JP2019533695A - 腎機能の改善のためのｔｉｍｐ−２に対する抗体の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、メタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ−２）に特異的に結合する抗体を使用する、腎臓損傷を有するかまたは腎臓損傷を有するリスクのある被験体の処置のための方法を提供する。詳細には、方法は、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、急性腎臓損傷（ＡＫＩ）を有する被験体、またはうっ血性心不全、子癇前症、子癇、真正糖尿病、高血圧症、冠動脈疾患、タンパク尿、正常範囲に満たない糸球体濾過、肝硬変、正常範囲を上回る血清クレアチニン、敗血症、もしくは急性腎不全（ＡＲＰ）のうちの１つもしくは複数の既存の診断を有する被験体の処置のために使用され得る。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／４１４，４７９号の利益を主張し、すべての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明の背景についての以下の議論は、本発明を理解するに当たり読み手を補助するために提供されるにすぎず、本発明に対する先行技術について記載するまたは先行技術を構成することを認めるものではない。

メタロプロテイナーゼ阻害剤２（「メタロプロテイナーゼ２の組織阻害剤」および「ＴＩＭＰ２」としても公知のヒト前駆体Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１６０３５）は、メタロプロテイナーゼと複合体形成し、触媒性亜鉛補因子に結合することによってメタロプロテイナーゼを不可逆的に不活性化する分泌タンパク質である。ＴＩＭＰ２は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６およびＭＭＰ−１９に作用することが公知である。ＴＩＭＰ２は、内皮細胞の増殖を抑制することが報告されている。結果として、コード化タンパク質は、血管新生因子に応じた静止組織の増殖を抑制することによって、およびリモデリングを受けている組織のプロテアーゼ活性を阻害することによって、組織恒常性の維持における役割を果たすことが示唆される。

さらに、そのそれぞれが、表、図および特許請求の範囲のすべてを含む全体として、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０４８３４６およびＷＯ２０１１／０７５７４４は、個別にとマルチマーカーパネルでの両方で、被験体の腎臓の状況を評価するためのＴＩＭＰ２の使用について記載する。特に、イムノアッセイによって測定されるＴＩＭＰ２レベルは、腎臓の状況のリスク層別化、診断、ステージ分類、予後、分類およびモニタリングと相関することが示される。

急性腎臓損傷（ＡＫＩ）は、様々な条件に起因し、重篤な結果を有する。ＡＫＩは以下のいずれかとして定義される：
Ｓｃｒが４８時間以内に≧０．３ｍｇ／ｄｌ（≧２６．５μｍｏｌ／ｌ）増加；または
Ｓｃｒが、それ以前の７日以内に生じたことが知られているかもしくは推定されるベースラインの≧１．５倍に増加；または
尿量が、６時間にわたって、＜０．５ｍｌ／ｋｇ／時。

ＡＫＩは、以下の判断基準に従って重症度についてステージ分類される：

重要なことに、腎機能の急性変化の症候群をより広く定義することによって、ＲＩＦＬＥ判断基準はＡＲＦを超えるものとなる。ＲＩＦＬＥ判断基準によって定義されるＡＫＩの概念は、他のより重症度の低い条件を含む。Ｂｅｌｌｏｍｏら、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ． ８巻（４号）：Ｒ２０４〜１２頁、２００４年は、ＲＩＦＬＥ判断基準について記載する：
「Ｒｉｓｋ」：ベースラインから１．５倍増加した血清クレアチニンまたは６時間にわたって＜０．５ｍｌ／ｋｇ体重／時の尿生成；
「Ｉｎｊｕｒｙ」：ベースラインから２．０倍増加した血清クレアチニンまたは１２時間にわたって＜０．５ｍｌ／ｋｇ／時の尿生成；
「Ｆａｉｌｕｒｅ」：ベースラインから３．０倍増加した血清クレアチニンあるいは２４時間にわたって＞３５５μｍｏｌ／ｌ（＞４４の上昇を伴う）のクレアチニンもしくは０．３ｍｌ／ｋｇ／時未満の尿排出量（ｕｒｉｎｅ ｏｕｔｐｕｔ）または少なくとも１２時間にわたって無尿；
「Ｌｏｓｓ」：４週間を超えて腎代替療法を持続的に要する。
「ＥＳＲＤ」：末期腎疾患 − ３カ月を超えて透析を要する。
それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｅｌｌｕｍ、Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ３６巻：Ｓ１４１〜４５頁、２００８年およびＲｉｃｃｉら、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ７３巻、５３８〜５４６頁、２００８年で議論されたように、ＲＩＦＬＥ判断基準は、数多くの研究で確認されてきたＡＫＩの均一な定義を提供する。
ＡＫＩが入院患者の高い罹患率と死亡率をもたらすことが広く認識されており、有効な療法に対する緊急の必要性が存在する。いくつかの単独の研究を除き、大多数の動物研究および臨床研究はまだ、ＡＫＩの薬理学的処置の利益を決定的に実証してはいない。Ｊｏら、Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２巻：３５６〜３６５頁、２００７年。

国際公開第２０１０／０４８３４６号 国際公開第２０１１／０７５７４４号

Ｊｏら、Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ（２００７年）２巻：３５６〜３６５頁

本発明の目的は、腎損傷を有するかまたは腎損傷のリスクのある被験体の処置のための方法である。詳細には、メタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ−２）に対する抗体の投与が、敗血症誘導性ＡＫＩのモデルにおける腎臓組織学スコア（ｋｉｄｎｅｙ ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ｓｃｏｒｅ）を改善することが本明細書において示される。

第１の態様では、本発明は、それを必要とする被験体、最も好ましくはヒト被験体の腎臓機能を改善するための方法であって、被験体に、メタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ−２）に特異的に結合する抗体を投与することを含む方法を提供する。

ある特定の実施形態では、抗ＴＩＭＰ−２抗体の投与は、腎臓機能を改善するために十分な量で、腎臓機能の改善のために指示される１つまたは複数のさらなる治療剤または治療手順を必要に応じて伴って実施される。適切な追加の処置モダリティは以降に詳細に記載される。

ある特定の実施形態では、それを必要とする被験体は、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を有するかまたはＣＫＤの１つもしくは複数の症状を呈する被験体である。他の実施形態では、それを必要とする被験体は、急性腎臓損傷（ＡＫＩ）を有するかまたはＡＫＩの１つもしくは複数の症状を呈する被験体である。

さらに他の実施形態では、それを必要とする被験体は、ＡＫＩのリスクが増加していると特定される被験体である。例として、このような被験体は、うっ血性心不全、子癇前症、子癇、真正糖尿病、高血圧症、冠動脈疾患、タンパク尿、腎不全、正常範囲に満たない糸球体濾過、肝硬変、正常範囲を上回る血清クレアチニン、敗血症、腎機能に対する損傷、または腎機能の低減のうちの１つまたは複数の既存の診断に基づいてリスクが増加していると特定されてもよい。ある特定の実施形態では、被験体は、糖尿病性腎症（ＤＮ）を有するかまたはＤＮの１つもしくは複数の症状を呈すると特徴付けられる。

あるいは、またはさらに、このような被験体は、大規模な血管手術、冠動脈バイパス、もしくは他の心臓手術を受けているかもしくは受けたことがある、および／またはＮＳＡＩＤ、シクロスポリン、タクロリムス、アミノグリコシド、ホスカルネット、エチレングリコール、ヘモグロビン、ミオグロビン、イホスファミド、重金属、メトトレキサート、放射線不透過性造影剤、もしくはストレプトゾトシンのうちの１つもしくは複数を受けたことがある被験体に基づいてリスクが増加していると特定されてもよい。

ある特定の実施形態では、このような被験体は、バイオマーカーの結果に基づいてリスクが増加していると特定されてもよい。好ましくは、バイオマーカーの結果は、測定された尿中ＴＩＭＰ−２濃度および測定された尿中インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）濃度のうちの１つまたは複数、最も好ましくは、［ＴＩＭＰ−２］×［ＩＧＦＢＰ７］の結果などの、測定された尿中ＴＩＭＰ−２濃度と測定された尿中ＩＧＦＢＰ７濃度から計算された組み合わせた結果を含む。

ある特定の実施形態では、被験体は、ＡＫＩＮのステージ１もしくはステージ１未満と特徴付けられる；被験体は、ＡＫＩＮのステージ２もしくはステージ２未満と特徴付けられる、または被験体は、ＡＫＩＮのステージ３もしくはステージ３未満と特徴付けられる。

種々の実施形態では、単独の、または必要に応じた処置モダリティを伴う抗ＴＩＭＰ−２抗体の投与は、被験体の推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の改善をもたらす。

種々の実施形態では、単独の、または必要に応じた処置モダリティを伴う抗ＴＩＭＰ−２抗体の投与は、被験体の血清クレアチニンのレベルを低減する。

種々の実施形態では、抗ＴＩＭＰ−２抗体の投与は、静脈内、動脈内、または皮下などの非経口である。

種々の実施形態では、抗ＴＩＭＰ−２抗体の投与は、ＩｇＧ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖである。この列挙は限定的であることを意味するものではない。ある特定の実施形態では、抗ＴＩＭＰ−２抗体はヒト化されているかまたは完全にヒトのものである。

ある特定の実施形態では、腎臓機能の改善のために指示される１つまたは複数のさらなる治療剤または治療手順は、腎代替療法、水分過負荷の管理、カスパーゼ阻害剤の投与、ミノサイクリンの投与、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ阻害剤の投与、鉄キレート剤の投与、それを必要とする被験体における敗血症に対する処置の投与、インスリンの投与、エリスロポエチンの投与、および血管拡張薬の投与からなる群より選択される１つまたは複数の処置を含む。

本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の記載に示される。本開示の他の特色、目的、および利点は、本記載および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例示し、本記載と併せて本発明の原理を説明するのに役立つ。

図１は、未処置の敗血症動物と比較した、抗ＴＩＭＰ２による処置後のマウス盲腸結紮穿刺敗血症モデルにおける組織学によって測定した腎臓組織損傷を示す。

図２は、未処置の敗血症動物と比較した、抗ＴＩＭＰ２による処置後のマウス盲腸結紮穿刺敗血症モデルにおける血清クレアチニンによって測定した腎臓機能を示す。

定義

本明細書で使用される場合、用語「メタロプロテイナーゼ阻害剤２」および「ＴＩＭＰ−２」は、メタロプロテイナーゼ阻害剤２前駆体（ヒト前駆体：Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１６０３５（配列番号１０））に由来する生体試料中に存在する１つまたは複数のポリペプチドを指す。

