CN104027308A - bFGF长循环脂质体、制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种bFGF长循环脂质体、制备及其应用,制备长循环脂质体的原料为包括大豆卵磷脂、胆固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、以及bFGF。本发明的bFGF长循环脂质体包封率高、稳定性好,对治疗牵张性脊髓损伤具有较好的疗效。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域,具体而言,涉及一种bFGF长循环脂质体、制备及其应用。
背景技术
牵张性脊髓损伤是脊柱矫形手术的常见并发症,在早期使用的Harrington、Luque、Dick和Cotrel-Dubousset等脊柱矫形复位手术中时有发生。随着CD、TSRH等三维矫形器械及诱发电位术中监护的相继应用,脊柱侧凸畸形矫正的手术适应证不断扩大,效果也越来越好。但随之而来的医源性牵张性脊髓损伤仍然是个严重的问题。因此,各种原因造成的脊柱过度牵拉并由之引发的脊髓牵张性损伤逐渐被关注。目前对牵张性脊髓损伤的治疗效果和预后均不够理想,主要是因为牵张性脊髓损伤后的病理生理机制非常复杂,对其认识还不够全面、深入。因此,寻求新的、更加有效的治疗方法,以及更透彻地阐明牵张性脊髓损伤所涉及的复杂机制,更有效地评估牵张性脊髓损伤后处理手段的正确性是目前的研究热点。
脊髓损伤的治疗至今是个难题,如何有效地治疗脊髓损伤并促进损伤脊髓的功能恢复,一直是国内外研究的重点。应用神经营养因子修复脊髓损伤,是该领域最具潜力的研究方向之一。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)属于成纤维细胞生长因子(FGF)总族,是一种具有广泛生物学活性的肽类生长因子,可诱导起源于中胚层和神经外胚层的多种细胞的增殖与分化,因而在胚胎发育、血管形成、创伤修复等方面发挥着重要作用,其在神经系统中的作用尤为突出。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是近年来被关注程度较高的一种神经营养因子,其神经营养作用包括促进神经细胞再生和存活。在体外试验中发现,bFGF以剂量依赖方式促进多种神经元再生并延长存活时间,且在体内能促进外周神经损伤的修复与再生[8-9]。bFGF几乎存在于包括中枢神经系统的所有组织中,在中枢神经系统损伤后它可能被释放。近期研究表明,脊髓损伤可明显增加损伤后神经元bFGFmRNA的表达,并且bFGF主要在脊髓中间神经元和前角的运动神经元中表达,其表达的高峰出现于损伤后1~7天,此后开始逐渐下降[10]。提示bFGF可能对损伤神经元有保护作用。在体外实验中,bFGF对多种体外培养的神经元都具有营养作用,可以促进突起生长和神经元的成活,有中枢性的神经元,包括皮层、海马、丘脑、脊髓等的神经元;也有周围性神经元,包括视网膜神经节和睫状神经节细胞。其中中枢神经元较多,说明bFGF对中枢神经的营养作用较强。Kojima[11]等研究发现脊髓损伤后早期连续给予外源性bFGF可以对脊髓损伤区域起到明显的保护作用,促进脊髓功能的恢复。但bFGF如何保护脊髓组织,其间的信号传递通路及存在哪些调控因素,值得研究。bFGF对脊髓损伤后神经细胞凋亡相关蛋白的影响机理也尚待研究。
脊髓损伤及其继发性病理生理反应可直接导致神经功能损害,引起组织器官功能障碍,致残率非常高。对其研究的难题之一就是如何建立一个可以确实模拟实际损伤情况、定量的、可重复性的动物模型,使其病理过程能恰如其分地复制到模型动物身上,应用于脊髓损伤后的研究。目前关于脊髓损伤的实验研究多以诱发电位来判断和评价脊髓神经功能的变化,诱发电位检测的解剖生理学基础与脊髓的病理改变密切相关,为临床上如何防止牵张性脊髓损伤提供了重要的实验依据,也为临床脊柱手术中脊髓功能监护提供了有益的参考。当脊髓受到牵张性损害时,有学者主张以P1波幅降低50%作为临界线[21-24]。Fehlings等[25-26]观察脊髓运动、感觉诱发电位和脊髓血流变化,以了解牵张性脊髓损伤后运动传导束和感觉传导束轴突功能的改变与脊髓血流变化的相互关系。线性判断分析结果显示运动、感觉诱发电位振幅的衰减与脊髓损伤程度和脊髓损伤血流量递减有明显关联,并且认为脊髓损伤程度和损伤部位血流量的下降存在线性关系(r=-0.89)。目前,一些实验研究试图解释牵张性脊髓损伤机制,包括脊髓机械性牵张损伤、脊髓微血管内皮细胞损伤、肿胀和活性胺类或血管收缩因子的释放等,认为牵张性脊髓损伤应是综合因素所致,但确切机制仍不十分清楚。
