KR102068295B1 - 암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템 - Google Patents

암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR102068295B1
KR102068295B1 KR1020170180296A KR20170180296A KR102068295B1 KR 102068295 B1 KR102068295 B1 KR 102068295B1 KR 1020170180296 A KR1020170180296 A KR 1020170180296A KR 20170180296 A KR20170180296 A KR 20170180296A KR 102068295 B1 KR102068295 B1 KR 102068295B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
glycero
cancer
lipid
anticancer agent
Prior art date
Application number
KR1020170180296A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190078409A (ko
Inventor
성하수
김소연
남재현
Original Assignee
한국화학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국화학연구원 filed Critical 한국화학연구원
Priority to KR1020170180296A priority Critical patent/KR102068295B1/ko
Publication of KR20190078409A publication Critical patent/KR20190078409A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102068295B1 publication Critical patent/KR102068295B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A61K9/1278—Post-loading, e.g. by ion or pH gradient

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템에 관한 것으로, 본 발명의 일 측면에 따라 제공되는 약물전달시스템은, 질병 세포의 수용체를 표적하는 리간드가 약물전달체의 말단부에 결합된 종래의 약물전달시스템에 비해, 상대적으로 표적 세포에 도달하는 전달체의 양과, 표적 세포에 도달한 후 세포 내로 투과되는 약물의 양이 많아 암 치료 효율이 개선되는 효과가 있다.