以下のドメインは、メタロプロテイナーゼ阻害剤２において特定された：

本明細書で別段具体的に注記されていなければ、使用される用語の定義は、薬学の技術分野で使用される標準的定義である。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単一形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に指示していなければ、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つまたはそれよりも多いこのような担体の混合物などを含む。

用語「被験体」は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは非ヒト生物を指す。したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、ヒト疾患と獣医学的な疾患の両方に適用可能である。さらに、被験体は、好ましくは生きている生物であるが、本明細書に記載される発明は、死後の分析においても同様に使用され得る。好ましい被験体はヒト、最も好ましくは「患者」であり、「患者」は、本明細書で使用される場合、疾患または状態に対する医療を受けている生きているヒトを指す。これは、病理の徴候について調査されている、定義された病気を有さない人々を含む。

用語「診断」は、本明細書で使用される場合、当業者が、患者が所与の疾患または状態に罹患しているか否かの確率（「尤度」）を推定および／または決定することができる方法を指す。本発明の場合には、「診断」は、本発明の腎臓損傷マーカーについてのアッセイ、最も好ましくはイムノアッセイの結果を使用して、必要に応じて他の臨床特徴と併せて、試料が入手およびアッセイされた被験体について急性腎損傷またはＡＲＦの診断（すなわち、発生または不発生）に至ることを含む。このような診断が「決定」されることは、診断が１００％正確であることを示すことを意味しない。多くのバイオマーカーは、複数の状態の指標である。熟練臨床医は、情報が欠如している状態（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｖａｃｕｕｍ）ではバイオマーカーの結果を使用せず、むしろ、試験結果を他の臨床的徴候と併せて使用して診断に至る。したがって、所定の診断閾値の一方の側にある測定バイオマーカーレベルは、所定の診断閾値のもう一方の側にある測定レベルに比べて、被験体における疾患の発生のより大きな尤度を示す。

同様に、予後リスクは、所与の経過または転帰が生じる確率（「尤度」）を示唆する。予後指標のレベルまたはレベルの変化は、その結果として、罹患確率の増加（例えば、腎機能の悪化、将来のＡＲＦ、または死亡）に関連し、患者の有害転帰の「尤度増加の指標」であると言及される。

用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原またはエピトープに特異的に結合可能な１つもしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはその断片由来の、それらからモデル化された、またはそれらにより実質的にコードされるペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３年）；Ｗｉｌｓｏｎ（１９９４年；Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７５巻：２６７〜２７３頁；Ｙａｒｍｕｓｈ（１９９２年）Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５巻：８５〜９７頁を参照のこと。用語の抗体は、抗原結合部分、すなわち、抗原に結合する能力を保持する「抗原結合部位」（例えば、断片、部分配列、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含み、これには、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。また、用語「抗体」の言及には、単鎖抗体も含まれる。

ある特定の治療用抗体は、ＩｇＧ抗体である。用語「ＩｇＧ」は、本明細書で使用される場合、認識される免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。抗体のＩｇＧクラスにおける公知のＩｇドメインは、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ、およびＣＬである。ＩｇＧは、いくつかの実用上の理由で、治療用抗体として好ましいクラスである。ＩｇＧ抗体は、安定で、容易に精製され、医薬品サプライチェーンに対して実用的である条件下で保存することができる。ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＩｇＧ抗体は、単にサイズの関数ではなく、いわゆるＦｃ受容体（またはＦｃＲｎ）との相互作用の結果でもある長期の生物学的半減期を有する。この受容体は、ＩｇＧを細胞内における異化から保護すると考えられ、ＩｇＧを血漿に戻して再循環させる。

抗体は、特異的抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物では、抗体は、ポリペプチド重鎖とポリペプチド軽鎖との対合により構築される。軽鎖および重鎖可変領域は、抗体間で顕著な配列多様性を示し、標的抗原への結合を担う。各鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインで構成され、したがって、一般的用語である免疫グロブリンは、このようなタンパク質に対して使用される。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２抗原結合性断片とその使用方法を含む。本明細書で使用される場合、別段指定されていなければ、「抗体断片」または「抗原結合性断片」は、抗体の抗原結合性断片、すなわち、完全長抗体が結合する抗原に対する特異的結合能を保持している抗体断片、例えば、１つまたは複数のＣＤＲ領域を保持している断片を指す。抗体結合性断片の例としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；線状抗体；一本鎖抗体分子、例えば、ｓｃ−Ｆｖ；ナノボディ；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体など）が挙げられる。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２ Ｆａｂ断片およびその使用方法を含む。「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣ_Ｈ１および可変領域から構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆａｂ断片」は、抗体のパパイン切断産物であり得る。

本発明は、Ｆｃ領域を含む抗ＴＩＭＰ−２抗体およびその抗原結合性断片ならびにその使用方法を含む。「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含有する。この２つの重鎖断片は、２つまたはそれを超えるジスルフィド結合とＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に保持されている。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２ Ｆａｂ’断片およびその使用方法を含む。「Ｆａｂ’断片」は、１つの軽鎖と１つの重鎖の一部分または断片とを含有し、この重鎖の一部分または断片には、Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインが含有され、また、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメイン間の領域が、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）_２分子が形成され得るように含有される。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２ Ｆ（ａｂ’）_２断片およびその使用方法を含む。「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、２つの軽鎖と、Ｃ_Ｈ１ドメインとＣ_Ｈ２ドメイン間の定常領域の一部分を含有する２つの重鎖とを含み、そのため鎖間ジスルフィド結合は２つの重鎖の間に形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に保持された２つのＦａｂ’断片から構成される。「Ｆ（ａｂ’）_２断片」は、抗体のペプシン切断産物であり得る。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２ Ｆｖ断片およびその使用方法を含む。「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含むが、定常領域を欠く。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２ ｓｃＦｖ断片およびその使用方法を含む。用語「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体は、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌドメインを含む抗体断片を指し、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドには、さらに、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間にポリペプチドリンカーが含まれており、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能である。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４年）ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁を参照のこと。また、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号も参照のこと。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２ドメイン抗体およびその使用方法を含む。「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。一部の場合には、２つまたはそれを超えるＶ_Ｈ領域は、ペプチドリンカーと共有結合により接合して、二価ドメイン抗体を作出する。二価ドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ領域は、同一または異なる抗原を標的としてもよい。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２二価抗体およびその使用方法を含む。「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。一部の場合には、２つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は二重特異性であってもよい（以下を参照のこと）。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２ラクダ化単一ドメイン抗体およびその使用方法を含む。ある特定の実施形態では、本明細書における抗体は、ラクダ化単一ドメイン抗体も含む。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２６巻：２３０頁；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻：２５頁；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号を参照のこと。一実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるような修飾を有する２つのＶ_Ｈドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。

本発明は、抗ＴＩＭＰ−２ダイアボディおよびその使用方法を含む。本明細書で使用される場合、用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であって、同一のポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ）内で軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む断片を指す。同一鎖上において２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、このドメインは強制的に別の鎖の相補的なドメインと対合され、２つの抗原結合部位が作出される。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁に、より十分に記載されている。操作された抗体バリアントの概説については、一般的に、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ（２００５年）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３巻：１１２６〜１１３６頁を参照のこと。

用語「特異的に結合する」は、上記で注記されたように、抗体は抗体が結合するエピトープ（複数可）を提示する任意のポリペプチドに結合するため、抗体はその意図される標的に排他的に結合するということを示すことは意図されない。むしろ、抗体の意図される標的に対する親和性が、適当なエピトープ（複数可）を提示しない非標的分子に対する親和性と比較したときに、約５倍大きい場合に、抗体は「特異的に結合する」。好ましくは、抗体の親和性は、非標的分子に対する親和性よりも、標的分子に対して少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、さらにより好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍またはそれを超えて大きい。好ましい実施形態では、好ましい抗体は、少なくとも約１０^７Ｍ^−１、好ましくは約１０^８Ｍ^−１から約１０^９Ｍ^−１の間、約１０^９Ｍ^−１から約１０^１０Ｍ^−１の間、または約１０^１０Ｍ^−１から約１０^１２Ｍ^−１の間の親和性により結合する。

親和性は、Ｋ_ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ（ｋ_ｏｆｆは、解離速度定数であり、Ｋ_ｏｎは、会合速度定数であり、Ｋ_ｄは、平衡定数である）として計算される。親和性は、種々の濃度（ｃ）において標識リガンドの結合した割合（ｒ）を測定することによって平衡状態で決定され得る。データは、Ｓｃａｔｃｈａｒｄの式：ｒ／ｃ＝Ｋ（ｎ−ｒ）を使用してグラフ化される：式中、ｒ＝平衡状態における、結合リガンドのモル／受容体のモル；ｃ＝平衡状態における、遊離リガンド濃度；Ｋ＝平衡会合定数；および、ｎ＝受容体分子１つ当たりのリガンド結合部位数である。グラフ分析によって、ｒ／ｃは、Ｘ軸上のｒに対してＹ軸上にプロットされており、このようにしてＳｃａｔｃｈａｒｄプロットを生成する。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析による抗体親和性測定は、当技術分野で周知である。例えば、ｖａｎ Ｅｒｐら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１２巻：４２５〜４３頁、１９９１年；ＮｅｌｓｏｎおよびＧｒｉｓｗｏｌｄ、Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ． ２７巻：６５〜８頁、１９８８年を参照のこと。

本発明の抗体は、本明細書に記載されるイムノアッセイにおいて最も大きな臨床上の有用性を有する抗体およびエピトープが選択され得るように、エピトープマッピングによってさらに特徴付けることができる。用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる抗原決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面群からなり、通常、特異的な三次元構造特徴、および特異的な電荷特徴を有する。コンフォメーションおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で、前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないということで識別される。好ましくは、標的分子上に存在するが、非標的分子上には部分的または全体的に存在しないエピトープが標的とされる。

