CN104740603B - 一种多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物中的应用；所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种；所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。本发明的多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，该肽段的衍生物Pep2‑A1，Pep2‑A2，Pep2‑A3可以治疗或预防类风湿性关节炎引发的各类病症。

Description

一种多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种多肽及其衍生物在制备治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物中的应用。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病。类风湿关节炎的病变特点为滑膜炎，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形。如果不经过正规治疗，约75％的患者在3年内出现残废。类风湿关节炎分布于世界各地，在不同人群中的患病率为0.18％～1.07％，其发病具有一定的种族差异，印地安人高于白种人，白种人高于亚洲黄种人。在我国的总患病人数逾500万。类风湿关节炎在各年龄中皆可发病，高峰年龄在30～50岁左右，一般女性发病多于男性。类风湿关节炎的发病原因尚不明确，一般认为与遗传、环境、感染等因素密切相关。

类风湿关节炎的主要病理改变为滑膜炎，表现为滑膜增生和炎性细胞浸润。类风湿关节炎的滑膜改变可分为炎症期、血管翳形成期和纤维化期。血管翳形成是类风湿关节炎滑膜的重要病理特征，在类风湿关节炎软骨和骨破坏过程中发挥重要作用。关节外表现的主要病理基础为血管炎。类风湿结节是其特征性表现，结节中心为类纤维素样坏死组织，周围有“栅状”排列的组织细胞，成纤维细胞及巨噬细胞等。

在类风湿关节炎疾病中，炎症由免疫系统细胞因子和响应这些因子的T细胞介导。目前的药物治疗主要采用：1)非甾体类抗炎药(NSAID)通过抑制环氧合酶(COX)活性，减少前列腺素合成而具有抗炎、止痛、退热及减轻关节肿胀；2)免疫抑制剂改善病情抗风湿药(DMARDs)，如甲氨蝶呤等；3)生物制剂如肿瘤坏死因子(TNF)–α拮抗剂、白细胞介素(IL)-l和IL-6拮抗剂、抗CD20单抗以及T细胞共刺激信号抑制剂，该类药物是目前积极有效控制炎症的主要药物，减少骨破坏，减少激素的用量和骨质疏松，是开发治疗类风湿关节炎疾病药物的热点领域。

自噬是生物进化过程中产生的一种细胞蛋白和细胞器的循环利用机制，参与多种疾病如神经退行性疾病、癌症及心脏疾病等的病理过程。自噬过程广泛存在于正常的生理过程中，作为细胞对不良环境的一种防御机制，参与内质网应激引起的异常蛋白和受损细胞器的降解、炎症和氧自由基的清除以维持正常细胞稳态；但是自噬过度往往会导致胞内重要组分被降解，细胞发生死亡，因此自噬也被认为是另一种形式的程序性细胞死亡。无论是自噬过度还是自噬不足都可能导致疾病发生。最近研究表明自噬在类风湿性关节炎关节损伤过程中发挥着重要作用，如在炎症过程中出现的一些前炎性细胞因子包括白介素-1、白介素-6，白介素-23以及TLR配体等促进自噬的发生。同时自噬也控制炎性细胞因子的释放，调控着与自身免疫性疾病有牵连的细胞。自噬可能是新的抗炎疗法作用靶标。

TRB3(Tribbles Homologue 3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一，最早在果蝇中被鉴定到，并发现该蛋白能抑制有丝分裂，调节发育过程中细胞的增殖、迁移及形态形成。在哺乳动物中，有三种Tribbles同源蛋白：TRB1，TRB2和TRB3，它们都是假激酶蛋白家族成员。这三种蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶样结构域(Kinase like domain,KD)，但却缺乏ATP的结合位点和催化残基，因此没有激酶活性。尽管如此，Tribbles蛋白却具有接头蛋白样的功能，参与多种蛋白复合体的组装。在哺乳动物Tribbles家族成员中，TRB3的研究最为深入，其相互作用蛋白包括转录因子、泛素连接酶、细胞膜上II型BMP受体以及MAPK、PI3K信号通路成员。通过与这些蛋白相互作用，TRB3参与了糖脂代谢、脂肪细胞分化、凋亡、应激和胶原表达等的调控。