Description

암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템{Cancer microenvironment-sensitive combinatorial drug delivery system containing a new lipid-peptide-polymer conjugate as a substrate of cancer-overexpressing enzyme}
암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템에 관한 것이다.
난치암 치료의 어려움은 항암제에 대한 내성의 발생, 분자표적 약물의 부재 및 분자수준의 병인 해석의 부재 등 매우 복잡하고 다양한 요인들에 기인한다. 이러한 문제를 극복하기 위해 암 세포의 신호전달의 다중의 경로를 표적할 수 있도록 다수의 분자표적 약물을 사용하는 등의 약물 복합요법이 연구되고 있다.
상승효과를 나타내는 약물이 세포 수준에서 스크리닝되고 그 기전이 제시되더라도 임상 적용에 필요한 가교 연구(translational research)를 위해서는 각각의 약물의 약동력학 특성의 차이를 극복할 수 있는 전달시스템 즉, 두 가지 이상의 약물을 하나의 전달체에 봉입시켜 전달하는 것이 가능해야 한다.
두 가지 이상의 약물을 봉입시킬 수 있는 다양한 전달체가 개발되고 있으며, 리포솜이나 폴리머솜은 구조적 특성으로 인해 내부 코어(core)에 친수성 약물을 봉입시키고 쉘(shell) 층에 소수성 약물을 봉입시킬 수 있는 전달체이다(비특허문헌 1).
리포솜 또는 고분자 나노입자 등의 약물전달체는 전신 순환계를 거치는 동안 세망내피계의 기관에 의한 소실이 일어나며, 이는 전달체에 단백질이 흡착하여 옵소닌화되어 세망내피계에 잘 인식되기 때문이다. 따라서, 약물전달체가 세망내피계를 회피할 수 있도록 그 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG, Polyethylene glycol)과 같은 친수성 고분자를 도입시켜 단백질의 흡착을 억제하는 시스템이 혈중 장기 순환형(long-circulating) 전달체로 이용되어 왔다.
PEG와 같은 친수성 고분자는 입체적으로 안정화된 전달체(sterically stabilized carrier)의 제조를 가능하게 하여 약물의 혈중 순환을 연장 시키는 등 많은 장점을 가지나, 표적 조직에 도달된 후 전달체와 표적 세포와의 상호작용을 어렵게 할 수 있다.
약물의 체외소실을 억제하고 약효를 극대화하며 정상세포에 대한 독성을 최소화하기 위해서는 혈중 순환계에서 충분한 안정성을 가지면서 표적 세포와 특이적으로 상호작용할 수 있는 전달체가 절실히 요구되며, 이러한 특성을 갖는 전달체에 요구되는 새로운 물질이 필요하다.
즉, 약물전달체의 능동적인 표적화(active targeting)를 위해, 비특허문헌 1과 같이 질병 세포 표면의 수용체를 표적하는 리간드(folate 등)를 대부분 약물전달체의 말단부(distal end)에 결합시키는 방법을 이용하고 있으나, 약물전달체의 질병 세포로의 특이적 전달과 약효 발현의 극대화를 위해서는 세포투과 펩티드 및 질병 세포 표적화 리간드가 정상 조직 및 세포에서는 보호(shielding)되고 병소에서는 비-보호(de-shielding)되어 활성화되는 약물전달체가 요구된다.
Sci Signal. 2014 May 13;7(325):ra44.
본 발명의 일 측면의 목적은,
세포투과 펩티드, 암 과발현효소 분해성 펩티드 및 전달체 보호용 친수성 고분자가 표면에 결합된 리포솜 기반 항암제 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면의 목적은,
상기 항암제 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면의 목적은,
세포투과 펩티드, 암 과발현효소 분해성 펩티드 및 전달체 보호용 친수성 고분자가 표면에 결합되고, 친수성 영역에 친수성 항암제가 봉입되고, 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된 항암제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면의 목적은,
상기 항암제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 일 측면의 목적은,
지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면의 목적은,
상기 지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에 따라,
리포솜;
상기 리포솜 표면에 결합된 세포투과 펩티드;
상기 세포투과 펩티드에 결합된 암 과발현효소 분해성 펩티드; 및
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드에 결합된 전달체 보호용 친수성 고분자를 포함하는 항암제 전달체가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따라,
용매에 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계;
상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계;
지질막을 수화시켜, 리포솜을 형성시키는 단계; 및
제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계; 를 포함하는 항암제 전달체의 제조방법이 제공된다.
나아가, 본 발명의 또 다른 측면에 따라,
리포솜;
상기 리포솜 표면에 결합된 세포투과 펩티드;
상기 세포투과 펩티드에 결합된 암 과발현효소 분해성 펩티드; 및
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드에 결합된 전달체 보호용 친수성 고분자를 포함하는 항암제 전달체의 친수성 영역에 친수성 항암제가 봉입되고, 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된 항암제가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따라,
용매에 소수성 항암제 및 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계;
상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계;
암모늄 설페이트를 포함하는 용액으로 지질막을 수화시켜, 친수성 영역에 암모늄 설페이트가 봉입되고 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된 리포솜을 형성시키는 단계;
제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계; 및
친수성 항암제를 포함하는 용액을 첨가하여, 상기 리포솜의 친수성 영역에 친수성 항암제를 봉입하는 단계; 를 포함하는 항암제의 제조방법이 제공된다.
나아가, 본 발명의 또 다른 측면에 따라,
지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트가 제공된다.
또한, 본 발명의 다른 측면에 따라,
지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 일 측면에 따라 제공되는 약물전달시스템은, 질병 세포의 수용체를 표적하는 리간드가 약물전달체의 말단부에 결합된 종래의 약물전달시스템에 비해, 상대적으로 표적 세포에 도달하는 전달체의 양과, 표적 세포에 도달한 후 세포 내로 투과되는 약물의 양이 많아 암 치료 효율이 개선되는 효과가 있다.
도 1a 내지 1c는 MCF-7 세포에 대한 펩티드 컨쥬게이트의 cellular uptake의 형광현미경 관찰 결과를 나타내며, 도 1a 내지 1c에서 (1) 내지 (10)은 다음을 의미한다: (1) No treatment control, (2) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 5 uM로 처리 (3) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 10 uM로 처리 (4) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 20 uM로 처리, (5) 활성화 MMP-9으로 처리한 Control-1 펩티드를 10 uM로 처리, (6) 활성화 MMP-9으로 처리한 Control-1 펩티드를 20 uM로 처리, (7) Control-2 펩티드를 10 uM로 세포에 직접 처리, (8) Control-2 펩티드를 20 uM로 세포에 직접 처리, (9) CPP-M-CPP-FITC를 10 uM로 세포에 직접 처리 및 (10) CPP-M-CPP-FITC를 20 uM로 세포에 직접 처리.
도 2a 내지 2c는 MDA-MB-231 세포에 대한 펩티드 컨쥬게이트의 cellular uptake의 형광현미경 관찰 결과를 나타내며, 도 2a 내지 2c에서 (1) 내지 (10)은 다음을 의미한다: (1) No treatment control, (2) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 5 uM로 처리 (3) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 10 uM로 처리 (4) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 20uM로 처리, (5) 활성화 MMP-9으로 처리한 Control-1 펩티드를 10 uM로 처리, (6) 활성화 MMP-9으로 처리한Control-1 펩티드를 20 uM로 처리, (7) Control-2 펩티드를 10 uM로 세포에 직접 처리, (8) Control-2 펩티드를 20 uM로 세포에 직접 처리, (9) CPP-M-CPP-FITC를 10 uM로 세포에 직접 처리 및 (10) CPP-M-CPP-FITC를 20 uM로 세포에 직접 처리.
도 3a는 MDA-MB-231에 대한 ERL과 DOX 복합 약물 처리 프로토콜에 따른 세포 생존능을 나타낸다. (약물 처리 농도 10 uM)
도 3b는 MDA-MB-231에 대한 ERL과 DOX 복합 약물 처리 프로토콜에 따른 세포 생존능을 나타낸다. (약물 처리 농도 20 uM)
도 4a는 MDA-MB-468에 대한 ERL과 DOX 복합 약물 처리 프로토콜에 따른 세포 생존능을 나타낸다. (약물 처리 농도 10 uM)
도 4b는 MDA-MB-468에 대한 ERL과 DOX 복합 약물 처리 프로토콜에 따른 세포 생존능을 나타낸다. (약물 처리 농도 20 uM)
도 5a는 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을, MDA-MB-231 세포에 각각 처리한 경우 관찰되는 세포 생존능을 나타낸다. (인큐베이션 시간: 48시간)
도 5b는 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을, MDA-MB-231 세포에 각각 처리한 경우 관찰되는 세포 생존능을 나타낸다. (인큐베이션 시간: 72시간)
도 6a는 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을, MCF-7 세포에 각각 처리한 경우 관찰되는 세포 생존능을 나타낸다. (인큐베이션 시간: 48시간)
도 6b는 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을, MCF-7 세포에 각각 처리한 경우 관찰되는 세포 생존능을 나타낸다. (인큐베이션 시간: 72시간)
도 7a 내지 7c는 이종 약물 봉입된 실시예 (F2), 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3), 비교예 3 (F4), 및 비교예 4 (F5)의 리포솜으로 처리한 MDA-MB-231 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 8c는 이종 약물 봉입된 실시예 (F2), 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3), 비교예 3 (F4), 및 비교예 4 (F5)의 리포솜으로 처리한 MDA-MB-468 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 9e는 이종 약물 봉입된 실시예 1 (F2), 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3), 및 비교예 3 (F4)의 리포솜으로 처리한 MDA-MB-231 세포의 CFSM 분석 결과를 나타내며, 각 이미지에서 좌측 상단은 (blue; DAPI), 우측 상단은 (red; doxorubicin) 및 좌측 하단은 (merged image)); (A) free DOX, (B) 비교예 1 (F1), (C) 실시예 1 (F2), (D) 비교예 2 (F3), 및 (E) 비교예 3 (F4) 이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은,
리포솜;
상기 리포솜 표면에 결합된 세포투과 펩티드;
상기 세포투과 펩티드에 결합된 암 과발현효소 분해성 펩티드; 및
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드에 결합된 전달체 보호용 친수성 고분자를 포함하는 항암제 전달체를 제공한다.
이때, 상기 세포투과 펩티드는 암세포를 투과할 수 있는 펩티드라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예를 들면 다음과 같다:
서열번호 1(lclrpv): D-form, 서열번호 2(SIWV), 서열번호 3(ASIW), 서열번호 4(WVGH), 서열번호 5(IWVG), 서열번호 6(VGHR), 서열번호 7(GHRG), 서열번호 8(MASI) 등.
또한, 상기 암 과발현효소 분해성 펩티드는 표적세포/조직 효소 특이적인 절단부위를 갖는 스페이서(spacer)로서, 암이 발현시키는 효소에 의해 절단되는 펩티드라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예를 들면 다음과 같다:
서열번호 9(GGGGPLGLAGG), 서열번호 10(CHSSKLQG), 서열번호 11(LRLSSYYM), 서열번호 12(SSQPWQ), 서열번호 13(RRFLCG), 서열번호 14(THDNDL), 서열번호 15(VRPIE), 서열번호 16(VSGWGT), 서열번호 17(YPAS), 서열번호 18(TITPGM), 서열번호 19(QGRAMC), 서열번호 20(GPRAMC), 서열번호 21(QRRAMC), 서열번호 22(GGRAMC), 서열번호 23(VLKAMC), 서열번호 24(LGRAMC), 서열번호 25(QARAMC), 서열번호 26(VPRAMC), 서열번호 27(PFRAMC), 서열번호 28(FSRAMC), 서열번호 29(PLGLAG) 및 서열번호 30(SGRSA).
나아가, 상기 전달체 보호용 친수성 고분자는, 생체 내 세망내피계의 기관에 의한 소실로부터 전달체를 보호할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예를 들면 다음과 같다:
폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 헤파린(heparin), 히알루론산(hyaluronic acid), 혈청 알부민(serum albumin), 키토산(chitoxan) 등.
만약, 친수성 고분자로서 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 사용할 경우, 상기 폴리에틸렌글리콜의 수평균분자량은 200 내지 10,000 범위일 수 있고, 500 내지 10,000 범위일 수 있고, 800 내지 10,000 범위일 수 있고, 1,000 내지 10,000 범위일 수 있고, 1,500 내지 10,000 범위일 수 있고, 2,000 내지 10,000 범위일 수 있고, 200 내지 8,000 범위일 수 있고, 200 내지 6,000 범위일 수 있고, 200 내지 4,000 범위일 수 있고, 200 내지 2,000 범위일 수 있고, 200 내지 1,000 범위일 수 있고, 200 내지 800 범위일 수 있고, 200 내지 600 범위일 수 있고, 1,000 내지 8,000 범위일 수 있고, 1,500 내지 6,000 범위일 수 있고, 2,000 내지 4,000 범위일 수 있으나, 생체 내 세망내피계의 기관에 의한 소실로부터 전달체를 보호할 수 있는 수평균분자량 값이라면 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 리포솜은 수용액에서 인지질의 이중층이 속이 비어있는 구형의 구조를 이룬 것을 의미하며, 리포솜은 수상의 내부 공간에 친수성 약물을 봉입시키거나, 인지질의 이중층에 소수성 약물을 봉입시킬 수 있는 장점으로 인해 다양한 약물의 전달체로서 사용되어 왔으나, 일반적인 리포솜은 체내의 세망내피계에 의해 쉽게 포획되기 때문에 리포솜에 봉입시킨 약물이 병변에 도달하기 전에 쉽게 체외 소실되는 단점이 있다.
이러한 문제의 해결을 위해 리포솜의 표면에 세망내피계를 회피하는데 유리한 친수성 고분자의 한 종류인 PEG를 도입한 PEGylated 리포솜 (소위, stealth liposome or sterically stabilized liposome)이 개발되었으며, PEGylated 리포솜은 체내 순환계에서 리포솜이 장시간 동안 순환할 수 있도록 함으로써 리포솜에 봉입된 약물의 혈중 반감기를 연장시킬 수 있다. PEGylated 리포솜의 이러한 장점을 이용하여 리포솜의 내부 친수성 영역에 항암제, 예를 들어 독소루비신 (doxorubicin, DOX)과 같은 약물을 봉입시켜 혈중 장시간 순환 항암제로 개발한 DOXIL®은 PEGylated 리포솜의 대표적인 응용 사례이다. 이러한 PEGylated 리포솜은 암이나 염증 조직이 정상 조직에 비해 느슨한 구조를 가짐으로 인해 선택적으로 투과되는 EPR 효과 (Enhanced Permeability and Retention effect)에 의해 암이나 염증 조직에 축적된다. 비록, PEGylated 리포솜은 약물을 병변 조직으로 축적시키는 장점이 있지만, PEGylated 리포솜은 PEG 분자의 높은 친수성으로 인해 세포와의 융합 또는 세포 내 이입 (cellular uptake)에 장애요인이 되기도 한다. 또한, 약물 및 전달체의 세포 내 이입을 증진시키기 위해서 세포투과 펩티드의 표적선택성과 암세포 표적화 리간드의 선택성 향상이 요구된다.
상기 본 발명의 일 측면에서 제공되는,
리포솜;
상기 리포솜 표면에 결합된 세포투과 펩티드;
상기 세포투과 펩티드에 결합된 암 과발현효소 분해성 펩티드; 및
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드에 결합된 전달체 보호용 친수성 고분자를 포함하는 항암제 전달체는,
상기 PEGylated 리포솜이 세포와의 융합 또는 세포 내 이입이 낮은 단점의 극복이 가능하다.
보다 구체적으로,