一部の実施形態では、抗体足場は、異なる種由来の配列の混合物であり得る。したがって、抗体が１種の抗体であれば、このような抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。一般に、「キメラ抗体」と「ヒト化抗体」は両方、１つを超える種由来の領域を組み合わせた抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、伝統的に、マウス（または一部の場合には、ラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）を含む。「ヒト化抗体」は、一般的に、ヒト抗体中に見出される配列にスワップされた可変ドメインフレームワーク領域を有した非ヒト抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く全抗体が、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされているかまたはＣＤＲ内を除きこのような抗体と同一である。ＣＤＲは、それらの一部またはすべてが非ヒト生物内で発生する核酸によりコードされており、ＣＤＲをヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークに移植することで、移植されたＣＤＲにより特異性が決定される抗体を作出する。このような抗体の作出は、例えばＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁に記載されている。選択されたアクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「復帰変異」は、多くの場合、初期移植構築物内で喪失している親和性を回復する必要がある（米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第６，１８０，３７０号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，８２１，３３７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第６，４０７，２１３号）。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、典型的にヒト免疫グロブリンのものも含み、それにより、典型的には、ヒトＦｃ領域を含むことになる。ヒト化抗体は、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを使用して作製することもできる。Ｒｏｑｕｅら、２００４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． ２０巻：６３９〜６５４頁。非ヒト抗体をヒト化して再形成するための様々な技法および方法は、当技術分野で周知である（ＴｓｕｒｕｓｈｉｔａおよびＶａｓｑｕｅｚ、２００４年、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ、５３３〜５４５頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、およびそれに引用された参考文献を参照のこと）。ヒト化方法としては、これらに限定されないが、Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年；Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁；Ｑｕｅｅｎら、１９８９年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ、８６巻：１００２９〜３３頁；Ｈｅら、１９９８年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０巻：１０２９〜１０３５頁；Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９巻：４２８５〜９頁、Ｐｒｅｓｔａら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７巻（２０号）：４５９３〜９頁；Ｇｏｒｍａｎら、１９９１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：４１８１〜４１８５頁；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ、１１巻：３２１〜８頁に記載された方法が挙げられる。ヒト化、または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減する他の方法は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１巻：９６９〜９７３頁に記載された通り、リサーフェシング方法を含み得る。一実施形態では、親抗体は、当技術分野で公知の通り、親和性成熟されている。構造に基づく方法は、例えば、米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載された通り、ヒト化および親和性成熟に用いられ得る。選択に基づく方法は、これらに限定されないが、Ｗｕら、１９９９年、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９４巻：１５１〜１６２頁；Ｂａｃａら、１９９７年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２巻（１６号）：１０６７８〜１０６８４頁；Ｒｏｓｏｋら、１９９６年、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１巻（３７号）：２２６１１〜２２６１８頁；Ｒａｄｅｒら、１９９８年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９５巻：８９１０〜８９１５頁；Ｋｒａｕｓｓら、２００３年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１６巻（１０号）：７５３〜７５９頁に記載された方法を含む、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟するのに用いられ得る。他のヒト化方法は、これらに限定されないが、米国特許出願第０９／８１０，５０２号；Ｔａｎら、２００２年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９巻：１１１９〜１１２５頁；Ｄｅ Ｐａｓｃａｌｉｓら、２００２年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９巻：３０７６〜３０８４頁に記載された方法を含む、ＣＤＲのほんの一部の移植に関与し得る。

一実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体である。「完全ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」は、ヒト染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体を指す。完全ヒト抗体は、例えば、トランスジェニックマウス（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、８巻：４５５〜４５８頁）または選択方法と組み合わせたヒト抗体ライブラリー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９８年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９巻：１０２〜１０８頁）を使用して、得てもよい。

抗体生成

モノクローナル抗体調製物を、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術の使用、またはこれらの組み合わせを含む当技術分野で公知の多様な技法を使用して生成することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、例えばＨａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ Ｔ−ＣＥＬＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ、５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）（その両方が、全体が参照により組み込まれる）に教示された技法を含むハイブリドーマ技法を使用して生成することができる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンに由来するが、それを生成する方法には由来しない抗体を指す。

ラットおよびマウス以外の動物に由来するモノクローナル抗体は、特有の利点を提供する。シグナル伝達および疾患に関連する多くのタンパク質標的は、マウスとラットとヒトとの間で高度に保存されており、それゆえに、マウスまたはラット宿主により自己抗原として認識されてしまい、免疫原性が低い可能性がある。この問題は、宿主動物としてウサギを使用する場合には回避され得る。例えばＲｏｓｓｉら、Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．、１２４巻、２９５〜３０２頁、２００５年を参照のこと。

ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を生成およびスクリーニングするための方法は、日常的であり、当技術分野で周知である。非限定的例において、マウスは、目的の抗原またはこのような抗原を発現する細胞により免疫化することができる。例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されるなど、免疫応答が検出されれば、マウス脾臓を回収して、脾臓細胞を単離する。次いで、脾臓細胞は、周知技法により任意の適切な骨髄腫細胞に融合する。ハイブリドーマを選択して、限界希釈によりクローニングする。次いで、ハイブリドーマクローンを、抗原に結合することが可能な抗体を分泌する細胞に関して当技術分野で公知の方法によりアッセイする。マウスに陽性ハイブリドーマクローンを腹腔内接種することにより、一般的には、高レベルの抗体を含有する腹水液を作製することができる。

抗体作製の方法において使用することができるアジュバントとしては、これらに限定されないが、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、全細菌（ＢＣＧ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）ならびに細胞壁骨格、トレハロースジミコレート、モノホスホリル脂質Ａ、結核菌のメタノール抽出性残渣（ＭＥＲ）、完全または不完全フロイントアジュバントを含む細菌成分；ウイルスアジュバント；化学的アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、ヨード酢酸塩およびコレステリルヘミスクシネート、または；ネイキッドＤＮＡアジュバントが挙げられる。本発明の方法で使用され得る他のアジュバントとしては、コレラ毒、パロポクスタンパク質（ｐａｒｏｐｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；参照により本明細書に組み込まれるＢｉｅｇら（１９９９年）「ＧＡＤ６５ Ａｎｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｂ Ｃｈａｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ （９−２３） Ａｒｅ Ｎｏｔ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｏｆ Ｔｈｅ ＢＢ Ｒａｔ」、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、３１巻（１号）：１５〜２４頁も参照のこと）、ＭＰＬ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｏｄｍｅｌｌら（２０００年）「ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｉｃｅ Ａｇａｉｎｓｔ Ｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ： Ｅｆｆｅｃｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｒｏｕｔｅ Ｏｆ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ （ＭＰＬ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻：１０５９〜１０６６頁；Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９年）「３−Ｏ−Ｄｅｓａｃｙｌ Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２巻：４６４０〜４６４９頁；Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら（１９９９年）「Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ （ＭＰＬ） Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９巻：１０３〜１０７頁も参照のこと）、ＲＣ−５２９アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃｏｒｉｘａのアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）化学ライブラリー由来のリード化合物。ｗｗｗ．ｃｏｒｉｘａ．ｃｏｍも参照のこと）、およびＤＥＴＯＸ（商標）アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＤＥＴＯＸ（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント（モノホスホリル脂質Ａ）およびマイコバクテリア細胞壁骨格を含む；その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｔｏｎら（１９９８年）「Ａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｗｉｔｈ Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｂ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｗｈｏｌｅ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｐｌｕｓ ＤＥＴＯＸ Ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ」、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４巻（３号）：６１９〜６２７頁；およびＧｕｐｔａら（１９９５年）「Ａｄｊｕｖａｎｔｓ Ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−−Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ， Ｐｒｏｂｌｅｍｓ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３巻（１４号）：１２６３〜１２７６頁も参照のこと）が挙げられる。

数多くの刊行物により、選択された分析物への結合に関するポリペプチドライブラリーを生成およびスクリーニングするファージディスプレイ技術の使用が議論されている。例えば、Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７巻、６３７８〜８２頁、１９９０年；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、４０４〜６頁、１９９０年、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、３８６〜８８頁、１９９０年；ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第５，５７１，６９８号を参照のこと。ファージディスプレイ方法の基本的概念は、スクリーニングされるポリペプチドをコードするＤＮＡとそのポリペプチドの間の物理的会合の確立である。この物理的会合は、ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入するカプシドの一部としてポリペプチドを提示するファージ粒子により提供される。ポリペプチドとそれらの遺伝物質の間の物理的会合の確立は、異なるポリペプチドを有する非常に多数のファージの同時マススクリーニングを可能にする。標的への親和性を有するポリペプチドを提示するファージが、その標的に結合し、これらのファージが、標的への親和性スクリーニングにより濃縮される。これらのファージから提示されたポリペプチドの正体を、それらの各ゲノムから決定することができる。これらの方法を使用して、所望の標的への結合親和性を有するとして同定されたポリペプチドが、その後、従来の手段によりバルクで合成され得る。例えば、すべての表、図、および特許請求の範囲を含む全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０５７，０９８号を参照のこと。

これらの方法により作製された抗体は、次いで、目的の精製ポリペプチドとの親和性および特異性について第１のスクリーニングを行うこと、そして必要に応じて、その結果を、結合から除外されることが望ましいポリペプチドと抗体との親和性および特異性と比較することにより選択することができる。スクリーニング手順は、マイクロタイタープレートの個別のウェルにおいて精製ポリペプチドを固定化することに関与し得る。潜在的な抗体または抗体群を含有する溶液を、次いで、各マイクロタイターウェルに入れて、約３０分から２時間インキュベートする。次いで、マイクロタイターウェルを洗浄して、標識された二次抗体（例えば、産生させた抗体がマウス抗体であれば、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされた抗マウス抗体）をウェルに添加して約３０分間インキュベートし、次いで、洗浄する。基質をウェルに添加し、固定されたポリペプチド（複数可）への抗体が存在すれば、呈色反応が現れる。

このように同定された抗体は、次いで、選択されたアッセイデザインにおいて親和性および特異性についてさらに分析され得る。標的タンパク質についてのイムノアッセイの開発において、精製された標的タンパク質が、選択された抗体を使用するイムノアッセイの感度および特異性を決定する標準として作用する。様々な抗体の結合親和性は、異なる場合があり、ある特定の抗体対（例えば、サンドイッチアッセイにおいて）は、互いに立体的に干渉する場合があることなどにより、抗体のアッセイ性能は、抗体の絶対的な親和性および特異性よりも重要な尺度になり得る。

抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することができないがヒト免疫グロブリン遺伝子は発現し得るトランスジェニックマウスを使用して生成することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為に、または相同組換えにより、マウス胚性幹細胞に導入することができる。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、およびダイバーシティ領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｒｅｇｉｏｎ）をマウス胚性幹細胞にも導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別に、または同時に非機能性にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内在性抗体の生成を防止する。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを生成する。次いで、キメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産み出す。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部分で、従来の方法論を使用して免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を使用して免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが抱えるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成し、次に、クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技法を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能になる。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概要については、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９５年）「Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ」、Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３巻：６５〜９３頁を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術、ならびにこのような抗体を生成するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、および同第ＷＯ９６／３３７３５号、ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、および同第５，９３９，５９８号を参照のこと。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＭｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）などの会社は、先に記載された技術と類似の技術を使用して選択された抗原に対するヒト抗体を提供するよう契約することができる。