相关的问题还在于,血液循环中的大分子药物(主要为蛋白质及肽类)一直被认为是无法通过血脑(脊髓)屏障的,即使药物进入中枢神经系统也达不到有效剂量。bFGF分子量较大(18KDa),难以通过血脑屏障。且bFGF本身对热、酸和有机溶剂均不稳定,56℃作用5min或酸性条件下(pH=2.0)作用2h可失活。在体内复杂内环境下半衰期很短,仅3~5分钟即在生物体内被迅速灭活而无法达到治疗目的[14]。目前尚无使用bFGF的具体方案,其使用剂量和疗程也有待作进一步研究。因此,bFGF必须经过加工修饰,以延长bFGF在血浆中的存留时间,从而增加bFGF透过血脑屏障的量,其中脂质体包裹bFGF是一种有希望的解决方法。
脂质体(liposomes)或称类脂小球、脂囊泡,是一种定向药物载体,属于靶向给药系统的一种类似微型胶囊的新剂型。脂质体形状为球形,直径大小约为几十纳米到几十微米。然而,如何制备具有较高包封率、稳定性好的bFGF长循环脂质体,以提高其在治疗牵张性脊髓损伤的疗效是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷,提供一种稳定性和包封率高的bFGF长循环脂质体、制备及其应用。为了实现本发明的目的,拟采用如下技术方案。
本发明一方面涉及一种bFGF长循环脂质体,其特征在于制备长循环脂质体的原料为包括大豆卵磷脂、胆固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、以及bFGF。
在本发明的一个优选实施方式中,所述的原料重量配比为15-25:4-6:1.5-2.5:0.1;优选为20:5:2.2:0.1。
在本发明的一个优选实施方式中,所述的bFGF长循环脂质体通过如下的步骤制备得到:
(1)用茄形瓶称取大豆卵磷脂、胆固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000以及bFGF,加入氯仿使之完全溶解;
(2)使用旋转蒸发仪利用旋转蒸发法抽去溶液中的氯仿,在茄形瓶瓶底以及内壁形成一层均匀的脂质薄膜;
(3)真空干燥器内放置过夜;
(4)加入10%的蔗糖溶液作为保护剂,使用恒温空气摇床,在25℃、300rpm、4h的条件下,使脂质膜充分水化;
(5)水化后通过0.22μm聚碳酸酯膜整粒5次,即得到包载bFGF的脂质体;
(6)sephadexG-50葡聚糖凝胶预先用10%蔗糖平衡过夜,将制得的脂质体通过葡聚糖凝胶柱分离除去游离的bFGF。
在本发明的一个优选实施方式中,所述的bFGF长循环脂质体平均粒径介于190-250nm之间,ζ电位为-20mV以下。
在本发明的一个优选实施方式中,所述的bFGF长循环脂质体能够在4℃能稳定存放1个月以上。
本发明另一方面还涉及上述bFGF长循环脂质体在治疗牵张性脊髓损伤中的应用。
具体实施方式:
实施例1
1.薄膜分散法制备bFGF长循环脂质体
(1)用茄形瓶称取20mg SPC(大豆卵磷脂)、5mg Chol(胆固醇)、2.2mg DSPE-PEG2000(二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000)、100μg bFGF,加入氯仿使之完全溶解(所用器具均先在紫外灯下辐射灭菌);
(2)使用旋转蒸发仪利用旋转蒸发法抽去溶液中的氯仿,在茄形瓶瓶底以及内壁形成一层均匀的脂质薄膜;
(3)真空干燥器内放置过夜;
(4)加入10%的蔗糖溶液作为保护剂,使用恒温空气摇床,在25℃、300rpm、4h的条件下,使脂质膜充分水化;
(5)水化后通过0.22μm聚碳酸酯膜整粒5次,即得到包载bFGF的脂质体;
(6)sephadexG-50葡聚糖凝胶预先用10%蔗糖平衡过夜,将制得的脂质体通过葡聚糖凝胶柱分离除去游离的bFGF。
bFGF长循环脂质体的外观、色泽及稳定性