近来研究证据表明，TRB3在关节炎的发生发展过程中都具有重要的调节作用，在正常的人软骨细胞可以检测到TRB3信使RNA。TRB3蛋白水平低，在正常软骨细胞中TRB3低表达而在关节炎的软骨中高表达。过表达TRB3可以抑制Akt磷酸化，减少软骨细胞的生存和蛋白多糖的合成。Tang等人发现终末糖基化产物(AGEs)激活TRB3/MAPK信号通路介导的I型和III型胶原表达。Cravero等人发现TRB3可以抑制Akt活性，TRB3高表达将促进细胞死亡以及减少软骨细胞对胰岛素样生长因子1(IGF-1)的反应。因此，研究和开发TRB3蛋白的抑制剂，或者阻断其与P62蛋白结合的物质，将为类风湿性关节炎的临床治疗提供有效且崭新的手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前缺乏能有效利用的TRB3蛋白抑制剂的现状，而提供一种能特异性结合TRB3的多肽及其在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

本发明的发明人在研究的过程中发现，肿瘤细胞内TRB3的过度表达能降低自噬关键性抑制因子mTOR蛋白水平，并抑制多个自噬相关蛋白，例如II型LC3、Becline-1、PI3K3C表达增多，进而造成自噬相关货车蛋白P62产生堆积，证明肿瘤细胞内TRB3表达能诱导自噬受到抑制。P62是反映自噬动态过程的重要指标，作为“货车蛋白”，P62蛋白结构域中的泛素相关结构域(Ubiquitin associated domain,UBA)能与泛素化蛋白(Ubiquitin,Ub)结合，并把它们募集到自噬体膜上与LC3结合，这个过程主要通过P62蛋白的LIR(LC3-Interacting Region,LIR)结构域与LC3结合，介导泛素化蛋白的降解，P62的表达水平也随之降低。自噬受到抑制时，P62与其结合的泛素化蛋白不能及时降解，在胞浆内堆积而表达升高。发明人还进一步发现肿瘤细胞内的TRB3主要与P62蛋白发生相互作用，进而阻断其他泛素化蛋白与P62蛋白的结合，造成自噬通路被抑制，诱导肿瘤细胞的发生和转移。基于发明人的研究工作，本发明提供下述技术方案。

本发明提供的技术方案是：一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物中的应用；

所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种；

所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。

本发明中，所述的如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中，可适当引入氨基酸替换，缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍然能够形成能与TRB3特异性结合的多肽且该多肽仍然保持改变前的活性即可。

本发明中，所述的细胞穿膜肽为本领域常规所述的细胞穿膜肽，只要其能辅助将所述多肽送入细胞以发挥作用即可，一般而言，所述的细胞穿膜肽为由10～30个氨基酸组成的短肽分子。所述的细胞穿膜肽较佳地为Pep2多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；即在本发明中，所述的多肽衍生物较佳地为以Pep2多肽连接如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种多肽后所形成的嵌合多肽。所述的细胞穿膜肽还可以为HIV-1病毒反转录激活因子(Trans-activator transcription，Tat)蛋白的TAT肽(YGRKKRRQRRR，其氨基酸序列如SEQ ID：5所示)、果蝇触角同源异型蛋白的转录因子Antp肽(RQIKIWFQNRRMKWKK，其氨基酸序列如SEQ ID：6所示)、Pep-1肽(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID：7所示)、MPG肽(GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID：8所示)和RGD肽(Arg-Gly-Asp，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)中的任一种或多种。所述细胞穿膜肽较佳地连接在所述多肽的N端或者C端，更佳的是N端。

本发明所述的多肽及其衍生物可以作为活性成分用于制备预防或治疗类风湿性关节炎的药物。所述的“活性成分”是指具有预防和/或治疗类风湿性关节炎功能的化合物，即所述多肽或所述多肽的衍生物用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物。在该药物中，所述多肽或所述多肽的衍生物可以单独作为活性成分，也可以和其他化合物一起作为活性成分。