抗体の組換え発現

本発明の抗体をコードする核酸配列が得られたら、抗体生成のためのベクターを、当技術分野で周知の技法を使用する組換えＤＮＡ技術により生成することができる。当業者に周知である方法を使用して、抗体コード配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えがある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８年、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹを参照のこと）。

抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、従来の技法（例えば、電子穿孔、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈降法）により宿主細胞に移入することができ、次いで、トランスフェクトされた細胞を、従来の技法で培養して本発明の抗体を生成する。具体的な実施形態では、抗体の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異性プロモーターにより調節される。

本明細書に開示された抗体または断片または免疫グロブリン鎖の発現のための宿主として哺乳動物細胞を含む真核宿主細胞および原核宿主細胞は、当技術分野において周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手できる多くの不死化細胞系統を含む。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびいくらかの他の細胞系統を含む。哺乳動物宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞を含む。特に好ましい細胞系統は、どの細胞系統が高発現レベルを有するかを決定することにより選択される。使用することができる他の細胞系統は、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞系統、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。真菌細胞としては、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．、任意のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、任意のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、任意のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、任意のＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、ならびにＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａを含む酵母細胞および糸状菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合部分もしくは断片、軽鎖および／またはその抗原結合性断片をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞へ導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体もしくは断片もしくは鎖の発現、または、宿主細胞が成長する培養培地への分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。

様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明の抗体を発現させることができる。このような宿主−発現系は、それによって抗体のコード配列を生成し、次に、精製することができるビヒクルを表すが、また適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはそれをトランスフェクトしたときに本発明の抗体をｉｎ ｓｉｔｕで発現し得る細胞も表す。これらには、これらに限定されないが、免疫グロブリンコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；免疫グロブリンコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｉｃｈｉａ）；免疫グロブリンコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させたか、もしくは免疫グロブリンコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ細胞（米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）、Ｐｅｒ Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌによって開発されたラット網膜細胞））が含まれる。

細菌系では、発現される抗体を意図した使用に依存して、いくつかの発現ベクターを都合よく選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を作製するために、大量のこのようなタンパク質を生成する場合は、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい場合がある。このようなベクターには、これらに限定されないが、融合タンパク質が生成されるように、抗体コード配列を個々にｌａｃ Ｚコード領域とインフレームでベクターにライゲーションすることができるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、（１９８３年）「Ｅａｓｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ ｃＤＮＡ Ｃｌｏｎｅｓ」、ＥＭＢＯ Ｊ． ２巻：１７９１〜１７９４頁）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら（１９８５年）「Ｕｐ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｌｐｐ Ｇｅｎｅ Ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３巻：３１０１〜３１１０頁；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅら（１９８９年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４巻：５５０３〜５５０９頁）などが含まれる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するためには、ｐＧＥＸベクターも使用することができる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオン−アガロースビーズに吸着および結合した後、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離できるように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。

昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で成長する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置することができる。

哺乳動物宿主細胞では、ウイルスに基づくいくつかの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能で、感染した宿主内で免疫グロブリン分子の発現が可能な組換えウイルスをもたらすことになる。（例えば、Ｌｏｇａｎら（１９８４年）「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ Ｌｅａｄｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｏｆ ｍＲＮＡｓ Ｌａｔｅ Ａｆｔｅｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）８１巻：３６５５〜３６５９頁を参照のこと）。挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、インサート全体の翻訳を保証するためには、開始コドンが、所望のコード配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、由来が種々であってよく、天然および合成の両方であってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを包含させることにより増強できる（Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｙｅａｓｔ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３巻：５１６〜５４４頁を参照のこと）。

さらに、挿入した配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物を翻訳後にプロセシングおよび修飾するための特徴的で特異的な機序を有する。適当な細胞系統または宿主系を選択すると、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証することができる。そのためには、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化の細胞機構を所有する真核生物宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞には、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０、ならびにＨｓ５７８Ｂｓｔが含まれる。

組換えタンパク質を長期にわたり高収量で生成するためには、安定的発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定的に発現する細胞系統を操作することができる。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されたＤＮＡおよび選択マーカーを用いて形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、強化培地中で１〜２日間、操作された細胞の成長を可能にすることができ、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、それ自体の染色体にプラスミドを安定的に組み込み、その後クローニングして細胞系統へと増殖することができるフォーカスを形成するように成長を可能にする。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞系統を操作するために都合よく使用できる。このような操作された細胞系統は、本発明の抗体と直接的にまたは間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。

これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７年）「Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｏｆ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｇｅｎｅ Ｔｏ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｅｌｌ、１１巻：２２３〜２３２頁）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら（１９６２年）「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｓｓ Ｌｉｎｅ． ＩＶ． ＤＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｒａｉｔ」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）４８巻：２０２６〜２０３４頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら（１９８０年）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ＤＮＡ： Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｈｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ａｐｒｔ Ｇｅｎｅ」、Ｃｅｌｌ、２２巻：８１７〜８２３頁）遺伝子を含むいくつかの選択系を、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞で用いることができる。また、以下の遺伝子の場合は、選択基準として代謝拮抗剤耐性を使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら（１９８０年）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈ Ａｎ Ａｍｐｌｆｉａｂｌｅ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ａｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅ」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）７７巻：３５６７〜３５７０頁；Ｏ’Ｈａｒｅら（１９８１年）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｂｙ Ａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ａ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８巻：１５２７〜１５３１頁）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら（１９８１年）「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｔｈａｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｉｎｇ Ｆｏｒ Ｘａｎｔｈｉｎｅ−Ｇｕａｎｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８巻：２０７２〜２０７６頁）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｔａｃｈｉｂａｎａら（１９９１年）「Ａｌｔｅｒｅｄ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｂｙ Ｈｕｍａｎ−Ｈｕｍａｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ Ｂｙ ｐＳＶ２−Ｎｅｏ Ｇｅｎｅ」、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（３号）：２１９〜２２６頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ（１９９３年）「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｃｏｎｃｅｐｔｓ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｒｉａｌｓ Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２巻：５７３〜５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３年）「Ｔｈｅ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０巻：９２６〜９３２頁；およびＭｏｒｇａｎら（１９９３年）「Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２巻：１９１〜２１７頁）。使用できる組換えＤＮＡ技術の、当技術分野で一般的に公知な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３年、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、１９９４年、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ＮＹ．の第１２章および第１３章；Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら（１９８１年）「Ａ Ｎｅｗ Ｄｏｍｉｎａｎｔ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｆｏｒ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０巻：１〜１４頁に記載されており、ヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏである（Ｓａｎｔｅｒｒｅら（１９８４年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ Ｆｏｒ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ Ａｎｄ Ｇ４１８ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ａｓ Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｌ Ｃｅｌｌｓ」、Ｇｅｎｅ、３０巻：１４７〜１５６頁）。

本発明の抗体の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる（総説は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、「Ｔｈｅ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎ Ｍａｍｍａｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」、ＤＮＡ ＣＬＯＮＩＮＧ、３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤レベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させることになる。増幅された領域が、抗体のヌクレオチド配列と関連しているため、抗体産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅら（１９８３年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ」、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３巻：２５７〜２６６頁）。

宿主細胞に、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする本発明の２つの発現ベクターを同時トランスフェクトし得る。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択マーカーを含有することができる。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターを使用することができる。このような状況では、軽鎖は、過剰な毒性遊離重鎖を回避するために重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８６年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、３２２巻：５６２〜５６５頁；Ｋｏｈｌｅｒ（１９８０年）「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｃｈａｉｎ Ｌｏｓｓ Ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｌｉｎｅｓ」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （Ｕ．Ｓ．Ａ．）７７巻：２１９７〜２１９９頁）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。

一般的に、特定の細胞系統またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、細胞系統またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。したがって、抗体の特定のグリコシル化パターンは、抗体を生成するために使用される特定の細胞系統またはトランスジェニック動物に依存する。しかし、本明細書で提供される核酸分子によりコードされるか、または本明細書で提供されるアミノ酸配列を含むすべての抗体は、抗体が有する可能性のあるグリコシル化パターンとは無関係に、本発明を構成する。同様に、特定の実施形態では、非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体が有利であり得る。なぜなら、これらの抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方において、それらのフコシル化対応物より高い効力を典型的に呈することが示されているからである（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８巻：３４６６〜３４７３頁（２００３年）；米国特許第６，９４６，２９２号および同第７，２１４，７７５号を参照のこと）。非フコシル化Ｎ−グリカンを有するこれらの抗体が免疫原性である可能性は低い。なぜなら、それらの炭水化物構造は、ヒト血清ＩｇＧにおいて存在する集団の正常成分であるからである。

本発明の抗体が組換えにより発現されると、抗体は、抗体精製に関して当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインＡ後の特異的抗原に対するアフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的溶解度、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技法によって精製することができる。

急性腎不全の診断

本発明は、部分的に、ＡＫＩと診断された患者に対する抗ＴＩＭＰ−２抗体の投与に関する。上記で注記されたように、用語「急性腎（または腎臓）損傷」および「急性腎（または腎臓）不全」は、本明細書で使用される場合、ベースライン値からの血清クレアチニンの変化に関して部分的に定義される。ＡＲＦのほとんどの定義は、血清クレアチニンの使用、および、多くの場合、尿排出量の使用を含む共通要素を有する。患者は、この比較において使用するための腎機能の利用可能なベースライン尺度を用いずに腎機能障害を示すことがある。このような事象では、患者が最初に正常ＧＦＲを有していたと仮定することによってベースライン血清クレアチニン値を推定することができる。糸球体濾過率（ＧＦＲ）は、腎（腎臓）糸球体毛細血管からボーマン嚢内へ濾過される単位時間当たりの流体体積である。糸球体濾過率（ＧＦＲ）は、血中で定常レベルを有し、かつ、腎臓によって支障なく濾過されるが再吸収も分泌もされない、任意の化学物質を測定することによって計算され得る。ＧＦＲは、典型的には、ｍｌ／分の単位で表される。

ＧＦＲを体表面積に対して正規化することによって、１．７３ｍ^２当たりほぼ７５〜１００ｍｌ／分のＧＦＲが仮定され得る。したがって、測定された率は、計算可能な血液体積から生じた尿中の物質量である。