암 또는 염증 조직에서 특이적으로 분비되는 효소에 의해 상기 암 과발현효소 분해성 펩티드-친수성 고분자 컨쥬게이트가 분리되고, 친수성 고분자가 분리된 후 리포솜의 표면에 세포투과 펩티드 (CPP) (또는, 암세포 표적화 리간드 (TL))가 드러남으로써, 세포 내 이입 효율이 현저히 증가할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공되는 항암제 전달체는 표면에 표적화 리간드 (targeting ligand, TL)를 더 포함할 수 있다. 표적화 리간드란 암세포 또는 암 미세환경의 세포가 정상 세포에 비해 과발현하는 수용체(receptor)를 표적하는 리간드(ligand)를 의미한다. 일반적으로, 암세포에 folate 수용체가 과발현되는 것으로 알려져 있어, folate를 표적화 리간드로 사용할 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 DSPE-PEG-folate를 사용하였다. (DSPE-PEG = 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(polyethylene glycol)). 또한, 암세포의 인테그린 (integrin)을 표적하는 펩티드인 RGD (arginine-glycine-aspartic acid) 펩티드, NGR (asparagine-glycine-arginine) 펩티드, cyclic RGD 펩티드, cyclic NGR 펩티드 등을 비롯하여 다양한 TL들을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은,
용매에 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계;
상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계;
지질막을 수화시켜, 리포솜을 형성시키는 단계; 및
제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계; 를 포함하는 항암제 전달체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제 전달체의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 1: 용매에 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 1은 용매에 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계이다.
이때, 상기 용매는 지질을 용해시킬 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 클로로포름 등을 단독으로 사용하거나 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 제1지질은 리포솜 제조에 사용하는 지질로 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예로는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 수소화 L-α-포스파티딜콜린(대두)(L-α-Phosphatidylcholine, hydrogenated(Soy), HSPC), 1,2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000)(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(methoxy(polyethylene glycol)-2000), DSPE-mPEG), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG), 팔미트산(palmitic acid) 등이 있다.
단계 2: 상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 2는 상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계이다.
이때, 대부분의 용매를 제거하기 위하여 공지된 건조 방법을 사용할 수 있다. 용매를 제거하기 위한 건조 조건으로 온도와 시간의 몇 가지 구체예로는 다음과 같다.
건조 온도로는 10 내지 70℃ 범위일 수 있고, 20 내지 70℃ 범위일 수 있고, 30 내지 70℃ 범위일 수 있고, 40 내지 70℃ 범위일 수 있고, 10 내지 60℃ 범위일 수 있고, 10 내지 50℃ 범위일 수 있고, 10 내지 40℃ 범위일 수 있고, 20 내지 60℃ 범위일 수 있고, 30 내지 50℃ 범위일 수 있고, 40℃ 일 수 있다. 건조 온도가 10℃ 미만일 경우 용매를 건조시키는데 오랜 시간이 걸리는 문제가 있고, 건조 온도가 70℃ 초과일 경우 불필요한 과량의 에너지 사용과 시료에 변성이 생기는 문제가 있다.
건조 시간으로는 1 내지 40시간 범위일 수 있고, 5 내지 40시간 범위일 수 있고, 10 내지 40시간 범위일 수 있고, 15 내지 40시간 범위일 수 있고, 20 내지 40시간 범위일 수 있고, 25 내지 40시간 범위일 수 있고, 1 내지 35시간 범위일 수 있고, 1 내지 30시간 범위일 수 있고, 1 내지 25시간 범위일 수 있고, 15 내지 35시간 범위일 수 있고, 20 내지 30시간 범위일 수 있고, 하루 동안 수행할 수 있다. 건조 시간이 1시간 미만일 경우 용매의 충분한 건조가 불가능한 문제가 있고, 건조 시간이 40시간 초과일 경우 불필요하게 긴 시간 동안 건조를 수행하는 문제가 있다.
단계 3: 지질막을 수화시켜, 리포솜을 형성시키는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 3은 지질막을 수화시켜, 리포솜을 형성시키는 단계이며, 본 단계는 지질막-수화법(lipid film-hydration method)에 해당한다.
지질막을 수화시키기 위한 용액은 지질막을 수화시킬 수 있는 것이면 제한 없이 사용 가능하며, 한가지 예시로 물을 사용할 수 있다.
단계 4: 제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제 전달체의 제조방법에 있어서, 단계 4는 제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계이다.
이때, 상기 제2지질은 리포솜 제조에 사용하는 지질로 공지된 것으로서 펩티드와 결합이 가능한 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예로는 콜레스테롤, 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid),1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine, DPPS), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG) 등이 있다.
또한, 상기 세포투과 펩티드는 암세포를 투과할 수 있는 펩티드라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예는 상술한 바와 같다. 세포투과 펩티드는 protein transduction domain (PTD) 라고도 불리며, TAT 펩티드(GRKKRRQRRRPQ)가 대표적인 예이다. 세포투과 펩티드는 거대분자 물질(단백질, 유전자 등)에 결합시켜 세포 내로 이입시키는데 이용된다. 최근 특이성(specificity)을 갖는 세포투과 펩티드가 보고되고 있으나, 이들은 일반적으로 특이성이 높지 않고, 세포독성을 나타내는 문제가 있다. 하지만, 본 발명의 일 측면에서 제공되는 서열번호 1의 세포투과 펩티드는 암 과발현효소 분해성 펩티드 및 친수성 고분자와 결합되어 암 조직/세포에서 활성화됨으로써 특이성이 높고 정상 세포에 대한 세포독성이 없어 상술한 문제점이 극복 가능하다.
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드(Cancer-overexpressing enzyme-cleavable peptide, M)는 암세포 또는 암의 기질 세포에서 과발현되는 다양한 효소들에 의해 절단/분해되는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예는 상술한 바와 같다. 이때, 상기 암 과발현효소의 몇 가지 예로는 다음과 같다: 전립선암 표면효소, 칼리크레인 14(Kallikrein 14, KLK14), 카텝신(Cathepsin), 기질금속단백분해효소(matrix metalloprotease, MMP).
또한, 전달체 보호용 친수성 고분자는 생체 내 세망내피계의 기관에 의한 소실로부터 전달체를 보호할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예는 상술한 바와 같다. 폴리에틸렌글리콜 (Polyethylene glycol; PEG)과 같은 친수성 고분자는 전달체의 표면에 위치하여 혈액 중의 단백질이 흡착하는 것을 방지하여 전달체가 세망내피계에 흡수되는 것을 방지할 수 있다. PEG는 PLA (Polylactic acid)-PEG 마이셀(micelle), PEGylated 리포솜(liposome) 및 다양한 약물전달체에서 친수성 쉘(hydrophilic shell)을 형성할 수 있고, 또한, PEG는 단백질 약물-PEG 결합체 (예, PEGASYS (Genentech사): peginterferon alfa-2a)에서 단백질 약물을 단백질 분해효소로부터 보호하여 안정성을 증진시키는 쉘(shell)을 형성할 수 있다. 체 순환계에서 약물 또는 전달체를 보호하고 면역계를 회피할 수 있도록 하는 등 많은 장점에도 불구하고, 병소에 전달된 약물이나 전달체 표면에 존재하는 친수성 고분자, 즉, PEG 등은 약물 또는 전달체와 병변 조직의 세포와의 상호작용(interaction)을 저해하는 요인이 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은,
리포솜;
상기 리포솜 표면에 결합된 세포투과 펩티드;
상기 세포투과 펩티드에 결합된 암 과발현효소 분해성 펩티드; 및
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드에 결합된 전달체 보호용 친수성 고분자를 포함하는 항암제 전달체의 친수성 영역에 친수성 항암제가 봉입되고, 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된 항암제를 제공한다.
이때, 상기 친수성 항암제(즉, DNA 손상 화학요법제)는 독소루비신(doxorubicin, DOX), 다우노루비신(daunorubicin), 아루고마이신(arugomycin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin) 또는 다이네마이신(dynemicin)과 같은 엔다이엔계(ene-dyene) 항생제를 포함하는 안트라사이클린계(anthracycline) DNA 삽입제들, 캄토테신(camptothecin), 이리노테칸(irinotecan) 또는 토포테칸(topotecan)을 포함하는 세포독성 퀴놀론계(quinolone) 알칼로이드와 같은 DNA 효소 토포이소머라제(topoisomerase) I 저해제들, 및 카무스틴(carmustine, BCNU) 또는 시스플라틴(cis-platin)과 같은 DNA 알킬화제들일 수 있다.
또한, 상기 소수성 항암제(EGFR 경로 억제제)는 엘로티닙(erlotinib, ERL), 게피티닙(gefitinib), 라파티닙(lapatinib), 트라스쥬맙(trastuzumab) 또는 다른 화합물로서 EGFR들을 표적하는 화합물; 수니티닙(sunitinib) 또는 다른 화합물로서 다수의 수용체 티로신 키나아제들을 표적하는 화합물; 이매티닙(imatinib) 또는 다른 화합물로서 Abl 키나아제 및 PDGF 수용체들을 표적하는 화합물; 소라페닙(sorafenib) 또는 다른 화합물로서 B-raf를 표적하는 화합물; 렌바티닙(lenvatinib) 또는 다른 화합물로서 FGF 수용체와 PDGF 수용체를 표적하는 화합물; 베바시주맙(bevacizumab) 또는 다른 화합물로서 VEGF 수용체를 표적하는 화합물; BMS-345541 또는 다른 화합물로서 IKB/IKK를 표적하는 화합물; 토린(torin), 라파마이신(rapamycin) 또는 다른 화합물로서 mTOR을 표적하는 화합물; BEZ-235 또는 다른 화합물로서 PI3K 및 mTOR을 표적하는 화합물; 코비메티닙(cobimetinib), 트라메티닙(trametinib), PD98059 또는 다른 화합물로서 MAPK/ERK 키나아제를 표적하는 화합물; SB202190 또는 관련 화합물로서 p38 MAPK를 표적하는 화합물; Wortmannin, LY294002 또는 다른 화합물로서 PI3K를 표적하는 화합물; PF-03758309, FRAX486 또는 다른 화합물로서 p21 활성화 키나아제들을 표적하는 화합물; 포나티닙(ponatinib), 닌테다닙(nintedanib) 또는 다른 화합물로서 FGF 수용체를 저해하는 화합물; 및 SP600125 또는 다른 화합물로서 JNK 키나아제들을 저해하는 화합물일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은,
용매에 소수성 항암제 및 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계;
상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계;
암모늄 설페이트를 포함하는 용액에 지질막을 수화시켜, 친수성 영역에 암모늄 설페이트가 봉입되고 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된 리포솜을 형성시키는 단계;
제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계; 및
친수성 항암제를 포함하는 용액을 첨가하여, 상기 리포솜의 친수성 영역에 친수성 항암제를 봉입하는 단계; 를 포함하는 항암제의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 1: 용매에 소수성 항암제 및 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제의 제조방법에 있어서, 단계 1은 용매에 소수성 항암제 및 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계이다.
이때, 상기 용매는 소수성 항암제와 지질을 용해시킬 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 클로로포름 등을 단독으로 사용하거나 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 제1지질은 리포좀 제조에 사용하는 지질로 공지된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예로는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 수소화 L-α-포스파티딜콜린(대두)(L-α-Phosphatidylcholine, hydrogenated(Soy), HSPC), 1,2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DPPC), 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000)(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(methoxy(polyethylene glycol)-2000), DSPE-mPEG), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG), 팔미트산(palmitic acid) 등이 있다.
소수성 항암제에 관한 것은 상술한 바와 같으므로, 중복 설명을 피하기 위해 생략한다.
단계 2: 상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제의 제조방법에 있어서, 단계 2는 상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계이다.
이때, 대부분의 용매를 제거하기 위하여 공지된 건조 방법을 사용할 수 있다. 용매를 제거하기 위한 건조 조건으로 온도와 시간의 몇 가지 구체예로는 다음과 같다.
건조 온도로는 10 내지 70℃ 범위일 수 있고, 20 내지 70℃ 범위일 수 있고, 30 내지 70℃ 범위일 수 있고, 40 내지 70℃ 범위일 수 있고, 10 내지 60℃ 범위일 수 있고, 10 내지 50℃ 범위일 수 있고, 10 내지 40℃ 범위일 수 있고, 20 내지 60℃ 범위일 수 있고, 30 내지 50℃ 범위일 수 있고, 40℃ 일 수 있다. 건조 온도가 10℃ 미만일 경우 용매를 건조시키는데 오랜 시간이 걸리는 문제가 있고, 건조 온도가 70℃ 초과일 경우 불필요한 과량의 에너지 사용과 시료에 변성이 생기는 문제가 있다.
건조 시간으로는 1 내지 40시간 범위일 수 있고, 5 내지 40시간 범위일 수 있고, 10 내지 40시간 범위일 수 있고, 15 내지 40시간 범위일 수 있고, 20 내지 40시간 범위일 수 있고, 25 내지 40시간 범위일 수 있고, 1 내지 35시간 범위일 수 있고, 1 내지 30시간 범위일 수 있고, 1 내지 25시간 범위일 수 있고, 15 내지 35시간 범위일 수 있고, 20 내지 30시간 범위일 수 있고, 하루 동안 수행할 수 있다. 건조 시간이 1시간 미만일 경우 용매의 충분한 건조가 불가능한 문제가 있고, 건조 시간이 40시간 초과일 경우 불필요하게 긴 시간 동안 건조를 수행하는 문제가 있다.
단계 3: 암모늄 설페이트를 포함하는 용액으로 지질막을 수화시켜, 친수성 영역에 암모늄 설페이트가 봉입되고 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된 리포솜을 형성시키는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제의 제조방법에 있어서, 단계 3은 암모늄 설페이트를 포함하는 용액으로 지질막을 수화시켜, 친수성 영역에 암모늄 설페이트가 봉입되고 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된 리포솜을 형성시키는 단계이다.
이때, 암모늄 설페이트를 포함하는 용액은 암모늄 설페이트 수용액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 단계는 지질막-수화법(lipid film-hydration method)에 해당한다.
상기 용액 내 암모늄 설페이트의 농도는 후술하는 단계에서 독소루비신(DOX)을 리포솜의 친수성 영역으로 이끌 수 있는 범위하에 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예로는 50 내지 650 mM 농도 범위일 수 있고, 100 내지 650 mM 농도 범위일 수 있고, 150 내지 650 mM 농도 범위일 수 있고, 200 내지 650 mM 농도 범위일 수 있고, 250 내지 650 mM 농도 범위일 수 있고, 50 내지 600 mM 농도 범위일 수 있고, 50 내지 550 mM 농도 범위일 수 있고, 50 내지 500 mM 농도 범위일 수 있고, 50 내지 450 mM 농도 범위일 수 있고, 50 내지 400 mM 농도 범위일 수 있고, 150 내지 550 mM 농도 범위일 수 있고, 250 내지 400 mM 농도 범위일 수 있다.