本发明中，所述的药物可以包含生理学或药学上可接受的载体，所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料，较佳地选自壳聚糖及其衍生物、卡波姆和脂质体中的一种或多种。因此，在本发明中，所述的多肽或所述多肽的衍生物较佳地与所述药物辅料组成药物组合物。所述的药物组合物可以为本领域常规所述的各种剂型，较佳地是固体、半固体或液体的形式，可以是水溶液、非水溶液或混悬液，更佳地是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。所述药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药，所述注射给药较佳地包括：静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射途径给药。

本发明所述的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，使用剂量较佳地为0.1～15mg/kg，更佳地为5～10mg/kg，最优选为5mg/kg，给药次数较佳地为一天一次或数次。

本发明中，所述的类风湿性关节炎能够引发多种病症，本发明所述的多肽或所述多肽的衍生物能够针对性地治疗该些病症，所述病症可以为类风湿性关节炎引起的滑膜炎，滑膜炎主要表现为滑膜增生和炎性细胞浸润，或者可以为类风湿性关节炎引起的足趾肿胀，或者可以为类风湿性关节炎引起的血管炎，或者可以为类风湿性关节炎引起的纤维组织增生。

在预防或治疗类风湿性关节炎时，本发明所述的药物组合物可以单独使用或者和其他药物联合使用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

目前临床上治疗类风湿性关节炎一般采用非甾类抗炎药(NSAIDs)、抗风湿药(DMARDs)或者生物制剂。非甾类抗炎药主要通过抑制环氧合酶(COX)活性，减少前列腺素合成而具有抗炎、止痛、退热及减轻关节肿胀的作用，但其存在一定的不良反应，包括胃肠道症状、肝和肾功能损害以及可能增加的心血管不良反应。而改善病情的抗风湿药(DMARDs)较非甾类抗炎药发挥作用慢，大约需要1～6个月，且副作用较大，常对肝、肾及造血系统造成损害。另外，目前治疗类风湿性关节炎的生物制剂主要包括肿瘤坏死因子(TNF)-α拮抗剂、白细胞介素(IL)-l和IL-6拮抗剂、抗CD20单抗以及T细胞共刺激信号抑制剂等，虽然这类生物制剂靶向性强，但其强大的免疫抑制作用，仍会带来一些不良反应。

而本发明所述的多肽或多肽衍生物能够特意性地与细胞内的TRB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白的相互作用，温和地激活自噬，有效改善在类风湿性关节炎发病过程中免疫细胞由于自身自噬阻断而造成的炎症反应。同时，该肽段的衍生物Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3可以改善人工诱导的动物关节炎症，不再出现类风湿性关节炎症状。

附图说明

图1为免疫共沉淀方法验证P62蛋白与TRB3蛋白之间存在相互作用。

图2为实施例3中，正常组、模型组、MTX组、高剂量多肽组治疗CIA大鼠5周后足趾肿胀及踝关节病理切片照片。其中，A和F为正常组，HE×100；B和G为模型组，HE×100；C和H为MTX治疗组，HE×100；D和I为高剂量多肽治疗组，HE×100。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，部分物质的全称或相应的中文名称如下：

MTX：甲氨喋呤；

CIA：胶原诱导性关节炎；

KHB：Krebs-Henseleit缓冲液；

Laminin：层粘连蛋白；

HEPES：羟乙基哌嗪乙硫磺酸；

BSA：牛血清白蛋白；

EDTA：乙二胺四乙酸；

NP40：乙基苯基聚乙二醇；

TBST：含吐温-20的Tris缓冲液；

PBS：pH7.4的磷酸缓冲液

Leu(Leupeptin，亮肽素)、Pep(Pepstatin，胃酶抑素)、Apr(Aprotinin，胰蛋白酶抑制剂)、DTT(Dithiothreitol，二硫苏糖醇)：均为蛋白酶抑制剂。

下述实施例中，序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的多肽分别称为A1、A2和A3，其连接Pep2细胞穿膜肽(Pep2的氨基酸序列为HLYVSPW，如序列表中SEQ IDNO:4所示)后形成的嵌合多肽分别称为Pep2-A1、Pep2-A2和Pep2-A3，上述多肽或嵌合肽均由北京赛百盛基因技术有限公司人工合成。A1、A2和A3通过两个甘氨酸链连接到Pep2的C端。以上嵌合肽的序列结构如下：

