JPH08503873A - 皮膚疾患治療薬を調製する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 皮膚疾患の治療に使用される薬物を所定量デリバーする方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 皮膚疾患治療薬を調製する方法 発明の分野 本発明は薬物の投与方法に関する。より具体的には、本発明は皮膚疾患の治療 および創傷治癒に有用な薬物の、所定量の局所投与に関する。関連技術の説明 皮膚疾患および創傷の治療に使用される薬剤の好ましい適用方法は局所投与で ある。本法によれば、薬物を経口的または注射によって投与した際にしばしば起 こりうる副作用が避けられる。経口投与および注射では多くの体組織が薬物に曝 露されることになるが、局所投与では本質的に薬物が適用される組織だけが曝露 する。 薬物の局所投与には、クリーム類、ゲル類、水剤類および噴霧剤を使用する方 法、あるいは医薬品を含有する細片を埋め込む（外科的創傷や切開の場合）方法 などが利用できる。これらの方法は多くの場合適切であるが、その有用性には各 々制限がある。 皮膚患部にゲルやクリームを塗布するためには、皮膚に接触 することが必要であり、これによって皮膚をさらに刺激したり、皮膚に汚れや病 原体を導入したり、あるいはその両者であったりする恐れがある。加えて、均一 かつ正確な量の薬物をデリバーすることは難しいと考えられる。 液剤は、速やかに吸収されるおよび／または液体が完全に吸収されるまで皮膚 が適切な位置に保持されなければ、標的皮膚領域から流出してしまう。したがっ て、本法を使用して正確な用量の薬物を標的領域にデリバーすることは難しいと 考えられる。 薬物を含んだ細片を外科的切開創に埋め込むことは、異物の創傷内留置を含む 方法であるため、創傷治癒薬の好ましい適用方法ではない。この異物は移動した り感染を引き起こす恐れがある。 皮膚患部に噴霧溶液を適用するなら、皮膚に接触する必要はない。しかし、噴 霧剤が速やかに乾燥するか皮膚によって速やかに吸収されなければ、標的皮膚領 域から溶液が流出し、実際に皮膚にデリバーされる薬物の量が減少する。 血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、ヒトを始めとする多くの動物で自然に産 生される蛋白である。ＰＤＧＦはいろいろな 生物学的活性を有しているが、ＰＤＧＦは適切な濃度、すなわち通常は約０．５ ないし５．０μg/cm²で投与したとき、種々の皮膚創傷および外科的創傷の治癒 および組織修復を刺激するようである（Grotendorstet al.，J．Clin．Invest. ，76：2323−2329［1985］；Robson et al.，The Lancet，339．23−25［1992］ ；Pierce，G．F．Encyclopedia of Human Biology，vol．7，pp．499−509，Aca demic Press［1991］）。 天然型ＰＤＧＦは、Ａ鎖およびＢ鎖と呼ばれる２種類のポリペプチド鎖がジス ルフィド結合した二量体として存在している。Ａ鎖およびＢ鎖のアミノ酸配列は 約６０％の相同性を有し、両者とも８個のシシテイン残基を含有する。ＰＤＧＦ 二量体には、異なる３種類の型、すなわちＰＤＧＦ−ＡＢヘテロ二量体、ＰＤＧ Ｆ−ＡＡホモ二量体、およびＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体が存在する（Hannick et al.，Mol．Cell，Biol.，6：1304−1314［1986］を参照されたい）。ＰＤＧＦ −ＡＢが主要な天然型として同定されているが、ＰＤＧＦ−ＢＢが創傷治癒試験 に最も広く使用されてきた。 ヒト血小板中に存在するＰＤＧＦ−Ｂ鎖は、２４１個のアミノ酸前駆体ポリペ プチドの１０９個のアミノ酸開裂生成物とし て同定されている（Johnsson et al.，EMBO Journal，3：921−928［1984］）。 この１０９個のアミノ酸ポリペプチド（ＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉）は、ＰＤＧＦ−Ｂ前 駆体ポリペプチドをコードする遺伝子、c-sisのアミノ酸８２〜１９１と相同性 を有する。c-sisの全長はアミノ酸２４１個である。c-sis遺伝子全体を哺乳類宿 主細胞にトランスフェクトし発現させたとき、c-sis遺伝子産物のアミノ酸８２ 〜２０１に相当する別種のＰＤＧＦ−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉）も、c-sisコード化 前駆体産物の主要開裂生成物として同定されている。 １９９２年１０月２８日に公開された欧州特許第２４３，１７９号は、走化性 因子、表皮成長因子や血小板由来増殖因子などの増殖因子、または分化因子のい ずれかと一緒にコラーゲン、ヘパリンまたはグリコサミノグリカンを含む組成物 を記載している。