CN102580085A - Vegf受体融合蛋白在制备治疗脓毒症药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种或多种选自VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的VEGF抑制剂用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应,所述炎症反应主要包括但不限于脓毒症、重症脓毒症和脓毒症休克。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可与一种或多种其它药物、治疗手段联合用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应。
Description
本申请是申请日为2008年10月13日,申请号为200810046277.2,发明名称为“VEGF受体融合蛋白在制备治疗伴随VEGF升高的炎症的药物中的应用”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及利用一种或多种选自VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的VEGF抑制剂用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应。
背景技术
机体发生严重的全身性炎症称为全身性炎症反应综合征(SystemicInflammatory ResponseSyndrome,SIRS),由明确的病原微生物(如细菌、病毒、真菌、寄生虫等)感染引起的SIRS,统称为脓毒症(Sepsis),并根据症状的严重程度可以分为脓毒症(Sepsis)、重症脓毒症(SevereSepsis)、脓毒症休克(Sepsis Shock)等。简言之,脓毒症指有明显感染表现的S IRS;严重脓毒症在脓毒症基础上出现至少1个器官功能不全;脓毒性休克指在严重脓毒症基础上发生血管阻塞,甚至休克等(Bone RC et al.(1992),Chest,101(6):1644-1655;Levy MM et al.(2003),Intensive Care Med.,29:530-538)。
据报道,全球每年脓毒症发病人数超过1800万人,并且每年增长1.5%。在美国,每年约有70万脓毒症患者,其中约有25万人发展为重度脓毒症、脓毒性休克,总体病死率约为50%(Barie PS et al.(2000),American Journal of Surgery,179(Suppl2A):2S-7S;Barie PS etal.(2000),Surgical Infections,1:173-186;Angus DC et al.(2001),Crit Care Med.,29(7):1303-1310)。中国每年脓毒症病人超过300万人,死亡人数高达50万人以上。虽然治疗手段不断创新,但脓毒症的发病率和死亡率仍居高不下(Angus DC et al.(2001),Crit.Care Med.,29(7):1303-1310)。
抗生素对脓毒症的治疗具有重要作用,但无法解决的问题是:病源微生物感染只是脓毒症最初的触发,抗生素等虽能杀死部分病源微生物,但这些微生物代谢过程中产生的大量内毒素可能导致脓毒症,并引起肾衰、肝衰、脑衰等多种脏器衰竭(Ince C et al.(1999),Crit CareMed,27(7):1369-1377)。
2001年至今,美国FDA(Food and Drug Administration)仅批准一种药物用于治疗脓毒症,即除栓素注射剂(XigrisTM),为Eli Lilly公司产品。除栓素注射剂的活性成分重组人活化蛋白C(Recombinant Human Activated Protein C,rhAPC,或称Drotrecogin alfa)具有抗血栓、抗炎和纤溶等特性。其III期临床试验证实:治疗脓毒症患者绝对病死率降低仅6.1%(30.8%-24.7%);只有在APACHE(AcutePhysiology And Chronic Health Evaluation,急性生理学与慢性健康状况)II评分≥25(严重脓毒症,高危死亡)时,患者的病死率降低稍大,约13%(Bernard GRetal.(2001),N Engl J Med.344(10):699-709)。可见目前还没有真正攻克脓毒症的药物,迫切需要发现更加有效的药物。
随着研究的不断深入,发现了多种伴随血管内皮生长因子(VascularEndothelial GrowthFactor,VEGF)升高的的炎症反应,例如脓毒症、重症脓毒症、脓毒症休克等。近来研究表明,脓毒症发生后,血液循环中的VEGF含量会增加,并且与该病的严重程度正相关(Van Der FlierM et al.(2005),Shock.,23(1):35-38;Pickkers P et al.(2005)Shock.,24(6):508-512;ShapiroNI et al.(2008),Shock.,29(4):452-457)。VEGF发挥功能需要其受体介导,VEGF受体(VascularEndothelialGrowth Factor Receptor,VEGFR)有多种,介导VEGF功能的主要受体为VEGFR-1(或称为FLT-1,FMS-like Tyrosine Kinase,FMS样酪氨酸激酶)和VEGFR-2(或称为KDR,Kinase Insert Domain-Containing Receptor,含激酶插入功能域受体,亦或称为FLK-1,Fetal Liver Kinase-1,胎儿肝激酶-1)。VEGFR-1和VEGFR-2的结构分为胞外区、胞内区和跨膜区3个部分,其中胞外区由七个免疫球蛋白样区域(d1-d7)组成,具有与VEGF结合的活性。(Ferrara N et al.(2002),Nat Rev Cancer,10:795-803;Ferrara N et al.(2002),Semin Oncol,29(6sumppl):10-14;Ferrara N et al.(2004),Nat Rev Drug Discov,3(5):391-400;Ferrara Netal.(2003),Nat Med,9(6):669-676)。
