JP2004527242A - ヒスチジンリッチ糖タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許(35USC)第119条(e)の下、2001年2月5日出願の米国特許仮出願第60/266,505号の優先権を請求し、その全内容を本明細書中に参照として組み込む。
【0002】
本発明は、血管形成の阻害に関し、より詳細には、ヒスチジンリッチ糖タンパク質タンパク質(histidine−rich glycoprotein protein、HRGP)の血管形成阻害剤としての使用に関する。
【背景技術】
【0003】
HRGPは、Heimburger他によって同定されたヘパリン結合の血漿タンパク質である。Heimburger他、1972、生理化学(Physiol.Chem.)、353:1133〜1140参照。血漿中のHRGPの平均濃度は約100μg/mlである。Drasin及びSahud、1996、血栓症の研究(Thrombosis Research)、84:179〜188参照。マウス、ラット、(Hulett及びParish、2000、免疫学と細胞生物学(Immunology and Cell Biology)、78:280〜287)、ウサギ(Borza他、1996、生化学(Biochemistry)、35:1925〜1934)、ヒト(Koide他、1986、生化学(Biochemistry)、25:2220〜2225)のHRGPのアミノ酸配列が決定されている。構造的には、HRGP分子を3つの主なドメインに分けることができる。アミノ末端ドメインは約250個のアミノ酸残基を包含し、2つのシステインプロテイナーゼ阻害剤(シスタチン)様ストレッチを含み、このため、HRGPはα2HS糖タンパク質及びキニノーゲンと共にシスタチンスーパーファミリーとして分類される。HRGPのアミノ末端部分には、N結合の糖修飾推定部位が6つある。中央ドメインは、ペンタペプチド[H/P]−[H/P]PHGの直列型反復を含む。中央ドメインと105アミノ酸のC末端ドメインのいずれもが、アミノ末端ドメインのシスタチン様ストレッチにジスルフィド結合している(Borza他、1996)。HRGPは、pH依存性の相互作用で(Peterson他、1987、生物化学雑誌(J.Biol.Chem.)、262:7567〜7574)、ヘパリン/ヘパラン硫酸を結合している(Lijnen他、1983、生物化学雑誌(J.Biol.Chem.)、258:3803〜3808)。単離したヒスチジンとプロリンリッチな中央ドメインがヘパリン結合を媒介するが(Borza他、1996)、ヘパリン結合にはアミノ末端ドメインも関連している。Koide他、1986、FEBSレター(FEBS Lett.)、194:242〜244参照。HRGPの先天性欠損は、HRGPのGly85がGluに置き換えられた、単一ヌクレオチドの変異に位置付けされた。この変異により、大部分が細胞内に保持されるこのタンパク質のプロセッシングが不十分になる。その結果、HRGPの血清レベルが通常レベルの25〜30%に低下する。Shigekiyo他、1993、血栓症と止血(Thromb.Haemost.)、70:263〜265及びShigekiyo他、1998、血液学(Blood)、91:128〜133参照。
【0004】
血管新生(neovascularization)をもたらす新しい血管の生成プロセスである血管形成(angiogenesis)は、胚の発生、排卵、子宮内膜の周期的な発生、創傷治癒、組織及び臓器の成長、炎症及び創傷治癒の期間中に重要である。不均衡な血管新生は、ある種の疾病状態、たとえば関節炎、乾癬、血管腫、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症の病原性に寄与し、腫瘍の成長や転移を引き起こさせると考えられている。米国特許第5,854,205号参照。腫瘍細胞が局部的に拡大して転移を引き起こすためには、新しい血管を誘引しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、HRGPを哺乳動物に投与すると血管形成の阻害がもたらされるという発見に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、本発明は、実質的に純粋なHRGPポリペプチドを含む組成物を特徴とする。通常、実質的に純粋なHRGPポリペプチドは抗血管形成活性を有する。いくつかの実施形態では、この組成物は抗血管形成活性を有する別の薬剤を含むこともできる。このような薬剤は、本明細書中では抗血管形成剤(anti−angiogenic agent)と称する。いくつかの実施形態では、この組成物は抗腫瘍活性を有する薬剤を含むこともできる。このような薬剤は、本明細書中では抗腫瘍剤(anti−neoplastic agent)と称する。
【0007】
一態様では、本発明は、HRGPポリペプチドと抗血管形成剤又は抗腫瘍剤を含む薬剤組成物を特徴とする。この組成物は、哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアを含むことができる。HRGPポリペプチドは、たとえば無処置(intact)のHRGP、改変したHRPGポリペプチド、又は無処置のHRGPの断片を含むことができる。この無処置のHPGPの断片は、無処置のHRGPのアミノ末端ドメイン、中央ドメイン又はC末端ドメイン、あるいはペンタペプチド[H/P]−[H/P]PHGの1つの直列型反復を含む断片を含むことができるが、それだけに限定されるものではない。抗血管形成剤は、たとえばアンジオスタチン、トロンボスタチン、エンドスタチン、インターフェロンα、インターフェロン誘導因子10、血小板因子4、COX−2阻害剤でよい。
【0008】
本発明はまた、HRGPのN末端ドメイン、中央ドメイン、C末端ドメインではない、血管形成を阻害する無処置のHRGPポリペプチドの断片を特徴とする。
【0009】
本発明はまた、包装材料及び包装材料内のPRGPポリペプチドを含む製品を特徴とし、包装材料は、血管形成を阻害するためにHRGPポリペプチドを哺乳動物に投与すべきであることを表示するラベル又は添付文書を含む。
【0010】
別の態様では、本発明は、哺乳動物の血管形成を阻害する方法を特徴とする。この方法は、哺乳動物にHRGPポリペプチドを投与することを含む。哺乳動物は、血管形成依存性の癌を生じている又は血管形成に関連する状態にある可能性がある。血管形成に関連するこのような状態には、心筋血管形成、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、不適切な創傷治癒、炎症性疾患が含まれ得るが、これだけには限定されるものではない。
【0011】
別の態様では、本発明は、抗血管形成ポリペプチドを同定する方法を特徴とする。この方法は、FGF−2で誘発させた一次ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞の遊走に対するHRGPポリペプチドの効果を測定すること、及び、FGF−2で誘発させた遊走がHRGPポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に、HRGPポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定することを含むことができる。あるいは、この方法は、ヒヨコ漿尿膜の血管形成に対するHRGPポリペプチドの効果を測定すること、及び、ヒヨコ漿尿膜の血管形成がHRGPポリペプチドの存在下で有意に減少される場合に、HRGPポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定することを含むことができる。別の代替方法では、この方法は、哺乳動物の血管形成依存性腫瘍の成長に対するHRGPポリペプチドの効果を測定すること、及び、腫瘍の成長がHRGPポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に、HRGPポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定することを含むことができる。HRGPポリペプチドはHRGP断片でよい。血管形成依存性腫瘍は、たとえば、繊維肉腫、神経芽細胞腫、奇形腫でよい。腫瘍は、たとえばマウス又はラット内で成長させることができる。
【0012】
本発明の別の態様は、HRGPポリペプチドを結合する抗体を特徴とする。これら抗体は、HRGPポリペプチドのC末端ドメイン、中央ドメイン、又はN末端ドメインと結合することができる。本発明には、血管形成を阻害するHRGPポリペプチドの能力を中和させる、血管形成に作用性である、又は血管形成に拮抗性である抗体もまた含まれる。
【0013】
さらに別の態様では、本発明は、HRGPポリペプチドに結合する抗体を投与することによって哺乳動物の血管形成を阻害する方法を特徴とする。
【0014】
本発明は、血管形成に作用性がある抗HRGP抗体を投与することによって哺乳動物の血管形成を増強させる方法も特徴とする。
【0015】
本発明のさらに別の態様は、HRGPポリペプチドを雌の哺乳動物に投与することを含む避妊の方法を特徴とする。
【0016】
本発明の他の態様は、検出可能なマーカーに結合させた又は毒素に結合させたHRGPポリペプチド、及び検出可能なマーカーに結合させたHRGPポリペプチドを哺乳動物に投与することによって哺乳動物の血管新生をイメージングする方法を特徴とする。
【0017】
本発明の別の態様は、HRGPポリペプチドに結合する受容体を特徴とする。
【0018】
本発明はまた、ヒトHRGP欠乏性(depleted)血漿を含めて、HRGPを欠いた(depleted)血漿も特徴とする。
【0019】
HRGPポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを含むベクター、これらベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の特徴である。
【0020】
別段に定義しない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の技術者に一般的に理解される意味をも持つものとする。本発明の実施及び試験には、本発明書中で説明する方法及び材料に類似する又は相当するものを用いることもできるが、適切な方法及び材料を記載する。本明細書中で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献を、その全体を参照として組み込む。矛盾する場合は、定義を含めて本発明の明細書が支配する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示的なものにすぎず、限定的なものではない。
【0021】
本発明の1つ又は複数の実施形態の詳細を、添付の図及び下記の説明で示す。本発明の他の特徴、材料、及び利点は、説明及び図、並びに特許請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【0022】
精製したヒト血漿HRGPが漿尿膜(chorioallantoic membrane、CAM)血管形成、内皮細胞の遊走、及び腫瘍の成長を阻害することが発見された。成長因子たとえば線維芽細胞成長因子2(FGF−2)や血管内皮細胞成長因子A(VEGF−A)を用いたCAMの処置は、CAM内の血管形成を刺激する。驚くべきことに、10倍のモル濃度過剰のHRGPを適用することが、FGF−2又はVEGF−Aを適用することとあいまって、血管形成の抑制をもたらす。一次ウシ毛細血管内皮(bovine capillary endothelial、BCE)細胞では、ミニボイデンチャンバー(Boyden chamber)での基準遊走に比べて、FGF−2に向かう遊走が150%増加する。この増大した遊走は、HRGPとの共インキュベーションによって完全に抑制される。最後に、精製したHRGPを注入すると、マウスの繊維肉腫腫瘍の成長が著しく低下し、腫瘍の大きさが75%減少した。実施例9及び図2参照。これらの予想外の発見に基づいて、HRGPポリペプチドは、血管形成に媒介される又はこれに関与する疾患又はプロセスを治療する、新しい、新規の治療薬である。HRGPポリペプチドは、血管形成依存性癌の治療又はその成長の抑制に特に有用となろう。
【0023】