상기 용액 내 암모늄 설페이트의 농도가 50 mM 미만일 경우, 후술하는 단계에서 독소루비신(DOX)을 리포솜의 친수성 영역으로 이끌기에 충분하지 못한 양의 암모늄 설페이트가 존재하여 독소루비신(DOX)의 봉입 효율이 떨어지는 문제가 있고, 상기 용액 내 암모늄 설페이트의 농도가 650 mM 초과일 경우 불필요한 과량의 암모늄 설페이트가 사용되어 시료가 낭비되는 문제가 있다.
단계 4: 제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제의 제조방법에 있어서, 단계 4는 제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계이다.
이때, 상기 제2지질은 리포좀 제조에 사용하는 지질로 공지된 것으로서 펩티드와 결합이 가능한 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예로는 콜레스테롤, 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine, DPPS), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG) 등이 있다.
또한, 상기 세포투과 펩티드는 암세포를 투과할 수 있는 펩티드라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예는 상술한 바와 같다. 세포투과 펩티드는 protein trasduction domain (PTD) 라고도 불리며, TAT 펩티드(GRKKRRQRRRPQ)가 대표적인 예이다. 세포투과 펩티드는 거대분자 물질(단백질, 유전자 등)에 결합시켜 세포 내로 이입시키는데 이용된다. 최근 특이성(specificity)을 갖는 세포투과 펩티드가 보고되고 있으나, 이들은 일반적으로 특이성이 낮고 세포독성을 나타내는 문제가 있다. 하지만, 본 발명의 일 측면에서 제공되는 서열번호 1의 세포투과 펩티드는 특이성도 높고 세포독성이 없어 상술한 문제점이 극복 가능하다.
나아가, 상기 암 과발현효소 분해성 펩티드(Cancer-overexpressing enzyme-cleavable peptide, M)는 암세포 또는 암의 기질 세포에서 과발현되는 다양한 효소들에 의해 절단/분해되는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예는 상술한 바와 같다. 이때, 상기 암 과발현효소의 몇 가지 예로는 다음과 같다: 전립선암 표면효소, 칼리크레인 14(Kallikrein 14, KLK14), 카텝신(Cathepsin), 기질금속단백분해효소(matrix metalloprotease, MMP).
또한, 전달체 보호용 친수성 고분자는 생체 내 세망내피계의 기관에 의한 소실로부터 전달체를 보호할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 몇 가지 구체예는 상술한 바와 같다.
단계 5: 친수성 항암제를 포함하는 용액을 첨가하여, 상기 리포솜의 친수성 영역에 친수성 항암제를 봉입하는 단계
본 발명의 다른 측면에서 제공되는 항암제의 제조방법에 있어서, 단계 5는 친수성 항암제를 포함하는 용액을 첨가하여, 상기 리포솜의 친수성 영역에 친수성 항암제를 봉입하는 단계이다.
다만, 친수성 항암제를 포함하는 용액을 첨가하기 이전에, 표면이 개질된 리포솜을 포함하는 용액을 분산하여, 리포솜의 직경을 조절하는 단계를 먼저 수행할 수 있고, 이때 분산은 공지된 분산 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 한 가지 구체예로는 초음파 처리를 사용할 수 있다.
리포솜의 직경을 조절하기 위한 분산 조건으로 온도와 시간의 몇 가지 구체예로는 다음과 같다.
분산 온도로는 10 내지 120℃ 범위일 수 있고, 20 내지 120℃ 범위일 수 있고, 30 내지 120℃ 범위일 수 있고, 40 내지 120℃ 범위일 수 있고, 50 내지 120℃ 범위일 수 있고, 60 내지 120℃ 범위일 수 있고, 65 내지 120℃ 범위일 수 있고, 10 내지 110℃ 범위일 수 있고, 10 내지 100℃ 범위일 수 있고, 10 내지 90℃ 범위일 수 있고, 10 내지 80℃ 범위일 수 있고, 10 내지 70℃ 범위일 수 있고, 10 내지 65℃ 범위일 수 있고, 20 내지 110℃ 범위일 수 있고, 30 내지 100℃ 범위일 수 있고, 40 내지 90℃ 범위일 수 있고, 50 내지 80℃ 범위일 수 있고, 60 내지 70℃ 범위일 수 있고, 65℃일 수 있다.
분산 온도가 10℃ 미만이면 목적한 리포솜의 직경을 얻을 수 없는 문제가 있고, 분산 온도가 120℃ 초과이면 불필요한 에너지를 사용하게 되는 문제가 있다.
분산 시간으로는 1분 내지 20분 범위일 수 있고, 2분 내지 20분 범위일 수 있고, 3분 내지 20분 범위일 수 있고, 4분 내지 20분 범위일 수 있고, 5분 내지 20분 범위일 수 있고, 1분 내지 18분 범위일 수 있고, 1분 내지 16분 범위일 수 있고, 1분 내지 14분 범위일 수 있고, 1분 내지 12분 범위일 수 있고, 1분 내지 10분 범위일 수 있고, 1분 내지 8분 범위일 수 있고, 1분 내지 6분 범위일 수 있고, 1분 내지 5분 범위일 수 있고, 2분 내지 18분 범위일 수 있고, 3분 내지 15분 범위일 수 있고, 4분 내지 12분 범위일 수 있고, 5분 내지 10분 범위일 수 있다.
분산 시간이 1분 미만이면 리포솜의 직경이 필요 이상으로 커지는 문제가 있고, 교반 시간이 20분 초과이면 리포솜의 직경이 필요 이상으로 작아지는 문제가 있다.
분산 시간이 증가함에 따라 리포솜의 직경이 줄어드며, 일 측면에서 제공되는 리포솜의 직경 범위는 200 nm 이하일 수 있고, 50 내지 200 nm일 수 있고, 60 내지 200 nm일 수 있고, 70 내지 200 nm일 수 있고, 80 내지 200 nm일 수 있고, 90 내지 200 nm일 수 있고, 100 내지 200 nm일 수 있고, 110 내지 200 nm일 수 있고, 120 내지 200 nm일 수 있고, 130 내지 200 nm일 수 있고, 140 내지 200 nm일 수 있고, 50 내지 190 nm일 수 있고, 50 내지 180 nm일 수 있고, 50 내지 170 nm일 수 있고, 50 내지 160 nm일 수 있고, 50 내지 150 nm일 수 있고, 50 내지 140 nm일 수 있고, 50 내지 200 nm일 수 있고, 70 내지 190 nm일 수 있고, 90 내지 180 nm일 수 있고, 110 내지 170 nm일 수 있고, 140 nm일 수 있다.
리포솜 직경이 50 nm 미만일 경우 봉입되는 항암제 양이 적어 이를 암 치료에 적용할 경우 치료 효율이 좋지 못한 문제가 있고, 리포솜 직경이 200 nm 초과일 경우 리포솜의 EPR 효과(Enhanced Permeability and Retention effect)에 의해 리포좀이 암 조직에 축적되는 효과가 감소하는 문제가 있다.
친수성 항암제를 포함하는 용액은 친수성 항암제를 용해시킬 수 있는 용매와 혼합되는 것이라면 제한없이 사용할 수 있고, 하나의 구체예로는 염화나트륨 수용액을 포함하는 용액일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따라, 지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트가 제공된다.
나아가, 본 발명의 다른 일 측면에 따라, 펩티드 고상 합성법으로 세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드 컨쥬게이트를 제조하는 단계;
상기 세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드 컨쥬게이트의 암 과발현효소 분해성 펩티드에, 전달체 보호용 친수성 고분자를 결합시켜, 세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 제조하는 단계; 및
상기 세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트의 세포투과 펩티드에 지질을 결합시켜, 지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 제조하는 단계; 를 포함하는,
지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트의 제조방법이 제공된다.
상기 지질, 세포투과 펩티드, 암 과발현효소 분해성 펩티드, 전달체 보호용 친수성 고분자는 앞서 설명한 바와 동일하게 적용될 수 있다.
다만, 펩티드 고상 합성법으로 세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드 컨쥬게이트를 제조하는 단계에 있어서, 세포투과 펩티드와 암 과발현효소 분해성 펩티드는 각각 합성될 수도 있고, 연속적으로 합성될 수도 있다.
본 발명의 일 측면에 따라 제공되는 약물전달시스템은, 질병 세포의 수용체를 표적하는 리간드가 약물전달체의 말단부에 결합된 종래의 약물전달시스템에 비해, 상대적으로 표적 세포에 도달하는 전달체의 양과, 표적 세포에 도달한 후 세포 내로 투과되는 약물의 양이 많아 암 치료 효율이 개선되는 효과가 있다.
이러한 효과를 입증하기 위하여, 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을 세포에 처리하고, CCK-8 assay를 실시하여 세포독성 평가를 수행한 결과,
실시예 1(F2)는 MMP-9에 감응성을 갖지 않는 DSPE-mPEG를 함유하는 비교예 1(F1)에 비해 세포 생존능 억제 효과가 우수하였고, DSPE-mPEG와 folate 수용체를 인식할 수 있는 DSPE-PEG-Folate를 함유하는 비교예 2(F3)에 비해서도 세포 생존능 억제 효과가 우수하였다. 또한, 실시예 1(F2) 보다 PAL-CPP-M-PEG의 함량이 낮고 DSPE-PEG-Folate를 함유하는 비교예 3(F4)에 비해서도 실시예 1의 세포 생존능 억제 효과가 우수하였다(실험예 3의 도 5 참조).
또한, 실시예 1 (F2)와 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3), 비교예 3 (F4) 및 비교예 4 (F5)로서 이종 약물이 봉입된 리포솜으로 처리한 삼중음성유방암 세포 MDA-MB-231과 MDA-MB-468의 유세포 분석 (BD FACS Canto Ⅱ, BD biosciences, USA)과, 실시예 1 (F2)와 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3) 및 비교예 3 (F4)로서 이종 약물이 봉입된 리포솜으로 처리한 삼중음성유방암 세포 MDA-MB-231의 공초점 현미경 분석 (LSM5 live configuration Variotwo VRGB, Zeiss, USA)을 통해, 이종 약물이 봉입된 암 효소 감응성 리포솜의 세포 이입 평가를 수행한 결과, MDA-MB-231 세포에 대한 세포 흡수 정도는 실시예 1(F2)에서 높게 나타났고, MDA-MB-468 세포에 대한 세포 흡수 정도도 실시예 1(F2)에서 높게 나타났고, 실시예 1(F2)의 세포 흡수는 비교예 1 내지 3에 비해 상대적으로 높게 나타났다(실험예 4의 도 7, 8, 9 참조).
이하, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
리포솜 제조에 사용된 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC); 콜레스테롤(cholesterol, CHOL); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000], DSPE-mPEG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴레이트(폴리에틸렌 글리콜)] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[folate(polyethlyene glycol)] DSPE-PEG-Folate) 및 DSPE-PEG-Cy5.5는 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA)에서 구입하여 사용하였다. 독소루비신(doxorubicin hydrochloride, DOX)은 Boryung Inc. (Seoul, South Korea), 엘로티닙 (Erlotinib hydrochloride, ERL)은 Haihang Inc. (Jinan, Shandong, China)에서 구입하여 사용하였다.
펩티드 고상 합성법 (Wang C. Chan, Peter D. White, "Fmoc Solid phase peptide synthesis", Oxford)에 따라 펩티드를 제조하였다. 보다 구체적으로, 자동합성기 (ASP48S, Peptron, Inc.)를 사용하여 Fmoc-SPPS (9-Fluorenyl methyl oxycarbonyl solid phase peptide synthesis) 방법을 이용하여 C-말단부터 하나씩 아미노산을 커플링(coupling) 하였다. 펩티드 합성에 사용한 모든 단량체 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고, 잔기는 트리틸(Trt), t-부틸옥시카보닐(t-Boc), t-부틸(t-Bu) 등으로 보호된 아미노산을 사용하였다. 커플링제(Coupling reagent)로는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우르늄 헥사플루오로포스페이트(2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate, HBTU), 하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole, HOBt), N-메틸모르폴린(N-methylmorpholine, NMM)을 사용하였다.
(1) 보호된 아미노산 (8당량)과 커플링제 HBTU (8당량) / NMM (16당량)을 DMF (Dimethyl formamide)에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 반응시켰다.
(2) Fmoc 제거는 20% (v/v) 피페리딘 / DMF를 가하여 상온에서 5분간 2회 반응하였다. 상기 (1)과 (2)의 반응을 반복적으로 하여 펩티드를 만들었다.
형광물질을 연결한 펩티드의 경우 플루오르세인 이소티오시아네이트(fluore scein isothiocyanate: FITC)를 이용하여 결합시켰고,
팔미틱산(Palmitic acid)를 이용하여 팔미테이션, 및 PEG2000 (Polyethylene glycol, 평균분자량 2,000)을 이용하여 페길레이션을 하였다.
이후, 수지(resin)에서의 펩티드 분리 및 분리된 펩티드에서의 아미노산 보호기의 분리는 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA) / 1,2-에탄디티올(1,2-ethanedithiol, EDT) / 티오아니솔(Thioanisole) / 트리이소프로필실란(Triisopropylsilane, TIS) / H2O (혼합비(중량기준) = 90 / 2.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5)을 사용하여 분리하였다. 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시켰고, 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시킨 후, 과량의 TFA, EDT, 티오아니솔 및 TIS 등을 일차로 제거하였다. 동일한 절차를 2회 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다.
얻은 침전물을 C18 컬럼 (250mm × 22 mm, 10 μm, Vydac Everest, USA)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 기기 (Shimadzu Prominence HPLC, Japan)를 이용하여 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산을 포함하는 Water-Acetonitrile linear gradient (아세토나이트릴 농도: 10~75% (v/v)) 방법으로 분리하였다. 정제된 펩티드들의 분자량은 LC/MS (Shimadzu LC/Mass-2020, Japan)로 확인하였고, 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형태의 TFA(Trifluoroacetic acid) 염으로서 펩티드를 제조하였다. 최종 제조된 펩티드의 서열과 머무름 시간 및 분자량을 하기에 나타내었다.
< 제조예 1> 세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-세포투과 펩티드-FITC ( CPP -M- CPP - FITC ) 컨쥬게이트
[CPP (cell penetrating peptide)]-[M:MMP-9 cleavable peptide]-[CPP (cell penetrating peptide)]-[FITC (fluorescein isothiocyanate)]
서열번호: lclrpvGGGGPLGLAGGlclrpvGK(FITC)
Rt = 6.192 분 (0.01% (v/v) TFA를 함유하는 5% (v/v) 내지 100% (v/v)의 DW/아세토나이트릴로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS (ESI) 2748.71 m/e, [M+H]+ = 2749.
< 제조예 2> 지질-펩티드-고분자(PAL- CPP -M-PEG) 컨쥬게이트
[PAL (palmitic acid)]-[CPP]-[M]-[PEG] 컨쥬게이트
서열번호: PEG2000-GGGGPLGLAGGlclrpvGK(G-Pal)
MS(ESI) 2973.36 m/e, [M+H]+/3 = 1325.
< 제조예 3> Control 1 펩티드
[CPP]-[FITC]
서열번호: lclrpvGK(FITC)
Rt = 7.658 분 (0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 DW/아세토나이트릴로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 1273.91 m/e, [M+H]+ = 1273.
< 제조예 4> Control 2 펩티드
서열번호: LAGGlclrpvGK(FITC)
Rt = 6.225 분(0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5% (v/v) 내지 100% (v/v)의 DW/Acetonitrile로부터 20분에 걸쳐 다양한 농도구배); MS(ESI) 1572.07 m/e, [M+H]+ = 1573.
< 실시예 1> PAL- CPP -M-PEG가 도입된 리포솜의 제조
단계 a: ERL이 봉입된 리포솜 제조 (단계 1~3)