我们的前期工作表明,通过蛋白质工程的方法,构建的可溶性VEGF受体融合蛋白可以有效阻断由VEGF介导的信号传递(Ming Zhang et al.(2008),Molecular Vision,14:37-49)。我们推测这类融合蛋白可能可以用来治疗多类与VEGF相关的炎症反应相关疾病,例如脓毒症、重症脓毒症、脓毒症休克等。
发明内容
本发明的一个目的是利用融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中一种或多种作为VEGF抑制剂,用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应,FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8如下所述(结构示意图见附图1):
FP1:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成;
FP2:由KDR的第1免疫球蛋白样区域、FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成;
FP3:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成;
FP4:由编码FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域、FLT-1的第4免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白Fc组成;
FP5:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3-5免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白Fc组成;
FP6:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域、FLT-1的第4-5免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白Fc组成;
FP7:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域组成;
FP8:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3免疫球蛋白样区域组成。本发明涉及VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的相关资料参见同一申请人的中国专利申请CN200510073595.4(WO2005/121176A1,发明名称“抑制血管生成的融合蛋白质及其用途”)和CN 200610066257.2(WO2007/112675A1,发明名称“VEGF受体融合蛋白及其应用”),这两个申请的公开内容作为本申请的一部分全文并入本申请。
融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可以作为VEGF抑制药物的基础是:融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8具有与VEGF的特异性结合的能力,但亲和力高低有差异,以半效结合浓度(IC50)作为亲和力大小的指标,IC50越小说明亲和力越强。融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8与VEGF的亲和力IC50值位于4.6pM-11.2pM,其中FP3的IC50值最低为4.6pM,因此FP3与VEGF的亲和力最高。(见实施例1)
本发明的一个目的是利用融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的一种或多种作为VEGF抑制剂,用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应,主要包括但不限于脓毒症、重症脓毒症和脓毒症休克等。
融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8适用但不限于如下病因引起的伴随VEGF升高的炎症反应:由各种微生物(如病毒、细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、真菌、寄生虫等)感染引起;由各种腹腔内感染(如化脓性胆囊炎、胆炎、化脓性腹膜炎、非感染性胰腺炎、肠道内细菌和内毒素移位等)引起;由各种呼吸系统感染(如化脓性支气管炎、细支气管炎,克雷白杆菌肺炎、吸入性肺炎、肺炎球菌性肺炎、葡萄球菌肺炎、过敏性肺炎、军团病肺炎、病毒性肺炎、放射性肺炎、衣原体肺炎、支原体肺炎、假单胞菌属肺炎、绿脓杆菌肺炎)引起;由泌尿系统感染(如肾盂肾炎、膀胱炎、尿道炎)引起;由产科感染、儿科感染、烧伤后感染、脏器移植后感染、药物中毒等引起。
