CN103819555A - 一种肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种属于动物基因工程领域的肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体，其中诱导肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体产生的抗原多肽由SEQ IDNo:1所示的氨基酸序列组成，该抗原多肽的编码基因由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了其表达载体和检测试剂盒；以及该多克隆抗体的制备方法和用途。本发明肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体特异性强，为GR在肉鸡组织或细胞中的定量分析及其相关研究提供了重要工具。其次，本发明所用的抗原序列长，更容易出现免疫反应，检测灵敏度高。

Description

一种肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于动物基因工程领域，具体涉及一种肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体，以及该多克隆抗体的制备方法和用途。
背景技术
糖皮质激素（Glucocorticoid，简称GC）是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类甾体激素，主要为皮质醇（cortisol）和皮质酮（corticosterone），具有调节糖、脂肪、和蛋白质的生物合成和代谢的作用，还具有抑制免疫应答、抗炎、抗毒、抗休克作用。称其为“糖皮质激素”是因为其调节糖类代谢的活性最早为人们所认识。
糖皮质激素是机体重要的应激激素和临床常用的抗炎、抗免疫反应药物。糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，简称GR）在其效应发挥过程中起着关键作用（Schacke等.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America.2004,101:227-232；Miner等.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America.2007,104:19244-19249）。GR是激素核受体家族的成员，也是一种重要的核转录调控因子，广泛表达在各种组织和细胞，可以调控多种基因的转录激活和抑制，在机体的生命活动中具有重要的意义。GR作为GC生物学作用的介导者，其表达水平和活性直接影响组织细胞对GC的敏感性，与免疫细胞的活性、存活等直接相关（Mathievu.Gene Therapy.1999,6:245-252；Slotkin.Brain research bulletin.2008,76:531-535）。
GC具有参与机体应激反应、抗炎、抗免疫反应和促进细胞凋亡等多种作用，而这些生物学作用基本上都是通过活化GR而实现的，GR作为有效的药物治疗靶点已得到临床确证。应激状态下GR不仅参与机体能量代谢，而且还对多种基因具有转录调控作用（Bruna等.EMBO Journal.2003,22:6035-6044；Hayashi等.European Journal of Pharmacology.2004,500:51-62）。此外，应激反应中GR还可抑制炎症反应。可见，GR在调控整个机体的应激反应状态方面发挥着重要作用，GR与多种热休克蛋白的关系及其对基因启动子的调控已成为重要的研究内容，其中GR的组织定量分析具有特别的意义。由于肉鸡既是热敏感动物，也是GC敏感动物，因此成为很好的应激研究模型，在探讨热休克蛋白与GR的结合与解离，及应激损伤与GR的相关性方面具有重要作用。
目前，商业化的GR抗体仅为针对人和大小鼠的多抗或单抗，至今尚无专门针对肉鸡的GR抗体。由于肉鸡GR的蛋白序列与人或大小鼠序列的相似性仅为75%，而采用针对人或大小鼠的抗体来检测肉鸡组织或细胞中GR的表达效果很差，大大限制了GR在肉鸡研究上的应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于诱导肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体的抗原多肽。
本发明另一目的在于提供上述抗原多肽的编码基因。
本发明第三目的在于提供含有上述编码基因的表达载体。
本发明第四目的在于提供用于扩增上述抗原多肽编码基因的引物对。
本发明第五目的在于提供一种肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体。该多克隆抗体特异性好、效价高，高特异性的肉鸡GR抗体可为GR在肉鸡组织或细胞中的定量分析及其相关研究提供重要工具。
本发明第六目的在于提供上述肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体的制备方法。
本发明第七目的在于提供含有上述肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体的检测试剂盒。
本发明第八目的在于提供上述肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体的用途。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明用于诱导肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体的抗原多肽，由SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成。
上述抗原多肽的编码基因，由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成。
含有上述抗原多肽编码基因的表达载体。
所述的载体，是指pGEM-T Easy、pET-28a（+）或pMAL-p2x等。
用于扩增上述抗原多肽编码基因的引物对，由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。
本发明一种肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体，其所述多克隆抗体的抗原多肽为由SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成的多肽。
上述肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体，其所述抗原多肽的编码基因由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成。
上述肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体，所述的编码基因的PCR扩增引物由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成；
上游引物：5’-CGGAATTCATGGATTCCAAAGAATTGC-3’（SEQ ID No:3），
下游引物：5’-GCGTCGACCTATGAATAGCCATTAGAGAAAGC-3’（SEQ IDNo:4）。
含有上述肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体的检测试剂盒。
上述肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体在检测肉鸡组织中糖皮质激素受体表达上的应用。
上述肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体的制备方法，包括从28日龄AA肉鸡血液中提取肉鸡总RNA，反转录为cDNA；以SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列为引物，利用RT-PCR方法克隆肉鸡GR基因片段；构建pET-28a和MBP原核表达载体，将肉鸡GR基因片段克隆到载体上，测序，诱导蛋白表达；超声波破碎诱导表达菌，用镍层析柱进行纯化；以纯化的重组pET-28a-GR免疫新西兰大白兔，五免后第7天进行心脏采血，制备抗血清；纯化MBP-GR抗原，与GE公司的亲和填料NHS-activated4FF（71-5000-14AC）偶联，亲和纯化抗血清，得到肉鸡GR多克隆抗体。
与现有技术相比，本发明的优点是：（1）、本发明肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体特异性强，为GR在肉鸡组织或细胞中的定量分析及其相关研究提供了重要工具。（2）、本发明所用的抗原序列长，更容易出现免疫反应，检测灵敏度高。
附图说明
图1.GR重组蛋白表达和纯化电泳图谱；其中1：蛋白分子量标准；2：未诱导；3：诱导的BL21（PET-28a转化）；4：超声波上清；5：穿透液；6：洗脱20mM咪唑；7：洗脱50mM咪唑；8：洗脱300mM咪唑。
图2.肉鸡胸肌GR抗体检测电泳图谱（胞浆）；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图3.肉鸡胸肌GR抗体检测电泳图谱（胞核）；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图4.急性热应激后肉鸡胸肌GR抗体检测电泳图谱（胞浆）；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图5.急性热应激后肉鸡胸肌GR抗体检测电泳图谱（胞核）；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图6.急性热应激后肉鸡脑组织GR抗体检测电泳图谱；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图7.常温肉鸡脑组织GR抗体检测电泳图谱（胞核）；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图8.急性热应激后肉鸡心脏GR抗体检测电泳图谱；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图9.常温肉鸡心脏GR抗体检测电泳图谱（胞核）；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图10.急性热应激后肉鸡肝脏GR抗体检测电泳图谱；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图11.常温肉鸡肝脏GR抗体检测电泳图谱（胞核）；其中1、2、3为不同AA肉鸡样本。
图12.商业化GR抗体检测电泳图谱；其中1、2、3为不同AA肉鸡外周血淋巴细胞样本。
图13.本发明肉鸡GR抗体检测电泳图谱。其中1、2、3为不同AA肉鸡外周血淋巴细胞样本。
具体实施方式
实施例1肉鸡糖皮质激素受体（GR）基因的克隆
按照如下方法进行：
（1）、应用德国Qiagen公司试剂盒（RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit），从28日龄AA肉鸡血液中提取总RNA。利用RT-PCR反转录为cDNA，克隆GR部分基因序列。具体程序如下：通过GenBank上的肉鸡GR序列（NM_001037826），利用Primer5.0软件设计引物，所设计的引物如下：上游引物：5’-CGGAATTCATGGATTCCAAAGAATTGC-3’（SEQ ID No:3），下游引物：5’-GCGTCGACCTATGAATAGCCATTAGAGAAAGC-3’（SEQ ID No:4），引物由上海生工生物工程公司合成。RT-PCR的反应体系（25μL）:10×buffer2.5μL、2.5mmol/L的dNTP2μL、25mmol/L的Mg2+2μL、混合引物1μL、RNA酶抑制剂1μL、AMV反转录酶0.7μL、热启动Taq DNA聚合酶0.3μL、模板加3μL，最后补DEPC处理水至25μL。其中AMV反转录酶、RNA酶抑制剂和热启动Taq DNA聚合酶均购自大连Takara公司。反应程序为：42℃反转录50min，95℃预变性3min，94℃30s，54℃30s，72℃45s，30个循环后；72℃延伸8min，得RT-PCR扩增产物。
（2）、将RT-PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的片段（德国Qiagen公司柱式回收试剂盒）。将纯化目的片段与pGEM-T Easy载体（美国Promega公司）按照摩尔比为3﹕1的比例连接进行T-A克隆，4℃放置过夜以达到较高的连接产率。取连接产物转化DH-5α感受态菌株（北京天根生物技术有限公司），LB培养基（不含氨苄青霉素）37℃下振荡培养5h，取培养液80μL接种到LB平板，37℃温箱倒置培养10h以上，进行蓝白斑筛选。挑选白色单菌落，在LB培养基（含氨苄青霉素100μg/mL）（上海生工生物工程公司）中37℃振荡培养过夜，用菌液直接进行PCR鉴定。反应体系参照RT-PCR，同时送菌液到上海生工生物工程公司进行测序，其所测序列见SEQ ID No:2，筛选出阳性菌。对于筛选出的序列正确的阳性克隆菌培养后提取质粒，作为模板将目的基因转移至原核表达载体（pET-28a和pMAL-p2x）中。
实施例2本发明肉鸡糖皮质激素受体（GR）原核表达载体的构建
按照如下方法进行：
（1）构建含有肉鸡GR（第1-390位氨基酸）的原核表达载体：对T-A克隆阳性质粒和表达载体（pET-28a-GR（6HIS标签），pMAL-p2x-GR（MBP标签））同时进行NdeⅠ、XhoⅠ双酶切（大连Takara公司）。将双酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，分别回收纯化酶切后的目的片段和表达载体，按摩尔比3﹕1的比例进行连接反应，16℃连接过夜。将连接产物转化BL-21感受态菌株（北京天根生物技术有限公司），LB培养基（不含卡那霉素）37℃振荡培养5h，取培养液50～100μL接种到含卡那霉素（50μg/mL）（上海生工生物工程公司）LB平板，37℃温箱倒置培养10h以上，进行筛选。挑选的单菌落在LB培养基（含卡那霉素50μg/mL）中37℃振荡培养过夜，用菌液直接进行PCR鉴定。同时送菌液到（上海生工生物工程公司）进行测序分析，筛选出阳性菌。
（2）表达工程菌BL-21构建之后，将PET-28a质粒（Novagen公司）转化BL21菌株，按质粒说明书进行诱导表达。表达条件为：诱导剂IPTG（上海生工生物工程公司）终浓度为1mM；37℃诱导3h。超声波破碎诱导表达菌，离心，对上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。目的蛋白为上清表达，用Novagen公司镍层析柱进行纯化。浓度在1.2mg/mL左右，纯度85%左右，大小为45kD左右（见图1）。
实施例3本发明肉鸡糖皮质激素受体（GR）多克隆抗体的制备
以实施例2中纯化的重组PET-28a-GR免疫两只新西兰大白兔，免疫方法见表1。
表1免疫方法
Figure BDA0000467889480000061
五免后第5天，自免疫兔耳中央静脉采血，分离血清，测定抗体效价。待抗体ELISA效价达到1：20000以上时，于五免后第7天及时进行心脏采血，制备抗血清。纯化MBP-GR抗原，与GE公司的亲和填料NHS-activated4FF（71-5000-14AC）偶联，亲和纯化抗血清，得到高纯度的肉鸡GR抗体。
实施例4用本发明肉鸡GR多克隆抗体测定肉鸡胸肌组织中GR表达试验
按照如下方法进行：
将常规适应性饲养至42日龄的AA肉鸡的环境温度在20min内从室温突然升至40±1℃，进行3h热应激处理。分别取3只热应激处理和3只未经热应激处理肉鸡的胸肌组织，液氮速冻后于-80℃冰箱保存。采用Western Blot技术检测胞浆和胞核中GR的表达情况。
具体操作如下：
（1）采用Pierce公司NE-PER核蛋白—胞浆蛋白抽提试剂盒抽提各肉鸡胸肌组织的胞浆蛋白和胞核蛋白，并经BCA微量蛋白定量分析试剂盒（Pierce公司）进行蛋白定量。配制12%分离胶和5%浓缩胶，上样（20μg/孔）。电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压160V，通过预染蛋白marker确定电泳停止时间。电泳完毕后采用湿转法进行转膜（0.45μm孔径NC膜，Millipore公司），转膜时间1.5h（恒流，300mA）。
（2）转膜完成后，将膜在3%BSA-TBST溶液（Amresco公司）中室温孵育30min以封闭膜上的非特异结合位点。
（3）封闭过的膜加入1:5,000稀释的实施例3制备的肉鸡GR抗体，室温孵育10min后4℃过夜。
（4）次日，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体（1:5,000稀释）（天德悦生物科技有限责任公司），室温孵育1h。
（5）洗膜后加入ECL（Millipore公司），反应3～5min后，曝光20s。胶片扫描。
结果常温条件下GR主要分布于细胞浆中（见图2），细胞核中含量较少（见图3）；而热应激会使GR发生明显的核转位，从而增加在细胞核中的表达（见图4、图5）。说明本发明制备的肉鸡GR抗体具有较高的特异性，可以检测出肉鸡胸肌组织中GR的表达及其表达水平。
实施例5利用本发明肉鸡GR多克隆抗体测定肉鸡脑、心脏和肝脏组织中GR表达试验
按照如下方法进行：
取实施例4中经热应激处理的3只42日龄AA肉鸡的脑、心脏和肝脏组织和3只未经热应激处理的42日龄AA肉鸡的脑、心脏和肝脏组织，液氮速冻后于-80℃冰箱保存。采用Western Blot技术检测各组织中GR的表达情况。
具体操作如下：
（1）采用Pierce公司NE-PER核蛋白—胞浆蛋白抽提试剂盒抽提各肉鸡组织的胞核蛋白，并经BCA微量蛋白定量分析试剂盒（Pierce公司）进行蛋白定量。配制12%分离胶和5%浓缩胶，上样（20μg/孔）。电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压160V，通过预染蛋白marker确定电泳停止时间。电泳完毕后采用湿转法进行转膜（0.45μm孔径NC膜，Millipore公司），转膜时间1.5h（恒流，300mA）。
（2）转膜完成后，将膜在3%BSA-TBST溶液（Amresco公司）中室温孵育30min以封闭膜上的非特异结合位点。
（3）封闭过的膜加入1:5,000稀释的实施例3制备的肉鸡GR抗体，室温孵育10min后4℃过夜。
（4）次日，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体（1:5,000稀释）（天德悦生物科技有限责任公司），室温孵育1h。
（5）洗膜后加入ECL（Millipore公司），反应3～5min后，曝光20s。胶片扫描。
结果热应激处理后，肉鸡的脑（见图6，对应的常温胞核见图7）、心脏（图8，对应的常温胞核见图9）和肝脏组织图（见图10，对应的常温胞核见图11）的胞核中均可检测到GR的明显表达，以及表达水平上的差异。说明本发明制备的肉鸡GR抗体具有较高的特异性，可以准确检测出肉鸡脑、心脏和肝脏组织中GR的表达及其表达水平。
实施例6利用本发明肉鸡GR多克隆抗体测定细胞中GR表达的对比试验
试验材料：收集培养的42日龄AA肉鸡外周血淋巴细胞6份（细胞密度1×107个/mL），液氮速冻后于-80℃冰箱保存。分别采用商业化GR抗体（圣克鲁斯生物技术公司SANTA CRUZ，货号sc-1002）和本发明实施例3制备的GR抗体测定细胞中GR的表达情况。
