CN1706867A

CN1706867A - 抑制血管新生的融合蛋白质及其用途

Info

Publication number: CN1706867A
Application number: CN 200510073595
Authority: CN
Inventors: 刘征
Original assignee: Kanghong Science & Tech Industrial (group) Co Ltd Chengdu
Current assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Priority date: 2004-06-08
Filing date: 2005-06-06
Publication date: 2005-12-14
Anticipated expiration: 2025-06-06
Also published as: CN1304427C

Abstract

本发明涉及一种抑制血管新生的融合蛋白质及其用途，本发明的融合蛋白由FLT－1和KDR的片断以及免疫球蛋白Fc片断经融合得到的，称为FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6，其中FLT－1和KDR免疫球蛋白样区域的氨基酸FLT－1 D2、FLT－1 D4、KDR，D1、KDR D3、KDR D4、FP3序列见序列表1－6，FP3的编码DNA序列见序列表7。

Description

抑制血管新生的融合蛋白质及其用途

技术领域

本发明涉及一系列能有效抑制血管新生(angiogenesis)的基因重组蛋白质。血管新生是指从已经存在的血管生长出新的血管的过程。成人体内的血管绝大多数处于静止状态，血管新生只见于少数病理或生理状态，例如肿瘤，糖尿病人的病变视网目，关节炎，贫血器官，增生期子宫内膜等。在肿瘤的发生过程中，血管新生对肿瘤的快速生长起到关键的作用(Hanahan and Folkman：Patterns andemerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis。Cell。1996，86：353-364)。动物肿瘤模型的研究和人体临床试验已经证明，抑制肿瘤内新生血管的形成可以有效地阻止肿瘤的生长和发展，从而延长病人的生命

血管新生受到多种生物活性物质的调节和控制。主导血管新生过程的主要细胞是构成血管壁最内层的血管内皮细胞。多种生长因子能与血管内皮细胞表面相应的受体结合，经细胞内的信号传递系统调节血管内皮细胞的活动，从而调控血管的新生。

背景技术

在各种生长因子中，血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cellgrowth factor，VEGF)是调节血管新生的最重要的因子(Ferrara：VEGF and thequest for tumor angiogenesis factor。Nat。Rev。Cancer，2002，10：795-803。Ferrara：Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis：therapeutic implications。Semin。Oncol。2002，29(6sumppl)：10-14)。血管内皮细胞生长因子可由多种细胞分泌，但它在肿瘤细胞常常过量表达。内皮细胞生长因子通过与相应的受体结合而起作用。与VEGF相结合的受体主要有两种：FLT-1和KDR。在分子结构上，这两种受体均由三个不同的功能区组成。第一个功能区是位于细胞之外的细胞外部分。它由七个免疫球蛋白样区域(d1-d7)组成。这一部分对VEGF具有特异亲和性，是VEGF与受体相结合的关键部位。第二个功能区是由疏水性氨基酸组成的跨细胞膜部分。第三个功能区是细胞内部分，其中包括酪氨酸激酶基团。在受体被VEGF激活后，酪氨酸激酶基团发生磷酸化，从而启动细胞内部的信号传递系统，最终造成内皮细胞的功能变化，导致血管新生。

FLT-1和KDR主要分布于血管内皮细胞。因此，VEGF对于血管内皮细胞具有高度专一性的调节作用。VEGF具有促进内皮细胞分裂，引导内皮细胞迁移，抑制细胞调亡，和诱导血管形态发生等等功能，是血管新生的高效诱导剂。

在肿瘤组织，VEGF的表达水平比正常组织为高。另外，肿瘤的快速生长常常导致肿瘤内部的缺氧。而氧分压的降低又导致VEGF表达的增高。因此，VEGF是导致肿瘤中血管新生的关键因子。许多动物试验表明，阻断VEGF与其受体的结合能有效地抑制肿瘤中血管的新生，从而阻止肿瘤的生长。在其他与血管新生相关的疾病中，例如糖尿病的视网目病变和关节炎的关节病变等等，VEGF也与这些疾病的发展有密切的关系。