本発明のHRGPポリペプチドは、採取したての血清から精製するか又は周知の組換え手法により生成することができる。HRGPポリペプチドは、診断上の応用のために検出可能なマーカーと結合させる又は治療上の応用のために毒素と結合させることができる。HRGPポリペプチドを含む製薬的組成物を、血管形成を阻害したい対象に投与することができる。本発明によると、HRGPポリペプチドはまた、疾病の治療のために他の組成物や手順と組み合わせて使用することもできる。たとえば、HRGPポリペプチドを、他の抗血管形成化合物、抗腫瘍化合物、及び/又は抗炎症化合物をさらに含む製薬的組成物として投与することができる。
【0024】
本発明は、診断上及び治療上の応用のいずれかに使用することができる、HRGPポリペプチドに対する特異的結合アフィニティーを有する抗体を含む。特に有用なのは、HRGPポリペプチドの生物活性を阻害又は除去することができる中和抗体である。本発明はさらに、HRGPに特異的な受容体を同定する方法、並びに、それにより同定及び単離されたHRGP受容体分子を包含する。HRGPポリペプチドの拮抗剤、たとえば抗HRGP抗体又は単離したHRGP受容体ポリペプチドを、血管形成を促進させたい対象に投与することができる。
【0025】
本発明はまた、包装材料及び単離したHRGPポリペプチドを含むキットを含み、包装材料は、血管形成の阻害のためにHRGPポリペプチドを哺乳動物に投与すべきであることを表示する包装材料はラベル又は添付文書を含む。
【0026】
HRGPポリペプチドの生成
本発明は、実質的に純粋なHRGPポリペプチドを提供する。ポリペプチドに関して本明細書中で用いる用語「実質的に純粋」とは、ポリペプチドが実質的に、自然には付随している他のポリペプチド、脂質、炭化水素、核酸を含まないことを意味する。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、その自然の環境から取り出された任意のポリペプチドである。本明細書では、実質的に純粋なHRGPポリペプチドは最低でも60%の純度であり、少なくとも約65、70、75、80、85、90、95、又は99パーセントの純度にすることが可能である。通常、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単一の主バンドをもたらす。
【0027】
いくつかの異なる種由来のHRGPのcDNA配列及びアミノ酸配列が知られている。完全なcDNC配列及びアミノ酸配列は、ヒト(Koide他、1986、FEBSレター(FEBS Lett.)、194:242〜244)、ラット及びマウスのHRGP(Hulett及びParish、2000、免疫学と細胞生物学(Immunology and Cell Biology)、78:280〜287)で知られている。ウサギのHRGPは、リーダー配列のコード領域を欠いたcDNA配列の一部と、完全長の推論されたアミノ酸配列とが知られている。Borza他、1996、生化学(Biochemistry)、35:1925〜1934参照。タンパク質を直接配列決定して導いたウシHRGPの部分アミノ酸配列も知られている。Sorenson他、1993、FEBSレター(FEBS Lett.)、328:285参照。Hennis他によって、ヒトHRGPの5つのアミノ酸多型が同定された。すなわち、Ile162、Pro186、His322、Arg430、Asn475である。Hennis他、1995、血栓症と止血(Thromb.Haemost.)、74:1491及びHennis他、1995、血栓症と止血(Thromb.Haemost.)、74:1497参照。Shigekiyo他が、追加のGlu85多型を同定した。Shigekiyo他、1998、血液学(Blood)、91:128参照。
【0028】
用語「HRGPポリペプチド」とは、無処置のHRGPだけでなく、翻訳後の修飾に関係なく、当分野で既知のHRGP配列に由来する任意の部分の、6個以上の任意のアミノ酸残基を含むポリペプチドを含むことを理解されたい。用語「HRGPポリペプチド」はまた、1つ又は複数のアミノ酸がHRGPの一方又は両方の末端、あるいはHRGPの内部領域に付加された、伸長させたタンパク質又はペプチドを含む。用語「HRGPポリペプチド」はまた、検出可能な部分(moiety)又は毒素たとえばヒマ毒を用いて標識したHRGPポリペプチドを含む。
【0029】
用語HRGPポリペプチドは、HRGP分子の3つの主なドメインのうち1つ及びその機能性断片を含むポリペプチドを含む。アミノ末端ドメインは約250個のアミノ酸残基を包含し、2つのシステインプロテイナーゼ阻害剤(シスタチン)様ストレッチを含む。HRGPのアミノ末端ドメインには、6つのN関連の糖修飾推定部位が存在する。中央ドメインは、ペンタペプチド[H/P]−[H/P]PHGの直列型反復を含み、C末端ドメインは105個のアミノ酸を含む。中央ドメインとC末端ドメインのどちらも、アミノ末端ドメインのシスタチン様ストレッチにジスルフィド結合している(Borza他、1996参照)。単離されたヒスチジンとプロリンに富んだ中央ドメインは、pH依存性のヘパリン結合を媒介する(Borza他、1996)。ヘパリン結合にはアミノ末端ドメインも関連している。
【0030】
用語HRGPポリペプチドは、たとえば当分野で既知のHRGP配列のうち1つの、任意の6〜25個のアミノ酸(たとえば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25個のアミノ酸残基)を含む短縮したポリペプチドを含む。また、用語HRGPポリペプチドは、長さが25アミノ酸残基以上(たとえば、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74個、又はそれ以上のアミノ酸残基)であり、当分野で既知のHRGP配列のうち1つの、任意の部分と同じアミノ酸配列を含むタンパク質であることを理解されたい。追加の例には、長さが75アミノ酸残基以上(たとえば、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、320、325、350、390個又はそれ以上のアミノ酸残基)であり、当分野で既知のHRGPアミノ酸配列の任意の部分と同じアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれるが、それだけには限定されない。
【0031】
いくつかの実施形態では、HRGPポリペプチドは無処置のHRGPポリペプチドの抗血管形成活性を保持している。このようなHRGPポリペプチドは、完全長の無処置のHRGPの、少なくとも5%(たとえば、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%、又はそれ以上)の抗血管形成活性を保持している。抗血管形成活性は、下に記載のように、CAM又は内皮細胞遊走検定で検定される。
【0032】
「HRGPポリペプチド」の定義はさらに、「改変したHRGPポリペプチド」が含まれる。このような改変したHRGPポリペプチドは、抗血管形成活性を保持している可能性があり、さらに増強された活性を示す可能性がある。改変したHRGPポリペプチドには、HRGPポリペプチドの特定の部位の自然に存在するアミノ酸が、自然に存在する又は自然に存在しないアミノ酸を含むがそれだけに限定されない他分子で置換されたHRGPポリペプチドが含まれるが、それだけには限定されない。単一挿入、単一欠失、単一置換、複数の挿入、複数の欠失、複数の置換、又はそれらの任意の組合せ(たとえば、単一欠失と複数の挿入)を含むアミノ酸配列を含むHRGPポリペプチドも、含まれる。これらの様々な改変は、1つ又は複数のアミノ酸の変化を導入するためあるいは事前に決定されたアミノ酸残基の箇所でタンパク質コード配列を切断するために、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)に基づく技法やin vitroの部位特異的突然変異誘発を含めた当分野で周知の方法を用いて引き起こすことができる。たとえば、Kunkel他、1985、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.、USA)、82:488〜492参照。
【0033】
改変したHRGPポリペプチドの定義にはさらに、他の化合物たとえばポリエチレングリコール(PEG)重合体に結合したHRGPポリペプチドが含まれる。PEGを含む化合物を用いて、ポリペプチドたとえばHRGPポリペプチド表面のアミノ基を誘導体化させると、このようなポリペプチドの循環寿命を延ばし、その潜在的な血管形成特性を低減させることができる。Beauchamp他、1983、分析生化学(Anal.Biochem)、131(1):25〜33参照。用いるPEGの分子量に特に限定はないが、通常は300〜30,000、好ましくは1,000〜15,000である。PEGを改変する方法は、当分野で周知の任意の方法でよい。たとえば、Beauchamp他、1983、分析生化学(Anal.Biochem.)、131(1):25〜33参照。
【0034】
さらに、本発明の範囲に含まれる改変されたHRGPポリペプチドは、アフィニティーマトリクス上でポリペプチドが捕捉可能にさせるアミノ酸配列を含むように「操作」することができる。たとえば、ポリペプチド精製を支援するためにタグたとえばc−myc、赤血球凝集素、ポリヒスチジン、Flag(商標)タグ(Kodak)を使用することができる。このようなタグは、カルボキシル末端及びアミノ末端のいずれかを含めたポリペプチド内の任意の部位に挿入することができる。HRGPポリペプチドはまた、ポリペプチドの検出を支援する、アルカリホスファターゼなど酵素との融合体として生成することができる。
【0035】
実質的に純粋なHRGPポリペプチドを得るために、任意の方法を使用することができる。たとえば、無処置のHRGPは、採取したてのヒト血漿から、前記手順に続けて、プロテイナーゼ阻害剤の存在下でホスホセルロース上のクラマトグラフィーによって精製することができる。Rylatt他、1981、ヨーロッパ生化学雑誌(Eur.J.Biochem.)、119:641〜646、又はKluszynski他、1997、生物化学雑誌(J.Biol.Chem.)、272:13541〜13547参照。生じたタンパク質は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)で推定したとおり、95%の純度であった。N末端ドメイン、中央ドメイン、C末端ドメインを含むHRGPドメインは、Borza他、1996、生化学(Biochemistry)、35:1925〜1934に概略が説明されている方法に従ってプラスミン限定加水分解を施してHRGPから単離することができる。実質的に純粋なポリペプチドを得るために、任意の材料を原料として用いることができる。たとえば、特定の目的ポリペプチドを発現している組織培養細胞を用いて、実質的に純粋なポリペプチドを得ることができる。アフィニティークロマトグラフィーやHPLCなどのポリペプチド精製技術に加えて、HRGPポリペプチドを生成するために、ポリペプチド合成技術を用いることもできる。
【0036】
HRGPポリペプチドはまた、組換え方法によって生成することもできる。ウサギ(Borza他、1996、生化学(Biochemistry)、35:1925〜1934)、ラット、マウス(Hulett及びParish、2000、免疫学と細胞生物学(Immunology and Cell Biology)、78:280〜287)、ヒト(Koide他、1986、FEBSレター(FEBS Lett.)、194:242〜244)のHRGPのcDNA配列が知られている。cDNAからタンパク質産物を発現させる方法は周知である。たとえば、Maniatis他、1989、「分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州、16.1〜17.44ページ参照。生成したHRGPポリペプチドは、無処置のHRGPポリペプチド又はHRGPの断片のいずれでもよい。適切な発現システムには、組換えバクテリオファージ、プラスミドDNA、コスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換させた微生物たとえば細菌(たとえばE.coliやB.subtilis);組換え酵母菌発現ベクターを用いて形質転換させた酵母菌(たとえばSaccharomycesやPichia);組換えウイルス発現ベクター(たとえばバキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞システム;融合タンパク質ヌクレオチド配列を含んだ組換えウイルス発現ベクター(たとえばカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)やタバコモザイクウイルス(TMV))で感染させた、又は融合タンパク質ヌクレオチド配列を含んだ組換えプラスミド発現ベクター(たとえばTiプラスミド)を用いて形質転換させた植物細胞システム;哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(たとえばメタロチオネインプロモーター)又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(たとえばアデノウイルス後期プロモーターやワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む発現構築体を用いて形質転換させた哺乳動物細胞システム(たとえば、HEK、COS、CHO、BHK、293、VERO、HeLa、MDCK、WI38、NIH 3T3細胞)が含まれるが、それだけには限定されない。哺乳動物から直接得た、プラスミドベクターを用いて形質転換させた、あるいはウイルスベクター(たとえば、とりわけヘルペスウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス)で感染させた一次細胞又は二次細胞もまた宿主細胞として有用である。