本发明的另一个目的是利用融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的一种或多种VEGF抑制剂与其它治疗药物联合使用治疗伴随VEGF升高的炎症反应,这些药物包括但不限于:抗感染药物,除栓素注射剂即重组人活化蛋白C(Recombinant HumanActivated Protein C,rhAPC,或称Drotrecogin alfa),Avastin,Lucentis,VEGF-Trap,Nexavar,Sutent和Zactima等。此外,还可以包括:抗内毒素抗体、抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α抗体、白细胞介素(Interleukin,IL)-1受体拮抗剂、高迁移率族蛋白1、巨噬细胞移动抑制因子、补体C5a、补体受体(C5aR)及半胱氨酸蛋白酶阻断剂、细胞凋亡抑制剂、己酮可可碱,氯胺酮,乌司他丁,低分子肝素钙等。
所述的抗感染药物包括但不限于:各种抗生素如①β-内酰胺类包括青霉素类和头孢菌素类;②氨基糖甙类,包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等;③四环素类,包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等;④酰胺醇类(氯霉素类),包括氯霉素、甲砜霉素等;⑤大环内脂类,包括红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等;⑥其它抗生素,如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等;抗真菌感染的药物,如多烯类(两性霉素B及其衍生物)、三唑类(如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等)、嘧啶类(如氟胞嘧啶)、棘白菌素类(如卡泊芬净)、复方磺胺甲口恶唑等;抗病毒类药物,如阿糖腺苷、阿昔洛韦(无环鸟苷)、泛昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦;抗支原体药物;抗肿瘤药物如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等;具有免疫抑制作用的药物,如环孢霉素。
本发明的另一个目的是利用一种或多种选自VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的VEGF抑制剂与其它治疗方法联合用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应,其它治疗方法包括治疗肺功能障碍的机械通气,补充体液(见实施例6)等,还包括但不限于:外科引流,针对器官功能衰竭的适当支持护理,例如治疗肾功能衰竭的血液透析,治疗循环衰竭的血液制品输液疗法,肠道补充营养等。
本发明的另一个目的是提供将治疗有效剂量的VEGF抑制剂,即VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的一种或多种和任选的药物载体给予患者,治疗伴随VEGF升高的炎症反应。本发明的VEGF受体融合蛋白包括它们的纯化合物形式、溶剂化物形式、盐形式或盐的溶剂化物形式。
本发明涉及的融合蛋白制品经过纯化达到药用纯度后,可以根据制剂的需要制备成药物制剂,按药物制剂的常规制法完成,优选溶液制剂或干粉制剂,作为干粉制剂,使用时将干粉溶解,使成为溶液。
本发明所述的融合蛋白制剂,可以加入药物稳定所需的药用载体等,可以是适合的任何形式,优选自:磷酸钠(Sodium Phosphate)、琥珀酸钠(SodiumSuccinate)、组氨酸(Histidine)、甘露醇(Mannitol)、聚山梨醇酯20/80(Polysorbate20/80)、氯化钠(Sodium Chloride)、蔗糖(Sucrose)、三羟甲基氨基甲烷(Trometamol)和乳糖等。
本发明涉及的制剂缓冲液应含有pH缓冲系统如磷酸盐(Phosphate)、柠檬酸盐(Citrate)、乙酸盐(Acetate)、琥珀酸盐(Succinate)、三羟甲基氨基甲烷(Trometamol,又名Tris)或组氨酸(Histidine)等中的一种或多种,pH的范围在3.0至9.0。
本发明涉及的制剂缓冲液可以含有渗透压调节剂,优选自氯化钠(SodiumChloride)、葡萄糖(Dextrose)等。另外根据需要还可加入防腐剂,助溶剂等辅助成分,可以选自任何适宜的药剂学常规的辅助成分。溶剂选择水或其他等渗溶液,缓冲溶液等。可含有防腐剂如噻汞撒(Thimerosal)、亚硫酸氢钠(Sodium Bisulfite)、苯基乙醇(Benzyl Alcohol)等。对于冻干制剂,可含有赋形剂如甘露醇(Mannitol)等;对于溶液制剂,可含有表面活性剂如聚山梨醇酯(Polysorbate 20或80)、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在上述制剂中,融合蛋白的浓度范围在0.01mg/ml至1000mg/ml。
本发明融合蛋白的用量根据临床的需要、具体疾病、患者体重、病情、病程、临床医生的经验而定,作为指导,可以按照每次给药0.1mg-3000mg,优选1mg-2000mg,可以每日、每2日、每3日、每4日、每5日、每6日、每周、每两周、每三周等给药一次,或者每日给药一次以上。