糸球体濾過率（ＧＦＲまたはｅＧＦＲ）を計算または推定するために使用されるいくつかの異なる技法が存在する。しかしながら、臨床上の実施において、クレアチニンクリアランスがＧＦＲを測定するために使用される。クレアチニンは、身体によって自然に産生される（クレアチニンは、筋肉内に見出されるクレアチンの代謝産物である）。クレアチニンは、糸球体によって支障なく濾過されるが、また非常に少量が尿細管によって能動的に分泌され、そのためクレアチニンクリアランスは、実際のＧＦＲを１０〜２０％過大に推定する。クレアチニンクリアランスが容易に測定されることを考えれば、この誤差の範囲は許容可能である。

クレアチニンクリアランス（ＣＣｒ）は、クレアチニンの尿中濃度（Ｕ_Ｃｒ）、尿流量（Ｖ）、およびクレアチニンの血漿中濃度（Ｐ_Ｃｒ）の値が既知であれば計算され得る。尿中濃度と尿流量の積がクレアチニンの排出率をもたらすので、クレアチニンクリアランスはまた、排出率（Ｕ_Ｃｒ×Ｖ）をその血漿中濃度で割ったものであると言われる。これは、通常、以下のように数学的に表される。

通常、ある朝の空の膀胱から翌朝の膀胱の内容物まで２４時間の採尿が企てられ、次いで、比較血液試験が行われる。

異なる大きさの人々の間での結果の比較を可能にするために、ＣＣｒは、体表面積（ＢＳＡ）に対して補正され、平均的な大きさの人と比較してｍｌ／分／１．７３ ｍ２で表されることが多い。ほとんどの成人は、１．７に近いＢＳＡ（１．６〜１．９）を有するが、極度の肥満または極度に細い患者は、彼らの実際のＢＳＡに対して補正されたＣＣｒを有するべきである。

クレアチニンクリアランス測定の精度は（採取が完全な場合でさえ）限定される。なぜなら、糸球体濾過率（ＧＦＲ）が低下するとクレアチニン分泌は増加し、ゆえに、血清クレアチニンの上昇は少なくなるからである。ゆえに、クレアチニン排出は、濾過される負荷よりもはるかに多いので、結果として（２倍ほどの差の）ＧＦＲの潜在的に大きな過剰推定をもたらす。しかしながら、臨床目的にとって、腎機能が安定であるかまたは悪化しているか良くなっているかを決定することは重要である。これは、多くの場合、血清クレアチニン単独をモニタリングすることによって決定される。クレアチニンクリアランスのように、血清クレアチニンは、ＡＲＦの非定常状態の条件において、ＧＦＲの正確な反映ではない。それにもかかわらず、血清クレアチニンがベースラインから変化する程度は、ＧＦＲにおける変化を反映するであろう。血清クレアチニンは、直ちにかつ容易に測定され、腎機能に対して特異的である。

ｍＬ／ｋｇ／時を基にする尿排出量において尿排出量を決定する目的のために、１時間毎の尿採取および測定が適切である。例えば、２４時間の累積排出量のみが利用可能であり、患者の体重が提供されていない場合において、ＲＩＦＬＥ尿排出量判断基準の微修正が記載されている。例えば、Ｂａｇｓｈａｗら、Ｎｅｐｈｒｏｌ． Ｄｉａｌ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． ２３巻：１２０３〜１２１０頁、２００８年は、平均患者体重７０ｋｇを仮定し、患者は、以下に基づいて、ＲＩＦＬＥ分類に割り当てられる：＜３５ｍＬ／時（Ｒｉｓｋ）、＜２１ｍＬ／時（Ｉｎｊｕｒｙ）または、＜４ｍＬ／時（Ｆａｉｌｕｒｅ）。

リスク評価

ＡＫＩは、有意な罹患率および死亡率に関連し、ＡＫＩを逆転させるために特定の処置が利用不能であるため、早期認識と管理が最も重要である。実際に、ＡＫＩのリスクを有するか、または臨床症状発現の前であるがＡＫＩを有する可能性のある患者の認識は、確立したＡＫＩのみを処置するよりもより良い転帰をもたらす傾向がある。したがって、本発明は、部分的に、切迫した（７２時間以内、より好ましくは４８、２４、１８、または１２時間以内）ＡＫＩの高リスクを有する患者への抗ＴＩＭＰ−２抗体の投与に関する。

高リスクの患者は、急性腎臓損傷（ＡＫＩ）に対するリスク因子を有するが、正常なＧＦＲを有する患者を含む。例えば、高リスクの患者は、糖尿病および高血圧症を有するかまたは非ステロイド抗炎症薬もしくはアンギオテンシン変換酵素阻害剤などの薬品を摂取している患者を含んでもよい。これらの個体は、可能であれば、リスク因子を修正するために特定される必要があり、指示された場合（例えば、対比研究）予防戦略を開始する必要のある集団を表す。腎前性ＡＫＩを有する患者は、腎前性尿指数とＧＦＲの低下を導く自己調節機序の不全（例えば、脱水）を有する患者である。これらの個体は、腎前性状態の急速な逆転に対する潜在能力を有する。この期間、近位尿細管細胞の刷子縁への損傷が存在するが検出不能である場合がある。しかし、新規バイオマーカーを用いると、早期損傷の特定と処置が可能である。ＡＫＩを有する患者は、重度の腎前性ＡＫＩの拡張を表す場合がある。あるいは、一部の状態では、ＡＫＩは、腎前性の状況（例えば、敗血症、腎毒素への曝露）が先行しない場合がある。血清クレアチニンは、後期マーカーであり、実質的損傷が存在した後にＡＫＩを検出することになる。この時点では、介入は遅すぎる場合がある。

すべての付録を含む全体が参照により組み込まれる、ＫＤＩＧＯ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｆｏｒ Ａｃｕｔｅ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ（Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ． ２巻（補遺１号）、２０１２年は、特に第２．２章と付録Ｄにおいて、ＡＫＩに対するリスク評価の説明を提供する。リスク因子としては、水分補給状態（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ）、低アルブミン血症、高齢、女性の性別、黒色人種、ＣＫＤの存在、糖尿病、心疾患、敗血症、または肺疾患、ある特定の薬品への曝露、および腎毒性の造影剤、心臓手術などが挙げられる。

バイオマーカーの使用

血清クレアチニン測定値（ＳＣｒ）は、腎機能に対するゴールドスタンダードマーカーである。しかし、ＳＣｒ濃度は、ネフロンの５０％が失われるまで、残っている健常なネフロンの機能予備能（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅｒｖｅ）がＳＣｒの有意な上昇を妨げるため、腎機能の急な低下を検出するのに不正確である場合がある。したがって、ＳＣｒは腎損傷の「後期」マーカーであるため、ＳＣｒに基づく腎機能の推定が「正常」であっても、腎損傷がすでに始まっている場合がある。ＡＫＩを評価するために使用されている他のバイオマーカーとして、血清および尿中のシスタチンＣ、血清および尿中の好中球ゼラチナーゼ結合性リポカイン、尿中の腎臓損傷分子１、インターロイキン−１８、肝臓型脂肪酸結合タンパク質、ならびにＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼが挙げられる。

２０１４年には、米国食品医薬品局は、患者が将来ＡＫＩを発症するリスクを有することを特定するために、メタロプロテイナーゼ２の組織阻害剤とインスリン様増殖因子結合タンパク質７の尿中濃度の組み合わせ（［ＴＩＭＰ−２］×［ＩＧＦＢＰ７］）に基づく試験の市販を承認した。１つの研究では、ＩＣＵ入室後間もなくの尿中のＴＩＭＰ２・ＩＧＦＢＰ７の単回測定を行ったところ、１２時間以内の中程度から重度のＡＫＩの発症について０．８４のＡＵＣ−ＲＯＣを見出した。０．３のカットオフ値を使用すると、試験は、それぞれ、８９％（７７〜９７％）と４９％（４３〜５４％）の感度と特異性を示し、２．０のカットオフ値では、試験は、４０％（２３〜５７％）と９４％（９２〜９６％）の感度と特異性を示した。Ｇｕｎｎｅｒｓｏｎら、Ｊ． Ｔｒａｕｍａ Ａｃｕｔｅ Ｃａｒｅ Ｓｕｒｇ． ８０巻：２４３〜４９頁、２０１６年。このような試験は、本発明の方法に従う処置に対して、高リスク患者を特定する理想的な方法を提供する。

医薬組成物および投与

本発明の抗ＴＩＭＰ−２抗体および抗原結合性断片の医薬または無菌組成物を調製するために、抗体またはその抗原結合性断片は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混ぜられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ： Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８４年）を参照のこと。

治療剤および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁物の形態の許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製されてもよい（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１年）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ： Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００年）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照のこと）。

単独でまたは別の治療剤と組み合わせて投与される本発明の抗体の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死の用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順で決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトでの使用のための投薬量範囲の製剤化に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない、ＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および投与経路に依存してこの範囲内で異なってもよい。

さらなる実施形態では、さらなる治療剤が、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；第５７版（２００２年１１月１日））に従って、本発明の抗ＴＩＭＰ−２抗体またはその抗原結合性断片に付随して被験体に投与される。

投与様式は変化し得る。投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、ガス注入、局所、皮膚、経皮、または動脈内が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明の抗ＴＩＭＰ−２抗体またはその抗原結合性断片は、注射によるなど侵襲的経路で投与され得る。本発明のさらなる実施形態では、抗ＴＩＭＰ−２抗体もしくはその抗原結合性断片、またはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内に、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路による投与（例えば、経口的に、例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤で）も本発明の範囲内にある。