本組成物は軟部組織創傷の治癒に有用であると報告されている 。 １９９０年１１月２７日に発行された米国特許第４，９７３，４６６号は、凝 集すると、創傷に適用される水膨潤性ゲルを生成するフィブロネクチンでできた 創傷治癒包帯剤を記載している。 １９８８年７月２６日に発行された米国特許第４，７６０，１３１号は、軟部 組織創傷治癒に有用な組成物を記載している。本組成物はコラーゲン、ヘパリン もしくはグリコサミノグリカンと非脱顆粒血小板または血小板放出物を含む。 １９９２年１月１５日に公告された英国特許出願ＧＢ２，２４５，８３１号は 、セルロース、ゼラチン、コラーゲン、デキストランまたはスターチ誘導体でで きた水不溶性微小球内にβ−線維芽細胞増殖因子を負荷することを記載している 。本複合体を凍結乾燥すると粉末を生じ、その粉末は創傷または火傷部位に直接 塗布される。 １９９０年１２月２９日に公告された欧州特許第４４０，９８９号は、強酸の 存在下で乾燥することによってインスリン様増殖因子Ｉの乾燥組成物を調製する 方法を教示している。 １９９１年２月１３日に公告された欧州特許第４１２，５５４号は、グリコー ル酸、乳酸、アルブミン、コラーゲンまたはゼラチンなどの生分解性担体に薬物 を組み込むことによって、神経栄養性因子、表皮成長因子や血小板由来増殖因子 などの細胞増殖因子、神経伝達物質、脳疾患の治療に有用な関連化合物などの薬 物の徐放性製剤を記載している。 １９９０年１０月９日に発行された米国特許第４，９６２，０１９号は、薬物 の管理された投与のためのデリバリーシステムを記載している。本システムはポ リペプチドが分散されるポリアクチドマトリックスを含む。 １９８８年５月１０日に発行された米国特許第４，７４３，５８３号は、ポリ ペプチド用徐放性デリバリーシステムを開示している。本ポリペプチドは、その 後、遠心分離によって収集される微小滴の乳濁液を作るために、非水性ルイス塩 基および水性ルイス酸を含有する溶液中に分散されている。 １９８７年４月２１日に発行された米国特許第４，６５９，５７０号は、化学 的に修飾されたゼラチンと混合されたポリペプチドの安定化製剤を開示している 。 １９９１年４月３０日に発行された米国特許第５，０１１，６７８号は、エア ゾール噴射剤と組み合わせて、ポリペプチド型薬物または他の薬物、および生体 適合性ステロイドを含む薬物の経粘膜投与用組成物を教示している。 １９９２年３月１４日に公開されたカナダ特許出願２，０２５，２８２号は、 ゼラチンなどの担体および血小板由来増殖因子などの薬理学的に活性な薬剤を任 意に含有する、コラーゲン のエアゾール製剤を調製する方法を記載している。本製剤は創傷包帯剤として有 用であると報告されている。 １９９１年１１月１４日に公告されたＷＯ９１／１６８８２号は、水溶性薬物 のための薬物−脂質粉末組成物を調製する方法を開示している。本粉末組成物は 、浮遊懸濁物を作製することによって、選択された用量で気道に投与することが できる。 １９９１年１０月３日に公開されたＷＯ９１／１４４２２号は、炭化水素噴射 剤、散剤、および分散剤を含むエアゾール製剤を開示している。この場合散剤は ホルモン、酵素、ペプチド、ステロイド、抗生物質または他の化合物であっても よく、粒子の大部分が約１０ミクロン未満の直径であるように微粉状で調製され る。本エアゾール製剤は皮膚投与、肺投与または粘膜投与に適すると報告されて いる。 １９９０年１月９日に発行された米国特許第４，８９２，８８９号は、脂溶性 ビタミン類、ゼラチンおよび水溶性炭水化物類の溶液を噴霧乾燥することによっ てビタミン粉末を調製する方法を記載している。 １９８８年３月２９日に発行された米国特許第４，７３４，４０１号は、噴霧 乾燥によって１種類以上のアミノ酸の乾燥組 成物を調製する方法を記載している。 １９８０年１１月１１日に発行された米国特許第４，２３３，４０５号は、噴 霧乾燥した酵素組成物を調製する方法を記載している。本方法は、酵素および水 不溶性塩類の液体組成物を濃縮し、本組成物を高温で噴霧乾燥することを含む。 １９６５年９月２１日に発行された米国特許第３，２０７，６６６号は、極め て酸化されやすい有機物質を含有する自由流動性の乾燥粉末を生成する方法を記 載している。本物質の溶液を、有機フィルム形成性コロイド、抗酸化薬、および 炭水化物の存在下で噴霧し、酸化されやすい有機物質を酸化から保護するのに役 立つ微滴を形成する。 局所適用される薬物を投与するための噴霧器の使用は、当業界で周知である。 例えば、Polysporin（登録商標）の抗生物質軟膏（Burroughs Wellcome，Inc.， Research Triangle Park，N．C．）およびDecaspray（登録商標）のステロイド 噴霧剤（Merck，Sharp & Dohme，Inc.