｋａｔｔ，Ｊ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．；Ｂｏｔｔａｚｚｉ，Ｍ．Ｅ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．；Ｋｅｅｇａｎ，Ｂ．；Ｈｏｔｅｚ，Ｐ．Ｊ．；Ｌｏｕｋａｓ，Ａ． Ａｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｏｏｋｗｏｒｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｄｏｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｈｏｏｋｗｏｒｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００９、２３、３００７－１９．
３３． Ｃａｍｂｅｒｉｓ，Ｍ．；Ｌｅ Ｇｒｏｓ，Ｇ．；Ｕｒｂａｎ Ｊｒ．，Ｊ． Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｌｉｇｍｏｓｏｍｏｉｄｅｓ ｐｏｌｙｇｙｒｕｓ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００３、５５、１９．１２．１－１９．１２．２７．
３４． Ｌｕｏ，Ｚ．；Ｌｉ，Ｐ．；Ｄｅｎｇ，Ｊ．；Ｇａｏ，Ｎ．；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．；Ｐａｎ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｌ．；Ｗａｎｇ，Ｃ．；Ｃａｉ，Ｌ．；Ｍａ，Ｙ． Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｃｅｌｌｅ－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ：Ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｒｏｂｕｓｔ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１３、１７０、２５９－２６７．
３５． Ｆｕａａｄ，Ａ．Ａ．Ｈ．Ａ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｏｏｋｗｏｒｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１６、１４０３、６３９－６５３．
３６． Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐ．；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．；Ｂｏｔｔｏ，Ｍ．；Ｄａｈａ，Ｍ．；Ｄ Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．；Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．；Ｄｅｎｔ，Ｌ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ，ａｄａｐｔｉｖｅ ａｎｄ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ． ２００８；第４５巻、４４６－５５頁．
３７． Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｂｅｔｈｏｎｙ，Ｊ．Ｍ．；Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ，Ｄ．Ａ．；ｄｅ Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｌ．Ｍ．；Ｊａｒｉｗａｌａ，Ａ．；Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｈ．；Ｍｉｌｅｓ，Ａ．Ｐ．；Ｚｈａｎ，Ｂ．；Ｊｉａｎｇ，Ｄ．；Ｒａｎｊｉｔ，Ｎ．；Ｍｕｌｖｅｎｎａ，Ｊ．；Ｔｒｉｂｏｌｅｔ，Ｌ．；Ｐｌｉｅｓｋａｔｔ，Ｊ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．；Ｂｏｔｔａｚｚｉ，Ｍ．Ｅ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｋ．；Ｋｅｅｇａｎ，Ｂ．；Ｈｏｔｅｚ，Ｐ．Ｊ．；Ｌｏｕｋａｓ，Ａ． Ａｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ ｉｎｄｕｃｅｓ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｏｏｋｗｏｒｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｄｏｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｈｏｏｋｗｏｒｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． ＦＡＳＥＢ ｊｏｕｒｎａｌ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００９、２３、３００７－３０１９．
３８． Ｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．；Ｒｙａｎ，Ｓ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．；Ｂｕｉｔｒａｇｏ，Ｇ．；Ｐｏｌｓｔｅｒ，Ｒ．；Ｍｏｎｔｅｓ ｄｅ Ｏｃａ，Ｍ．；Ｚｕｖｅｌｅｋ，Ｊ．；Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐ．Ｒ．；Ｄｅｎｔ，Ｌ．Ａ．；Ｅｎｇｗｅｒｄａ，Ｃ．Ｒ．；Ｆｉｅｌｄ，Ｍ．Ａ．；Ｓｏｔｉｌｌｏ，Ｊ．；Ｌｏｕｋａｓ，Ａ． Ｈｏｏｋｗｏｒｍ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔ Ｗｉｔｈ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８、９、８５０－８５０．
参考文献 － 実施例４
１． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｚｈａｏ，Ｇ．；Ｂｏｅｒ，Ｊ．Ｃ．；Ｏｚｂｅｒｋ，Ｖ．；Ａｚｕａｒ，Ａ．；Ｃｒｕｚ，Ｊ．Ｇ．；Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｋｈａｌｉｌ，Ｚ．Ｇ．；Ｐａｎｄｅｙ，Ｍ．；Ｓｈｉｂｕ，Ｍ．Ａ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｎｅｖａｇｉ，Ｒ．Ｊ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｗ．；Ｃａｐｏｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｔｏｔｈ Ｉ． Ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ） ａｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ Ｎａｎｏｖａｃｃｉｎｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２０２０、６、ｅａａｘ２２８５．