具体按照如下方法进行：
（1）采用Pierce公司细胞总蛋白抽提试剂盒抽提细胞的总蛋白，并经BCA微量蛋白定量分析试剂盒（Pierce公司）进行蛋白定量。配制12%分离胶和5%浓缩胶，上样（20μg/孔）。电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压160V，通过预染蛋白marker确定电泳停止时间。电泳完毕后采用湿转法进行转膜（0.45μm孔径NC膜，Millipore公司），转膜时间1.5h（恒流，300mA）。
（2）转膜完成后，将膜在3%BSA-TBST溶液（Amresco公司）中室温孵育30min以封闭膜上的非特异结合位点。
（3）、封闭过的膜加入1:200（SANTA CRUZ）或1:5,000稀释的GR抗体，室温孵育10min后4℃过夜。
（4）、次日，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体（1:5,000稀释）（天德悦生物科技有限责任公司），室温孵育1h。
（5）、洗膜后加入ECL（Millipore公司）反应3～5min后，曝光20s。胶片扫描。
结果（见图12）使用商业化GR抗体可以检测外周血淋巴细胞中GR的表达情况，但目的条带附近有杂带。使用实施例3制备的GR抗体（见图13）可以检测到外周血淋巴细胞中GR的表达及其表达水平，且没有杂带，具有较强的特异性。上述结果说明，与商业化GR抗体相比，本发明肉鸡GR多克隆抗体特异性强，灵敏度高，可作为GR在肉鸡组织或细胞中的定量分析及其相关研究的重要工具。
Figure IDA0000467889560000011
Figure IDA0000467889560000021
Figure IDA0000467889560000031
Figure IDA0000467889560000041

Claims (10)

1.用于诱导肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体的抗原多肽，其特征在于由SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成。
2.权利要求1所述的抗原多肽的编码基因，其特征在于由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成。
3.含有权利要求2所述的抗原多肽编码基因的表达载体。
4.用于扩增权利要求2所述的抗原多肽编码基因的引物对，其特征在于由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。
5.一种肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体，其特征在于所述多克隆抗体的抗原多肽为由SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成的多肽。
6.按照权利要求5所述的肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体，其特征在于所述抗原多肽的编码基因由SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成。
7.按照权利要求6所述的肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体，其特征在于所述的编码基因的PCR扩增引物由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列组成。
8.含有权利要求5所述的肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体的检测试剂盒。
9.权利要求5所述的肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体在检测肉鸡组织中糖皮质激素受体表达上的应用。
10.权利要求5所述的肉鸡糖皮质激素受体多克隆抗体的制备方法，包括从28日龄AA肉鸡血液中提取肉鸡总RNA，反转录为cDNA；以SEQ IDNo:3和SEQ ID No:4所示的核苷酸序列为引物，利用RT-PCR方法克隆肉鸡GR基因片段；构建pET-28a和MBP原核表达载体，将肉鸡GR基因片段克隆到载体上，测序，诱导蛋白表达；超声波破碎诱导表达菌，用镍层析柱进行纯化；以纯化的重组pET-28a-GR免疫新西兰大白兔，五免后第7天进行心脏采血，制备抗血清；纯化MBP-GR抗原，与GE公司的亲和填料NHS-activated4FF（71-5000-14AC）偶联，亲和纯化抗血清，得到肉鸡GR多克隆抗体。
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