CN103285373A - 肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂制备及其应用。本发明涉及药物领域,具体涉及具有抑制肿瘤坏死因子-α,能预防和治疗类风湿性关节炎的多肽。其序列为Gly-Gly-Asp-Thr-Met-Leu是全新的序列,本发明的有益效益是可用于治疗类风湿性关节炎,具有潜在的新药开发价值。
Description
技术领域:
本发明涉及药物领域,具体涉及用于预防和治疗或预防类风湿性关节炎的肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂。
背景技术:
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一。在全世界约为0.5%-1.0%,RA的发病在我国约为0.4%。RA可发生于任何年龄,随着年龄的增长,发病率也随之增高。女性高发年龄为45-55岁,性别与RA发病关系密切,男女之比约1:3。RA是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病,以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现,属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕部疼痛及肿胀(特别是腕背部的肿胀)为首发症状,症状持续不缓解,普通的对症治疗虽可以缓解症状,但常常由于用药不规则或不足量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显的晨僵,通常可达1小时以上,并不断加重;同时出现一定的关节功能障碍。
类风湿关节炎的病因和发病机制尚未完全明了,其基本病理特点是血管炎和滑膜炎。关节内滑膜血管增生,形成血管翳,导致滑膜增厚,渗出增多,分泌多种细胞因子,侵犯软骨并引起骨质损害。对其周围的肌腔、韧带、腱鞘以及肌肉等组织也均可侵蚀,从而影响关节的稳定,容易发生关节畸形而出现功能障碍。血管炎亦可侵犯周身各脏器组织,形成系统性疾病。
目前治疗RA的药物分为两大类:控制症状药和控制疾病药。由于RA病因不明,故当今并无堪称控制疾病的药。控制症状的抗风湿药分为四类:一、非甾体类抗炎药,通常称为一线药,这类药物种类繁多,国内市场已多达数十种。二、类固醇激素,激素是一个非常好的止痛抗炎药,但长期单独使用不能改善病情,反而带来许多副作用,激素作为二线慢作用药起效前的过渡性用是可以的,但用量要小,时间不宜过长。在病情较重,伴有关节外表现的患者,短期治疗冲击,并联合二线药治疗时必须的。三、慢作用抗风湿药,通常称为二线药,所谓慢作用药包括抗疟药、金盐、青霉胺和柳氮碘胺吡啶,它们治疗RA起效慢,长期作用对RA病情有一定缓解作用,故也称病情改善药。四、免疫抑制剂:常用有甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青风藤等。
在治疗RA的生物制剂中,临床上研究最多的就是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的拮抗剂。TNF-α是活动期RA滑膜及血液中重要的细胞因子之一,主要由滑膜巨噬细胞产生。它能刺激滑膜成纤维细胞增生,分泌IL-6,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、趋化因子以及基质金属蛋白酶和前列腺素等效应分子,在RA的发病中起着极其重要的作用。TNF-α拮抗剂的作用是特异性地拮抗TNF-α,抑制RA的病情进展。目前已批准上市的TNF-α拮抗剂主要有依那西普(etanercept)、英夫利西单抗(irdliximab)和阿达木单抗(adalimumab)。由于这些药物为单抗,存在着分子量较大,及产生抗原反应等缺点,大大限制了其在临床的使用。
发明内容:
本发明目的是针对现有TNF-α拮抗剂的特点,设计一种分子量小的TNF-α多肽拮抗剂,可以避免产生抗原反应,更加适用于临床的应用。
本发明技术方案是提供一种肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2,其序列为Gly-Gly-Asp-Thr-Met-Leu,及在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。
本发明的原理在于肿瘤坏死因子-α是以三聚体的形式与肿瘤坏死因子受体结合,产生生理或病理的效应,肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2并不直接作用于肿瘤坏死因子受体,而是抑制肿瘤坏死因子-α的三聚体的形成,间接的抑制肿瘤坏死因子受体的作用,从而起到预防和治疗类风湿关节炎的作用。
有益结果:
本发明中的肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2序列Gly-Gly-Asp-Thr-Met-Leu,可以靶向抑制肿瘤坏死因子-α, 抑制肿瘤坏死因子受体产生的生理或病理的效应,达到预防或治疗类风湿性关节炎的效果。
发明人经过大量实验获知肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2能够抑制佐剂型大鼠类风湿关节炎和DBA/1小鼠胶原型类风湿性关节炎的发展,体内实验证明具有显著的治疗类风湿型关节炎的效果,并且副作用少,用量少成本降低。说明本发明设计的肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2科学、合理、可行有效,能作为治疗或预防类风湿性关节炎药物。
附图说明:
附图1多肽抑制剂分子构像示意图。1.Gly 甘氨酸,2.Gly甘氨酸,3.Asp天冬氨酸, 4.Thr苏氨酸,5. Met甲硫氨酸, 6.Leu亮氨酸。
具体实施方式:
实施例1
多肽的化学合成方法
多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行,Rink介质(可在Advanced ChemTech公司购得)上有自由氨基,顺序连接Leu,Met,Thr,Asp,Gly和Gly。每一步连接过程中,氨基酸残基都要活化,活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU,HOBt,DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后,都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(4:1:0.5)的混合物来封闭未连接的自由氨基,封闭反应10 min。每次氨基酸的连接反应之后,下一个氨基酸连接之前,都要把介质上的Fmoc-基团去掉,去Fmoc-基团使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺,需15分钟。最后,当所有氨基酸残基顺序连接之后,多肽用98%三氟乙酸从介质上切割下来,切割在室温下进行2小时。
应用上述化学条件可合成并获得多肽,序列为Gly-Gly-Asp-Thr-Met-Leu,该序列为全新序列。也可委托上海生工合成。
实施例2
肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用