２． Ａｈｍａｄ Ｆｕａａｄ，Ａ．Ａ．Ｈ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｈｏｏｋｗｏｒｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：第１巻：Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｔｈｏｍａｓ，Ｓ．編収載 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０１６；６３９－６５３頁．
３． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｏ－Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ－Ｃｈａｐｔｅｒ ７８． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．：２０１３；５７１－５７９頁．
４． Ｊａｄｈａｖ，Ｋ．Ｂ．，Ｗｏｏｌｃｏｃｋ，Ｋ．Ｊ．及びＭｕｔｔｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｍ． （２０２０）． Ａｎｈｙｄｒｏｕｓ Ｈｙｄｒｏｇｅｎ Ｆｌｕｏｒｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ Ｂｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、２１０３、４１－５７． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－１－０７１６－０２２７－０＿４．
５． Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｎ．Ｊ． Ｕｓｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒａ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ． ２００６、１、２８７６－２８９０．
参考文献 － 実施例５
１． Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ． Ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｍａｋ，Ｔ．Ｗ．；Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｍ．Ｅ．；Ｊｅｔｔ，Ｂ．Ｄ．編収載 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｃｅｌｌ：Ｂｏｓｔｏｎ、２０１４；３３３－３７５頁．
２． Ｃｈａｎｇ，Ｋ．Ｐ． Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ：Ｔｈｅ ｎｅｃｅｓｓｉｔｙ ｏｆ ｒｅｎｅｗｅｄ ｅｍｐｈａｓｉｓ ａｎｄ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ ２０１４、１、１０．１７６５３／２３７４－９１０５．ＳＳｅ０００１．
３． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ． ２０１６、７、８４２－８５４．
４． Ｍａｌｏｎｉｓ，Ｒ．Ｊ．；Ｌａｉ，Ｊ．Ｒ．；Ｖｅｒｇｎｏｌｌｅ，Ｏ． Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ． Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ２０２０、１２０、３２１０－３２２９．
５． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｄ． Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｗｈｙ ａｎｄ ｈｏｗ． Ｈｕｍａｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１６、１２、２７０９－２７１１．
６． Ａｚｍｉ，Ｆ．；Ａｈｍａｄ Ｆｕａａｄ，Ａ．Ａ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｄｊｕｖａｎｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０１４、１０、７７８－７９６．
７． Ｓｈｉ，Ｓ．；Ｚｈｕ，Ｈ．；Ｘｉａ，Ｘ．；Ｌｉａｎｇ，Ｚ．；Ｍａ，Ｘ．；Ｓｕｎ，Ｂ． Ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１９、３７、３１６７－３１７８．
８． Ｎｅｖａｇｉ，Ｒ．Ｊ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ． Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｏｕｔｓｏｐｏｕｌｏｓ，Ｓ．編収載 Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ、２０１８；３２７－３５８頁．
９． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｎａｎｏｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．） ２０１４、９、２６５７－２６６９．
１０． Ｓｕｎ，Ｂ．；Ｘｉａ，Ｔ． Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ． Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｃｈｅｍ Ｂ ２０１６、４、５４９６－５５０９．
１１． Ｌｅｂｒｅ，Ｆ．；Ｈｅａｒｎｄｅｎ，Ｃ．Ｈ．；Ｌａｖｅｌｌｅ，Ｅ．Ｃ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１６、２８、５５２５－５５４１．
１２． Ｚｈａｏ，Ｇ．；Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ，Ｓ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ． ２０１７、９３、６７０－６８１．