，West Point，PA）は両者とも噴霧器内に 収容されている。これらの噴霧型容器の問題は、正確な量の薬物を標的皮膚領域 に投与できないことであり、投与量は、通常、カンを皮膚からある一定の距離に 保持し、薬物を 指定された時間、噴霧することによって測定される。 当業界では、創傷や外科的切開創などの皮膚疾患を治療するために使用される 薬物を正確かつ精密な量標的領域にデリバリーする噴霧器が必要である。 したがって、本発明の目的は、所定量の薬物を標的皮膚領域にデリバリーする 噴霧器を使用して、創傷や外科的切開創などの皮膚疾患を治療するために使用さ れる薬物を分配する方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、エアゾール噴霧器中に充填され分散される薬物の適 当な製剤を提供することである。 以上の目的は、普通の技術熟練者には容易に明白になるであろう。 発明の要約 本発明は、計量バルブ（metered dose valve）が取り付けられた噴霧型塗布器 を使用して、皮膚疾患の治療および創傷治癒に使用される薬物の製剤を、所定量 で調製し、投与して、正確な量の薬物を皮膚にデリバリーすることができるとい う発見に基づく。したがって、本発明は、局所適用に使用されるゲル類、クリー ム類、または液剤を使用した際に見られる問題を回避 する。 好ましい一実施態様で、本発明は計量バルブおよび皮膚疾患の治療に使用され る薬物の微粒子を含む容器を提供する。 別の実施態様で、本発明はＰＤＧＦ様活性を有する薬物の微粒子を提供する。 別の好ましい実施態様で、ＰＤＧＦ様活性を有する薬物は賦形剤を含む微粒子 中に形成されたヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢであり、本微粒子は噴射剤および任意 に潤滑剤が入った容器内に充填される。 さらに別の好ましい実施態様で、賦形剤は、平均分子量が２０，０００ダルト ンの加水分解ゼラチン、コラーゲンおよび炭水化物から選択される。 さらに別の好ましい実施態様で、本潤滑剤はミリスチン酸イソプロピルであり 、噴射剤はイソブタンである。 他の好ましい一実施態様で、本発明は、皮膚疾患を治療するために使用される 薬物を含む微粒子を調製し、微粒子を容器内に詰め、容器を計量バルブで密閉し 、容器に噴射剤を加えることからなる所定量の薬物をデリバーする装置を作製す る方法を提供する。 さらに別の好ましい実施態様で、本発明は、計量バルブを含む容器から、ＰＤ ＧＦ−様活性を有する薬物を投与することを含む、創傷治癒または外科的切開創 治癒を促進する方法を提供する。 図面の簡単な説明 第１図は、微粒子の調製に使用される適当な噴霧乾燥装置の概略図である。 第２図は、逆計量バルブを備えた容器を表す。描写されている通り、本容器は 作動装置に適合する。本作動装置は指台と長いノゾル先端を有する。 発明の詳細な説明 次の用語は本発明の説明に使用される。 「賦形剤」という用語は、薬剤学的に不活性であるか不活性な任意の化合物を 指し、薬物分子間の望ましくない吸湿性または他の物理的相互作用を防止するた めの増量剤である。賦形剤は希釈剤としても有用であり、薬物の取り扱いを容易 にするのにも役立つと考えられる。賦形剤は天然の化合物でもよく、任意の手段 で合成された化合物でもよい。好ましい賦形剤は、特定の平均分子量を有するも ので、このことは適切なサイズの微 粒を得るために重要である。蛋白をベースにした賦形剤の場合、約１０，０００ ダルトンから約３０，０００ダルトンの分子量がほとんどの適用例に好ましい。 ある適用例では、２種類以上の賦形剤を同時に使用することが望ましいことも ある。適当な賦形剤の例としては、可溶性コラーゲン（任意の起源から得られる ）、ゼラチンおよび炭水化物などがあるが、これらに限定されるものではない。 好ましい賦形剤はコラーゲンおよびゼラチンである。最も好ましい賦形剤はゼラ チンである。 「微粒子」という用語は、薬物−賦形剤混合物の水溶液が噴霧乾燥装置を通過 するときに薬物−賦形剤混合物またはマトリックスがとる形態を指す。溶液が噴 霧乾燥器のノズルを通過するとき、細かいミストが形成され、ミスト中の水が蒸 発すると薬物−賦形剤複合体の乾燥微粒子が生じることになる。一般に、微粒子 は直径約１５０ミクロン以下であり、直径約５０ミクロン以下が好ましく、直径 約５〜１５ミクロンが最も好ましい。 「ＰＤＧＦ」という用語は血小板由来増殖因子またはＰＤＧＦ様活性を示す任 意のペプチドまたはポリペプチドを指す。本明細書で使用されるとき、ＰＤＧＦ は任意の起源、すな わちヒトまたは非ヒト哺乳類由来であってもよく、例えば組換えＤＮＡ技術また はペプチド合成などの、合成または半合成手段で製造されてもよい。ＰＤＧＦの 挿入、欠失および／または置換変異体も、本発明の範囲内に含まれる。ヘテロ二 量体ＰＤＧＦ−ＡＢもホモ二量体ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＡも共に、 本発明の範囲内である。