【0037】
抗血管形成活性の検定
抗血管形成活性は、基本的にFriedlander他及びDixelius他に記載のようにCAM検定で検定することができる。Friedlander他、1995、サイエンス(Science)、5241:1500及びDixelius他、2000、血液学(Blood)、95:3403参照。手短に述べると、殻に1×1cmの窓を作成して、受精したヒヨコ胚のCAMの無血管性領域を露出させる。試験する試料をこの無血管性領域に施用し、窓をテープで塞ぎ、ヒヨコ胚をさらに3日間インキュベートする。この時点で、試験した試料が抗血管形成であることを示す、内皮細胞成長の試料による阻害が起こったかどうかを調べるために、CAMを光学顕微鏡で検査する。CAMスコアの、刺激剤のみの場合と比べて統計的に有意な1.0以上の減少は、HRGPポリペプチドが抗血管形成活性を有することを示す。
【0038】
あるいは、HRGPポリペプチドの抗血管形成活性は、改良したボイデンチャンバー内で、FGF−2で誘発させたウシ毛細血管内皮細胞の遊走の抑制に対する、HRGPポリペプチドの効果を検定することによって決定することもできる。Auerbach他、1991、薬理学と治療学(Pharmacol.Ther.)、51:1〜11参照。FGF−2で誘発させる遊走が、FGF−2のみの存在下での遊走と比べて統計的に有意である少なくとも50%の減少を示したことにより、HRGPポリペプチドが抗血管形成活性を有することが示された。
【0039】
HRGPポリペプチドの抗血管形成活性はまた、哺乳動物の血管形成依存性腫瘍の成長、たとえば動物内の繊維肉腫の成長に対するポリペプチドの効果を測定することによって決定することができる。腫瘍を有するマウスに投与すると統計的に有意な腫瘍体積の阻害を生じるHRGPポリペプチドは、抗血管形成活性を有するとみなされる。いくつかの実施形態では、抗血管形成HRGPポリペプチドは、腫瘍の成長に対して何の効果もないことが知られているコントロールのポリペプチドに比べて、腫瘍体積を10%減少させることができる。他の実施形態では、抗血管形成HRGPポリペプチドは、腫瘍の成長に対して何の効果もないコントロールのポリペプチドに比べて、腫瘍体積を15%以上、20%以上、30%以上、50%以上、75%以上、90%以上減少させることができる。
【0040】
HRGPポリペプチドの効果を評価するために、差は、適切なパラメトリック又はノンパラメトリック統計を用いたp値が≦0.05で統計的に有意とみなされることを理解されよう。
【0041】
HRGPを含む組成物
本発明の組成物はHRGPポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、この組成物は抗血管形成剤又は抗腫瘍剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は製薬上許容されるキャリアも含む。
【0042】
抗血管形成剤には、インターフェロン誘導性タンパク質10及びインターフェロン誘導性タンパク質10の断片や類似体、TGFベータ、トロンボスポンジン、インターロイキン−1(IL−1)、ガンマ及びアルファインターフェロン(IFN)、メタロプロテイナーゼ−1(TIMP−1)、血小板因子4(PF4)、プロタミン、フマギリン、アンジオスタチンなどが含まれるが、それだけには限定されない。
【0043】
本発明での使用を企図した抗腫瘍剤は、腫瘍細胞に毒性のある化学療法剤として知られている薬剤である。化学療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物、ホルモンや拮抗剤、生物応答修飾因子(たとえばインターフェロンや造血成長因子)、ブチレート誘導体など分化剤、腫瘍抗原に対する抗体、他の種々の薬剤が含まれる。具体的な例には、タキソール、シクロホスファミド、カルボプラチナ、シスプラチナ、シスプラチン、ガンシクロビル、カンプトセシン、パクリタキセル、ヒドロキシ尿素、5−アザシチジン、5−アザ−2’−デオキシシチジン、スラミン、レチノイドなどが含まれるがそれだけには限定されない。化学療法剤の使用は、治療する哺乳動物が十分に血管形成されている既存の大きな腫瘍塊を有する場合に、特に有用である。化学療法剤は腫瘍塊を減少させるのに役立ち、HRGPポリペプチドは腫瘍塊内又は腫瘍塊の周りの血管新生を予防又は阻害する。
【0044】
併用療法は、HRGPポリペプチドを抗血管形成剤又は抗腫瘍剤と組み合わせて使用することだけに限定されるものではない。併用療法は、HRGPポリペプチドと抗炎症剤たとえばプレドニゾン、COX−2阻害剤などを組み合わせて使用するものでもよい。適切な抗炎症剤には、イブプロフェンやアスピリンが含まれる。
【0045】
HRGPを含む製薬組成物は、静脈注射によって投与することができ、また皮下、筋肉内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、肺内、腫瘍内、病巣内に注入することができる。必要とされる用量は、選択した投与経路、製剤の性質、患者の疾病の性質、対象の大きさ、体重、表面積、年齢、性別、投与中の他の薬剤、主治医の判断に依存する。投与経路の多様性を考慮すると、広範囲の必要用量が予想される。これら用量レベルの多様性は、当分野でよく理解されているように、標準の経験的最適化ルーチンを用いて調整することができる。投与は、1回又は複数回(たとえば、2、3、4、6、8、10、20、50、100、150回以上)とすることができる。製薬上許容されるキャリアは、哺乳動物対象たとえばヒトの患者に投与するのに適した生体適合性媒体たとえば生理食塩水である。このような製薬組成物は通常、製薬上許容されるキャリア中に、本発明の治療薬を約0.1〜90重量%(たとえば1〜20%又は1〜10%)含む。注入可能なこの組成物の製剤は様々なキャリア、たとえば植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)を含んでいてもよい。静脈注射では、点滴法により化合物の水溶性異形を投与することができ、それによってHRGP及び生理的手段(expedient)を含む製薬製剤を注入する。生理的に許容できるキャリアには、たとえば、5%ブドウ糖、0.9%生理食塩水、リンゲル液、他の適切なキャリアが含まれる。筋肉内調製物、たとえば化合物の適切な可溶塩の形の無菌製剤を、製薬用賦形剤たとえば0.9%生理食塩水や5%グルコース液に溶かして投与することができる。化合物の適切な不溶形を調製し、水性基剤又は製薬上許容される油性基剤たとえば長鎖脂肪酸(たとえばオレイン酸エチル)中の懸濁液として投与することができる。外用半固体軟膏製剤は通常、製薬クリーム基剤などキャリア中に約1〜20%、たとえば5〜10%の濃度の活性成分を含む。外用用途の様々な製剤には、活性成分と様々な支持体や媒体を含んだ液滴、チンキ、ローション、クリーム、溶液、軟膏が含まれる。各製薬製剤中の治療薬の最適割合は、製剤自体並びに特定病原及び関連する治療療法によって異なる。このような製剤を作成する方法は周知であり、たとえば「レミントン製薬科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)」に出ている。
【0046】
治療上有効な量は、処置した哺乳動物たとえばヒトの患者に、医学的に望ましい結果を生じることができる量である。医学分野で周知のように、任意の患者の適用量は、患者の大きさ、身体表面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与の時間や経路、身体全体の健康、同時に投与している他の薬剤を含めて多くの要因に依存する。用量は様々であるが、好ましい投与用量は体重1kgあたり約0.01〜1,000mgである。たとえば、好ましい用量には、体重1kgあたり0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10、25、50、100、500、750又は1,000mgが含まれるが、それだけには限定されない。好ましい投与方法が静脈経由であることが期待される。
【0047】
抗血管形成HRGPポリペプチドを、血管形成を阻害するのが望ましい対象に投与することができる。適切な対象には、様々な血管形成依存の癌たとえば横紋筋肉腫、多形性グリア芽腫、平滑筋肉腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、黒色腫、膀胱癌、膵臓癌、腎癌などのうちいずれかを有するものが含まれるが、それだけには限定されない。HRGPポリペプチドを用いた治療に敏感に反応する血管形成の疾病には、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、水晶体後線維増殖症、トラコーマ、血管新生緑内障、乾癬、血管繊維腫、免疫性又は非免液性炎症、アテローム硬化症プラーク内の毛細血管形成、心筋血管形成、血管腫、過剰の創傷修復、様々な疾病、過剰の及び/又は調節解除された血管形成によって特徴付けられる任意の他の疾病が含まれるが、それだけには限定されない。
【0048】
製品
HRGPポリペプチドは、1単位又は複数単位の用量形を含む製品として包装することができる。製品は通常、ラベルを有する少なくとも1つの容器を含む。この容器は、たとえばガラス又はプラスチックのボトル又はバイアル、金属又はプラスチックの箔を含んでもよく、また単位用量のブリスター包装も含んでもよい。この容器には、HRGPポリペプチドを含む組成物が入っている。この包装は、血管形成の阻害のためにHRGPポリペプチドを投与すべきことを示すラベル又は添付文書を添えることができ、またin vivo又はex vivoでの使用法を示すこともできる。これらの指示は、HRGPポリペプチドを単独で又は他の薬剤と組み合わせて使用することができることを示してもよい。包装はまた、追加の薬剤たとえば追加の抗血管形成剤、抗腫瘍剤、抗炎症剤を含んでもよい。製品はまた、適切な希釈剤又は緩衝液を含む第2の容器を含んでもよい。製品は、商業的又は消費者的立場から望ましい他の材料、たとえば緩衝液、フィルター、針、シリンジ、使用指示書を記載した添付文書をさらに含んでもよい。
【0049】
HRGPの抗体
HRGPポリペプチドに特異的結合アフィニティーを有する抗体を標準の方法で生成することができる。本発明書中で使用する、用語「抗体」又は「複数の抗体」とは、HRGPポリペプチド内のエピトープ決定因子と結合することができる無処置の分子やその断片を含む。用語「エピトープ」とは、抗体のパラトープが結合する、抗体の抗原決定因子である。エピトープ決定因子は通常、化学的に活性のある表面分子たとえばアミノ酸や糖側鎖の集団であり、通常、特異的な3次元構造特性及び特異的電荷特性を有する。エピトープは一般的に少なくとも5つの近接したアミノ酸を有する。用語「抗体」及び「複数の抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化した抗体又はキメラ抗体、単鎖Fv抗体断片、Fab断片、F(ab)2断片が含まれる。モノクローナル抗体が特に有用である。
【0050】