鉴于VEGF在肿瘤及其他疾病中所起到的关键作用，能特异性地阻断VEGF的蛋白质或化合物将具有治疗这些疾病的可能。例如，研究证明抗VEGF的中和抗体能有效的抑制肿瘤的生长(Jain：Tumor angiogenesis and accessibility：role of vascular endothelial growth factor。Semin。Oncol。2002，29(6suppl)：3-9)。因此，寻找新的更为有效的VEGF阻断剂在临床上具有重大的意义。由于FLT-1和KDR对VEGF有天然的亲和性，已有研究探讨可溶性FLT-1(FLT-1的细胞外部分)或可溶性KDR(KDR的细胞外部分)的抗血管新生作用。可溶性FLT-1可以在体外有效的抑制血管内皮细胞的增生，但其在血清中的半衰期很短，不能达到有效的血清浓度。可溶性KDR在体外也具有抑制血管内皮细胞的增生的作用，但在动物试验中其抗肿瘤效果不佳。FLT-1的第三免疫球蛋白样区域的部分碱性氨基酸是导致FLT-1在体内不稳定的主要原因，因此用KDR的部分氨基酸取代这些碱性氨基酸可以增加FLT-1的稳定性。

美国专利6100071、5952199、6383486描述了几种用KDR的部分片段和FLT-1部分片段融合的蛋白，但由于其不稳定，副作用大，没有进一步开发。

发明内容

本发明涉及用基因工程技术构建和生产能阻断VEGF的蛋白质药物的方法以及这类药物在疾病治疗上的应用。

本发明提供一种由FLT-1和KDR的片断以及免疫球蛋白Fc片断经融合得到的六种具有阻断血管内皮细胞生长因子生物作用，抑制血管新生的融合蛋白，简称为FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6，具有以下结构：

a.FP1由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：FLTd2-KDRd3-Fc；

b.FP2由KDR的第1免疫球蛋白样区域，FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fc；

c.FP3由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3-4免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：FLTd2-KDRd3，4-Fc；

d.FP4由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域，KDR的第3免疫球蛋白样区域和FLT-1的第4免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fc；

e.FP5由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3-5免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：FLTd2-KDRd3，4，5-Fc；

f.FP6由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域，KDR的第3免疫球蛋白样区域和

FLT-1的第4-5免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：

FLTd2-KDRd3-FLTd4，5-Fc。

以上FLT-1和KDR免疫球蛋白样区域的氨基酸FLT-1 D2、FLT-1D4、KDR，D1、KDR D3、KDR D4、FP3序列见序列表1-6，FP3的编码DNA序列见序列表7。

其中FLT代表FLT-1序列，KDR代表KDR序列，d是FLT-1或KDR的免疫球蛋白样区域，也可用大写D表示(domain)，Fc为人免疫球蛋白Fc序列。

其中的免疫球蛋白FC片段选自是人免疫球蛋白FC或动物的免疫球蛋白FC。如：IgG，IgM，IgA或亚型IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。其中的免疫球蛋白FC片段是FC全长或是部分FC序列，选自CH2片断，CH3片断，绞合区域片段，这些序列和片段都是现有技术，在教科书中可以找到。

本发明还提供本发明的融合蛋白在制备阻断血管内皮细胞生长因子生物作用，抑制血管新生的药物中的应用。

这一发明的关键在于根据FLT-1和KDR的结构设计构建了一系列由不同的FLT-1片段，KDR片段，和人免疫球蛋白Fc相融合而成的融合蛋白质，再用VEGF结合试验等方法筛选对VEGF具有最大亲和性的融合蛋白质。从而得到最优的VEGF阻断剂。融合蛋白质的构建技术基于分子克隆方法，具体实验方法可参考《分子克隆》第二版和第三版等实验手册。