アミノ酸１０９個型ＰＤＧＦ−Ｂとアミノ酸１１９個型 ＰＤＧＦ−Ｂの両者は、生物学的に活性なフラグメントであるため、本発明の範 囲内である。長さがアミノ酸１１９個のヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢは、本発明を 実施する際に使用するＰＤＧＦの好ましい型である。本明細書で使用するとき、 本用語は、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡの生物学的に活性 な任意のフラグメント、および／またはＡまたはＢ単量体のフラグメントを含む 。創傷治癒を促進するためにＰＤＧＦを局所塗布に使用する場合、使用されるＰ ＤＧＦの種類によって投与量を変えることが可能である。成熟型ＰＤＧＦ−ＢＢ 蛋白の場合、創傷１cm²当たり約０．５〜５μgの投与量が適当であるが、投与量 は創傷１cm²当たり約１．５〜３．５μgが好ましく、創傷１cm²当たり約２〜２ ．５μgが最も好ましい。他種の ＰＤＧＦに関する適当な投与量は、当業者に周知の方法による定型の実験を使用 して決定することができる。 「皮膚疾患」という用語は、あらゆる種類の皮膚病、または直接、間接を問わ ず、皮膚の任意の部分の外傷を含む。このような疾患の例としては、皮膚癌、皮 膚炎、発疹、アレルギー反応、アクネ、創傷、皮膚潰瘍（例えば、圧迫性潰瘍、 静脈狭窄潰瘍、および糖尿病性潰瘍）、外科的切開創などがあるが、これらに限 定されるものではない。本発明を製作する方法 １．薬物の起源 本発明の実施に使用するあらゆる薬物は水性媒体に溶解し、高温でかなり安定 でなければならない。すなわち、約１００℃〜１５０℃の温度で、少なくとも部 分的に生物学的活性を保持していなければならない。本薬物は有機物でも無機物 でもよく、任意の自然源由来のものであっても、合成的に製造されたものであっ てもよい。薬物は蛋白、炭水化物、脂質、核酸であってもよく、あるいは、例え ば複素環式化合物、芳香族化合物、炭化水素化合物など他の任意の有機化合物で あってもよい。 本発明は、単一製剤に組み入れたとき、薬物が化学的かつ薬 学的に適合するという条件で、所与の微粒子製剤中に２種類以上の薬物を使用す ることも包含する。 蛋白である薬物は、特に脊椎動物、非脊椎動物、または植物の細胞型または組 織など、任意の内因性起源由来の蛋白の精製によって得ることができる。このよ うな精製方法は、Sambrook et al．（Molecular Cloning：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY．［1989］ ）に記載されているように熟練者に周知である。代わりに、あるいは加えて、一 般に熟練者に周知の組換えＤＮＡ生産技術を使用して蛋白を得ることも可能であ る。蛋白を得るために組換え生産技術を使用する場合、本発明は生物学的に活性 な蛋白フラグメント、ならびに挿入、欠失および／または置換突然変異体などの 蛋白の突然変異体の使用を企図する。 適当な起源からの精製や、化学合成または酵素的合成など、技術上周知の手段 によって非蛋白薬物を得ることができる。 好ましい薬物は創傷治癒を促進するか、あるいは創傷および外科的切開創、並 びに種々の皮膚癌、皮膚炎、発疹、アレルギー反応、および様々な種類のアクネ などの皮膚疾患を治療する上で有用な薬物である。ステロイド類、抗生物質類、 ケラチノ サイト増殖因子（ＫＧＦ）や血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を始めとする増殖 因子類などの薬物の方が好ましい。最も好ましい薬物は、１１９個のアミノ酸配 列型のＰＤＧＦ−ＢＢである。 ２．賦形剤の起源 賦形剤は、有機物であるか無機物であるかに拘わらず、希釈剤としても有用で あり、凝集や吸湿相互作用など、望ましくない薬物粒子間の相互作用を低減また は防止するのにも有用な、薬学的に不活性な任意の物質でよい。有用な賦形剤は 当業界で周知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences，17th ed .，1985，Mack publishers，Easton，PAを参照されたい）。賦形剤は天然型であ ってもよく、化学的、酵素的あるいは別の方法で修飾されていてもよい。一般に 、分子量が低い（蛋白の場合、約２５，０００ダルトン未満）賦形剤の方が、よ り小さい微粒子が容易に調製することができるため好ましい。 所与の製剤に２種類以上の賦形剤を同時に使用することも可能である。薬物の １単位当たり使用される賦形剤の量は、薬物の種類、所望の薬物濃度、および標 的皮膚領域にデリバーされ る薬物の量によって異なる。 本発明に使用するための好ましい賦形剤は、ラクトース、グルコース、マンニ トールまたはヒドロキシエチル・スターチなど、種々の炭水化物類、またはヒト 血清アルブミン、コラーゲン、またはゼラチンなどの蛋白類である。