本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合性断片またはその医薬組成物のいずれかを含む容器（例えば、キャップまたはクロマトグラフィーカラム、中空針またはシリンジシリンダーなどを有するプラスチックまたはガラスバイアル）を提供する。本発明はまた、本発明の抗体もしくは抗原結合性断片またはその医薬組成物のいずれかを含む注射デバイスを提供する。注射デバイスは、非経口経路、例えば、筋肉内、皮下または静脈内を介して、物質を患者の体内に導入するデバイスである。例えば、注射デバイスは、例えば、注射される流体（例えば、抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物）を保持するシリンダーまたはバレル、流体を注射するための、皮膚および／または血管を刺すための針、ならびに流体をシリンダーから押し出して針の穴を通すためのプランジャーを含むシリンジ（例えば、医薬組成物を予め充填した、例えば、自動注射器）であってもよい。本発明の実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片またはそれらの医薬組成物を含む注射デバイスは、静脈内（ＩＶ）注射デバイスである。このようなデバイスは、カニューレまたはトロカール／針を介して患者の体内に導入される流体（例えば、生理食塩水；またはＮａＣｌ、乳酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＣａＣｌ_２を含む、および必要に応じてグルコースを含む乳酸加リンゲル液）を保持するためのバッグまたはリザーバーに取り付けられていてもよいチューブに取り付けられていてもよいカニューレまたはトロカール／針中に抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物を含む。抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物は、本発明の実施形態では、トロカールおよびカニューレが被験体の静脈に挿入されるとデバイスに導入されてもよく、トロカールは挿入されたカニューレから除去される。ＩＶデバイスは、例えば、（例えば、手または腕の）末梢静脈；上大静脈もしくは下大静脈、または心臓の右心房内（例えば、中央ＩＶ）に；あるいは鎖骨下静脈、内頚静脈、または大腿静脈に挿入されてもよく、例えば、ＩＶデバイスが上大静脈または右心房（例えば、中心静脈線）に到達するまで心臓に向かって進めてもよい。本発明の実施形態では、注射デバイスは、自動注射器、ジェット式注射器または外部輸液ポンプである。ジェット式注射器は、表皮を貫通して、抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物を患者の体に導入する液体の細い高圧ジェットを使用する。外部輸液ポンプは、抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物を、量を制御して、患者の体内に送達する医学デバイスである。外部輸液ポンプは、電気的にまたは機械的に動力を供給されてよい。様々なポンプが様々な方法で作動し、例えば、シリンジポンプはシリンジのリザーバーに流体を保持し、可動ピストンが流体送達を制御し、エラストマーポンプは伸縮自在なバルーンリザーバー中に流体を保持し、バルーンの弾性壁からの圧力が流体送達を駆動する。蠕動ポンプでは、一組のローラーが、ある長さの可撓性チューブを挟み、流体を前方に押す。マルチチャネルポンプでは、流体は、複数の速度で複数のリザーバーから流体を送達することができる。

本明細書に開示される医薬組成物はまた、米国特許第６，６２０，１３５号；同第６，０９６，００２号；同第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。医薬組成物を含むこのような無針デバイスはまた、本発明の一部である。本明細書に開示される医薬組成物はまた、注入によって投与することができる。医薬組成物を投与するための周知のインプラントおよびモジュールの例として、速度を制御して薬品を分注するための埋め込み型微注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；正確な注入速度で薬品を送達するための薬品注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための可変流量埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号に開示されるものが挙げられる。他の多くのこのようなインプラント、送達システム、およびモジュールが、当業者に周知であり、本発明の医薬組成物を含むものは本発明の範囲内である。

投与レジメンは、治療用抗体または抗原結合性断片の血清または組織の代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性、および生体マトリクスにおける標的細胞の接近性を含むいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、望ましくない副作用を最小限にすると同時に、標的疾患の状況の改善をもたらすのに十分な治療用抗体または断片を送達する。したがって、送達される生物製剤の量は、部分的に、特定の治療用抗体、および処置される状態の重症度に依存する。治療用抗体または断片の適当な用量を選択するガイダンスが利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ． Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｅｒｔら（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４８巻：６０１〜６０８頁；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４１巻：１９６６〜１９７３頁；Ｓｌａｍｏｎら（２００１年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４４巻：７８３〜７９２頁；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４２巻：６１３〜６１９頁；Ｇｈｏｓｈら（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４８巻：２４〜３２頁；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４３巻：１５９４〜１６０２頁を参照のこと）。

適当な用量の決定は、臨床医によって、例えば、処置に影響を及ぼすことが当技術分野で公知かまたは影響を及ぼすと予想されるパラメーターまたは因子を使用してなされる。一般的には、用量は、やや最適の用量未満の量から始め、その後、所望の効果または最適の効果が、あらゆる負の副作用と比べて達成されるまで、わずかな増分だけ増大される。重要な診断尺度は、例えば、炎症の症状の尺度または生成された炎症性サイトカインのレベルを含む。一般的に、使用される生物製剤が、処置のために標的とされた動物と同じ種に由来し、それによって、試薬に対する任意の免疫応答を最小限にすることが望ましい。ヒト被験体の場合では、例えば、ヒト化および完全ヒト抗体が望ましい場合がある。

本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片は、連続的注入によって、または、例えば、毎日、１週間に１〜７回、毎週、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎、半年毎、毎年など、投与された用量によって提供することができる。用量は、例えば、静脈内に、皮下に、局所的に、経口的に、経鼻的に、直腸に、筋肉内に、脳内に、脊髄内に、または吸入によって提供され得る。毎週の総用量は、一般的に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれよりも多い（例えば、Ｙａｎｇら（２００３年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４９巻：４２７〜４３４頁；Ｈｅｒｏｌｄら（２００２年）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４６巻：１６９２〜１６９８頁；Ｌｉｕら（１９９９年）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． Ｐｓｙｃｈ． ６７巻：４５１〜４５６頁；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら（２０００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５２巻：１５１〜１４４頁を参照のこと）。用量はまた、被験体の血清中の抗ＴＩＭＰ−２抗体の所定の標的濃度、例えば、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれよりも高い濃度を達成するために提供されてもよい。他の実施形態では、本発明の抗ＴＩＭＰ−２抗体は、例えば、皮下または静脈内に、毎週、２週間毎、「４週毎」、毎月、２カ月毎、または３カ月毎を基準に、被験体当たり１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ投与される。

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、細胞、組織、または被験体に、単独でまたは追加の治療剤と組み合わせて投与される場合に、疾患の１つまたは複数の症状、例えば、がんまたはがんの進行における測定可能な改善を引き起こすのに有効な本発明の抗ＴＩＭＰ−２またはその抗原結合性断片の量を指す。有効用量は、さらに、少なくとも部分的な症状の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）、例えば、腎機能または組織学の改善をもたらすのに十分な抗体または断片の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、有効用量は、その成分を単独で指す。組み合わせに適用される場合、有効用量は、逐次的にまたは同時に組み合わせて投与されるか否かにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせた量を指す。治療薬の有効量は、少なくとも１０％の；通常は、少なくとも２０％の；好ましくは、少なくとも約３０％の；より好ましくは少なくとも４０％の、最も好ましくは少なくとも５０％の診断尺度またはパラメーターの改善をもたらすことになる。有効量はまた、主観的な尺度が疾患の重症度を評価するために使用される場合には、主観的な尺度に改善をもたらすことができる。

追加の処置モダリティ

一旦、診断が得られるかまたは患者が「高リスク」と特定されると、臨床医は、例えば、腎代替療法を開始すること、腎臓に傷害を与えることが公知である化合物の送達を中止すること、腎臓移植、腎臓に傷害を与えることが公知である手順を遅らせるかまたは回避すること、利尿薬投与を修正すること、目標指向療法を開始することなどの診断に適合する処置レジメンを容易に選択することができる。当業者は、本明細書で記載された診断方法に関連して議論される多数の疾患に対する適当な処置を知っている。例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、第１７版、Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ、１９９９年を参照のこと。これらの処置は、本発明に従う抗ＴＩＭＰ−２抗体の投与と一緒に使用することができる。

ＡＫＩに対する管理および処置の選択肢は多因子性であり、最終的には、各特異的状況および患者に対して調整させなければならない。以前に述べたように、連続的であるか間欠的であるかにかかわらず、ＲＲＴは、腎臓機能を代用する血液精製系である。しかし、ＲＲＴは、上記で論じたように、リスクと合併症を伴い、エビデンスによると、ＲＲＴは、より悪い転帰に対する独立したリスク因子となり得ることが示唆される。リスク−ベネフィットの観点から、ＲＲＴは、最も持続性ＡＫＩを有する傾向にあり、および／または最も回復する可能性の低いと考えられる患者に対して確保されるべきである。この二分法的構成では、保存的管理は、臨床エビデンス、ベッドサイド評価および客観的データが、ＡＫＩからの回復に対する高い尤度および／またはＡＫＩの非持続性を示唆する状況を含む、多くの通常の臨床シナリオに対する好ましい臨床選択肢を高い頻度で表す。

保存的管理は、ＲＲＴを使用することなく、ＡＫＩの危険かつ生命を脅かす症状発現に対処する医学的介入および手法と定義される。これらの管理戦略として、これらに限定されないが、多血症および体液平衡失調、アシドーシスおよび酸−塩基障害、電解質異常（例えば、高カリウム血症）、ならびに尿毒症および重度の高窒素血症などの重要な生理学的および病態生理学的異常が挙げられる。保存的管理戦略は、以下の基本的戦略からなる：
血行動態サポート：
ａ．クリスタロイド、およびコロイドの使用を含む輸液療法（ｆｌｕｉｄ ｔｈｅｒａｐｙ）
ｂ．昇圧剤および血管作用剤の投与（通常、使用される昇圧薬剤は、以下の：ノルエピネフリン、エピネフリン、フェニレフリン、ドーパミン、バソプレッシンを含む）
ｃ．ループ利尿薬および浸透圧利尿薬の使用を含む利尿薬療法
ｄ．アシドーシスおよび他の酸−塩基異常の処置
ｅ．カリウムおよび他の電解質異常および不均衡の処置
ｆ．血糖コントロールおよび高血糖の処置
ｇ．栄養サポート。

高カリウム血症は、重度である場合、内科救急であり、即時介入を必要とする。処置手法は、３つの主要な手法に分けられる：１）細胞外空間から細胞内空間にカリウムをシフトさせる介入、２）カリウムの膜作用を安定化させる介入、および３）カリウム排除を増強する介入。これらの介入は同時に提供されることが多い。

ＡＫＩを有する患者は、通常、臨床的に有意である場合に介入を必要とする酸−塩基異常、最も注目すべきは、代謝性アシドーシスを発症する。

ストレス高血糖により上昇したグルコースは、ＡＫＩおよび他の重症疾病において直面する頻度が高く、血糖制御に関連する転帰ベネフィットに関してエビデンスは論争の的のままであるが、患者および集団はベネフィットを受ける可能性があり、所望のグルコース標的と（相対的）正常血糖を達成するための特定の治療手法、ケアのコンセンサスと現行の標準は以下を示唆する：１１０から１４９ｍｇ／ｄＬ（６．１〜８．３ｍｍｏｌ／Ｌ）の間およびそれを超える血清グルコースレベルを達成するためのインスリン療法の使用；ならびに血清グルコースの高頻度のモニタリング。