Pep2-A1序列为：

“N”-His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ser-Leu-Ser-Gln-Met-Leu-Ser-Met-“C”(其序列如序列表中SEQ ID NO:10所示)。

Pep2-A2的序列为：

“N”-His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys-“C”(其序列如序列表中SEQ ID NO:11所示)。

Pep2-A3的序列为：

“N”-His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp-Gly-Gly-Ile-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-Ile-“C”(其序列如序列表中SEQ ID NO:12所示)。

下述实施例中所述室温如本领域常规所述，一般指15～25℃。

实施例1类风湿性关节炎体外模型制备

1.1模型构建

1)收集类风湿性关节炎患者膝盖或手腕滑膜切除术或关节置换术中获得滑膜或骨样本。

2)无菌条件下，样本被切成2立方毫米小块并分成数份置于2块24孔板中。

3)样本利用MEM(Gibco,Grand Island,NY,USA)完全培养基(含有2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、50mg/ml庆大霉素、20mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙基磺酸缓冲溶液和1％胎牛血清)每孔2mL，37℃，5％CO₂，95％湿度培养过夜。

4)剪碎的组织块在培养基中培养，待组织块内的炎性细胞及其他细胞进入培养基中，作为次日药物治疗实验的工具细胞。

1.2治疗活性检测

1)按照1.1制备类风湿性关节炎体外模型，分成多肽处理组及未处理对照组，每组6个复孔。

2)多肽处理组中使用Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3处理滑膜或骨骼培养物，将Pep2-A1，Pep2-A2和Pep2-A3多肽干粉用生理盐水溶解，直接加入到培养孔中，经细胞培养基稀释至终浓度为50M，未处理组加等体积生理盐水，培养24h。

3)24h后收集各孔细胞培养上清，使用商业化细胞因子检测试剂盒(请给出型号)(包括人IL6定量ELISA检测试剂盒D6050、人IL-1beta定量ELISA检测试剂盒DLB50和人TNF-alpha定量ELISA检测试剂盒DTA00C，均购自R&D System公司)，按照试剂盒说明书进行操作，双夹心酶联免疫吸附法检测培养液中IL-1β、IL-6、TNF-α等含量。

1.3统计学处理

数据用X±SD表示，t检验统计分析各组差异显著性，由SPSS13.0统计软件分析。

1.4结果

Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3与未处理组相比较，Pep2-A1，Pep2-A2，Pep2-A3可以改善风湿性关节炎相关因子，见表1。

与未处理组相比较，三种多肽治疗组的类风湿性关节炎相关细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β均有明显下降，其中pep2-A2组在三组多肽组中效果最优。

表1.比较三种多肽对风湿性关节炎相关细胞因子的影响(n＝6，X±SD)

组别	剂量	TNF-α	IL-6	IL-1β
						(μM)	(pg/L)	(pg/L)	(ng/L)
未处理组	——	213.13±10.21	142.21±12.24	162.17±25.29
					Pep2-A1组	50	89.12±6.13*	78.43±5.51*	64.81±8.32*
Pep2-A2组	50	35.26±5.23*	46.11±5.26*	35.25±9.73*
					Pep2-A3组	50	54.12±8.24*	81.52±8.31*	78.31±13.20*

注：与模型组比较，*：P＜0.01

实施例2免疫共沉淀的方法验证蛋白p62与蛋白TRB3在软骨细胞内存在相互作用。

2.1试剂

1)裂解液A液：裂解液A液：0.6057g Tris碱，1.7532g NaCl，0.1017g MgCl₂·6H₂O，0.0742g EDTA，10mL甘油，10mL 10％NP-40，加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7.6，定容至191mL，充分混匀，0.45μm滤膜过滤，4℃储存。

2)裂解液B液：200μL 2Mβ-磷酸甘油，4mL 2.5M NaF，2mL 100mM NaVO3，2mL 100mMPMSF(苯甲基磺酰氟)，200μL 1M DTT(二硫苏糖醇)，1mg/mL的Leupeptin(亮肽素)、Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)、Aprotinin(抑肽酶)各200μL，总体积共9mL。母液于-20℃储存。使用前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀，A液与B液混匀后得到免疫共沉淀裂解液。