一般的に、目的のポリペプチドは、組換えによって、化学合成によって、又は自然のタンパク質の精製によって生成され、その後動物を免疫化するために使用される。たとえばウサギ、ニワトリ、マウス、モルモット、ラットを含む様々な宿主動物を、目的のポリペプチドを注入することによって免疫化することができる。宿主の種類に応じて免疫応答を増加させるためにアジュバントを使用することができ、これにはフロイントアジュバント(完全及び不完全)、鉱物ゲルたとえば水酸化アルミニウム、表面化成物質たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、KLH(keyhole limpet hemocyanin、キーホールリンペットヘモシアニン)、ジニトロフェノールが含まれる。ポリクローナル抗体は、特定の抗原に特異性を有する抗体分子の異質集合であり、免疫化させた動物の血清内に含まれている。抗原内に含まれる特定のエピトープの抗体の均質集合であるモノクローナル抗体は、標準のハイブリドーマ技法を用いて調製することができる。Kohler他、1975、ネイチャー(Nature)、256:495参照。特に、モノクローナル抗体は、連続培養中の細胞系によって抗体分子の生成をもたらす任意の技法、たとえばヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor他、1983、現代免疫学(Immunology Today)、4:72及びCole他、1983、米国科学アカデミー紀要(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、80:2026参照)やEBVハイブリドーマ技術(Cole他、1983、「モノクローナル抗体及び癌の治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)」、Alan R.Liss,Inc.、ページ77〜96参照)によって得ることができる。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含めた任意の免疫グロブリンクラス、及びその任意のサブクラスのものであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマは、in vitor又はin vivoで培養することができる。
【0051】
キメラ抗体とは、別々の部分が異なった動物種に由来する分子であり、たとえばマウスのモノクローナル抗体に由来する可変部とヒト免疫グロブリン定常部を有する抗体である。キメラ抗体は、標準の技術を用いて生成することができる。
【0052】
当分野で周知の技法を用いて、マウス抗体の相補性決定領域をヒトフレームワークドメインに置換挿入することによってヒト化(humanized)した形のマウス抗体を作成することができる。また、選択されたマウスフレームワーク残基をレシピエントのヒト免疫グロブリンに置換挿入することもできる。所望する結合特異性を有するモノクローナル抗体を商業的にヒト化させることができる(Scotgene、スコットランド;Oxford Molecular、Palo Alto、カリフォルニア州)。たとえば遺伝子導入動物内で発現される、完全なヒト抗体も、本発明の特徴である。たとえば、Green他、1994、ネイチャー遺伝学(Nature Genetics)、7:13〜21、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,569,825号参照。
【0053】
HRGPポリペプチドに特異的結合アフィニティーを有する抗体断片を、周知の技術によって作成することができる。たとえば、このような断片には、それだけには限定されないが、抗体分子をペプシン消化することによって生成できるF(ab’)2断片や、F(ab’)2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作成できるFab断片が含まれる。代わりに、Fab発現ライブラリを構築することができる。たとえば、Huse他、1989、サイエンス(Science)、246:1275参照。単鎖Fv抗体断片は、アミノ酸架橋(たとえば15〜18個のアミノ酸)によってFv領域の重鎖断片と軽鎖断片を結合させ、単鎖ポリペプチドを生じさせることによって形成される。単鎖Fv抗体断片は、標準の技術を用いて生成することができる。たとえば、米国特許第4,946,778号参照。
【0054】
生成後、標準の免疫測定法たとえばELISA技法やRIAによって、抗体又はその断片の、HRGPポリペプチドに対する認識を試験する。「分子生物学の手短なプロトコル(Short Protocols in Molecular Biology)」、第11章、Green Publishing Associates及びJohn Wiley&Sons、Ausbel,F.M他編、1992参照。適切な抗体は、好ましくは組換えタンパク質と自然のタンパク質に対して同等の結合アフィニティーを有している。
【0055】
本発明のHRGP抗体を、本明細書中に記載のHRGP特異的抗体を少なくとも1つ含む診断キットに包装することができ、これを都合良く用いて研究又は診断目的で試料中のHRGPを検出することができる。HRGPに対する抗体は、任意の周知の検定方法たとえば競合的結合検定、直接又は間接サンドイッチ検定、免疫沈降検定で利用することができる。Zola、「モノクローナル抗体:技法のマニュアル(Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques)」、ページ147から158、CRC Press,Inc.、1987参照。競合的結合検定は、限られた量の抗体と結合することに対して、標識した標準物質(これはHRGPポリペプチド又はその免疫学的に反応性のある部分であってよい)が試験する試料分析物(HRGP)と競合する能力に依存する。試験する試料中のHRGP量は、抗体に結合する標準物質の量に反比例する。結合する標準物質の量の決定を容易にするために、抗体は一般的に競合前又は後に不溶化され、これにより抗体と結合している標準物質と分析物が、結合していない標準物質と分析物から都合良く分離される。
【0056】
本発明のHRGP抗体は、HRGPの生理活性、たとえばCAM検定で検定されるHRGPの抗血管形成活性を実質的に阻害又は排除することができる中和抗体であってもよい。本発明のHRGP抗体はまた、血管形成に作用性又は拮抗性である可能性がある。
【0057】
検出可能なマーカーに結合させたHRGP
診断上用途のために、検出可能な部分を用いてHRGPポリペプチドを標識することができる。この検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接又は間接的に生成することができる。たとえば、検出可能な部分は、放射性同位元素、たとえばH3、C14、P32、S35、I125;蛍光又は化学発光化合物たとえばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ルシフェリン;又は酵素たとえばアルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼであってよい。ポリペプチドを検出可能な部分に結合させる当分野で周知の任意の方法を利用することができる。たとえば、Hunter他、1962、ネイチャー(Nature)、144:945;David他、1974、生化学(Biochemistry)、13:1014;Pain他、1982、免疫学的方法雑誌(J.Immunol.Meth.)、40:219;Nygren、1982、組織化学と細胞科学(Histochem.and Cytochem.)、30:407参照。
【0058】
HRGPポリペプチドはまた、血管新生の領域をイメージングするために、in vivoイメージングに有用な検出可能な部分と結合させてもよい。HRGPポリペプチドを検出可能な部分たとえば放射線不透過性薬剤や放射性同位元素を用いて標識し、宿主の好ましくは血流中に投与し、標識されたHRGPポリペプチドの存在及び位置を検定する。HRGPポリペプチドは、核磁気共鳴、放射化学、当分野で周知の他の検出方法によって、宿主内で検出可能などのような部分を用いて標識してもよい。たとえば、放射性同位元素は186Re、188Re、64Cu、67Cu、212Bi、123I、131I、211At、177Lu、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、199Au、99mTc、111In、124I、18F、11C、198Au、75Br、76Br、77Br、13N、34mCl、38Cl、52mMn、55Co、62Cu、68Ga、72As、76As、72Se、73Se又は75Seであってよい。
【0059】
毒素に結合させたHRGP
毒素に結合させたHRGPは、HRGP受容体を標的にするための治療薬として使用することができる。HRGPポリペプチドを、当分野で周知の手順によって細胞の細胞質中の細胞毒性効果を媒介する任意の毒素ポリペプチドに結合させることができる。好ましい毒素ポリペプチドには、リボソーム不活性化タンパク質、たとえばA鎖毒素(たとえばヒマ毒A鎖)、サポリン(saporin)、ブリオジン(bryodin)、ゲロニン(gelonin)、アブリン(abrin)、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質(pokeweed antiviral protein、PAP)など植物性毒素、αサルシン(α−sarcin)、アスペルギリン(aspergillin)、レストリクトシン(restrictocin)など真菌性毒素、ジフテリア毒素(DT)など細菌性毒素、Pseudomonas外毒素A、胎盤性リボ核酸やアンジオゲニンなどリボ核酸が含まれる。他の有用な毒素ポリペプチドは、アポトーシス促進ポリペプチド、たとえばBax、Bad、Bak、Bim、Bik、Bok、Hrkである。さらに、1つ以上(たとえば2、3、4又は6)の毒素の複数の機能性断片(たとえば2、3、4、6、8、10、15又は20)をHRGPに結合させることができる。反復が含まれている場合は、互いにすぐ隣接、1つ又は複数の標的断片によって分離、又は上に記載の結合ペプチドによって分離されていてもよい。本発明はまた、HRGPポリペプチドに結合した任意のこれらポリペプチドの機能性断片を含む。
【0060】
HRGP受容体の単離
本発明はさらに、HRGPポリペプチドに特異的な受容体を同定する方法、並びに同定された受容体分子及びそれを単離したものを包含する。当分野で周知の技法を使用して、HRGPペプチドを用いて細胞可溶化液からHRGP受容体を単離するためのアフィニティーカラムを開発することができる。HRGP受容体の単離に続いて、アミノ酸シーケンシングを行う。このアミノ酸配列情報から、HRGP受容体をコードするポリヌクレオチド配列のクローニングに使用するために、ポリヌクレオチドプローブを開発することができる。
【0061】
血管形成を阻害するための治療方法
抗血管形成HRGPポリペプチドを、血管形成を阻害することが望ましい対象に投与することができる。適切な対象には、様々な血管形成依存の癌たとえば横紋筋肉腫、多形性グリア芽腫、平滑筋肉腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、黒色腫、膀胱癌、膵臓癌、腎癌などのうちいずれかを有するものが含まれるが、それだけには限定されない。HRGPポリペプチドを用いた治療に敏感に反応する血管形成の疾病には、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、水晶体後線維増殖症、トラコーマ、血管新生緑内障、乾癬、血管繊維腫、免疫性又は非免液性炎症、アテローム硬化症プラーク内の毛細血管形成、心筋血管形成、血管腫、過剰の創傷修復、様々な疾病、過剰の及び/又は調節解除された血管形成によって特徴付けられる任意の他の疾病が含まれるが、それだけには限定されない。
【0062】
通常、抗血管形成HRGPポリペプチドは製薬的組成物中で投与される。治療上の応用では、HRGPポリペプチドを、製薬上許容される剤形で哺乳動物たとえばヒトに投与する。HRGPポリペプチドを静脈内に大量瞬時投与として、又は筋肉内、皮下、間接内、滑液内、くも膜下腔内、経口、外用、吸入経路による一定時間をかけた連続的な注入によって、投与することができる。HRGPポリペプチドの長期の連続的な局部送達は、マイクロカプセルに封入したHRGPポリペプチドを分泌する細胞の埋め込みによって行うことができる。Read他、2001、ネイチャーバイオテクノロジー(Nat.Biotechnol.)、19(1):29〜34及びJoki他、2001、ネイチャーバイオテクノロジー(Nat.Biotechnol.)、19(1):35〜39参照。
【0063】