保存的管理の他に、医師は、腎代替療法の開始または維持が適当であることを決定することができる。間欠的ＲＲＴは、血液透析と持続型低効率透析を含む一方、連続ＲＲＴは、限外濾過（ＵＦ）、連続的静静脈血液濾過（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｖｅｎｏｖｅｎｏｕｓ Ｈｅｍｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＣＶＶＨ）、連続的静静脈血液透析（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｖｅｎｏｖｅｎｏｕｓ Ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ）（ＣＶＶＨＤ）、連続的静静脈血液濾過透析（Ｃｏｎｔｉｎｏｕｕｓ Ｖｅｎｏｖｅｎｏｕｓ Ｈｅｍｏｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＣＶＶＨＤＦ）、連続的静静脈高流量血液透析（Ｃｏｎｔｉｎｏｕｓ Ｖｅｎｏｖｅｎｏｕｓ Ｈｉｇｈ−Ｆｌｕｘ Ｈｅｍｏｄｉａｌｙｓｉｓ）、および連続的動脈性静脈血液濾過透析（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ａｒｔｅｒｉａｌ Ｖｅｎｏｕｓ Ｈｅｍｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＣＡＶＨ）を指す。

一般的方法

分子生物学の標準的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２年および１９８９年第２版、２００１年第３版）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｗｕ（１９９３年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に記載される。標準的方法はまた、細菌細胞におけるクローニングとＤＮＡ変異誘発（１巻）、哺乳動物細胞と酵母におけるクローニング（２巻）、糖コンジュゲートとタンパク質発現（３巻）、およびバイオインフォマティクス（４巻）について記載するＡｕｓｂｅｌら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１〜４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹにもみられる。

免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製のための方法について記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化について記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ、１６．０．５〜１６．２２．１７頁；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｃｏ．（２００１年）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；４５〜８９頁；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１年）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、３８４〜３９１頁を参照のこと）。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成、精製、および断片化について記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上掲）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的技法が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。

モノクローナル、ポリクローナル、およびヒト化抗体は調製することができる（例えば、ＳｈｅｐｅｒｄおよびＤｅａｎ（編）（２０００年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）（２００１年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１３９〜２４３頁；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２０００年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５巻：６２０５頁；Ｈｅら（１９９８年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０巻：１０２９頁；Ｔａｎｇら（１９９９年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４巻：２７３７１〜２７３７８頁；Ｂａｃａら（１９９７年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２巻：１０６７８〜１０６８４頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁；ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４巻：４８７〜４９９頁；米国特許第６，３２９，５１１号を参照のこと）。

ヒト化への代替法は、ファージに提示されたヒト抗体ライブラリーまたはトランスジェニックマウスのヒト抗体ライブラリーを使用することである（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １４巻：３０９〜３１４頁；Ｂａｒｂａｓ（１９９５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１巻：８３７〜８３９頁；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻：１４６〜１５６頁；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＣｈａｍｅｓ（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、２１巻：３７１〜３７７頁；Ｂａｒｂａｓら（２００１年）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋａｙら（１９９６年）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ｄｅ Ｂｒｕｉｎら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７巻：３９７〜３９９頁）。

単鎖抗体およびダイアボディについて記載されている（例えば、Ｍａｌｅｃｋｉら（２００２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９９巻：２１３〜２１８頁；Ｃｏｎｒａｔｈら（２００１年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６巻：７３４６〜７３５０頁；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら（２００１年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６巻：２６２８５〜２６２９０頁；ＨｕｄｓｏｎおよびＫｏｒｔｔ（１９９９年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻：１７７〜１８９頁；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。二官能性抗体が提供される（例えば、Ｍａｃｋら（１９９５年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９２巻：７０２１〜７０２５頁；Ｃａｒｔｅｒ（２００１年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８巻：７〜１５頁；Ｖｏｌｋｅｌら（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１４巻：８１５〜８２３頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８巻：１〜６頁；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１〜８３頁；Ｒａｓｏら（１９９７年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２巻：２７６２３頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：１２０２〜１２０７頁；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１年）ＥＭＢＯ Ｊ． １０巻：３６５５〜３６５９頁；ならびに米国特許第５，９３２，４４８号、同第５，５３２，２１０号、および同第６，１２９，９１４号を参照のこと）。

多重特異性抗体も提供される（例えば、Ａｚｚｏｎｉら（１９９８年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１巻：３４９３頁；Ｋｉｔａら（１９９９年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２巻：６９０１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（２０００年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ７４巻：９１１５頁；Ｐａｎｄｅｙら（２０００年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５巻：３８６３３頁；Ｚｈｅｎｇら（２００１年）Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７６巻：１２９９９頁；Ｐｒｏｐｓｔら（２０００年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５巻：２２１４頁；Ｌｏｎｇ（１９９９年）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７巻：８７５頁；Ｌａｂｒｉｊｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１１０巻：５１４５〜５０頁、２０１３年；ｄｅ Ｊｏｎｇら、ＰＬＯＳ Ｂｉｏｌ、１４巻（１号）：ｅ１００２３４４頁、２０１６年（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．１００２３４４を参照のこと）。

抗原の精製は、抗体の作製にとって必須ではない。動物は、目的の抗原を有する細胞で免疫化することができる。次いで、脾臓細胞を免疫化動物から単離することができ、脾臓細胞を骨髄腫細胞系統と融合してハイブリドーマを生成することができる（例えば、Ｍｅｙａａｒｄら（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、７巻：２８３〜２９０頁；Ｗｒｉｇｈｔら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１３巻：２３３〜２４２頁；Ｐｒｅｓｔｏｎら、上掲；Ｋａｉｔｈａｍａｎａら（１９９９年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３巻：５１５７〜５１６４頁を参照のこと）。

抗体は、例えば、小型薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされ得る。抗体は、治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、例えば、色素、放射性同位体、酵素、または金属、例えば、コロイド金に連結した抗体を含む（例えば、Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌら（１９９１年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４６巻：１６９〜１７５頁；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉら（１９９８年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０巻：３８９１〜３８９８頁；ＨｓｉｎｇおよびＢｉｓｈｏｐ（１９９９年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６２巻：２８０４〜２８１１頁；Ｅｖｅｒｔｓら（２００２年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６８巻：８８３〜８８９頁を参照のこと）。

蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４年）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１年）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、第２版；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪを参照のこと）。例えば、診断試薬として使用するための核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチド、ならびに抗体を修飾するのに適する蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３年）カタログ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３年）カタログ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。

免疫系の組織学の標準的方法が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６年）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ： Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００年）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ、ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２年）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ： Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照のこと）。

例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．、Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ、Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６巻：７４１〜７４２頁；Ｍｅｎｎｅら（２０００年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ、１６巻：７４１〜７４２頁；Ｗｒｅｎら（２００２年）Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ． ６８巻：１７７〜１８１頁；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３年）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３３巻：１７〜２１頁；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４巻：４６８３〜４６９０頁を参照のこと）。

（実施例１：ウサギにおけるモノクローナル抗体の発生）

雌のニュージーランドウサギを、抗原／アジュバントエマルションで皮下注射（ＳＱ）によって免疫化する。一次免疫化は、完全フロイントアジュバントを用いてなされ、不完全フロイントアジュバントは、次のすべての追加免疫に対して使用する。ウサギは、ウサギ１頭当たり２５０μｇのタンパク質抗原を３週間毎にＳＱ注射する（２つの部位、臀部と肩甲骨を交互に）。試験採血は、２回目の追加免疫の７日後に耳翼辺縁静脈（ｍａｒｇｉｎａｌ ｅａｒ ｖｅｉｎ）から採取する。この試験採血（抗血清）を間接ＥＬＩＳＡアッセイによって試験し、ウサギの免疫応答がモノクローナル抗体の発生にとって適当であるかどうかを決定する。最良の応答するウサギに最後のＳＱ追加免疫を与え、４日後に、失血により安楽死させる。全血は、心臓穿刺により採取する。目的の抗体を産生するＢ細胞は、標的抗原に関する間接ＥＬＩＳＡによって特定し、免疫グロブリン遺伝子を単離する。重鎖および軽鎖を別々の哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトし（一過性トランスフェクション）、ウサギのモノクローナル抗体を含有する組織培養上清を回収する。

（実施例２：マウスにおけるモノクローナル抗体の発生）

雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６０日齢）を、標準的操作手順によって、抗原／アジュバントエマルションで腹腔内注射（ＩＰ）によって免疫化する。一次免疫化は、完全フロイントアジュバントを用いてなされ、不完全フロイントアジュバントは、次のすべての追加免疫に対して使用する。マウスは、マウス１頭当たり２５μｇの抗原を３週間毎にＩＰ注射する（マウス１頭当たり１２５μＬの総体積）。試験用採血は、２回目の追加免疫の７から１０日後に伏在静脈穿刺（ｓａｐｈｅｎｏｕｓ ｖｅｉｎ ｌａｎｃｉｎｇ）によってなされる。この試験採血（抗血清）を間接ＥＬＩＳＡアッセイによって試験し、マウスの免疫応答が融合にとって適当であるかどうかを決定する。最良の応答する２頭のマウスに、外側尾静脈を介して、無菌生理食塩水中、マウス１頭当たり１０μｇの抗原の最終の静脈内追加免疫を与える。ＩＶ追加免疫の４日後に、マウスを安楽死させ、脾臓を回収する。脾臓から単離したリンパ球を融合プロセスで使用し、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．； Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．（１９７５年）「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻（５５１７号）：４９５〜４９７頁の方法を使用してハイブリドーマを生成する。ハイブリドーマをＰＥＧ１５００融合プロセスを使用して作製する。

（実施例３：ヒト化）

マウスモノクローナルのマウス可変（Ｖ）領域フレームワーク（ＦＲ）配列を、参照により組み込まれるＫａｂａｔのデータベース（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｕ．Ｓ． Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｉｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）のヒト抗体のものと比較することによって、ヒト配列は、マウスモノクローナルのＶＫおよびＶＨドメインのＦＲと最も高い程度の配列相同性を示すことが見出される。したがって、これらのヒト配列は、マウスモノクローナルに対するＣＤＲが移植されるヒトフレームワークとして選択される。