3)Protein A/G Plus-Agarose购自美国Santa cruz公司。

2.2步骤

(1)收集培养24小时后的原代大鼠软骨细胞。

(2)以前述A、B液混匀后得到的免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白，将蛋白调整至1μg/μL，取200μg蛋白留作“输入细胞裂解液”，以作为对照。

(3)剩余蛋白(除“输入细胞裂解液”之外的总蛋白，大约100μg)加入2μg P62抗体(购自Sigma公司)或者与P62抗体种属相同的正常IgG抗体(购自Santa cruz公司)，同时加入10μL Protein A/G Plus-Agarose充分重悬，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃、3000rpm离心5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0.5mL免疫共沉淀裂解液，混匀，冰浴静置1min，4℃、3000rpm离心30sec，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入20-30μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性3min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2.3结果

如图1所示，在软骨细胞内TRB3蛋白与P62蛋白存在明显的结合。其中输入代表初始细胞裂解液，输出代表经过P62抗体及对照抗体IgG沉淀过的裂解液。

实施例3

3.1材料

1.动物

SPF级SD大鼠，雌性，体质量180-200g。购自北京维通利华实验动物有限公司，实验室控制温度23～25℃，湿度60～70％，定时排气、换气。

2.药物及试剂

甲氨喋呤片，上海医药(集团)有限公司华谊制药厂生产，1mg/片。批号：120815。免疫级牛II型胶原为美国Chondrex公司产品(Catalog No.20022)，2mg/ml，溶于0.05M乙酸溶液。弗氏不完全佐剂(Freund′s incompleteadjuvant)为美国Sigma公司产品(10mL/支)。大鼠IgG、IL1-β、TNF-α酶链免疫检测试剂盒，美国R&D公司(Research&Diagnostics System)产品。

3.2方法

1.模型构造

取2mg/ml溶于0.05M乙酸的II型胶原与弗氏完全佐剂，按体积比1:1混合。用注射器反复抽吸，直至混和物充分乳化(以乳化物滴入水中不松散为度)，即得II型胶原蛋白乳化剂。造模大鼠剪掉尾根部皮毛，2％戊巴比妥钠腹腔注射轻度麻醉后，尾根部常规消毒。取乳化的II型胶原，每鼠尾根部皮内注射3-4个点，0.3mL/只。可见到形成圆形皮丘。对造模大鼠进行每天一次轻轻按摩四肢。第14天按同法再次尾根部皮内注射II型胶原蛋白乳化剂一次。每周测足趾肿胀容积，并观察记录四肢关节的红肿范围和程度。根据以下标准对关节的肿胀范围与程度做出关节炎指数(AI)评分。0分：无红肿；1分：小趾关节红斑或轻度肿胀；2分：趾关节和趾跖关节中度肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。四肢分别评分，累计每只大鼠四肢关节的AI最高得分为16分。AI＞4即为造模成功。

2.动物分组与给药

SD大鼠48只，适应性养殖3天后，随机分为5组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组(甲氨喋呤)、Pep2-A2多肽高剂量组、Pep2-A2多肽低剂量组。除正常对照组外，其余各组均造模。造模成功后分别灌胃或尾静脉给药，使用前用生理盐水稀释至500mg/mL，连续5周。每周称体重。正常对照与模型对照组分别给等体积的生理盐水，多肽高、低剂量分别为50mg/kg、5mg/kg，每天一次，甲氨蝶呤组灌胃给药为1mg/kg，每周一次。

将Pep2-A1及Pep2-A3进行了与Pep2-A2同样的实验，其药效学结果与Pep2-A1、Pep2-A3同样具有一定治疗作用，其中pep2-A2组在三组多肽组中效果最优。

3.观察指标与检测方法

1)动物一般情况及体重测量观察记录给药前后大鼠的行为活动与一般状况。每周称体重一次。

2)关节炎指数评定给药前测一次，给药后每周测一次，依据上述关节炎指数评分标准，对各鼠的关节炎病变程度进行评定。

3)足趾容积的测定给药前测一次，给药后每周测一次，依据排水法原理用自制足趾容积测定装置测量大鼠右后足趾容积，并按照下例公式计算给药后足趾容积变化率：给药后足趾容积变化率(％)＝(给药前容积-给药后容积)/给药前容积×100％