本发明涉及的含有抑制血管生成的VEGF抑制剂可以通过多种不同的给药途径给予病人,其中包括(但不限于)静脉给药,皮下注射,腹腔内注射,肌注,局部给药和关节腔内注射等。
下列多项实验结果体现出融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8可以单独使用或与其它药物、治疗手段等联合使用,用于治疗伴随VEGF升高的炎症反应:
(1)对于静脉注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)构建的脓毒症大鼠模型,融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗可以提高大鼠存活数量,其中FP3效果最好,并且融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗可以抑制大鼠血浆VEGF水平,其中FP3对VEGF含量抑制最强。(见实施例2)
(2)对于盲肠结扎穿孔(Caecal Ligation Puncture,CLP)构建的脓毒症大鼠模型,分为正常组,假手术组,CLP对照组,FP1治疗组和FP3治疗组,检测不同组织部位的肿瘤坏死因子TNF-α的表达量,TNF-α量越高,说明动物发生的炎症越严重。实验结果显示:CLP造模后动物肝脏、肺脏以及血浆中的TNF-α含量迅速升高,之后缓慢降低;与CLP对照组相比,FP1和FP3治疗可不同程度地降低肝、肺组织和血浆TNF-α水平,并且FP3略优于FP1。因此,融合蛋白FP1和FP3有助于下调TNF-α的过量表达,减轻炎症反应。(见实施例3)
(3)融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8与抗生素联用可以显著提高脓毒症大鼠的生存率,以融合蛋白FP3为例,将盲肠结扎穿孔(CLP)致脓毒症大鼠模型分为未治疗组、抗生素治疗组、融合蛋白FP3治疗组,及FP3与抗生素联合治疗组。结果显示:与未治疗组相比,抗生素治疗组和FP3治疗组均使大鼠存活率显著提高,抗生素治疗组和FP3治疗组无显著差异;而FP3与抗生素联合治疗组存活率提升最为显著,显著高于其他组。(见实施例4)
(4)融合蛋白FP3与抗生素联合使用可以提高重症脓毒症小鼠的存活率,并且与对照组或单独使用抗生素治疗组相比,炎性因子TNF-α和IL-6水平均有所降低。说明融合蛋白FP3与抗生素联合使用对重症脓毒症小鼠有较好的治疗作用,并且优于抗生素的单独使用。(见实施例5)
(5)融合蛋白FP3治疗可以对脓毒症休克犬的肝、肾功能起到保护作用。脓毒症休克犬建模后,其ALT、AST、BUN、Cr等肝、肾指标逐渐升高,FP3治疗时上述指标升高较慢,说明肝、肾功能受损较小。FP3起到了治疗和缓解脓毒症休克的作用。(见实施例6)
附图说明
附图1是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8结构示意图。它们由不同的FLT-1片段、KDR片段以及免疫球蛋白Fc片段用基因工程方法构建而成。
附图2是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8与VEGF的亲和力实验。
附图3是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8对大鼠存活数量的影响。
附图4是融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8对大鼠血浆VEGF含量的影响。
具体实施方式
以下实施例对本发明所涉及的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的部分应用作了详细说明。
实施例1融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8与VEGF结合亲和力的实验
本发明用测定游离VEGF的量来确定各种融合蛋白结合VEGF的能力。在这一试验中,将一定量的VEGF(10PM)加入离心管中,然后将含有一定浓度梯度的融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8分别加到含有VEGF的离心管中,混合好后,在37℃的培养箱中保存一个小时。一个小时以后,各个离心管中游离的VEGF由R&D系统公司(R&D systems)提供的检测VEGF量的试剂盒——VEGF检测试剂盒(VEGF assay Kit)测定。以半效结合浓度(theHalfMaximal Inhibitory Concentration,IC50)作为亲和力大小的指标,IC50越小说明亲和力越强。
融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8都能有效地与VEGF亲和结合,其IC50值见附图2,各融合蛋白亲和力IC50值位于4.6pM-11.2pM,其中FP3的IC50值最低为4.6pM,因此FP3与VEGF的亲和力最高。
实施例2融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8对LPS脓毒症大鼠生存率和血浆VEGF的影响
