CN103254291B - 肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂及其应用。本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制基质金属蛋白酶-2和肿瘤坏死因子释放酶、具有减轻急性炎症反应对机体破坏的多肽。其序列为Pro-Thr-Thr-Asn-Arg是全新的序列，它们可以在1微摩尔水平上体外抑制基质金属蛋白酶-2和肿瘤坏死因子释放酶的活力，并在体内试验中增加内毒素休克小鼠的生存率，具有潜在的新药开发价值。

Description

肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂及其应用

技术领域：

本发明涉及药物领域，具体涉及用于预防和治疗或预防类风湿性关节炎的肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂。

背景技术：

    类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一。在全世界约为0.5%-1.0%，RA的发病在我国约为0.4%。RA可发生于任何年龄，随着年龄的增长，发病率也随之增高。女性高发年龄为45-55岁，性别与RA发病关系密切，男女之比约1:3。RA是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕部疼痛及肿胀(特别是腕背部的肿胀)为首发症状，症状持续不缓解，普通的对症治疗虽可以缓解症状，但常常由于用药不规则或不足量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显的晨僵，通常可达1小时以上，并不断加重；同时出现一定的关节功能障碍。

类风湿关节炎的病因和发病机制尚未完全明了，其基本病理特点是血管炎和滑膜炎。关节内滑膜血管增生，形成血管翳，导致滑膜增厚，渗出增多，分泌多种细胞因子，侵犯软骨并引起骨质损害。对其周围的肌腔、韧带、腱鞘以及肌肉等组织也均可侵蚀，从而影响关节的稳定，容易发生关节畸形而出现功能障碍。血管炎亦可侵犯周身各脏器组织，形成系统性疾病。

目前治疗RA的药物分为两大类：控制症状药和控制疾病药。由于RA病因不明，故当今并无堪称控制疾病的药。控制症状的抗风湿药分为四类：一、非甾体类抗炎药，通常称为一线药，这类药物种类繁多，国内市场已多达数十种。二、类固醇激素，激素是一个非常好的止痛抗炎药，但长期单独使用不能改善病情，反而带来许多副作用，激素作为二线慢作用药起效前的过渡性用是可以的，但用量要小，时间不宜过长。在病情较重，伴有关节外表现的患者，短期治疗冲击，并联合二线药治疗时必须的。三、慢作用抗风湿药，通常称为二线药，所谓慢作用药包括抗疟药、金盐、青霉胺和柳氮碘胺吡啶，它们治疗RA起效慢，长期作用对RA病情有一定缓解作用，故也称病情改善药。四、免疫抑制剂：常用有甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青风藤等。

在治疗RA的生物制剂中，临床上研究最多的就是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的拮抗剂。TNF-α是活动期RA滑膜及血液中重要的细胞因子之一，主要由滑膜巨噬细胞产生。它能刺激滑膜成纤维细胞增生，分泌IL-6，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、趋化因子以及基质金属蛋白酶和前列腺素等效应分子，在RA的发病中起着极其重要的作用。TNF-α拮抗剂的作用是特异性地拮抗TNF-α，抑制RA的病情进展。目前已批准上市的TNF-α拮抗剂主要有依那西普(etanercept)、英夫利西单抗(irdliximab)和阿达木单抗(adalimumab)。由于这些药物为单抗，存在着分子量较大，及产生抗原反应等缺点，大大限制了其在临床的使用。

发明内容：

本发明目的是针对现有TNF-α拮抗剂的特点，设计一种分子量小的TNF-α多肽拮抗剂，可以避免产生抗原反应，更加适用于临床的应用。

本发明技术方案是提供一种肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1,其序列为Pro-Thr-Met-Ser-Trp，及在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。

本发明的原理在于肿瘤坏死因子-α是以三聚体的形式与肿瘤坏死因子受体结合，产生生理或病理的效应，肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1并不直接作用于肿瘤坏死因子受体，而是抑制肿瘤坏死因子-α的三聚体的形成，间接的抑制肿瘤坏死因子受体的作用，从而起到预防和治疗类风湿关节炎的作用。 

有益结果：

本发明中的肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1序列Pro-Thr-Met-Ser-Trp，可以靶向抑制肿瘤坏死因子-α, 抑制肿瘤坏死因子受体产生的生理或病理的效应，达到预防或治疗类风湿性关节炎的效果。

发明人经过大量实验获知肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1能够抑制佐剂型大鼠类风湿关节炎和DBA/1小鼠胶原型类风湿性关节炎的发展，体内实验证明具有显著的治疗类风湿型关节炎的效果，并且副作用少，用量少成本降低。说明本发明设计的肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1科学、合理、可行有效，能作为治疗或预防类风湿性关节炎药物。

附图说明

附图1多肽抑制剂分子构像示意图。1.Pro脯氨酸，2.Thr苏氨酸，3.Met甲硫氨酸4.Ser丝氨酸5.Trp色氨酸。

具体实施方式

实施例1

多肽的化学合成方法

多肽用Fmoc化学方法合成。合成反应从C端向N端进行，Rink介质（可在Advanced ChemTech公司购得）上有自由氨基，顺序连接Trp，Ser，Met，Thr和Pro。每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸。每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑（4:1:0.5）的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10 min。每次氨基酸的连接反应之后，下一个氨基酸连接之前，都要把介质上的Fmoc-基团去掉，去Fmoc-基团使用含20%哌啶的二甲基甲酰胺，需15分钟。最后，当所有氨基酸残基顺序连接之后，多肽用98%三氟乙酸从介质上切割下来，切割在室温下进行2小时。