根据FLT-1和KDR分子各区域的氨基酸序列结构，在上列融合蛋白中，FP1融合蛋白将可以提供与VEGF相结合的基本结构，它由FLT-1的第二免疫球蛋白区域(FLTd2)序列，KDR的第三免疫球蛋白区域(KDRd3)序列和Fc组成。FP2融合蛋白中增加了来自KDR的第一免疫球蛋白样区域(KDRd1)的氨基酸序列，这些序列可以增加与VEGF相结合的位点，从而增加对VEGF的亲和力。FP3和FP4融合蛋白中增加了FLT-1或KDR的第四(FLTd4或KDRd4)免疫球蛋白样区域的序列。FP5和FP6是在FP1的基础上增加了FLT-1或KDR的第四和第五免疫球蛋白样区域(FLT-1d4，5，KDRd4，5)。这些新增的序列将有利于融合蛋白之间的偶联，从而进一步形成有利于和VEGF相结合的空间结构，增加与VEGF结合的亲和力。

本发明的融合蛋白可通过基因重组技术获得，该技术为常规技术，首先获得编码有上述融合蛋白的DNA，DNA的获得可以通过常规技术，如PCR合成等方法，在用PCR合成后被克隆到载体中。所用载体可以是分子生物学所常用的质粒、病毒或DNA片断。各融合蛋白的氨基末断前加上蛋白分泌信号序列以保证蛋白质从细胞中分泌出来。载体序列中包括用于驱动基因表达的启动子，蛋白质翻译起始和终止信号，以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中有抗菌素抗性基因以利于质粒在细菌中所繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因用于稳定转染细胞株的选择。

由于FLT-1和KDR中各个免疫球蛋白样区域的氨基酸序列之间并没绝然的分界，因此各免疫球蛋白样区域的氨基酸序列的长度可以有一定的变化。所以，本发明所涉及的融合蛋白质的氨基酸序列也可以有一定的变化。它们都属于本发明的范围。

在完成上列各种融合蛋白的质粒构建以后，即可用质粒DNA转染细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，它们包括(但不限于)哺乳动物细胞，细菌，酵母，昆虫细胞，等等(其中哺乳动物细胞和昆虫细胞为真核细胞，细菌和酵母细胞为原核细胞。从哺乳动物细胞所表达的蛋白质具有糖基修饰。由于本发明的融合蛋白质的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸，因此，哺乳动物细胞是表达这些蛋白质的最佳细胞。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，例如293细胞，CHO细胞，SP20细胞，NS0细胞，COS细胞，BHK细胞，PerC6细胞，等等。许多其他细胞也可用于这些蛋白质的表达和生产，因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。编码多肽的质粒可经转染(transfection)进入细胞。转染细胞的方法有多种，其中包括(但不限于)：电钻孔(electroporation)，脂质体(liposome)介导，钙介导，等等。

除了哺乳动物细胞，其他表达系统也能用于这些多肽的表达，例如细菌，酵母，昆虫细胞，等等。它们也包括在本发明所能使用的细胞之列。这些表达系统的蛋白质产量比哺乳动物细胞为高，但是，所表达的蛋白质缺乏糖基化或者所形成的糖链与哺乳动物细胞不同。

融合蛋白质表达后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测定细胞培养液中融合蛋白质的浓度。由于这些融合蛋白质具有免疫球蛋白Fc片断，因此可用蛋白A亲和层析法提取所表达的融合蛋白质。

本发明从质粒转染的293细胞培养液中获得相应的各种融合蛋白质。然后利用VEGF结合试验来比较各种蛋白质对VEGF的亲和力。进而，利用VEGF诱导下的人血管内皮细胞分裂试验检测和比较各融合蛋白对VEGF的阻断作用。实验结果证明本发明所构建的各种融合蛋白质对VEGF具有高度的亲和力(见图2)，而且，它们能有效地阻断VEGF对血管内皮细胞刺激，抑制内皮细胞的分裂。进一步的试验发现，FP3对VEGF的阻断效果最好。是阻断VEGF最有效的融合蛋白质。