本实验采用静脉注射脂多糖(LPS)法构建脓毒症大鼠模型(参考Schultz M J etal.(2002),Ann Med,34:573-581)。清洁级雄性大鼠270只,体重200g-240g,各给予静脉注射脂多糖(LPS)30mg/kg,随机分为9组,各30只。其中一组为对照组,其余依次为融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗组。对照组静脉注射等体积生理盐水,融合蛋白治疗组分别给予静脉注射相应融合蛋白各10mg/kg。于完成后0-96小时记录大鼠存活的数量。
将实验中死亡的大鼠立即心脏取血,或于96小时后处死再心脏取血,将血液样品保存于-20℃备用。VEGF检测采用双抗夹心ELISA法试剂盒,先用抗大鼠VEGF单抗包被酶标板,大鼠血浆样品中的VEGF会与单抗结合,加入生物素化的抗大鼠VEGF(二抗),将与结合在单抗上的大鼠VEGF结合而形成免疫复合物,它将与结合在单抗上的大鼠VEGF结合而形成免疫复合物。加入辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合,最后加入TMB显色。VEGF浓度与OD(450nm)成正比。结果以平均值±标准差表示,并作统计学分析。
大鼠存活数量的结果见附图3:与对照组相比,融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗组均提高了大鼠96小时后的存活数量,其中FP3组的存活数量最高。
大鼠血浆VEGF含量的检测结果见附图4,LPS脓毒症大鼠模型建立后,大鼠血浆VEGF含量迅速升高。与对照组(即图3和图4中的control组)相比,融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8治疗组大鼠血浆VEGF含量均显著降低,均为P<0.05,其中FP3组VEGF含量最低。
实施例3融合蛋白FP1和FP3对CLP脓毒症大鼠TNF-α水平影响
清洁级雄性大鼠,体重230g~260g,用于制备盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症大鼠模型(参考Chaudry IH et al.(1979),Surgery,85:205-211)。112只动物随机分组。1,正常组8只;2,假手术组8只;3,对照组32只:分别于术后2小时、8小时、24小时、48小时处死(各8只);4,FP1给药组32只:术后静脉给予FP16mg/kg,分别于2、8、24、48小时处死(各8只);5,FP3给药组32只:术后静脉给予FP36mg/kg,分别于2、8、24、48小时处死(各8只)。实验动物处死方式为麻醉后活杀,采集腹主动脉血,分离血清,分装后-80℃保存;另外取肝脏、肺脏,液氮保存。
TNF-α的检测:将肝、肺组织称重后匀浆,离心后取上清液。组织样本适当稀释用于检测,血清样本复融后直接检测,采用大鼠TNF-αELISA检测试剂盒,结果以平均值±标准差表示,并作统计学分析。
结果见表1:CLP造模4小时后,动物肝、肺组织、血浆中TNF-α水平迅速升高,之后缓慢降低。与对照组相比,FP1和FP3治疗可不同程度地抑制肝、肺组织和血浆中的TNF-α水平,24小时时FP1组和FP3组均与同时间点对照组有显著差异,P<0.05,并且FP3组略优于FP1组。因此,融合蛋白FP1和FP3有助于下调TNF-α的过量表达,从而减轻机体发生的严重炎症反应。
表1:FP3和FP4对CLP脓毒症大鼠TNF-α水平的影响(平均值±标准差)
实施例4融合蛋白FP3与抗生素联用对脓毒症大鼠保护作用
清洁级雄性大鼠构建盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症大鼠模型。将120只大鼠随机分为模型未治疗组(n=30)、抗生素治疗组(n=30)、融合蛋白FP3治疗组(n=30)和联合治疗组(n=30)。各治疗组给药方式:FP3治疗组经尾静脉注射FP310mg/kg;抗生素治疗组分别经肌肉注射氨苄青霉素100mg/kg、庆大霉素20mg/kg;联合治疗组分别肌肉注射氨苄青霉素100mg/kg、庆大霉素20mg/kg,以及尾静脉注射FP310mg/kg。模型未治疗组同法注射等量生理盐水作为对照。观察记录5天存活率,并作统计学分析。
结果见表2:与模型未治疗组相比,其余各组均使脓毒症大鼠存活率显著提升(P<0.05),联合治疗组存活率显著高于其他组(P<0.05),抗生素治疗组和FP3治疗组无显著差异。
表2:融合蛋白FP3与抗生素联用对脓毒症大鼠存活率的影响
实施例5融合蛋白FP3与抗生素联用对重症脓毒症小鼠细胞因子的影响
将健康昆明系小鼠,体重20g-22g,用于制备重症脓毒症小鼠模型(参考Jackson J etal.(1979),J Endotoxin,1996,3:201-218)。将重症脓毒症小鼠模型90只,随机分为生理盐水对照组(n=30),抗生素治疗组(n=30),融合蛋白FP3与抗生素联合治疗组(n=30)。抗生素尼泰欣和FP3给药方式均为腹腔注射,FP3为3mg/kg,尼泰欣为0.04g/kg,均为每日1次,连用3天。生理盐水对照组注射等量生理盐水。
检测指标:给药3天后处死小鼠取肺脏,若试验小鼠死亡则立即取肺脏,匀浆后离心分离上清,置-80℃冰箱保存。肿瘤坏死因子α(TNF-α)测定采用放射免疫分析法,单位用mg/kg表示,白细胞介素6(IL-6)测定采用抗原竞争放射免疫方法,单位为μg/kg,结果以平均值±标准差表示,并作统计学分析。
实验结果见表3,给药3天后,联合治疗组小鼠存活数量最高,并且炎性因子TNF-α和IL-6水平较其它两组均有明显降低(P值均小于0.05)。说明融合蛋白FP3与抗生素联合使用对重症脓毒症小鼠有较好的治疗作用,并且优于抗生素的单独使用。
表3:抗生素尼泰欣、融合蛋白FP3治疗重症脓毒症小鼠(平均值±标准差)
