CN102552929A

CN102552929A - 通过修饰细胞穿透肽提高给药系统的靶向选择性的方法

Info

Publication number: CN102552929A
Application number: CN2010106138479A
Authority: CN
Inventors: 齐宪荣; 董达文; 王鹏程; 时念秋; 向柏; 马冬旭
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2010-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明涉及细胞穿透肽的修饰以达到低毒的具有主动靶向选择功能的给药系统。由屏蔽肽、酶解底物肽、穿膜肽顺序连接形成可激活细胞穿透肽，药物和/或示踪剂和/或药物载体连接或包埋或吸附于细胞穿透肽段构筑成给药系统。屏蔽肽序列可降低或完全中和给药系统表面所带的正电，屏蔽了穿膜肽的穿膜能力，减小给药系统对机体正常细胞的毒性；酶解底物肽序列可被不同病变组织细胞特异性分泌的酶系识别并被该酶水解断裂，释放穿膜肽并使其携带药物和/或药物载体穿透细胞膜，实现药物入胞并发挥作用。本发明的目的是利用具有可激活细胞穿透功能的给药系统，将抗肿瘤药物主动靶向输送至肿瘤组织并使其更大程度地进入肿瘤细胞，实现增大药物抗肿瘤效果的同时降低其对非肿瘤部位的毒性。

Description

通过修饰细胞穿透肽提高给药系统的靶向选择性的方法

技术领域

本发明涉及细胞穿透肽的修饰以达到低毒的具有主动靶向选择功能的给药系统，其所在的技术领域与生命科学和生物医药技术相关。

技术背景

从蛋白中分离出来的具有细胞穿透活性的肽链叫细胞穿透肽，它一般是由小于30个氨基酸的肽链组成，在生理pH条件下带正电。目前细胞穿透肽有蛋白衍生的肽链，模型肽链和设计肽链三种类型。其目前报道的具有穿透功能的氨基酸序列不下百种。

目前，对细胞穿透肽入胞机制的研究主要包括转导模式和内吞模式。其中，转导模式包括直接穿膜和跨膜转导模式，在这种模式下，细胞穿透肽可通过打孔、地毯式或形成反转微团的形式进入细胞；在内吞模式下，细胞穿透肽通过不同的囊泡进入细胞，然后释放入胞浆和胞核。

在生命科学和生物医药技术领域里，细胞穿透肽主要是作为模型药物、基因或成像基团穿透细胞膜的功能基团，目前有关细胞穿透肽在这个领域的研究主要有以下两个方面：

第一、直接与药物、基因或示踪剂连接。通过合理设计，在细胞穿透肽末端引入功能基团，与药物、基因或示踪剂通过共价键相连，从而携带药物、基因或示踪剂穿透细胞膜进入细胞。

第二、细胞穿透肽用于修饰载体给药系统，将载体输送到细胞内，通过载体在胞内的作用释放药物、基因或示踪剂。

尽管与其他生物大分子转运方式相比，细胞穿透肽的运载穿透潜能有很多独特之处，但在应用中仍然存在很多困扰。在抗肿瘤治疗领域，其中一个比较突出的问题是细胞穿透肽携带药物或给药系统进入机体后缺乏细胞选择性，同时其自身携带的正电荷在一定程度上能够引起细胞毒性，从而限制了其在临床上的应用。

发明内容

本发明的目的在于设计可激活的细胞穿透肽，使之能够有效地提高细胞穿透肽的细胞选择性，并将其与负载的药物、基因、示踪剂或药物载体相连，组成主动靶向给药系统，实现对目标细胞的靶向输送并发挥药效；同时降低其在运输过程中引起的细胞毒性。

本发明通过对已知肽段的合理结合，使其成为可激活的、靶向性的、可载药或载体的功能基团，通过肿瘤部位过度表达的酶激活形成穿透肽序列，实现特异性对肿瘤细胞膜的穿透并在胞内释放药物，从而产生肿瘤抑制作用。如附图1所示。