DSPC, CHOL 및 POPG (중량비 = 27:20:3) 50 mg 및 엘로티닙(erlotinib, ERL) 3 mg을, 클로로포름과 메탄올을 2:1 (v/v)로 혼합한 용매 8 mL에 용해시킨 후, 회전증발기 (Buchi rotavapor R-210, Switzerland)를 이용하여 40 ℃에서 감압 증류하여 용매를 제거시켜 둥근 플라스크 벽에 얇은 지질막을 형성시켰다. 지질막이 형성된 둥근 플라스크를 진공 하에서 30 ℃로 12시간 동안 건조하여 용매를 완전히 제거시킨 후, 350 mM의 암모늄 설페이트 수용액을 가해 지질막을 수화하고 지질의 수화액이 충분히 분산될 때까지 초음파 분산기 (KODO JAC-3010, South Korea)로 처리하여 리포솜 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 리포솜 용액을 pH 7.4의 PBS에서 12시간 이상 막 투석 (MWCO 14,000)을 실시하였다.
단계 b: PAL- CPP -M-PEG 도입 리포솜의 제조 (단계 4)
상기 <제조예 2>에서 제조한 지질-펩티드-고분자(PAL-CPP-M-PEG) 컨쥬게이트, 즉, [PAL (palmitic acid)]-[CPP]-[M]-[PEG] 컨쥬게이트 3.60 mg을 0.9%의 NaCl 용액 1 mL에 가하여 35 ℃에서 교반한 후,
상기 단계 a를 통해 제조된 리포솜 용액과 혼합하고, 65 ℃에서 30분간 유지하였다.
단계 c: DOX 봉입 (단계 5)
0.9% NaCl 용액 1 mL에 독소루비신(doxorubicin, DOX) 3.6 mg을 녹인 DOX 용액을, 상기 단계 b의 최종 용액에 혼합하고, 65 ℃에서 30분간 유지한 후, 65 ℃에서 5분간 초음파 분산기로 분산시켜 리포솜 내부와 외부의 이온농도 구배에 의해 리포솜의 내부로 약물을 봉입시켰다. DOX를 봉입시킨 리포솜을 30분간 안정화시킨 후, DOX가 봉입된 리포솜 용액을 pH 7.4의 10 mM PBS에서 12시간 이상 막 투석 (MWCO 14,000)을 실시하였다.
상기 단계 a 내지 c를 통해, PAL-CPP-M-PEG가 도입된 리포솜을 제조하였다.
< 비교예 1> DSPE -mPEG가 도입된 리포솜의 제조
[PAL (palmitic acid)]-[CPP]-[M]-[PEG] 컨쥬게이트 3.60 mg을 사용하는 대신, DSPE-mPEG 2.54 mg을 사용하는 것을 제외하고,
상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 통해 DSPE-mPEG가 도입된 리포솜을 제조하였다.
< 비교예 2> DSPE -PEG 및 DSPE -PEG- Folate가 도입된 리포솜의 제조
[PAL (palmitic acid)]-[CPP]-[M]-[PEG] 컨쥬게이트 3.60 mg을 사용하는 대신, DSPE-PEG 1.90 mg 및 DSPE-PEG-Folate 0.70 mg을 사용하는 것을 제외하고,
상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 통해 DSPE-mPEG가 도입된 리포솜을 제조하였다.
< 비교예 3> PAL-CPP-M-PEG 및 DSPE -PEG- Folate가 도입된 리포솜의 제조
[PAL (palmitic acid)]-[CPP]-[M]-[PEG] 컨쥬게이트 3.60 mg을 사용하는 대신, PAL-CPP-M-PEG 2.70 mg 및 DSPE-PEG-Folate 0.70 mg을 사용하는 것을 제외하고,
상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 통해 DSPE-mPEG가 도입된 리포솜을 제조하였다.
< 비교예 4> PAL- CPP -M-PEG, DSPE -PEG- Folate 및 DSPE -PEG- Cy5 .5가 도입된 리포솜의 제조
[PAL (palmitic acid)]-[CPP]-[M]-[PEG] 컨쥬게이트 3.60 mg을 사용하는 대신, PAL-CPP-M-PEG 1.62 mg, DSPE-PEG-Folate 1.32 mg 및 DSPE-PEG-Cy5.5 0.312 mg을 사용하는 것을 제외하고,
상기 <실시예 1>과 동일한 과정을 통해 DSPE-mPEG가 도입된 리포솜을 제조하였다.
하기 표 1에 실시예 1 및 비교예 1 내지 4에 따른 리포솜 제조시 사용한 지질-세포투과 펩티드-효소분해성펩티드-폴리에틸렌글리콜 등의 컨쥬게이트의 양(mg)과, 리포솜을 구성하는 지질 즉, DSPC, CHOL, POPG 및 컨쥬게이트의 총 몰(mole)수에 대한 컨쥬게이트의 몰(mole)분율로 조성(mol%)을 정리하여 나타내었다.
PAL-CPP-M-PEG
(mg), 제조예 2		 DSPE-mPEG
(mg)		 DSPE-PEG-Folate (mg) DSPE-PEG-Cy5.5
(mg)
실시예 1
(F2)		 3.60
(1.0 mol%)		 - - -
비교예 1
(F1)		 - 2.54
(1.0 mol%)		 - -
비교예 2
(F3)		 - 1.90
(0.75 mol%)		 0.70
(0.25 mol%)		 -
비교예 3
(F4)		 2.70
(0.75 mol%)		 - 0.70
(0.25 mol%)		 -
비교예 4
(F5)		 1.62
(0.45 mol%)		 - 1.32
(0.45 mol%)		 0.312
(0.1 mol%)
< 실험예 1> MMP -9에 대한 감수성 평가
상기 <제조예 1>에서 제조한 세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-세포투과 펩티드-FITC 컨쥬게이트의, MMP-9에 대한 감수성을 평가하였다.
유방암 세포주로는 MCF-7, MDA-MB-231 및 MDA-MB-468을 사용하였다. 세포는 10%의 소태아혈청 (Fetal bovine serum)과 1%의 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가한 RPMI 1640 medium (Welgene, South Korea)을 이용하여 5% CO2 배양기로 37 ℃에서 배양하였다.
유방암 세포주 MCF-7과 MDA-MB-231을 96-웰 플레이트(well plate)에 최종 세포 농도가 1x105 세포/웰이 되도록 가하고 5% CO2 배양기로 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. MMP-9 활성화 완충액은 0.1 M의 NaOH 1 mL에 3.5 mg의 APMA (p-Aminophenolmercuric acetate)를 녹여 만든 10 mM의 APMA용액과 TCC 버퍼 (pH 7.5의 50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2, 0.05% Triton X-100)를 1:3 (v/v)으로 혼합하여 제조하였다. 0.4 uL의 MMP-9을 활성화 완충액 50 uL에 가하여 MMP-9을 활성화하였다. 이 용액을 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션(incubation)하고 완충액으로부터 APMA를 제거하기 위하여 MWCO 5000 Da의 원심 분리 농축기(centrifugal concentrator)로 농축 (15000 g, 4 ℃)하고 희석하는 것을 4회 반복하였다. 활성화시킨 MMP-9과 CPP-M-CPP-FITC를 하기 표 2에 나타낸 것과 같이 세포에 가하고, 3시간 동안 37 ℃에서 CO2 배양기로 인큐베이션(incubation)한 후, 세포를 형광현미경 (Nikon E600, Japan)으로 관찰하였다. 미처리 대조군 세포가 나타내는 백그라운드(background) 자발형광은 모든 이미지들에서 제외하였고, 실험은 3회 반복하였다. <제조예 3>에서 제조한 Control-1 펩티드와, <제조예 4>에서 제조한 Control-2 펩티드의 아미노산 서열은 각각 lclrpvGK-FITC와 LAGGlclrpvGK-FITC이었다. 이와 같이 실시한 실험의 MCF-7 세포에 대한 결과는 도 1a 내지 1c에 나타내었으며, MDA-MB-231 세포에 대한 결과는 도 2a 내지 2c에 나타내었다.
펩티드 컨쥬게이트 종류 /
처리량 (μM)		 활성화된 MMP-9 처리여부
(0.4 μg/mL)
실험군 1
(미처리 대조군)		 - -
실험군 2 CPP-M-CPP-FITC
5		 ○
실험군 3 CPP-M-CPP-FITC
10		 ○
실험군 4 CPP-M-CPP-FITC
20		 ○
실험군 5 Control-1 펩티드
10		 ○
실험군 6 Control-1 펩티드
20		 ○
실험군 7 Control-2 펩티드
10		 -
실험군 8 Control-2 펩티드
20		 -
실험군 9 CPP-M-CPP-FITC
10		 -
실험군 10 CPP-M-CPP-FITC
20		 -
도 1a 내지 1c는 MCF-7 세포에 대한 펩티드 컨쥬게이트의 cellular uptake의 형광현미경 관찰 결과를 나타내며, 도 1a 내지 1c에서 (1) 내지 (10)은 다음을 의미한다: (1) No treatment control, (2) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 5 uM로 처리 (3) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 10 uM로 처리 (4) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 20 uM로 처리, (5) 활성화 MMP-9으로 처리한 Control-1 펩티드를 10 uM로 처리, (6) 활성화 MMP-9으로 처리한 Control-1 펩티드를 20 uM로 처리, (7) Control-2 펩티드를 10 uM로 세포에 직접 처리, (8) Control-2 펩티드를 20 uM로 세포에 직접 처리, (9) CPP-M-CPP-FITC를 10 uM로 세포에 직접 처리 및 (10) CPP-M-CPP-FITC를 20 uM로 세포에 직접 처리.
도 2a 내지 2c는 MDA-MB-231 세포에 대한 펩티드 컨쥬게이트의 cellular uptake의 형광현미경 관찰 결과를 나타내며, 도 2a 내지 2c에서 (1) 내지 (10)은 다음을 의미한다: (1) No treatment control, (2) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 5 uM로 처리 (3) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 10 uM로 처리 (4) 활성화 MMP-9으로 처리한 CPP-M-CPP-FITC를 20uM로 처리, (5) 활성화 MMP-9으로 처리한 Control-1 펩티드를 10 uM로 처리, (6) 활성화 MMP-9으로 처리한Control-1 펩티드를 20 uM로 처리, (7) Control-2 펩티드를 10 uM로 세포에 직접 처리, (8) Control-2 펩티드를 20 uM로 세포에 직접 처리, (9) CPP-M-CPP-FITC를 10 uM로 세포에 직접 처리 및 (10) CPP-M-CPP-FITC를 20 uM로 세포에 직접 처리.
도 1a 내지 1c의 결과에서, CPP-M-CPP-FITC는 MCF-7 세포가 분비하는 MMP-9에 감수성이 있고 (도 1c의 (9)와 (10)), 활성화시킨 MMP-9 처리에 의해 생성되는 CPP는 MCF-7 세포에 대한 흡수가 높지 않으며 (도 1a의 (2), (3) 및 (4)), Control-1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 CPP (도 1b의 (5)와 (6))인 것으로 확인되었다.
도 2a 내지 2c의 결과에서, CPP-M-CPP-FITC는 MDA-MB-231 세포가 분비하는 MMP-9에 감수성이 있고 (도 2c의 (9)와 (10)), CPP-M-CPP-FITC의 농도 증가에 따라 활성화 MMP-9 처리로 생성되는 CPP는 MDA-MB-231 세포에 대한 흡수가 증가하며 (도 2a의 (2), (3) 및 (4)), Control-1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 CPP (도 1b의 (5)와 (6))인 것으로 확인되었다.
< 실험예 2> 이종 약물의 처리 프로토콜에 따른 세포독성 평가
이종 약물의 처리 프로토콜에 따른 세포독성을 조사하기 위해 삼중음성유방암 세포주인 MDA-MB-231과 MDA-MB-468 유방암 세포를 대상으로 이종 약물의 처리 순서를 변경하면서 처리한 후, CCK-8 assay를 실시하여 세포 생존능(cell viability)을 조사하였다. MDA-MB-231과 MDA-MB-468 세포를 96-웰 플레이트에 최종 세포 농도가 1x104 세포/웰이 되도록 가한 후, 5% CO2 배양기로 37 ℃에서 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시켰다. ERL과 DOX의 농도가 각각 10 uM 또는 각각 20 uM이 되도록 하고, 하기 표 3에 나타낸 약물 처리 프로토콜에 따라 처리한 세포를 인큐베이션(incubation) 하였다. CCK-8 용액 10 uL을 첨가하고 1시간 동안 37 ℃에서 CO2 배양기로 인큐베이션(incubation) 한 후, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포 생존능을 도 3과 도 4에 나타내었다.
시료명 약물 처리 프로토콜
미처리 대조군 Control 약물 미처리
실험군 1 DOX DOX 처리, 7시간 incubation
실험군 2 ERL ERL 처리, 7시간 incubation
실험군 3 DOX/ERL DOX과 ERL 동시 처리, 7시간 incubation
실험군 4 D(1hr)-E DOX 1시간 처리 후, ERL 처리, 7시간 incubation
실험군 5 E(1hr)-D ERL 1시간 처리 후, DOX 처리, 7시간 incubation
실험군 6 E(4hr)-D ERL 4시간 처리 후, DOX 처리, 7시간 incubation
실험군 7 E(24hr)-D ERL 24시간 처리 후 DOX 처리, 7시간 incubation
도 3a는 MDA-MB-231에 대한 ERL과 DOX 복합 약물 처리 프로토콜에 따른 세포 생존능을 나타낸다. (약물 처리 농도 10 uM)
도 3b는 MDA-MB-231에 대한 ERL과 DOX 복합 약물 처리 프로토콜에 따른 세포 생존능을 나타낸다. (약물 처리 농도 20 uM)
도 4a는 MDA-MB-468에 대한 ERL과 DOX 복합 약물 처리 프로토콜에 따른 세포 생존능을 나타낸다. (약물 처리 농도 10 uM)
도 4b는 MDA-MB-468에 대한 ERL과 DOX 복합 약물 처리 프로토콜에 따른 세포 생존능을 나타낸다. (약물 처리 농도 20 uM)
도 3a, 3b의 결과로부터, MDA-MB-231 세포는 E-->D 처리군에서 약물의 농도에 의존적인 세포 생존능 감소를 나타냈고, E(1hr)-->D 실험군이 세포 생존능의 억제에 효과적임을 확인하였다.
도 4a, 4b의 결과로부터, MDA-MB-468 세포는 10 uM 농도에서 E(1hr)-->D 및 E(4hr)-->D 실험군이 DOX 단독 처리군과 유사한 수준의 세포 생존능의 감소를 나타내었고, 순차적으로 처리하는 약물의 농도 증가에 따라 세포 생존능이 감소하는 경향은 나타내지 않았다.
< 실험예 3> 이종 약물이 봉입된 암 효소 감응성 리포솜의 세포독성 평가
이종 약물이 봉입된 암 효소 감응성 리포솜의 세포독성 시험은, 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을 세포에 처리하고, CCK-8 assay를 실시하여 세포독성을 평가하였다.
삼중음성유방암세포가 아닌 MCF-7 세포와 삼중음성유방암 세포인 MDA-MB-231 세포를 96-웰 플레이트에 최종 세포 농도가 1x104 세포/웰이 되도록 가한 후, 5% CO2 배양기로 37 ℃에서 24시간 동안 배양하여 세포가 부착되게 하였다. 각각의 리포솜마다 최종 리포솜 내 DOX 농도가 10 uM이 되도록 조절하는 등, 각각의 리포솜에 봉입된 항암제의 양을 동일하게 일치시키고, 48 또는 72 시간 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 그 후, CCK-8 용액 10 uL을 첨가하고 1시간 동안 37 ℃에서 CO2 배양기로 인큐베이션(incubation) 하였다. 마이크로플레이트 리더(Microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존능을 구하고, 그 결과를 도 5와 도 6에 나타내었다.
도 5a는 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을, MDA-MB-231 세포에 각각 처리한 경우 관찰되는 세포 생존능을 나타낸다. (인큐베이션 시간: 48시간)
도 5b는 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을, MDA-MB-231 세포에 각각 처리한 경우 관찰되는 세포 생존능을 나타낸다. (인큐베이션 시간: 72시간)
도 6a는 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을, MCF-7 세포에 각각 처리한 경우 관찰되는 세포 생존능을 나타낸다. (인큐베이션 시간: 48시간)
도 6b는 실시예 1(F2), 비교예 1(F1), 2(F3), 3(F4)으로서 이종 약물이 봉입된 리포솜을, MCF-7 세포에 각각 처리한 경우 관찰되는 세포 생존능을 나타낸다. (인큐베이션 시간: 72시간)
도 5a, 5b의 결과에서, MDA-MB-231 유방암 세포는 비교예와는 달리 PAL-CPP-M-PEG를 함유하는 실시예 1(F2)로 처리한 후, 인큐베이션 시간의 증가에 따라 세포 생존능이 감소하였고, 이는 실시예 1(F2)가 암 세포가 분비하는 MMP-9에 감응성을 가지고 있음을 나타내었다. 실시예 1(F2)는 MMP-9에 감응성을 갖지 않는 DSPE-mPEG를 함유하는 비교예 1(F1)에 비해 세포 생존능 억제 효과가 우수하였고, DSPE-mPEG와 folate 수용체를 인식할 수 있는 DSPE-PEG-Folate를 함유하는 비교예 2(F3)에 비해서도 세포 생존능 억제 효과가 우수하였다. 또한, 실시예 1(F2) 보다 PAL-CPP-M-PEG의 함량이 낮고 DSPE-PEG-Folate를 함유하는 비교예 3(F4)에 비해서도 실시예 1의 세포 생존능 억제 효과가 우수하였다.
도 6a, 6b의 결과에서, 삼중음성유방암 세포가 아닌 MCF-7 유방암 세포는 실시예 1(F2)과 비교예 1(F1), 2(F3) 및 3(F4)이 유사한 세포 생존능 억제를 나타냈으며, 인큐베이션 시간을 증가시켜도 세포 생존능 억제의 증가는 거의 나타나지 않았다.
도 5, 6의 결과에서, 실시예 1(F2)의 리포좀은 삼중음성유방암 세포가 아닌 MCF-7 세포에 비해, MMP를 과발현하는 삼중음성유방암 세포인 MDA-MB-231세포에서 리포좀의 PAL-CPP-M-PEG가 활성화되어, 우수한 세포 생존능의 억제를 나타내는 것을 확인하였다.
< 실험예 4> 이종 약물이 봉입된 암 효소 감응성 리포솜의 세포 이입 평가