さらに好ま しい賦形剤はコラーゲンおよびゼラチンであり、最も好ましい賦形剤は、平均分 子量約２０，０００ダルトンに加水分解されたゼラチンである。 ３．徐放性製剤 標的組織に薬物の徐放性製剤を適用することが好都合な場合もある。これは薬 物適用頻度を低減するのに役立つ。この場合、ヒト血清アルブミン、セルロース 、スターチまたはそれらの誘導体など、ある種のポリマー、あるいは合成ポリマ ーを徐放性製剤のマトリックスとして使用することができる。これらのポリマー は薬理学的に不活性かつ無毒でなければならない。所望の量のポリマーが製剤に 添加される。使用されるポリマーの量は経験に基づいて決定されるが、その化学 組成、皮膚に塗布されたときの分解速度、製剤中に存在する薬物の量、その他の 、当業者に周知の類似した考慮すべき事項に主として左右される。 ゼラチンと組み合わせて蛋白表皮増殖因子（ＥＧＦ）を含有する創傷治癒用薬 物製剤は、ＥＧＦのみを塗布した場合より、創傷治癒の促進に有効なことが判明 している。ゼラチンは、創傷部位に存在するプロテアーゼ類によってＥＧＦが分 解される速度を低減すると考えられる（Okumura et al.，Pharm．Res．7：1289 −1293［1990］）。一つの理論に限定される訳ではないが、類推すると、ＰＤＧ Ｆは、ゼラチンまたは適合するマトリックスと共に調剤したときの方が効果的で あったり、効果が長く持続する可能性があると考えられる。したがって、本発明 では、賦形剤としても、創傷または切開創を治癒するために皮膚に塗布されたＰ ＤＧＦの寿命を延長するためにも、あるいは前述の目的のためにも、ゼラチンは 有用なことになる。 ４．蛋白−賦形剤混合物の調製 一般に、薬物−賦形剤混合物は、当業者に周知の無菌技法および条件を使用し て調製される。一般に、微粒子として調製される薬物は水性媒体中、好ましくは 精製水中に溶解されるが、塩類、緩衝液類および／または保存薬のような他の成 分が所望により含まれていてもよい。水性媒体中の薬物濃度は、主として所望の 微粒子最終濃度または賦形剤に対する薬物の比率に基 づいて決定され、皮膚に適用される噴霧剤の単位量当たりデリバーされる薬物の 所望量に基づいて計算される。 賦形剤は、他の成分を適宜含有する水性媒体に溶解される。使用される賦形剤 の量は、薬物の種類、所望の薬物の希釈量、および使用する賦形剤の種類によっ て一部決定される。次に、薬物および賦形剤溶液を一緒に混合し、室温またはそ れ以下に保つ。 あるいは、薬物および賦形剤は、単一の完全混合物として、最初に水溶液中で 一緒にしてもよい。この混合物は室温またはそれ以下に保たれる。 賦形剤に加えて、塩類、緩衝液類、保存薬、抗生物質類などの他の成分が、薬 学的に薬物および賦形剤に適合し、しかも本質的に無毒であるという条件で、こ れらを本製剤に加えることも可能である。 ５．微粒子の形成 賦形剤および薬物の溶液は、一般に無菌条件下で噴霧乾燥されて微粒子を形成 する。噴霧乾燥は、溶液を非常に細かいミストに噴霧するか微粒化するノズルを 具備する市販の噴霧乾燥装置のうち、任意の型を使用して行われる。このような 装置の概 略図を第１図に示したので、この図を参照することによって、下記の説明が最も よく理解される。薬物および賦形剤の溶液（１）は、ノズル（２）を通って乾燥 チャンバ（４）に引き込まれる。加熱された空気が、流入口（３）から乾燥チャ ンバに入る。微粒子および熱空気が吸引装置（５）を通ってサイクロン（６）に 引き込まれる。空気はサイクロンの頂部を通って出て行くが、乾燥した微粒子は サイクロンの底部に引き寄せられて容器（７）に収集される。 水ジャケットまたは他の適切な装置を使用して、ノズルが室温以下に保たれる ことが好ましい。ノズルは、流入口および流出口が取り付けられている乾燥チャ ンバに封じ込められている。約１００℃〜１５０℃の温度の熱空気は流入口を通 ってチャンバに入り、ノズルから放出された微粒化粒子の加熱を推進し、その結 果、粒子から水を蒸発させて固体微粒子を生じる。 流出口に接続された吸引装置は加熱された空気と固体微粒子の両者を乾燥チャ ンバから、固体微粒子が小さい容器内に収集される２番目のチャンバ内に引き寄 せられる。 微粒子のサイズは、標準走査型電子顕微鏡法を使用して測定することができる 。 ６．エアゾール製剤の調製 所望量の微粒子固体粉末を詰めるため容器内に入れる。この粉末に、任意にミ リスチン酸イソプロピルやその等価物などの潤滑剤を、潤滑剤約３０μlに対し て粉末約１００mgの比率で加えることが可能である（別の潤滑剤を使用する場合 、あるいはその他の理由でそれが望ましい場合、この比率は変化することもある ）。使用してもよいが、それほど望ましくない他の潤滑剤としては、例えば、オ レイン酸やソルビタントリオレエートなどがある。