１３． Ｎｅｇａｈｄａｒｉｐｏｕｒ，Ｍ．；Ｇｏｌｋａｒ，Ｎ．；Ｈａｊｉｇｈａｈｒａｍａｎｉ，Ｎ．；Ｋｉａｎｐｏｕｒ，Ｓ．；Ｎｅｚａｆａｔ，Ｎ．；Ｇｈａｓｅｍｉ，Ｙ． Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ． ２０１７、３５、５７５－５９６．
１４． Ｂｌａｃｋ，Ｍ．；Ｔｒｅｎｔ，Ａ．；Ｋｏｓｔｅｎｋｏ，Ｙ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．；Ｏｌｉｖｅ，Ｃ．；Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｍ． Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ Ｍｉｃｅｌｌｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｐｒｏｍｏｔｅ ａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１２、２４、３８４５－３８４９．
１５． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ｕｒｂａｎｉ，Ｃ．Ｎ．；Ｌｉｎ，Ｉ．Ｃ．；Ｊｉａ，Ｚ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ａ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ． Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ２０１０、４９、５７４２－５７４５．
１６． Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ａｂｄｅｌ－Ａａｌ，Ａ．－Ｂ．Ｍ．；Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．；Ｐｈｉｌｌｉｐｐｓ，Ｋ．Ｓ．Ｍ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＧＡＳ） Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１２、７、ｅ３０１４６．
１７． Ｎｅｖａｇｉ，Ｒ．Ｊ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ． ２０１９、１１４、３９７－４１０．
１８． Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｓ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｐｉｄｓ ａｓ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２０２０、２７、２８８７－２９０１．
１９． Ａｂｄｅｌ－Ａａｌ，Ａ．Ｂ．Ｍ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．；Ｂａｒｏｚｚｉ，Ｎ．；Ｆａｒｉａ，Ａ．；Ｓｉｍｅｒｓｋａ，Ｐ．；Ｍｏｙｌｅ，Ｐ．Ｍ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ． Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２００８、５１、１６７－１７２．
２０． Ｆａｒｕｃｋ，Ｍ．Ｏ．；Ｚｈａｏ，Ｌ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｋｈａｌｉｌ，Ｚ．Ｇ．；Ｃａｐｏｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｓ ａ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｄｏｓｅ Ｏｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０２０、８、２３．
２１． Ｃｈａｎｄｒｕｄｕ，Ｓ．；Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｓ．；Ｋｈａｌｉｌ，Ｚ．Ｇ．；Ｊｉａ，Ｚ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｃａｐｏｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｌｉｎｅａｒ ａｎｄ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅｓ ａｓ ａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ ２０１６、７、６０１－６０９．
２２． Ｌｉｕ，Ｔ．Ｙ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｊｉａ，Ｚ．；Ｒｅｉｍａｎ，Ｊ．Ｍ．；Ｚａｍａｎ，Ｍ．；ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｎ．Ａ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ． Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２０１５、５８、８８８－８９６．
２３． Ａｈｍａｄ Ｆｕａａｄ，Ａ．Ａ．；Ｊｉａ，Ｚ．；Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ｈａｒｔａｓ，Ｊ．；Ｚｉｏｒａ，Ｚ．Ｍ．；Ｌｉｎ，Ｉ．Ｃ．；Ｍｏｙｌｅ，Ｐ．Ｍ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｏｌｙｍｅｒ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｈｙｂｒｉｄｓ ａｓ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｓｅ ｎａｎｏｖａｃｃｉｎｅ． Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ） ２０１４、９、３５－４３
２４． Ｌｉｕ，Ｔ．Ｙ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｊｉａ，Ｚ．；Ｚｉｏｒａ，Ｚ．Ｍ．；ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｎ．Ａ．；Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ． Ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ－ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３、１４、２７９８－２８０６．
