CN1660410A - 一种bFGF脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种bFGF脂质体及其制备方法，该脂质体包封的药物为bFGF，脂质体的膜材为磷脂、胆固醇和其他脂质成分，可通过薄膜分散法、表面活性剂处理法、钙融合法、加压挤出法等方法制备该脂质体，也可将上述方法制备的脂质体加入适宜的冻干保护剂后冷冻干燥或采用冻干重建法制备前体脂质体冻干粉剂，临用前水化。其冻干粉剂白色细腻、疏松不塌陷粘连，稳定性好，易水化。水化后粒径均匀，粒度可控制在40－1000nm范围内，包封率可达60％以上。该制剂可用于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、病变部位直接注射、手术埋植、口服给药、肺部及粘膜给药和眼部给药等多种给药途径。
Description
技术领域：
本发明属于医药技术领域。确切地说它是一种bFGF脂质体及其制备方法。
背景技术：
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一个由146个氨基酸组成，分子量16-18kD，等电点为9.6的阳离子多肽。bFGF的分布极为广泛，在脑、脑垂体、丘脑下部、软骨、骨、睾丸、前列腺、卵巢、黄体和胎盘中都能提取到，而在心、肝、胃、眼、肾上腺皮质、神经节中也有bFGF存在。bFGF是一种很强的丝裂原，具有促进各种软组织损伤修复的作用，可用于创伤、烧伤、溃疡等的治疗。它可以促进毛细血管的生长分化和侧支循环的建立，有利于改善局部组织的微循环，参与胃溃疡的愈合过程以及参与心肌缺血与心肌梗塞的修复过程。它还可以促进神经组织再生，加速神经损伤的修复。因而，bFGF有着重要的药物开发价值。1996年我国在大肠杆菌中表达成功表达了bFGF，实现了大规模生产，使bFGF的临床应用成为可能，
但bFGF体外稳定性差、体内半衰期短且无特异性作用靶点，临床应用局限较多，因而对于具有缓控释作用的bFGF制剂的研究尤为重要。脂质体是目前研究较多的一类药物传递系统，可作为蛋白多肽类药物的理想载体，具有增加蛋白多肽类药物体内外稳定性、体内缓释延长半衰期及靶向治疗作用等优势，局部应用时还可以增加药物与局部组织的亲和性，减少刺激性。bFGF稳定性较差，对热、酸及有机溶剂敏感，56℃作用5min或酸性条件下(pH＝2.0)作用2h可失活，采用冻干重建法制备脂质体可使制剂中bFGF的原有生物活性不受影响。目前已有bFGF缓释微球、缓释微囊、胶原海绵的研究报道，但尚无bFGF脂质体及其制备方法和用途的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种粒径均匀，粒度可控在40-1000nm范围内，冻干制剂稳定性好，易水化，包封率60％以上的bFGF脂质体及其制备方法。
该脂质体包封的药物为bFGF，脂质体的膜材为磷脂、胆固醇和其他脂质成分，可通过薄膜分散法、表面活性剂处理法、钙融合法、加压挤出法等方法制备该脂质体，也可将上述方法制备的脂质体加入适宜的冻干保护剂后冷冻干燥或采用冻干重建法制备前体脂质体冻干粉剂，临用前水化。
该bFGF脂质体的制备方法包括以下步骤：
(1)可采用薄膜分散法、表面活性剂处理法、钙融合法、加压挤出法等方法直接制备bFGF脂质体；
(2)可将(1)中制备好的bFGF脂质体加入适宜的冻干保护剂冷冻干燥，密封，4℃保存，用前加适量无菌生理盐水稍加振荡，室温水化即可；
(3)可采用任何脂质体制备方法制备空白小单室脂质体，然后加入制剂量bFGF和适宜的冻干保护剂冷冻干燥，密封，4℃保存，用前加适量无菌生理盐水，稍加振荡，室温水化即可；
(4)也可将(1)、(2)、(3)中制备的bFGF脂质体制成脂质体气雾剂或喷雾剂。
该制剂可用于制备静脉注射、肌肉注射、皮下注射、病变部位直接注射、手术埋植、口服给药、肺部及粘膜给药和眼部给药等多种剂型。
本发明的优点是，所提供的bFGF脂质体制备工艺不影响bFGF的原有生物活性，其冻干粉剂为白色细腻、疏松不塌陷粘连，稳定性好，易水化。水化后可用于治疗创伤、烧伤、软组织损伤、各类溃疡、改善局部组织微循环的局部给药，可用于促进消化道(胃、肠)溃疡愈合的口服给药，可用于治疗心肌缺血和神经损伤的静脉给药。
附图说明：
图1为脂质体制备工艺对bFGF生物活性的影响。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步详细描述。
实施例1：bFGF脂质体冻干粉及水化后的形态
按PC∶Chol∶PG(100∶25∶10，W/W)制备100nm左右的小单室空白脂质体，加入100μg/mL的bFGF和5％的蔗糖混匀后冷冻干燥，得到的冻干粉白色、较细腻、疏松不塌陷粘连，稳定性好，易水化，水化后粒径均匀，呈半透明乳状。