실시예 1 (F2)와 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3), 비교예 3 (F4) 및 비교예 4 (F5)로서 이종 약물이 봉입된 리포솜으로 처리한 삼중음성유방암 세포 MDA-MB-231과 MDA-MB-468의 유세포 분석 (BD FACS Canto Ⅱ, BD biosciences, USA)과, 실시예 1 (F2)와 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3) 및 비교예 3 (F4)로서 이종 약물이 봉입된 리포솜으로 처리한 삼중음성유방암 세포 MDA-MB-231의 공초점 현미경 분석 (LSM5 live configuration Variotwo VRGB, Zeiss, USA)을 통해, 이종 약물이 봉입된 암 효소 감응성 리포솜의 세포 이입 평가를 실시하였다.
유세포 분석을 위해 6-웰 플레이트에 최종 세포 농도가 4x105 세포/웰이 되도록 가하고 5% CO2 배양기에서 37 ℃로 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시켰다. 실시예 및 비교예의 리포솜 내 최종 DOX 농도가 10 uM이 되도록 조절한 후, 세포에 리포솜 용액을 처리하고 1시간 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 배양액을 제거한 후 10 mM phosphate buffered saline (PBS)로 씻어주고 Trypsin-EDTA를 이용해 세포를 떼어냈다. 떼어낸 세포들을 미세 원심 분리관(microcentrifuge tube)에 각각 담고 4 ℃에서 1200 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 버리는 작업을 두 번 반복하였다. 마지막으로 PBS를 300 uL 첨가하여 세포를 잘 분산시켜 유세포 분석기로 분석하였고, 그 결과를 도 7a 내지 7c, 도 8a 내지 8c에 나타내었다.
도 7a 내지 7c는 이종 약물 봉입된 실시예 (F2), 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3), 비교예 3 (F4), 및 비교예 4 (F5)의 리포솜으로 처리한 MDA-MB-231 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 8c는 이종 약물 봉입된 실시예 (F2), 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3), 비교예 3 (F4), 및 비교예 4 (F5)의 리포솜으로 처리한 MDA-MB-468 세포의 FACS 분석 결과를 나타낸다.
도 7a 내지 7c에 제시한 바와 같이, MDA-MB-231 세포에 대한 세포 흡수 정도는 실시예 1(F2)에서 높게 나타났다.
도 8a 내지 8c에서 제시한 바와 같이, MDA-MB-468 세포에 대한 세포 흡수 정도는 실시예 1(F2)에서 높게 나타났다.
공초점 현미경 분석을 위해 MDA-MB-231 세포를 8-웰 챔버 슬라이드에 1x104 세포/웰이 되도록 가한 후, 5% CO2 배양기로 37 ℃에서 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시켰다. DOX 용액은 10 uM, 리포솜 용액은 DOX의 농도가 20 uM이 되도록 웰에 처리하고 1시간 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 10 mM PBS로 2회 세척한 후, 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 실온에서 10분간 고정시키고, 10 mM PBS로 2회 세척하였다. 5 ug/mL 농도의 DAPI 용액을 가하고 10분간 실온에서 염색시킨 후, PBS로 세척하였다. 마지막으로 마운팅 용액(mounting solution)을 가하고 커버 글래스(cover glass)를 덮고 봉하여 공초점 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 9a 내지 9e에 나타내었다.
도 9a 내지 9e는 이종 약물 봉입된 실시예 1 (F2), 비교예 1 (F1), 비교예 2 (F3), 및 비교예 3 (F4)의 리포솜으로 처리한 MDA-MB-231 세포의 CFSM 분석 결과를 나타내며, 각 이미지에서 좌측 상단은 (blue; DAPI), 우측 상단은 (red; doxorubicin) 및 좌측 하단은 (merged image)); (9a) free DOX, (9b) 비교예 1 (F1), (9c) 실시예 1 (F2), (9d) 비교예 2 (F3), 및 (9e) 비교예 3 (F4) 이다.
도 9에 제시한 바와 같이, 실시예 1(F2)의 세포 흡수는 비교예 1 내지 3에 비해 상대적으로 높게 나타났다.
<서열번호 1> 세포투과펩티드 1 ( CPP 1)
lclrpv
D-Leucine-D-Cysteine-D-Leucine-D-Arginine-D-Proline-D-Valine
D-Leu-D-Cys-D-Leu-D-Arg-D-Pro-D-Val
<서열번호 2> 세포투과펩티드 2 ( CPP 2)
SIWV
Serine-Isoleucine-Tryptophan-Valine
Ser-Ile-Trp-Val
<서열번호 3> 세포투과펩티드 3 ( CPP 3)
ASIW
Alanine-Serine-Isoleucine-Tryptophan
Ala-Ser-Ile-Trp
<서열번호 4> 세포투과펩티드 4 ( CPP 4)
WVGH
Tryptophan-Valine-Glycine-Histidine
Trp-Val-Gly-His
<서열번호 5> 세포투과펩티드 5 ( CPP 5)
IWVG
Isoleucine-Tryptophan-Valine-Glycine
Ile-Trp-Val-Gly
<서열번호 6> 세포투과펩티드 6 ( CPP 6)
VGHR
Valine-Glycine-Histidine-Arginine
Val-Gly-His-Arg
<서열번호 7> 세포투과펩티드 7 ( CPP 7)
GHRG
Glycine-Histidine-Arginine-Glycine
Gly-His-Arg-Gly
<서열번호 8> 세포투과펩티드 8 ( CPP 8)
MASI
Methionine-Alanine-Serine-Isoleucine
Met-Ala-Ser-Ile
<서열번호 9> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M1)
GGGGPLGLAGG
Glycine-Glycine-Glycine-Glycine-Proline-Leucine-Glycine-Leucine-Alanine-Glycine-Glycine
Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly-Gly
<서열번호 10> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M2)
CHSSKLQG
Cysteine-Histidine-Serine-Serine-Lysine-Leucine-Glutamine-Glycine
Cys-His-Ser-Ser-Lys-Leu-Gln-Gly
<서열번호 11> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M3)
LRLSSYYM
Leucine-Arginine-Leucine-Serine-Serine-Tyrosine-Tyrosine-Methionine
Leu-Arg-Leu-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Met
<서열번호 12> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M4)
SSQPWQ
Serine-Serine-Glutamine-Proline-Tryptophan-Glutamine
Ser-Ser-Gln-Pro-Trp-Gln
<서열번호 13> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M5)
RRFLCG
Arginine-Arginine-Phenylalanine-Leucine-Cysteine-Glycine
Arg-Arg-Phe-Leu-Cys-Gly
<서열번호 14> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M6)
THDNDL
Threonine-Histidine-Aspartic acid-Asparagine-Aspartic acid-Leucine
Thr-His-Asp-Asn-Asp-Leu
<서열번호 15> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M7)
VRPIE
Valine-Arginine-Proline-Isoleucine-Glutamic acid
Val-Arg-Pro-Ile-Glu
<서열번호 16> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M8)
VSGWGT
Valine-Serine-Glycine-Tryptophan-Glycine-Threonine
Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Thr
<서열번호 17> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M9)
YPAS
Tyrosine-Proline-Alanine-Serine
Tyr-Pro-Ala-Ser
<서열번호 18> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M10)
TITPGM
Threonine-Isoleucine-Threonine-Proline-Glycine-Methionine
Thr-Ile-Thr-Pro-Gly-Met
<서열번호 19> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M11)
QGRAMC
Glutamine-Glycine-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Gln-Gly-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 20> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M12)
GPRAMC
Glycine-Proline-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Gly-Pro-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 21> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M13)
QRRAMC
Glutamine-Arginine-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Gln-Arg-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 22> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M14)
GGRAMC
Glycine-Glycine-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Gly-Gly-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 23> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M15)
VLKAMC
Valine-Leucine-Lysine-Alanine-Methionine-Cysteine
Val-Leu-Lys-Ala-Met-Cys
<서열번호 24> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M16)
LGRAMC
Leucine-Glycine-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Leu-Gly-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 25> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M17)
QARAMC
Glutamine-Alanine-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Gln-Ala-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 26> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M18)
VPRAMC
Valine-Proline-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Val-Pro-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 27> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M19)
PFRAMC
Proline-Phenylalanine-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Pro-Phe-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 28> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M20)
FSRAMC
Phenylalanine-Serine-Arginine-Alanine-Methionine-Cysteine
Phe-Ser-Arg-Ala-Met-Cys
<서열번호 29> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M21)
PLGLAG
Proline-Leucine-Glycine-Leucine-Alanine-Glycine
Pro-Leu-Gly-Leu-Ala-Gly
<서열번호 30> 암 과발현효소 분해성 펩티드 (M22)
SGRSA
Serine-Glycine-Arginine-Serine-Alanine
Ser-Gly-Arg-Ser-Ala
<110> Korea Research Institute of Chemical Technology <120> Cancer microenvironment-sensitive combinatorial drug delivery system containing a new lipid-peptide-polymer conjugate as a substrate of cancer-overexpressing enzyme <130> 2017P-11-060 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP 1 <400> 1 Leu Cys Leu Arg Pro Val 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP 2 <400> 2 Ser Ile Trp Val 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP 3 <400> 3 Ala Ser Ile Trp 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP 4 <400> 4 Trp Val Gly His 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP 5 <400> 5 Ile Trp Val Gly 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP 6 <400> 6 Val Gly His Arg 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP 7 <400> 7 Gly His Arg Gly 1 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP 8 <400> 8 Met Ala Ser Ile 1 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 1 <400> 9 Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ala Gly Gly 1 5 10 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 2 <400> 10 Cys His Ser Ser Lys Leu Gln Gly 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 3 <400> 11 Leu Arg Leu Ser Ser Tyr Tyr Met 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 4 <400> 12 Ser Ser Gln Pro Trp Gln 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 5 <400> 13 Arg Arg Phe Leu Cys Gly 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 6 <400> 14 Thr His Asp Asn Asp Leu 1 5 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 7 <400> 15 Val Arg Pro Ile Glu 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 8 <400> 16 Val Ser Gly Trp Gly Thr 1 5 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 9 <400> 17 Tyr Pro Ala Ser 1 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 10 <400> 18 Thr Ile Thr Pro Gly Met 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 11 <400> 19 Gln Gly Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 12 <400> 20 Gly Pro Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 13 <400> 21 Gln Arg Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 14 <400> 22 Gly Gly Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 15 <400> 23 Val Leu Lys Ala Met Cys 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 16 <400> 24 Leu Gly Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 17 <400> 25 Gln Ala Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 18 <400> 26 Val Pro Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 19 <400> 27 Pro Phe Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 20 <400> 28 Phe Ser Arg Ala Met Cys 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 21 <400> 29 Pro Leu Gly Leu Ala Gly 1 5 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M 22 <400> 30 Ser Gly Arg Ser Ala 1 5