4)足趾厚度的测定给药前测一次，给药后每周测一次，用游标卡尺测定大鼠右后足足趾厚度，并按照下例公式计算给药后足趾厚度变化率：给药后足趾厚度变化率(％)＝(给药前厚度-给药后厚度)/给药前厚度×100％。

5)血清免疫球蛋白G及炎性细胞因子水平测定实验结束时，从腹主动脉采血。所采集的血液经3000prn/min、离心15min后，取上清液低温保存。采用双抗体夹心酶联免疫(ELISA)法，按照试剂盒(包括大鼠血清免疫球蛋白G定量ELISA检测试剂盒，北京驰明瑞生物科技公司，货号：CSB-E07981；大鼠IL-1beta定量ELISA检测试剂盒，R&D公司，货号：RLB00；大鼠TNF-alpha定量ELISA检测试剂盒，R&D公司，货号：RAT00)的操作要求与步骤测定血清中免疫球蛋白G(IgG)、白介素-1(IL1-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)含量。检测波长均为450nm。

6)关节组织病理学检查实验结束时，从足踝上0.5cm处剪取大鼠后足关节，用10％的甲醛溶液固定。经脱钙、脱水后石蜡包埋。切片、HE染色。在光学显微镜下观察滑膜、软骨细胞病变程度。比较各组的病变程度。

4.统计学处理

数据用X±SD表示，由SPSS13.0统计软件分析，组间比较用方差分析多重比较、t检验统计分析各组差异显著性，即在软件中选择最小显著性差异法(LSD)检验组间差异显著性。

3.3结果

1.一般情况及体重变化

给大鼠免疫注射II型胶原造模后，可见关节红肿逐渐出现，先是后肢，继而前肢多个关节的红、肿。表现有一定程度的行动不便。与正常动物比较活动减少，毛色较差。对造模动物进行体重监测的结果显示，高、低剂量治疗组及阳性对照甲氨喋呤(MTX)组与模型组比较，大鼠体重无显著性差异，将Pep2-A1及Pep2-A3进行了与Pep2-A2同样的实验，各组对胶原诱导型关节炎大鼠体重的影响结果为Pep2-A1及Pep2-A3对大鼠体重显著性差异。见表2。

表2各组对胶原诱导型关节炎大鼠体重的影响(X±SD)

2.关节炎指数观察结果

造模第21日多发性关节炎的出现表明大鼠CIA模型建立成功，之后开始分组给药。与模型组比较，甲氨喋呤组3周后可明显降低关节炎指数(P<0.01)，且随着给药次数的增加作用增强；高剂量组在给药3周后关节炎指数降低(P<0.01)；低剂量组在给药4周后关节炎指数降低(P<0.01)，随着给药时间的延长，其作用有加强的趋势。降低关节炎指数的作用与剂量具有相关性，剂量增加作用增强。将Pep2-A1及Pep2-A3进行了与Pep2-A2同样的实验，其均能缓解由胶原诱导的大鼠足趾肿胀，其中pep2-A2组在三组多肽组中效果最优。具体结果参见表3。

表3.各组对胶原诱导型关节炎大鼠足趾肿胀指数(AI)的影响(X±SD)

注：与模型组比较，*：P＜0.05，**：P＜0.01(表4-6同)

3.足趾容积测定结果

采用药物治疗的各组，足趾容积均有不同程度下降趋势。与模型组比较，甲氨喋呤在给药2周后足趾容积的降低有显著性差异(P<0.05)；高剂量组在给药2周后对足趾的肿胀明显减轻(P<0.05)，随着给药次数的增加，表现为持续、稳定减轻足趾肿胀程度的作用，给药4周后作用进一步增强，差异更加明显(P<0.01)；低剂量组在给药3周后可见对足趾的肿胀减轻(P<0.05)。将Pep2-A1及Pep2-A3进行了与Pep2-A2同样的实验，其均能缓解由胶原诱导的大鼠足趾肿胀，其中pep2-A2组在三组多肽组中效果最优。具体结果参见表4。