实施例2：脂质体制备工艺对bFGF生物活性的影响
取适量bFGF原液加入1mL小单室空白脂质体混和液或薄膜分散法室温水化挤出整粒制备bFGF脂质体，加入10％蔗糖作为冻干保护剂，混匀，冷冻干燥，密封，4℃保存。选用对数生长期的BalB 3T3细胞，采用MTT法检测bFGF脂质体中bFGF的促细胞增殖活性。测定时将1mL无菌生理盐水加入冻干粉中，稍加振荡，粉末立即溶解形成半透明乳状液，该脂质体溶液中bFGF浓度为113μg/mL，用相同浓度的bFGF生理盐水溶液作对照，考察本发明所提供的脂质体制备工艺对bFGF生物活性的影响(附图1)。薄膜分散法室温水化挤出整粒制备bFGF脂质体冻干粉、空白脂质体冻干重建法制备的bFGF脂质体冻干粉及对照bFGF水溶液的活性测定结果见附图1，三条活性曲线几乎重合。表明与对照bFGF水溶液相比，薄膜分散法室温水化挤出整粒制备bFGF脂质体再冻干与空白脂质体冻干重建法制备的bFGF脂质体对bFGF生物活性均无影响。
实施例3：不同处方的bFGF脂质体的粒径及包封率
按表1中处方制备小单室空白脂质体，PC用量为1％，平均粒径100nm左右。空白脂质体加入处方量的bFGF和蔗糖混匀后冻干。粒径及包封率测定时将1mL无菌生理盐水加入冻干粉中，稍加振荡，观察水化速度和状态。采用超速离心法分离脂质体与游离药物后，取上清游离药物溶液用bFGF-ELISA试剂盒测定bFGF的量，计算游离药物量。包封率＝(总投药量-游离药物量)/总投药量。NICOMP-380/ZLS激光粒度测定仪测定脂质体粒径。结果见表1。
可知PG的加入能够增加脂质体的包封率，由于PG的加入增加了蛋白与脂质体的静电吸附作用，从而使包封率有所增加，但当PG加入达15％时水化较慢且呈粘稠乳状，因此PG加入量选用10％较适宜，包封率可达60％以上。糖脂比增加包封率降低，水化分散更快，粒径减小，粒径分布更均匀，综合考虑粒径与包封率两因素选择糖脂比3∶1-5∶1较适宜。bFGF投入量由50μg/mL增至200μg/mL时，包封率的变化成抛物线状，bFGF投入量100μg/mL时包封率最高。
表1 bFGF脂质体处方影响因素考察
| 样品 | PC∶Chol∶PG(W/W) | bFGF(μg/mL) | 蔗糖∶磷脂(W/W) | 包封率(％) | 粒径(nm) | 水化情况 |
| 123456789 | 100∶25∶0100∶25∶5100∶25∶10100∶25∶15100∶25∶10100∶25∶10100∶25∶10100∶25∶10100∶25∶10 | 10010010010010010015020050 | 5∶15∶15∶15∶11∶13∶15∶15∶15∶1 | 54.6475.0083.4690.2389.9882.8771.1962.7257.65 | 125.3122.3141.1286.5248.6172.3146.5163.4142.0 | 快，半透明快，半透明快，半透明慢，粘稠较慢，乳状快，半透明快，半透明快，半透明快，半透明 |
Claims (4)
1、一种bFGF脂质体，其特征在于：所包封的药物为bFGF，脂质体的膜材为磷脂、胆固醇和其他脂质成分，脂质体粒径均匀，可控在40-1000nm范围内，包封率较高，可达60％以上。
2、一种如权利要求1所述的bFGF脂质体的制备方法，其特征在于：该bFGF脂质体的制备方法包括以下步骤：
(1)可采用薄膜分散法、表面活性剂处理法、钙融合法、加压挤出法等方法直接制备bFGF脂质体；
(2)可将(1)中制备好的bFGF脂质体加入适宜的冻干保护剂冷冻干燥，密封，4℃保存，用前加适量无菌生理盐水稍加振荡，室温水化即可；
(3)可采用任何脂质体制备方法制备空白小单室脂质体，然后加入制剂量bFGF和适宜的冻干保护剂冷冻干燥，密封，4℃保存，用前加适量无菌生理盐水，稍加振荡，室温水化即可；
(4)也可将(1)、(2)、(3)中制备的bFGF脂质体制成脂质体气雾剂或喷雾剂。
3、根据权利要求2所述的bFGF脂质体的制备方法，制备时加入荷负电的磷脂如PS、PG等可增加包封率，PG∶PC为1％-15％，综合考虑粒径与包封率两因素选择糖脂比3∶1-5∶1；PC用量为1％时，bFGF投入量100μg/mL时包封率最高。
4、根据权利要求1所述的bFGF脂质体，其特征是该制剂可用于制备静脉注射、肌肉注射、皮下注射、病变部位直接注射、手术埋植、口服给药、肺部及粘膜给药和眼部给药等多种剂型。
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