CN109517071A - 穿膜肽及其包覆疏水分子的粒子和粒子的制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种穿膜肽及其包覆疏水分子的粒子和粒子的制备方法与应用，属于纳米生物材料技术领域。所述穿膜肽氨基酸序列为X‑Y‑(r‑R)3‑(R)2；其中X是至少为3个且至多为20个氨基酸残基的肽链，所述X中各个氨基酸各自独立地选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或组氨酸；其中Y是至多为20个任意氨基酸残基的肽链；其中r为D型精氨酸；其中R为L型精氨酸。该两亲性细胞穿膜肽与疏水分子共组装，通过非共价的分子间疏水相互作用自组装形成纳米粒子。该纳米粒子能使疏水分子快速、低细胞毒性地穿透细胞膜进入细胞内部。该纳米粒子在活细胞荧光成像、时间分辨成像及包覆疏水药物等方面具有良好的应用前景。

Description

穿膜肽及其包覆疏水分子的粒子和粒子的制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米生物材料技术领域，更具体地，涉及一种两亲性细胞穿膜肽及其包覆疏水性分子的纳米粒子和该粒子的制备方法与应用。
背景技术
细胞膜是一种生物学屏障，能阻止荧光探针分子、生物大分子及药物分子等进入细胞。对细胞膜通透性较差的荧光探针需要较长的孵育时间才能完成穿膜过程，导致实时荧光检测延迟。类似地，许多具有治疗功效的生物大分子及药物分子也存在难以进入病变细胞从而发挥生物学效应，大大降低了药物的疗效，增加了药物使用量和安全隐患。因此，如何使荧光探针分子、生物大分子及药物分子有效地穿过细胞膜，进入细胞内部发挥作用是解决上述问题的关键。
病毒重组技术和物理透膜方式是目前常用的细胞穿膜技术。但上述技术仍存在细胞毒性大、转入效率低等诸多局限。因此，亟需开发新型高效、低毒的细胞穿膜技术。
细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)，也称为蛋白转导域(proteintransduction domains，PTDs)或膜转运蛋白(membrane transduction peptides，MTPs)，是一类由10–30个氨基酸残基组成的短肽，具有很强的跨膜转运能力，能有效地介导生物大分子、药物分子穿过细胞膜，具有很好的应用前景。
富含精氨酸的细胞穿膜肽(arginine-rich cell-penetrating peptides，AR-CPPs)中含有的胍基可以和细胞膜表面带负电的磷酸基和硫酸基结合，使其能高效地穿越细胞膜。同时，细胞穿膜肽具有较低的细胞毒性，因而在细胞穿膜领域有应用用途(孙春萌等，细胞穿膜肽的研究进展，Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences(2013)48(14):1143-1146)。由非天然的D型精氨酸(r)及天然的L型精氨酸(R)杂合的一种聚精氨酸(rR)3R2能高效、低毒性地进入细胞；同时具有一定的抗酶解、抗血清降解能力，因而备受关注(Yan Ma,et al.Direct cytosolic delivery of cargoes in vivo by a chimeraconsisting of D-and L-arginine residues,Journal of Controlled Release(2012)162:286-294)。然而，该聚精氨酸需要将标记物和包覆的分子以共价键的形式连接在肽链的N端或者C端。这样的分子结构一方面增加了多肽与标记物或者包覆分子的合成的步骤、难度与成本；另一方面，以共价键连接在聚精氨酸上的标记物和包覆分子数量有限，而在成像或载药应用时则需要较多的多肽。此外，通过化学键与该聚精氨酸键合的标记物和包覆分子的种类和用量有限，进一步限制了其应用的领域。
发明内容
本发明解决了现有技术中穿膜肽与疏水分子化学键合过程复杂，且键合的分子数量和种类有限，不能满足成像或载药应用的要求的技术问题。
根据本发明的第一方面，提供了一种细胞穿膜肽，所述穿膜肽氨基酸序列为X-Y-(r-R)3-(R)2；