应用上述化学条件可合成并获得多肽，序列为Pro-Thr-Met-Ser-Trp，该序列为全新序列。

实施例2

肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建胶原型小鼠关节炎动物模型，研究肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对小鼠胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis, CIA）的治疗作用。采用小鼠作为受试动物，SPF级DBA/1小鼠90只（由上海西普尔-必凯实验动物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd）提供，动物生产许可证号码：SCXK(沪)2008-0016），雄性，7-8周龄，体重为18-22 g，随机分成6组，分别是正常对照组，模型对照组，多肽抑制剂1低中高3个剂量组（0.4，0.8，1.6 mg/kg）和阳性药对照组(甲氨蝶呤2 mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立小鼠CIA模型，方法是鸡软骨Ⅱ型胶原(cⅡ)用0.1 mol/l醋酸溶解成4 mg/ml的溶液，于4℃冰箱过夜。实验当天用Ⅱ型胶原与含4 mg/ml Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv的完全弗氏佐剂(CFA)等体积充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射乳化剂50 μl进行致敏，21 d后用4 mg/ml的Ⅱ型胶原(cⅡ)与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积充分乳化后以相同剂量的乳化剂于尾部进行再次免疫。造模第30 d起皮下注射给药：多肽1的3个剂量组（0.4，0.8，1.6 mg/kg ）：每日两次，连续10天；阳性药对照组(甲氨蝶呤2 mg/kg )：每五天一次，连续3次；正常对照组和模型对照组（生理盐水）：连续10天。分别于造模后第21天至第70天每3天称量体重、关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对小鼠胶原型关节炎的影响。

结果：造模后小鼠与正常小鼠相比较，免疫后第27天，CIA小鼠足爪红肿，关节炎指数评分增高，模型组第45-60天为肿胀高峰，模型组自第35天开始体重几乎不增加，后期还略微有下降。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用具体结果如下：

肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对小鼠胶原型关节炎左足足爪肿胀度的影响，阳性对照组、肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1高、中、低剂量组左后足踝直径与模型组比较，均有极显著性差异（P<0.01）实验结果具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对小鼠胶原型关节炎右足足爪肿胀度的影响，阳性对照组、肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1高、中、低剂量组右后足踝直径与模型组比较，均有极显著性差异（P<0.01），实验结果具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对胶原型关节炎小鼠临床评分的影响，多肽1低、中、高剂量组四肢评分显著低于模型对照组（P＜0.01），与模型对照组比较极显著性差异，实验结果具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对胶原型关节炎小鼠体重影响，多肽1高、中、低剂量组体重显著高于模型对照组（P＜0.01），与模型对照组比较极显著性差异，实验结果具有统计学意义。

结论：肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对小鼠胶原型关节炎具有治疗作用。

实施例3

肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对佐剂型大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用

构建佐剂型大鼠关节炎动物模型，研究肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对佐剂性关节炎（Adjuvant arthritis, AA）大鼠的治疗作用。采用大鼠作为受试动物，SPF级SD大鼠90只（由上海西普尔-必凯实验动物有限公司（Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd）提供，动物生产许可证号码：SCXK(沪)2008-0016），雄性，体重为140 g-160 g，随机分成6组，分别是正常对照组，模型对照组，肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1低中高3个剂量组（0.2，0.4，0.8 mg/kg）和阳性药对照组(甲氨蝶呤1 mg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立大鼠AA模型，方法是在大鼠的左侧后足足跎注射含灭活的结核分枝杆菌(H37RA，10 mg/ml)完全弗氏佐剂0.08 ml造成大鼠佐剂性关节炎模型。造模第10天起皮下注射给药：多肽1的3个剂量组（0.2， 0.4， 0.8 mg/kg ）：每日两次，连续10天；阳性药对照组(甲氨蝶呤1 mg/kg )：每五天一次，连续3次；正常对照组和模型对照组（生理盐水）：连续10天。分别于造模后第8，11，14，17，20，23和26天，称量体重、关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对大鼠佐剂型关节炎的影响。

结果：造模后大鼠与正常大鼠相比较，AA大鼠左后足会迅速产生原发性关节炎，出现明显的肿胀，并伴有溃烂；右后足大约10 d后开始出现继发性关节炎，评分的分值逐渐增大；同时耳部血管增生明显，红肿明显；尾部关节出现肿胀。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1在佐剂性大鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用，具体结果如下：

肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对大鼠原发性关节炎足爪肿胀度的影响，大鼠阳性对照组、肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1的低、中、高剂量组左后足踝直径与模型组比较，有极显著性差异（P<0.01）；肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1低、中、高剂量组左后足踝直径与模型组比较，均有显著性差异（P<0.05），实验结果具有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对大鼠继发性关节炎足爪肿胀度的影响，大鼠阳性对照组、肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1低、中、高剂量组右后足踝直径与模型组比较，有显著性差异（P<0.05）。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1Ⅰ对佐剂型关节炎大鼠临床评分的影响，多肽Ⅰ低、中、高剂量组四肢评分显著低于模型对照组（P＜0.05），与模型对照组比较差异均有统计学意义。肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对佐剂型关节炎大鼠体重影响，多肽1高、中、低剂量组体重显著高于模型对照组（P＜0.05），与模型对照组比较差异均有统计学意义。

结论：肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1对AA大鼠关节炎具有治疗作用。

SEQUENCE LISTING

<110>  苏州普罗达生物科技有限公司

 

<120>  肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1制备及其应用

<130> 

<160>  1    

<170>  Patent In version 3.3

<210>  1

<211>  5

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  1

Pro Thr Met Ser Trp

1             5

 

 

 

Claims (1)

1.肿瘤坏死因子-α多肽抑制剂1, 其特征在于其序列为Pro-Thr-Met-Ser-Trp。

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