构建胶原型小鼠关节炎动物模型,研究肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)的治疗作用。采用小鼠作为受试动物,SPF级DBA/1小鼠90只(由上海西普尔-必凯实验动物有限公司(Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供,动物生产许可证号码:SCXK(沪)2008-0016),雄性,7-8周龄,体重为18-22 g,随机分成6组,分别是正常对照组,模型对照组,多肽抑制剂2低中高3个剂量组(0.4,0.8,1.6 mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤2 mg/kg)。除正常组外,第0天各实验组建立小鼠CIA模型,方法是鸡软骨Ⅱ型胶原(cⅡ)用0.1 mol/l醋酸溶解成4 mg/ml的溶液,于4℃冰箱过夜。实验当天用Ⅱ型胶原与含4 mg/ml Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv的完全弗氏佐剂(CFA)等体积充分乳化,待DBA/1小鼠麻醉后,于其尾部皮内每只注射乳化剂50 μl进行致敏,21 d后用4 mg/ml的Ⅱ型胶原(cⅡ)与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积充分乳化后以相同剂量的乳化剂于尾部进行再次免疫。造模第30 d起皮下注射给药:多肽2的3个剂量组(0.4,0.8,1.6 mg/kg ):每日两次,连续10天;阳性药对照组(甲氨蝶呤2 mg/kg ):每五天一次,连续3次;正常对照组和模型对照组(生理盐水):连续10天。分别于造模后第21天至第70天每3天称量体重、关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对小鼠胶原型关节炎的影响。
结果:造模后小鼠与正常小鼠相比较,免疫后第27天,CIA小鼠足爪红肿,关节炎指数评分增高,模型组第45-60天为肿胀高峰,模型组自第35天开始体重几乎不增加,后期还略微有下降。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用具体结果如下:
肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对小鼠胶原型关节炎左足足爪肿胀度的影响,阳性对照组、肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2高、中、低剂量组左后足踝直径与模型组比较,均有极显著性差异(P<0.01)实验结果具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对小鼠胶原型关节炎右足足爪肿胀度的影响,阳性对照组、肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2高、中、低剂量组右后足踝直径与模型组比较,均有极显著性差异(P<0.01),实验结果具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对胶原型关节炎小鼠临床评分的影响,多肽2低、中、高剂量组四肢评分显著低于模型对照组(P<0.01),与模型对照组比较极显著性差异,实验结果具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对胶原型关节炎小鼠体重影响,多肽2高、中、低剂量组体重显著高于模型对照组(P<0.01),与模型对照组比较极显著性差异,实验结果具有统计学意义。
结论:肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对小鼠胶原型关节炎具有治疗作用。
实施例3
肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对佐剂型大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用
构建佐剂型大鼠关节炎动物模型,研究肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis, AA)大鼠的治疗作用。采用大鼠作为受试动物,SPF级SD大鼠90只(由上海西普尔-必凯实验动物有限公司(Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供,动物生产许可证号码:SCXK(沪)2008-0016),雄性,体重为140 g—160 g,随机分成6组,分别是正常对照组,模型对照组,肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2低中高3个剂量组(0.2,0.4,0.8 mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤1 mg/kg)。除正常组外,第0天各实验组建立大鼠AA模型,方法是在大鼠的左侧后足足跎注射含灭活的结核分枝杆菌(H37RA,10 mg/ml)完全弗氏佐剂0.08 ml造成大鼠佐剂性关节炎模型。造模第10天起皮下注射给药:多肽2的3个剂量组(0.2, 0.4, 0.8 mg/kg ):每日两次,连续10天;阳性药对照组(甲氨蝶呤1 mg/kg ):每五天一次,连续3次;正常对照组和模型对照组(生理盐水):连续10天。分别于造模后第8,11,14,17,20,23和26天,称量体重、关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对大鼠佐剂型关节炎的影响。
结果:造模后大鼠与正常大鼠相比较,AA大鼠左后足会迅速产生原发性关节炎,出现明显的肿胀,并伴有溃烂;右后足大约10 d后开始出现继发性关节炎,评分的分值逐渐增大;同时耳部血管增生明显,红肿明显;尾部关节出现肿胀。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2在佐剂性大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用,具体结果如下:
肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对大鼠原发性关节炎足爪肿胀度的影响,大鼠阳性对照组、肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2的低、中、高剂量组左后足踝直径与模型组比较,有极显著性差异(P<0.01);肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2低、中、高剂量组左后足踝直径与模型组比较,均有显著性差异(P<0.05),实验结果具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对大鼠继发性关节炎足爪肿胀度的影响,大鼠阳性对照组、肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2低、中、高剂量组右后足踝直径与模型组比较,有显著性差异(P<0.05)。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2Ⅰ对佐剂型关节炎大鼠临床评分的影响,多肽Ⅰ低、中、高剂量组四肢评分显著低于模型对照组(P<0.05),与模型对照组比较差异均有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对佐剂型关节炎大鼠体重影响,多肽2高、中、低剂量组体重显著高于模型对照组(P<0.05),与模型对照组比较差异均有统计学意义。
结论:肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2对AA大鼠关节炎具有治疗作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2制备及其应用
<130>
<160> 1
<170> Patent In version 3.3
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Gly Asp Thr Met Leu
1 5
Claims (2)
1.肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2,其特征在于其序列为Gly-Gly-Asp-Thr-Met-Leu。
2.肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂2,在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。
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