Claims (12)

1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 콜레스테롤, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG) 및 팔미트산(palmitic acid)을 지질로 포함하는 리포솜;
상기 리포솜 표면에 결합된 서열번호 1(lclrpv)의 세포투과 펩티드;
상기 세포투과 펩티드에 결합된 서열번호 9(GGGGPLGLAGG)의 암 과발현효소 분해성 펩티드; 및
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드에 결합된 전달체 보호용 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 포함하는,
항암제 전달체.
삭제
삭제
삭제
용매에, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 콜레스테롤 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG)를 포함하는 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계;
상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계;
지질막을 수화시켜, 리포솜을 형성시키는 단계; 및
제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계; 를 포함하는,
항암제 전달체의 제조방법에 있어서,

상기 제2지질은 팔미트산(palmitic acid)을 포함하고,
상기 세포투과 펩티드는 서열번호 1(lclrpv)의 세포투과 펩티드이고,
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드는 서열번호 9(GGGGPLGLAGG)의 암 과발현효소 분해성 펩티드이고,
상기 전달체 보호용 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)인 것을 특징으로 하는,
항암제 전달체의 제조방법.
삭제
제5항에 있어서,
상기 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 및 클로로포름으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는,
항암제 전달체의 제조방법.
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 콜레스테롤, 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG) 및 팔미트산(palmitic acid)을 지질로 포함하는 리포솜;
상기 리포솜 표면에 결합된 서열번호 1(lclrpv)의 세포투과 펩티드;
상기 세포투과 펩티드에 결합된 서열번호 9(GGGGPLGLAGG)의 암 과발현효소 분해성 펩티드; 및
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드에 결합된 전달체 보호용 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)을 포함하는 항암제 전달체의 내부 친수성 영역에 친수성 항암제가 봉입되고, 지질 이중층의 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된,
항암제에 있어서,