因此，本发明所构建的融合蛋白质对VEGF具有阻断作用。其中FP1的分子量最小。FP3对阻断VEGF最为有效。这些融合蛋白质都具有抗血管新生的生物学特性，从而具有治疗疾病可能。

由于本发明的各种融合蛋白质的基本作用是阻断VEGF，因此这些蛋白质可能应用于与血管新生或者VEGF相关的疾病。这些疾病可能包括(但不限于)各种肿瘤，视网目血管病变，关节炎，等等。融合蛋白可以作为提取的重组蛋白质注射到病人体内。也可以将融合蛋白DNA序列插入到适当的载体中，用基因治疗或细胞治疗的方法在病人体内表达。所以，本发明所涉及的融合蛋白质的使用方法有多种形色，不仅包括蛋白质本身，也包括编码融合蛋白的DNA。

为了进一步证明融合蛋白质在体内的抗血管作用，本发明试验了FP3融合蛋白质在动物体内的抗肿瘤作用。在小鼠B16F10黑色素瘤和异种移植(Xenograft)模型人PC-3前列腺癌，融合蛋白质非常有效地抑制了肿瘤的生长，延长了个体的生命。因此，本发明所构建的融合蛋白质具有高效的抗癌能力。

本发明还包括含有本发明融合蛋白的药物组合物，组合物中可以含有药物可接受的载体。组合物可以以任何形式的药物制剂形式存在，优选的是注射剂，最优选的是冷冻干燥注射剂，该药物制剂形式药物组合物，可以按照制剂学常规技术制备，包括将药物活性成分，本发明的融合蛋白与药物载体混合，按照制剂学常规技术制成所需要的剂型。

本发明的融合蛋白，与现有技术相比，优点明显，具有稳定性好，产率高，副作用小的特点，本发明特别优选的融合蛋白是FP3，是经过大量筛选得到的，经与本发明的其他融合蛋白以及现有技术中其他类似的融合蛋白进行比较实验研究，发现，该融合蛋白具有特别优良的在动物体内的抗肿瘤作用。在小鼠B16F10黑色素瘤和异种移植(Xenograft)模型人PC-3前列腺癌，FP3融合蛋白非常有效地抑制了肿瘤的生长，延长了个体的生命，实验证明，FP3比其他融合蛋白更有效，副作用更小，制成制剂后稳定性最好。在本发明融合蛋白质中最具抗癌应用价值。

附图说明

图1展示了六种融合蛋白的结构组成。它们由不同的FLT-1和KDR多肽片断以及免疫球蛋白Fc片断用基因工程构建而成。

图2显示六种融合蛋白与VEGF结合的试验结果。OD读数代表融合蛋白质与VEGF的结合信号。结果显示它们与VEGF具有很强的结合能力，尤其以FP3的结合能力最强。

图3融合蛋白有效地抑制人血管内皮细胞的在体外的分裂。

图4显示融合蛋白质FP3有效地抑制小鼠B16F10黑色素瘤在体内的生长。

图5显示融合蛋白质有效地抑制人PC-3前列腺癌在小鼠体内的生长。

图6融合多肽FP1与FP3有效地抑制小鼠肿瘤的生长的比较研究。

具体实施方式

以下实例对本发明所涉及的融合蛋白构建，试验和应用作了详细说明。但是本发明的内容及用途并不限制于实例的范围。

实施例1：融合蛋白质及其质粒的构建。

除了免疫球蛋白Fc片断，构建本发明中各种融合蛋白的原始序列来自FLT-1和KDR相应的cDNA。由于FLT-1和KDR的表达主要见于血管内皮细胞，故本发明用RNA提纯药盒(QIAGEN公司)从人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)提取了总RNA。然后用逆转录酶从RNA合成cDNA。再用不同的引物利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得所需要的FLT-1和KDR片断。最后用PCR将来自FLT-1，KDR，和人免疫球蛋白Fc(IgG1 Fc)序列相融合，从而构建成不同融合蛋白质的DNA序列。六种融合蛋白的结构见图1。