其中X是至少为3个且至多为20个氨基酸残基的肽链，所述X中各个氨基酸各自独立地选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或组氨酸；
其中Y是至多为20个任意氨基酸残基的肽链；
其中r为D型精氨酸；
其中R为L型精氨酸。
优选地，所述Y是至少含有2个且至多含有10个氨基酸的肽链，所述Y中各个氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
优选地，所述Y的氨基酸序列为SEQ ID:1、SEQ ID:2或SEQ ID:3。
本发明所述穿膜肽中连续的精氨酸序列为高度亲水性的穿膜肽，可以介导穿膜；X中的氨基酸残基的疏水性较强，可与疏水性小分子自组装形成纳米颗粒。这两段肽决定了整个肽穿膜功能和负载疏水分子的功能，最终使制备的复合纳米粒子能够顺利进入细胞内。
Y为辅助性或功能性的肽，可以增加穿膜肽的水溶性、使穿膜肽具有定位功能，或者仅仅起到连接作用，以降低疏水段或包覆的疏水分子对精氨酸序列的影响。当Y为SEQ IDNO：1所示的序列时，具有定位细胞核的作用；当Y为SEQ ID NO：2所示的序列时，具有定位线粒体的作用；当Y为SEQ ID NO：3所示的序列时，具有定位溶酶体的作用。
根据本发明的另一方面，提供了一种细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子，所述纳米粒子由权利要求1-3任意一种细胞穿膜肽包覆疏水分子构成，所述穿膜肽与疏水分子通过非共价的分子间疏水作用力结合。
优选地，所述疏水分子为疏水发光分子、疏水药物分子、疏水生物大分子和疏水高分子中的至少一种；
优选地，所述疏水发光分子为疏水荧光分子和/或疏水磷光分子；
优选地，所述疏水发光分子为疏水室温磷光分子、疏水热激活延迟发光分子和疏水聚集诱导发光分子中的至少一种。
优选地，将所述的细胞穿膜肽与疏水分子自组装，得到所述细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子；所述细胞穿膜肽与疏水分子通过非共价的分子间疏水作用力结合。
优选地，所述疏水分子为疏水发光分子、疏水药物分子、疏水生物大分子和疏水高分子中的至少一种；
优选地，所述疏水发光分子为疏水荧光染料分子和/或疏水磷光分子；
优选地，所述疏水发光分子为疏水室温磷光分子、疏水热激活延迟发光分子和疏水聚集诱导发光分子中的至少一种。所述的室温磷光分子、热激活延迟发光分子具有长寿命激发态，分子的发光寿命较长，可应用于时间分辨技术。所述聚集诱导发光分子，可避免传统的荧光染料在高浓度下荧光会减弱甚至不发光等问题。
优选地，所述自组装为任一所述的细胞穿膜肽和具有靶向功能的多肽与疏水分子自组装。
根据本发明的另一方面，提供了任一所述的细胞穿膜肽用于包覆疏水分子的应用，优选地，用于包覆疏水药物的应用。
根据本发明的另一方面，提供了所述的细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子用于细胞成像的应用，优选地，用于细胞时间分辨成像的应用。
时间分辨成像，可减少分子的光漂白问题，并有效去除背景荧光以及各种散射光的干扰，显著提高检测的信噪比。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明公开了两亲性细胞穿膜肽及其包覆疏水分子的纳米粒子、及该纳米粒子的制备方法与应用。该两亲性细胞穿膜肽可通过疏水相互作用与疏水分子自组装来制备复合纳米粒子。在该两亲性细胞穿膜肽的作用下，复合纳米粒子能快速、低细胞毒性地穿透细胞膜进入细胞内部。
(2)本发明公开的具有细胞穿膜性质的两亲性细胞穿膜肽，该两亲性细胞穿膜肽与疏水性分子通过非共价的分子间疏水相互作用自组装形成纳米粒子，且分散性好、尺寸均一。该纳米粒子能快速进入细胞内(5min以内进入细胞)，且低细胞毒性(24h细胞存活率高于80％)的穿透细胞膜进入细胞内部。与两亲性细胞穿膜肽的非共价相互作用可用于不同疏水分子转运至细胞内，包括疏水性发光分子、疏水药物分子、疏水生物大分子、疏水高分子等，相比于现有技术中的共价修饰而言，本申请包覆疏水分子工艺更加简便，且包覆疏水分子的类型更加多样，包覆疏水分子的数量也更多。该两亲性细胞穿膜肽及纳米粒子的制备方法在活细胞荧光成像、时间分辨成像及运载药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中两亲性细胞穿膜肽的序列SEQ ID NO:4的HPLC谱图。