２５． Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｚｈａｏ，Ｇ．；Ｂｏｅｒ，Ｊ．Ｃ．；Ｏｚｂｅｒｋ，Ｖ．；Ａｚｕａｒ，Ａ．；Ｃｒｕｚ，Ｊ．Ｇ．；Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｋｈａｌｉｌ，Ｚ．Ｇ．；Ｐａｎｄｅｙ，Ｍ．；Ｓｈｉｂｕ，Ｍ．Ａ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｎｅｖａｇｉ，Ｒ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｗ．；Ｃａｐｏｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｏｌｙ（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ） ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｓｅｌｆａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｓｃｉ Ａｄｖ ２０２０、６、ｅａａｘ２２８５．
２６． Ｎｅｖａｇｉ，Ｒ．Ｊ．；Ｄａｉ，Ｗ．；Ｋｈａｌｉｌ，Ｚ．Ｇ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｃａｐｏｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｉｎ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｂａｓｅｄ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ． Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２０１９、１７９、１００－１０８．
２７． Ｃｈａｎ，Ａ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｇｈａｆｆａｒ，Ｋ．Ａ．；Ｍａｒａｓｉｎｉ，Ｎ．；Ｍｏｓｔａｆａ，Ａ．；Ｅｓｋａｎｄａｒｉ，Ｓ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｃｏｒｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ． Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２０１６、２４、３０９５－３１０１．
２８． Ｚｅｎｇ，Ｗ．；Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．；Ｌａｕ，Ｙ．Ｆ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｅ．；Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｃ． Ｈｉｇｈｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｔｏｔａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２、１６９、４９０５－４９１２．
２９． Ｚａｍａｎ，Ｍ．；Ａｂｄｅｌ－Ａａｌ，Ａ．－Ｂ．Ｍ．；Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．；Ｚｉｏｒａ，Ｚ．Ｍ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｅｌｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ ｍｕｃｏｓａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ． Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２０１２、５５、８５１５－８５２３．
３０． Ｅｓｋａｎｄａｒｉ，Ｓ．；Ｐａｔｔｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｇｒｏｖｅｓ，Ｐ．Ｌ．；Ａｐｔｅ，Ｓ．Ｈ．；Ｓｅｄａｇｈａｔ，Ｂ．；Ｃｈａｎｄｕｒｕｄｕ，Ｓ．；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ： Ａ ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｃｈｅｍ－Ｅｕｒ Ｊ ２０１８、２４、９８９２－９９０２．
３１． Ｈａｙｍａｎ，Ｗ．Ａ．；Ｂｒａｎｄｔ，Ｅ．Ｒ．；Ｒｅｌｆ，Ｗ．Ａ．；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．；Ｓａｕｌ，Ａ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ． Ｍａｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｍｕｒｉｎｅ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ． Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７、９、１７２３－１７３３．
３２． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．；Ｄｅｌ Ｇｕｅｒｃｉｏ，Ｍ．－Ｆ．；Ｍａｅｗａｌ，Ａ．；Ｆｉｋｅｓ，Ｊ．；Ｃｈｅｓｎｕｔ，Ｒ．Ｗ．；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．；Ｑｉａｏ，Ｌ．；Ｐａｕｌｓｏｎ，Ｊ．；ＤｅＦｒｅｅｓ，Ｓ．；Ｂｕｎｄｌｅ，Ｄ．Ｒ． Ｌｉｎｅａｒ ＰＡＤＲＥ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００、１６４、１６２５－１６３３．
３３． Ｓｅｋｕｌｏｓｋｉ，Ｓ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｐ．；Ｐａｒｓｏｎａｇｅ，Ｗ．；Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．；Ｈａｒｔａｓ，Ｊ．；Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｐ．；Ｍａｒｑｕａｒｔ，Ｌ．；Ｐａｎｄｅｙ，Ｍ．；Ｒｕｂｉｎ，Ｆ．Ａ．；Ｃａｒａｐｅｔｉｓ，Ｊ．；ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｊ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ． Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ（ＭＪ８ＶＡＸ） ｉｎ ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１８、１３、ｅ０１９８６５８．