FP3基因的构建：

用EGM-2培养基(Clonetics)在T-175培养瓶中培养人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC细胞)(Clonetics)。收集大约1×10e7个细胞，利用Qiagen公司的RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，并用Invitrogen cDNA试剂盒合成cDNA，-80℃冻存备用。采用下列特异引物从HUVEC cDNA中扩增到FLT-1and KDR基因片段。

用人IgG1 Fc特异引物从来源自淋巴结(BD Clontech)的cDNA中扩增到IgG1 Fc基因片段。

Primers(引物)：

FLT-1D2 forward：cctttcgtagagatgtacagtga

FLT-1D2 reverse：tatgattgtattggtttgtccat

KDR D3-4 forward：gatgtggttctgagtccgtctca

KDR D3-4 reverse：cggtgggacatacacaaccaga

Human IgG1 Fc forward：gacaaaactcacacatgcccact

Human IgG1 Fc reverse：tcatttacccggagacagggagag

在变性95℃，30分，退火56℃，45秒，延伸72℃，2分的条件下，进行PCR扩增，30个循环，获得FLT-1和KDR IgG样结构域的PCR产物及人IgG1 Fc段PCR产物。用TA cloning试剂盒，把PCR产物克隆入pCR2.1质粒，并转染E.coli，选取白色菌落，加入LB培养基，培养过夜。Qiangen质粒提取试剂盒提取质粒后酶切，及测序鉴定。

采用拼接PCR(sewing PCR)方法，把FLT-1、KDR和IgG Fc cDNA连接在一起，在引物中设计有EcoRI的酶切位点，用EcoRI酶切后，Qiangen纯化试剂盒纯化DNA片段并插入pcDNA3.1质粒，重组质粒转染E.coli，选取阳性菌落，加入LB培养基，培养过夜。Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒后酶切，及测序鉴定。已获证实的质粒再转染293或CHO细胞获得稳定表达FP3的细胞系。FP3的具体氨基酸序列见序列表6，

实施例2：融合蛋白质在细胞中的表达。

本发明的组成部分之一是在细胞中表达所构建的融合蛋白质。在完成各质粒的构建以后，用质粒DNA提纯药盒(QIAGEN公司)提取了高纯度质粒DNA。然后，利用FUGEN6质粒转染药盒(ROCHE公司)将质粒DNA导入293细胞中。按所需蛋白质量的多少，采用了两种不同的质粒转染的方法表达融合蛋白。

第一种方法是瞬时转染(Transient transfection)法，用这一方法可以得到小规模量的融合蛋白质。首先用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基将293细胞在细胞培养皿内培养。当细胞生长至覆盖60-80％面积时，将质粒DNA与FUGEN6试剂的复合物加入细胞培养液中。第二天，用无血清DMEM培养基换液。再继续培养三天，然后收集上清液。这些上清液中含有从细胞表达的融合蛋白多肽。融合多肽的浓度用ELISA法定量确定。用这一方法，本发明表达了上述六种融合多肽。

第二种方法是用稳定转染(Stable transfection)法建立稳定细胞，以表达大量的融合蛋白多肽。所用细胞亦是293细胞。质粒的转染方法与上述瞬时转染法相同，但是，在转染第二天，细胞在含有新酶素的DMEM完全培养中用有限密度稀释法经行克隆培养。大约21天后，挑取新酶素抗性克隆，进行细胞的扩大培养。最后，细胞在转鼓培养瓶中培养生产融合多肽。融合多肽的浓度用ELISA法定量确定。