制备的bFGF长循环脂质体溶液样本呈半透明混悬液状,溶液均匀、无任何沉淀及漂浮颗粒物。将得到的bFGF长循环脂质体溶液样本(粒径=194.8nm,ζ-电位=-24.78mV)放置于4℃恒温冰箱进行稳定性测试,并测定放置1月后的bFGF长循环脂质体溶液样本的粒径。结果显示:在4℃冰箱放置1月后,bFGF长循环脂质体溶液样本能保持较好的稳定性,溶液未发生明显沉淀。且脂质体的粒径测定表现出较好的一致性(粒径=204.6nm,ζ-电位=-21.92mV),与刚制备出的样本相比并无明显差异。
bFGF长循环脂质体包封率的测定
bFGF酶联免疫吸附剂测定(ELISA)方法的建立
(1)一抗浓度的筛选:
固定二抗浓度,对一抗浓度1000ng/ml,500ng/ml进行筛选。用pH9.6的包被液将bFGF标准品稀释至以下浓度:100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、0.78125ng/ml,依次加入96孔板中,每孔100μl,4℃下包被过夜;用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次;每孔加入300μl1%BSA封闭液,约封闭2h;用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次;将两种浓度的一抗加入96孔板中,每孔加入100μl,37℃放置2h;用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次;每孔加入800ng/ml的二抗,37℃放置1h;分别用PBS洗涤液、超纯水洗板2次,每孔加入100μl反应液,37℃反应30min;每孔加入50μlH2SO4终止反应,酶标板测得荧光。
(2)二抗浓度的筛选
固定一抗浓度,对二抗浓度800ng/ml,400ng/ml,200ng/ml进行筛选。用pH9.6的包被液将bFGF标准品稀释至以下浓度:100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、0.78125ng/ml,依次加入96孔板中,每孔100μl,4℃下包被过夜;用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次;每孔加入300μl1%BSA封闭液,约封闭2h;用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次;将500ng/ml的一抗加入96孔板中,每孔加入100μl,37℃放置2h;用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次。将三种浓度的二抗分别加入96孔板中,37℃放置1h;分别用PBS洗涤液、超纯水洗板2次,每孔加入100μl反应液,37℃反应30min;每孔加入50μlH2SO4终止反应,酶标板测得荧光。
ELISA法测定bFGF脂质体包封率
(1)取留样脂质体和过柱后的脂质体各30μl,按一下步骤平行操作:用PBS稀释液稀释至300μl,加入氯仿900μl,混合均匀;4℃8000rpm离心20min,取水相40μl,用pH9.6的包被液定容至2ml;
(2)用pH9.6的包被液将bFGF标准品稀释至以下浓度:100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5625ng/ml、0.78125ng/ml;将bFGF标准品、留样脂质体和过柱后的脂质体依次加入96孔板中,每孔100μl,4℃下包被过夜;
(3)用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次;
(4)每孔加入300μl1%BSA封闭液,约封闭2h;
(5)用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次;
(6)用pH7.4的PBS将一抗配至500ng/ml的浓度,每孔加入100μl的一抗,37℃放置2h;
(7)用PBS洗涤液洗板,每孔300μl,洗板2次;
(8)用pH7.4的PBS将二抗配至800ng/ml的浓度,每孔加入100μl的二抗,37℃放置1h;