（実施例４：組織学的評価）

動物モデルにおける腎臓損傷の決定に関する標準は、熟練の病理学者による腎臓形態の注意深い顕微鏡検査である。例えば、ＦＤＡ「Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｓａｆｅｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにより提出、２００９年、１３頁（「Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｔｈａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｉｎｊｕｒｙ」）を参照のこと；また、Ｖａｉｄｙａら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２８巻：４７８〜８５頁、２０１０年（ＳＣｒとＢＵＮの乏しい感度と特異性によって、腎臓細管傷害が組織病理学によってスコア化される）も参照のこと。Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｐａｔｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＰｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｓａｆｅｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＰＳＴＣ）Ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＮＷＧ）は、組織病理学の語彙を作成し、０〜５の重症度スコアグレーディングスケールを割り当て、病理学的病変を、０（観察可能な病理なし）、１（最小限）、２（軽微）、３（中程度）、４（顕著な）または５（重度）に等級付けた。このグレーディングスケールを使用して、抗ＴＩＭＰ−２による処置の効果を評価した。

（実施例５）

Ｂａｌｂ／ｃマウス（２０〜２４週齢、体重２５〜３０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．から購入した。すべての手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＰＭＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。１週間の馴化期間後に、マウスを盲腸結紮穿刺手術（ＣＬＰ）に供して敗血症を誘導するかまたはイソフルランによる麻酔後に開腹手術のみ（偽）に供した。具体的には、盲腸を露出させ、上から１／４で結紮し、２１ゲージの針で３回穿刺させた。排泄物の液滴を押出し、結紮および穿刺した盲腸を腹部に再配置し、腹壁を閉じた。標準的な術後処置として、補液蘇生（生理食塩水４０ｍｌ／ｋｇ）の投与を一回、首筋に皮下で実施し、ブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を注射し、セフトリアキソン（２５ｍｇ／ｋｇ）とメトロニダゾール（１２．５ｍｇ／ｋｇ）を含む抗生物質を手術後直ちにと１２時間毎に３日間腹腔内に適用した。すべての動物を厳重にモニタリングし、回復中は食餌および水に自由にアクセス可能とした。マウスは、手術の４８時間後に屠殺し、腎臓組織を回収し、血液試料をさらなる測定のために得た。

抗ＴＩＭＰ２抗体の２つのアイソタイプは、Ａｓｔｕｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって提供された。抗体ＴＩＭＰ２（ＮＢ１７２−７７）は、モノクローナルＦ（ａｂ’）２であり、抗体ＴＩＭＰ２（ＮＢ２５１−４７）は、ポリクローナルヤギＩｇＧである。ＣＬＰ動物をＣＬＰ手術の８時間後に３つの群に無作為化した：ＣＬＰ（ビヒクルプラセボで処置した）、ＣＬＰ＋抗ＴＩＭＰ２抗体ＮＢ１７２−７７、５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射）、ＣＬＰ＋抗ＴＩＭＰ２抗体ＮＢ２５１−４７、５ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射）。

腎臓損傷をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色組織学の組織画像における組織学によってスコア化した。これは、細胞浸潤スコア（０〜３）と尿細管上皮損傷スコア（０〜５）を含んだ。具体的には、細胞浸潤は、尿細管と血管壁周辺の細胞（層）の近似値をスコア化することによって決定した（スコア：０＝なし、１＝＜１０個の細胞（５つの層）、２＝１０から２０個の細胞（５から１０個の細胞層）、３＝＞３０個の細胞（＞１０個の細胞層）；尿細管上皮の損傷は、細胞壊死、刷子縁の損失、円柱形成、空胞形成、および尿細管拡張を呈する尿細管の比率に基づいて、以下のようにスコア化した：０、なし；１、＜１０％；２、１１％から２５％；３、２６％から４５％；４、４６％から７５％；および５、＞７６％。血清クレアチニン（ＳＣｒ）は、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）からのクレアチニンアッセイキットにより測定した。

群を比較する統計試験は、ＳＰＳＳバージョン１４．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して解析した。対になった実験群はｔ検定を使用して比較した。差は、ｐ＜０．０５で有意とみなした。結果は、平均±ＳＥＭとして表す。

図１に示すように、ＴＩＭＰ２（ＮＢ１７２−７７）による抗ＴＩＭＰ２処置により、未処置の敗血症動物と比較して、腎臓組織損傷の程度が有意に低下した（両側Ｔ検定、Ｐ値０．０４６）。予期されたように、抗ＴＩＭＰ２処置は、血清クレアチニンによって測定された腎臓機能に影響を及ぼさない（図２）。したがって、ＴＩＭＰ２は、血清クレアチニンレベルと無関係に、敗血症の間に腎臓組織傷害を促進する。

本発明は、当業者がこれを作製および使用するのに十分詳細に記載および例示されたが、種々の変更、修正、および改良は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく明らかであるべきである。本明細書に提供される例は、好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。そこにおける修正および他の使用が当業者に対して生じるであろう。これらの修正は、本発明の精神内に包含され、請求項の範囲によって定義される。

本明細書における「または（ｏｒ）」の使用は、別段述べられていなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換的であり、限定を意図するものではない。

種々の実施形態の記載が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者は、一部の具体例では、実施形態が、言語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を使用して代わりに記載され得ることをさらに理解する。

別段定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この開示が属する技術分野における当業者に通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または均等な任意の方法および試薬が、開示された方法および組成物の実践において使用することができるが、例示的方法および材料がここに記載される。

本明細書で言及されるすべての刊行物は、本明細書の記載と関連して使用され得る刊行物に記載される方法論を記載および開示する目的で、完全に参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、この開示の出願日前の、本発明が属する技術分野の当業者のレベルの指標である。本明細書のいずれも、本発明者らが、前の開示のために、このような開示に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。

本発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々な置き換えおよび修正が本明細書に開示された発明に対してなされ得ることは、当業者にとって容易に明らかとなろう。

本明細書に例示的に記載された発明は、本発明に具体的に開示されていないいずれの要素（複数可）、限定（複数可）もない場合に実践することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合には、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いられた用語および表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示されかつ記載された特色の任意の均等物またはその部分を除外する意図はないが、種々の修正が特許請求された発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態と必要に応じた特色によって具体的に開示されているが、開示された本明細書の概念の修正および変形が当業者によって行われる場合があり、このような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されたこの発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に示される。

Claims (22)

1. 腎臓機能の改善を必要とする被験体の腎臓機能を改善する方法であって、腎臓機能の改善のために指示される１つまたは複数のさらなる治療剤または治療手順を必要に応じて伴って、前記被験体に、メタロプロテイナーゼ阻害剤２（ＴＩＭＰ−２）に特異的に結合する抗体を、腎臓機能を改善するのに十分な量で投与することを含む、方法。
2. 前記被験体が、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を有するかまたはＣＫＤの１つもしくは複数の症状を呈する、請求項１に記載の方法。
3. 前記被験体が、急性腎臓損傷（ＡＫＩ）を有するかまたはＡＫＩの１つもしくは複数の症状を呈する、請求項１に記載の方法。
4. 前記被験体が、うっ血性心不全、子癇前症、子癇、真正糖尿病、高血圧症、冠動脈疾患、タンパク尿、腎不全、正常範囲に満たない糸球体濾過、肝硬変、正常範囲を上回る血清クレアチニン、敗血症、腎機能に対する損傷、腎機能の低減、または急性腎不全（ＡＲＦ）のうちの１つまたは複数の既存の診断を有する、請求項１に記載の方法。
5. 前記被験体が、大規模な血管手術、冠動脈バイパス、もしくは他の心臓手術を受けているかもしくは受けたことがある、および／またはＮＳＡＩＤ、シクロスポリン、タクロリムス、アミノグリコシド、ホスカルネット、エチレングリコール、ヘモグロビン、ミオグロビン、イホスファミド、重金属、メトトレキサート、放射線不透過性造影剤、もしくはストレプトゾトシンのうちの１つもしくは複数を受けたことがある、請求項１に記載の方法。
6. 前記被験体が、ＡＫＩＮステージ１であるかまたはそれ未満であると特徴付けられる、請求項１から５の一項に記載の方法。
7. 前記被験体が、ＡＫＩＮステージ２であるかまたはそれ未満であると特徴付けられる、請求項１から５の一項に記載の方法。
8. 前記被験体が、ＡＫＩＮステージ３であるかまたはそれ未満であると特徴付けられる、請求項１から５の一項に記載の方法。
9. 前記被験体が、糖尿病性腎症（ＤＮ）を有するかまたはＤＮの１つもしくは複数の症状を呈する、請求項１から８の一項に記載の方法。
10. 前記投与することにより、前記被験体の推定糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）の改善がもたらされる、請求項１から９の一項に記載の方法。
11. 前記投与することにより、前記被験体の血清クレアチニンレベルが低減される、請求項１から９の一項に記載の方法。
12. 前記被験体が、バイオマーカーの結果によって、切迫したＡＫＩのリスクの増加を有すると特徴付けられる、請求項１から９の一項に記載の方法。
13. 前記バイオマーカーの結果が、測定された尿中ＴＩＭＰ−２濃度および測定された尿中インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）濃度のうちの１つまたは複数を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記被験体がヒトである、請求項１から１３の一項に記載の方法。
15. ＴＩＭＰ−２に特異的に結合する前記抗体が、非経口的に投与される、請求項１から１４の一項に記載の方法。
16. ＴＩＭＰ−２に特異的に結合する前記抗体が、静脈内に投与される、請求項１５に記載の方法。
17. ＴＩＭＰ−２に特異的に結合する前記抗体が、動脈内に投与される、請求項１５に記載の方法。
18. ＴＩＭＰ−２に特異的に結合する前記抗体が、皮下に投与される、請求項１５に記載の方法。
19. ＴＩＭＰ−２に特異的に結合する前記抗体が、腹腔内に投与される、請求項１５に記載の方法。
20. ＴＩＭＰ−２に特異的に結合する前記抗体が、ＩｇＧである、請求項１から１９の一項に記載の方法。
21. ＴＩＭＰ−２に特異的に結合する前記抗体が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖである、請求項１から１９の一項に記載の方法。
22. 腎臓機能の改善のために指示される前記１つまたは複数のさらなる治療剤または治療手順が、腎代替療法、水分過負荷の管理、カスパーゼ阻害剤の投与、ミノサイクリンの投与、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ阻害剤の投与、鉄キレート剤の投与、それを必要とする被験体における敗血症に対する処置の投与、インスリンの投与、エリスロポエチンの投与、および血管拡張薬の投与からなる群より選択される１つまたは複数の処置を含む、請求項１から２１の一項に記載の方法。