本发明证明可以从质粒经细胞转染表达和生产所构建的融合多肽。

实施例3：融合多肽与VEGF的结合实验。

本发明用VEGF结合试验测定了各融合多肽与VEGF的结合能力。在这一试验中，首先将重组VEGF(Chemicom公司)蛋白质包被在96孔ELISA板上。然后用百分之五的牛奶粉溶液阻断非特异性蛋白结合位点。再向各孔加入含有不同浓度的各种融合蛋白质，在37度培养两个小时。清洗以后，加入兔抗人Ig抗体-HRP。最终用过氧化物酶底物显色。用ELISA阅读仪测量96孔板各孔OD值。高OD值代表融合蛋白质与VEGF的结合信号。

如图2所示，本发明所构建和表达的六种融合蛋白都具有与VEGF结合的能力。在每毫升1毫微克的浓度，便能检测到它们与VEGF的结合信号。因此，这六种融合蛋白都与VEGF具有很高的亲和力。但是，比较而言，FP3与VEGF的结合能力最大，是最强大的VEGF阻断剂。它的半数最大结合浓度(Halfmaximal binding concentration)比FP1低约5倍。FP5与VEGF的结合能力比FP3稍弱。这一结果说明KDR的第四免疫球蛋白样区域的氨基酸序列可增进融合蛋白对VEGF的阻断能力。但是，在融合蛋白中进一步增加KDR的序列，例如第五免疫球蛋白样区域，并不进一步增加对VEGF的抑制能力。其他三个融合蛋白质的抑制能力比FP3和FP5为弱，但比FP1强。

实施例4：融合蛋白有效地抑制人血管内皮细胞的在体外的分裂。

本发明另一关键实例是证明了所构建的融合蛋白能有效地阻断VEGF所诱导的血管内皮细胞的分裂。在这一实验中，将脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC细胞，CLONETICS公司)接种于96孔细胞培养板。细胞培养液为EBM基本培养基(CLONETICS公司)，含2％胎牛血清和15ng/ml VEGF。在实验组的细胞培养液中，加入含不同浓度融合蛋白的293细胞上清液。在阴性对照组的细胞培养液中，加入未经质粒转染的293细胞上清液(不含融合蛋白)。不同处理的HUVEC细胞在37度继续培养。三天后，细胞计数确定各孔中的HUVEC密度。

如图3所示，六种蛋白质都能有效的阻断VEGF对其受体的刺激作用。其中FP3对HUVEC生长抑制作用最明显。

HUVEC细胞分裂试验显示，本发明所构建的六种融合蛋白质钧能抑制血管内皮细胞的分裂。鉴于在这个实验中HUVEC细胞的分裂由VEGF刺激造成，因此，这六种蛋白质都能有效的阻断VEGF对其受体的刺激作用。它们都有抑制血管新生的功能。在这六种蛋白质中，以FP3对HUVEC细胞分裂的阻抑作用最强，它们的半数抑制浓度(IC50)在3ng/ml左右。FP1的IC50为12ng/ml左右。FP2，FP4，FP5，和FP6的IC50在5-8ng/ml。

实施例5：融合多肽能有效地抑制小鼠肿瘤的生长。

作为VEGF阻断剂，本发明所构建的融合蛋白质的应用之一是用于肿瘤的治疗。鉴于FP3融合蛋白对VEGF有高效的阻断作用，本发明选择FP3进行了动物体内抗肿瘤效果的试验。

本发明所试验的小鼠肿瘤模型是B16F10黑色素瘤。这是一种快速生长的恶性肿瘤。在这个试验中，先将B16F10细胞注入小鼠背部皮下。经尾静脉注射提纯的融合蛋白质。注射剂量为每小鼠每次400微克(小鼠平均体重约22克)，每周两次。对照组注射同剂量的提纯人免疫球蛋白Fc。图4显示肿瘤的生长曲线。融合蛋白非常有效抑制了该黑色素瘤的生长(P＜0.01)。