(9)分别用PBS洗涤液、超纯水洗板2次,每孔加入100μl反应液,37℃避光显色反应30min;
(10)每孔加入50μlH2SO4终止反应,酶标板测得荧光光密度(OD值)。
得出由浓度-OD值绘制得到bFGF的标准曲线,根据:
(1)包封率=[(投入药量-液体介质中游离的药量)/总投入药量]×100%
投入药量-液体介质中游离的药量=被包封药量,即W包
总投药量即W总
包封率=(W包/W总)×100%。
(2)过柱前bFGF脂质体样品(即为包含游离bFGF的样品),测定的OD值为0.351,依据标准曲线可知脂质体中bFGF含量为17.54ng/ml;
(3)过柱后bFGF脂质体样品(即为已经过滤出游离bFGF后的样品),测定的OD值为0.21,依据标准曲线可知脂质体中bFGF含量为10.233ng/ml;
(4)bFGF脂质体的包封率:
包封率=(W包/W总)×100%=(10.233/17.54)×100%=58.3%
2.bFGF长循环脂质体对大鼠牵张性脊髓损伤神经细胞凋亡的影响
将168只SPF级健康Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为4组:
适应性喂养一周后,采用随机数字表法将实验用大鼠随机分为4组。每组造模后又分6h,ld,3d,1w,2w,4w,6w七个时相点,每个时相点6只大鼠。动物分组情况:
假手术组(Sham组)42只,麻醉后手术行椎板切除,在椎旁安放脊柱撑开器,但不撑开,不造成脊髓损伤。
牵张性脊髓损伤组(tractive spinal cord injury,TSCI组)42只,手术行椎板切除,在椎旁安放脊柱撑开器,撑开至SEPP1波幅下降至正常波幅的70%,持续10min,损伤脊髓,不用药物治疗。
牵张性脊髓损伤后蛛网膜下腔灌注bFGF长循环脂质体组(bFGFlong-circulating liposome by subarachnoid spaceinfusion,bFGF+LCL SSI组)42只,椎板切除后脊柱撑开至SEP P1波幅下降至正常波幅的70%,持续10min,造成脊髓损伤,蛛网膜下腔置管每日灌注bFGF脂质体20μg/Kg体重,连续7日。
牵张性脊髓损伤后尾静脉注射bFGF长循环脂质体组(bFGFlong-circulating liposome by injection through venacaudalis,bFGF+LCLIV组)42只,椎板切除后脊柱撑开至SEPP1波幅下降至正常波幅的70%,持续10min,造成脊髓损伤,然后每日经尾静脉注射bFGF长循环脂质体20μg/Kg体重,连续7日。
每组42只大鼠。Sham组只切除椎板,但是不牵拉脊髓。TSCI组、bFGF+LCL IV组、bFGF+LCL SSI组,以自行设计制造的大鼠脊柱撑开器造成牵张性脊髓损伤,牵张至SEP P1波幅下降至正常水平的70%,维持10min。bFGF+LCL IV组在术后即刻、术后第1~6d,共7次经大鼠尾静脉注入bFGF长循环脂质体(20ug/Kg体重);bFGF+LCL SSI组在术后即刻、术后第1~6d,共7次经大鼠背部导管将bFGF长循环脂质体(20ug/Kg体重)注入蛛网膜下腔。分别在术后ld,1w,2w,3w,4w,6w六个时相点,每组随机选取6只大鼠应用改良Gale联合功能评分法(ICBS)进行功能评分。每组分别在术后6h,ld,3d,1w,2w,4w六个时相点,每个时相点每组随机选取6只大鼠行4%多聚甲醛心脏灌注固定,处死并取损伤区脊髓组织,分别行HE染色、尼氏染色、免疫组织化学染色和TUNEL法标记。观察并比较牵张性脊髓损伤后脊髓组织大体情况和Fas-L、TNF-α、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p53的阳性细胞比率以及脊髓细胞凋亡指数(AI)。采用Pearson相关性分析对AI与Fas-L、TNF-α、Caspase-3、Bcl-2、Bax、p53之间的相关性进行分析。