疾病の予防又は治療のための適切なHRGPポリペプチドの用量は、治療する疾病の種類、疾病の重症度及び過程、それ以前の治療の過程、患者の既往歴及びHRGPポリペプチドへの反応、主治医の判断に依存する。患者にHRGPポリペプチドを、一度に又は一連の治療の期間中に投与する。疾病の種類や重症度に応じて、患者の体重1kgあたり約0.01〜1000mgのHRGPポリペプチドが、患者に投与する初期用量候補であり、これはたとえば一回又は複数回の個別の投与あるいは連続的な注入のいずれかによって行う。数日間以上をかけた反復投与では、状態次第で、疾病症状に対する所望する抑制が起こるまで治療を繰り返す。しかし、他の投与計画(regimen)も有用な可能性があり、除外はしない。
【0064】
治療の有効性は、以下を含む様々なパラメーターによって評価することができる。すなわち、皮膚質量、X線、スキャン、腫瘍の大きさを評価する他の手段によって決定した、腫瘍の大きさの縮小;上記の方法により評価した、腫瘍進行の欠如;表面病変の測定及び評価によって決定した、ケロイド形成の減少;眼底網膜の写真の比較分析又は他の適切な評価方法によって決定した、糖尿病性網膜症に関連した網膜病変の改善;上記の方法により決定した、糖尿病性網膜症の進行の欠如である。血液中のHRGPポリペプチドの薬理学的レベルは、ELISA、捕獲検定、放射性免疫測定法、受容体結合検定などによって決定することができる。
【0065】
血管形成を促進するための治療方法
抗血管形成HRGPポリペプチドの拮抗剤を、血管形成を促進することが望ましい対象に投与することができる。適切な対象には、限定することなしに、HRGP拮抗剤を用いた治療に敏感に反応する任意の様々な疾病を有する対象が含まれ、これには末梢虚血疾患、末梢循環性疾患、糖尿病疾患、不妊症が含まれるが限定しない。治療上の応用には、HRGP拮抗剤たとえば抗HRGP抗体又はHRGP受容体を、製薬的に許容される剤形で哺乳動物たとえばヒトに投与する。HRGP拮抗剤を静脈内に大量瞬時投与として、又は筋肉内、皮下、間接内、滑液内、くも膜下腔内、経口、外用、吸入経路による一定時間をかけた連続的な注入によって、投与することができる。適切なHRGP拮抗剤の用量は、治療する疾病の種類、疾病の重症度及び過程、それ以前の治療の過程、患者の既往歴及びHRGPポリペプチドへの反応、主治医の判断に依存する。患者にHRGP拮抗剤を、一度に又は一連の治療の期間中に投与する。
【0066】
避妊の方法
抗血管形成HRGPポリペプチドは、胚の着床に必要な子宮の血管新生を減少又は妨げることによって、避妊薬として使用することができる。このような避妊方法では、胚の着床を妨げるのに十分な量のHRGPポリペプチドを雌の哺乳動物に投与する。この避妊方法の一態様では、性交及び受精が起こる前又は起こった後に、胚の着床をブロックするのに十分な量のHRGPポリペプチドを投与して、効果的な避妊方法、おそらくは「翌朝」の方法を提供する。投与方法には、錠剤、注入(静脈内、皮下、筋肉内)、坐薬、膣内スポンジ、膣内タンポン、子宮内装置が含まれるが、それだけには限定されない。
【0067】
HRGP欠乏性血漿
HRGP欠乏性血漿は、当分野で周知の様々な免疫沈降技術で抗HRGP抗体を使用して調製することができる。このような技術には、免疫沈降、免疫親和性ビーズ精製、免疫親和性カラムクロマトグラフィーが含まれるが、それだけには限定されない。HRGP欠乏性血漿はまた、当分野で周知の方法によって、Ni−NTAアガロース樹脂を用いて調製したNiカラム(Qiagen Inc.、米国チャッツワース)に血漿を通すことによって調製することもできる。
【0068】
HRGPポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様は、HRGPポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を含む。このようなポリヌクレオチドには、mRNA、cDNA、ゲノムDNA、それらの診断上又は治療上有用な断片が含まれるが、それだけには限定されない。HRGPポリペプチドの誘導体又は類似体である断片をコードする、このようなポリヌクレオチドの変異体も含まれる。
【0069】
本発明の単離した核酸分子は、標準の技法によって生成することができる。本明細書中で使用する「単離した」とは、HRGPポリペプチドをコードする遺伝子の一部又はすべてに対応する配列であり、自然に存在するゲノム中の野生型遺伝子の一方又は両方の末端に通常隣接する配列を含まないものをいう。自然に存在しない配列は自然にはなく、自然に存在するゲノムにある直接隣接する配列を有さないので、核酸に関して本明細書中で使用する用語「単離した」とは、任意の自然に存在しない核酸配列も含む。
【0070】
単離した核酸は、たとえば、自然に存在するゲノム中のDNA分子に通常直接隣接している核酸配列が取り除かれている又は存在しないことを条件として、DNA分子とすることができる。したがって、単離した核酸には、他の配列から独立した分離された分子として存在するDNA分子(たとえばPCR又は制限酵素処理によって生成したcDNA又はゲノムDNA断片)、及びベクター、自己複製プラスミド、ウイルス(たとえばレトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス)、原核生物又は真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAが含まれるが、それだけには限定されない。さらに、単離された核酸は、操作した核酸、たとえばハイブリッド核酸又は融合核酸の一部である組換えDNA分子を含むことができる。たとえばcDNAライブラリまたはゲノムライブラリ中であるいは制限消化したゲノムDNAを含むゲル切片中で数百から数百万個の他の核酸と一緒に存在する核酸は、単離した核酸と見なすべきでない。
【0071】
本発明の範囲内にある単離した核酸は、通常の分子クローニング及び核酸の化学合成技術を含むが限定はしない任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、PCR技術を用いて、当分野で既知のHRGP配列と同一性を共有する核酸配列を含む核酸を単離することができる。PCRとは、標的核酸配列を増幅させる手順又は技術を意味する。増幅する鋳型と逆の鎖の配列と同一であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するためには、通常、目的領域の末端又はその領域より先の配列情報を使用する。PCRを用いて、全ゲノムDNA又は全細胞性RNAの配列を含めたDNA及びRNAの特定配列を増幅することができる。プライマーは通常14〜40ヌクレオチド長であるが、10ヌクレオチド〜数百ヌクレオチド長にわたることもできる。一般的なPCR技術は、たとえば「PCRプライマー:実験室マニュアル(PCR Primer:A Laboratory Manual)」、Dieffenbach,C.及びDveksler,G.編集、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1995に記載されている。鋳型源としてRNAを使用する場合、逆転写酵素を使用して相補DNA(cDNA)鎖を合成することができる。
【0072】
単離した本発明の核酸は、単一核酸分子又は一連のオリゴヌクレオチドのどちらかとして化学合成することもできる。たとえば、所望する配列を含む一対又は複数対の長いオリゴヌクレオチド(たとえば>100ヌクレオチド)を合成することができ、この場合、各対が、オリゴヌクレオチド対がアニーリングしたときに二重鎖が形成されるように相補性の短いセグメント(たとえば約15ヌクレオチド)を含んでいる。DNAポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを伸長させると、各オリゴヌクレオチド対あたり1個の二本鎖核酸分子が生じ、その後それをライゲーションによってベクターに挿入することができる。
【0073】
単離した本発明の核酸は、突然変異誘発によっても得ることができる。たとえば、単離した、当分野で既知のHRGP配列と同一性を共有する核酸を、通常の分子クローニング技術(たとえば部位特異的突然変異誘発)を使用して変異させることができる。可能な変異は、欠失、挿入、置換、及び欠失、挿入、置換の組合せである。
【0074】
さらに、核酸及びアミノ酸のデータベース(たとえばGenBank(登録商標))を使用して、単離した、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドを得ることができる。たとえば、当分野で既知のHRGPポリペプチドをコードする核酸配列と相同性を有する配列、又は当分野で既知のHRGPアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列をクエリーとしてGenBank(登録商標)を検索することができる。既知のHRGPポリペプチドをコードする核酸の例には、以下のGenBank(登録商標)登録番号が含まれる。すなわち、NM000412(ヒト)、AF194028(マウス)、AF194029(ラット)、U32189(ウサギ)である。
【0075】
さらに、核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して本発明の範囲内にある核酸を単離することができる。手短に述べると、HRGPポリペプチドをコードする核酸配列を、中程度から高度の厳密性の条件下でのハイブリダイゼーションによって類似の核酸を同定する、プローブとして使用することができる。中程度の厳密性のハイブリダイゼーション条件は、25mMのKPO4(pH7.4)、5X SCC、5Xデンハルト液(Denhardt’s solution)、50μg/mLの変性させた超音波処理したサケ精子DNA、50%ホルムアミド、10%デキストラン硫酸、1〜15ng/mLのプローブ(1μgあたり約5×107cpm)を含むハイブリダイゼーション溶液中で、約42℃でのハイブリダイゼーションを行い、2X SSC及び0.1%SDSを含む洗浄液を用いた約50℃での洗浄ステップを含む。高度な厳密性では、同一のハイブリダイゼーション条件が使用できるが、0.2X SSC及び0.1%SDSを含む洗浄液を用いて、洗浄を約65℃で行う。
【0076】
核酸が同定されれば、その後、この核酸が本明細書に記載の本発明の範囲内にあるかどうかを決定するために、核酸を精製し、配列決定し、分析することができる。ハイブリダイゼーションは、DNA又はRNA配列を同定するために、それぞれプローブとハイブリッド形成するサザン又はノーザン分析によって行うことができる。プローブを、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素、放射性同位元素たとえば32Pや35Sを用いて標識することができる。分析するDNA又はRNAをアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で分離し、ニトロセルロース、ナイロン、又は他の適切な膜に移し、当分野で周知の標準技術を使用してプローブをハイブリッド形成させることができる。たとえば、Sambrook他、1989、「分子クローニング(Molecular Cloning)」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州プレインビューのセクション7.39〜7.52参照。
【0077】
本発明は、単離したHRGPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及びこれらベクターを含む宿主細胞も含む。本発明のベクターは、たとえばクローニングベクター又は発現ベクターを含むこともできる。宿主細胞は、本発明のベクターを用いて遺伝的に操作(形質導入、形質転換、又は形質移入)されていてもよい。操作した宿主細胞を、必要に応じてプロモーターの活性化、形質転換体の選択、本発明の遺伝子の増幅のために改変した従来の栄養培地中で培養することができる。培養条件たとえば温度、pHなどは、発現用に選択された宿主細胞で以前に用いた条件であり、当分野の技術者には明らかであろう。
【0078】
本発明を以下の実施例中でさらに説明し、これは特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない。
【実施例1】
【0079】
組織培養