使用される潤滑剤は薬学的に 不活性であり、かつ皮膚に対して全く無毒であることが好ましい。 容器は、Pamasolから供給されたクリンパーおよび噴射剤充填機（BLM Associa tes Inc.，Greenwich，CT；P2005型）などの標準機器類を使用して、適当なバル ブでクリンプされる。容器に加えられる噴射剤は、ポンプ（Pamasol P2008型；B LMAssociates Inc.，Greenwich，CTなど）で圧縮され、機械の使用に際して製造 業者のガイドラインに従って、クリンパーおよび噴射剤充填機によって、この噴 射剤の特定容量を容器内に分散させる。 容器内充填の代替手段は「冷却充填」法である。微粒子を少 量の噴射剤と混合して濃縮物を作製する。次に、噴射剤の沸点未満である温度ま で、濃縮物を冷却する。本濃縮物を容器に入れ、容器をバルブでクリンプしてか ら噴射剤の残りを加える。 本発明の実施に使用される噴射剤は、製薬業界で使用される任意の種類であっ てもよい。ただし、フルオロカーボンを含有するほとんどの噴射剤は、地球のオ ゾン層に有害作用を及ぼすため、好ましくない。本明細書で使用してもよく、オ ゾン層に有害作用を及ぼさないと考えられるフルオロカーボン噴射剤は、１，１ ，１−トリフルオロ−２−フルオロエタンである。 本明細書で使用する好ましい噴射剤は、約１５〜５０psigの蒸気圧を有するフ ルオロカーボンを含有しないものである。好ましい噴射剤はイソブタンである。 この範囲外の蒸気圧を有する噴射剤が使用されるとき、ブタンを加えて蒸気圧を 低下させることができ、必要に応じプロパンを加えて蒸気圧を高めることができ る。使用される噴射剤の量は、主として噴射剤中の所望の薬物濃度に依存する。 これは主として、投与される噴霧剤の単位当たりの皮膚に塗布される薬物量の関 数である。一般に、噴射剤に対する薬物の比率は、ＰＤＧＦ微粒子の場合、５〜 ７５mg/mlになり、ＰＤＧＦ微粒子の場合、８〜６０mg/ml が好ましい。 ７．投与量デリバリー 本発明の重要な特徴は、標的皮膚領域に所定量の薬物を精密かつ正確にデリバ ーするための一定容積のチャンバを有する計量バルブを使用することにある。創 傷治癒または外科的切開創治癒など、適用される薬物の量が臨界的である場合、 この種のバルブの使用は重要である。 市販されている任意の計量バルブが、ゴム製ガスケットか、または噴射剤、潤 滑剤、および薬物−賦形剤微粒子に関して化学的に不活性である他種のガスケッ トを具備しているならば、この計量バルブを本発明の実施に使用することが可能 である。バルブは、正立型でも倒立型でもよいが、投与を容易にするためには倒 立型の方が好ましい。所定量投与型のメタード・バルブと調節可能な量のメター ド・バルブの両者を使用することが可能である。しかし、所定量投与型のバルブ が好ましく、特に倒立の、所定量投与型計量バルブが好ましい。本明細書で使用 する好ましいバルブは、Valois 20 mm倒立バルブ（Valois of America Inc.，BL M Associates Inc.，Greenwich，CTから入手されるDF 10/100 RC 20mm型）など 、１回の噴霧当たり約 １００μlをデリバーするものである。その他の適当なバルブは、Bespak，Inc． （Framingham，MA）によって製造されるものである。 微粒子−噴射剤溶液の充填に使用される溶液は、噴射剤および薬物−賦形剤微 粒子に関して不活性である任意の材料でできていてもよい。充填に便利なために は、容器が、計量バルブのサイズと適合するサイズ、一般には円周約２０mm、の 開口部を具備しなければならない。好ましい容器は、アルミニウム製のものであ り、適当なポリマー・コーティングのあるものが好ましい。好ましい容器は、Ｏ ＮＣエポキシフェノール製の内側裏打ちがあるSafet Canister ２０．９×４５ ×２０mm（BLM Associates Inc.，Greenwich，CT）である。 作動装置は容器−計量バルブ装置に取り付けられる。作動装置は、使用するた めに選択された計量バルブに適合する任意の型であってもよい。好ましい作動装 置は指台および長いノズルを具備するものである。指台は、投与するために倒立 位で装置が使用されるときに、装置を快適に保持する手段を提供し、長いノズル は精密な方式で薬物をデリバーする助けになる。容器、倒立の計量バルブおよび 作動装置を含む本装置を、第２図に図 解する。 ８．製剤の安定性 薬物の効力を維持するためには、製剤の経時的安定性が重要である。薬物の活 性を評価するために設計されたイン・ビボまたはイン・ビトロ検定法を使用して 、安定性をモニターすることができる。本検定法は、調製された製剤の容器を、 適切な温度条件下で、ある期間保存し、その期間中の幾つかの時点で製剤の生物 学的活性を評価することによって実施される。 本発明は、下記の例を参照することによって、さらに完全に理解されるであろ う。