图2为两亲性细胞穿膜肽包覆疏水性分子的纳米粒子透射电镜图(图中的标尺适用于其他图片)；其中图2(a)为SEQ ID NO：4包裹了疏水性荧光分子尼罗红的透射电镜图；图2(b)为SEQ ID NO：5包裹了疏水性热激活延迟发光分子4CzIPN的透射电镜图；图2(c)为SEQ ID NO：6包裹了疏水热激活性延迟发光分子NAI-DPAC的透射电镜图；图2(d)为SEQ IDNO：7包裹了疏水性热激活延迟发光分子BTZ-DMAC的透射电镜图；图2(e)为SEQ ID NO：8包裹了疏水性药物分子紫杉醇的透射电镜图；图2(f)为SEQ ID NO：9包裹了疏水性聚集诱导发光聚合物分子PTPES-PEO的透射电镜图。
图3为两亲性细胞穿膜肽包覆疏水性分子的纳米粒子动态光散射图；其中图3(a)为SEQ ID NO：4包裹了疏水性荧光分子尼罗红的动态光散射图；图3(b)为SEQ ID NO：5包裹了疏水性热激活延迟发光分子4CzIPN的动态光散射图；图3(c)为SEQ ID NO：6包裹了疏水热激活性延迟发光分子NAI-DPAC的动态光散射图；图3(d)为SEQ ID NO：7包裹了疏水性热激活延迟发光分子BTZ-DMAC的动态光散射图；图3(e)为SEQ ID NO：8包裹了疏水性药物分子紫杉醇的动态光散射图；图3(f)为SEQ ID NO：9包裹了疏水性聚集诱导发光聚合物分子PTPES-PEO的动态光散射图。
图4为MTT检测两亲性细胞穿膜肽及其包覆尼罗红纳米粒子的细胞毒性试验结果显示图；其中图4(a)为两亲性穿膜肽SEQ ID NO：4的细胞存活率；图4(b)为两亲性穿膜肽SEQ ID NO：4包裹了尼罗红的纳米粒子的细胞存活率。
图5为流式细胞仪检测两亲性细胞穿膜肽包覆4CzIPN的纳米粒子穿膜效率实验显示图；其中图5(a)为流式细胞仪检测疏水性热激活延迟发光分子4CzIPN的穿膜效率显示图；图5(b)为流式细胞仪检测SEQ ID NO：5包裹了疏水性热激活延迟发光分子4CzIPN的纳米粒子的5min细胞穿膜效率显示图；图5(c)为流式细胞仪检测SEQ ID NO：5包裹了疏水性热激活延迟发光分子4CzIPN的纳米粒子的15min细胞穿膜效率显示图。
图6为两亲性细胞穿膜肽包覆NAI-DPAC的纳米粒子与细胞共孵育后的激光共聚焦成像图(图中的标尺适用于其他图片)；其中图6(a)为NAI-DPAC与癌细胞Hela细胞共同孵育5min的激光共聚焦成像图；图6(b)为两亲性细胞穿膜肽包覆NAI-DPAC的纳米粒子与癌细胞Hela细胞共同孵育5min的激光共聚焦成像图；图6(c)为两亲性细胞穿膜肽包覆NAI-DPAC的纳米粒子与癌细胞Hela细胞共同孵育15min的激光共聚焦成像图。
图7为两亲性细胞穿膜肽包覆BTZ-DMAC的纳米粒子在细胞内的时间分辨成像图(图中的标尺适用于其他图片)；其中图7(a)为两亲性细胞穿膜肽包覆BTZ-DMAC的纳米粒子在细胞里的稳态成像图；图7(b)为两亲性细胞穿膜肽包覆BTZ-DMAC的纳米粒子在细胞里的时间门控延迟时间为0.05-2μs的成像图；图7(c)为两亲性细胞穿膜肽包覆BTZ-DMAC的纳米粒子在细胞里的时间门控延迟时间为0.1-2μs的成像图；图7(d)为两亲性细胞穿膜肽包覆BTZ-DMAC的纳米粒子在细胞里的时间门控延迟时间为0.5-2μs的成像图；图7(e)为两亲性细胞穿膜肽包覆BTZ-DMAC的纳米粒子在细胞里的时间门控延迟时间为1-2μs的成像图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
一种细胞穿膜肽，所述穿膜肽氨基酸序列为X-Y-(r-R)3-(R)2；