表4.各组对胶原诱导型关节炎大鼠足趾肿胀容积的影响(X±SD)

4.足趾厚度测定结果

造模后的大鼠足趾厚度较未造模的正常动物增加。分组给药后，足趾厚度有不同程度的下降趋势，具体结果见表5。如表5所示，正常组中，给药前后足趾厚度无明显差异。模型组较正常组大鼠足趾明显增厚。给予阳性对照药甲氨喋呤(MTX)，可见随着给药时间延长，大鼠足趾厚度逐渐降低。给予高剂量多肽组及低剂量多肽组，可以发现随着治疗时间的延长均可以降低大鼠足趾的肿胀程度，其中在第二周高剂量组与模型组比较出现了治疗差异(P<0.05)，第三周出现显著差异(P<0.01)。低剂量组的治疗效果在第三周出现(P<0.01)。实验表明，多肽可以有效降低模型造成的大鼠足趾厚度。将Pep2-A1及Pep2-A3进行了与Pep2-A2同样的实验，其均能缓解由胶原诱导的大鼠足趾肿胀，其中pep2-A2组在三组多肽组中效果最优。

表5.各组对胶原诱导型关节炎大鼠足趾厚度的影响(X±SD)

5.血清IgG、血清细胞因子测定结果

正常大鼠血清中IgG含量很低，模型组动物血清中IgG含量与正常对照组比较明显升高。与模型组比较，甲氨喋呤降低造模动物血清IgG水平的作用显著(P<0.01)，多肽组也有降低血清IgG水平的作用，其作用随剂量加大而增强。

与正常对照组比较，CIA造模的大鼠血清中细胞因子IL-1、TNF-含量明显升高，与模型组比较，高、低剂量组的血清IL-1含量较模型组均显著下降(P<0.01)，高剂量组的TNF-含量下降(P<0.05)。将Pep2-A1及Pep2-A3进行了与Pep2-A2同样的实验，其均能降低由胶原诱导的大鼠血清IgG与细胞因子，其中pep2-A2组在三组多肽组中效果最优。具体数据见表6。

表6.给药对胶原诱导型关节炎大鼠血清IgG与细胞因子的影响(n＝8，X±SD)

3.6关节组织病理学检查结果

取大鼠踝关节组织切片，HE染色后光镜下观察，结果如图2所示。可见，正常大鼠滑膜由1-2层滑膜细胞组成且部分不连续，滑膜衬里下层为均匀分布的脂肪细胞和血管，未见炎症细胞浸润、无纤维组织增生；关节软骨表面光滑。CIA造模的全部大鼠均可见不同程度的滑膜病变形成，其中以模型组病变程度最为明显，表现为滑膜上皮层增厚，滑膜内结缔组织血管充血，毛细血管明显增多，可见较多的慢性炎细胞浸润，个别关节软骨表面可见边缘不整。与模型组比较，各药物治疗组的上述病变均较模型组不同程度减轻。阳性对照药甲氨喋呤对减轻病变有明显的作用，多肽组对减轻滑膜增生和炎细胞浸润表现出了较好的作用。将Pep2-A1及Pep2-A3进行了与Pep2-A2同样的实验，其均能缓解由胶原诱导的大鼠足趾关节炎性细胞浸润，其中pep2-A2组在三组多肽组中效果最优。

Claims (10)

1.一种可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用；

所述的多肽的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种；

所述多肽的衍生物为所述多肽与细胞穿膜肽接连所形成的嵌合肽。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:9中的任一种所示。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种的多肽的N端与细胞穿膜肽连接。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嵌合肽为如序列表中SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示序列中的任一种的多肽的C端与细胞穿膜肽连接。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物作为单一活性成分在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可特异性结合TRB3的多肽或所述多肽的衍生物与其他治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物联合作为活性成分在制备治疗类风湿性关节炎的药物中的应用。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类风湿性关节炎为类风湿性关节炎引起的滑膜炎。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类风湿性关节炎为类风湿性关节炎引起的炎症细胞浸润。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类风湿性关节炎为类风湿性关节炎引起的足趾肿胀。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的类风湿性关节炎为类风湿性关节炎引起的纤维组织增生。