３４． Ｌａ Ｒｏｓａ，Ｃ．；Ｌｏｎｇｍａｔｅ，Ｊ．；Ｌａｃｅｙ，Ｓ．Ｆ．；Ｋａｌｔｃｈｅｖａ，Ｔ．；Ｓｈａｒａｎ，Ｒ．；Ｍａｒｓａｎｏ，Ｄ．；Ｋｗｏｎ，Ｐ．；Ｄｒａｋｅ，Ｊ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．；Ｄｅｎｉｓｏｎ，Ｓ．；Ｂｒｏｙｅｒ，Ｓ．；Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｌ．；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｒ．；Ｋｅｌｓｅｙ，Ｍ．Ｉ．；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．；Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｄ．Ｊ．；Ｚａｉａ，Ｊ．Ａ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＰＡＤＲＥ－ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ） ａｎｄ ｔｅｔａｎｕｓ－ＣＭＶ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ＰＦ０３５１２６７６ ａｄｊｕｖａｎｔ． Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． ２０１２、２０５、１２９４－１３０４
３５． Ｍａｌｋｏｖ，Ｓ．Ｎ．；Ｚｉｖｋｏｖｉｃ，Ｍ．Ｖ．；Ｂｅｌｊａｎｓｋｉ，Ｍ．Ｖ．；Ｈａｌｌ，Ｍ．Ｂ．；Ｚａｒｉｃ，Ｓ．Ｄ． Ａ ｒｅｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｏｄｅｌ． ２００８、１４、７６９－７７５．
３６． Ａｚｕａｒ，Ａ．；Ｊｉｎ，Ｗ．；Ｍｕｋａｉｄａ，Ｓ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０１９、７、１０．３３９０／ｖａｃｃｉｎｅｓ７０３００５８．
３７． Ｒｅｅｄ，Ｓ．Ｇ．；Ｏｒｒ，Ｍ．Ｔ．；Ｆｏｘ，Ｃ．Ｂ． Ｋｅｙ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ２０１３、１９、１５９７－１６０８．
３８． Ｃｏｌａｃｏ，Ｍ．；Ｐａｒｋ，Ｊ．；Ｂｌａｎｃｈ，Ｈ． Ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２００８、１３６、７４－８６．
３９． Ｎｅｖａｇｉ，Ｒ．Ｊ．；Ｋｈａｌｉｌ，Ｚ．Ｇ．；Ｈｕｓｓｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｃａｐｏｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．；Ｓｋｗａｒｃｚｙｎｓｋｉ，Ｍ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ． Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ｃｈｉｔｏｓａｎ－ｂａｓｅｄ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎａｎｏ－ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ． Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ２０１８、８０、２７８－２８７．
４０． Ｌｉｌｌｉｕ，Ｅ．；Ｖｉｌｌｅｒｉ，Ｖ．；Ｐｅｌａｓｓａ，Ｉ．；Ｃｅｓａｎｏ，Ｆ．；Ｓｃａｒａｎｏ，Ｄ．；Ｆｉｕｍａｒａ，Ｆ． Ｐｏｌｙｓｅｒｉｎｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｉｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｅｎｇｔｈ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ． Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ２０１８、２０４、５７２－５８４．
４１． Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｓ．；Ｋａｍｉｋｕｂｏ，Ｈ．；Ｏｎｉｔｓｕｋａ，Ｍ．；Ｋａｔａｏｋａ，Ｍ．；Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｄ． Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｐｏｌｙｇｌｙｃｉｎｅ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ｅｌｏｎｇａｔｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２００６、１２８、１６３３８－１６３４４．
４２． Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ，Ｔ．；Ｐａｎｄｅｙ，Ｍ．；Ｃａｌｃｕｔｔ，Ａ．；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｚ．Ｎ．；Ｙｅｕｎｇ，Ｇ．；Ｇｉｄｄａｍ，Ａ．Ｋ．；Ｓｈｉ，Ｙ．；Ｈａｓｅｌｈｏｒｓｔ，Ｔ．；ｖｏｎ Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，Ｍ．；Ｂａｔｚｌｏｆｆ，Ｍ．Ｒ．；Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ． Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｏ ｂｅｃｏｍｅ ａ ｓｕｐｅｒ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１７、１９９、２７９４－２８０２．
４３． Ｄｏｒｕｋｅｒ，Ｐ．；Ｂａｈａｒ，Ｉ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｏｎ ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｈｅｌｉｃａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｊｏｕｒｎａｌ １９９７、７２、２４４５－２４５６．
４４． Ｍａｒｑｕｓｅｅ，Ｓ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｖ．Ｈ．；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｒ．Ｌ． Ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｈｅｌｉｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｈｏｒｔ ａｌａｎｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９８９、８６、５２８６－５２９０．