其中X是至少为3个且至多为20个氨基酸残基的肽链，所述X中各个氨基酸各自独立地选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或组氨酸；
其中Y是至多为20个任意氨基酸残基的肽链；
其中r为D型精氨酸；
其中R为L型精氨酸。
本发明所述穿膜肽中连续的精氨酸序列为高度亲水性的穿膜肽，可以介导穿膜；X中的氨基酸残基的疏水性较强，可与疏水性小分子自组装形成纳米颗粒。这两段肽决定了整个肽穿膜功能和负载疏水分子的功能，最终使制备的复合纳米粒子能够顺利进入细胞内。
Y为辅助性或功能性的肽，可以增加穿膜肽的水溶性、使穿膜肽具有定位功能，或者仅仅起到连接作用，以降低疏水段或包覆的疏水分子对精氨酸序列的影响。当Y为SEQ IDNO：1所示的序列时，具有穿细胞核的作用；当Y为SEQ ID NO：2所示的序列时，具有穿线粒体的作用；当Y为SEQ ID NO：3所示的序列时，具有穿溶酶体的作用。
实施例1
多肽序列的合成：SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示序列的多肽均由常见的氨基酸构成，采用经典的固相合成方法制备而成，这些肽序列经过液相色谱纯化后，纯度可以达到95％以上。
其中，纯化后的SEQ ID NO：4的HPLC谱图见图1，该序列的质谱：[M+3H]3+＝831.79。
其余肽的质谱如下：
所述的两亲性细胞穿膜肽的序列SEQ ID NO：5的质谱：[M+3H]3+＝706.81
所述的两亲性细胞穿膜肽的序列SEQ ID NO：6的质谱：[M+6H]6+＝465.43
所述的两亲性细胞穿膜肽的序列SEQ ID NO：7的质谱：[M+5H]5+＝598.18
所述的两亲性细胞穿膜肽的序列SEQ ID NO：8的质谱：[M+4H]4+＝716.91
所述的两亲性细胞穿膜肽的序列SEQ ID NO：9的质谱：[M+4H]4+＝680.65
所述的两亲性细胞穿膜肽的序列SEQ ID NO：10的质谱：[M+3H]3+＝570.35
所述的两亲性细胞穿膜肽的序列SEQ ID NO：11的质谱：[M+3H]3+＝1985.29
实施例2
两亲性细胞穿膜肽及其包覆疏水性分子的纳米粒子的制备方法
取1mg/mL的序列SEQ ID NO：4水溶液25μL，缓慢滴加至100μL0.25mg/mL的疏水性荧光分子尼罗红四氢呋喃溶液中，待其超声均匀后，加入900μL去离子水，得到分散性好、尺寸均一的纳米粒子。其透射电镜图见图2(a)，DLS图见图3(a)。
取1mg/mL的序列SEQ ID NO：5水溶液50μL，缓慢滴加至100μL0.25mg/mL的疏水性延迟发光分子4CzIPN(Ishimatsu Ryoichi,et al.Solvent effect on thermallyactivated delayed fluorescence by1,2,3,5-tetrakis(carbazol-9-yl)-4,6-dicyanobenzene.Journal of Physical Chemistry A(2013)117(27):5607-5612)四氢呋喃溶液中，待其超声均匀后，加入900μL去离子水，得到分散性好、尺寸均一的纳米粒子。其透射电镜图见图2(b)，DLS图见图3(b)。
取0.5mg/mL的序列SEQ ID NO：6水溶液25μL，缓慢滴加至100μL0.5mg/mL的疏水性延迟发光分子NAI-DPAC(WenxuanZeng,et al.Achieving Nearly 30％External QuantumEfficiency for Orange-Red Organic Light Emitting Diodes by EmployingThermally Activated Delayed Fluorescence Emitters Composed of 1,8-Naphthalimide-Acridine Hybrids.Advanced Materials(2017)30(5))，待其超声均匀后，加入800μL去离子水，得到分散性好、尺寸均一的纳米粒子。其透射电镜图见图2(c)，DLS图见图3(c)。