FGF受容体1(FGFR−1)を過剰発現しているブタ大動脈内皮(PAE)細胞系を、10%ウシ胎児血清(FCS)を補充したハムF12培地中で培養した。Wennstrom他、1992、生物化学雑誌(J.Biol.Chem.)、267:13749参照。一次ウシ副腎皮質毛細血管内皮(BCE)細胞を、ゼラチンでコーティングした組織培養皿上で、10%FCS及び1ng/mlのFGF−2(Boehringer Mannheim)で補完した改変ダルベッコ培地中で培養した。U−343ヒトグリオーマ細胞を、10%FCSで補完した改変ダルベッコ培地中で培養した。スイス3T3線維芽細胞を、10%FCSで補充したDMEM中で培養した。ヒト胚性腎(human embryonic kidney、HEK)293−EBNA細胞を、DMEM/10%FCS中で培養した。
【実施例2】
【0080】
漿尿膜(CAM)検定
準拠したCAM検定条件は、基本的にFriedlander他及びDixelius他に記載のとおりである。Friedlander他、1995、サイエンス(Science)、5241:1500及びDixelius他、2000、血液学(Blood)、95:3403参照。受精したヒヨコ胚を当地で購入し、湿度70%、38℃で10日間プレインキュベートした。卵の一端にある気室の真上に、穴あけ器で小さな穴を開けた。CAM上の無血管領域を確認し、その領域の上方の卵殻に第2の穴を開けた。第1の穴に真空をかけることによって殻からCAMを分離した。フィルターディスク(Whatman Inc.)を3mg/mlの酢酸コルチゾン(Sigma)で飽和させ、FGF−2(Boehringer Mannheim、各フィルター0.2μg)、VEGF−A(Peprotech、各フィルター0.2μg)、精製HRGP(各フィルター3μg)を含む又は含まない緩衝液(各フィルター30μl)に浸した。殻に1×1cmの窓を作成してCAMを露出させ、試験する試料をこの無血管性領域に施用した。窓をテープで塞ぎ、ヒヨコ胚をさらに3日間インキュベートした。この時点で、膜をフィルターの周りで切り取り、これを上下逆にして光学顕微鏡(Nikon Eclipse TE 300、倍率2.5又は4)で検査した。
【実施例3】
【0081】
内皮細胞遊走検定
100μg/mlのタイプ1コラーゲン溶液(Vitrogen100、Collagen Corp)を用いてコーティングした毛細孔ニトロセルロースフィルター(厚さ8μm、8μm孔)を使用して遊走検定を改変ボイデンチャンバー内で実施した(Auerbach他、1991、薬理学と治療学(Pharmacol.Ther.)、51:1〜11参照)。一次BCE細胞又はヒトグリオーマ細胞(U−343 MG)をHRGP(100ng/ml)を用いて30分間プレインキュベートし、トリプシン処理し、0.1%ウシ胎児血清(FCS)を含むハムF12培地中、1mlあたり4.0×105個の細胞の濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液を上チャンバーに置き、0.1%FCSと5ng/mlのFGF−2又は5ng/mlの血小板由来の成長因子BB(platelet−derived growth factor−BB、PDGF−BB、Peprotech Inc.)とを組み合わせた培地、及び100ng/mlのHRGPを含む培地を個別に又は組み合わせて、下チャンバーにフィルターの下方に置いた。10%のFCSは、ポジティブコントロールとして用いた。37℃で4時間後、培地を取り除き、フィルターに付着している細胞を純粋なメタノールで固定化し、ギムザ染色で染色した。フィルターの下側の細胞を、スイス、Bergstrom Instrumentsの画像分析ソフトウェア(Easy Image Analysis)を使用して3つの個別の顕微鏡視野で数えた。すべての試料を、各処置少なくとも6個のウェルで分析した。
【実施例4】
【0082】
動物研究
動物研究は、ウプサラ大学のBiomedical Center動物施設で実施し、動物実験の地域(local)委員会の承認を受け、腫瘍実験における動物の福祉に関するUKCCCR指針に従って実施した。Workman他、1988、実験動物(Lab.Anim.)、22:195〜201参照。6週齢、雌のC57BL6/Jマウス(Mollegard/Bomhultgard、デンマーク)を気候順応させ5個体ずつの群でケージに入れ、自由に動物用固形試料及び飲料水の食餌を摂食させた。すべての操作中、イソフルラン(Forene、スウェーデン、アボット)を用いてマウスに麻酔した。50μlのDMEM中に0.5×106個のT241繊維肉腫細胞をマウスの左脇腹に皮下注射した。触知可能な腫瘍を有する動物を無作為に選択し、4mg/kg/日のHRGP、媒体(PBS)、又はコントロールとしてのサーモライシン切断抗トロンビンを用いて11日間毎日、右脇腹に皮下注射として与え、治療を受けさせた。カリパーを用いて1日1回、二重盲手順で腫瘍を測定し、式π/6×幅2×長さによって体積を計算した。ANOVAを使用して統計分析を実施した。約11日間の治療後、致死量のペントバルビタールで屠殺し、ミロニヒリン酸緩衝液(Millonig’s phosphate buffer)中の4%パラホルムアルデヒドで灌流した。その後、標準の組織学手順に従って腫瘍をパラフィンに包埋して、4μmの厚さの切片にした。
【実施例5】
【0083】
免疫沈降及びブロッティング
実施例1に記載のPAE/FGFR−1細胞を一晩血清飢餓させ、FGF−2(100ng/ml)又はHRGP(1μg/ml)を個別に又は組み合わせて用い、10分間37℃で刺激させ、又は刺激させなかった。細胞をNonidet P40を含む緩衝液中で溶解し、試料をSDS−PAGEで分離してHybond−C extra(Amersham Pharmacia Biotech)に移した。抗リン酸Erk1/2抗体(New England Biolabs Inc.)又は抗リン酸p38(New England Biolabs Inc.)を用いて膜を免疫ブロットした。化学発光検出システムを用いて免疫反応性タンパク質を可視化させた。Matthews他、1985、分析生化学(Anal.Biochem.)、151:205〜209参照。
【実施例6】
【0084】
HRGPはCAM血管形成を阻害する
殻に窓を作成することによって10日齢のヒヨコ胚のCAMを露出させた。CAMを成長因子たとえばFGF−2で処置することで、CAMの血管形成が刺激された(表1)。FGF−2及びVEGF−Aを10倍モル濃度過剰のHRGPと一緒にCAMに施用することにより、血管形成の抑制が生じた。
【0085】
【表1】
【0086】
0(低い)から3(高い)のスコアは、Friedlander他、1995及びDixelius他、2000の方法に従った、血管分岐点の数に基づいている。5〜6個の胚の平均値を記録した。ばらつきは15%未満であった。これらの結果は、漿尿膜検定によって測定されたように、HRGPが抗血管形成活性を有することを示す。
【実施例7】
【0087】
HRGPは内皮細胞遊走を阻害する
血管形成とは、血管内皮細胞が新しい血管を形成するために起こすいくつかの変化、たとえば増殖、遊走、分化の集合語である。Gerwins他、2000、腫瘍学と血液学におけるクリティカルレビュー(Crit.Rev.Oncol.Hematol.)、34:185〜194参照。実施例3に記載の検定を使用して、内皮細胞の遊走に対するHRGPの影響を分析した。一次ウシ毛細血管内皮(BCE)細胞は、ミニボイデンチャンバー内での基準遊走に比べて、FGF−2に向かう遊走が150%増強された。この増強された遊走は、FGF−2と100ng/mlのHRGPとの共インキュベーションにより、完全に抑制された(図1)。対照的に、PDGF−BBに向かうU−343 MGヒトグリオーマ細胞の遊走は、HRGPに阻害されなかった。この結果は、内皮細胞遊走検定によって測定されたように、HRGPが抗血管形成活性を有することを示す。
【実施例8】
【0088】
シグナル形質導入
内皮細胞で、FGF−2で誘発させたシグナル形質導入に対するHRGPの効果を、実施例5に記載の検定で試験した。PAE/FGFR−1細胞を、100ng/mlのFGF−2又は50ng/mlのVEGF−Aを用いて、1mg/mlのHRGPの存在下又は非存在下で7分間処理した。全細胞の溶解物を調製し、SDS−PAGE及び免疫ブロットにより分析した。HRGPは、VEGF−A又はFGF−2で誘発させたMAPキナーゼたとえばErk1/2の活性化にも、FGF−2で誘発させたp38の活性化にも影響を与えず、これによりFGF−2に媒介されるFGFR−1の活性化及びシグナル導入はHRGPによって影響されないことが示された。Erk1/2及びp38の活性は、HRGPで処理した細胞内で基準レベルがわずかに増加していた。
【実施例9】
【0089】
マウスにおける繊維肉腫腫瘍の成長の阻害
実施例4に記載の検定では、HRGPはマウスの繊維肉腫の成長を阻害した。ヒト血漿から精製したHRGPを使用して、左脇腹に触知可能な皮下T241繊維肉腫を有するC57/ブラックマウスを処置した。コントロールとして、C57/ブラックマウスをPBSで処置した。コントロールの腫瘍の大きさが最大で2.5cm2(約11日)になるまで、4mg/kgの用量を右脇腹に皮下注射する処置を毎日行った。HRGPを用いた注入は、腫瘍の成長に劇的な減少をもたらした(図2)。屠殺時には、腫瘍の大きさは約75%減少していた。それと平行して、腫瘍を有する動物を、サーモリシン切断抗トロンビンを用いて処置した(図2B)。PBSで処置した動物と、サーモリシン切断抗トロンビンで処置した動物の腫瘍の大きさには、統計的に有意な差はなかった。これらの結果は、pHRGPの効果は一般的にタンパク質の操作や注入によるものではなく、繊維肉腫腫瘍成長検定によって測定すると、HRGPが抗血管形成活性を有することを示す。
【実施例10】
【0090】
HRGP発現ベクターの構築
ヒトのヒスチジンリッチ糖タンパク質(HRGP)完全長のcDNAを、pCEP−Pu2発現ベクター内のEcoR1/Xho 1部位にクローニングした。Hallgren他、2000)。HRGP cDNAのアミノ酸1〜18はシグナルペプチドをコードし、これはこのタンパク質の細胞外分泌を可能にする。したがって、pCEP−Pu2内のクローニングカセットの前にあるBM40シグナル配列を、HindIII/Nhe1を用いた制限切断によって取り除いた。新しいベクターをpCEP−78544と命名し、これはヒスチジンタグなしのHRGP(rHRGP)をコードしている。
【0091】
ヒスチジンタグした完全長HRGP及びC末端で切断された変異体の発現ベクターも、pCEP−Pu2発現システムを用いて構築した。これらベクターは、HRGPの完全長又は完全長より少ない部分のPCR増幅によって作成した。精製を容易にするために、HRGPコード領域のN末端にヒスチジンタグ(6個のヒスチジン)を付加した。ヒスチジンタグの除去を可能にするために、エンテロキナーゼ切断部位をヒスチジンタグとHRGPコード領域の間に導入した。これらベクター内では、HRGPシグナル配列を除去した。その代わりに、PCR産物を、pCEP−Pu2の枠内でBM40シグナル配列に入れた。3つのこのようなベクターを構築し、pCEP−Pu2/His1、3、4と命名した。この3つのベクターは、ヒスチジンタグした完全長HRGP(His1)及び2つの切断されたHRGPポリペプチド(His3〜4)をコードしている。図3参照。
【実施例11】
【0092】
EBNA−293細胞の形質移入及び条件培地の回収
ヒト胚性腎(HEK)293−EBNA細胞を用いて、組換えHRGPポリペプチドを生成した。形質転換されたプラスミドDNAが染色体に組み込まれるのを防止するために、やはりpCEP−Pu2ベクターで発現されるEBNA−1遺伝子を用いてこれらの細胞を安定に形質転換させた。この操作は、細胞の細胞質中のプラスミドが高コピー数であることを可能にし、組換えタンパク質の収量を増大させる。実施例10に記載のHRGP発現ベクターを、Lipofectamine(Invitrogen)を使用して製造者のマニュアルに従って293−EBNA細胞系に形質移入させた。形質移入の48〜72時間後、pCEP−Pu2ベクターが取り込まれたものを選択するために2.5μg/mlのプロマイシン(Sigma)を用い、EBNA−1を発現する細胞を選択するために0.25mg/ml のG418(Calbiochem)を用いて細胞を選択圧下に置いた。成長中の細胞が拡大し、条件培地を5日目毎に回収した。ウシHRGPによる汚染を防止するために、条件培地の回収中にFCSを、定義した血清置換培地TCM(ICN Biomedicals)で交換した。細胞及び細片を、10分、1200gの遠心分離により取り除いた。
【実施例12】
【0093】
血漿からのHRGP(pHRGP)及び組換えHRGP(rHRGP)の精製