４５． Ｆｏｒｏｏｄ，Ｂ．；Ｐｅｒｅｚ－Ｐａｙａ，Ｅ．；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．；Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ，Ｓ．Ｅ． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｓｔａｂｌｅ ｐｏｌｙａｌａｎｉｎｅ ｂｅｔａ－ｓｈｅｅｔ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １９９５、２１１、７－１３．
４６． Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ，Ｓ．Ｅ．；Ｆｏｒｏｏｄ，Ｂ．；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．；ＰｅｒｅｚＰａｙａ，Ｅ． Ｐｏｌｙａｌａｎｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｓｅｌｆ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ－ｐｌｅａｔｅｄ－ｓｈｅｅｔ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７、３６、８３９３－８４００．
４７． Ｒｕｃｋｅｒ，Ａ．Ｌ．；Ｃｒｅａｍｅｒ，Ｔ．Ｐ． Ｐｏｌｙｐｒｏｌｉｎｅ ＩＩ ｈｅｌｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｓｔａｔｅｓ：ｌｙｓｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ． ２００２、１１、９８０－９８５．
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参考文献 － 実施例６
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２９． Ｈｅ，Ｙ．ら、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ ｈｉｇｈｌｙ ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００５． １７４（８）：４９０８－１５頁．
３０． Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｌｉｎｅａｒ ＰＡＤＲＥ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｅｐｉｔｏｐｅ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｉｇｈ ｔｉｔｅｒ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００． １６４（３）：１６２５－１６３３頁．

Claims (25)

  1. 対象への投与に適した免疫原性剤であって、少なくとも１つの抗原分子に共有結合又はコンジュゲートされた疎水性ペプチドを含む免疫原性剤。
  2. ［抗原分子］ｎ－［担体／リンカー］ｍ－［疎水性ペプチド］の構造を有する免疫原性剤であって、
    式中、
    ｎは１又はそれ以上の数であり、
    ｍは０又はそれ以上の数であり、
    「－」は共有結合又はコンジュゲーションを表す
    免疫原性剤。
  3. 免疫原性剤を製造する方法であって、疎水性ペプチドを少なくとも１つの抗原分子に共有結合して、それによって前記免疫原性剤を製造する工程を含む方法。
  4. 請求項３に記載の方法によって製造される場合の免疫原性剤。
  5. 複数の請求項１、請求項２及び請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性剤を含む免疫原性複合体であって、複数の疎水性ペプチドが前記免疫原性複合体中で相互作用する免疫原性複合体。
  6. 免疫原性複合体を製造する方法であって、複数の請求項１、請求項２及び請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性剤を組み合わせる工程を含み、前記複数の免疫原性剤は前記免疫原性複合体へと自己組織化する方法。
  7. 請求項６に記載の方法によって製造される場合の免疫原性複合体。
  8. 前記疎水性ペプチドが、天然アミノ酸を含むか、又は天然アミノ酸からなる請求項１、請求項２及び請求項４のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５若しくは請求項７に記載の免疫原性複合体、又は請求項３若しくは請求項６に記載の方法。
  9. 前記疎水性ペプチドが、約２～約５０の任意の数のアミノ酸を含むか、又はそれからなる請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５、請求項７及び請求項８のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 疎水性アミノ酸が、好ましくはグリシン、プロリン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、ポリグリシン、ポリプロリン、ポリバリン、ポリアラニン、ポリフェニルアラニン及びポリロイシンからなる群から選択される請求項１、請求項２、請求項４、請求項８及び請求項９のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項９のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６、請求項８及び請求項９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記疎水性ペプチドが、リポソーム膜又はミセル若しくはナノ粒子等の他の親油性表面への前記免疫原性剤の固定を可能にする請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１０のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記少なくとも１つの抗原分子の立体構造が、前記疎水性ペプチドのアミノ酸配列及び／若しくは長さを変化させることによって制御され、かつ／又は前記免疫原性剤の溶解度が、前記疎水性ペプチドのアミノ酸配列及び／若しくは長さを変化させることによって制御される請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１１のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記免疫原性剤が、構造において直鎖状、分枝状又は樹状である請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