상기 소수성 항암제는 엘로티닙(erlotinib), 게피티닙(gefitinib), 라파티닙(lapatinib), 트라스쥬맙(trastuzumab), 수니티닙(sunitinib), 이매티닙(imatinib), 소라페닙(sorafenib), 렌바티닙(lenvatinib), 베바시주맙(bevacizumab), 토린(torin), 라파마이신(rapamycin), 코비메티닙(cobimetinib), 트라메티닙(trametinib), 포나티닙(ponatinib) 및 닌테다닙(nintedanib)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;

상기 친수성 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 아루고마이신(arugomycin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 다이네마이신(dynemicin), 캄토테신(camptothecin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 카무스틴(carmustine) 및 시스플라틴(cis-platin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는,
항암제.
용매에, 소수성 항암제; 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DSPC), 콜레스테롤 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol), POPG)를 포함하는 제1지질을 용해시켜 혼합 용액을 준비하는 단계;
상기 혼합 용액의 용매를 증발시켜, 지질막을 형성하는 단계;
암모늄 설페이트를 포함하는 용액으로 지질막을 수화시켜, 친수성 영역에 암모늄 설페이트가 봉입되고 소수성 영역에 소수성 항암제가 봉입된 리포솜을 형성시키는 단계;
제2지질-세포투과 펩티드-암 과발현효소 분해성 펩티드-전달체 보호용 친수성 고분자 컨쥬게이트를 첨가하여, 리포솜의 표면을 개질하는 단계; 및
친수성 항암제를 포함하는 용액을 첨가하여, 상기 리포솜의 친수성 영역에 친수성 항암제를 봉입하는 단계; 를 포함하는,
항암제의 제조방법에 있어서,

상기 소수성 항암제는 엘로티닙(erlotinib), 게피티닙(gefitinib), 라파티닙(lapatinib), 트라스쥬맙(trastuzumab), 수니티닙(sunitinib), 이매티닙(imatinib), 소라페닙(sorafenib), 렌바티닙(lenvatinib), 베바시주맙(bevacizumab), 토린(torin), 라파마이신(rapamycin), 코비메티닙(cobimetinib), 트라메티닙(trametinib), 포나티닙(ponatinib) 및 닌테다닙(nintedanib)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;

상기 제2지질은 팔미트산(palmitic acid)을 포함하고,
상기 세포투과 펩티드는 서열번호 1(lclrpv)의 세포투과 펩티드이고,
상기 암 과발현효소 분해성 펩티드는 서열번호 9(GGGGPLGLAGG)의 암 과발현효소 분해성 펩티드이고,
상기 전달체 보호용 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)이고; 및

상기 친수성 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 아루고마이신(arugomycin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 다이네마이신(dynemicin), 캄토테신(camptothecin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 카무스틴(carmustine) 및 시스플라틴(cis-platin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는,
항암제의 제조방법.
제9항에 있어서,
친수성 항암제를 포함하는 용액을 첨가하기 이전에,
표면이 개질된 리포솜을 포함하는 용액을 분산하여, 리포솜의 직경을 조절하는 단계를 더 포함하는,
항암제의 제조방법.
삭제
삭제
KR1020170180296A 2017-12-26 2017-12-26 암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템 KR102068295B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170180296A KR102068295B1 (ko) 2017-12-26 2017-12-26 암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170180296A KR102068295B1 (ko) 2017-12-26 2017-12-26 암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190078409A KR20190078409A (ko) 2019-07-04
KR102068295B1 true KR102068295B1 (ko) 2020-01-20

Family

ID=67259092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170180296A KR102068295B1 (ko) 2017-12-26 2017-12-26 암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102068295B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114225046B (zh) * 2021-12-20 2024-07-02 中国农业大学 一种抗菌/促愈合的双药递送系统、药物组合物及其制备方法和应用
CN116063389B (zh) * 2022-08-23 2023-07-07 广州医科大学 递送核酸药物的多肽载体、治疗肿瘤的核酸药物及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101095841B1 (ko) * 2009-02-19 2011-12-21 주식회사 나이벡 표적 선택적 세포／조직 투과기능 활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도
KR101647804B1 (ko) * 2015-06-24 2016-08-11 한국과학기술연구원 신규 세포투과 펩타이드 및 이의 용도
US20160256387A1 (en) * 2015-03-03 2016-09-08 Cureport, Inc. Dual loaded liposomal pharmaceutical formulations

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101095841B1 (ko) * 2009-02-19 2011-12-21 주식회사 나이벡 표적 선택적 세포／조직 투과기능 활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도
US20160256387A1 (en) * 2015-03-03 2016-09-08 Cureport, Inc. Dual loaded liposomal pharmaceutical formulations
KR101647804B1 (ko) * 2015-06-24 2016-08-11 한국과학기술연구원 신규 세포투과 펩타이드 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190078409A (ko) 2019-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. Highly efficacious and specific anti-glioma chemotherapy by tandem nanomicelles co-functionalized with brain tumor-targeting and cell-penetrating peptides
AU2017200766B2 (en) Liposome compositions and methods of use thereof
Zhang et al. A pH-responsive α-helical cell penetrating peptide-mediated liposomal delivery system
Georgieva et al. Peptide-mediated blood-brain barrier transport of polymersomes
US8741338B2 (en) Targeted delivery to human diseases and disorders
Wang et al. Nanodisk-based glioma-targeted drug delivery enabled by a stable glycopeptide
Moreno et al. Delivering wasp venom for cancer therapy
Ying et al. A stabilized peptide ligand for multifunctional glioma targeted drug delivery
US9415114B2 (en) Conformations of divergent peptides with mineral binding affinity
US11191724B2 (en) Branched peptides for enzymatic assembly and mitochondria drug delivery
CN109432432B (zh) 靶向至细胞内质网纳米载药系统的构建与应用
Kong et al. RPV‐modified epirubicin and dioscin co‐delivery liposomes suppress non‐small cell lung cancer growth by limiting nutrition supply
KR102068295B1 (ko) 암 과발현 효소의 기질로서 신규 지질-펩티드-고분자 컨쥬게이트가 함유된 암 미세환경 감응성 복합 약물전달시스템
EP2789348B1 (en) Liposomes and corresponding production method
ES2259674T3 (es) Liposomas de encapsulacion de farmacos anticancerosos y utilizacion de los mismos en el tratamiento de tumores malignos.
KR101747489B1 (ko) ｐＨ 응답성 펩티드를 포함하는 나노 입자
Zoughaib et al. Amphiphilic RGD and GHK peptides synergistically enhance liposomal delivery into cancer and endothelial cells
Yang et al. The application progress of peptides in drug delivery systems in the past decade
Mejia et al. Identification and optimization of tunable endosomal escape parameters for enhanced efficacy in peptide-targeted prodrug-loaded nanoparticles
KR101476953B1 (ko) 세포투과성이 증진된 헵신 표적 신규 펩타이드 및 그의 용도
RU2451509C1 (ru) Противоопухолевый препарат
US9526791B2 (en) Weakly acidic pH-responsive peptide and liposome containing same
KR20110114952A (ko) 유전자 운반체
Negussie et al. Synthesis and in vitro evaluation of novel cyclic NGR peptide targeted thermally sensitive liposome
Wan et al. Enzyme‐Responsive Micelles with High Drug‐Loading Capacity for Antitumor Therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant