WO2010095881A2 - 표적 선택적 세포／조직 투과기능 활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

표적 선택적 세포／조직 투과기능 활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to target selective cell / tissue penetrating peptides and uses thereof, and more particularly target selective cell / tissue penetrating functionalities that specifically add drugs or drug-containing particles only to target cells / tissues by adding selectivity. It relates to a peptide and a complex of the drug or drug-containing particles thereof.
  • PTD protein transduction domain
  • HAV-1 human immunodeficiency virus-1
  • YGRKKRRQRRR transmembrane cell membranes consisting of a portion of the 47th to 57th amino acid sequence (YGRKKRRQRRR), in which the positively charged amino acids are concentrated, rather than the complete form of 86 amino acids.
  • PTD effect as PTD
  • peptides having amino acid sequences 267 to 300 of the VP22 protein of HSV-1 (herpes simplex virus type 1) (Elliott, G. et al., Cell , 88: 223, 1997), peptides having amino acid sequences 84-92 of the UL-56 protein of HSV-2 (GeneBank code: D1047 [gi: 221784]) and antennapedia of the genus Drosophila sp. , ANTP) peptides (Schwarze, SR et al., Trends. Pharmacol.
  • LMWP low molecular weight protamine
  • the present inventors have attempted to minimize the side effects or problems of low image quality due to the nonspecific distribution of a substance for diagnosis or treatment of an existing disease, and to develop a method for effectively and effectively delivering a substance for diagnosis or disease treatment only to target cells.
  • a target selective cell / tissue permeable peptide consisting of a spacer having a protein transport domain (PTD) -target histase-specific cleavage site and a masking domain which ionically binds to the protein transport domain (PTD)
  • PTD protein transport domain
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for diagnosing and treating diseases such as cancer and inflammation, including the target selective cell / tissue penetrating functional peptide-drug complex.
  • the present invention provides a target activated cell / tissue translocation peptide for Impermeable Compound Strategy (TACYICS), including:
  • PTD protein transport domain
  • a spacer which connects the protein transport domain (PTD) and the masking domain and has a target cell / tissue enzyme specific cleavage site.
  • the protein transport domain is composed of amino acids of D-type or L-type, and may include any one or more amino acids selected from the group consisting of arginine, lysine and histidine in an amount of 70-80%. Can be.
  • the masking domain ion-bonding with the protein transport domain is composed of D-type or L-type amino acids, it may be characterized in that it comprises an anionic amino acid in a content of 70 ⁇ 100% have.
  • the anionic amino acid may include glutamic acid or aspartic acid, preferably, the masking domain may be composed of 4 to 8 amino acids.
  • the spacer is any one enzyme selected from the group consisting of prostate cancer surface enzyme, kallikrein 14 (Kallikrein 14, KLK14), catepsin (Cathepsin) and matrix metalloprotease (MMP) It can be characterized by having a site
  • the present invention also provides a target selective cell / tissue penetrating peptide-drug complex, characterized in that the target selective cell / tissue penetrating peptide and drug or drug-containing particles are combined.
  • a drug or a drug-containing particle may be coupled to a protein transport domain (PTD) of the target selective cell / tissue permeable peptide, preferably the protein transport domain (PTD) and the drug or Drug-containing particles can be linked to cysteine.
  • PTD protein transport domain
  • the drug is an antisense oligonucleotide targeting RNA of an anticancer agent, an anticancer protein, an anti-inflammatory agent, an anti-inflammatory protein, an immune enhancing protein, an bone resorption inhibitor, a tumor or an inflammatory disease protein, and an RNA of a tumor or inflammatory disease protein. It may be characterized in that the selected from the group consisting of siRNA as a target.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for diagnosing and treating a disease comprising the target selective cell / tissue permeable peptide-drug complex. That is, it can provide a pharmaceutical composition for treating cancer diseases.
  • the present invention also provides a method for treating a cancer disease, characterized in that by administering the target selective cell / tissue permeable peptide-drug complex.
  • the present invention also provides a use of the target selective cell / tissue permeable peptide-drug complex for the treatment of cancer.
  • FIG. 1 is a schematic of the mechanism of a target selective cell / tissue permeable peptide-drug complex according to the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph of fluorescence of normal cell lines (a) and tumor cell lines (b) measured by FACS after fluorescence-labeled target selective cell / tissue penetrating functional peptide treatment.
  • Figure 3 is a photograph of the tumor cell line group (a) and normal cell line group (b) after fluorescence-labeled target selective cell / tissue penetrating functional peptide treatment observed by confocal microscopy.
  • Figure 4 is a photograph of the fluorescence of normal cell line (a) and tumor cell line (b) after treatment with the target selective cell / tissue penetrating functional peptide-gelonin complex observed by confocal microscopy.
  • FIG. 5 is a photograph of fluorescence of normal cell lines (a) and tumor cell lines (b) measured by FACS after treatment with target selective cell / tissue penetrating peptide-gelonin complexes.
  • Figure 6 is a graph showing the cell survival rate in the normal cell group (1) and tumor cell group (2 and 3) according to the target selective cell / tissue penetrating functional peptide-gelonin complex treatment concentration.
  • 'protein transport domain refers to a permeable peptide that can permeate a drug or drug-containing particles into the cytoplasm or nucleus of a cell. This means that covalent bonds with oligonucleotides, peptides, proteins, oligosaccharides, polysaccharides, or nanoparticles can introduce these substances into cells without requiring additional receptors, carriers, or energy.
  • target cell / tissue refers to cells and tissues to which drugs or drug-containing particles are delivered by a target selective cell / tissue penetrating functional peptide, and refers to cells in or outside the body.
  • target cells / tissues are meant to include cells in the body, ie cells constituting organs or tissues of living animals or humans, or microorganisms found in living animals or humans.
  • target cells / tissues are meant to include extracellular cells, ie cultured animal cells, human cells or microorganisms.
  • the present invention relates to a target activated cell / tissue translocation peptide for impermeable compound strategy (TACYICS), comprising:
  • PTD protein transport domain
  • a spacer which connects the protein transport domain (PTD) and the masking domain and has a target cell / tissue enzyme specific cleavage site.