取2mg/mL的序列SEQ ID NO：7水溶液75μL，缓慢滴加至100μL0.75mg/mL的疏水性延迟发光分子BTZ-DMAC(Fan Ni,et al.Teaching an old acceptor new tricks:rationally employing 2,1,3-benzothiadiazole as input to design a highlyefficient red thermally activated delayed fluorescence emitter.Journal ofMaterials Chemistry C(2017)5:1363-1368)，待其超声均匀后，加入900μL去离子水，得到分散性好、尺寸均一的纳米粒子。其透射电镜图见图2(d)，DLS图见图3(d)。
取1mg/mL的序列SEQ ID NO：8水溶液50μL，缓慢滴加至100μL0.5mg/mL的疏水性药物分子紫杉醇的四氢呋喃溶液中，待其超声均匀后，加入900μL去离子水，得到分散性好、尺寸均一的纳米粒子。其透射电镜图见图2(e)，DLS图见图3(e)。
取1mg/mL的序列SEQ ID NO：9水溶液100μL，缓慢滴加至100μL1mg/mL的疏水性聚集诱导发光聚合物分子PTPES-PEO的四氢呋喃溶液中，待其超声均匀后，加入800μL去离子水，得到分散性好、尺寸均一的纳米粒子。其透射电镜图见图2(f)，DLS图见图3(f)。
纳米粒子的制备方法还可以采用自组装沉淀法、纳米沉淀发、乳液挥发法、界面不稳定、喷雾干燥法、微流控技术或者模板法制备。
上述疏水性荧光分子、磷光分子、聚集诱导发光分子可以根据参考文献合成或者购于试剂公司。具有疏水性质的分子均可按照上述方法制备纳米粒子。所用的肽可以是其他一种或两种以上设计的细胞穿膜肽，也可与其它功能性肽如具有靶向功能的多肽或高分子共混后，再与疏水分子共组装从而得到纳米粒子。
实施例3
MTT检测两亲性细胞穿膜肽及其包覆尼罗红纳米粒子的细胞毒性实验
从同一批次原代癌细胞Hela细胞和正常细胞3T3细胞中分别接种相同数目(1.5×104/孔)的细胞于96孔板中，在完全培养基、37℃、5％CO2的环境下培养12h，细胞贴壁。加入10μL上述制备出的尼罗红纳米粒子，混合均匀后在37℃、5％CO2环境下分别孵育24h。孵育后加入MTT(5mg/mL)，接着孵育4h，吸走上层液体，加入100μL DMSO溶液。通过酶标仪，在570nm下检测各孔的吸收值。酶标仪的型号：Tecan Infinite F50。
通过MTT法检测了两亲性细胞穿膜肽及其包覆尼罗红纳米粒子的细胞毒性。图4(a)显示了两亲性细胞穿膜肽在孵育24h后，癌细胞Hela细胞与正常细胞3T3细胞的细胞活性并无显著降低，显示了很低的细胞毒性。图4(b)显示了，两亲性细胞穿膜肽包覆尼罗红的纳米粒子在HeLa或者3T3细胞中孵育24h后，细胞活性并无显著降低。
实施例4
两亲性细胞穿膜肽包覆包覆4CzIPN的纳米粒子穿膜效率实验
从同一批次原代Hela细胞接种相同数目(1.0×105/孔)的细胞于12孔板中，在完全培养基、37℃、5％CO2环境下培养12h，细胞贴壁。加入100μL上述制备出的任一纳米粒子，如两亲性细胞穿膜肽包覆4CzIPN的纳米粒子，混合均匀后在37℃、5％CO2环境下分别孵育5min，15min。接着用PBS(pH值为7.2)清洗3次以上，再用胰酶溶液消化细胞。将消化下来的细胞分散在PBS溶液中1000rpm离心5min，除去上清液，重复3次。流式细胞仪型号：Guava,Easy-Cyte。
与癌细胞Hela细胞共同孵育5min与15min的纳米粒子，用流式细胞仪检测出细胞中有明显的荧光信号，见图5(b)和5(c)，未使用两亲性细胞穿膜肽包覆的4CzIPN基本没有检测出荧光信号，其穿膜效率见附图5(a)。本发明设计的两亲性细胞穿膜肽可载尺寸为200nm左右的纳米粒子，在5min内进入细胞，具有较高的穿膜效率。
实施例5
两亲性细胞穿膜肽包覆NAI-DPAC的纳米粒子与细胞共孵育后的激光共聚焦成像