结果:在术后ld、1w、2w、3w、4w、6w,每组随机选取6只大鼠进行ICBS评分。各组大鼠1d、1w时ICBS评分未见明显差异(P>0.05);从2w开始,bFGF+LCLIV组与bFGF+LCLSSI组评分明显高于TSCI组(P<0.05),而bFGF+LCLIV组在2w~6w4个时间点的评分优于bFGF+LCLSSI组,具有显著性差异(P<0.05)。免疫组织化学染色和TUNEL标记的结果。A.损伤组与治疗组比较:bFGF长循环脂质体治疗组在伤后1d~4w各个时间点的AI以及Fas-L、Caspase-3、Bax、p53的阳性细胞率明显低于损伤组,Bcl-2的阳性细胞率明显高于损伤组,二组之间有显著性或者非常显著性差异(P<0.05,或P<0.01);以上指标在伤后6h均无显著性差异。治疗组TNF-α阳性细胞率在伤后6h~1w各个时间点明显低于损伤组,二者之间有显著性或者非常显著性差异(P<0.05,或P<0.01),伤后2w、4w无显著性差异。B.两治疗组比较:bFGF+LCL IV组的AI以及Fas-L、Caspase-3、Bax、p53的阳性细胞率在伤后1d~2w低于bFGF+LCL SSI组,存在显著性差异(P<0.05);伤后6h、4w无显著性差异;bFGF+LCL IV组的Bcl-2在伤后3d~2w高于bFGF+LCL SSI组,存在显著性差异(P<0.05),其余时间点无显著性差异;bFGF+LCL IV组的TNF-α在伤后6h~3d低于bFGF+LCL SSI组,存在显著性差异(P<0.05),其余时间点无显著性差异。经Pearson相关系数验证,各组AI与Fas-L、Caspase-3、Bax、p53、Bcl-2的表达在各个时间点上存在较高的相关性;与TNF-α无明显相关性。
以上所述是本发明的优选实施例,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种bFGF长循环脂质体,其特征在于制备长循环脂质体的原料为包括大豆卵磷脂、胆固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000、以及bFGF。
2.根据权利要求1所述的bFGF长循环脂质体,所述的原料重量配比为15-25:4-6:1.5-2.5:0.1;优选为20:5:2.2:0.1。
3.根据权利要求1所述的bFGF长循环脂质体,所述的bFGF长循环脂质体通过如下的步骤制备得到:
(1)用茄形瓶称取大豆卵磷脂、胆固醇、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇2000以及bFGF,加入氯仿使之完全溶解;
(2)使用旋转蒸发仪利用旋转蒸发法抽去溶液中的氯仿,在茄形瓶瓶底以及内壁形成一层均匀的脂质薄膜;
(3)真空干燥器内放置过夜;
(4)加入10%的蔗糖溶液作为保护剂,使用恒温空气摇床,在25℃、300rpm、4h的条件下,使脂质膜充分水化;
(5)水化后通过0.22μm聚碳酸酯膜整粒5次,即得到包载bFGF的脂质体;
(6)sephadexG-50葡聚糖凝胶预先用10%蔗糖平衡过夜,将制得的脂质体通过葡聚糖凝胶柱分离除去游离的bFGF。
4.根据权利要求3所述的bFGF长循环脂质体,所述的bFGF长循环脂质体平均粒径介于190-250nm之间,ζ电位为-20mV以下。
5.根据权利要求3所述的bFGF长循环脂质体,所述的bFGF长循环脂质体能够在4℃能稳定存放1个月以上。
6.权利要求1-5任意一项所述的bFGF长循环脂质体在治疗牵张性脊髓损伤中的应用。
7.权利要求1-5任意一项所述的bFGF长循环脂质体在制备治疗牵张性脊髓损伤药物中的应用。
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CN106265518A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-04 | 河南佰柯生物科技有限公司 | Fgf脂质体及其制备方法 |
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CN107320716A (zh) * | 2017-06-27 | 2017-11-07 | 珠海亿胜生物制药有限公司 | 碱性成纤维细胞生长因子囊泡及其制备方法 |
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