採取したてのヒト血漿から、プロテイナーゼ阻害剤の存在下でホスホセルロース上のクロマトグラフィーによってpHRGPを精製した(Rylatt他、1981、Kluszynski他、1997)。タグ付けされていないHRGP(rHRGP)を条件培地から精製するために同じ方法を使用した。
【実施例13】
【0094】
ヒスチジンタグしたHRGPの精製
Ni−NTAアガロースを使用して、実施例11に記載のHis1、3、4形質移入細胞系から、ヒスチジンタグしたHRGPポリペプチドを精製した。約50mlのHRGP条件培地を200μlの50%Ni−NTAアガローススラリーと一緒に、終夜4℃「回転させながら(end−over−end)」インキュベートした。アガロースを遠心沈殿させて、PBS pH7.0/1M NaCl/0.1%Tween−20を用いて3〜4回洗浄した。アガロースをカラムに充填し、上記のように再度洗浄した。結合した物質は、100mMイミダゾール/20mMトリスpH8.0/0.1M NaClを使用した分画で溶出された。タンパク質を含む分画を貯留し、PBS pH7.0に対して透析した。SDS−PAGE上でBSA標準と比較することによって、またBCA Protein Assay Kit(Pierce)によって最終タンパク質濃度を推定した。
【実施例14】
【0095】
TUNEL検定
末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を用いたdUTPニック末端標識(terminal deoxynucleotidyl transferase−mediated dUTP nick−end labeling、TUNEL)検定を以下のように実施した。ゼラチンでコーティングしたガラススライドに、BCE細胞をDMEM/10%NCSと2ng/mlのFGF−2中で播種した。40時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、In Situ Detection Kit、Fluorescein(Roche Diagnostics)を用いてアポトーシス細胞を染色した。手短に述べると、この方法の原理は、アポトーシスプロセス中に作成されたフリーの3’−OHを、酵素反応で蛍光dUTPを用いて標識することである。すべての細胞が検出されるようにするために、Hoechst33342を用いて二重染色を実施した。TUNEL陽性細胞の割合は、各処置から約1500個ずつの細胞を分析することによって決定した。
【実施例15】
【0096】
FGFR活性化の分析
FGF受容体(FGFR)活性化の分析は、F12/0.1%BSA中で終夜血清飢餓させ、FGF−2(50ng/ml)、rHRGP(1μg/ml)又はその組合せを用いて37℃で8分間刺激したPAE/FGFR−1細胞を用いて実施した。Triton X−100を含む緩衝液中で細胞を溶解し、チロシンリン酸化されたタンパク質を4G10抗体(Upstate Biotetchnology)を用いて免疫沈降させた。試料をSDS−PAGEで分離し、Hybond−C extra(Amersham Pharmacia Biotech)に移した。P Maher博士、Scripps Research Institute、米国、カリフォルニア州la Jollaから提供された抗FGFR−1抗体を用いて免疫ブロッティングを実施した。p38リン酸化の分析は、FGF−2を添加する前に1μg/mlのrHRGPで30分間プレインキュベーションした、又はしていない、50ng/mlのFGF−2を用いて37℃で10分又は30分間処置したPAE/FGFR−1細胞で実施した。細胞をTriton X−100を含む緩衝液中で溶解し、全溶解物をSDS−PAGEで分離し、抗リン酸p38抗体又は抗p39抗体(New England Biolabs)を用いて免疫ブロットした。ERK1/2リン酸化の分析は、FGF−2を添加する前に1μg/mlのrHRGPで30分間プレインキュベートした、又はしていない、50ng/mlのFGF−2を用いて37℃で10分又は90分間処置したBCE細胞で実施した。細胞をTriton X−100を含む緩衝液中で溶解し、全溶解物をSDS−PAGEで分離し、抗リン酸ERK抗体(New England Biolabs Inc.)を用いて免疫ブロットした。免疫反応性タンパク質を、化学発光検出システムによって可視化した(Matthews他、1985)。
【実施例16】
【0097】
組換えHRGPの生成及び特徴付け
HRGPの抗血管形成作用をさらに調査し、タンパク質中の活性が一番低い領域を決定するために、組換えHRGPを生成した(rHRGP)。ヒスチジンタグを有する又は有さない完全長のHRGPを構築し、実施例10〜13に記載のように単離した。ヒスチジンタグを有する2つのC末端切断HRGPポリペプチドを生成し、実施例10〜11、13に記載のように単離した。
【0098】
組換えタンパク質が、おそらくは様々なレベルの糖鎖形成により、わずかに少ない見かけの分子量を示すことが、単離したpHRGPポリペプチド及び単離したrHRGPポリペプチドのクマシー染色により明らかになった。HRGP特異的抗体を用いたウエスタンブロットにより、完全長タンパク質以外にも、pHRGP及びrHRGP分画のどちらもで、いくつかのより短い断片の存在が明らかになった。単離したHis1、3、4HRGPポリペプチドも、クマシー染色及び抗HRGPウエスタンブロットで分析した。予測した分子量は予想どおりであり、3つの組換えタンパク質すべてがHRGP特異的抗体で認識された。最も短い切断HRGPポリペプチド、His3は、His1及びHis4HRGPポリペプチドと比べてタンパク質分解切断により感受性があった。
【0099】
HRGPに対するドメイン特異的な抗体は、0115、0116、0119と命名した3つの異なるペプチドを用いてウサギを免疫化させることによって産生させた。HRGPタンパク質内のこれらペプチドの位置を、図3に示した。3つの抗ペプチド抗体を用いて、完全長HRGPのウエスタンブロットを実施した。その結果、完全長HRGPポリペプチドが3つの抗体すべてで検出されることが示された。しかし、より小さなHRGP由来の断片に対しては、3つの抗体それぞれで特異的パターンの反応性が観察された。
【実施例17】
【0100】
rHRGPは内皮細胞の遊走を阻害する
内皮細胞の遊走に対するrHRGPの効果を、実施例3に記載の検定法を使用して測定した。pHRGPで見られた、FGFで誘発させた遊走に対する阻害効果と同じものが、rHRGPを使用した場合も観察された(図4A)。rHRGPの阻害効果は統計的に有意であった。しかし、ウシ胎児血清で誘発させた遊走は、rHRGPで阻害されなかった。図4A参照。
【0101】
また、検定は様々なrHRGP量を用いて実施した。図4Bに示すように、基準レベルにまで遊走を阻害するには100ng/mlのrHRGPが必要であった。ヒスチジンタグの存在は、FGFで誘発させた遊走の阻害に対するHis1HRGPの能力に影響を及ぼさなかった。
【0102】
成長因子VEGF−A及び血小板因子由来の成長因子BB(PDGF−BB)に対するrHRGPの効果も分析した。VEGF−A及びPDGF−BBもまた、培養物中でBCE細胞の遊走を誘発させる。rHRGPは、VEGF−A又はPDGF−BBのどちらの成長因子で誘発させた遊走も完全に阻止した。HRGPとほぼ同じ大きさの任意のヘパリン結合血漿タンパク質がFGFに誘発される遊走に影響を与える可能性を排除するために、本発明者らは、遊走検定中で、タンパク質C阻害剤(protein C inhibitor、PCI)の効果を測定した。HRGPが存在しない場合、PCIの存在はFGFに誘発される遊走に影響を与えなかった。rHRGP単独の場合の、FGFで誘発させた内皮細胞遊走に対する効果を、エンドスタチン(ES)単独の場合の効果と比較した。rHRGP及びESのいずれも100ng/mlで使用し、これは、HRGPとESのモル濃度比1:3に対応する。rHRGPとESのどちらもが、FGFに誘発される遊走を最低でも基準レベルにまで減少させ、ESの方がわずかに効果が高かった。rHRGPの効果の細胞特異性を調査するために、本発明者らは、FGFに誘発されるスイス3T3マウス線維芽細胞の遊走を阻害するrHRGPの能力を試験した。検定で3T3細胞をBCEに置き換えた場合、rHRGPは遊走に対して効果を表さず、これにより、rHRGPの生物活性は内皮細胞に特異的であることが示された。
【実施例18】
【0103】
HRGPはFGFで誘発させた内皮細胞の生存を阻害する
実施例14に記載のようにTUNEL検定を実施した。ゼラチンでコーティングしたガラススライドに播種したBCEを、低血清(DMEM/0.5% NCS)培地中に入れ、FGF−2及びrHRGPを個別に又は組み合わせて添加し、FGF−2は10ng/ml、rHRGPは1μg/mlとした。各処理中のTUNEL陽性細胞の割合を測定した。
【0104】
FGF−2では、飢餓培地中でアポトーシス(TUNEL陽性)細胞を誘発した割合が3倍減少した。FGFで誘発させた内皮細胞の生存は、rHRGPをFGF−2と一緒に加えた場合は無効となった。rHRGP単独では効果がなかった。
【実施例19】
【0105】
シグナル形質誘導
本発明者らは、FGF−2に誘発される内皮細胞のシグナル形質導入に対するHRGPの効果を試験した。FGF受容体1(FGFR−1)の活性化に対する効果は、1μg/mlのrHRGPで30分間プレインキュベートした、又はしていない、PAE/FGFR−1細胞を50ng/mlのFGF−2で8分間処理することによって調査した。全細胞溶解物を調製し、チロシンリン酸化タンパク質を免疫沈降した。試料をSDS−PAGEで分離し、抗FGFR−1抗体で免疫ブロットした。その結果、rHRGPがFGF−2で誘発させたFGFR1の活性化に影響を与えないことが示された。
【0106】
p38MAPK活性化に対するrHRGPの効果をPAE/FGFR−1細胞で分析した。p38 MAPKは、内皮細胞のアポトーシスに関連している。細胞を、FGF−2を添加する前に1μg/mlのrHRGPで30分間プレインキュベーションしてから、又はせずに、10分又は30分間、50ng/mlのFGF−2を用いて処置した。全溶解物をSDS−PAGEで分離し、抗リン酸化p38抗体で免疫ブロットした。FGF−2に誘発された、10分又は30分間のどちらの刺激でもp38のリン酸化が増加したが、HRGPの効果はなかった。抗p38抗体を用いた免疫ブロットにより、各レーンに同量のタンパク質があることが明らかになった。
【実施例20】
【0107】
マウスの腫瘍成長
実施例4に記載の方法と同様の方法で、T241繊維肉腫細胞の代わりに神経芽細胞腫細胞を用いて、動物に対する適切な導入部位を使用して腫瘍を有するマウスを準備した。検出可能な腫瘍を有するマウスを無作為に選択し、HRGP、媒体(PBS)単独、又は腫瘍成長に影響のないネガティブコントロールとポリペプチドたとえばサーモリシン切断のATや免疫グロブリンGを用いた治療を受けさせた。HRGP、媒体、コントロールポリペプチドを毎日投与した。二重盲手順を使用して、腫瘍を1日1回すなわち投与時に測定した。腫瘍体積を、式π/6×幅2×長さによって計算した。統計分析は、ANOVA又は他の適切な統計手順を用いて実施した。実験の最後に、致死量のペントバルビタール又は他の認められた屠殺方法を用いて屠殺し、ミロニヒリン酸緩衝液pH7.4中の4%パラホルムアルデヒドで灌流、又は内皮細胞に特異的に結合する標識レクチンを含む緩衝液で灌流した。その後、標準の組織学手順に従って腫瘍をパラフィンに包埋、又は超低温凍結し、4μmの厚さの切片にした。
【0108】
この実験を、隔日の投与計画、週に5日の投与計画を使用して繰り返した。この実験を、神経芽細胞腫細胞の代わりにルイス(Lewis)肺細胞、奇形腫細胞、他の腫瘍細胞モデルを用いて繰り返した。
【実施例21】
【0109】
切断された形のHRGPの効果
組換えHRGPポリペプチドHis3及びHis4を、実施例13に記載のように単離した。ヒスチジンタグを有さない、対応するポリペプチドも単離した。
【0110】
4つのポリペプチドそれぞれを、実施例2に記載したCAM検定、実施例3に記載した内皮細胞遊走検定、実施例4に記載した繊維肉腫の腫瘍検定、実施例8に記載のシグナル形質誘導検定、実施例14に記載のTUNELアポトーシス検定で試験した。
【実施例22】
【0111】
胚様体血管形成
LIFの使用を中止することによってマウス胚性幹細胞の分化を誘発させた。細胞をハンギングドロップ培養により凝集させ、4日後、非粘着性ペトリ皿(non−adherent petri dish)に流し込んだ。凝集体(胚様体、EB)をペトリ皿内で、pHRGP、rHRGP、His1、His3、His4のいずれかを用いて処理した。コントロールとしては、ESで処置したEBをポジティブコントロール、PCIで処置したPCIをネガティブコントロールとした。血管叢の形成は、抗CD31抗体を用いた免疫組織化学によって、培養してから6、8、12、16日後のEB試料で定性的に分析した。免疫組織化学染色では、ガラススライド上のEBを4%パラホルムアルデヒドで固定化し、メタノールで透過化処理した。内在ペルオキシダーゼ活性は、メタノール中の3%H2O2でブロックされる。ブロッキング緩衝液キット(NEL700、NEN Life Science Products)を使用してTNB非特異的結合部位をブロックし、続いて、TNBで1:8000に希釈した一次ラットCD31抗体(Pharmingen)を用いて終夜インキュベートした。洗浄後、試料を、二次ビオチン標識ヤギ抗ラットIgG(Vector)、次いでシグナルを増幅させるためにストレプトアビジン結合西洋わさびペルオキシダーゼ及びビオチン標識チラミド(NELキットから)インキュベートした。酵素反応には、VectorのABC試薬キットを使用した。同様のプロトコルを用いて3−Dコラーゲンゲル中のEBを染色したが、インキュベーション及び洗浄時間を長くし、洗浄をTriton−X 100を含むPBSで行った。
【0112】
内皮細胞プールの大きさを決定するために、胚様体も定性的に分析した。これは、コラゲナーゼ処理、次いで蛍光標示式細胞分取(FACS)又は抗CD31でコーティングした磁気ビーズで捕捉することによる内皮細胞の単離によって行う。
【0113】
個々のEBをグラススライドに拾い、次いで上に記載のようにHRGPポリペプチドで処理することによって実験を繰り返す。EBを3次元コラーゲンゲルに播種し、次いで上に記載のようにHRGPポリペプチドで処理して実験を繰り返す。
【0114】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は例示的なものであり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、添付の特許請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0115】
【図1】FGF−2で誘発させた内皮細胞の遊走に対するHRGPの効果を示す図である。ミニボイデンチャンバー内で一次ウシ毛細血管内皮細胞(BCE)がHRGPの存在下又は非存在下でFGF−2に向かって遊走する能力を分析した。平均値±3つの異なる実験のSEMを示す。
【図2】HRGPの投与に伴って阻害される腫瘍の成長を示すグラフである。図2Aでは、雌のC57BL6/Jマウスに、リン酸緩衝食塩水(PBS)中のT241細胞0.5×106個を皮下接種した。腫瘍が触知可能になったら(治療日0)、4mg/kg/日のHRGP(n=8)又はPBS(n=10)を皮下注射注入する11日間の治療を受けるように動物を無作為に割り当てた。図2Bでは、触知可能なT241腫瘍を保有するマウスの平行群にPBS(N=6)又はサーモリシン切断抗トロンビン(N=6)を注入した。AT=サーモリシン切断抗トロンビンである。
【図3】N末端シスタチン様部分、ヒスチジン/プロリンに富んだ中央ドメイン、及びC末端領域を含む、HRGPの主なドメインを示す図である。また、ヒスチジンタグを有する完全長HRGP(His1)及び2つのC末端で切断されたポリペプチド(His3〜4)も示す。6×His=ヒスチジンタグ、EK=エンテロキナーゼ切断部位である。数字390及び320は、切断されたポリペプチドのC末端残基を示す。0115、0116、0119と標示したバーは、産生させたウサギ抗体に対するペプチドの位置を示す。
【図4】FGF−2及び血清で誘発させた遊走に対するrHRGPの効果を示す図である。A.BCE細胞に対してFGFで誘発させた遊走は100ng/mlのrHRGPで阻害された。血清(FCS)で誘発させた遊走はHRGPで阻害されなかった。B.FGFで誘発させたBCE細胞の遊走に対するrHRGPの用量応答曲線である。FGF−2は5ng/mlで使用した。
Claims (54)
- 実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドを含む組成物。
- 抗血管形成剤をさらに含む請求項1に記載の組成物。
- 前記抗血管形成剤が、アンジオスタチン、トロンボスタチン(thrombostatin)、エンドスタチン、インターフェロンα、インターフェロン誘導性因子10、血小板因子4、COX−2阻害剤からなる群から選択される請求項2に記載の組成物。
- 哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドがHRGP断片である請求項1に記載の組成物。
- 前記断片が無処置のHRGPのアミノ末端ドメインを含む請求項5に記載の組成物。
- 前記断片が無処置のHRGPの中央ドメインを含む請求項5に記載の組成物。
- 前記断片が無処置のHRGPのC末端ドメインを含む請求項5に記載の組成物。
- 前記断片がペンタペプチド[H/P]−[H/P]PHGの少なくとも1つの直列型反復を含む請求項5に記載の組成物。
- 抗腫瘍剤をさらに含む請求項1に記載の組成物。
- 抗血管形成剤をさらに含む請求項10に記載の組成物。
- 前記抗腫瘍剤が、タキソール、シクロホスファミド、カルボプラチナ(carboplatinum)、シスプラチナ(cisphatinum)、シスプラチン、ガンシクロビル、カンプトセシン、パクリタキセル、ヒドロキシ尿素、5−アザシチジン、5−アザ−2’−デオキシシチジン、スラミンからなる群から選択される請求項11に記載の組成物。
- 哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項10に記載の組成物。
- 前記ポリペプチドがHRGP断片である請求項10に記載の組成物。
- 包装材料及び前記包装材料内の実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質を含む製品であって、前記包装材料が、血管形成を阻害するために前記ポリペプチドを哺乳動物に投与すべきであることを表示するラベル又は添付文書を含む製品。
- 実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドを含む組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、前記哺乳動物の血管形成が阻害される、哺乳動物の血管形成を阻害する方法。
- 前記哺乳動物が癌を生じている請求項16に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、心筋性血管形成、糖尿病性網膜症、糖尿病性血管新生、不適切な創傷治癒、炎症性疾患からなる群から選択される状態にある請求項16に記載の方法。
- 前記哺乳動物がマウスである請求項16に記載の方法。
- 前記哺乳動物がラットである請求項16に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである請求項16に記載の方法。
- 前記組成物が、哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項16に記載の方法。
- 前記ポリペプチドがHRGP断片である請求項16に記載の方法。
- 前記組成物が抗血管形成剤をさらに含む請求項16に記載の方法。
- 前記抗血管形成剤が、アンジオスタチン、トロンボスタチン、エンドスタチン、インターフェロンα、インターフェロン誘導性因子10、血小板因子4、COX−2阻害剤からなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記組成物が哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項24に記載の方法。
- 前記ポリペプチドがHRGP断片である請求項24に記載の方法。
- 前記組成物が抗腫瘍剤をさらに含む請求項16に記載の方法。
- 前記抗腫瘍剤が、タキソール、シクロホスファミド、カルボプラチナ、シスプラチナ、シスプラチン、ガンシクロビル、カンプトセシン、パクリタキセル、ヒドロキシ尿素、5−アザシチジン、5−アザ−2’−デオキシシチジン、スラミンからなる群から選択される請求項28に記載の方法。
- 哺乳動物への投与が許容される薬剤キャリアをさらに含む請求項28に記載の方法。
- 前記ポリペプチドがHRGP断片である請求項28に記載の方法。
- FGF−2で誘発させた一次ウシ副腎皮質毛細血管内皮細胞の遊走に対するHRGPポリペプチドの効果を測定すること、及び
前記FGF−2で誘発させた遊走が前記HRGPポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に、前記HRGPポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定すること
を含む、抗血管形成ポリペプチドを同定する方法。 - 前記HRGPポリペプチドがHRGP断片である請求項32に記載の方法。
- ヒヨコ漿尿膜血管形成に対するHRGPポリペプチドの効果を測定すること、及び
前記ヒヨコ漿尿膜血管形成が前記HRGPポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に前記HRGPポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定すること
を含む、抗血管形成ポリペプチドを同定する方法。 - 前記HRGPポリペプチドがHRGP断片である請求項34に記載の方法。
- 血管形成依存性腫瘍の成長に対するHRGPポリペプチドの効果を測定すること、及び
前記腫瘍の成長が前記HRGPポリペプチドの存在下で有意に低減される場合に、前記HRGPポリペプチドを抗血管形成ポリペプチドとして同定すること
を含む、抗血管形成ポリペプチドを同定する方法。 - 前記HRGPポリペプチドがHRGP断片である請求項36に記載の方法。
- ヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドに結合する抗体。
- 前記抗体が、血管形成を阻害する前記ポリペプチドの能力を中和する請求項38に記載の抗体。
- 前記抗体が血管形成に対して作用性である請求項38に記載の抗体。
- 前記抗体が血管形成に対して拮抗性である請求項38に記載の抗体。
- 請求項40に記載の抗体を前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の血管形成を阻害する方法。
- 請求項41に記載の抗体を前記哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の血管形成を刺激する方法。
- 実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドを雌の哺乳動物に投与することを含む避妊の方法。
- 検出可能なマーカーに結合した実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドを投与し、前記検出可能なマーカーに基づいて前記哺乳動物の血管新生を測定することを含む、哺乳動物の血管新生をイメージングする方法。
- 検出可能なマーカーに結合した実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチド。
- 毒素に結合した実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチド。
- ヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドに結合する実質的に純粋な受容体。
- ヒスチジンリッチ糖タンパク質が欠乏した血漿。
- 前記血漿がヒト血漿である請求項49に記載の血漿
- HRGPポリペプチド断片をコードする単離したポリヌクレオチド。
- 請求項51に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項52に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 実質的に純粋なヒスチジンリッチ糖タンパク質ポリペプチドの抗血管形成剤としての使用。
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