从同一批次原代Hela细胞接种相同数目(5.0×105/孔)的细胞于24孔板里，在完全培养基、37℃、5％CO2环境下培养12h，使细胞贴壁。加入50μL上述制备出的NAI-DPACCPP纳米粒子，混合均匀后在37℃、5％CO2环境下分别孵育5min，15min。接着用PBS(pH值为7.2)清洗3次以上，用4％多聚甲醛固定以后，再用PBS洗3次，封片，上镜观察。
成像条件：所有的细胞样品通过激光共聚焦显微镜FV3000在油镜100×下观察。NAI-DPACCPP纳米粒子在405nm激发，在650-750nm接收信号。共聚焦显微镜型号：OlympusFV3000。
两亲性细胞穿膜肽包覆NAI-DPAC的纳米粒子与细胞共孵育后的激光共聚焦成像图见附图6。图6(a)为不含多肽的NAI-DPAC CPP纳米粒子与细胞共孵育5min的共聚焦成像图，图6(b)与图6(c)为NAI-DPACCPP纳米粒子与细胞共孵育5min，15min的共聚焦成像图。未使用两亲性细胞穿膜肽包覆的NAI-DPAC与细胞共孵育5min时未见明显荧光；两亲性细胞穿膜肽包覆NAI-DPAC纳米粒子与细胞共孵育5min时，细胞内出现明显的荧光；共孵育15min，细胞内的荧光信号更强。本发明设计的两亲性细胞穿膜肽可载尺寸为200nm左右的纳米粒子，在5min内进入细胞。
实施例6
两亲性细胞穿膜肽包覆BTZ-DMAC的纳米粒子在细胞内的时间分辨成像
从同一批次原代HeLa细胞接种相同数目(5.0×105/孔)的细胞于24孔板里，在完全培养基、37℃、5％CO2环境下培养12h，使细胞贴壁。加入50μL上述制备出的BTZ-DMAC CPP纳米粒子，混合均匀后在37℃、5％CO2环境下分别孵育16h。接着用PBS(pH值为7.2)清洗3次以上，上镜观察。
成像条件：所有的细胞样品在活细胞成像系统(OLYMPUS,Xcellence)中进行时间分辨发光成像。时间分辨成像装置在OLYMPUS IX81激光共聚焦显微镜上集成。通过配备TCSPC的共焦显微镜系统检测荧光信号，并使用PicoQuant GmbH提供的专业软件对数据进行相关计算。激发光为脉冲二极管激光器(PicoQuant,PDL 800-D)的频率为0.5MHz，405nm，聚焦于40x物镜(NA0.95)对样品单光子激发。选用的热激活延迟发光分子的发光寿命不同，随着时间门控细胞成像延迟时间的增加，纳米粒子的发光衰减也不同。附图7(a)-图7(e)显示了两亲性细胞穿膜肽包覆BTZ-DMAC的纳米粒子孵育的细胞在延迟时间达到1微秒时仍有许多发光信号。本发明设计的两亲性细胞穿膜肽可载尺寸为200nm左右的纳米粒子进入细胞，实现时间分辨成像。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<120> 穿膜肽及其包覆疏水分子的粒子和粒子的制备方法与应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Arg Lys Arg Gln Arg
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Lys Phe Arg
1
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Lys Arg Asn Gln Tyr Lys
1 5
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Phe Phe Phe Phe Phe Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg
20
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
His His His His His His Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Phe Phe Phe Leu Leu Leu Gly Arg Arg Lys Arg Gln Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg
20