とにかく、これらの例は本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならな い。 実施例１ １．ＰＤＧＦ微粒子の調製 ａ．ＰＤＧＦ−ゼラチン微粒子 溶液から塩類を除去するために、ヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢの水溶液を１０mM 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を用いて透析した。ゼラチンの重量で１０％であ り、ＰＤＧＦの重量で１％である最終溶液を得るため、濃度２．７６mg/ml Ｐ ＤＧＦの透析溶液（５０ml）を、水８６．６ml中、平均分子量 ２０，０００ダルトンを持つ加水分解された精製ゼラチン（Dynagel，Inc.，Cal umet City，Illinoisから入手した）１３．６６gの、予め濾過した溶液と混合し た。 ｂ．ＰＤＧＦ−コラーゲン微粒子 １０mM酢酸ナトリウム、１５０mM NaCl（ｐＨ４．０）中の、２．０３８mg/m lのヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢの水溶液１０mlを、Semed S可溶性コラーゲン（Se mex Medical Co．，Malvern，PA）の溶液１００mlに加えた。コラーゲンは予め 、１．０ｇ／０．１M酢酸１００mlの濃度に調製されていた。 ｃ．微粒子の調製 Buchi小型噴霧乾燥器（Brinkman Instruments，190型）を使用して、ＰＤＧＦ −加水分解ゼラチンおよびＰＤＧＦ−コラーゲンの溶液を噴霧乾燥した。本噴霧 乾燥器を、ノズルに入る溶液を約２０℃に保つために、ノズルの回りに循環水ジ ャケットを設置することによって改良した。無菌条件を維持するために、流入口 を経て乾燥チャンバ内に入る空気を最初に濾過した。空気流入口の温度は約１３ ６℃であり、流出口の温度は約９６℃であって、吸引装置は最大に設定し、空気 噴霧量は６００l／時に設定した。ゼラチン−ＰＤＧＦ溶液またはコラーゲン− ＰＤＧＦ溶液はノズルを通過するにつれて固体微粒子を形成し、ミスト化された 粒子から水が蒸発した。微粒子は噴霧乾燥器のサイクロン部分（第１図参照）に 引き寄せられ、無菌容器内に収集された。 走査型電子顕微鏡を使用して、本法で生成された微粒子のサイズを評価した。 平均すると、微粒子は、直径１〜１０ミクロンの範囲であった。 本微粒子を室温のデシケータ内で保存した。 ２．エアゾール製剤の調製 微粒子５００mgおよびミリスチン酸イソプロピル１５０μlをWheatonプラスチ ック被覆ガラス瓶に入れ、Pamasol P2005クリンプおよび圧充填装置（BLM Assoc iates.，Inc．）を使用し、製造業者の説明書に従って、倒立の計量バルブ（Val ois，DF 10/100）＃４００；BLM Associates，Inc.，Grennwich，CT）で瓶を密 閉した。Pamasol P2008噴射剤圧縮ポンプを使用して加圧したイソブタン１０ml を、Pamasol P2005圧および充填装置を再び使用して、バルブを通して瓶に加え た。作動装置（Valois 25 Gpp 0/7）を設置し、詰めた溶液を室温で保存した。 ３．ＰＤＧＦ微粒子安定性検定 熟練者には周知の標準技法を使用し、非変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電 気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタン・ブロット分析法によって、粉 末とエアゾール型の両者について、２週間にわたるＰＤＧＦ−ＢＢ−加水分解ゼ ラチン微粒子の安定性を評価した。 ２種類のゲルを同時に運転し、一方は蛋白用クーマシー染色であり、他方はウ エスタン・ブロットであった。各ゲルは、１０〜２０％勾配ゲルであり（１０cm ×１０cm、Integrated Separation Systems，Enprotech，Inc.，Hyde Park，MA から入手した）、製造業者の説明書に従って、約３５mAの一定電流で運転させた 。下記の通りに、エアゾール製剤サンプルを作製した。ガラス平板にエアゾール 製剤を噴霧し、平板から粉末約２６mgを収集した。本粉末を、１０mM緩衝液（ｐ Ｈ４．０）約１mlに溶解すると、結果として約０．２mg/mlのＰＤＧＦ濃度にな った。次に、約０．１mg/mlのＰＤＧＦ最終濃度にするため、本サンプルを同じ 緩衝液で希釈した。このサンプル６μlを、ＳＤＳおよび色素を含有する電気泳 動緩衝液２μlと混合し、このサンプルをゲル上に負荷した。 乾燥粉末約５０mgを、緩衝液（１０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）約２．５ mlに加えることによって、微粒子粉末サンプルを調製した。最終濃度約０．