１２のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１２のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記少なくとも１つの抗原分子が、ペプチド、タンパク質若しくは炭水化物、若しくはその断片又は誘導体を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１３のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１３のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記少なくとも１つの抗原分子又はその断片若しくは誘導体が病原体に由来する請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１４のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１４のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記少なくとも１つの抗原分子及び前記疎水性ペプチドが、前記免疫原性剤の反対側の末端に位置する請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１５のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１５のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記免疫原性剤が複数の抗原分子を含む場合、担体又はリンカーが、連続した、分枝状若しくは樹状の形態又は様式で前記抗原分子を共に結合又は連結するために利用される請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１６のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１６のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記免疫原性剤の適切な立体構造及び／若しくは前記免疫原性剤の溶解度を補助するために、少なくとも１つの担体若しくはリンカーが、前記免疫原性剤の疎水性：親水性比のバランスをとる、並びに／又は
    少なくとも１つの担体若しくはリンカーが、前記疎水性ペプチドへの結合のために、分枝鎖を形成することができる少なくとも１つのアミノ酸を含む
    請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１７のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１７のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧ（Ｓ６２３～６３９）（配列番号１５）からなるか、若しくはそれらを含む、
    前記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹ（Ｓ４６９～５０８）（配列番号１６）からなるか、若しくはそれらを含む、
    前記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶ（Ｓ４４５～４８３）（配列番号１７）からなるか、若しくはそれらを含む、
    前記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴ（Ｓ５５９～５７２）（配列番号１８）からなるか、若しくはそれらを含む、かつ／又は
    前記少なくとも１つの抗原分子が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質エピトープＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶ（Ｓ３６６～３９５）（配列番号１９）からなるか、若しくはそれらを含む
    請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１８のいずれか１項に記載の免疫原性剤、請求項５及び請求項７から請求項１８のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は請求項３、請求項６及び請求項８から請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 少なくとも１つの請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性剤、並びに／又は少なくとも１つの請求項５及び請求項７から請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性複合体と、少なくとも１つの許容できる担体、希釈剤又は賦形剤とを含む組成物。
  21. リポソーム、ミセル若しくはナノ粒子、又は
    リポソーム、ミセル若しくはナノ粒子、及びマンノース標的化部分
    をさらに含む請求項２０に記載の組成物。
  22. 対象において免疫応答を誘発する方法であって、少なくとも１つの請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性剤、少なくとも１つの請求項５及び請求項７から請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの請求項２０若しくは請求項２１に記載の組成物を前記対象に投与し、それによって前記対象において免疫応答を誘発する工程を含む方法。
  23. 対象を免役する方法であって、少なくとも１つの請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性剤、少なくとも１つの請求項５及び請求項７から請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの請求項２０若しくは請求項２１に記載の組成物を前記対象に投与し、それによって前記対象を免疫する工程を含む方法。
  24. 対象において疾患、障害若しくは状態を治療又は予防する方法であって、少なくとも１つの請求項１、請求項２、請求項４及び請求項８から請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性剤、少なくとも１つの請求項５及び請求項７から請求項１９のいずれか１項に記載の免疫原性複合体、又は少なくとも１つの請求項２０若しくは請求項２１に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。
  25. 前記動物が、哺乳動物、鳥類、ブタ若しくはヒトであり、かつ／又は
    前記方法が、アジュバント若しくは他の一般的な免疫賦活剤の同時投与を必要としない
    請求項２２から請求項２４のいずれか１項に記載の方法。
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