本发明所设计的可激活细胞穿透肽共包括以下三部分：1)带有正电荷的细胞穿透肽段，发挥穿透细胞膜的作用；2)肿瘤部位高表达的酶可识别的底物肽段，在相应酶作用下可断裂；3)带有负电荷的屏蔽肽段，屏蔽阳性的肽段在输送过程中对机体的毒性。酶解底物肽序列位于屏蔽肽序列和穿膜肽序列的中间连接组成可激活细胞穿透肽。

本发明目的涉及的可激活细胞穿透肽中带有负电荷的屏蔽肽段主要是由天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)为主的肽序列，或以D，E与其它氨基酸组成的肽序列。肽序列的长度为4到20个氨基酸范围。肽段的净电荷为负，有效地屏蔽穿透序列所带的正电荷。

本发明目的涉及的可激活细胞穿透肽中酶解底物肽序列能够被肿瘤部位高表达的酶有效水解。这种酶主要包括基质金属蛋白酶，前列腺特异抗原酶，组织蛋白酶，弹性蛋白酶和尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂。针对上述酶可酶解的肽序列为下列序列中的任意一种。可被基质金属蛋白酶酶解的PLGLAG，PLGLAR，GPQGIAGQ，VPMSMRGG，IPVSLRSG，RPFSMIMG，VPLSLTMG，VPLSLYSG，IPESLRAG；可被前列腺特异抗原酶酶解的HSSKLQL，SSKYQ，HSSKYQ；可被组织蛋白酶酶解的FK，GFLG，GFGG，ALAL；可被弹性蛋白酶酶解的AAPV；可被尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂酶解的GGGRR。

本发明目的涉及的可激活细胞穿透肽中的所有氨基酸可以是天然的L型氨基酸，也可以是人工合成的D型氨基酸，根据需要可做出选择。本发明目的涉及的可激活细胞穿透肽中带有正电荷的细胞穿透肽段是由低于30个氨基酸序列组成的。肽段呈现两亲性、净电荷为正，能穿过生物膜并携带多种生物分子，所述的细胞穿透肽段可选自源于人免疫缺陷病毒转录激活因子Tat，源于I型单纯疱疹病毒(HSV-1)蛋白的VP22，源于果蝇同源触角蛋白(Antp)的Penetratin，由促生长激素神经肽和黄蜂毒素改造而成的Transportan，人工合成的由大T抗原核定位序列与不同疏水肽段组成的兼性分子MPG，MAP，Pep-1，从4个到15个不同长度的多聚精氨酸序列，SynB1，Polyomavirus Vp1，Bac，NF-κB，SV40Tantigen，HATF3，hCT，pVEC，Integrin，DPV6，S413PV，Poly-P中的一种。

本发明目的涉及的可激活细胞穿透肽是从屏蔽肽序列、酶解底物肽序列和细胞穿膜肽序列中各自选取一个，根据不同的需要自由组合。例如，针对基质金属蛋白酶酶解的可激活细胞穿透肽序列有DGGDGGDGGDCRALGLPKRRRRRRRRR，DGGDGGDGGDGPLGLAGrrrrrrrrrC(r为人工合成精氨酸)，CEEEEEXIPESLRAGRRRRRRXKC，EEEEEXPLGLAGRRRRRRXKC等；针对前列腺特异抗原酶酶解的可激活细胞穿透肽序列DGGDGGDGGDGHSSKLQrrrrrrrrr、DGGDGGDGGDGSSKYQLLIILRRRIRKQAHAHSK或CEEEEEHSSKYQKLALKALKALKAALKLA等；针对组织蛋白酶酶解的可激活细胞穿透肽序列DGGDGGDGGDGGFLGKFHTFPQTAIGVGAP或DGGDGGDGGDGALALKETWWETWWTEWSQPKKRKV等；针对弹性蛋白酶酶解的可激活细胞穿透肽序列CEEEEEAAPVGRKKRRQRRRPQ等；针对尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂酶解的可激活细胞穿透肽序列CEEEEEGGGRRRRLSSYSSRRRF等。

本发明所设计的具有可激活细胞穿透肽的给药系统主要包括以下两种：1)利用连接物，可激活细胞穿透肽的穿透肽末端直接与药物共价或非共价连接；2)可激活细胞穿透肽与给药载体连接。

本发明目的涉及的具有可激活细胞穿透肽的给药载体为可激活细胞穿透肽的穿膜肽末端与活性药物和/或示踪剂共价连接和/或非共价连接，可激活细胞穿透肽发挥主动靶向和穿透细胞膜作用，活性药物或示踪剂进入细胞后发挥抑制细胞生长或显影作用。所述的具有抗癌活性的药物包括阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、丝裂霉素、柔红霉素、顺铂、卡铂、喜树碱、羟基喜树碱、长春新碱、博莱霉素、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、吉西他滨、甲氨蝶呤、卡培他滨、洛莫司汀、依托泊苷，示踪剂包括荧光物质、放射性同位素，量子点，生物活性物质包括DNA，RNA，蛋白质或肽类物质中的一种或多种。

本发明目的涉及的具有可激活细胞穿透肽的给药系统为可激活细胞穿透肽与载体材料组构筑成的载体给药系统，可激活细胞穿透肽发挥主动靶向和穿透细胞膜作用，载体释放包裹的药物发挥抑制细胞生长作用。所述的载体可选自共聚物、脂质体、胶束、聚电解质共聚物、纳米粒、纳米囊、乳剂、微乳中的一种。

本发明目的涉及的具有可激活细胞穿透肽给药系统是利用细胞穿透肽携带药物或载药载体实现穿膜入胞作用和利用肿瘤细胞分泌的特异性酶酶解特殊肽段实现主动靶向作用。与细胞穿透肽给药系统相比，可激活细胞穿透肽给药系统能够基本消除或减轻对正常细胞的穿膜作用，减少非特异性分布对正常细胞造成的损害，实现主动靶向的目的。同时，由于屏蔽肽序列对正电荷屏蔽作用的应用，能够有效地降低可激活细胞穿透肽给药系统在体内传递过程中对正常细胞造成的毒性。

附图说明

附图1：具有可激活细胞穿透肽的给药系统的入胞模拟图。可激活细胞穿透肽携带的药物或载药载体，通过肿瘤部位高表达的特异性的酶将其对应的底物肽段劈裂，暴露细胞穿透肽段，从而穿透细胞进入胞内。并且利用不同细胞所分泌的不同的酶对特异性的可酶解肽段的劈裂，实现靶向效应。

附图2：可激活细胞穿透肽-阿霉素共聚物。图中a为阿霉素，b为中间连接物，c为可激活细胞穿透肽。

附图3：可激活细胞穿透肽-阿霉素共聚物对肿瘤细胞的抗增殖实验结果图。

附图4：可激活细胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物。图中a为甲氨蝶呤，b为可激活细胞穿透肽。

附图5：可激活细胞穿透肽与亲和素形成的复合物对细胞入胞分析的流式细胞检测结果图。

附图6：可激活细胞穿透肽修饰的脂质体结构图。

具体实施方式

实施例1：可激活细胞穿膜肽的酶解研究

设计和合成可激活细胞穿膜肽，可激活细胞穿膜肽序列为EEEEEXPLGLAGRRRRRRXKC。对合成的可激活细胞穿膜肽进行酶解研究。采用反相高效液相色谱监测37℃条件下IV型胶原酶(含有MMP-2和9)对可激活细胞穿膜肽的酶解过程。收集酶解成分进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，比对推测酶解碎片的序列。HPLC检测可活化细胞穿透肽的峰位和酶解反应后的图谱变化情况，不同浓度的可活化细胞穿透肽溶液都在14.8min左右处有吸收峰(MALDI-TOF-MS检测分子量为2567.24(M+H⁺)。可以确定14.8min的峰即为试验HPLC条件下可活化细胞穿透肽的特征吸收峰)，峰高和峰面积随可活化细胞穿透肽溶液浓度的升高而增大，峰面积与可活化细胞穿透肽浓度呈线性关系。随着酶解时间的延长，出现降解产物的峰，可活化细胞穿透肽的峰面积逐渐减少。37℃时，可活化细胞穿透肽降解一半的时间(T_1/2)约为4h。将分解峰收集，冻干，进行MALDI-TOF-MS检测。通过MALDI-TOF-MS解析及序列分析，酶解肽段包括G-R-R-R-R-R-R(理论m/z值为1012.27，试验m/z值为1012.54)；P-L-G-L-A-G-R-R-R-R(理论m/z值为1151.50，试验m/z值为1150.67)，E-E-E-E-E-X-P(理论m/z值为873.98，试验m/z值为873.49)，E-E-E-E-E-X-P-L(理论m/z值为987.15，试验m/z值为986.55)，E-E-E-E-X-P-L-G-L-A(理论m/z值为1099.35，试验m/z值为1099.69)，E-E-E-E-E-X-P-L-G(理论m/z值为1044.22，试验m/z值为1043.6)。可激活细胞穿膜肽可以被IV型胶原酶裂解，释放出细胞穿膜肽，酶解发生于目标位点PLGLAG，酶解产物包括但不排除可活化细胞穿透肽裂解后肽段的再次断裂。

实施例2：可激活细胞穿透肽-阿霉素共聚物对肿瘤细胞的抗增殖考察

可激活细胞穿透肽，序列为DGGDGGDGGDGPLGLAGrrrrrrrrrC，与阿霉素通过中间连接物3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAS：55750-62-4)化学键和形成共聚物(如附图2所示)。其具体过程为：二甲基甲酰胺分别溶解阿霉素和3-马来酰亚胺丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，加入三乙胺调节pH值，室温搅拌反应2小时后倒入50ml乙醚中，析出的沉淀用无水乙醚洗2次，离心分离沉淀并真空干燥；取沉淀和可激活细胞穿透肽用二甲基甲酰胺溶解，并加入三乙胺，室温搅拌反应2小时后倒入10ml乙醚中，析出的沉淀用无水乙醚洗2次，离心分离沉淀，真空干燥后得到目标共聚物。

人纤维肉瘤细胞HT-1080，MMP酶高表达，对肽段PLGLAG有特异性降解作用；人乳腺癌细胞MCF-7，MMP酶表达较少。将两种细胞在适当的培养液中培养，利用两种细胞做体外抗增殖实验，结果如附图3所示。游离药阿霉素在两种细胞中都具有很强的抗增殖能力，但对于可激活细胞穿透肽-阿霉素共聚物而言，由于人乳腺癌细胞MCF-7分泌的MMP酶较少，不能有效地酶解肽段PLGLAG，使得阿霉素入胞能力低，从而导致细胞抗增殖能力较弱；由于人纤维肉瘤细胞HT-1080中MMP酶的高表达，有效地降解肽段PLGLAG，释放细胞穿透肽，使其携带阿霉素进入细胞，实现抗增殖作用。

实施例3：可激活细胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物对肿瘤细胞的抑制作用

可激活细胞穿透肽，序列为DGGDGGDGGDGPLGLAGrrrrrrrrrC，与甲氨蝶呤形成共聚物(如附图4所示)。

人纤维肉瘤细胞HT-1080，MMP酶高表达，对肽段PLGLAG有特异性降解作用；人乳腺癌细胞MCF-7，MMP酶表达较少。将两种细胞在适当的培养液中培养，考察可激活细胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物在HT-1080和MCF-7细胞的细胞毒作用。结果显示，游离药甲氨蝶呤在两种细胞中都具有很强的细胞毒作用，抑制了细胞的生长；可激活细胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物在HT-1080细胞中，孵育2h的细胞抑制率达到20％，孵育24h的细胞抑制率与游离甲氨蝶呤组相当；可激活细胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物在MCF-7细胞中，孵育2h的细胞抑制率＜2％，孵育24h的细胞抑制率为10％，远远小于游离甲氨蝶呤组。由于人乳腺癌细胞MCF-7分泌的MMP酶较少，不能有效地酶解肽段PLGLAG，使得阿霉素入胞能力低，从而导致细胞毒作用较弱；由于人纤维肉瘤细胞HT-1080中MMP酶的高表达，有效地降解肽段PLGLAG，释放细胞穿透肽，使其携带甲氨蝶呤进入细胞，实现了对肿瘤细胞的杀伤作用。

实施例4：可激活细胞穿透肽携带蛋白特异性激活入胞的考察

合成带有荧光素标记的生物素的可激活细胞穿透肽，序列为DGGDGGDGGDCRALGLPKRRRRRRRRR-biotin，与亲和素以摩尔比为4∶1在37℃下孵育15分钟，形成复合物。

对基质金属蛋白酶(MMP)高表达的人纤维肉瘤细胞HT-1080和MMP酶表达较少的人乳腺癌细胞MCF-7进行传代培养，然后进行下列操作：1)加入复合物后孵育一段时间，利用台盼蓝在流式细胞仪检测之前处理细胞5min以猝灭细胞膜吸附的荧光，流式细胞仪检测结果如附图5所示。

从附图5可以看出，在复合物入胞过程中，MMP酶起到了决定性的作用。在可活化细胞穿透肽未被活化之前，带负电荷的屏蔽肽序列屏蔽了细胞穿膜肽的正电荷，细胞穿膜肽的活性被由具有负电荷的屏蔽肽序列掩盖，暂时失去细胞膜穿透功能，但是当人纤维肉瘤细胞HT-1080中高表达的MMP酶对肽段RALGLP有效酶解后，屏蔽肽序列与细胞穿膜肽序列分离释放出细胞穿膜肽从而发挥功能，携带亲和素进入到胞内。而在MMP酶表达较少的人乳腺癌细胞MCF-7细胞中，这种入胞行为非常的弱。同时，激活并穿膜入胞是具有一定的时间依赖性的，随着时间的延长，有利于复合物的入胞行为。

实施例5：可激活细胞穿透肽-脂质体给药系统

合成含有可激活细胞穿透肽(ABC)的脂材DSPE-PEG-ABC，ABC序列为DGGDGGDGGDG-HSSKLQ-rrrrrrrrr，将脂材(EPC∶Chol∶DSPE-PEG-ABC，60∶40∶5，摩尔比)与规定量紫杉醇共溶于氯仿，旋转蒸发除去氯仿，真空干燥过夜得均匀脂膜。加入10mM HEPES缓冲液(pH 7.4)涡旋水化，脂质体悬液挤出通过双层聚碳酸酯膜(孔径0.2μm)，即得载紫杉醇可活化细胞穿透肽修饰的长循环脂质体(附图6)。

过Sepharose CL-4B葡聚糖凝胶柱分离脂质体和游离药物，收集洗脱液，利用HPLC法测算得载紫杉醇靶向脂质体的平均包封率为91.24％(n＝3)。用激光散射粒径仪测定载紫杉醇靶向脂质体平均粒径为(138±36.9)nm(n＝3)。

PC-3和LNCaP为常用的两种前列腺癌细胞系，其中LNCaP分泌前列腺特异性抗原(PSA)，PC-3则不分泌PSA，PSA可特异性地裂解HSSKLQ肽段。本实验将两种细胞在规定培养液中培养，取对数生长期细胞用胰酶消化后接种于96孔板中，加入载紫杉醇可活化细胞穿透肽修饰的长循环脂质体(紫杉醇终浓度100nmol/L)，37℃，5％ CO₂条件下培养72h后，每孔加入MTT继续培养，4h后，吸掉上清液，每孔加入DMSO 200μl，以570nm波长检测每孔吸光度(A)值，测算细胞抑制率，PC-3和LNCaP的平均抑制率分别为12.53％(n＝3)和68.32％(n＝3)，证明含有可激活细胞穿透肽的靶向脂质体的抗肿瘤活性与前列腺特异性抗原(PSA)的分泌量相关。

实施例6：可激活细胞穿透肽-脂质体双靶向给药系统

合成含有可激活细胞穿透肽(ABC)的脂材DSPE-PEG-ABC，ABC序列为DGGDGGDGGDG-HSSKLQ-rrrrrrrrr，将脂材(EPC∶Chol∶DSPE-PEG-ABC∶DSPE-PEG-folate，60∶40∶3∶3，摩尔比)与规定量紫杉醇共溶于氯仿，旋转蒸发除去氯仿，真空干燥过夜得均匀脂膜。加入10mM HEPES缓冲液(pH 7.4)涡旋水化，脂质体悬液挤出通过双层聚碳酸酯膜(孔径0.2μm)，即得载紫杉醇可活化细胞穿透肽修饰的长循环双靶向脂质体。

过Sepharose CL-4B葡聚糖凝胶柱分离脂质体和游离药物，收集洗脱液，利用HPLC法测算得载紫杉醇双靶向脂质体的平均包封率为92.13％(n＝3)。用激光散射粒径仪测定载紫杉醇双靶向脂质体平均粒径为(141.25±26.89)nm(n＝3)。

将PC-3和LNCaP两种细胞在规定培养液中培养，取对数生长期细胞用胰酶消化后接种于96孔板中，加入载紫杉醇可活化细胞穿透肽修饰的长循环双靶向脂质体(紫杉醇终浓度100nmol/L)，37℃，5％ CO₂条件下培养72h后，每孔加入MTT继续培养，4h后，吸掉上清液，每孔加入DMSO 200μl，以570nm波长检测每孔吸光度(A)值，测算细胞抑制率，PC-3和LNCaP的平均抑制率分别为9.64％(n＝3)和89.63％(n＝3)，证明含有可激活细胞穿透肽的双靶向脂质体的抗肿瘤活性与前列腺特异性抗原(PSA)的分泌量相关。

实施例7：可激活细胞穿透肽-胶束给药系统

合成含有可激活细胞穿透肽(ABC)的脂材DSPE-PEG-ABC，ABC序列为DGGDGGDGGDG-HSSKLQ-rrrrrrrrr，将含有可激活细胞穿透肽的脂材(DSPE-PEG-ABC)与PEG-DSPE二嵌段共聚物和多西紫杉醇混合，形成内核疏水，外部亲水的胶束载体系统，疏水性药物包载于疏水内核中。用激光散射粒径仪测定载紫杉醇胶束的平均粒径为15-100nm，利用HPLC法测算得载多西紫杉醇胶束的平均包封率大于60％。与PC-3和LNCaP细胞孵育，分泌前列腺特异性抗原(PSA)的LNCaP细胞显示出高的细胞内荧光，是PC-3细胞的5倍。MTT分析结果显示对LNCaP细胞抑制率是对PC-3细胞的抑制率的3倍。

实施例8：可激活细胞穿透肽-纳米粒给药系统

阿霉素与PEG通过GFLG相连，形成纳米复合物(PEG-GFLG-阿霉素)，其中PEG的分子量为2000-50000中的任意一种。GFLG可以被肿瘤组织特异分泌的组织蛋白酶(cathepsin B，主要存在于溶酶体内)水解断裂，在肿瘤组织释放阿霉素，杀伤肿瘤细胞。小鼠体内结果显示，PEG-GFLG-阿霉素纳米粒的体内消除半衰期是游离阿霉素的10倍以上，PEG的分子量为4万或5万的纳米粒的体内消除半衰期达到游离阿霉素的20倍，小鼠S180肉瘤模型的生命延长率为86.2％-152.3％(与治疗方案有关)。

实施例9：可激活细胞穿透肽-胶束给药系统

设计和合成可激活细胞穿膜肽-胶束给药系统，可激活细胞穿膜肽序列为DGGDGGDGGDGGFLGKFHTFPQTAIGVGAP，将其连接到甲基丙烯酸二甲胺乙酯(亲水端)和聚己内酯(疏水端)胶束的亲水端上，在HAc-NaAc buffer(20mM，pH 5.0)的条件下形成胶束，将紫杉醇的DMSO溶液滴加到胶束溶液中，超声形成载药的胶束给药系统。由于肿瘤细胞过度表达的组织蛋白酶，有效地识别GFLG序列并使其水解，穿透序列KFHTFPQTAIGVGAP发挥作用携带载药胶束进入胞浆释放药物，发挥药效。

实施例10：可激活细胞穿透肽-聚合物给药系统

设计和合成可激活细胞穿膜肽-聚合物给药系统，可激活细胞穿膜肽序列为CEEEEEGGGRRRRLSSYSSRRRF，将其与聚合物聚乙酰亚胺(PEI)通过中间物共价连接，利用PEI所带的正电荷与siRNA结合，利用肿瘤细胞过度表达的尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂酶，有效识别GGGRR序列并使其水解，穿透序列RRLSSYSSRRRF发挥作用携带聚合物进入胞浆释放siRNA，发挥治疗作用。

实施例11：可激活细胞穿透肽-聚合物给药系统

设计和合成可激活细胞穿膜肽-聚合物给药系统，可激活细胞穿膜肽序列为CEEEEEAAPVGRKKRRQRRRPQ，将其与树枝状聚合物聚酰胺-胺(PAMAM)通过中间物共价连接，利用PAMAM的氨基与药物阿霉素共价连接，利用肿瘤细胞过度表达的弹性蛋白酶，有效识别AAPV序列并使其水解，穿透序列GRKKRRQRRRPQ发挥作用携带聚合物进入胞浆释放阿霉素，发挥治疗作用。

实施例12：可激活细胞穿透肽-脂质体给药系统

设计和合成可激活细胞穿膜肽-脂质体给药系统，可激活细胞穿膜肽序列为CEEEEEHSSKYQKLALKALKALKAALKLA，利用含有可激活细胞穿膜肽序列的脂材和含有腙键的聚乙二醇6000脂材，在加入带正电荷的3β[N-(N’，N’-二甲氨基乙基)-氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)或其他阳离子脂材，例如DOTMA、DODAB、DOTAP的条件下形成能够包载siRNA的脂质体，在肿瘤细胞外的酸性环境下断裂腙键，露出可激活细胞穿膜肽(该法能有效避免可激活细胞穿膜肽序列在体循环中被非特异性酶酶解)，在前列腺特异抗原酶作用下断裂HSSKYQ，穿透序列KLALKALKALKAALKLA发挥作用携带聚合物进入胞浆释放siRNA，发挥治疗作用。

实施例13：可激活细胞穿透肽-胶束成像系统

利用以上实施例中的给药系统，将所负载的疏水性药物换成疏水性荧光物质，利用相同的原理与方法实现对肿瘤组织的定位与成像。

Claims

1.一种连有能够提高细胞穿透肽靶向选择性的给药系统，其特征在于，所述的给药系统由能够提高靶向选择性的可激活细胞穿透肽与具有抗癌和/或示踪剂和/或生物活性物质和/或载体连接组成。

2.根据权利要求1所述的可激活细胞穿透肽，其特征在于，所述的可激活细胞穿透肽包括屏蔽肽序列、酶解底物肽序列、穿膜肽序列，酶解底物肽序列介于屏蔽肽序列和穿膜肽序列之间。

3.根据权利要求2所述的可激活细胞穿透肽，其特征在于，所述的屏蔽肽序列为具有净电荷为负的肽序列，主要包括以天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)为主的肽序列，或以D，E与其它氨基酸组成的肽序列。肽序列的长度为4到20个氨基酸范围。

4.根据权利要求2所述的可激活细胞穿透肽，其特征在于，所述的酶解底物肽序列包括基质金属蛋白酶激活的底物肽序列，前列腺特异抗原酶激活的底物肽序列，组织蛋白酶激活的底物肽序列，弹性蛋白酶激活的底物肽序列，尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂激活的底物肽序列，其中，基质金属蛋白酶可激活的底物肽序列包括PLGLAG，PLGLAR，GPQGIAGQ，VPMSMRGG，IPVSLRSG，RPFSMIMG，VPLSLTMG，VPLSLYSG，IPESLRAG，所述的前列腺特异抗原酶可激活的底物肽序列包括HSSKLQL，SSKYQ，HSSKYQ，所述的组织蛋白酶可激活的底物肽序列包括FK，GFLG，GFGG，ALAL，所述的弹性蛋白酶可激活的底物肽序列包括AAPV，所述的尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂可激活的底物肽序列包括GGGRR。

5.根据权利要求2所述的可激活细胞穿透肽，其特征在于，所述的细胞穿透肽序列为一系列天然L型氨基酸和人工合成D型氨基酸组成的具有细胞穿透活性的肽链，具有两亲性、净电荷为正，能穿过生物膜并携带多种生物分子和/或小粒子载体穿过细胞膜发挥作用。

6.根据权利要求5所述的穿透肽序列，其特征在于，所述的穿透肽序列包括源于人免疫缺陷病毒转录激活因子Tat，源于I型单纯疱疹病毒(HSV-1)蛋白的VP22，源于果蝇同源触角蛋白(Antp)的Penetratin，由促生长激素神经肽和黄蜂毒素改造而成的Transportan，人工合成的由大T抗原核定位序列与不同疏水肽段组成的兼性分子MPG，MAP，Pep-1，从4个到15个不同长度的多聚精氨酸序列，SynB1，Polyomavirus Vp1，Bac，NF-κB，SV40T antigen，HATF3，hCT，pVEC，Integrin，DPV6，S413PV，Poly-P。

7.根据权利要求2所述的可激活细胞穿透肽，其特征在于，可激活细胞穿透肽是从屏蔽肽序列、酶解底物肽序列和细胞穿膜肽序列中各自选取一个，根据不同的需要自由组合。

8.根据权利要求1所述的给药系统，其特征在于，所述的给药系统为可激活细胞穿透肽的细胞穿膜肽序列通过共价连接和/或非共价键的方式与抗癌药物和/或示踪剂和/或生物活性物质连接形成的给药系统，其中，抗癌药物包括阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、丝裂霉素、柔红霉素、顺铂、卡铂、喜树碱、羟基喜树碱、长春新碱、博莱霉素、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺、吉西他滨、甲氨蝶呤、卡培他滨、洛莫司汀、依托泊苷，示踪剂包括荧光物质、放射性同位素，量子点，生物活性物质包括DNA，RNA，蛋白质或肽类物质。

9.根据权利要求1所述的给药系统，其特征在于，所述的给药系统为可激活细胞穿透肽的细胞穿膜肽序列通过共价连接或载体包埋或物理混合的方式与载体形成给药系统，其中，载体包括共聚物，脂质体、胶束、聚电解质聚合物、纳米粒、纳米囊、乳剂、微乳。

10.根据权利要求1所述的给药系统，其特征在于，所述的给药系统能够利用特异性酶对可激活细胞穿透肽进行激活，使其具有对病变细胞的主动靶向作用和提高病变细胞对药物摄取的能力，实现治疗疾病和控制疾病进程的目的，应用于药物治疗领域、医学成像领域，体内示踪检测领域。