１mg /ml ＰＤＧＦを得るため、この溶液を同緩衝液で２倍に希釈した。本サンプル 約６μlを、ＳＤＳおよび色素を含有する緩衝液２μlに加え、このサンプルをゲ ルに負荷した。ゲルの運転後、標準手法を使用して一方のゲルをクーマシーブル ー色素で染色し、下記の手法を使用して、他方をニトロセルロース紙上にウエス タン・ブロットした。 ブロットされるゲルをKodak EZE Formura I緩衝液（Eastman Kodak Company， Rochester，NY）中に、室温で２０分間、浸漬した。１０Ｎ NaOHを加えること によって、緩衝液のｐＨを約９．５に調節した。移動前に、ニトロセルロース紙 をメタノール中に約５分間浸漬し、次に冷（約４℃）緩衝液（Kodak EZE Formul a I）に約１５分間浸漬した。ＩＳＳ Enprotech半乾燥ブロッティング・ユニッ トを使用し、製造業者の説明書に従って、１２５mAで約１時間、移動を実施した 。ウエスタン・ブロットを乾燥させ、抗体で精査した。 ウエスタン・ブロットにおけるＰＤＧＦ蛋白検出に使用されたプローブは、約 １：２５０の比率の、ＰＢＳ（Irvlne Scientific，Santa Ana，CAから１０倍保存溶液として入手し、製造業者の説明 書に従って調製した、リン酸緩衝食塩水）で希釈したマウス・モノクローナル抗 体および１０％ウマ血清であった。このインキュベーションは、シェーカー上、 室温で一晩、行われた。インキュベーション後、ブロットをＰＢＳで洗浄した。 製造業者の説明書に従って、Vectastainキット（Vector Laboratories，Burling ame，CA）でマウス・モノクローナル抗体の存在を検出するための分析を実施し た。ビオチニル化抗マウス抗体をブロットに加え、室温で約１時間インキュベー トした後、ＰＢＳ中でブロットを洗浄した。次に、ビオチニル化西洋ワサビ・ペ ルオキシダーゼおよびアビジンを含有する溶液を加えた。発色現像液を加えるこ とによって、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを検出した。 クーマシー染色ゲルからも、ウエスタン・ブロットからもＰＤＧＦの顕著な分 解は認められず、乾燥状態で保存しようと、噴射剤が存在する条件下で噴霧容器 内に保存しようと、少なくとも２週間の期間にわたって、微粒子が安定なままで あったことがわかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．計量バルブおよび皮膚疾患の治療に使用される薬物の微粒子を含む容器。 ２．薬物がヒトＰＤＧＦ様活性を有することを特徴とする、請求の範囲第１項に 記載の容器。 ３．薬物がヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢであることを特徴とする、請求の範囲第２ 項に記載の容器。 ４．さらに、コラーゲン、ゼラチンおよび炭水化物から成るグループから選択さ れた賦形剤を含む、請求の範囲第２項に記載の容器。 ５．賦形剤が、約２０，０００ダルトンの平均分子量を持つ加水分解ゼラチンで あることを特徴とする、請求の範囲第４項に記載の容器。 ６．さらに、噴射剤および潤滑剤を含む、請求の範囲第５項に記載の容器。 ７．イソブタン、ミリスチン酸イソプロピル、およびヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢ −加水分解ゼラチン微粒子を含み、加水分解ゼラチンの平均分子量が約２０，０ ００ダルトンであることを 特徴とする、請求の範囲第５項に記載の容器。 ８．（ａ）皮膚疾患の治療に使用される薬物を含む微粒子を調製すること、 （ｂ）微粒子を容器に充填すること、 （ｃ）計量バルブで容器を密閉すること、 （ｄ）容器に噴射剤を加えること を含む、所定量の薬物をデリバーする装置を作製する方法。 ９．薬物がＰＤＧＦ様活性を有することを特徴とする、請求の範囲第８項に記載 の方法。 １０．薬物がヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢであることを特徴とする、請求の範囲第 ９項に記載の方法。 １１．微粒子が、ヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢおよび平均分子量２０，０００ダル トンの加水分解ゼラチンを含むことを特徴とする、請求の範囲第１０項に記載の 方法。 １２．さらに、容器に噴射剤および潤滑剤を加えることを含む、請求の範囲第１ １項に記載の方法。 １３．噴射剤がイソブタンであり、潤滑剤がミリスチン酸イソプロピルであるこ とを特徴とする、請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４．請求の範囲第２項から第７項のいずれか一項に記載の容器の内容物を投与 することを含む、創傷治癒または外科的切開創治癒を促進する方法。