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Phe Phe Trp Trp Phe Phe Phe Gly Lys Phe Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Phe Pro Phe Pro Phe Pro Gly Lys Arg Asn Gln Tyr Lys Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Arg
20
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Phe Phe Phe Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
1 5 10 15
Phe Phe Phe Phe Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
35 40 45

Claims (10)

1.一种细胞穿膜肽，其特征在于，所述穿膜肽氨基酸序列为X-Y-(r-R)3-(R)2；
其中X是至少为3个且至多为20个氨基酸残基的肽链，所述X中各个氨基酸各自独立地选自苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或组氨酸；
其中Y是至多为20个任意氨基酸残基的肽链；
其中r为D型精氨酸；
其中R为L型精氨酸。
2.如权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，所述Y是至少含有2个且至多含有10个氨基酸的肽链，所述Y中各个氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
3.如权利要求1所述的细胞穿膜肽，其特征在于，所述Y的氨基酸序列为SEQ ID:1、SEQID:2或SEQ ID:3。
4.一种细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子由权利要求1-3任意一种细胞穿膜肽包覆疏水分子构成，所述穿膜肽与疏水分子通过非共价的分子间疏水作用力结合。
5.如权利要求4所述的细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子，其特征在于，所述疏水分子为疏水发光分子、疏水药物分子、疏水生物大分子和疏水高分子中的至少一种；
优选地，所述疏水发光分子为疏水荧光分子和/或疏水磷光分子；
优选地，所述疏水发光分子为疏水室温磷光分子、疏水热激活延迟发光分子和疏水聚集诱导发光分子中的至少一种。
6.一种细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子的制备方法，其特征在于，将权利要求1-3任一所述的细胞穿膜肽与疏水分子自组装，得到所述细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子；所述细胞穿膜肽与疏水分子通过非共价的分子间疏水作用力结合。
7.如权利要求6所述的细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述疏水分子为疏水发光分子、疏水药物分子、疏水生物大分子和疏水高分子中的至少一种；
优选地，所述疏水发光分子为疏水荧光染料分子和/或疏水磷光分子；
优选地，所述疏水发光分子为疏水室温磷光分子、疏水热激活延迟发光分子和疏水聚集诱导发光分子中的至少一种。
8.如权利要求6所述的细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述自组装为权利要求1-3任一所述的细胞穿膜肽和具有靶向功能的多肽与疏水分子自组装。
9.权利要求1-3任一所述的细胞穿膜肽用于包覆疏水分子的应用，优选地，用于包覆疏水药物的应用。
10.权利要求4所述的细胞穿膜肽包覆疏水分子的纳米粒子用于细胞成像的应用，优选地，用于细胞时间分辨成像的应用。
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