  • the present invention relates to a cell / tissue delivery technique for preparing a target selective cell / tissue penetrating functional peptide and allowing drug-containing particles such as drugs or drug-containing nanomagnetic particles to penetrate only into target cells / tissues.
  • drug-containing particles such as drugs or drug-containing nanomagnetic particles
  • FIG. 1 the drug or drug-containing nanoparticles to be introduced are chemically bound and then treated in vivo and in vitro in an aqueous solution, thereby exhibiting no permeability in non-target cells. And permeate only into the target cell. In other words, the cell is directly introduced into the cell without endocytosis.
  • the target selective cell / tissue penetrating peptide according to the present invention can be prepared using a peptide synthesizing apparatus by chemical synthesis, and the spacer and masking domains are sequentially arranged at the C terminal of the protein transport domain (PTD) having intracellular penetrating function.
  • the compound can be synthesized in the order of the N terminal-protein transport domain-spacer-masking domain-C terminus, and also in the order of the N terminal-masking domain-spacer-protein transport domain-C terminus. .
  • the protein transport domain may include 70 to 80% of any one or more amino acids selected from the group consisting of arginine, lysine and histidine.
  • the amino acid constituting the protein transport domain (PTD) can be L-type or D-type in consideration of stability in the body.
  • Protein transport domains (PTDs) having intracellular permeability include 70 to 80 cationic protein transport domain peptides other than LMWP (SEQ ID NO: 1: VSRRRRRRGGRRRR), a transport domain found by the inventors, ie arginine, lysine or histidine.
  • Peptides containing at least% may be used, preferably TAT (SEQ ID NO: 2: YGRKKRRQRRR), Pentratratin (SEQ ID NO: 3: RQIKIWFQNRRMKWKK), polyarginine (SEQ ID NO: 4: RRRRRRR), polylysine (polylysine) (SEQ ID NO: 5: KKKKKKKK), protamine fragments and antennapedia (ANTP) may be used, and other peptides or peptide analogs other than those described above may be used as long as they can penetrate the cell membrane. .
  • the masking domain ion-bonding with the protein transport domain may be characterized in that it comprises an anionic amino acid in a content of 70 ⁇ 100%.
  • the amino acid constituting the masking domain can be L-type or D-type in consideration of stability in the body.
  • the anionic amino acid may include glutamic acid or aspartic acid, preferably, the masking domain may be composed of 4 to 8 amino acids.
  • the spacer is any one enzyme selected from the group consisting of prostate cancer surface enzyme, kallikrein 14 (Kallikrein 14, KLK14), catepsin (Cathepsin) and matrix metalloprotease (MMP) It may be characterized by having a site that is cleaved by, wherein the spacer is SEQ ID NO: 6 (CHSSKLQG), SEQ ID NO: 7 (LRLSSYYM), SEQ ID NO: 8 (SSQPWQ), SEQ ID NO: 9 (RRFLCG), SEQ ID NO: 10 ( THDNDL), SEQ ID NO: 11 (VRPIE), SEQ ID NO: 12 (VSGWGT), SEQ ID NO: 13 (YPAS), SEQ ID NO: 14 (TITPGM), SEQ ID NO: 15 (QGRAMC), SEQ ID NO: 16 (GPRAMC), SEQ ID NO: 17 (QRRAMC ), SEQ ID NO: 18 (GGRAMC), SEQ ID NO: 19 (VLKAMC), SEQ ID NO:
  • the present invention relates to a target selective cell / tissue penetrating peptide-drug complex, characterized in that the target selective cell / tissue penetrating peptide is combined with a drug or drug-containing particle.
  • the target selective cell / tissue penetrating peptide is covalently bound to a drug or drug-containing particle to provide a target selective cell / tissue penetrating peptide-drug complex, the protein transport domain (PTD) of the target selective cell / tissue penetrating peptide.
  • Drugs or drug-containing nanoparticles may be covalently bonded to the N- or C-terminus, and preferably, cysteine is additionally attached to the distal end of the protein transport domain (PTD).
  • the complex may be made by inducing a chemical bond using a crosslinking agent.
  • a crosslinking agent When chemical bonds are induced using a crosslinking agent, complexes formed by the crosslinking agent are easily formed because each of the free amino groups is provided at the N-terminus of the protein transport domain (PTD) peptide, that is, the protein transport domain (PTD).
  • the crosslinking agent that can be used in the present invention is 1,4-bis-maleimidobutane (BMB), 1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol (1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol, BM [PEO] 4), 1-ethyl-3- [3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (1-ethyl-3- [3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC), succinimidyl-4- [ N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy- [6-amidocaproate]] (succinimidyl-4- [N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy- [6-amidocaproate]], SMCC) and its sulfonates -SMCC), succimidyl 6- [3- (2-pyridyldithio) -lopionamido
  • the drug may be dissociated from the cell-penetrating peptide in the cell by a reductase or the like present in the cell.
  • the drug includes an anticancer agent, an anti-inflammatory agent, a bone resorption inhibitor, an anticancer protein, an anti-inflammatory protein, an immunopotentiating protein, an anti-cancer and anti-inflammatory siRNA, an oligonucleotide, and nanomagnetic particles containing them.
  • siRNA refers to RNA silencing expression of target RNA.
  • Target RNA is a mRNA transcribed from a disease-causing gene, in particular, a tumor or inflammation-causing gene.
  • the cancer-causing gene is a vascular endothelial growth factor (vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, but is not limited thereto.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the tumor or inflammatory disease protein is vascular endothelial growth factor (VEGF), B-cell Leukemia / lymphoma 2 (BCL2), epidermal growth factor receptor (epidermal growth factor receptor) factor receptor (EGFR), human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), Janus kinase (JAN) and phosphatidylinositol-3-kinase / Akt kinase (phosphatidylinositol-3-kinase / Akt) kinase, PI3-K / AKT).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • BCL2 B-cell Leukemia / lymphoma 2
  • EGFR epidermal growth factor receptor (epidermal growth factor receptor) factor receptor
  • HER2 human epidermal growth factor receptor 2
  • JAN Janus kinase
  • phosphatidylinositol-3-kinase / Akt kinase
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for diagnosing and treating a disease comprising the target selective cell / tissue permeable peptide-drug complex. That is, it can be provided as a pharmaceutical composition for treating cancer diseases.
  • the target selective cell / tissue permeable peptides according to the present invention were labeled with the fluorescent marker FITC and applied to normal cells and tumor cells.
  • the fluorescence in tumor cells was increased and the fluorescence in normal cells was the same as before application. It was confirmed. This is because the spacer is degraded by the enzyme on the surface of the tumor cell, and thus, the fluorescently labeled target selective cell / tissue penetrating functional peptide is dissociated and penetrated into the tumor cell.
  • the peptide's permeability was not exerted.
  • binding the tumor suppressor protein to the terminal of the peptide did not affect the cell growth of normal cells, while suppressing the growth of tumor cells.
  • MTT assay was performed to determine the effective inhibitory concentration (IC50) of the target selective cell / tissue penetrating functional peptide-drug according to the present invention, and showed cytotoxicity even at a low concentration of 5 ⁇ 10 ⁇ 9 M.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered with a pharmaceutically acceptable carrier, and during oral administration, a binder, a suspending agent, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a coloring agent, a flavoring agent, etc. may be used.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a pharmaceutically acceptable triglyceride, a pharmaceutically acceptable sulfate, etc.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as described above.
  • oral administration in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elesir, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, may be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms.
  • composition of the present invention may be administered in a therapeutically or prophylactically effective amount. Dosage may vary depending on a variety of factors, including the type and severity of the patient, age, sex, weight, sensitivity to the drug, type of current treatment, method of administration, target cells, and can be readily determined by those skilled in the art. Can be.
  • the composition of the present invention may be administered in combination with a conventional therapeutic agent and may be administered sequentially or simultaneously with the conventional therapeutic agent. It may also be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the term “administration” means introducing a predetermined substance into a patient in any suitable manner and the route of administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device that allows the active material to migrate to the target cell.
  • gelonin an anticancer protein as a drug
  • other anticancer proteins, antisense oligonucleotides of cancer-causing genes, siRNA, and the like and particles containing them are similar in tumor treatment.
  • the same effects can be obtained, and anti-inflammatory effects using anti-inflammatory substances, anti-inflammatory proteins, etc. as drugs in relation to anti-inflammatory treatments will be apparent to those skilled in the art.
  • Target selective cells / tissues using peptide synthesizers to contain EEEEEEE (SEQ ID NO: 27) as a masking domain, PLGLAG (SEQ ID NO: 25), which is a sequence degraded in MMP as a spacer, and LMWP as PTD, in order from the N terminus Permeable peptides were synthesized by F-moc solid phase chemical synthesis.
  • the synthesized peptide sequence was cleaved from the resin, washed, lyophilized and separated and purified by liquid chromatography. The purified peptide was confirmed molecular weight using MALDI analysis.
  • the target selective cell / tissue penetrating functional peptide prepared in Example 1 contains cysteine and there is a free-sulfhydryl group, it is used as a chemical crosslinking agent to chemically react with the anticancer protein Gelonin. Binding was induced.
  • the modification of the surface of the gelonin was made in the form of attaching a thiol group to the surface carboxyl group. After 10 minutes of peptide-SH per 1 particle surface-SH of the molecule was reacted at 4 ° C for 12 hours, the unbound molecules were filtered through ultrafiltration, and then lyophilized to target selective cells / tissues. Permeable peptide-gelonin complex was obtained.
  • Example 3 Tumor intracellular permeability of target selective cell / tissue permeable peptides
  • Example 2 To test the cell selective permeability of the target selective cell / tissue permeable peptide prepared in Example 1, fluorescently labeled with FITC at the C terminus of the prepared peptide, these were normal cell line (ATCC) and tumor cell line (CT-26, KCLB). (0909) Korea cell line bank).
  • a represents the fluorescence of the normal cell line
  • b represents the fluorescence of the tumor cell line.
  • the experimental results indicate that the target selective cell / tissue permeability was degraded by the action of the enzyme, while the spacer having the PLGLAG peptide sequence (SEQ ID NO: 25), which is a cleavage site specific for tumor cell surface enzyme (MMP), on the tumor cell surface.
  • the masking domain (EEEEEEE: SEQ ID NO: 27), which ionizes and covers the protein transport domain (PTD) of the peptide, dissociates and the LMWP
  • the protein transport domain (PTD) is smoothly introduced into the cells, whereas in normal cells, it is an enzyme spacer. No degradation occurred, indicating that introduction was inhibited even when the same peptide was treated.
  • the target selective cell / tissue permeable peptide-anticancer protein complex prepared in Example 2 was inoculated into a normal cell line (ATCC) and a tumor cell line (CT-26, KCLB (Korea cell line bank) 80009).
  • CT-26 normal cell line
  • KCLB Kirea cell line bank 80009
  • the cells were stained with Hoechst 33342 (5 ⁇ g / ml), which stains the cell nuclei, and the cells were fixed with 10% neutral formalin solution.
  • the spacer was decomposed by the action of the enzyme on the surface of the tumor cell, and the masking domain, which was ion-bonded and masked the LMWP, which is the protein transport domain (PTD) of the target selective cell / tissue penetrating functional peptide, was dissociated and the protein While the transport domain (PTD) was smoothly introduced into the cells, spacer degradation by enzymes did not occur in normal cells, indicating that introduction was inhibited even when the same peptide was treated.
  • the LMWP which is the protein transport domain (PTD) of the target selective cell / tissue penetrating functional peptide
  • MTT assay is a test that utilizes the ability of the mitochondria to reduce the yellow water-soluble substrate MTT tetrazolium to a blue-violet, water-insoluble MTT formazan by dehydrogenase action.
  • the normal cell group does not exhibit cytotoxicity by the applied complex, whereas the tumor cell group showed significant cytotoxicity when the peptide complex was treated, the effective inhibitory concentration (IC50) is approximately It was measured at 5 x 10 -9 M.
  • IC50 the effective inhibitory concentration
  • 1 indicates the cell growth in the normal cell group
  • 2 and 3 shows the cell growth in the tumor cell line (CT-26) as a result of two experiments.
  • the experimental results indicate that the activity of the penetrating functional peptide is selectively restored in the tumor cell group, and thus the penetrating peptide-anticancer protein complex is introduced into the cell to exhibit an effective anticancer force even at low concentrations.
  • the target selective cell / tissue permeable peptide-drug complex according to the present invention shows high safety by breaking away from the existing non-specific and non-selective peptide transporter, and the diagnosis and drug treatment through optimal target orientation. Maximize the effectiveness of the therapy and minimize side effects.
  • the present invention can provide innovative disease diagnosis and treatment technology by providing a pharmaceutical composition for diagnosing and treating a disease, including a target-selective cell / tissue permeable peptide-drug complex having target cell specific permeability.

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Abstract

본 발명은 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드(Target Activated Cell/tissue Translocation peptide for Impermeable Compound Strategy (TACTICS)) 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 단백질 수송도메인(PTD), (B) 마스킹 도메인 및 (C) 표적세포/조직 효소 특이적인 절단부위를 가지는 스페이서를 포함하는 것으로, 선택성을 부가하여 표적조직에서만 특이적으로 투과기능성을 발휘하도록 한 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드 및 이와 영상 또는 치료용 약물 또는 약물함유입자의 복합체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체는 펩타이드에 표적선택능을 부여하여 최대의 영상 및 치료효과를 발휘하게 함과 동시에, 복합체의 비특이적 체내 분포를 억제하여 부작용을 최소화하고 진단효과를 극대화시키며, 질병 치료에 유용하다.

Description

표적 선택적 세포／조직 투과기능 활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도
본 발명은 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 선택성을 부가하여 약물 또는 약물함유입자를 표적세포/조직 내로만 특이적으로 투과시키는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드 및 이와 약물 또는 약물함유입자의 복합체에 관한 것이다.
질환의 진단이나 치료에서 목적물질이 선택적으로 표적 조직 또는 세포에만 머무르며 작용하도록 하기 위한 시도가 오랫동안 이루어져 왔다.
특히 종양의 치료나 골관절염 및 뇌질환의 진단 및 치료영역에서 표적 병소에 특이적으로 존재하는 단백질이나 작은 물질에 대한 많은 연구가 진행되어 왔으며, 이에 따라 이러한 물질들이 많이 도출되면서 이를 이용한 치료연구도 활발히 진행되고 있다. 일례로, 전립선암의 경우 전립선특이항원 (Prostate Specific Angigen, PSA)이 많이 존재하고, 관절염이나 기타 종양조직에는 기질금속단백질 분해효소 (Matrix Metalloprotease, MMP)가 정상조직에 비해 특이적으로 높게 발현하는 것으로 나타나, 질병 연구 및 치료의 표적이 되고 있다. 그러나, 질병의 진단 및 치료를 위해 사용하는 물질이 이러한 표적에만 특이적으로 작용하지 않는 경우, 비특이적으로 분포에 의한 부작용이나 낮은 영상도의 문제가 발생하므로 표적에만 머무르거나 작용하는 제형 개발이 요청되고 있다.
한편, 일반적으로 일부 작은 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내부의 세포질 또는 핵으로 들어갈 수 있는 반면, 거대분자는 세포 내부로 들어갈 수 없다. 그런데, 유효량이 세포 내로 전달되어야 하는 대부분의 치료, 예방 및 진단 목적으로 제조되는 물질들은 거대분자이기 때문에, 생체 내부 및 외부 모두에서 세포를 손상시키지 않고 생물학적 활성을 지닌 거대 분자를 효과적으로 전달하는 방법이 요청되었다.
이러한 요구에 대한 연구의 결과로서 제시된 것으로 단백질 수송 도메인(protein transduction domain, PTD)이 있으며, 이중 가장 많은 연구가 진행된 것은 인간 면역 결핍 바이러스-1(human immunodeficiency virus-1, HIV-1)의 전사인자인 TAT 단백질이다. 상기 단백질은 세포막을 통과함에 있어 86개의 아미노산으로 구성된 완전한 형태일 때보다 양전하를 갖는 아미노산들이 집중적으로 분포되어 있는 47번째부터 57번째 아미노산 서열(YGRKKRRQRRR)의 일부분으로 구성된 형태일 경우 더욱 효과적이라는 것이 밝혀졌다 (Fawell, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:664, 1994). PTD로서의 효과가 확인된 다른 예로는 HSV-1(herpes simplex virus type 1)의 VP22 단백질의 267번째부터 300번째까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드(Elliott, G. et al., Cell, 88:223, 1997), HSV-2의 UL-56 단백질의 84번째부터 92번째까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드(GeneBank code:D1047[gi:221784]) 및 드로소필라 속(Drosophila sp.)의 안테나페디아(antennapedia, ANTP) 단백질의 339번째부터 355번째까지의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 (Schwarze, S.R. et al., Trends. Pharmacol. Sci., 21:45, 2000) 등이 있으며, 전기적으로 양성인 아미노산들을 나열한 인위적인 펩타이드의 경우도 그 효과가 확인되었다 (Laus, R. et al., Nature. Biotechnol., 18:1269, 2000).
최근 본 발명자는 TAT와 유사한 펩타이드 배열을 가지고, 수송 도메인으로 활용되는 펩타이드로서 아르기닌(arginine) 등의 양이온성 아미노산을 다량 함유하는 저분자형 프로타민(low molecular weight protamine, LMWP)을 제조하고 이의 세포내 투과기능성에 대해 발표한 바 있다. 특히, LMWP는 프로타민으로부터 유래하는 천연 유래 양이온성 펩타이드로서, 독성에 대한 염려가 없고 대량으로 생산해 낼 수 있는 장점이 있다 (Park, Y.J. et al., J. Gene. Med., 700, 2003). 그러나 이 펩타이드 역시 선택적 영상이나 진단, 치료를 위해서는 부가적으로 표적선택성의 부여가 요청되었다.
이에, 본 발명자는 기존의 질병의 진단 또는 치료용 물질의 비특이적 분포로 인한 부작용이나 낮은 영상도의 문제점을 최소화하고 진단 또는 질병 치료용 물질을 표적세포에만 특이적으로 효과적으로 전달할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 단백질 수송 도메인(PTD)-표적조직효소 특이적인 절단부위를 갖는 스페이서(spacer)-상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 이온 결합하는 마스킹 도메인으로 구성되는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드를 제작한 다음, 이를 이용한 펩타이드-약물 복합체 사용 시 약물이 표적세포/조직 내로만 특이적으로 투과됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 약물 또는 약물함유입자를 표적세포/조직 내로만 특이적으로 투과시키는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드 및 이와 약물 또는 약물함유입자의 복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체를 포함한 암, 염증 등의 질환의 진단 및 치료용 약학조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드(Target Activated Cell/tissue Translocation peptide for Impermeable Compound Strategy (TACYICS))를 제공한다:
(a) 단백질 수송 도메인(PTD);
(b) 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 이온결합하는 마스킹 도메인; 및
(c) 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 마스킹 도메인을 연결하며, 표적세포/조직 효소 특이적인 절단부위를 가지는 스페이서(spacer).
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)은 D-형 또는 L-형의 아미노산으로 구성되며, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산을 70~80%의 함량으로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 이온결합하는 마스킹 도메인은 D-형 또는 L-형의 아미노산으로 구성되며, 음이온성 아미노산을 70~100%의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 음이온성 아미노산은 글루타민산 또는 아스파틱산 등을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 마스킹 도메인은 4~8개의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 전립선암 표면효소, 칼리크레인 14(Kallikrein 14, KLK14), 카텝신(Cathepsin) 및 기질금속단백분해효소(matrix metalloprotease, MMP)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 효소에 의해 절단되는 부위를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드와 약물 또는 약물함유입자가 결합된 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드의 단백질 수송 도메인(PTD)에 약물 또는 약물함유입자가 결합된 것을 특징으로 할 수 있는데, 바람직하게는 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 약물 또는 약물함유입자는 시스테인으로 연결될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 항암제, 항암성 단백질, 항염제, 항염 단백질, 면역증강단백질, 골흡수 억제제, 종양 또는 염증질환 단백질의 RNA를 타겟으로 하는 안티센스올리고뉴클레오티드 및 종양 또는 염증질환 단백질의 RNA를 타겟으로 하는 siRNA로 구성되는 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체를 포함하는 질병의 진단 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 즉, 암 질환 등의 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체를 투여하는 것을 특징으로 하는 암 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체의 암 치료용 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부한 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체의 기전의 도식도이다.
도 2는 형광표지한 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드 처리 후 정상세포주(ⓐ) 및 종양세포주(ⓑ)의 형광도를 FACS를 이용하여 측정한 사진이다.
도 3은 형광표지한 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드 처리 후 종양세포주 군(a) 및 정상세포주 군(b)을 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 4는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-젤로닌 복합체 처리 후 정상세포주(ⓐ) 및 종양세포주(ⓑ)의 형광도를 공초점 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-젤로닌 복합체 처리 후 정상세포주(ⓐ) 및 종양세포주(ⓑ)의 형광도를 FACS를 이용하여 측정한 사진이다.
도 6은 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-젤로닌 복합체 처리농도별 정상세포군(①) 및 종양세포군(② 및 ③)에서의 세포생존률을 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
‘단백질 수송 도메인(PTD)'은 약물 또는 약물함유입자를 세포의 세포질이나 핵 안으로 투과시킬 수 있는 투과기능성 펩타이드 등을 말한다. 이는 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당, 다당류 또는 나노입자 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고, 이들 물질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.
‘표적세포/조직’이란 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드에 의해 약물 또는 약물함유입자가 전달되는 세포 및 조직을 말하는 것으로서, 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적세포/조직은 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포/조직은 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 발명은 일 관점에서, 다음을 포함하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드(Target Activated Cell/tissue Translocation peptide for Impermeable Compound Strategy (TACYICS))에 관한 것이다:
(a) 단백질 수송 도메인(PTD);
(b) 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 이온결합하는 마스킹 도메인; 및
(c) 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 마스킹 도메인을 연결하며, 표적세포/조직 효소 특이적인 절단부위를 가지는 스페이서(spacer).
본 발명은 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드를 제조하여 이와 결합된 약물이나 약물함유 나노자성입자 등 약물함유입자를 표적세포/조직 내로만 투과할 수 있도록 하는 세포/조직 내 전달기법에 대한 것으로, 도 1에 나타난 바와 같이 도입시키고자 하는 약물이나 약물함유 나노입자를 화학적으로 결합시킨 후 수용액 상태로 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro)에 처리하여 비표적세포에서는 투과기능을 발휘하지 못하도록 하고 표적 세포내로만 투과기능을 발휘하도록 한다. 즉, 기존 세포 내 흡수방법인 엔도사이토시스(endocytosis) 과정 없이 직접 세포 내로 도입하는 것이다.
본 발명에 따른 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드는 화학적 합성으로 펩타이드 합성장치를 이용하여 제조될 수 있으며, 세포 내 투과기능성을 가지는 단백질 수송 도메인(PTD)의 C 말단부에 스페이서, 마스킹 도메인을 순차적으로 화합합성되도록 하여, N 말단-단백질 수송 도메인-스페이서-마스킹 도메인-C 말단의 순서로 합성할 수 있으며, 또한 N 말단-마스킹 도메인-스페이서-단백질 수송도메인-C말단의 순서로도 합성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산을 70~80%의 함량으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)을 구성하는 아미노산은 체내에서의 안정성을 고려하여 L-형 또는 D-형으로 할 수 있다.
세포 내 투과기능성을 가지는 단백질 수송 도메인(PTD)으로는 본 발명자에 의해 발견된 수송 도메인인 LMWP(서열번호 1:VSRRRRRRGGRRRR)이외의 다른 양이온 단백질 수송 도메인 펩타이드, 즉 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이 70~80% 이상 포함된 펩타이드가 사용될 수 있는데, 바람직하게는 TAT(서열번호 2: YGRKKRRQRRR), 페너트라틴(Penetratin; 서열번호 3:RQIKIWFQNRRMKWKK), 폴리아르기닌(polyarginine)(서열번호 4:RRRRRRR), 폴리라이신(polylysine)(서열번호 5:KKKKKKKKKK), 프로타민(protamine)절편 및 안테나페디아(Antennapedia, ANTP) 등이 사용될 수 있으며, 세포막을 투과할 수 있다면 전술한 펩타이드 이외의 다른 펩타이드 또는 펩타이드 유사체도 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 이온결합하는 마스킹 도메인은 음이온성 아미노산을 70~100%의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 마스킹 도메인을 구성하는 아미노산은 체내에서의 안정성을 고려하여 L-형 또는 D-형으로 할 수 있다. 이때, 상기 음이온성 아미노산은 글루타민산 또는 아스파틱산 등을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 마스킹 도메인은 4~8개의 아미노산으로 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스페이서는 전립선암 표면효소, 칼리크레인 14(Kallikrein 14, KLK14), 카텝신(Cathepsin) 및 기질금속단백분해효소(matrix metalloprotease, MMP)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 효소에 의해 절단되는 부위를 가지는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이때, 상기 스페이서는 서열번호 6(CHSSKLQG), 서열번호 7(LRLSSYYM), 서열번호 8(SSQPWQ), 서열번호 9(RRFLCG), 서열번호 10(THDNDL), 서열번호 11(VRPIE), 서열번호 12(VSGWGT), 서열번호 13(YPAS), 서열번호 14(TITPGM), 서열번호 15(QGRAMC), 서열번호 16(GPRAMC), 서열번호 17(QRRAMC), 서열번호 18(GGRAMC), 서열번호 19(VLKAMC), 서열번호 20(LGRAMC), 서열번호 21(QARAMC), 서열번호 22(VPRAMC), 서열번호 23(PFRAMC), 서열번호 24(FSRAMC), 서열번호 25(PLGLAG) 및 서열번호 26(SGRSA)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 원활한 효소분해를 위하여 이들 스페이서를 구성하는 아미노산은 L-형으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드와 약물 또는 약물함유입자가 결합된 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체에 관한 것이다.
상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드는 약물이나 약물 함유 입자와 공유결합되어 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체를 제공하는데, 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드의 단백질 수송 도메인(PTD)의 N 말단 또는 C 말단부 등에 약물 또는 약물 함유 나노입자가 공유결합될 수 있으며, 이때 바람직하게는 단백질 수송 도메인(PTD)의 말단부에 시스테인을 부가적으로 부착하여 사용한다.
또한, 상기 복합체는 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도시켜 만들 수 있다. 가교제를 이용하여 화학적 결합을 유도시킬 경우, 단백질 수송도메인(PTD) 펩타이드, 즉 단백질 수송 도메인(PTD)의 N말단에 각각의 자유 아미노기를 지니고 있어 가교제에 의한 복합체 형성이 용이하다. 본 발명에서 사용할 수 있는 가교제는 1,4-비스-말레이미도부탄(1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜(1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. S-S결합에 의해 세포투과성 펩타이드와 약물 혹은 약물함유 나노입자가 결합되는 경우, 세포 내에 존재하는 환원 효소 등에 의해 약물이 세포 내에서 세포투과성 펩타이드로부터 해리될 수 있다. 이와 같은 방법을 이용하면 장시간이 요구되는 재조합벡터를 제작하지 않아도 쉽고 간편하게 약물, 단백질, 기타 나노입자를 세포 내로 도입시킬 수 있어 목적하는 치료효과를 용이하게 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 항암제, 항염제, 골흡수 억제제, 항암성 단백질, 항염 단백질, 면역증강 단백질, 항암 및 항염 siRNA, 올리고 뉴클레오타이드 및 이들을 함유하는 나노 자성 입자 등을 포함한다. 여기서 siRNA는 타겟 RNA의 발현을 사일런싱하는 RNA를 의미하는데, 타겟 RNA는 질병을 유발하는 유전자, 특히 종양이나 염증을 유발하는 유전자에서 전사된 mRNA로서 일례로 암 유발 유전자는 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 유전자를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이때 상기 종양 또는 염증질환 단백질은 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), B-cell 루케미아/림포마 2(B-cell leukemia/lymphoma 2, BCL2), 표피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 인간 표피 성장인자 수용체(human epidermal growth factor receptor 2, HER2), 야누스 카이네이즈(Janus kinase, JAN) 및 포스파티딜리노시톨-3-카이네이즈/Akt 카이네이즈(phosphatidylinositol-3-kinase/Akt kinase, PI3-K/AKT)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체를 포함하는 질병의 진단 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 즉, 암 질환 등의 치료용 약학적 조성물로 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드를 형광표지자인 FITC로 표지하고 이들을 정상세포와 종양세포에 대해 적용한 결과, 종양세포에서의 형광도가 증가하고 정상세포에서는 형광도가 적용하기 전과 동일한 것을 확인하였다. 이는 종양세포 표면의 효소에 의해 스페이서가 분해되고 이에 따라 형광표지된 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드가 해리되어 종양세포로 투과되어 들어간 반면, 정상세포에서는 효소가 미미하게 존재하여 스페이서를 분해하기 어려우므로 펩타이드의 투과력이 발휘되지 못한 결과이다. 또한 이러한 펩타이드의 말단에 종양억제 단백질을 결합시킨 결과 정상세포의 세포성장에는 영향을 주지 않는 반면, 종양세포의 성장은 억제함을 보였다. 또한 본 발명에 따른 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물의 유효저해농도 (IC50)를 측정하기 위하여 MTT 검사법을 실시한 결과, 5×10-9M의 낮은 농도에서도 세포 독성을 나타내었다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료학적 또는 예방학적 유효양으로 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 약학적 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 약물로서 항암성 단백질인 젤로닌(Gelonin)만을 예시하였으나, 기타 다른 항암단백질, 암 유발 유전자의 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA 등 및 이들이 함유된 입자를 사용할 경우에도 종양치료에 있어 유사 또는 동일한 효과를 얻을 수 있으며, 항염증 치료와 관련해서도 약물로서 항염물질, 항염단백질 등을 사용하여 항염효과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드의 제조
N 말단으로부터 순서대로 마스킹도메인으로서 EEEEEEE(서열번호 27), 스페이서로서 MMP에 분해되는 서열인 PLGLAG(서열번호 25), PTD로서 LMWP를 함유하도록 펩타이드 합성장치를 이용하여 하기와 같은 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드를 F-moc 고상 화학합성 방법으로 합성하였다.
NH2-EEEEEEEPLGLAG-VSRRRRRRGGRRRR-C-COONH2 (서열번호 28)
합성된 펩타이드 서열은 레진으로부터 절단시켜 세척과정을 거쳐 동결건조 후 액체크로마토그래피에 의해 분리, 정제되었다. 정제된 펩타이드는 MALDI분석을 이용하여 분자량을 확인하였다.
실시예 2: 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체의 제조
실시예 1에서 제조된 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드에 시스테인이 함유되어 있어 자유 설프하이드릴(free-sulfhydryl)기가 존재하므로, 이를 화학 가교제로 이용하여 항암단백질인 젤로닌(Gelonin)과의 화학적 결합을 유도하였다.
젤로닌 표면의 개질은 표면의 카르복실기에 티올(thiol)기를 붙인 형태로 제작하였다. 상기 1분자의 입자표면-SH당 10분자의 펩타이드-SH를 넣어 4℃에서 12시간 반응시킨 후, 한외여과(ultrafiltration)를 통하여 결합되지 않은 분자들을 걸러낸 다음, 동결건조하여 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-젤로닌 복합체를 수득하였다.
실시예 3: 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드의 종양 세포내 투과력
실시예 1에서 제조된 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드의 세포선택적 투과력을 시험하기 위해 제조된 펩타이드의 C 말단에 FITC로 형광 표지하고, 이들을 정상세포주(ATCC) 및 종양세포주(CT-26, KCLB(한국세포주은행, Korea cell line bank) 80009)에 접종하였다.
접종한 다음 1시간 후 세포의 형광도를 FACS를 이용하여 측정하였는데, 그 결과는 도 2에 나타난 바와 같이 종양세포에서 세포의 형광도가 증가함이 관찰되었다. 도 2에서 ⓐ는 정상세포주의 형광도를 나타내며, ⓑ는 종양세포주의 형광도를 나타낸다.
또한, 세포 내 펩타이드 투과도를 공초점 주사형광 현미경(confocal laser scanning microscope)으로 관찰하였는데, 염색 부위가 세포임을 증명하기 위하여 세포핵을 염색시키는 Hoechst 33342(5㎍/㎖)로 염색한 후, 10% 중성 포르말린 용액으로 세포를 고정하였다. 그 결과는 도 3에 나타난 바와 같이, 종양세포주에서는 세포주 내 형광표지된 펩타이드가 관찰된 반면, 정상세포주에서는 이와 같은 현상이 관찰되지 않았다. 도 3에서 (a)는 종양세포주 군에서의 펩타이드 세포 투과도를 나타내고, 하단의 (b)는 정상세포주 군에서의 펩타이드 세포 투과도를 나타낸다.
상기의 실험결과는 종양세포 표면에서는 종양세포 표면효소 (MMP)에 특이적인 절단부위인 PLGLAG 펩타이드 서열(서열번호 25)을 가지는 스페이서가 상기 효소의 작용에 의해 분해되면서, 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드의 단백질 수송 도메인(PTD)을 이온결합하여 가리고 있는 마스킹 도메인(EEEEEEE: 서열번호 27)이 해리되고 이에 단백질 수송 도메인(PTD)인 LMWP이 세포 내로 원활히 도입된 반면, 정상세포에서는 효소에 의한 스페이서 분해가 일어나지 않아 같은 펩타이드가 처리되더라도 도입이 억제되었음을 나타낸다.
실시예 4: 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-항암단백질의 종양 세포 내 투과력
상기 실시예 2에서 제조된 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-항암단백질 복합체를 정상세포주(ATCC) 및 종양세포주(CT-26, KCLB(한국세포주은행, Korea cell line bank) 80009)에 접종하였다. 접종한 다음 1시간 후, 세포 내로의 펩타이드-Gelonin의 투과도를 공초점 주사형광 현미경(confocal laser scanning microscope)으로 관찰하였다 (도 4). 이때, 염색 부위가 세포임을 증명하기 위하여 세포핵을 염색시키는 Hoechst 33342(5㎍/㎖)로 염색한 후, 10% 중성 포르말린 용액으로 세포를 고정하였다.
그 결과, 종양세포주에서 도 5에 나타난 바와 같이 상기 펩타이드-젤로닌(Gelonin) 복합체가 처리된 경우 세포의 형광도가 증가하였고, 공초점 주사형광 현미경하에서도 세포 내로 형광표지된 복합체가 관찰된 반면, 정상세포에서는 이와 같은 현상이 관찰되지 않았다.
상기의 실험결과 역시 종양세포 표면에서는 스페이서가 상기 효소의 작용에 의해 분해되면서, 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드의 단백질 수송 도메인(PTD)인 LMWP를 이온결합하여 가리고 있는 마스킹 도메인이 해리되고 이에 단백질 수송 도메인(PTD)이 세포 내로 원활히 도입된 반면, 정상세포에서는 효소에 의한 스페이서 분해가 일어나지 않아 같은 펩타이드가 처리되더라도 도입이 억제되었음을 나타낸다.
실시예 5: 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-항암단백질 복합체의 유효 저해농도(IC50) 측정
상기 실시예 2에서 제조한 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체의 유효 저해농도(IC50)를 측정하기 위하여, 세포의 색소 환원능력 실험(MTT 검사법)를 실시하였다. MTT 검사법은 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리엄(tetrazolium)을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포마즌(formazan)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다.
쥐의 정상섬유아세포 및 쥐의 대장암 세포(CT-26, KCLB(한국세포주은행, Korea cell line bank) 80009)를 배양한 후, 각 세포군에 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-Gelonin 복합체를 다양한 농도로 넣어 주었다. 24시간 후, MTT 시약 3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT)을 넣어 37℃에서 4시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고 MTT 시약과 동량의 DMSO를 넣어 540㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 정상세포군에서는 상기 적용한 복합체에 의해 세포독성을 나타내지 않는데 비해, 종양세포군에서는 상기 펩타이드 복합체를 처리한 경우 현저한 세포 독성을 나타내었으며, 유효 저해농도(IC50)는 대략 5 x 10-9M로 측정되었다. 도 6에서 ①은 정상세포군에서의 세포 성장력을 나타내고, ② 및 ③은 2회 실험한 결과로 종양세포주(CT-26)에서의 세포성장력을 나타낸다.
상기의 실험결과는 종양세포군에서 선택적으로 투과기능성 펩타이드의 활성이 회복되고 이로 인하여 투과기능성 펩타이드-항암단백질 복합체가 세포 내 도입되어 낮은 농도에서도 유효한 항암력을 나타내는 것임을 나타낸다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체는 기존의 비특이적이고 비선택적인 펩타이드 수송체에서 탈피하여 높은 안전성을 보이고, 최적의 표적 지향화를 통해 진단 및 약물 치료 요법의 효과를 극대화하며, 부작용을 최소화할 수 있다. 결국 본 발명은 표적세포 특이적인 투과기능성을 가지는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체를 포함한 질병 진단 및 치료용 약학조성물을 제공함으로써 혁신적인 질병 진단 및 치료기술을 제시할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (15)

  1. 다음을 포함하는 표적 선택적 세포/조직 투과성 펩타이드(TACTICS):
    (a) 단백질 수송 도메인(PTD);
    (b) 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 이온결합하는 마스킹 도메인; 및
    (c) 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 마스킹 도메인을 연결하며, 표적세포/조직 효소 특이적인 절단부위를 가지는 스페이서(spacer).
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)은 D-형 또는 L-형의 아미노산으로 구성되며, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산을 70~80%의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)은 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP), TAT, 페너트라틴(Penetratin), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리라이신(polylysine), 프로타민(protamine)절편, VP22 펩타이드, UL-56 펩타이드, mph-1-btm 및 안테나페디아(Antennapedia, ANTP)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 펩타이드 또는 이의 유사체인 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 이온결합하는 마스킹 도메인은 D-형 또는 L-형의 아미노산으로 구성되며, 음이온성 아미노산을 70~100%의 함량으로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 음이온성 아미노산은 글루타민산 또는 아스파틱산을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 마스킹 도메인은 4~8개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 스페이서는 전립선암 표면효소, 칼리크레인 14(Kallikrein 14, KLK14), 카텝신(Cathepsin) 및 기질금속단백분해효소(matrix metalloprotease, MMP)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 효소에 의해 절단되는 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 스페이서는 서열번호 6(CHSSKLQG), 서열번호 7(LRLSSYYM), 서열번호 8(SSQPWQ), 서열번호 9(RRFLCG), 서열번호 10(THDNDL), 서열번호 11(VRPIE), 서열번호 12(VSGWGT), 서열번호 13(YPAS), 서열번호 14(TITPGM), 서열번호 15(QGRAMC), 서열번호 16(GPRAMC), 서열번호 17(QRRAMC), 서열번호 18(GGRAMC), 서열번호 19(VLKAMC), 서열번호 20(LGRAMC), 서열번호 21(QARAMC), 서열번호 22(VPRAMC), 서열번호 23(PFRAMC), 서열번호 24(FSRAMC), 서열번호 25(PLGLAG) 및 서열번호 26(SGRSA)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드와 약물 또는 약물함유입자가 결합된 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드의 단백질 수송 도메인(PTD)에 약물 또는 약물함유입자가 결합된 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질 수송 도메인(PTD)과 약물 또는 약물함유입자는 시스테인으로 연결된 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체.
  12. 제9항에 있어서, 상기 결합은 1,4-비스-말레이미도부탄 (1,4-bis-maleimidobutane, BMB), 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜 (1,11-bis-maleimidotetraethyleneglycol, BM[PEO]4), 1-에틸-3-[3-디메틸 아미노프로필] 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl] carbodiimide hydrochloride, EDC), 숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카복시-[6-아미도카프로에이트]](succinimidyl-4-[N-maleimidomethylcyclohexane-1-carboxy-[6-amidocaproate]], SMCC) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMCC), 숙시미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)-로피오나미도] 헥사노에이트](succimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)-ropionamido] hexanoate, SPDP) 및 그의 설폰화염(sulfo-SPDP), m-말레이미도벤조일-N-하이드로시숙시니미드 에스터(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS) 및 그의 설폰화염(sulfo-MBS), 및 숙시미딜[4-(p-말레이미도페닐) 부틸레이트](succimidyl[4-(p-maleimidophenyl) butyrate], SMPB) 및 그의 설폰화염(sulfo-SMPB)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 가교제에 의한 것임을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체.
  13. 제9항에 있어서, 상기 약물은 항암제, 항암성 단백질, 항염제, 항염 단백질, 면역증강단백질, 골흡수 억제제, 종양 또는 염증질환 단백질의 RNA를 타겟으로 하는 안티센스올리고뉴클레오티드 및 종양 또는 염증질환 단백질의 RNA를 타겟으로 하는 siRNA로 구성되는 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 종양 또는 염증질환 단백질은 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), B-cell 루케미아/림포마 2(B-cell leukemia/lymphoma 2, BCL2), 표피 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 인간 표피 성장인자 수용체(human epidermal growth factor receptor 2, HER2), 야누스 카이네이즈(Janus kinase, JAN) 및 포스파티딜리노시톨-3-카이네이즈/Akt 카이네이즈(phosphatidylinositol-3-kinase/Akt kinase, PI3-K/AKT)로 구성된 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체.
  15. 제13항의 표적 선택적 세포/조직 투과기능성 펩타이드-약물 복합체를 포함하는 암 질환의 치료용 약학적 조성물.
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