实施例6融合蛋白FP3对脓毒症休克犬肝、肾的保护作用
采用健康雄性犬,体重15kg-17kg,构建脓毒症休克犬模型(Fink MP et al.(1990),Shock.JSurg Res,49:186)。将脓毒症休克犬随机分为两组,实验中,对照组(n=20)接受10ml/(kg·h)林格氏液(RLS)。FP3治疗组(n=20)10min内给予首剂FP35mg/kg,然后持续泵入5mg/(kg·h),FP3溶于林格氏液,保证液体量相同。模型建立前及建立后的0小时、12小时、24小时分别取血10ml,分离出血清放置于-80℃冰箱储存,集中进行测定。肝、肾检测指标:血清谷丙转氨酶(AL T)、谷草转氨酶(AST)水平、血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平等,采用自动生化分析仪测定。
脓毒症休克犬的肝、肾指标检测结果分别见表4-1和表4-2,结果显示:脓毒症休克建模后,犬的ALT、AST、BUN、Cr水平逐渐升高,其中24小时后与建模前相比差异显著(P<0.05)。与对照组相比,FP3治疗组各种指标升高较慢,其中12小时-24小时时,与对照组差异显著(P<0.05)。说明FP3起到了治疗和缓解脓毒症休克的作用。
表4-1:脓毒症休克犬肝功能指标比较(平均值±标准差)
表4-2:脓毒症休克犬肾功能指标比较(平均值±标准差)
Claims (10)
1.融合蛋白在制备治疗脓毒症的药物中的应用,其中所述融合蛋白为FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的一种或几种,其中FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的结构如下所述:
FP1:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成;
FP2:由KDR的第1免疫球蛋白样区域、FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成;
FP3:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域和人免疫球蛋白Fc组成;
FP4:由编码FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3免疫球蛋白样区域、FLT-1的第4免疫球蛋白样区域和和人免疫球蛋白Fc组成;
FP7:由由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域、KDR的第3和第4免疫球蛋白样区域组成;
FP8:由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3免疫球蛋白样区域组成。
2.根据权利要求1所述的应用,有效剂量的VEGF受体融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8的一种或多种和适量药学上可以接受的载体制备成药物制剂,其中所述药用载体可以是pH缓冲系统,渗透压调节剂,防腐剂,稳定剂等辅助成分。
3.根据权利要求1所述的应用,其中特征在于脓毒症可以为重症脓毒症、脓毒症休克。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述的药物制剂为溶液制剂或干粉制剂。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述药物制剂的给药形式为静脉给药,皮下注射,腹腔内注射或肌肉注射。
6.根据权利要求1所述的用途,本发明融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8,用量可以0.1mg-3000mg/次,优选1mg-2000mg/次,可以每日、每2日、每3日、每4日、每5日、每6日、每周、每两周、每三周等给药一次,或者每日给药一次以上。
7.融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的一种或多种与其它治疗药物联合在制备治疗脓毒症的药物中的应用,其中所述的其它治疗药物为抗感染类药物或重组人活化蛋白C,所述抗感染类药物为抗生素类、抗真菌类、抗病毒类、抗支原体类、抗肿瘤类或免疫抑制剂;其中所述抗生素类为β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、酰胺醇类或大环内脂类,所述抗真菌类为多烯类、三唑类、嘧啶类或棘白菌素类。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于所述的氨基糖甙类药物为庆大霉素、尼泰欣;所述的β-内酰胺类为氨苄青霉素。
9.融合蛋白FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8中的一种或多种与其它方式联合用于制备治疗脓毒症的药物的应用,其中所述其它方式为机械通气、外科引流、补充体液或针对器官功能衰竭的适当支持护理。
10.根据权利要求1-9所述的应用,其特征在于所述FP1的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示;所述FP3的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
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