让人类肿瘤细胞在裸鼠体内生长的异种移植(Xenograft)模型是与人体肿瘤最为接近的动物肿瘤模型。裸鼠缺乏免疫排斥能力，因此，许多来自人的肿瘤细胞系能在裸鼠体内生长，形成肿瘤。本发明试验了融合蛋白FP3对人前列腺癌PC-3细胞在裸鼠体内生长的抑制作用。在这一模型，首先将PC-3细胞注入裸鼠背部皮下，从尾静脉注射提纯的融合蛋白。每个小鼠每次400微克，每周两次。对照组注射相同剂量的人免疫球蛋白Fc。实验结果如图5所示。在对照组，肿瘤细胞接种后45天，肿瘤已长至大于1000立方毫米。而在用融合蛋白质注射的动物，融合蛋白几乎完全抑制了PC-3肿瘤的生长(P＜0.01)，对肿瘤具有非常显著的治疗作用。

实施例6：融合多肽FP1与FP3有效地抑制小鼠肿瘤的生长的比较研究。

为更好地说明FP3具有较好的肿瘤抑制作用，选用了FP1同FP3做抑制肿瘤生长的比较试验。选用10只生长良好的裸鼠，每只背部注射鼠神经胶质瘤C6细胞1×10⁵，0.05ml，再尾静脉分别注射提纯的融合蛋白FP1和FP3，2.5mg/kg，每周两次，到31天。对照组注射相同剂量的人免疫球蛋白Fc。实验结果如图6所示。FP1和FP3对肿瘤具有非常显著的治疗作用，到第35天，FP1组肿瘤体积是1167.3，而FP3组是557.6，对照组再第24天已到1312.3。所以，FP3的作用更明显(P＜0.05.)。结果如图6所示。

综上所述，本发明所构建的融合蛋白质对VEGF具有高度的亲和性，能在体外抑制血管内皮细胞的增生，并能在体内非常显著抑制肿瘤的生长。鉴于血管新生为所有肿瘤增生之必需，本发明所涉及的融合蛋白质可用于多种肿瘤的治疗。

序列表

<110>成都康弘科技实业(集团)有限公司

<120>抑制血管新生的融合蛋白质及其用途

<160>7

<210>1

<211>93

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu

1 5 10 15 20

Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro

25 30 35 40

Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile

45 50 55 60

Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly

65 70 75 80

His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr

85 90 93

<210>2

<211>96

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Phe Ile Thr Val Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser

1 5 10 15 20

Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val Trp Leu Lys Asp

25 30 35 40

Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile

45 50 55 60

Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser

65 70 75 80

Asn Val Phe Lys Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro

85 90 95 96

<210>3

<211>86

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Pro Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr Leu Gln Ile

1 5 10 15 20

Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu

25 30 35 40

Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro

45 50 55 60

Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala

65 70 75 80

Ser Val Ile Tyr Val Tyr

85 86

<210>4

<211>102

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn

1 15 10 15 20

Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser

25 30 35 40

Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met

45 50 55 60

Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr

65 70 75 80

Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His

85 90 95 100

Glu Lys

102

<210>5

<211>92

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val

1 5 10 15 20

Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly

25 30 35 40

Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val

45 50 55 60

Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys

65 70 75 80

Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro

85 90 92

<210>6

<211>552

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser Cys Leu Leu Leu

1 5 10 15 20

Thr Gly Ser Ser Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile

25 30 35 40

Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile

45 50 55 60

Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile

65 70 75 80

Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu

85 90 95 100

Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln

105 110 115 120

Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu

Leu Ser Val Gly

125 130 135 140

Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn

145 150 155 160

Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr

165 170 175 180

Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg

185 190 195 200

Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser

205 210 215 220

Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu

225 230 235 240

Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg leu Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro

245 250 255 260

Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala

265 270 275 280

Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile

285 290 295 300

Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val

305 310 315 320

Pro Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

325 330 335 340

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

345 350 355 360

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

365 370 375 380

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

385 390 395 400

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

405 410 415 420

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

425 430 435 440

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

445 450 455 460

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

465 470 475 480

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ala Thr Pro

485 490 495 500

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

505 510 515 520

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

525 530 535 540

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

545 550 552

<210>7

<211>1656

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60

acaggatcta gttccggagg tagacctttc gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt 120

atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc attccctgcc gggttacgtc acctaacatc 180

actgttactt taaaaaagtt tccacttgac actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc 240

tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg 300

acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg tataagacaa actatctcac acatcgacaa 360

accaatacaa tcatagatgt ggttctgagt ccgtctcatg gaattgaact atctgttgga 420

gaaaagcttg tcttaaattg tacagcaaga actgaactaa atgtggggat tgacttcaac 480

tgggaatacc cttcttcgaa gcatcagcat aagaaacttg taaaccgaga cctaaaaacc 540

cagtctggga gtgagatgaa gaaatttttg agcaccttaa ctatagatgg tgtaacccgg 600

agtgaccaag gattgtacac ctgtgcagca tccagtgggc tgatgaccaa gaagaacagc 660

acatttgtca gggtccatga aaacctttct gttgcttttg gaagtggcat ggaatctctg 720

gtggaagcca cggtggggga gcgtgtcaga atccctgcga agtaccttgg ttacccaccc 780

ccagaaataa aatggtataa aaatggaata ccccttgagt ccaatcacac aattaaagcg 840

gggcatgtac tgacgattat ggaagtgagt gaaagagaca caggaaatta cactgtcatc 900

cttaccaatc ccatttcaaa ggagaagcag agccatgtgg tctctctggt tgtgtatgtc 960

ccaccgggcc cgggcgacaa aactcacaca tgcccactgt gcccagcacc tgaactcctg 1020

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1080

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1140

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1200

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1260

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1320

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1380

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctag tcaaaggctt ctatcccagc 1440

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa ggccacgcct 1500

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1560

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1620

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1656

Claims

1.由FLT-1和KDR的片断以及免疫球蛋白Fc片断经融合得到的六种具有阻断血管内皮细胞生长因子生物作用，抑制血管新生的融合蛋白，其特征在于，具有以下结构：

b.FP2由KDR的第1免疫球蛋白样区域，FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：

KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fc

e.FP5由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域和KDR的第3-5免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：FLTd2-KDRd3，4，5-Fc；或

f.FP6由FLT-1的第2免疫球蛋白样区域，KDR的第3免疫球蛋白样区域和FLT-1的第4-5免疫球蛋白样区域融合而成的蛋白：FLTd2-KDRd3-FLTd4，5-Fc。

2.权利要求1的融合蛋白，其特征在于，其中的免疫球蛋白FC片段选自是人免疫球蛋白FC或动物的免疫球蛋白FC。

3.权利要求1的融合蛋白，其特征在于，其中的免疫球蛋白FC片段选自IgG，，IgM，IgA或亚型IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。

4.权利要求1的融合蛋白，其特征在于，其中的免疫球蛋白FC片段是FC全长或是部分FC序列，选自CH2片断，CH3片断，绞合区域片段。

5.编码有权利要求1的融合蛋白的DNA序列。

6.含有权利要求2中所述DNA序列的载体，这些载体选自质粒，病毒或DNA片断。

7.含有权利要求6中所述载体的细胞，这些细胞可用于相应的权利要求1中的融合蛋白质的表达，它们选自真核细胞或原核细胞。

8.权利要求1的融合蛋白在制备阻断血管内皮细胞生长因子生物作用，抑制血管新生的药物中的应用。

9.含有权利要求1的融合蛋白的药物组合物。

10.权利要求9的药物组合物，是注射剂，其活性成分是融合蛋白FP3，根据需要，所述组合物还含有药物可接受的载体。